KR102594710B1 - Biomarker composition of low-dose radiation specific DNA methylation and uses thereof - Google Patents
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Abstract
본 발명은 저선량 방사선 특이적 DNA 메틸화 바이오마커 조성물 및 이의 용도에 관한 것으로, 저선량 방사선에 유도되는 유전자 프로모터의 DNA 메틸화 변화 여부를 활용한 저선량 방사선 노출 여부 진단 용도에 대한 것이다. 본 발명에 따르면 2종의 유전자(PGRMC1와 UNC119B)의 프로모터 부위에 존재하는 CpG 섬 영역에서 저선량 방사선에 의해 특이적으로 DNA 메틸화되는 현상은 정상 혈관 내피세포(대동맥 내피세포)에서 저선량 방사선이 노출되었을 때 특이적으로 일어나는 것으로 확인되며, 이를 이용하면 저선량 방사선 노출의 여부 결정 및 취약군(심혈관 질환 및 순환기 계통 질환)에서의 저선량 방사선(생활 주변 방사선) 노출 및 이에 대한 위험도 예측에 효과적으로 적용될 수 있다. The present invention relates to a low-dose radiation-specific DNA methylation biomarker composition and its use, and to the use of diagnosing low-dose radiation exposure using changes in DNA methylation of gene promoters induced by low-dose radiation. According to the present invention, the phenomenon of specific DNA methylation caused by low-dose radiation in the CpG island region present in the promoter region of two genes ( PGRMC1 and UNC119B ) occurs when normal vascular endothelial cells (aortic endothelial cells) are exposed to low-dose radiation. It is confirmed that this occurs specifically when using this, and can be effectively applied to determine whether or not to be exposed to low-dose radiation and to predict the exposure and risk of low-dose radiation (radiation around daily life) in vulnerable groups (cardiovascular disease and circulatory system disease).
Description
본 발명은 저선량 방사선 특이적 DNA 메틸화 바이오마커 조성물 및 이의 용도에 관한 것으로, 저선량 방사선에 유도되는 유전자 프로모터의 DNA 메틸화 변화 여부를 활용한 저선량 방사선 노출 여부 진단 용도에 대한 것이다.The present invention relates to a low-dose radiation-specific DNA methylation biomarker composition and its use, and to the use of diagnosing low-dose radiation exposure using changes in DNA methylation of gene promoters induced by low-dose radiation.
후성 유전학은 생물학 분야에서 광범위하게 연구되고 있다. 이는 특히 주로 DNA 메틸화, miRNA 또는 아세틸화, 메틸화, 인산화 또는 유비퀴틴화 등과 같은 히스톤 변이를 통한 유전자 발현 조절을 다룬다. 이 중 DNA 메틸화는 가장 연구가 많이 된 포유류 내 후성적 변이이다. 후성적 과정에 대한 조절 이상은 유전자 기능 변이 및 종양 세포로의 변화를 초래할 수 있다. DNA 메틸화는 종양에서 잘 확립된 역할을 포함하는 인체 질환 내 전사 유전자 발현 억제와 연관되어 있는 것으로 알려져 있고, 최근에는 DNA 메틸화 측정을 통하여 암을 포함한 여러 질병을 진단하는 방법들이 다양하게 제시되고 있다.Epigenetics is being studied extensively in the field of biology. It specifically deals with the regulation of gene expression, mainly through DNA methylation, miRNA or histone modifications such as acetylation, methylation, phosphorylation or ubiquitination. Among these, DNA methylation is the most studied epigenetic modification in mammals. Dysregulation of epigenetic processes can lead to gene function mutations and transformation into tumor cells. DNA methylation is known to be associated with the repression of transcriptional gene expression in human diseases, including a well-established role in tumors, and recently, various methods have been proposed to diagnose various diseases, including cancer, by measuring DNA methylation.
DNA 메틸화는 주로 특정 유전자의 프로모터 부위의 CpG 섬(CpG island)의 사이토신(cytosine)에서 일어나고, 그로 인하여 전사인자의 결합이 방해를 받게 되어 특정 유전자의 발현이 차단(gene silencing)되는 것으로, 코딩서열(coding sequence)에 돌연변이가 없이도 그 유전자의 기능이 소실되는 주요 기전이다. 암을 포함한 다양한 질병들에서 CpG 섬에서의 이러한 비정상적인 메틸화/탈메틸화가 보고되었으며, 질병 관련 유전자의 프로모터 메틸화를 조사하여 각종 질환의 진단에 사용하려는 시도가 활발하게 이루어지고 있다. DNA methylation mainly occurs at the cytosine of the CpG island in the promoter region of a specific gene, which interferes with the binding of transcription factors and blocks the expression of a specific gene (gene silencing). This is the main mechanism by which the function of a gene is lost without a mutation in the coding sequence. Abnormal methylation/demethylation at CpG islands has been reported in various diseases, including cancer, and attempts are being made to investigate promoter methylation of disease-related genes and use it for diagnosis of various diseases.
한편, 현재 많은 연구자들이 저선량 범위의 방사선에서도 정확한 생체 측정 지표를 찾고 있지만, 일반적으로 적용되는 표준 방법은 없는 실정이다. Meanwhile, many researchers are currently looking for accurate biometric indicators even in the low-dose range of radiation, but there is no generally applicable standard method.
본 발명의 목적은 PGRMC1 및 UNC119B로 이루어진 그룹에서 선택된 어느 하나 이상의 유전자의 메틸화된 CpG 섬(CpG island) 영역을 포함하는 저선량 방사선 노출 여부 진단용 바이오마커 조성물을 제공하는데 있다.The purpose of the present invention is to provide a biomarker composition for diagnosing low-dose radiation exposure, including the methylated CpG island region of one or more genes selected from the group consisting of PGRMC1 and UNC119B .
또한, 본 발명의 다른 목적은 PGRMC1 및 UNC119B로 이루어진 그룹에 선택된 어느 하나 이상의 유전자의 CpG 섬 영역의 메틸화 수준을 측정할 수 있는 제제를 유효성분으로 포함하는 저선량 방사선 노출 여부 진단용 조성물 및 이를 포함하는 저선량 방사선 노출 여부 진단용 키트를 제공하는데 있다.In addition, another object of the present invention is to provide a composition for diagnosing exposure to low-dose radiation, which contains as an active ingredient an agent capable of measuring the methylation level of the CpG island region of one or more genes selected from the group consisting of PGRMC1 and UNC119B , and a low-dose radiation exposure composition containing the same. The goal is to provide a kit for diagnosing radiation exposure.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 PGRMC1 및 UNC119B로 이루어진 그룹에 선택된 어느 하나 이상의 유전자의 CpG 섬 영역의 메틸화 수준을 측정하는 단계를 포함하는 저선량 방사선 노출 여부 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공하는데 있다.In addition, another object of the present invention is to provide a method for providing information necessary for diagnosing exposure to low-dose radiation, which includes measuring the methylation level of the CpG island region of one or more genes selected from the group consisting of PGRMC1 and UNC119B . there is.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 PGRMC1 및 UNC119B로 이루어진 그룹에서 선택된 어느 하나 이상의 유전자의 메틸화된 CpG 섬(CpG island) 영역을 포함하는 저선량 방사선 노출 여부 진단용 바이오마커 조성물을 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention provides a biomarker composition for diagnosing low-dose radiation exposure, including the methylated CpG island region of one or more genes selected from the group consisting of PGRMC1 and UNC119B .
또한, 본 발명은 PGRMC1 및 UNC119B로 이루어진 그룹에 선택된 어느 하나 이상의 유전자의 CpG 섬 영역의 메틸화 수준을 측정할 수 있는 제제를 유효성분으로 포함하는 저선량 방사선 노출 여부 진단용 조성물을 제공한다.In addition, the present invention provides a composition for diagnosing low-dose radiation exposure, which includes as an active ingredient an agent capable of measuring the methylation level of the CpG island region of one or more genes selected from the group consisting of PGRMC1 and UNC119B .
또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 저선량 방사선 노출 여부 진단용 키트를 제공한다.Additionally, the present invention provides a kit for diagnosing exposure to low-dose radiation, including the composition.
또한, 본 발명은 (1) 환자로부터 분리된 시료로부터 게놈 DNA를 수득하는 단계; (2) 상기 수득된 게놈 DNA에서 PGRMC1 및 UNC119B로 이루어진 그룹에 선택된 어느 하나 이상의 유전자의 CpG 섬 영역의 메틸화 수준을 측정하는 단계; 및 (3) 상기 측정된 유전자의 CpG 섬 영역의 메틸화 수준을 대조군 시료와 비교하는 단계를 포함하는 저선량 방사선 노출 여부 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.Additionally, the present invention includes the steps of (1) obtaining genomic DNA from a sample isolated from a patient; (2) measuring the methylation level of the CpG island region of one or more genes selected from the group consisting of PGRMC1 and UNC119B in the obtained genomic DNA; and (3) comparing the methylation level of the CpG island region of the measured gene with a control sample. It provides a method of providing information necessary for diagnosing exposure to low-dose radiation.
본 발명은 저선량 방사선 특이적 DNA 메틸화 바이오마커 조성물 및 이의 용도에 관한 것으로, 저선량 방사선에 유도되는 유전자 프로모터의 DNA 메틸화 변화 여부를 활용한 저선량 방사선 노출 여부 진단 용도에 대한 것이다. 본 발명에 따르면 2종의 유전자(PGRMC1와 UNC119B)의 프로모터 부위에 존재하는 CpG 섬 영역에서 저선량 방사선에 의해 특이적으로 DNA 메틸화되는 현상은 정상 혈관 내피세포(대동맥 내피세포)에서 저선량 방사선이 노출되었을 때 특이적으로 일어나는 것으로 확인되며, 이를 이용하면 저선량 방사선 노출의 여부 결정 및 취약군(심혈관 질환 및 순환기 계통 질환)에서의 저선량 방사선(생활 주변 방사선) 노출 및 이에 대한 위험도 예측에 효과적으로 적용될 수 있다. The present invention relates to a low-dose radiation-specific DNA methylation biomarker composition and its use, and to the use of diagnosing low-dose radiation exposure using changes in DNA methylation of gene promoters induced by low-dose radiation. According to the present invention, the phenomenon of specific DNA methylation caused by low-dose radiation in the CpG island region present in the promoter region of two genes ( PGRMC1 and UNC119B ) occurs when normal vascular endothelial cells (aortic endothelial cells) are exposed to low-dose radiation. It is confirmed that this occurs specifically when using this, and can be effectively applied to determine whether or not to be exposed to low-dose radiation and to predict the exposure and risk of low-dose radiation (radiation around daily life) in vulnerable groups (cardiovascular disease and circulatory system disease).
도 1A는 2종의 유전자 (PGRMC1과 UNC119B)의 전형적인 CpG 섬의 구조이며, 본 발명의 메틸레이션 검증을 위해 사용된 methylation specific PCR (MSP) 프라이머의 위치를 나타내고, 도 1B는 본 발명의 메틸화 검증을 위해 사용된 일반적인 MSP (conventional MSP) 방법을 통해 확인한 결과를 나타내고, 도 1C는 quantitative MSP (qMSP) 방법을 통해 검증한 결과를 나탄낸다.
도 2는 2종의 유전자 (PGRMC1과 UNC119B)의 전사적 발현을 Real-Time quantitative RT-PCR (qRT-PCR) 방법을 통해 분석한 결과를 나타낸다.
도 3은 2종의 유전자 (PGRMC1과 UNC119B)의 시퀀스 레벨에서 프로모터 메틸화 패턴 분석 결과를 나타낸다.
도 4는 PGRMC1 유전자의 프로모터 영역에 대한 ChIP 분석 결과를 나타낸다.
도 5는 UNC119B 유전자의 프로모터 영역에 대한 ChIP 분석 결과를 나타낸다.Figure 1A shows the structure of a typical CpG island of two genes ( PGRMC1 and UNC119B ) and shows the location of the methylation specific PCR (MSP) primer used for methylation verification of the present invention, and Figure 1B shows the methylation verification of the present invention. Shows the results confirmed through the general MSP (conventional MSP) method used for, and Figure 1C shows the results confirmed through the quantitative MSP (qMSP) method.
Figure 2 shows the results of analyzing the transcriptional expression of two genes ( PGRMC1 and UNC119B ) using Real-Time quantitative RT-PCR (qRT-PCR) method.
Figure 3 shows the results of promoter methylation pattern analysis at the sequence level of two genes ( PGRMC1 and UNC119B ).
Figure 4 shows the results of ChIP analysis for the promoter region of the PGRMC1 gene.
Figure 5 shows the results of ChIP analysis for the promoter region of the UNC119B gene.
본 발명은 PGRMC1 및 UNC119B로 이루어진 그룹에서 선택된 어느 하나 이상의 유전자의 메틸화된 CpG 섬(CpG island) 영역을 포함하는 저선량 방사선 노출 여부 진단용 바이오마커 조성물을 제공한다.The present invention provides a biomarker composition for diagnosing low-dose radiation exposure, including a methylated CpG island region of one or more genes selected from the group consisting of PGRMC1 and UNC119B .
본 발명에서 용어, "메틸화"는 특정 유전자의 프로모터 부위의 CpG 섬(CpG island)의 사이토신에서 일어나고, 그로 인하여 전사인자의 결합이 방해를 받게 되어 특정 유전자의 발현이 차단되는 것으로서, 본 발명의 목적상, 메틸화 여부는 PGRMC1 및 UNC119B 유전자로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 유전자의 프로모터 부위의 CpG 섬에서의 메틸화를 의미한다.In the present invention, the term "methylation" refers to the term "methylation" that occurs on the cytosine of the CpG island of the promoter region of a specific gene, thereby interfering with the binding of transcription factors and blocking the expression of a specific gene. For the purpose, methylation refers to methylation at the CpG island of the promoter region of one or more genes selected from the group consisting of PGRMC1 and UNC119B genes.
본 발명에서 용어, "CpG 섬(CpG island)"은 CpG가 예외적으로 높은 빈도로 모여 있는 게놈 영역을 의미하며, C+G 함유량이 50% 이상이고, CpG 비율이 3.75%이상인 0.2~3kb 길이의 부위를 말한다. 상기 CpG에서, C는 사이토신을, G는 구아닌을 나타내며 p는 사이토신과 구아닌과의 사이에 있는 포스포디에스테르 결합을 의미한다. 인간 게놈에는 약 45,000개의 CpG 섬이 있으며, 이들 대부분이 유전자의 발현을 조절하는 프로모터 부위에서 발견된다. 실제로, 상기 CpG 섬은 인간 유전자의 약 50%에 달하는 하우스키핑(housekeeping) 유전자의 프로모터에서 발견된다(Cross, S. and Bird, A., Curr. Opin. Gene Develop., 5:309, 1995). 정상인의 체세포에서, 상기 하우스키핑 유전자 프로모터 부위의 CpG 섬은 비메틸화되어 있으며, 임프린티드(imprinted) 유전자 및 비활성화 상태의 X 염색체 상의 유전자와 같이 발달과정 동안 발현되지 않는 유전자들은 메틸화되어 있다.In the present invention, the term "CpG island" refers to a genomic region where CpGs are gathered at an exceptionally high frequency, and is a 0.2 to 3 kb long CpG island with a C+G content of 50% or more and a CpG ratio of 3.75% or more. refers to the area In the CpG, C represents cytosine, G represents guanine, and p represents a phosphodiester bond between cytosine and guanine. There are approximately 45,000 CpG islands in the human genome, most of which are found in promoter regions that control gene expression. In fact, the CpG island is found in the promoters of housekeeping genes for approximately 50% of human genes (Cross, S. and Bird, A., Curr. Opin. Gene Develop., 5:309, 1995) . In normal human somatic cells, the CpG island in the housekeeping gene promoter region is unmethylated, and genes that are not expressed during development, such as imprinted genes and genes on the inactive X chromosome, are methylated.
포유동물 세포의 게놈 DNA에서는 A, C, G 및 T에 더하여, 사이토신 링(5-mC)의 다섯번째 탄소에 메틸 그룹이 부착된 5-메틸시토신(5-methylcytosine)이라는 5번째 염기가 존재한다. 5-mC는 CpG라고 불리는, CG 디뉴클레오티드(5'-mCG-3')의 C에만 부착된다. CpG의 C는 메틸 그룹의 접촉에 의하여 대부분 메틸화된다. CpG의 메틸화는 트랜스포존과 게놈의 반복서열이 발현되는 것을 억제한다. 또한, 상기 CpG는 포유동물 세포에서 대부분의 후생유전학적 변화가 자주 일어나는 부위이다. 상기 CpG의 5-mC가 자연적으로 탈아미노화하여 티민(T)이 되기 쉽기 때문이다.In the genomic DNA of mammalian cells, in addition to A, C, G, and T, there is a fifth base called 5-methylcytosine, which has a methyl group attached to the fifth carbon of the cytosine ring (5-mC). do. 5-mC is attached only to the C of the CG dinucleotide (5'-mCG-3'), called CpG. C of CpG is mostly methylated by contact with a methyl group. Methylation of CpG inhibits the expression of transposons and genomic repetitive sequences. Additionally, the CpG is the site where most epigenetic changes frequently occur in mammalian cells. This is because 5-mC of the CpG is prone to natural deamination to become thymine (T).
또한, 본 발명은 PGRMC1 및 UNC119B로 이루어진 그룹에 선택된 어느 하나 이상의 유전자의 CpG 섬 영역의 메틸화 수준을 측정할 수 있는 제제를 유효성분으로 포함하는 저선량 방사선 노출 여부 진단용 조성물을 제공한다. In addition, the present invention provides a composition for diagnosing low-dose radiation exposure, which includes as an active ingredient an agent capable of measuring the methylation level of the CpG island region of one or more genes selected from the group consisting of PGRMC1 and UNC119B .
바람직하게는, 상기 PGRMC1 및 UNC119B로 이루어진 그룹에 선택된 어느 하나 이상의 유전자의 CpG 섬 영역의 메틸화 수준을 측정할 수 있는 제제는 상기 유전자의 메틸화된 CpG 섬 영역 내의 단편을 증폭할 수 있는 프라이머쌍, 상기 유전자의 메틸화된 CpG 섬 영역과 혼성화할 수 있는 프로브, 상기 유전자의 메틸화된 CpG 섬 영역과 결합할 수 있는 메틸화 특이적 결합 단백질, 상기 유전자의 메틸화 특이적 결합 항체 또는 압타머; 및 메틸화 민감성 제한효소로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.Preferably, the agent capable of measuring the methylation level of the CpG island region of any one or more genes selected from the group consisting of PGRMC1 and UNC119B includes a primer pair capable of amplifying a fragment within the methylated CpG island region of the gene, A probe capable of hybridizing with a methylated CpG island region of a gene, a methylation-specific binding protein capable of binding to a methylated CpG island region of the gene, a methylation-specific binding antibody or aptamer of the gene; and methylation-sensitive restriction enzymes, but is not limited thereto.
바람직하게는, 상기 PGRMC1 유전자의 CpG 섬 영역은 서열번호 1로 표시되고, 상기 UNC119B 유전자의 CpG 섬 영역은 서열번호 2로 표시될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.Preferably, the CpG island region of the PGRMC1 gene may be represented by SEQ ID NO: 1, and the CpG island region of the UNC119B gene may be represented by SEQ ID NO: 2, but are not limited thereto.
바람직하게는, 상기 저선량 방사선은 0.1 내지 2 Gy일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.Preferably, the low dose radiation may be 0.1 to 2 Gy, but is not limited thereto.
본 명세서에서 용어 "프라이머"는 짧은 자유 3-말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로서 작용하는 짧은 핵산 서열을 말한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응을 위한 시약(즉, DNA 폴리머라제 또는 역전사효소) 및 상이한 4 가지의 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 기술에 따라 적절히 선택될 수 있다.As used herein, the term "primer" refers to a nucleic acid sequence with a short free 3' hydroxyl group that can form base pairs with a complementary template and acts as a starting point for copying the template strand. refers to a nucleic acid sequence. Primers can initiate DNA synthesis in the presence of four different nucleoside triphosphates and a reagent for polymerization (i.e., DNA polymerase or reverse transcriptase) in an appropriate buffer solution and temperature. PCR conditions and lengths of sense and antisense primers can be appropriately selected according to techniques known in the art.
본 발명의 프라이머는 메틸화 여부를 분석하는 대상이 되는 CpG 섬의 서열에 따라 바람직하게 디자인될 수 있으며, 각각 메틸화되어 바이설파이트에 의해 변형되지 않았던 사이토신을 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머쌍 및 메틸화되지 않아 바이설파이트에 의해 변형된 사이토신을 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머쌍일 수 있다. The primers of the present invention can be preferably designed according to the sequence of the CpG island to be analyzed for methylation, and each primer pair and methylation pair can specifically amplify a cytosine that is methylated and has not been modified by bisulfite. Therefore, it may be a primer pair that can specifically amplify cytosine modified by bisulfite.
본 명세서에서 용어 "프로브"는 mRNA외 특이적으로 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며 라벨링되어 있어서 특정 mRNA의 존재 유무, 발현양을 확인할 수 있다. 프로브는 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single strand DNA) 프로브, 이중쇄DNA(double strand DNA)프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 적절한 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당해 기술 분야에 공지된 기술에 따라 적절히 선택할 수 있다.As used herein, the term "probe" refers to a nucleic acid fragment, such as RNA or DNA, of as short as a few bases or as long as several hundreds of bases, capable of binding specifically to mRNA, and is labeled to determine the presence or absence of a specific mRNA and its expression. You can check the amount. Probes may be manufactured in the form of oligonucleotide probes, single strand DNA probes, double strand DNA probes, RNA probes, etc. Selection of appropriate probes and hybridization conditions can be appropriately selected according to techniques known in the art.
본 명세서에서 용어 "항체"는 당해 기술분야에 공지된 용어로서 항원성 부위에 대하여 지시되는 특이적인 면역 글로불린을 의미한다. 본 발명에서의 항체는 본 발명의 PMVK에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 당해 기술분야의 통상적인 방법에 따라 항체를 제조할 수 있다. 상기 항체의 형태는 폴리클로날 항체 또는 모노클로날 항체를 포함하며, 모든 면역글로불린 항체가 포함된다. 상기 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 갖는 완전한 형태를 의미한다. 또한, 상기 항체는 인간화 항체 등의 특수 항체도 포함된다.As used herein, the term “antibody” is a term known in the art and refers to a specific immunoglobulin directed against an antigenic site. The antibody in the present invention refers to an antibody that specifically binds to the PMVK of the present invention, and the antibody can be prepared according to conventional methods in the art. The types of antibodies include polyclonal antibodies or monoclonal antibodies, and all immunoglobulin antibodies are included. The antibody is meant to be intact, with two full-length light chains and two full-length heavy chains. Additionally, the above antibodies also include special antibodies such as humanized antibodies.
본 명세서에서 용어 "앱타머(aptamer)"란, 그 자체로 안정된 삼차 구조를 가지면서 표적 분자에 높은 친화성과 특이성으로 결합할 수 있는 특징을 가진 특별한 종류의 단일가닥 핵산(DNA, RNA 또는 변형핵산)으로 구성된 폴리뉴클레오티드의 일종을 의미한다. 상술한 바와 같이, 앱타머는 항체와 동일하게 항원성 물질에 특이적으로 결합할 수 있으면서도, 단백질보다 안정성이 높고, 구조가 간단하며, 합성이 용이한 폴리뉴클레오티드로 구성되어 있으므로, 항체를 대체하여 사용될 수 있다.As used herein, the term "aptamer" refers to a special type of single-stranded nucleic acid (DNA, RNA, or modified nucleic acid) that has a stable tertiary structure and the ability to bind to a target molecule with high affinity and specificity. ) refers to a type of polynucleotide composed of As mentioned above, aptamers can specifically bind to antigenic substances in the same way as antibodies, but are composed of polynucleotides that are more stable than proteins, have a simpler structure, and are easier to synthesize, so they can be used as a replacement for antibodies. You can.
본 명세서에서 용어 "메틸화 민감성 제한효소"는 CpG 섬의 메틸화를 특이적으로 검출할 수 있는 제한효소로서 제한효소의 인식부위로 CG를 함유하는 제한효소일 수 있다. 예를 들면, SmaI, SacII, EagI, HpaII, MspI, BssHII, BstUI, NotI 등이 있으며 이에 제한되지 않는다. 상기 제한효소 인식부위의 C에서의 메틸화 또는 비메틸화에 따라 제한효소에 의한 절단 여부가 달라지고 이를 PCR 또는 서던블롯(Southern Blot) 분석을 통해 검출할 수 있게 된다. 상기 제한효소 이외의 다른 메틸화 민감성 제한효소는 당업계에 잘 알려져 있다.As used herein, the term “methylation-sensitive restriction enzyme” refers to a restriction enzyme that can specifically detect methylation of a CpG island, and may be a restriction enzyme that contains CG as a recognition site. Examples include SmaI, SacII, EagI, HpaII, MspI, BssHII, BstUI, NotI, etc., but are not limited thereto. Depending on methylation or unmethylation at C of the restriction enzyme recognition site, cleavage by restriction enzymes varies and can be detected through PCR or Southern Blot analysis. Other methylation-sensitive restriction enzymes other than the above restriction enzymes are well known in the art.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 저선량 방사선 노출 여부 진단용 키트를 제공한다.Additionally, the present invention provides a kit for diagnosing exposure to low-dose radiation, including the composition.
본 발명에서 상기 키트는 RT-PCR 키트, 마이크로어레이 칩 키트, DNA 키트, 및 단백질 칩 키트로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.In the present invention, the kit may be any one selected from the group consisting of RT-PCR kit, microarray chip kit, DNA kit, and protein chip kit, but is not limited thereto.
또한, 본 발명은 (1) 환자로부터 분리된 시료로부터 게놈 DNA를 수득하는 단계; (2) 상기 수득된 게놈 DNA에서 PGRMC1 및 UNC119B로 이루어진 그룹에 선택된 어느 하나 이상의 유전자의 CpG 섬 영역의 메틸화 수준을 측정하는 단계; 및 (3) 상기 측정된 유전자의 CpG 섬 영역의 메틸화 수준을 대조군 시료와 비교하는 단계를 포함하는 저선량 방사선 노출 여부 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.Additionally, the present invention includes the steps of (1) obtaining genomic DNA from a sample isolated from a patient; (2) measuring the methylation level of the CpG island region of one or more genes selected from the group consisting of PGRMC1 and UNC119B in the obtained genomic DNA; and (3) comparing the methylation level of the CpG island region of the measured gene with a control sample. It provides a method of providing information necessary for diagnosing exposure to low-dose radiation.
바람직하게는, 상기 (3) 단계에서 측정된 유전자의 CpG 섬 영역의 메틸화 수준이 대조군 시료에 비해 증가된 경우, 저선량 방사선에 노출된 것으로 판단하는 단계를 더 포함할 수 있다.Preferably, if the methylation level of the CpG island region of the gene measured in step (3) above is increased compared to the control sample, a step of determining that the sample has been exposed to low-dose radiation may be further included.
바람직하게는, 상기 유전자의 CpG 섬 영역의 메틸화 수준 측정은 PCR, 메틸화 특이 PCR(methylation specific PCR), 실시간 메틸화 특이 PCR(real time methylation specific PCR), 메틸화 DNA 특이적 결합 단백질을 이용한 PCR, 메틸화 DNA 특이적 결합 항체 또는 압타머를 이용한 ChIP 분석, DNA 칩, 파이로시퀀싱 및 바이설파이트 시퀀싱으로 이루어진 군에서 선택된 방법에 의해 수행될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.Preferably, the methylation level of the CpG island region of the gene is measured by PCR, methylation specific PCR, real time methylation specific PCR, PCR using a methylated DNA specific binding protein, methylated DNA It may be performed by a method selected from the group consisting of ChIP analysis using a specific binding antibody or aptamer, DNA chip, pyrosequencing, and bisulfite sequencing, but is not limited thereto.
바람직하게는, 상기 PGRMC1 유전자의 CpG 섬 영역은 서열번호 1로 표시되고, 상기 UNC119B 유전자의 CpG 섬 영역은 서열번호 2로 표시될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.Preferably, the CpG island region of the PGRMC1 gene may be represented by SEQ ID NO: 1, and the CpG island region of the UNC119B gene may be represented by SEQ ID NO: 2, but are not limited thereto.
바람직하게는, 상기 저선량 방사선은 0.1 내지 2 Gy일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.Preferably, the low dose radiation may be 0.1 to 2 Gy, but is not limited thereto.
바람직하게는, 상기 환자는 저선량 방사선 노출 의심 환자, 저선량 방사선 노출 의심 심혈관질환 또는 순환기질환 환자일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.Preferably, the patient may be a patient suspected of being exposed to low-dose radiation, or a patient with cardiovascular disease or circulatory disease suspected of being exposed to low-dose radiation, but is not limited thereto.
바람직하게는, 상기 분리된 시료는 분리된 세포, 조직, 혈액, 타액 또는 뇨일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.Preferably, the separated sample may be separated cells, tissues, blood, saliva, or urine, but is not limited thereto.
본 명세서에서 용어 "그레이(gray, Gy)"는 단위 질량당 해당 물질이 방사선을 통해 흡수한 에너지를 표시하며, 1 Gy는 1 kg의 물질이 1 J의 에너지를 흡수한 것을 표현한다.In this specification, the term “gray (Gy)” represents the energy absorbed by the corresponding material through radiation per unit mass, and 1 Gy represents 1 kg of material absorbing 1 J of energy.
이하에서는, 본 발명을 한정하지 않는 실시예에 따라 본 발명을 상세히 설명한다. 본 발명의 하기 실시예는 본 발명을 구체화하기 위한 것일 뿐 본 발명의 권리범위를 제한하거나 한정하는 것이 아님은 물론이다. 따라서, 본 발명의 상세한 설명 및 실시예로부터 본 발명이 속하는 기술분야의 전문가가 용이하게 유추할 수 있는 것은 본 발명의 권리범위에 속하는 것으로 해석된다. Below, the present invention will be described in detail according to examples that do not limit the present invention. Of course, the following examples of the present invention are only intended to embody the present invention and do not limit or limit the scope of the present invention. Accordingly, what can be easily inferred by an expert in the technical field to which the present invention belongs from the detailed description and examples of the present invention is interpreted to fall within the scope of the rights of the present invention.
<실험예><Experimental example>
하기의 실험예들은 본 발명에 따른 각각의 실시예에 공통적으로 적용되는 실험예를 제공하기 위한 것이다.The following experimental examples are intended to provide experimental examples commonly applied to each embodiment according to the present invention.
본 발명에 적용되는 2종의 유전자들의 메틸화 변화 실험은 메틸레이션 특이적인 PCR (Methylation Specific PCR; MSP)과 Bisulphite sequencing 방법으로 측정하였다. 그리고, 전사적 발현 변화 분석은 Quantitative Real-time RT-PCR 방법으로 측정하였으며, 추가적으로 유전자 메틸화의 기전의 검증을 위한 염색질 면역 침전(Chromatin Immonoprecipitation, ChIP) 방법을 통해 측정하였다. 본 실험을 위해 발명자가 이들 유전자의 프로모터 영역의 CpG 섬에서 실험 방법에 관련한 특이적인 프라이머를 디자인하여 실험을 수행하였다(표 1). Methylation change experiments of the two genes applied in the present invention were measured using methylation specific PCR (MSP) and bisulphite sequencing methods. In addition, transcriptional expression change analysis was measured using Quantitative Real-time RT-PCR, and additionally, chromatin immunoprecipitation (ChIP) was used to verify the mechanism of gene methylation. For this experiment, the inventor designed specific primers related to the experimental method in the CpG island of the promoter region of these genes and performed the experiment (Table 1).
1. DNA 메틸화 분석1. DNA methylation analysis
인간 정상 대동맥 내피세포 (Human Aorta Endotherila cell; HAEC)에 저선량 방사선이라고 하는 100 밀리시버트 (100 mSV) 이하의 방사선량, 0.1 Gy을 포함한 0.5, 2, 6 Gy의 방사선을 조사한 세포주에서 페놀/클로로포름 방법을 사용하여 DNA를 추출하였다. 메틸화 분석을 위하여 사용한 프라이머쌍은 대상 유전자의 CpG 섬 내에서 구성되었다. 유전자들의 CpG 섬 분석 및 메틸화 특이적 PCR을 위한 프라이머 위치는 캘리포니아 주립 대학 산타크루즈 게놈 브라우저(http://www.genome.ucsc.edu) 및 MethPrimer (http://www.urogene.org/ cgi-bin/methprimer/ methprimer.cgi)를 사용하여 대상 유전자의 CpG 섬을 예측하고 실험을 수행하였다. 유전자들의 프로모터 영역 내에서 메틸화 분석을 한 프라이머들의 위치는 도 1 및 도 3 내지 도 5에서 나타내었다. 상기 메틸화 특이적 PCR에 사용한 프라이머는 하기 표 1과 같다. EZ DNA 메틸화 키트(Zymo Research)를 사용하여 2㎍의 게놈 DNA에 대하여 바이설파이트 변경(Bisulfite modification; 메틸화된 CG site는 변화없이 남게 되고, 메틸화되지 않은 Cytosine(C)은 Thymine(T)으로 변화되는 과정)을 수행하였다. 양성 대조군 및 음성 대조군을 위하여, 생체외 메틸화 DNA(IVD) 및 물을 각각 처리하였다. 대상 유전자의 메틸화 분석을 위하여, 바이설파이트를 처리한 샘플에 대하여 정량적 MSP 증폭을 수행하고, 아가로즈 젤로 PCR 산물을 확인한다. 메틸화 특이적 PCR 메틸화 분석은 Kim et al 2014에 상술된 방법을 참고하여 수행하였다.Phenol/chloroform method in cell lines irradiated to human normal aorta endotherila cells (HAEC) at doses of 0.5, 2, and 6 Gy, including 0.1 Gy, a radiation dose of less than 100 millisieverts (100 mSV), which is called low-dose radiation. DNA was extracted using . Primer pairs used for methylation analysis were constructed within the CpG island of the target gene. Primer positions for CpG island analysis of genes and methylation-specific PCR were identified using the California State University, Santa Cruz Genome Browser (http://www.genome.ucsc.edu) and MethPrimer ( http://www.urogene.org/cgi- bin/methprimer/ methprimer.cgi) was used to predict the CpG island of the target gene and perform the experiment. The positions of primers for methylation analysis within the promoter regions of genes are shown in Figures 1 and 3 to 5. Primers used in the methylation-specific PCR are shown in Table 1 below. Bisulfite modification (Bisulfite modification) on 2㎍ of genomic DNA using the EZ DNA Methylation Kit (Zymo Research); the methylated CG site remains unchanged, and the unmethylated Cytosine (C) changes to Thymine (T). process) was performed. For positive and negative controls, in vitro methylated DNA (IVD) and water were treated, respectively. For methylation analysis of the target gene, quantitative MSP amplification is performed on the bisulfite-treated sample, and the PCR product is confirmed using an agarose gel. Methylation-specific PCR methylation analysis was performed by referring to the method detailed in Kim et al 2014.
2. 정량적 실시간 RT-2. Quantitative real-time RT- PCR을PCR 이용한 유전자 발현 변화 검증 Verification of gene expression changes using
유전자들의 전사적 발현 분석을 위하여, 유전자들의 Exon과 Intron 영역의 정보를 보유한 Ensembl Genome Browser(https://asia.ensembl.org)에서 전사체 서열을 획득하여, Primer3 web tool(http://frodo.wi.mit.edu/primer3)을 사용하여 프라이머를 구성하였다. 사용한 프라이머는 하기 표 1과 같다. 정량적 실시간 RT-PCR을 분석하기 위해 인간 정상 대동맥 내피세포에서 0.1, 0.5, 2, 6 Gy의 방사선을 조사한 샘플에서 total RNA를 분리하였고, SYBR green master mix(Themo Scientific)를 사용하는 CFX96TM 실시간 시스템(Biorad)을 사용하여 cDNA를 합성하였다. 대상 유전자의 발현 수준은 베타 액틴 수준값으로 표준화하였고, 유전자 발현의 상대적 정량값은 △△Ct 방법을 사용하여 수행하였다. To analyze the transcriptional expression of genes, transcript sequences were obtained from the Ensembl Genome Browser (https://asia.ensembl.org), which contains information on the exon and intron regions of genes, and used through the Primer3 web tool (http://frodo). Primers were constructed using wi.mit.edu/primer3). The primers used are listed in Table 1 below. To analyze quantitative real-time RT-PCR, total RNA was isolated from samples irradiated with 0.1, 0.5, 2, and 6 Gy of human normal aortic endothelial cells, using the CFX96 TM real-time system using SYBR green master mix (Themo Scientific). cDNA was synthesized using (Biorad). The expression level of the target gene was normalized to the beta actin level value, and relative quantification of gene expression was performed using the △△Ct method.
3. 3. 바이설파이트bisulfite 시퀀싱 sequencing
EZ DNA 메틸화 키트(Zymo Research)를 사용하여 2㎍의 게놈 DNA에 대하여 바이설파이트 변경(Bisulfite modification; 메틸화된 CG site는 변화없이 남게 되고, 메틸화 되지 않은 Cytosine(C)은 Thymine(T)으로 변화되는 과정)을 수행하였다. 양성 대조군 및 음성 대조군을 위하여, 생체외 메틸화 DNA(IVD) 및 물을 각각 처리하였다. 대상 유전자의 메틸화 분석을 위하여. 바이설파이트를 처리한 샘플에 대하여 정량적 MSP 증폭을 수행하고, 아가로즈 젤로 PCR 산물을 확인한다. PCR 산물을 정제하여 획득한 DNA 절편을 분리하여, TOPO-TA 클로닝 키트를 활용하여, TOPO TA vector 플라스미드에 대량으로 클로닝한 뒤, 타겟 DNA 절편이 들어간 플라스미드를 정제 및 분리한 뒤, EcoR1 효소로 DNA 절편을 확인한다. 타겟 DNA 절편은 M13 reverse 프라이머를 활용하여 염기서열 시퀀싱을 분석한다. 샘플당 최소 15개 이상의 클론을 시퀀싱 하여, 전체적인 패턴을 분석한다. 시퀀싱 자료를 바탕으로 염기서열을 분석하여 CG 메틸화를 확인하여 비교 분석한다. Bisulfite modification (Bisulfite modification) to 2㎍ of genomic DNA using the EZ DNA Methylation Kit (Zymo Research); the methylated CG site remains unchanged, and the unmethylated Cytosine (C) changes to Thymine (T). process) was performed. For positive and negative controls, in vitro methylated DNA (IVD) and water were treated, respectively. For methylation analysis of target genes. Quantitative MSP amplification is performed on the bisulfite-treated sample, and PCR products are confirmed using an agarose gel. Purify the PCR product, isolate the obtained DNA fragment, clone it in large quantities into the TOPO TA vector plasmid using the TOPO-TA cloning kit, purify and isolate the plasmid containing the target DNA fragment, and then clone the DNA using EcoR1 enzyme. Check the section. The target DNA fragment is analyzed by sequencing using the M13 reverse primer. Sequence at least 15 clones per sample and analyze the overall pattern. Based on the sequencing data, the base sequence is analyzed to confirm and compare CG methylation.
4. 염색질 면역 침전 (4. Chromatin immunoprecipitation ( ChIPChIP ))
포름알데히드 등을 통해 세포 혹은 조직에서 DNA와 단백질들 간의 crosslinking을 유도한 뒤, Sonication을 통해 DNA를 일정한 크기로 잘라준다. DNMT1 antibody를 이용하여 면역침전을 수행하고, 이를 풀링(pulling) 한다. Reverse crosslinking을 통해, 면역침전된 단백질과 crosslink 되어 있는 DNA를 분리 (65℃에서 6시간 이상 반응)하여, 이후에 진행될 PCR에 방해가 될 수 있는 단백질을 제거한다. DNA만을 정제하여 깨끗한 DNA 절편을 획득한 이후, 프로모터 영역의 다양한 영역에서 확인할 수 있는 프라이머를 이용하여 qRT-PCR을 통해 본 발명자들이 보고자 하는 단백질이 표적 DNA 부분에 결합하는지를 확인할 수 있다. PCR은 CFX96 Real-Time PCR System (BioRad)를 사용하여 수행되었다. ChIP 프라이머는 표 1에 나열되어 있다.After inducing crosslinking between DNA and proteins in cells or tissues using formaldehyde, etc., the DNA is cut to a certain size through sonication. Immunoprecipitation was performed using DNMT1 antibody and pooled. Through reverse crosslinking, the immunoprecipitated protein and crosslinked DNA are separated (reacted at 65°C for more than 6 hours) to remove proteins that may interfere with subsequent PCR. After purifying only the DNA and obtaining clean DNA fragments, it is possible to confirm whether the protein we want to look at binds to the target DNA portion through qRT-PCR using primers that can be identified in various regions of the promoter region. PCR was performed using the CFX96 Real-Time PCR System (BioRad). ChIP primers are listed in Table 1.
PGRMC1PGRMC1
<< 실시예Example 1> 1> 저선량low dose 방사선 노출 여부 측정이 가능한 Capable of measuring radiation exposure 바이오마커의of biomarkers 발굴 excavation
본 발명은 인간의 정상 대동맥 내피 세포 (Human Aorta Endothelial cell)에서 저선량 방사선 (0.1 Gy)을 포함한 다양한 방사선량 (2, 4, 그리고 6 Gy)을 조사한 샘플에서의 genome-wide DNA methylation array를 통해 메틸화가 차이 나는 유전자 후보군을 발굴하였다. 이후, 이 후보군 중에 메틸화 분석이 가능한 유전자 후보군을 스크리닝(screening) 하였다. 도 1은 본 발명에 적용되는 2종의 유전자 (PGRMC1과 UNC119B)의 전형적인 CpG 섬의 구조(도 1A) 이며, 본 발명의 메틸화 검증을 위해 사용된 methylation specific PCR (MSP) 프라이머의 위치를 나타낸다. 정상의 대동맥 내피세포에는 PGRMC1과 UNC119B의 메틸화가 이루어져 있지 않은데, 저선량 방사선 (0.1Gy)에 노출되었을 때, 메틸화의 변화가 생기는 현상을 일반적인 MSP (conventional MSP) 방법을 통해 확인하였으며(도 1B), 이에 대한 부분을 정량적으로 다시 한 번 확인하기 위하여, quantitative MSP (qMSP) 방법을 통해 동일한 결과를 검증하였다(도 1C). 인간의 정상 대동맥 내피세포에서 PGRMC1과 UNC119B의 프로모터 과메틸화가 아주 낮은 선량의 방사선(0.1 Gy) 노출에서도 유도되는 현상을 본 발명에서 처음으로 보고하는 내용이며, 매우 흥미로운 결과이다. 이 유전자들의 프로모터 메틸화를 활용하여, 저선량 방사선 노출 여부 측정이 가능한 바이오마커로서의 활용이 가능하다는 것을 의미한다고 볼 수 있다. The present invention investigates methylation through a genome-wide DNA methylation array in samples irradiated with various radiation doses (2, 4, and 6 Gy), including low-dose radiation (0.1 Gy), in human normal aorta endothelial cells. Gene candidates with different values were discovered. Afterwards, among these candidate groups, gene candidates for which methylation analysis was possible were screened. Figure 1 is a typical CpG island structure (Figure 1A) of two genes ( PGRMC1 and UNC119B ) applied to the present invention, and shows the positions of methylation specific PCR (MSP) primers used for methylation verification of the present invention. In normal aortic endothelial cells, PGRMC1 and UNC119B are not methylated, and when exposed to low-dose radiation (0.1 Gy), methylation changes were confirmed using the conventional MSP (MSP) method (Figure 1B). In order to confirm this quantitatively, the same results were verified using quantitative MSP (qMSP) method (Figure 1C). This is the first report of the present invention that promoter hypermethylation of PGRMC1 and UNC119B in human normal aortic endothelial cells is induced even by exposure to a very low dose of radiation (0.1 Gy), and this is a very interesting result. This can be seen as meaning that it is possible to use the promoter methylation of these genes as a biomarker that can measure exposure to low-dose radiation.
<< 실시예Example 2> 2> PGRMC1PGRMC1 과class UNC119BUNC119B 의of 프로모터 메틸화에 의한 전사적 조절에 대한 상관관계 검증 Correlation verification of transcriptional regulation by promoter methylation
인간의 정상 대동맥 내피 세포 (Human Aorta Endothelial cell)에서 저선량 방사선을 포함한 다양한 방사선량을 조사한 샘플에서 RNA 분리한 뒤, 본 발명에 적용되는 2종의 유전자의 전사적 발현을 Real-Time quantitative RT-PCR (qRT-PCR) 방법을 통해 분석하였다. 실시예 1에서 보여준 이들의 프로모터 메틸화에 의한 전사적 조절에 대한 상관관계를 검증하고자 하였으며, 이들 유전자 발현 패턴의 합리적 도출을 위해, 각 유전자에서 서로 다른 exon 영역에 위치하는 2 쌍의 qRT-PCR 프라이머 세트를 디자인하여 분석한 결과이다. 흥미롭게도, 저선량의 방사선 노출에 이들 유전자 발현이 감소하는 것을 확인하였으며, 본 결과는 실시예 1의 결과에서 이들의 메틸화 변화에 의해서 전사적 유전자 발현이 조절되는 상관관계를 검증한다고 볼 수 있다. 따라서, 두 유전자의 메틸화 현상이 저선량 방사선에 의해 특이적으로 유도되어 이들의 유전자 발현에 영향을 주고 있으며, 이러한 현상을 활용하여, 저선량 방사선 노출 여부를 확인할 수 있는 메틸화 바이오마커임을 제시하고자 한다. RNA was isolated from samples irradiated with various radiation doses, including low-dose radiation, from human normal aorta endothelial cells, and the transcriptional expression of the two genes applied in the present invention was measured by Real-Time quantitative RT-PCR ( It was analyzed using qRT-PCR) method. We sought to verify the correlation between transcriptional regulation by promoter methylation shown in Example 1, and to reasonably derive the expression patterns of these genes, two pairs of qRT-PCR primer sets located in different exon regions in each gene were used. This is the result of designing and analyzing. Interestingly, it was confirmed that the expression of these genes decreased upon exposure to low doses of radiation, and this result can be seen as verifying the correlation in the results of Example 1 in which transcriptional gene expression is regulated by their methylation changes. Therefore, the methylation phenomenon of the two genes is specifically induced by low-dose radiation and affects their gene expression, and by utilizing this phenomenon, we would like to propose a methylation biomarker that can confirm exposure to low-dose radiation.
<< 실시예Example 3> 3> PGRMC1PGRMC1 과class UNC119BUNC119B 의of 시퀀스sequence 레벨에서 프로모터 메틸화 패턴 분석 Analysis of promoter methylation patterns at the level
본 발명에 적용되는 2종의 유전자들의 실제 시퀀스 레벨에서의 프로모터 메틸화의 패턴을 Bisulphite sequencing 방법으로 분석하였다(도 3). 도 3에서 두 유전자의 각각의 프로모터 구조에서 BSQ로 명시한 부분의 결과이며, PGRMC1은 19개의 CpG site (전사적 시작시점 (0)에서부터 -415bp ~ -196bp 영역) 와 UNC119B는 8개의 CpG site (전사적 시작시점 (0)에서부터 -422bp ~ -186bp 영역)를 포함하는 영역을 증폭하여 시퀸싱을 하여 분석하였다. 이 분석에 적용된 PCR 프라이머의 정보는 표 1에서 제시하고 있다. 흰색의 box는 unmethylation (비메틸화), 회색의 box는 methylation (메틸화)된 CpG site를 나타낸다. 본 결과에서는 저선량 방사선 (0.1 Gy)이 조사된 대동맥 내피세포에서 두 유전자의 프로모터에 존재하는 영역의 CpG site의 메틸화가 control에 비해 다소 증가되는 현상을 보여 주고 있다. 따라서, 도 1에서의 보여주는 MSP에 의한 두 유전자의 메틸화 레벨을 실제 시퀀스 레벨에서 다시 한 번 검증한 것임을 증명하고 있다. The pattern of promoter methylation at the actual sequence level of the two genes applied in the present invention was analyzed using Bisulphite sequencing (Figure 3). In Figure 3, this is the result of the part designated as BSQ in the promoter structure of each of the two genes. PGRMC1 has 19 CpG sites (-415bp to -196bp region from the transcriptional start point (0)) and UNC119B has 8 CpG sites (transcriptional start point). The region containing the -422bp to -186bp region from time point (0) was amplified and sequenced for analysis. Information on the PCR primers applied in this analysis is presented in Table 1. White boxes represent unmethylated CpG sites, and gray boxes represent methylated CpG sites. These results show that in aortic endothelial cells irradiated with low-dose radiation (0.1 Gy), methylation of CpG sites in the promoter region of two genes is slightly increased compared to the control. Therefore, it is proven that the methylation levels of the two genes by MSP shown in Figure 1 have been verified once again at the actual sequence level.
<< 실시예Example 4> 4> PGRMC1PGRMC1 유전자의 프로모터 영역에 대한 for the promoter region of the gene ChIPChIP 분석 analyze
본 발명에 적용되는 2종의 유전자들이 대동맥 저선량 방사선(0.1 Gy)에 의해 프로모터의 메틸화가 유도되어 저선량 방사선의 노출의 바이오마커로 활용 가능한지에 대한 추가적인 중요한 검증을 위해 유전자의 메틸화에 중요한 molecule인 DNA methyltransferase 1 (DNMT1)의 항체를 이용하여 두 유전자의 프로모터 영역에 DNMT1이 실제 결합하는 분포에 대한 분석을 ChIP 실험을 통해 검증하고자 하였다(도 4). 도 4는 유전자 PGRMC1의 ChIP 분석 결과이며, 결과의 신뢰도를 향상하기 위해 PGRMC1 유전자의 프로모터 영역의 메틸화 분석을 수행한 영역을 최대한 포함하는 부위에서 다수의 ChIP 프라이머를 디자인하여, 저선량 방사선 조사시 DNMT1 분포의 차이를 확인하였다. 따라서, 본 결과는 PGRMC1 유전자가 저선량 방사선에 특이적으로 메틸화가 유도되는 과정, 즉 DNMT1의 결합이 증가하는 과정을 통해 메틸화가 일어나는 것을 충분히 검증함을 제시하는 결과이다.For additional important verification of whether the two types of genes applied in the present invention can be used as biomarkers of exposure to low-dose radiation by inducing methylation of the promoters by aortic low-dose radiation (0.1 Gy), DNA, an important molecule for gene methylation, was used. Using an antibody against methyltransferase 1 (DNMT1), we attempted to verify the distribution of DNMT1's actual binding to the promoter regions of the two genes through ChIP experiments (Figure 4). Figure 4 is the ChIP analysis result of the gene PGRMC1 , and to improve the reliability of the results, PGRMC1 A number of ChIP primers were designed in regions that maximally encompassed the region where methylation analysis was performed in the promoter region of the gene, and differences in DNMT1 distribution upon low-dose radiation were confirmed. Therefore, the present results sufficiently verify that methylation of the PGRMC1 gene occurs through a process in which methylation is specifically induced by low-dose radiation, that is, a process in which DNMT1 binding increases.
<< 실시예Example 5> 5> UNC119BUNC119B 유전자의 프로모터 영역에 대한 for the promoter region of the gene ChIPChIP 분석 analyze
본 발명에 적용되는 2종의 유전자들이 대동맥 저선량 방사선 (0.1 Gy)에 의해 프로모터의 메틸화가 유도되어 저선량 방사선의 노출의 바이오마커로 활용 가능한지에 대한 추가적인 중요한 검증을 위해 유전자의 메틸화에 중요한 molecule인 DNA methyltransferase 1 (DNMT1)의 항체를 이용하여 두 유전자의 프로모터 영역에 DNMT1이 실제 결합하는 분포에 대한 분석을 ChIP 실험을 통해 검증하고자 하였다(도 5). 도 5는 유전자 UNC119B의 ChIP 분석 결과이며, 결과의 신뢰도를 향상하기 위해 UNC119B유전자의 프로모터 영역의 메틸화 분석을 수행한 영역을 최대한 포함하는 부위에서 다수의 ChIP 프라이머를 디자인하여, 저선량 방사선 조사시 DNMT1 분포의 차이를 확인하였다. 따라서, 본 결과는 UNC119B 유전자가 저선량 방사선에 특이적으로 메틸화가 유도되는 과정, 즉 DNMT1의 결합이 증가하는 과정을 통해 메틸화가 일어나는 것을 충분히 검증함을 제시하는 결과이다.For additional important verification of whether the two types of genes applied in the present invention can be used as biomarkers of exposure to low-dose radiation by inducing methylation of the promoters by aortic low-dose radiation (0.1 Gy), DNA, an important molecule in gene methylation, was used. Using an antibody against methyltransferase 1 (DNMT1), we attempted to verify the distribution of DNMT1's actual binding to the promoter regions of the two genes through ChIP experiments (Figure 5). Figure 5 shows the results of ChIP analysis of the gene UNC119B . To improve the reliability of the results, a number of ChIP primers were designed in the region containing the region where methylation analysis of the promoter region of the UNC119B gene was performed as much as possible, and DNMT1 distribution upon low-dose radiation irradiation The difference was confirmed. Therefore, the present results sufficiently verify that methylation of the UNC119B gene occurs through a process in which methylation is specifically induced by low-dose radiation, that is, a process in which DNMT1 binding increases.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시예일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다. As the specific parts of the present invention have been described in detail above, it is clear to those skilled in the art that these specific techniques are merely preferred embodiments and do not limit the scope of the present invention. will be. Accordingly, the substantial scope of the present invention will be defined by the appended claims and their equivalents.
Claims (16)
(2) 상기 수득된 게놈 DNA에서 UNC119B 유전자의 CpG 섬 영역의 메틸화 수준을 측정하는 단계; 및
(3) 상기 측정된 유전자의 CpG 섬 영역의 메틸화 수준을 대조군 시료와 비교하는 단계를 포함하는 저선량 방사선 노출 여부 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.(1) Obtaining genomic DNA from a sample isolated from a patient;
(2) measuring the methylation level of the CpG island region of the UNC119B gene in the obtained genomic DNA; and
(3) A method of providing information necessary for diagnosing exposure to low-dose radiation, including the step of comparing the methylation level of the CpG island region of the measured gene with a control sample.
The method of claim 9 or 10, wherein the separated sample is selected from the group consisting of separated cells, tissues, blood, saliva, and urine.
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| US20080076122A1 (en) * | 2006-09-26 | 2008-03-27 | The Regents Of The University Of California | Characterizing exposure to ionizing radiation |
| US10288626B2 (en) | 2012-09-14 | 2019-05-14 | University Of Kentucky Research Foundation | Secreted tumor-associated cytochrome as a blood-based biomarker for cancer |
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2022
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