KR102595859B1 - 페니실리움 라디아톨로바툼 추출물을 이용한 은나노입자 및 그 제조방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 페니실리움 라디아톨로바툼 추출물을 이용하여 은나노입자를 제조하는 방법에 관한 것이며, 해당 방법을 통하여 제조된 은나노입자는 항균, 항암 효과가 우수하다.

Description

페니실리움 라디아톨로바툼 추출물을 이용한 은나노입자 및 그 제조방법 {Silver nanoparticles using Penicillium radiatolovatum extract and method for manufacturing the same}
본 발명은 은나노입자 및 그 제조방법에 관한 것으로, 더 자세하게는, 페니실리움 라디아톨로바툼 추출물을 이용하여 은나노입자를 제조하는 방법에 관한 것이며, 해당 방법을 통해 제조된 은나노입자는 항균, 항암 효과가 우수하다.
곰팡이는 균사로 이루어진 생물의 한 분류로, 두꺼운 세포벽을 가지고 있으며 얼핏 식물과 비슷하지만, 스스로 양분을 만들어 살아갈 수 없는 종속영양생물이다. 특이한 번식방법을 여러 가지 가지고 있다.
곰팡이 중, Penicillium 종은 다양한 환경 조건에 서식한다. 이러한 곰팡이는 숙주에 대한 유전 형질을 가지고 있으며, 식물 면역의 활성화를 통해 수많은 위협으로부터 자신을 보호한다. Penicillium 종의 생체 분자는 의학, 식품 및 농업 산업 응용 분야에서 유망하다.
한편, 세균 감염은 현대 질병의 출현과 내성 미생물의 증가로 인해 전 세계적으로 수백만 명이 사망하는 주요 원인이다. 또한,, 현 시대에 암은 전 세계적으로 심각한 사망률과 함께 다양한 화학 요법의 심각한 부작용을 초래하는 끔찍하고 생명을 위협하는 질병이다.
지난 수십 년 동안 나노과학 및 기술은 의학, 농학 및 생물학에서 큰 관심을 받았다. 나노 크기의 금속 입자는 전자, 광학 장치, 소독제, 센서, 포장, 치료제 및 질병 진단을 포함한 많은 분야에서 탁월한 참여자로 입증되었다.
나노입자는 생물의학 및 의료 분야에서 독특한 특성과 광범위한 용도로 이용되었다. 나노입자는 화학적, 전기화학적, 물리적, 조사, 마이크로파, 초음파 처리, 열분해 및 레이저 제거 방법을 통해 제조할 수 있다. 그러나, 화학매개 합성은 독성 부산물의 생성을 통해 심각한 환경 문제를 일으키는 것으로 알려져 있으며, 경제적으로도 비용이 많이 든다.
한편, 생합성 방법은 나노입자의 제조를 위한 화학 기술보다 경제적이고 생태학적으로 실행 가능한 접근 방식이다. 생합성 나노입자는 폐수 처리, 항균, 약리학, 기능 식품 및 코스메슈티컬 특성에 효과적이라고 보고되고 있다.
따라서, 나노입자를 생산하기 위한 새로운 방식에 대한, 다양한 접근의 필요성이 커지고 있는 추세다.
공개특허공보 제10-2012-0137642호(2012.12.24.공개), "콘드로이틴황산 또는 아카란황산을 이용한 안정성, 안전성 및 상처치료 효과가 개선된 생체적 합성 은나노입자 및 이의 제조방법"
상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여, 본 발명은 페니실리움 라디아톨로바툼 추출물을 이용하여 은나노입자를 제조하는 방법을 제공하는데 그 목적이 있다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 페니실리움 라디아톨로바툼(Penicillium radiatolobatum) 균주를 이용하여 페니실리움 라디아톨로바툼 추출물(PRE)을 제조하는 PRE 제조 단계(S10); 상기 PRE 제조 단계(S10)에서 제조된 페니실리움 라디아톨로바툼 추출물(PRE)을 AgNO3 수용액과 혼합하고 배양하여, 은나노입자가 형성된 혼합물을 제조하는 PRE-AgNPs 형성 단계(S20); 및 상기 PRE-AgNPs 형성 단계(S20)의 은나노입자가 형성된 혼합물을 원심분리하고 세척하여, PRE-AgNPs를 수집하는 PRE-AgNPs를 수집 단계(S30);를 포함하는 것을 특징으로 하는 페니실리움 라디아톨로바툼 추출물을 이용한 은나노입자의 제조방법을 제공한다.
또한, 상기 PRE 제조 단계(S10)는, 상기 페니실리움 라디아톨로바툼 추출물(PRE)은 페니실리움 라디아톨로바툼(Penicillium radiatolobatum) 균주를 배양 배지에서 24 ~ 28℃에서 7 ~ 14일 동안 배양하는 배양 단계(S11)를 포함하는 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 PRE 제조 단계(S10)는, 상기 배양 단계(S11)를 수행한 다음, 배양된 페니실리움 라디아톨로바툼(Penicillium radiatolobatum) 균주가 포함된 배지를 증류수로 세척하여 잔류 배지 성분을 제거하는 세척 단계(S12)를 포함하는 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 PRE 제조 단계(S10)는, 상기 세척 단계(S12)를 수행한 다음, 페니실리움 라디아톨로바툼의 순수한 균사체를, 증류수에서 24 ~ 28℃에서 48 ~ 96시간 동안 160 ~ 200rpm의 교반을 가하면서 추가 배양하고, 여과하여, PRE 무세포 배양 여액을 얻는 PRE 무세포 배양 여액 제조 단계(S13)를 포함하는 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 PRE-AgNPs 형성 단계(S20)에서는 상기 PRE 제조 단계(S10)에서 제조된 페니실리움 라디아톨로바툼 추출물(PRE)을 AgNO3 수용액과 혼합하고 24 ~ 28℃에서 12 ~ 36시간 동안 반응시켜, 은나노입자가 형성된 혼합물을 제조하는 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 PRE-AgNPs를 수집 단계(S30)에서는 PRE-AgNPs 형성 단계(S20)의 은나노입자가 형성된 혼합물을 10000~ 14000rpm의 속도로 5 ~ 15분간 원심분리하고 세척하여, PRE-AgNPs를 수집하는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 페니실리움 라디아톨로바툼(Penicillium radiatolobatum) 균주를 이용하여 제조된 페니실리움 라디아톨로바툼 추출물(PRE)에, AgNO3 수용액을 혼합한 혼합물을, 배양하고, 원심분리하고, 세척하여 수집된 것을 특징으로 하는 페니실리움 라디아톨로바툼 추출물을 이용한 은나노입자를 제공한다.
또한, 상기 페니실리움 라디아톨로바툼 추출물(PRE)은 페니실리움 라디아톨로바툼(Penicillium radiatolobatum) 균주가 배양 배지에서 24 ~ 28℃에서 7 ~ 14일 동안 배양된 것을 이용한 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 페니실리움 라디아톨로바툼 추출물(PRE)은 배양된 페니실리움 라디아톨로바툼(Penicillium radiatolobatum) 균주가 포함된 배지를 증류수로 세척하여 잔류 배지 성분을 제거된 것을 이용하는 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 페니실리움 라디아톨로바툼 추출물(PRE)은 페니실리움 라디아톨로바툼의 순수한 균사체를, 증류수에서 24 ~ 28℃에서 72시간 동안 180rpm의 교반을 가하면서 추가 배양하고, 여과하여 얻어진 PRE 무세포 배양 여액인 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 페니실리움 라디아톨로바툼 추출물(PRE)을 AgNO3 수용액과 혼합하고 24 ~ 28℃에서 12 ~ 36시간 동안 반응시킨 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 페니실리움 라디아톨로바툼 추출물(PRE)에, AgNO3 수용액을 혼합한 혼합물을, 배양하고, 10000~ 14000rpm의 속도로 5 ~ 15분간 원심분리하고, 세척하여 수집된 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따르면, 페니실리움 라디아톨로바툼 추출물을 이용하여, 은나노입자를 제조할 수 있으며, 이는 생태학적으로 지속가능한 친환경적인 접근이다. 또한, 본 발명의 제조방법에 따라 제조된 은나노입자는 항균, 항암 효과가 우수하다.
도 1은 (a) UV-Vis 분광 광도계, (b) 입자 크기 분석 및 (c) 동적 광산란(DLS)에 의한 ζ 전위 분석을 사용한 PRE-AgNPs의 특성화를 나타낸 그래프..
도 2는 PRE 및 PRE-AgNPs의 X선 분말 회절(XRD) 패턴 분석(a) 및 푸리에 변환 적외선 분광기(FTIR) 분석(b)을 나타낸 그래프.
도 3은 PRE-AgNPs의 투과전자현미경 사진(a-c) 및 EDS에 의한 원소 분석을 나타낸 그래프(d).
도 4는 박테리아 병원체, (A) Listeria monocytogenes, (B) Salmonella enterica, (C) Bacillus cereus, (D) Escherichia coli 및 (E) Staphylococcus aureus에 대한 PRE-AgNPs의 항균 활성을 나타낸 사진. (a(0.1), b(0.2), c(0.5), d(1) 및 e(0.02)mg/mL(표준 약물 테트라사이클린 염산염))
도 5는 PRE-AgNP에 의한 세균 세포의 형태적 변화 관찰을 나타낸 사진.
도 6은 PRE 및 PRE-AgNPs의 세포독성 활성을 확인하기 위한 것으로, 비암성 HEK 293 세포주에서 WST 분석 그래프(a), 광학 현미경 사진(b) 및 Acridine orange/Ethidium bromide 염색(c)을 나타낸 그래프 및 사진.
도 7은 PRE 및 PRE-AgNPs의 세포독성 활성을 확인하기 위한 것으로, a) WST 분석 그래프, b) DCFH-DA 염색 사진, c) 세포자멸사 형태학적 변화 정도를 나타낸 그래프. 및, d)인간 폐암 A549 세포주에서 아크리딘 오렌지/Ethidium bromide 염색을 나타낸 사진.
이하의 본 발명에 관한 상세한 설명들은 본 발명이 실시될 수 있는 실시 예이고 해당 실시 예의 예시로써 도시된 첨부 도면을 참조한다.
이들 실시 예는 당 업자가 본 발명의 실시에 충분하도록 상세히 설명된다. 본 발명의 다양한 실시 예는 서로 다르지만 상호 배타적일 필요는 없음이 이해되어야 한다.
예를 들어, 여기에 기재되어 있는 특정 형상, 구조 및 특성은 일 실시 예에 관련하여 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않으면서 다른 실시 예로 구현될 수 있다. 본 발명의 실시예에 있어서, 질산은, 차아염소산나트륨 및 테트라사이클린 염산염은 Sigma Aldrich(대한민국)에서 조달했다. Potato dextrose broth (PDB), Potato dextrose agar (PDA), Mueller Hinton broth (MHB)는 Difco Laboratories(Fisher Scientific, Republic of Korea)에서 구입하였다. 인간배아신장세포(HEK293), 인간폐선암세포(A549) 등의 세포주는 한국세포주은행(KCLB, 대한민국)에서 조달하였다. 진균 내생균인 P. radiatolobatum 균주 AN003(NCBI 수탁 번호 MW237703.1)을 AgNPs 합성에 사용했다.
각각의 기재된 실시 예 내의 개별 구성요소의 위치 또는 배치는 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않으면서 변경될 수 있음이 이해되어야 한다.
후술되는 상세한 설명은 한정적인 의미로서 취하려는 것이 아니며, 본 발명의 범위는 적절하게 설명된다면 그 청구항들이 주장하는 것과 균등한 모든 범위와 더불어 첨부된 청구항에 의해서만 한정된다. 도면에서 유사한 참조부호는 여러 측면에 걸쳐서 동일하거나 유사한 기능을 지칭한다.
본 발명에서 사용되는 용어는 본 발명에서의 기능을 고려하면서 가능한 현재 널리 사용되는 일반적인 용어들을 선택하였으나, 이는 당 분야에 종사하는 기술자의 의도 또는 판례, 새로운 기술의 출현 등에 따라 달라질 수 있다. 또한, 특정한 경우는 출원인이 임의로 선정한 용어도 있으며, 이 경우 해당되는 발명의 설명 부분에서 상세히 그 의미를 기재할 것이다. 따라서 본 발명에서 사용되는 용어는 단순한 용어의 명칭이 아닌, 그 용어가 가지는 의미와 본 발명의 전반에 걸친 내용을 토대로 정의되어야 한다.
본 발명에서 어떤 부분이 어떤 구성요소를 “포함”한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한, 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 포함할 수 있음을 의미한다.
이하, 본 발명에 따른 페니실리움 라디아톨로바툼 추출물을 이용한 은나노입자의 제조방법에 대하여 설명한다.
본 발명에 따른 페니실리움 라디아톨로바툼 추출물을 이용한 은나노입자의 제조방법은 페니실리움 라디아톨로바툼(Penicillium radiatolobatum) 균주를 이용하여 페니실리움 라디아톨로바툼 추출물(PRE)을 제조하는 PRE 제조 단계(S10); 상기 PRE 제조 단계(S10)에서 제조된 페니실리움 라디아톨로바툼 추출물(PRE)을 AgNO3 수용액과 혼합하고 반응시켜, 은나노입자가 형성된 혼합물을 제조하는 PRE-AgNPs 형성 단계(S20); 및 상기 PRE-AgNPs 형성 단계(S20)의 은나노입자가 형성된 혼합물을 원심분리하고 세척하여, PRE-AgNPs를 수집하는 PRE-AgNPs를 수집 단계(S30);를 포함하는 것을 특징으로 한다.
우선, 본 발명에 따른 페니실리움 라디아톨로바툼 추출물을 이용한 은나노입자의 제조방법은 첫번째 단계로써, PRE 제조 단계(S10)를 수행한다.
상기 PRE 제조 단계(S10)에서는 페니실리움 라디아톨로바툼(Penicillium radiatolobatum) 균주를 이용하여 페니실리움 라디아톨로바툼 추출물(PRE)을 제조한다.
여기서, PRE란, 페니실리움 라디아톨로바툼(Penicillium radiatolobatum) 균주를 이용한 추출물(Penicillium radiatolobatum Extract)을 칭하며, 상기 페니실리움 라디아톨로바툼(Penicillium radiatolobatum) 균주는 Penicillium radiatolobatum AN003(수탁 번호 MW237703.1)일 수 있다. 또는, 페니실리움 라디아톨로바툼(Penicillium radiatolobatum) 균주는 시중에서 구입한 것을 사용할 수도 있다.
한편, 상기 PRE 제조 단계(S10)는 배양 단계(S11), 세척 단계(S12), PRE 무세포 배양 여액 제조 단계(S13)를 포함할 수 있다.
상기 배양 단계(S11)에서는 상기 페니실리움 라디아톨로바툼 추출물(PRE)은 페니실리움 라디아톨로바툼(Penicillium radiatolobatum) 균주를 배양 배지에서 24 ~ 28℃에서 7 ~ 14일 동안 배양하는 것이 적절하다. 가장 바람직하게, 상기 배양 단계(S11)에서는 상기 페니실리움 라디아톨로바툼 추출물(PRE)은 페니실리움 라디아톨로바툼(Penicillium radiatolobatum) 균주를 배양 배지에서 26℃에서 10일 동안 배양하는 것이 적절할 것이다.
상기 세척 단계(S12)에서는, 상기 배양 단계(S11)를 수행한 다음, 배양된 페니실리움 라디아톨로바툼(Penicillium radiatolobatum) 균주가 포함된 배지를 증류수로 세척하여 잔류 배지 성분을 제거하는 것이 적절하다.
상기 PRE 무세포 배양 여액 제조 단계(S13)에서는, 상기 세척 단계(S12)를 수행한 다음, 페니실리움 라디아톨로바툼의 순수한 균사체를, 증류수에서 24 ~ 28℃에서 48 ~ 96시간 동안 160 ~ 200rpm의 교반을 가하면서 추가 배양하고, 여과하여, PRE 무세포 배양 여액을 얻는 것이 적절하다. 가장 바람직하게, 상기 PRE 무세포 배양 여액 제조 단계(S13)에서는, 상기 세척 단계(S12)를 수행한 다음, 페니실리움 라디아톨로바툼의 순수한 균사체를, 증류수에서 26℃에서 72시간 동안 180rpm의 교반을 가하면서 추가 배양하고, Whatman No.1 여과지를 이용해 여과하여, 페니실리움 라디아톨로바툼이 포함되지 않은 PRE 무세포 배양 여액을 얻는 것이 적절할 것이다.
정리하자면, 본 발명에 따른 PRE 제조 단계(S10)는 상기 페니실리움 라디아톨로바툼 추출물(PRE)은 페니실리움 라디아톨로바툼(Penicillium radiatolobatum) 균주를 배양 배지에서 26℃에서 10일 동안 배양하고, 배양된 페니실리움 라디아톨로바툼(Penicillium radiatolobatum) 균주가 포함된 배지를 증류수로 세척하여 잔류 배지 성분을 제거하고, 페니실리움 라디아톨로바툼의 순수한 균사체를, 증류수에서 26℃에서 72시간 동안 180rpm의 교반을 가하면서 추가 배양하고, Whatman No.1 여과지를 이용해 여과하여, 페니실리움 라디아톨로바툼이 포함되지 않은 PRE 무세포 배양 여액(페니실리움 라디아톨로바툼 추출물(PRE))을 얻는 것일 수 있다.
물론, 상기 PRE 제조 단계(S10)가 배양 단계(S11), 세척 단계(S12), PRE 무세포 배양 여액 제조 단계(S13) 모두를 포함하는 것은 아니며, 상기 PRE 제조 단계(S10)는 페니실리움 라디아톨로바툼(Penicillium radiatolobatum) 균주로부터 추출물을 얻는 다양한 방법을 포함할 수 있을 것이다.
다음으로, PRE-AgNPs 형성 단계(S20)를 수행한다.
상기 PRE-AgNPs 형성 단계(S20)에서는, 상기 PRE 제조 단계(S10)에서 제조된 페니실리움 라디아톨로바툼 추출물(PRE)을 AgNO3 수용액과 혼합하고 반응시켜, 은나노입자가 형성된 혼합물을 제조한다.
상기 PRE-AgNPs 형성 단계(S20)에서는 상기 PRE 제조 단계(S10)에서 제조된 페니실리움 라디아톨로바툼 추출물(PRE)을 AgNO3 수용액과 혼합하고 24 ~ 28℃에서 12 ~ 36시간 동안 반응시켜, 은나노입자가 형성된 혼합물을 제조하는 것이 적절하다.
가장 바람직하게, 상기 PRE-AgNPs 형성 단계(S20)에서는 상기 PRE 제조 단계(S10)에서 제조된 페니실리움 라디아톨로바툼 추출물(PRE)을 AgNO3 수용액과 혼합하고 26℃에서 24시간 동안 반응시켜, 은나노입자가 형성된 혼합물을 제조하는 것이 적절할 것이다.
다음으로, PRE-AgNPs를 수집 단계(S30)를 수행한다.
상기 PRE-AgNPs를 수집 단계(S30)에서는, 상기 PRE-AgNPs 형성 단계(S20)의 은나노입자가 형성된 혼합물을 원심분리하고 세척하여, PRE-AgNPs를 수집한다.
상기 PRE-AgNPs를 수집 단계(S30)에서는 PRE-AgNPs 형성 단계(S20)의 은나노입자가 형성된 혼합물을 10000~ 14000rpm의 속도로 5 ~ 15분간 원심분리하고 세척하여, PRE-AgNPs를 수집하는 것이 적절하다.
가장 바람직하게, 상기 PRE-AgNPs를 수집 단계(S30)에서는 PRE-AgNPs 형성 단계(S20)의 은나노입자가 형성된 혼합물을 12000rpm의 속도로 10분간 원심분리하고 증류수로 세척하여, PRE-AgNPs를 수집하는 것이 적절할 것이다.
또한, 본 발명은 상기 제조방법을 통해 제조된, 페니실리움 라디아톨로바툼 추출물을 이용한 은나노입자를 제공한다.
본 발명에 따른 페니실리움 라디아톨로바툼 추출물을 이용한 은나노입자는 페니실리움 라디아톨로바툼(Penicillium radiatolobatum) 균주를 이용하여 제조된 페니실리움 라디아톨로바툼 추출물(PRE)에, AgNO3 수용액을 혼합한 혼합물을, 배양하고, 원심분리하고, 세척하여 수집된 것을 특징으로 한다.
상기 페니실리움 라디아톨로바툼 추출물을 이용한 은나노입자에 있어서, 상기 페니실리움 라디아톨로바툼 추출물(PRE)은 페니실리움 라디아톨로바툼(Penicillium radiatolobatum) 균주가 배양 배지에서 24 ~ 28℃에서 7 ~ 14일 동안 배양된 것을 이용한 것일 수 있다.
상기 페니실리움 라디아톨로바툼 추출물을 이용한 은나노입자에 있어서, 상기 페니실리움 라디아톨로바툼 추출물(PRE)은 배양된 페니실리움 라디아톨로바툼(Penicillium radiatolobatum) 균주가 포함된 배지를 증류수로 세척하여 잔류 배지 성분을 제거된 것을 이용한 것일 수 있다.
상기 페니실리움 라디아톨로바툼 추출물을 이용한 은나노입자에 있어서, 상기 페니실리움 라디아톨로바툼 추출물(PRE)은 페니실리움 라디아톨로바툼의 순수한 균사체를, 증류수에서 24 ~ 28℃에서 72시간 동안 180rpm의 교반을 가하면서 추가 배양하고, 여과하여 얻어진 PRE 무세포 배양 여액인 것일 수 있다.
또한, 상기 페니실리움 라디아톨로바툼 추출물을 이용한 은나노입자는, 상기 페니실리움 라디아톨로바툼 추출물(PRE)을 AgNO3 수용액과 혼합하고 24 ~ 28℃에서 12 ~ 36시간 동안 반응시킨 것이 적절하다.
또한, 상기 페니실리움 라디아톨로바툼 추출물을 이용한 은나노입자는, 상기 페니실리움 라디아톨로바툼 추출물(PRE)에, AgNO3 수용액을 혼합한 혼합물을, 배양하고, 10000~ 14000rpm의 속도로 5 ~ 15분간 원심분리하고, 세척하여 수집된 것이 적절하다.
정리하자면, 본 발명에 따른 페니실리움 라디아톨로바툼 추출물을 이용한 은나노입자는, 페니실리움 라디아톨로바툼 균주를 배양 배지에서 24 ~ 28℃에서 7 ~ 14일 동안 배양하고, 배양된 페니실리움 라디아톨로바툼 균주가 포함된 배지를 증류수로 세척하여 잔류 배지 성분을 제거하고, 잔류 배지 성분을 제거한 페니실리움 라디아톨로바툼의 순수한 균사체를 증류수에서 24 ~ 28℃에서 72시간 동안 180rpm의 교반을 가하면서 추가 배양하고, 여과하여, 얻어진 PRE 무세포 배양 여액인 페니실리움 라디아톨로바툼 추출물(PRE)을 AgNO3 수용액과 혼합하고 24 ~ 28℃에서 12 ~ 36시간 동안 반응시킨 혼합물을, 배양하고, 10000~ 14000rpm의 속도로 5 ~ 15분간 원심분리하고, 증류수로 세척하여 수집한 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 페니실리움 라디아톨로바툼 추출물을 이용한 은나노입자는, 본 발명에 따른 제조방법과 같은 기술적 사상을 가지며, 본 발명의 제조방법에 따라 제조되는 것이 적절할 것이다.
이하, 본 발명에 따른 페니실리움 라디아톨로바툼 추출물을 이용한 은나노입자가 갖는 효과에 대하여 자세히 살펴본다.
1. 시료 제조
1.1. 실시예 1. 페니실리움 라디아톨로바툼 추출물을 이용한 은나노입자(PRE AgNPs)의 제조
하기 제조방법에 따라, 본 발명의 실시예 1에 따른 페니실리움 라디아톨로바툼 추출물을 이용한 은나노입자(PRE AgNPs)를 제조 하였다.
배양 단계(S11): 페니실리움 라디아톨로바툼 균주를 배양 배지에서 26℃에서 10일 동안 배양하였다.
세척 단계(S12): 상기 배양 단계(S11)를 수행한 다음, 배양된 페니실리움 라디아톨로바툼 균주가 포함된 배지를 증류수로 세척하여 잔류 배지 성분을 제거하였다.
PRE 무세포 배양 여액 제조 단계(S13): 상기 세척 단계(S12)를 수행한 다음, 페니실리움 라디아톨로바툼의 순수한 균사체를, 증류수에서 26℃에서 72시간 동안 180rpm의 교반을 가하면서 추가 배양하고, Whatman No.1 여과지를 이용해 여과하여, 페니실리움 라디아톨로바툼이 포함되지 않은 PRE 무세포 배양 여액을 얻었으며, 이를 페니실리움 라디아톨로바툼 추출물(PRE)이라 칭하였다.
PRE-AgNPs 형성 단계(S20): 상기 PRE 제조 단계(S10)에서 제조된 페니실리움 라디아톨로바툼 추출물(PRE)을 AgNO3 수용액과 혼합하고 26℃에서 24시간 동안 반응시켜, 은나노입자가 형성된 혼합물을 제조하는 것이 적절할 것이다.
PRE-AgNPs를 수집 단계(S30): PRE-AgNPs 형성 단계(S20)에서 은나노입자가 형성된 혼합물을 12000rpm의 속도로 10분간 원심분리하고 세척하여, PRE-AgNPs를 수집하였다.
1.2. 비교예 1. 페니실리움 라디아톨로바툼 추출물( PRE )의 제조
하기 제조방법에 따라, 본 발명의 비교예 1에 따른 페니실리움 라디아톨로바툼 추출물(PRE)을 제조하였다.
배양 단계(S11): 페니실리움 라디아톨로바툼 균주를 배양 배지에서 26℃에서 10일 동안 배양하였다.
세척 단계(S12): 상기 배양 단계(S11)를 수행한 다음, 배양된 페니실리움 라디아톨로바툼 균주가 포함된 배지를 증류수로 세척하여 잔류 배지 성분을 제거하였다.
PRE 무세포 배양 여액 제조 단계(S13): 상기 세척 단계(S12)를 수행한 다음, 페니실리움 라디아톨로바툼의 순수한 균사체를, 증류수에서 26℃에서 72시간 동안 180rpm의 교반을 가하면서 추가 배양하고, Whatman No.1 여과지를 이용해 여과하여, 페니실리움 라디아톨로바툼이 포함되지 않은 PRE 무세포 배양 여액을 얻었으며, 이를 페니실리움 라디아톨로바툼 추출물(PRE)이라 칭하였다.
1.3. 비교예 2 내지 8. 다른 종의 Penicillium sp . 균주 추출물을 이용한 은나노입자(PRE AgNPs )의 제조
P. italicum, P. oxalicum, P. polonicum, P. aculeatum, P. chrysogenum, P. crustosum, P. decumbens 균주에 대해, 실시예 1과 동일한 방법을 적용하여, 은나노입자(AgNPs)를 제조하였다.
2. 실험 방법
2.1. 은 나노 입자의 특성 확인
제조된 PRE-AgNPs는 200-700 nm 스펙트럼 범위에서 UV-가시광선 분광광도계(SpectraMax®ABS Plus Microplate Reader, Molecular Devices)를 사용하여 측정했다.
PRE-AgNPs의 표면 전하 및 입자 크기는 제타 크기 분석기(Malvem Mastersizer 2000, UK)로 분석되었다.
PRE-AgNPs의 순도와 결정성은 5에서 85도 범위의 2θ각도에서 X선 회절(XRD, X'pert-pro MPD-PAN analysis, Netherland)에 의해 측정되었다.
PRE-AgNPs의 합성은 Fourier transforminfrared spectroscopy(FT-IR PerkinElmer Paragon 500, USA)로 관찰하였다.
투과전자현미경(TEM, JEOL-JSM 1200EX, Japan)을 사용하여 PRE-AgNP의 형태와 입자 크기를 조사했으며, 원소 분석을 위해 EDS(Energy-dispersive X-ray Spectra)를 이용하였다.
2.2. 항균 효과 확인
PRE-AgNPs의 항균 효과는 Bacillus cereus (ATCC 14579), Staphylococcus aureus (ATCC 19095), Escherichia coli (ATCC 43888), Salmonella enterica (ATCC 14028) 및 Listeria monocytogenes와 같은 5개의 표적 병원성 박테리아에서 테스트되었다.
웰 확산 방법에 의해. 병원균을 MHB에서 배양하고 37℃에서 12시간 동안 배양하였다. 그 후, MHA 플레이트에 멸균 면봉을 사용하여, 세균 배양(50μL)을 확장했다. sterile steel borer(직경 6mm)를 사용하여 각 플레이트에 총 5개의 웰을 만들었다. 40 μL의 다른 농도의 PRE-AgNPs(0.1mg/mL(a), 0.2mg/mL(b), 0.5mg/mL(c), 1.0mg/mL(d), 0.02mg/mL(e))를 삼중으로 로딩하고 표준 약물 테트라사이클린 염산염(0.02 mg/mL)을 양성 대조군으로 사용했다. 그런 다음 플레이트를 37℃의 인큐베이터에 넣고 24시간 배양 후 억제 영역을 측정했다.
또한, 투과전자현미경(TEM)을 이용하여 대조군 세포와 PRE-AgNPs 처리 세포를 확인하였다. S. enterica(그람-음성) 및 S. aureus(그람-양성) 배양물은 상기와 같은 조건에서 별도로 준비하였다. 또한, 두 박테리아 세포 모두 100 μL의 PRE-AgNPs(1 mg/mL)로 처리하였고, 처리되지 않은 박테리아를 대조군으로 취하였다. 그런 다음 박테리아 샘플을 24시간 동안 진탕 배양기(37 ± 2℃에서 140rpm)에 두었다. 인큐베이션 후, 박테리아 현탁액을 4000rpm에서 5분 동안 원심분리하고, 상등액을 제거하고 박테리아 세포를 수확하였다. 세포 펠렛을 글루타르알데히드(4% v/v)로 2시간 동안 고정하고 아세톤(70%)으로 탈수시켰다. 마지막으로, 그람 음성 및 그람 양성 박테리아에 대한 PRE-AgNPs의 항균 활성을 TEM 현미경 사진에서 확인했다.
2.3. 세포 독성 분석
PRE 및 PRE-AgNPs의 세포독성을 HEK293 및 A549 세포에서 테스트했다. 세포 배양 배지는 이전에 10%의 FBS(HyClone Laboratories, USA)와 1%의 페니실린 및 스트렙토마이신 용액으로 보충되었고 본 발명에 사용되었다.
HEK293 및 A549 세포를 가습된 5% CO2 분위기에서 DMEM(HyClone Laboratories, USA) 및 RPMI(Gibco, USA) 배지에서 각각 배양하였다. 적절한 confluence에 도달한 후, 세포(1.9 × 105)를 96웰 플레이트에 별도로 첨가하고 상기 언급된 조건에서 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 그런 다음, 다양한 농도의 PRE/PRE-AgNPs를 밤새 처리했다. 마지막으로 WST 용액(10μL)을 각 웰에 첨가하고 다시 37℃의 CO2 인큐베이터에서 2시간 동안 인큐베이션했다. 그런 다음, 450 nm에서 흡광도를 측정하여 세포 독성의 백분율을 계산했다. Acridine orange-ethidium bromide(AO/EB) 염색은 핵 변이와 세포자멸사 단계를 결정하는 데 사용되었다. DCFH-DA 염색을 사용하여 A549 세포에서 PRE 및 PRE-AgNPs 유도된 ROS 생성을 관찰했다. 이 모든 실험은 삼중으로 수행되었다.
3. 결과 및 논의
3.1. 육안 관찰 및 UV 분광광도법
육안 관찰에서 3mM의 AgNO3 수용액에 P. radiatolobatum 추출물(PRE)을 첨가하면 밝은 노란색에서 짙은 갈색으로 변하는 반면 대조 반응에서는 색상 변화가 관찰되지 않는 것으로 확인되었다(도 1a). 이 결과는 PRE가 표면 플라즈몬 공명의 영향으로 인해 은 이온을 PRE-AgNPs로 환원시키는 것과 관련이 있음을 나타낸다.
다음으로, PRE-AgNPs의 합성은 다른 시간 간격에서 200에서 700 nm 범위의 흡수 스펙트럼으로 측정되었다. PRE-AgNPs의 UV 스펙트럼 최대 흡수 피크는 410-420nm 범위에서 발견되었다(도 1a).
3.2. 제타 전위 크기 분석
도 1b 및 c는, PRE-AgNP의 경우 -22.2 ± 0.87 mV 및 72.04 nm의 평균 제타 전위와 크기를 보여준다. 제타 전위의 음수 값은 Penicillium의 폴리페놀 화합물의 캡핑으로 인한 것이다. PRE-AgNPs 표면에 DLS 결과는 다분산 지수(PDI)가 0.143인 단일 피크를 통해 잘 분산된 콜로이드성 PRE-AgNP를 나타낸다. 크기가 200 nm 미만이고 PDI가 0.5 미만이면 생물치료제 적용에 유리하다고 알려져 있다. 유사하게, PRE-AgNPs의 크기와 PDI는 200 nm 미만 및 0.5 미만의 PDI로 밝혀져 생의학 응용에 우호적이다.
3.3. XRD 분석
XRD 분석 결과는 PR-AgNPs의 면심 입방 결정 구조를 나타낸다. 이 XRD 데이터는 분말 회절 표준에 관한 합동 위원회(JCPDS 파일 번호 04-0783)와 일치했다. 유사한 XRD 패턴이 AgNP를 매개하는 여러 곰팡이 추출물에 대해서도 보고된 바 있다.
3.4. FT - IR 분석
FT-IR 분석은 PRE-AgNPs의 제작 메커니즘에 대한 설명을 보여준다. PRE와 PRE-AgNP의 스펙트럼 사이에서 밴드의 이동이 관찰되었다.
FT-IR 스펙트럼에서 PRE는 3270.60, 2921.21, 1597.76, 1408.29, 1354.95, 1100.16, 1072.46 및 1008.22cm -1 에서 주요 피크를 나타낸다(도 2b). PRE-AgNPs의 FT-IR 스펙트럼은 3246.92, 2924.08, 1590.80, 1354.56, 1074.78 및 1020.00cm-1에서 광범위하고 강렬한 진동을 나타냈다. 또한, PRE-AgNPs의 FTIR 결과는 PRE-AgNPs의 합성에서 PRE로부터 유래된 단백질 및 알킨(3246.92, 2924.08, 1590.80cm-1) 등을 포함하는 다양한 기능적 분자와의 관련성을 나타내었다.
3.5. TEM 및 EDS 분석
PRE-AgNPs의 크기와 형태는 TEM에 의해 조사되었다(도 3a-c). TEM 현미경 사진은 크기가 5.09에서 14.85 nm 범위인 이방성(anisotropic) PRE-AgNP의 존재를 나타낸다. 게다가, TEM 현미경 사진은 대부분의 PRE-AgNPs가 구형이고 삼각형과 육각형은 거의 없음을 입증했다.
또한, EDS 분석은 PRE-AgNPs에서 Ag의 존재를 나타내었다(도 3d). 그러나 PREAgNPs의 크기는 P. citrinum CGJ-C1 매개 AgNPs보다 더 컸다. NP의 크기, 모양 및 분산은 미생물 균주의 사용 및 방법에 따라 달라질 수 있다. DLS보다 TEM에서 PRE AgNPs의 더 작은 크기는 수성 매질에서 NP의 유체역학적 크기로 인한 것으로 보인다.
3.6. 항균 효과 분석
은 나노 입자의 높은 표면적과 독특한 화학 및 물리적 특성은 다양한 약물 내성 박테리아 및 곰팡이 병원체에 대해 강력한 항균 활성을 나타낸다. PRE-AgNPs는 다양한 병원선 박테리아 종에 대해 농도 의존적으로 억제 영역(ZoI)을 나타냈다(도 4 및 표 1). 하기 표 1은, 웰 확산법에서 따른, PRE-AgNPs에 의한 각 균주의 억제영역을 분석한 표다.
Bacterial strain Concentration of PRE-AgNPs (mg/mL) Tetracycline
(0.02mg/mL)
0.1 0.2 0.5 1
B. cereus 8.2 ±0.25 10.2 ±0.25 12.9 ±0.15 14.7 ±0.36 18.0 ±0.25
E. coli 12.0 ±0.25 13.0 ±0.15 16.3 ±026 19.0 ±0.30 22.0 ±0.20
S. aureus 18.9 ±0.25 20.1 ±0.36 21.9 ±0.05 25.1 ±0.32 27.2 ±0.20
L. monocytogenes 10.3 ±0.81 11.0 ±0.25 14.9 ±0.35 17.8 ±0.41 23.0 ±0.30
S. enterica 20.0 ±0.25 21.9 ±0.25 22.9 ±0.20 25.0 ±0.15 28.0 ±0.15
시험된 PRE AgNPs 농도(0.1-1 mg/mL)는 B. cereus의 경우 8.2 ±0.25 ~ 4.7 ±0.36mm, E. coli의 경우 12.0 ±0.25 ~ 19.0 ±0.30mm, S. aureus의 경우 18.9 ±0.25 ~ 25.1 ±0.32mm, L. monocytogenes의 경우 10.3 ±0.81 mm ~ 17.8 ±0.41 mm, S. enterica 의 경우, 20.0 ±0.25 ~ 25.0 ±0.15의 억제 범위가 관찰되었다.
또한, PRE AgNPs는 B. cereus, E. coli 및 L. monocytogenes 보다 S. aureus 및 S. enterica의 성장을 더 억제하였다.
나노 입자의 크기가 작을수록 그람 양성 및 그람 음성 세균 병원체에 대한 항균 활성에 유리한 더 높은 표면적을 제공한다. PRE-AgNPs는 <100 nm 크기로 형성되어, 박테리아 세포에서 더 높은 세포 침투를 가능하게 하고 박테리아 세포벽 손상을 유도한다.
다양한 Penicillium 종을 이용하여, 실시예 1과 같은 제조방법을 적용해 은나노 입자를 형성해 보았다(비교예 2 내지 8). 유사하게, 다양한 Penicillium 종을 통해 합성된 은나노입자들은 유망한 항균 활성을 보였다(표 2). 표 2는 Penicillium 종 추출물을 이용한 은나노입자의 크기 및 생물학적 활성에 관한 것을 나타낸다. 그중에서도, 페니실리움 라디아톨로바툼 추출물을 이용한 은나노입자가 가장 작은 평균 직경을 가질 수 있음을 확인하였다.
Name of Penicillium sp Size (nm) Shape Pharmacological Activity
AgNPs
P. italicum 32-100 spherical ND (antimicrobial and cytotoxicity)
P. oxalicum 60-80 spherical Antibacterial
P. polonicum 20-25 spherical MIC 156 μg/ mL
P. aculeatum 14-55 spherical IC50 4873 μg/mL (A549) cells
P. chrysogenum 55-60 spherical IC50 35108 and 43532 μg/ mL
P. crustosum 30-40 spherical to oval MIC 086 μg/mL and 065 μg/mL
P. decumbens 30-60 spherical IC50 80 μg/mL (24 h), 60 μg/mL (48 h)
P. radiatolobatum 5.09-24.85 spherical and hexagonal Antibacterial; non cytotoxic to HEK293 cell, IC50 1967 ± 309 μg/ mL for A549 cells
한편, 본 발명은, 도 5에 도시된 바와 같이, 메티실린 내성 S. enterica 및 S. aureus 종과 같이, 다양한 약제에 대한 내성을 갖는 박테리아 병원체에 대한 PRE AgNPs의 항균 활성을 확인했다. TEM 분석을 사용하여 S. enterica 및 S. aureus 세포 손상에 대한 PRE-AgNPs의 영향을 연구했다(도 5a-f). 처리되지 않은 세포(대조군)의 TEM 이미지는 전자 밀도가 높은 박테리아 세포질 물질을 둘러싸고 있는 온전한 막의 구조를 보여주었다(도 5a 및 d). 한편, 세포 외피 손상과, 세포 외부의 세포질 물질 누출이 PRE-AgNP를 통해 처리된 세포에서 발견되었다(도 5b-c 및 e-f). 그러나 각 박테리아의 대사 및 형태학적 특성은 AgNP에 대한 반응을 결정한다. 박테리아 사멸에서 PRE-AgNPs의 메커니즘은 세포벽에 기인할 수 있고 원형질막 손상은 막에 존재하는 단백질의 비활성화 및 지질의 과산화일 수 있다. 막 구조적 완전성에 대한 손상은 대사 교대 및 칼륨 누출을 통해 박테리아 세포 사멸을 유발할 수 있다.
3.7. 세포독성 분석
PRE 및 PRE-AgNPs의 생체 적합성 및 세포 독성은 WST cell viability assay 를 사용하여 HEK293(정상 세포) 및 A549(암세포)에서 테스트되었다.
HEK293(정상 세포)에 대한 결과는 PRE AgNPs는, 세포독성 및 광학현미경 및 AO/EB 염색 분석에 의해, HEK293 세포에 대해서는 어떠한 세포독성도 나타내지 않음을 나타내었다(도 6). 더 높은 농도의 PRE-AgNPs(120μg/mL)조차도 HEK293 세포에 주목할만한 세포독성을 나타내지 않았다. PRE-AgNPs의 무독성은 현미경 이미지와 형광성 AO/EB 염색 검사에 의해 확인되었다(Fig. 6b & c). 도 6c에서 처리된 PRE-AgNPs(120㎍/mL)가 더 적은 초기 세포자멸사 세포를 나타내었다는 것을 관찰하였다. NPs의 낮은 세포독성 특성은 잠재적인 생물학적 적용에 의존한다.
또한, 인간 폐암 세포주(A549)에 대한 결과는 PRE 및 PRE-AgNP가 각각 56.34 ± 1.85 및 19.67 ± 3.09 μg/mL의 IC50으로 나타나, 용량 의존적 항암 활성을 가질 수 있는 것으로 나타났다(도 7a). 또한, DCFH-DA 형광 염색을 사용하여 PRE/PRE-AgNPs의 세포 내 ROS(Reactive oxygen species) 유도 가능성을 면밀히 조사했다. 예상대로 PRE-AgNPs 처리된 세포에서 ROS 생성 수준이 향상되었다(형광 강도 증가). 반면 대조군 세포에서는 형광 강도가 낮았다(도 7b). 곰팡이 대사 산물은 A549 세포에서 세포 내 ROS를 유도할 가능성이 있음이 밝혀졌다. 한편, AO/EB 염색은 A549 세포에서 PRE 및 PREAgNPs의 세포자멸사 유도 가능성을 조사하기 위해 사용되었다. PRE AgNPs의 IC50 용량은 암 세포에서 세포 사멸 메커니즘을 유발할 수 있다(도 7c). 대조군의 세포는 잘 조직된 암세포 구조를 가진 짙은 녹색으로 나타났다. 한편, 오렌지색 내지 붉은색의 암세포는 분열되거나 응축된 것이다(도 7d).
4. 결론
전반적으로, PRE/PRE-AgNP는 비암성 세포에서 우수한 생체 적합성을 나타낸다. 폐암 세포의 경우 암세포에서 ROS 유도 세포 사멸 메커니즘을 유발한다. 유사하게, Penicillium sp.에서 합성된 AgNPs는 A549 세포, 3T3-L1, Hep-G2 암세포주와 같은 다양한 세포주에 세포독성을 보였다.
다양한 Penicillium sp.으로부터 유도된 AgNPs 중에서, PRE-AgNPs는 가장 작은 직경을 가진 것으로 나타나, A549 세포에 대한 세포독성을 유도하는데 더욱 유망할 것으로 보인다. 본 발명에 따른 PRE-AgNPs는 A549 세포주에서 미토콘드리아 매개 세포자멸사와 관련된 산화 스트레스를 유발할 수 있다. 그러나 세포 사멸을 유도하는 PRE-AgNPs의 정확한 메커니즘은 향후 연구에서 탐구될 것이다.
이에 본 발명은 페니실리움 라디아톨로바툼(Penicillium radiatolobatum) 균주를 이용하여 제조된 페니실리움 라디아톨로바툼 추출물(PRE)에, AgNO3 수용액을 혼합한 혼합물을, 배양하고, 원심분리하고, 세척하여 수집된 것을 특징으로 하며, PRE로부터 유래된 단백질 및 알킨을 포함하는 유효물질로 캡핑되고, 종래의 나노입자에 비해 작은 직경을 가져, 병원성 세균에 대한 항균 효과, 및, 암세포에 대한 세포 사멸 효과가 우수한 신규한 나노입자로서, 페니실리움 라디아톨로바툼 추출물을 이용한 은나노입자를 개발하였음을 명시한다.
본 발명을 첨부된 도면과 함께 설명하였으나, 이는 본 발명의 요지를 포함하는 다양한 실시 형태 중의 하나의 실시 예에 불과하며, 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 하는 데에 그 목적이 있는 것으로, 본 발명은 상기 설명된 실시예에만 국한되는 것이 아님은 명확하다. 따라서, 본 발명의 보호범위는 하기의 청구범위에 의해 해석되어야 하며, 본 발명의 요지를 벗어나지 않는 범위 내에서 변경, 치환, 대체 등에 의해 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 기술 사상은 본 발명의 권리에 포함될 것이다. 또한, 도면의 일부 구성은 구성을 보다 명확하게 설명하기 위한 것으로 실제보다 과장되거나 축소되어 제공되는 것임을 명확히 한다.
(S10): PRE 제조 단계
(S11): 배양 단계
(S12): 세척 단계
(S13): PRE 무세포 배양 여액 제조 단계
(S20): PRE-AgNPs 형성 단계
(S30): PRE-AgNPs를 수집 단계

Claims (12)

  1. 페니실리움 라디아톨로바툼(Penicillium radiatolobatum) 균주를 이용하여 페니실리움 라디아톨로바툼 추출물(PRE)을 제조하는 PRE 제조 단계(S10);
    상기 PRE 제조 단계(S10)에서 제조된 페니실리움 라디아톨로바툼 추출물(PRE)을 AgNO3 수용액과 혼합하고 배양하여, 은나노입자가 형성된 혼합물을 제조하는 PRE-AgNPs 형성 단계(S20); 및
    상기 PRE-AgNPs 형성 단계(S20)의 은나노입자가 형성된 혼합물을 원심분리하고 세척하여, PRE-AgNPs를 수집하는 PRE-AgNPs를 수집 단계(S30);를 포함하는 것을 특징으로 하는 페니실리움 라디아톨로바툼 추출물을 이용한 은나노입자의 제조방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 PRE 제조 단계(S10)는, 상기 페니실리움 라디아톨로바툼 추출물(PRE)은 페니실리움 라디아톨로바툼(Penicillium radiatolobatum) 균주를 배양 배지에서 24 ~ 28℃에서 7 ~ 14일 동안 배양하는 배양 단계(S11)를 포함하는 것을 특징으로 하는 페니실리움 라디아톨로바툼 추출물을 이용한 은나노입자의 제조방법.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 PRE 제조 단계(S10)는, 상기 배양 단계(S11)를 수행한 다음, 배양된 페니실리움 라디아톨로바툼(Penicillium radiatolobatum) 균주가 포함된 배지를 증류수로 세척하여 잔류 배지 성분을 제거하는 세척 단계(S12)를 포함하는 것을 특징으로 하는 페니실리움 라디아톨로바툼 추출물을 이용한 은나노입자의 제조방법.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 PRE 제조 단계(S10)는, 상기 세척 단계(S12)를 수행한 다음, 페니실리움 라디아톨로바툼의 순수한 균사체를, 증류수에서 24 ~ 28℃에서 48 ~ 96시간 동안 160 ~ 200rpm의 교반을 가하면서 추가 배양하고, 여과하여, PRE 무세포 배양 여액을 얻는 PRE 무세포 배양 여액 제조 단계(S13)를 포함하는 것을 특징으로 하는 페니실리움 라디아톨로바툼 추출물을 이용한 은나노입자의 제조방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 PRE-AgNPs 형성 단계(S20)에서는 상기 PRE 제조 단계(S10)에서 제조된 페니실리움 라디아톨로바툼 추출물(PRE)을 AgNO3 수용액과 혼합하고 24 ~ 28℃에서 12 ~ 36시간 동안 반응시켜, 은나노입자가 형성된 혼합물을 제조하는 것을 특징으로 하는 페니실리움 라디아톨로바툼 추출물을 이용한 은나노입자의 제조방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 PRE-AgNPs를 수집 단계(S30)에서는 PRE-AgNPs 형성 단계(S20)의 은나노입자가 형성된 혼합물을 10000~ 14000rpm의 속도로 5 ~ 15분간 원심분리하고 세척하여, PRE-AgNPs를 수집하는 것을 특징으로 하는 페니실리움 라디아톨로바툼 추출물을 이용한 은나노입자의 제조방법.
  7. 페니실리움 라디아톨로바툼(Penicillium radiatolobatum) 균주를 이용하여 제조된 페니실리움 라디아톨로바툼 추출물(PRE)에, AgNO3 수용액을 혼합한 혼합물을, 배양하고, 원심분리하고, 세척하여 수집된 것을 특징으로 하는 페니실리움 라디아톨로바툼 추출물을 이용한 은나노입자.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 페니실리움 라디아톨로바툼 추출물(PRE)은 페니실리움 라디아톨로바툼(Penicillium radiatolobatum) 균주가 배양 배지에서 24 ~ 28℃에서 7 ~ 14일 동안 배양된 것을 이용한 것을 특징으로 하는 페니실리움 라디아톨로바툼 추출물을 이용한 은나노입자.
  9. 제7항에 있어서,
    상기 페니실리움 라디아톨로바툼 추출물(PRE)은 배양된 페니실리움 라디아톨로바툼(Penicillium radiatolobatum) 균주가 포함된 배지를 증류수로 세척하여 잔류 배지 성분을 제거된 것을 이용하는 것을 특징으로 하는 페니실리움 라디아톨로바툼 추출물을 이용한 은나노입자.
  10. 제7항에 있어서,
    상기 페니실리움 라디아톨로바툼 추출물(PRE)은 페니실리움 라디아톨로바툼의 순수한 균사체를, 증류수에서 24 ~ 28℃에서 72시간 동안 180rpm의 교반을 가하면서 추가 배양하고, 여과하여 얻어진 PRE 무세포 배양 여액인 것을 특징으로 하는 페니실리움 라디아톨로바툼 추출물을 이용한 은나노입자.
  11. 제7항에 있어서,
    상기 페니실리움 라디아톨로바툼 추출물(PRE)을 AgNO3 수용액과 혼합하고 24 ~ 28℃에서 12 ~ 36시간 동안 반응시킨 것을 특징으로 하는 페니실리움 라디아톨로바툼 추출물을 이용한 은나노입자.
  12. 제7항에 있어서,
    상기 페니실리움 라디아톨로바툼 추출물(PRE)에, AgNO3 수용액을 혼합한 혼합물을, 배양하고, 10000~ 14000rpm의 속도로 5 ~ 15분간 원심분리하고, 세척하여 수집된 것을 특징으로 하는 페니실리움 라디아톨로바툼 추출물을 이용한 은나노입자.

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