KR102592445B1 - Crocin glucosides and manufacturing method of crocin glucosides thereof - Google Patents
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Abstract
본 발명은 크로신 배당체 및 상기 크로신 배당체의 제조방법에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명에 따른 크로신 배당체는 크로신과 비교하여 수용성이 높고 세포독성은 낮으면서도 신경세포 보호 효과를 나타내어, 신규한 생물학적 소재로서 유용하게 사용될 수 있다. 또한, 상기 크로신 배당체는 초고압 조건에서 높은 수율로 제조됨으써, 본 발명에 따른 방법은 크로신 배당체를 산업적으로 대량생산할 수 있다.The present invention relates to crocin glycosides and methods for producing the crocin glycosides. Specifically, the crocin glycoside according to the present invention has high water solubility and low cytotoxicity compared to crocin, while exhibiting a neuronal protective effect, and can be usefully used as a novel biological material. In addition, since the crocin glycoside is produced in high yield under ultra-high pressure conditions, the method according to the present invention can industrially mass-produce crocin glycoside.
Description
본 발명은 크로신 배당체 및 상기 크로신 배당체의 제조방법에 관한 것이다.The present invention relates to crocin glycosides and methods for producing the crocin glycosides.
샤프란(Saffron)은, 샤프란꽃(Crocus sativus)의 암술머리 150개를 건조하여 1 g을 생산할 수 있어, 세상에서 가장 비싼 향신료로 알려져 있다. 샤프란은 항산화, 항염증, 항우울증, 기억력 향상, 항종양, 신경세포보호 효과 등 다양한 생리활성이 있는 것으로 알려져 있으며, 이러한 다양한 기능성은 샤프란 색소의 주성분인 수용성 카로티노이드(Water-soluble carotenoid)가 크게 기여한다. 샤프란의 수용성 카로티노이드는 샤프란 고유 카로티노이드인 크로세틴(Crocetin)에 포도당들이 에스터(ester) 결합된 배당체 화합물들로 이루어져 있다. 여러가지 수용성 카로티노이드 성분 중에서 크로신(Crocin, crocetin-di-(β-D-gentiobiosyl) ester)이 가장 많은 함량 비율을 보이는 샤프란의 대표적인 수용성 카로티노이드이다. 크로신은 크로세틴의 양쪽 말단 탄소에 젠티오비오스(β-1,6 결합의 2개 포도당) 그룹 2개가 각각 에스터 결합되어 있는 총 4당을 가지는 크로세틴 배당체 화합물이다.Saffron is known to be the most expensive spice in the world, as 1 g can be produced by drying 150 stigmas of the saffron flower (Crocus sativus). Saffron is known to have various physiological activities such as antioxidant, anti-inflammatory, antidepressant, memory improvement, anti-tumor, and nerve cell protection effects. Water-soluble carotenoid, the main component of saffron pigment, contributes greatly to these various functionalities. do. Saffron's water-soluble carotenoid is composed of glycoside compounds in which glucose is ester bound to saffron's unique carotenoid, Crocetin. Among various water-soluble carotenoid components, Crocin (crocetin-di-(β-D-gentiobiosyl) ester) is the representative water-soluble carotenoid of saffron with the highest content ratio. Crocin is a crocetin glycoside compound with a total of 4 sugars in which two gentiobiose (two glucose with β-1,6 bonds) groups are ester bonded to carbons at both ends of crocetin.
크로신 분자구조에서 당부분(Sugar moiety)이 특히 위와 같은 생리활성 기능과 크게 관련되어 있다고 알려져 있다(Akhtari et al., 2013). 이란의 한 연구소에서 화학구조와 생리활성 간의 상관관계에 대한 연구를 통해, 크로신의 생리활성과 항산화 작용이 배당체 화합물인 크로신의 당부분(2개의 결합 형태의 젠티오비오스(Gentiobiose))에 기인한다고 보고하였다. 화학이론적인 계산방법인 DFT-B3LYP 방식으로 컴퓨터 시뮬레이션 하면 크로신의 당부분인 2개의 젠티오비오스 그룹(2개의 포도당이 β-1,6 결합되어 있는 2당)이 다양한 생리활성 작용에 핵심 역할을 하는 활성부위인 것으로 예측한 논문이 보고되었다(Akhtari et al., 2013). It is known that the sugar moiety in the crocin molecular structure is particularly closely related to the above physiological functions (Akhtari et al., 2013). Through a study on the correlation between chemical structure and physiological activity at a research institute in Iran, it was found that the physiological activity and antioxidant activity of crocin are due to the sugar moiety (Gentiobiose in the form of two bonds) of crocin, a glycoside compound. reported. Computer simulation using DFT-B3LYP, a chemical theoretical calculation method, shows that the two gentiobiose groups (disaccharides consisting of two glucose bonds to β-1,6), which are the sugar moieties of crocin, play a key role in various physiological activities. A paper predicting that this is an active site was reported (Akhtari et al., 2013).
또한, 샤프란의 대표적인 크로세틴 배당체 화합물인 크로세틴 젠티오비오스 글루코즈 에스터(Crocetin gentiobiose glucose ester)와 크로세틴 디-글루코즈 에스터(Cocetin di-glucose ester) 또한 해마의 장기간 강화작용 개선활성에 있어 크로신과 비교연구 되고, 2가지 다른 배당체 모두 크로신 보다 약하거나 거의 생리활성이 없었다. 이러한 신경병성 질환(Neurodegenerative disorder)의 치료 효과에서 크로신의 화학구조와 생리활성 간의 상관관계에 관한 연구들은 2개의 젠티오비오스 그룹(di-gentiobiose ester groups)이 중요한 활성부위임을 확인시켜 주었다. 크로신의 당부분에서 구조적으로 1개의 포도당이 부족한 배당체 화합물인 크로세틴 젠티오비오스 글루코즈 에스터가 크로신과 유사한 방식으로 알코올에 의한 해마 장기간 강화작용 억제현상을 보호하는 효과를 보였으나, 크로신 보다 약한 효능을 보였다. 반면, 또 다른 크로세틴 배당체 화합물인 크로세틴 디-글루코즈 에스터(크로신의 당부분에서 2개의 포도당이 부족)은 신경병성 질환의 치료 효과를 나타내지 않았다. 즉, 크로신의 아글리콘(aglycone)인 크로세틴의 지방산고리에 에스터 결합되어 있는 젠티오비오스 그룹(Gentiobiose group, 포도당 2개로 결합된 2당 그룹)이 신경세포 보호효과의 활성부위가 됨을 알 수 있다(Sugiura et al., 1994). In addition, saffron's representative crocetin glycoside compounds, Crocetin gentiobiose glucose ester and Crocetin di-glucose ester, are also compared to crocin in improving long-term strengthening of the hippocampus. Both of the two other glycosides studied had less or almost no biological activity than crocin. Studies on the correlation between the chemical structure and physiological activity of crocin have confirmed that the two di-gentiobiose ester groups are important active sites in the treatment of neurodegenerative disorders. Crocetin gentiobiose glucose ester, a glycoside compound that structurally lacks one glucose in the sugar portion of crocin, showed an effect in protecting against alcohol-induced long-term potentiation inhibition in the hippocampus in a similar manner to crocin, but had a weaker effect than crocin. showed. On the other hand, another crocetin glycoside compound, crocetin di-glucose ester (which lacks two glucose units in the sugar moiety of crocin), did not show therapeutic effects on neurodegenerative diseases. In other words, it can be seen that the gentiobiose group (a disaccharide group made up of two glucose units), which is ester-bonded to the fatty acid ring of crocetin, the aglycone of crocin, is the active site for the neuroprotective effect. (Sugiura et al., 1994).
많은 연구들이 EGCG, 클로로겐산(Chlorogenic acid), 카페익산(Caffeic acid) 등의 여러 생리활성물질들을 배당체화(Glucosylation)로 생합성하여 그 이화학적 특성을 보고해 왔다. 배당체 화합물의 공통적 특징은 비극성을 띄는 기존 생리활성물질들의 수용성이 크게 증가되었다는 점인데, 배당체 산물의 수용성 증가는 당부위(Sugar moiety)의 -OH 그룹의 증가로 기인하는 것으로 알려져 있다. 따라서 배당체 공정으로 아글리콘(aglycon)에 첨부되는 당의 숫자가 증가할수록 수용성이 증가하는 현상이 나타난다. 그러나 첨부되는 당의 숫자가 많아지게 되면 당의 비극성 탄화수소(hydrocarbon) 구조가 많이 노출되게 되어 역으로 수용성이 감소되는 경향이 보이기도 한다. Many studies have biosynthesized various bioactive substances such as EGCG, chlorogenic acid, and caffeic acid through glycosylation and reported their physicochemical properties. A common characteristic of glycoside compounds is that the water solubility of existing non-polar bioactive substances is greatly increased. The increase in water solubility of glycoside products is known to be due to an increase in the -OH group of the sugar moiety. Therefore, as the number of sugars attached to aglycone increases through the glycoside process, water solubility increases. However, as the number of attached sugars increases, the non-polar hydrocarbon structure of the sugar is exposed, which tends to reduce water solubility.
초고압 기술은 식품 가공 분야에서 오래 전부터 비열처리-살균방법으로 식품 저장을 위한 대안기술로 인식되어 왔고, 또한 비열처리-추출법으로도 활용되고 있다. 이와 같은 초고압 기술은 300 MPa(3000 기압) 이상의 조건에서 처리할 시, 식품의 비타민, 향미, 생리활성 물질을 파괴하지 않는 비열처리 방식으로 미생물을 불활성화시키고 천연 효소들 또한 활성을 잃도록 그 구조를 변성시켜 식품의 저장성을 증가시킨다(mozhaev et al., 1996). 초고압 기술은 처리압력 조건에 따라 효소반응을 활성화 또는 불활성화시킬 수 있는데, 퍼록시다제(Peroxidase)와 폴리페놀 옥시다제(Polyphenol oxidase) 같은 효소들의 활성이 200 MPa(2000 기압)의 상대적으로 낮은 초고압 조건에서 증가되었다. 반대로 400~600 MPa의 상대적으로 높은 압력에서는 효소활성이 감소하였다. 효소학 분야에서 이러한 초고압-효소반응 기술은 식품 성분의 효소적 가수분해 처리에 많이 응용되고 있다(Eisenmenger et al., 2009). 인삼 뿌리에서 유효성분 진세노사이드를 효과적으로 추출하기 위해 식물의 세포벽을 분해하는 셀룰라아제(Cellulase)와 β-아밀라아제(β-amylase) 등의 효소적 가수분해 반응을 초고압 100 MPa(1000 기압)에서 극대화한 연구가 있다(Sunwoo et al., 2014). 또 다른 연구는 플라보노이드 중 쓴 맛을 내는 나린진(Naringin) 성분을 나린기나아제(naringinase) 효소로 쓴맛이 없는 나린제닌(Naringenin)으로 가수분해하는 공정을 초고압 160 MPa(1600 기압)로 처리하여 그 생산수율을 증대시켰다(Real et al., 2007). In the food processing field, ultra-high pressure technology has long been recognized as an alternative technology for food storage as a non-heat treatment-sterilization method, and is also used as a non-heat treatment-extraction method. This ultra-high pressure technology, when processed under conditions of 300 MPa (3000 atmospheres) or higher, is a non-heat treatment method that does not destroy the vitamins, flavors, and bioactive substances of food, and has a structure that inactivates microorganisms and causes natural enzymes to lose their activity. It increases the storability of food by denaturing it (mozhaev et al., 1996). Ultra-high pressure technology can activate or deactivate enzyme reactions depending on the treatment pressure conditions. The activity of enzymes such as peroxidase and polyphenol oxidase is reduced at ultra-high pressure, which is relatively low at 200 MPa (2000 atmospheres). conditions increased. Conversely, enzyme activity decreased at relatively high pressures of 400 to 600 MPa. In the field of enzymology, this ultra-high pressure-enzyme reaction technology is widely applied to enzymatic hydrolysis of food ingredients (Eisenmenger et al., 2009). In order to effectively extract the active ingredient ginsenoside from ginseng roots, the enzymatic hydrolysis reaction of cellulase and β-amylase, which decompose the plant's cell walls, is maximized at ultra-high pressure of 100 MPa (1000 atmospheres). There is a study (Sunwoo et al., 2014). Another study produced the process of hydrolyzing Naringin, which has a bitter taste among flavonoids, into Naringenin, which does not have a bitter taste, using the naringinase enzyme, by treating it at ultra-high pressure of 160 MPa (1,600 atmospheres). Yield was increased (Real et al., 2007).
본 발명의 목적은 크로신 배당체 및 상기 크로신 배당체의 제조방법을 제공하는 것이다.The object of the present invention is to provide crocin glycosides and a method for producing the crocin glycosides.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 크로신(crocin)에 1개 이상의 당(sugar) 단위가 α결합으로 결합된 크로신 배당체를 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention provides a crocin glycoside in which one or more sugar units are bound to crocin through an α bond.
또한, 본 발명은 상기 크로신 배당체를 포함하는 조성물을 제공한다.Additionally, the present invention provides a composition containing the crocin glycoside.
또한, 본 발명은 상기 크로신 배당체를 유효성분으로 포함하는 뇌질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.In addition, the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating brain diseases containing the crocin glycoside as an active ingredient.
또한, 본 발명은 상기 크로신 배당체를 유효성분으로 포함하는 뇌질환 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.In addition, the present invention provides a health functional food for preventing or improving brain diseases containing the crocin glycoside as an active ingredient.
또한, 본 발명은 상기 크로신 배당체를 유효성분으로 포함하는 신경보호용 건강기능식품을 제공한다.In addition, the present invention provides a health functional food for neuroprotection containing the crocin glycoside as an active ingredient.
또한, 본 발명은 크로신, 당 및 당전이효소의 혼합물을 초고압 처리하는 단계를 포함하는 본 발명 따른 크로신 배당체 제조방법을 제공한다.Additionally, the present invention provides a method for producing crocin glycosides according to the present invention, which includes the step of treating a mixture of crocin, sugar, and glycosyltransferase under ultra-high pressure.
본 발명에 따른 크로신 배당체는 크로신과 비교하여 수용성이 높고 세포독성은 낮으면서도 신경세포 보호 효과를 나타내어, 신규한 생물학적 소재로서 유용하게 사용될 수 있다. 또한, 상기 크로신 배당체는 초고압 조건에서 높은 수율로 제조됨으써, 본 발명에 따른 방법은 크로신 배당체를 산업적으로 대량생산할 수 있다.Crocin glycoside according to the present invention has high water solubility and low cytotoxicity compared to crocin, while exhibiting a neuronal protective effect, and can be usefully used as a novel biological material. In addition, since the crocin glycoside is produced in high yield under ultra-high pressure conditions, the method according to the present invention can industrially mass-produce crocin glycoside.
도 1은 본 발명의 일 실시예에서 압력조건에 따른 크로신 배당체의 변환율(A) 및 변환된 크로신 배당체의 생합성 조성(B)을 확인한 결과 그래프이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에서 변환된 크로신 배당체 화합물을 TCL 분석(A), UV-visible spectrum 분석(B) 또는 크로마토그램 분석(C) 방법으로 분석한 결과 그래프이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에서 수득된 크로신 배당체의 혼합물(A)과 크로신 배당체의 단일물질인 크로신-1당(B), 크로신-2당(C) 및 크로신-3당(D)을 MALDI-TOF-MS 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에서 확인된 크로신 배당체의 구조를 나타내는 그림이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에서 크로신 배당체의 글루타메이트에 의한 신경세포독성 보호 효과를 확인한 결과 그래프(A) 및 사진(B)이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에서 크로신 배당체의 세포독성을 확인한 결과 그래프이다.
도 7은 본 발명에 따른 크로신 배당체의 제조방법을 나타내는 모식도이다.Figure 1 is a graph showing the results of confirming the conversion rate (A) of crocin glycosides and the biosynthetic composition (B) of converted crocin glycosides according to pressure conditions in one embodiment of the present invention.
Figure 2 is a graph showing the results of analyzing the crocin glycoside compound converted in one embodiment of the present invention by TCL analysis (A), UV-visible spectrum analysis (B), or chromatogram analysis (C) method.
Figure 3 shows a mixture of crocin glycosides (A) obtained in an example of the present invention and the single substances of crocin glycosides, crocin-monosaccharide (B), crocin-disaccharide (C), and crocin-3. This is a graph showing the results of MALDI-TOF-MS analysis of sugar (D).
Figure 4 is a diagram showing the structure of crocin glycoside confirmed in one embodiment of the present invention.
Figure 5 is a graph (A) and a photograph (B) showing the results of confirming the protective effect of crocin glycoside against neuronal cytotoxicity caused by glutamate in an embodiment of the present invention.
Figure 6 is a graph showing the results of confirming the cytotoxicity of crocin glycosides in an example of the present invention.
Figure 7 is a schematic diagram showing the method for producing crocin glycosides according to the present invention.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.
본 발명은 크로신(crocin)에 1개 이상의 당(sugar) 단위가 α결합으로 결합된 크로신 배당체를 제공한다.The present invention provides a crocin glycoside in which one or more sugar units are linked to crocin through an α bond.
본 명세서에 사용된 용어, "크로신(crocin)"은 샤프란에 포함된 카로티노이드 중 하나로, 이당류 겐티오비오스(gentiobiose)와 디카르복실산 크로세틴으로부터 형성되는 디에스테르를 의미한다. 크로신은 항산화 활성 및 신경보호 활성과 같은 생리활성을 나타내는 것으로 알려져 있으며, 또한 항암 활성도 나타낸다고 알려져 있다. 상기 크로신은 통상의 기술분야에 크로신으로 알려진 모든 화합물을 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 크로신은 하기 화학식 4로 표시되는 화합물일 수 있다:As used herein, the term "crocin" is one of the carotenoids contained in saffron and refers to a diester formed from the disaccharide gentiobiose and the dicarboxylic acid crocetin. Crocin is known to exhibit physiological activities such as antioxidant and neuroprotective activities, and is also known to exhibit anticancer activity. The crocin may include all compounds known as crocin in the art. Specifically, the crocin may be a compound represented by the following formula (4):
[화학식 4][Formula 4]
. .
본 명세서에서 사용된 용어, "배당체(glucoside)"는 식물에 분포하고 있는 성분의 하나로, 산, 알칼리 또는 가수분해효소 등의 작용으로 당과 아글리콘 또는 게닌으로 알려진 비당(non-sugar)으로 분리되는 물질을 의미한다. 일반적으로 비당 부분은 수산기를 사이에 두고 당과 에테르 결합을 하고 있으나, 겨자유 배당체와 같이 티오글루코시드 결합을 할 수도 있다. 즉, 본 명세서에서 사용된 용어, "크로신 배당체"는 크로신에 당이 결합한 형태의 화합물을 의미한다.As used herein, the term "glucoside" is one of the components distributed in plants, which is separated into sugar and non-sugar known as aglycone or genin by the action of acid, alkali, or hydrolytic enzymes. means a substance that becomes In general, the non-sugar portion has an ether bond with the sugar with a hydroxyl group in between, but it can also have a thioglucoside bond like mustard oil glycosides. That is, the term “crocin glycoside” used herein refers to a compound in which a sugar is bound to crocin.
상기 당은 통상의 기술분야에 알려진 모든 형태의 당을 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 당은 단당류, 이당류 및 삼당류 등을 모두 포함할 수 있고, 일례로, 상기 당은 글루코오스(glucose), 프룩토오스(fructose), 만노오스(mannose), 갈락토오스(galactose), 자일로스(xylose), 아라비노오스(arabinose) 및 푸코오스(fucose)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.The sugar may include all types of sugar known in the art. Specifically, the sugar may include all monosaccharides, disaccharides, and trisaccharides. For example, the sugar may include glucose, fructose, mannose, galactose, and xylose. It may be any one or more selected from the group consisting of xylose, arabinose, and fucose.
본 발명에 따른 크로신 배당체는 크로신에 1개 이상의 당이 통상적인 형태로 결합된 것일 수 있고, 구체적으로 상기 결합은 α결합일 수 있다. 일례로, 상기 크로신 배당체는 당 단위가 1개 이상, 1 내지 10개, 1 내지 8개, 1 내지 6개, 1 내지 4개 또는 1 내지 3개 결합된 것일 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 일 실시예에서, 상기 크로신 배당체는 하기 화학식 1 내지 3으로 표시될 수 있다:The crocin glycoside according to the present invention may be one or more sugars bonded to crocin in a conventional form, and specifically, the bond may be an α bond. For example, the crocin glycoside may be one in which one or more, 1 to 10, 1 to 8, 1 to 6, 1 to 4, or 1 to 3 sugar units are bonded. Specifically, in one embodiment of the present invention, the crocin glycoside may be represented by the following formulas 1 to 3:
[화학식 1][Formula 1]
[화학식 2][Formula 2]
[화학식 3][Formula 3]
. .
또한, 본 발명은 상기 크로신 배당체를 포함하는 조성물을 제공한다.Additionally, the present invention provides a composition containing the crocin glycoside.
상기 조성물은 상술한 바와 같은 특징을 갖는 크로신 배당체를 포함할 수 있다. 일례로, 상기 크로신 배당체는 크로신에 1개 이상의 당 단위가 α결합으로 결합된 것일 수 있다. 상기 당 단위는 1개 이상, 1 내지 10개, 1 내지 8개, 1 내지 6개, 1 내지 4개 또는 1 내지 3개 결합될 수 있고, 결합될 수 있는 당은 글루코오스, 프룩토오스, 만노오스, 갈락토오스, 자일로스, 아라비노오스 및 푸코오스로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.The composition may include crocin glycosides having the characteristics described above. For example, the crocin glycoside may be one or more sugar units bound to crocin through an α-bond. More than 1, 1 to 10, 1 to 8, 1 to 6, 1 to 4, or 1 to 3 sugar units may be bonded, and the sugars that can be bonded include glucose, fructose, and mannose. , it may be any one or more selected from the group consisting of galactose, xylose, arabinose, and fucose.
또한, 본 발명은 상기 크로신 배당체를 유효성분으로 포함하는 뇌질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.In addition, the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating brain diseases containing the crocin glycoside as an active ingredient.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 상술한 바와 같은 특징을 갖는 크로신 배당체를 포함할 수 있다. 일례로, 상기 크로신 배당체는 크로신에 1개 이상의 당 단위가 α결합으로 결합된 것일 수 있다. 상기 당 단위는 1개 이상, 1 내지 10개, 1 내지 8개, 1 내지 6개, 1 내지 4개 또는 1 내지 3개 결합될 수 있고, 결합될 수 있는 당은 글루코오스, 프룩토오스, 만노오스, 갈락토오스, 자일로스, 아라비노오스 및 푸코오스로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.The pharmaceutical composition according to the present invention may contain crocin glycosides having the characteristics described above. For example, the crocin glycoside may be one or more sugar units bound to crocin through an α-bond. More than 1, 1 to 10, 1 to 8, 1 to 6, 1 to 4, or 1 to 3 sugar units may be bonded, and the sugars that can be bonded include glucose, fructose, and mannose. , it may be any one or more selected from the group consisting of galactose, xylose, arabinose, and fucose.
상기 뇌질환은 통상의 기술분야에 알려진 뇌질환을 모두 포함할 수 있고, 구체적으로, 신경퇴행성(neurodegenerative) 뇌질환일 수 있다. 일례로, 상기 신경퇴행성 뇌질환은 치매, 알츠하이머 질환, 파킨슨 질환, 헌팅턴 질환, 근위촉성 촉석 경화증, 뇌허혈 또는 뇌출혈일 수 있다.The brain disease may include all brain diseases known in the art, and may specifically be a neurodegenerative brain disease. For example, the neurodegenerative brain disease may be dementia, Alzheimer's disease, Parkinson's disease, Huntington's disease, proximal pallial sclerosis, cerebral ischemia, or cerebral hemorrhage.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 조성물 전체 중량에 대하여 유효성분인 일본 크로신 배당체를 10 내지 95 중량%로 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 약학적 조성물은 상기 유효성분 이외에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 추가로 포함할 수 있다.The pharmaceutical composition according to the present invention may contain 10 to 95% by weight of Japanese crocin glycoside, an active ingredient, based on the total weight of the composition. In addition, the pharmaceutical composition of the present invention may further include one or more active ingredients that exhibit the same or similar functions in addition to the above-mentioned effective ingredients.
본 발명의 약학적 조성물은 생물학적 제제에 통상적으로 사용되는 담체, 희석제, 부형제 또는 이의 혼합물을 포함할 수 있다. 약학적으로 허용가능한 담체는 조성물을 생체 내에 전달하는데 적합한 것이면 모두 사용할 수 있다. 구체적으로, 상기 담체는 Merck Index, 13th ed., Merck & Co. Inc.에 기재된 화합물, 식염수, 멸균수, 링거액, 덱스트로스 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 또는 이의 혼합물일 수 있다. 또한, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등과 같은 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다.The pharmaceutical composition of the present invention may include carriers, diluents, excipients, or mixtures thereof commonly used in biological products. Any pharmaceutically acceptable carrier can be used as long as it is suitable for delivering the composition in vivo. Specifically, the carrier is Merck Index, 13th ed., Merck & Co. Inc., saline solution, sterile water, Ringer's solution, dextrose solution, maltodextrin solution, glycerol, ethanol, or mixtures thereof. Additionally, conventional additives such as antioxidants, buffers, bacteriostatic agents, etc. can be added as needed.
상기 조성물을 제제화하는 경우, 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 첨가할 수 있다.When formulating the composition, commonly used diluents or excipients such as fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrants, and surfactants may be added.
본 발명의 조성물은 경구용 제제 또는 비경구용 제제로 제형화될 수 있다. 경구용 제제로는 고형 제제 및 액상 제제가 포함될 수 있다. 상기 고형 제제는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 또는 트로키제일 수 있고, 이러한 고형 제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제를 첨가하여 조제할 수 있다. 상기 부형제는 전분, 탄산칼슘, 수크로스, 락토오스, 젤라틴 또는 이의 혼합물일 수 있다. 또한, 상기 고형 제제는 윤활제를 포함할 수 있고, 그 예로는 마그네슘 스티레이트, 탈크등이 있다. 한편, 상기 액상 제제는 현탁제, 내용액제, 유제 또는 시럽제일 수 있다. 이때, 상기 액상 제제에는 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등과 같은 부형제가 포함될 수 있다.The composition of the present invention may be formulated as an oral preparation or a parenteral preparation. Oral preparations may include solid preparations and liquid preparations. The solid preparation may be a tablet, pill, powder, granule, capsule, or troche, and such solid preparation may be prepared by adding at least one excipient to the composition. The excipient may be starch, calcium carbonate, sucrose, lactose, gelatin, or mixtures thereof. Additionally, the solid preparation may contain a lubricant, examples of which include magnesium styrate and talc. Meanwhile, the liquid preparation may be a suspension, oral solution, emulsion, or syrup. At this time, the liquid formulation may contain excipients such as wetting agents, sweeteners, fragrances, preservatives, etc.
상기 비경구용 제제는 주사제, 좌제, 호흡기 흡입용 분말, 스프레이용 에어로졸제, 파우더 및 크림 등을 포함할 수 있다. 상기 주사제는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁용제, 유제 등을 포함할 수 있다. 이때, 비수성용제 또는 현탁용제로서는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름이나, 에틸올레이트와 같이 주사가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.The parenteral preparations may include injections, suppositories, powders for respiratory inhalation, aerosol sprays, powders and creams. The injection may include sterilized aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, etc. At this time, the non-aqueous solvent or suspension may be propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, or injectable ester such as ethyl oleate.
본 발명의 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 또는 비경구로 투여될 수 있다. 비경구 투여는 복강내, 직장내, 피하, 정맥, 근육내 또는 흉부내 주사 방식을 포함할 수 있다.The composition of the present invention can be administered orally or parenterally depending on the desired method. Parenteral administration may include intraperitoneal, intrarectal, subcutaneous, intravenous, intramuscular, or intrathoracic injection.
상기 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있다. 이는 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 환자의 민감도, 투여 시간, 투여 경로, 치료기간, 동시에 사용되는 약물 등에 따라 달라질 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서, 본 발명에 따른 약학적 조성물에 포함되는 유효성분의 양은 0.0001 내지 1,000 ㎎/㎏, 구체적으로 0.001 내지 500 ㎎/㎏일 수 있다. 상기 투여는 하루에 1회 수회일 수 있다.The composition can be administered in a pharmaceutically effective amount. This may vary depending on the type of disease, severity, activity of the drug, patient's sensitivity to the drug, administration time, administration route, treatment period, drugs used simultaneously, etc. However, for a desirable effect, the amount of the active ingredient included in the pharmaceutical composition according to the present invention may be 0.0001 to 1,000 mg/kg, specifically 0.001 to 500 mg/kg. The administration may be once or several times a day.
본 발명의 조성물은 단독 또는 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있다. 병용 투여시, 투여는 순차적 또는 동시일 수 있다.The composition of the present invention can be administered alone or in combination with other therapeutic agents. When administered in combination, administration may be sequential or simultaneous.
또한, 본 발명은 상기 크로신 배당체를 유효성분으로 포함하는 뇌질환 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.In addition, the present invention provides a health functional food for preventing or improving brain diseases containing the crocin glycoside as an active ingredient.
본 발명에 따른 건강기능식품은 상술한 바와 같은 특징을 갖는 크로신 배당체를 포함할 수 있다. 일례로, 상기 크로신 배당체는 크로신에 1개 이상의 당 단위가 α결합으로 결합된 것일 수 있다. 상기 당 단위는 1개 이상, 1 내지 10개, 1 내지 8개, 1 내지 6개, 1 내지 4개 또는 1 내지 3개 결합될 수 있고, 결합될 수 있는 당은 글루코오스, 프룩토오스, 만노오스, 갈락토오스, 자일로스, 아라비노오스 및 푸코오스로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.The health functional food according to the present invention may contain crocin glycosides having the characteristics described above. For example, the crocin glycoside may be one or more sugar units bound to crocin through an α-bond. More than 1, 1 to 10, 1 to 8, 1 to 6, 1 to 4, or 1 to 3 sugar units may be bonded, and the sugars that can be bonded include glucose, fructose, and mannose. , it may be any one or more selected from the group consisting of galactose, xylose, arabinose, and fucose.
또한, 상기 뇌질환은 통상의 기술분야에 알려진 뇌질환을 모두 포함할 수 있고, 구체적으로, 신경퇴행성 뇌질환일 수 있다. 일례로, 상기 신경퇴행성 뇌질환은 치매, 알츠하이머 질환, 파킨슨 질환, 헌팅턴 질환, 근위촉성 촉석 경화증, 뇌허혈 또는 뇌출혈일 수 있다.Additionally, the brain disease may include all brain diseases known in the art, and may specifically be a neurodegenerative brain disease. For example, the neurodegenerative brain disease may be dementia, Alzheimer's disease, Parkinson's disease, Huntington's disease, proximal pallial sclerosis, cerebral ischemia, or cerebral hemorrhage.
본 발명의 크로신 배당체은 식품에 그대로 첨가하거나, 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있다. 이때, 첨가되는 유효성분의 함량은 목적에 따라 결정될 수 있고, 일반적으로는 전체 식품 중량의 0.01 내지 90 중량부일 수 있다.The crocin glycoside of the present invention can be added as is to food or used together with other foods or food ingredients. At this time, the content of the active ingredient added may be determined depending on the purpose, and may generally be 0.01 to 90 parts by weight of the total weight of the food.
건강기능식품의 형태 및 종류는 특별히 제한되지 않는다. 구체적으로, 상기 건강기능식품은 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상 및 환의 형태일 수 있다. 상기 건강기능식품은 추가성분으로서 여러 가지 향미제, 감미제 또는 천연 탄수화물을 포함할 수 있다. 상기 감미제는 천연 또는 합성 감미제일 수 있고, 천연 감미제의 예로는 타우마틴, 스테비아 추출물 등이 있다. 한편, 합성 감미제의 예로는 사카린, 아스파르탐 등이 있다. 또한, 상기 천연 탄수화물은 모노사카라이드, 디사카라이드, 폴리사카라이드, 올리고당 및 당알코올 등일 수 있다.The form and type of health functional food are not particularly limited. Specifically, the health functional food may be in the form of tablets, capsules, powders, granules, liquids, and pills. The health functional food may contain various flavors, sweeteners, or natural carbohydrates as additional ingredients. The sweetener may be a natural or synthetic sweetener, and examples of natural sweeteners include thaumatin and stevia extract. Meanwhile, examples of synthetic sweeteners include saccharin and aspartame. Additionally, the natural carbohydrate may be monosaccharide, disaccharide, polysaccharide, oligosaccharide, sugar alcohol, etc.
본 발명의 건강기능식품은 상기 서술한 추가성분 외에, 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙스탄 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올 등을 더 포함할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합으로 사용될 수 있다. 상기 첨가제의 비율은 본 발명의 조성물의 100 중량부당 0.01 내지 0.1 중량부의 범위에서 선택될 수 있다.In addition to the additional ingredients described above, the health functional food of the present invention contains nutrients, vitamins, electrolytes, flavors, colorants, pexane and its salts, alginic acid and its salts, organic acids, protective colloidal thickeners, pH adjusters, stabilizers, and preservatives. , glycerin, alcohol, etc. may be further included. These ingredients can be used independently or in combination. The ratio of the additive may be selected in the range of 0.01 to 0.1 parts by weight per 100 parts by weight of the composition of the present invention.
또한, 본 발명은 상기 크로신 배당체를 유효성분으로 포함하는 신경보호용 건강기능식품을 제공한다.In addition, the present invention provides a health functional food for neuroprotection containing the crocin glycoside as an active ingredient.
본 발명에 따른 건강기능식품은 상술한 바와 같은 특징을 갖는 크로신 배당체를 포함할 수 있다. 상기 건강기능식품은 신경보호 활성을 가질 수 있고, 구체적으로 상기 신경보호 활성은 글루타메이트에 의해 유발되는 신경독성으로부터의 보호 활성일 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 건강기능식품은 상기 서술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다.The health functional food according to the present invention may contain crocin glycosides having the characteristics described above. The health functional food may have neuroprotective activity, and specifically, the neuroprotective activity may be a protective activity against neurotoxicity caused by glutamate. Additionally, the health functional food according to the present invention may have the characteristics described above.
또한, 본 발명은 크로신, 당 및 당전이효소의 혼합물을 초고압 처리하는 단계를 포함하는 본 발명 따른 크로신 배당체 제조방법을 제공한다.Additionally, the present invention provides a method for producing crocin glycosides according to the present invention, which includes the step of treating a mixture of crocin, sugar, and glycosyltransferase under ultra-high pressure.
본 발명에 따른 제조방법으로 제조되는 크로신 배당체는 상기 서술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다.Crocin glycosides prepared by the production method according to the present invention may have the characteristics described above.
상기 제조방법에서 당은 통상의 기술분야에 알려진 모든 형태의 당을 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 당은 단당류, 이당류 및 삼당류 등을 모두 포함할 수 있고, 일례로, 상기 당은 글루코오스, 프룩토오스, 만노오스, 갈락토오스, 자일로스(xylose), 아라비노오스 및 푸코오스로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.In the above production method, sugar may include all types of sugar known in the art. Specifically, the sugar may include all monosaccharides, disaccharides, and trisaccharides. For example, the sugar is composed of glucose, fructose, mannose, galactose, xylose, arabinose, and fucose. It may be any one or more selected from the group.
본 명세서에서 사용된 용어, "당전이효소(glycosyltransferase)"는 당의 전이에 관여하는 전이 효소의 총칭으로 다당류, 소당류, 배당체 등과 같은 각 당류의 합성, 분해에 관여한다. 구체적으로, 상기 당전이효소는 덱스트란수크라아제(dextransucrase), 얼터나수크라아제(alternansucrase), 그리칸수크라아제(glucansucrase), 레반수크라아제(levansucrase), CGTase(cyclodextringlucanotransferase) 및 갈락토시다아제(galactosidase)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.As used herein, the term “glycosyltransferase” is a general term for transferases involved in the transfer of sugars and is involved in the synthesis and decomposition of each saccharide such as polysaccharides, oligosaccharides, and glycosides. Specifically, the glycosyltransferase is dextransucrase, alternansucrase, glucansucrase, levansucrase, cyclodextringlucanotransferase (CGTase), and galactosidase. It may be any one or more selected from the group consisting of (galactosidase).
상기 제조방법에서 초고압 처리는 통상의 기술자에 의해 적절하게 수행될 수 있다. 구체적으로, 상기 초고압은 30 내지 200 ㎫, 30 내지 170 ㎫, 30 내지 130 ㎫, 50 내지 200 ㎫, 50 내지 170 ㎫, 50 내지 130 ㎫, 70 내지 200 ㎫, 70 내지 170 ㎫ 또는 70 내지 130 ㎫의 압력으로 처리될 수 있다. 이때, 초고압은 3시간 이상, 구체적으로 3 내지 30시간 동안, 20℃이상, 구체적으로 20 내지 40℃의 온도에서 처리될 수 있다.In the above manufacturing method, ultra-high pressure treatment can be appropriately performed by a person skilled in the art. Specifically, the ultra-high pressure is 30 to 200 MPa, 30 to 170 MPa, 30 to 130 MPa, 50 to 200 MPa, 50 to 170 MPa, 50 to 130 MPa, 70 to 200 MPa, 70 to 170 MPa, or 70 to 130 MPa. ㎫ It can be treated with a pressure of At this time, ultra-high pressure may be applied at a temperature of 20°C or higher, specifically 20 to 40°C, for 3 hours or more, specifically 3 to 30 hours.
본 발명에 따른 크로신 배당체 제조방법은 초고압 처리로 수득된 크로신 배당체 혼합물을 단일물질로 정제하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 정제는 통상의 기술분야에 알려진 방법으로 수행될 수 있으며, 이때, 상기 방법은 통상의 기술자에 의해 적절히 변형되어 수행될 수 있다.The method for producing crocin glycosides according to the present invention may further include the step of purifying the crocin glycoside mixture obtained by ultra-high pressure treatment into a single substance. The purification may be performed by a method known in the art, and in this case, the method may be appropriately modified and performed by a person skilled in the art.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 이들에 의해 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 청구범위에 기재된 기술적 사상과 실질적으로 동일한 구성을 갖고 동일한 작용 효과를 이루는 것은 어떠한 것이라도 본 발명의 기술적 범위에 포함된다.Hereinafter, the present invention will be explained in detail by the following examples. However, the following examples only illustrate the present invention, and the present invention is not limited thereto. Anything that has substantially the same structure as the technical idea described in the claims of the present invention and achieves the same operation and effect is included in the technical scope of the present invention.
실시예 1. 크로신 배당체의 제조를 위한 압력조건 확인Example 1. Confirmation of pressure conditions for production of crocin glycoside
크로신 배당체의 제조를 위한 최적의 압력조건을 다음과 같은 방법으로 확인하였다.The optimal pressure conditions for the production of crocin glycosides were confirmed by the following method.
구체적으로, 20 mM의 크로신(crocin), 500 mM의 설탕 및 1 unit/㎖의 덱스트란수크라아제(dextransucrase)를 20 mM의 소듐 아세테이트(sodium acetate)(pH 5.2)에 첨가하여 혼합액을 제조하였다. 제조된 혼합액을 28℃ 온도하에서, 0.1, 50, 100 또는 150 ㎫의 압력으로 7시간 동안 초고압 장비에 넣고 반응시켰다. 반응 후, 크로신 배당체의 변환율을 도 1A에 변환된 크로신 배당체의 생합성 조성을 도 1B에 나타내었다.Specifically, 20mM crocin, 500mM sugar, and 1 unit/ml dextransucrase were added to 20mM sodium acetate (pH 5.2) to prepare a mixed solution. did. The prepared mixed solution was reacted in ultra-high pressure equipment at a temperature of 28°C and a pressure of 0.1, 50, 100, or 150 MPa for 7 hours. After the reaction, the conversion rate of crocin glycoside is shown in Figure 1A and the biosynthetic composition of the converted crocin glycoside is shown in Figure 1B.
도 1A에 나타난 바와 같이, 100 ㎫의 초고압 조건에서 크로신 배당체 변환율이 64.9%로 가장 우수하였고, 이는 대기압인 0.1 ㎫에서의 크로신 배당체 변환율인 33.2% 보다 약 1.95배 높았다. 150 ㎫에서는 오히려 크로신 배당체 변환율이 47.2%로 감소하였다. 또한, 도 1B에 나타난 바와 같이, 100 ㎫에서 모든 크로신 배당체의 생합성량이 가장 우수하였다.As shown in Figure 1A, the crocin glycoside conversion rate was the highest at 64.9% under ultra-high pressure conditions of 100 MPa, which was about 1.95 times higher than the crocin glycoside conversion rate of 33.2% at 0.1 MPa, which is atmospheric pressure. At 150 MPa, the crocin glycoside conversion rate decreased to 47.2%. Additionally, as shown in Figure 1B, the biosynthetic amount of all crocin glycosides was the highest at 100 MPa.
따라서, 상기로부터 덱스트란수크라아제를 이용한 크로신 배당체화 반응에서 100 ㎫가 최적 압력조건임을 확인하였다.Therefore, from the above, it was confirmed that 100 MPa is the optimal pressure condition in the crocin glycosidization reaction using dextransucrase.
실시예 2. 제조된 크로신 배당체의 양 확인Example 2. Confirmation of the amount of prepared crocin glycoside
상기에서 100 ㎫ 압력으로 합성된 크로신 배당체의 양을 TLC 분석 방법으로 다음과 같이 확인하였다.The amount of crocin glycoside synthesized above at a pressure of 100 MPa was confirmed using TLC analysis as follows.
구체적으로, 초고압 반응시킨 실시예 1에서 제조된 혼합액을 1 ㎕를 실리카겔 60F254 TLC 플레이트에 점적하고, n-부탄올:아세트산:물을 4:1:1의 부피비로 혼합한 혼합액으로 전개하였다. 전개가 완료된 TLC 플레이트는 용매를 완전히 건조시키고, 가시광선 영역에서 노란색의 스팟(spot)을 확인하였다. 이후, 0.5%(w/v) N-(1-나프틸)에틸렌디아민 디하이드로클로라이드 및 5%(w/v) 황산을 포함하는 메탄올을 TLC 플레이트에 처리하고, 125℃에서 10분 동안 발색시켜 청보라색 스팟을 확인하고, 그 결과를 도 2A에 나타내었다. 이때, 크로신 배당체 화합물의 양은 AlphaEaseFC 4.0 프로그램(Alpha Inotech, 미국)을 이용하여 계산하였다.Specifically, 1 ㎕ of the ultra-high pressure reaction mixture prepared in Example 1 was dropped onto a silica gel 60F254 TLC plate and developed into a mixture of n-butanol:acetic acid:water in a volume ratio of 4:1:1. On the TLC plate where development was completed, the solvent was completely dried, and a yellow spot was confirmed in the visible light region. Afterwards, methanol containing 0.5% (w/v) N-(1-naphthyl)ethylenediamine dihydrochloride and 5% (w/v) sulfuric acid was treated on the TLC plate, and color was developed at 125°C for 10 minutes. A blue-purple spot was identified, and the results are shown in Figure 2A. At this time, the amount of crocin glycoside compound was calculated using the AlphaEaseFC 4.0 program (Alpha Inotech, USA).
한편, 상기 합성된 크로신 배당체를 통상적인 UV-visible sepctrum 또는 크로마토그램 분석 방법으로 분석한 결과를 각각 도 2B 및 2C에 나타내었다.Meanwhile, the results of analyzing the synthesized crocin glycoside using conventional UV-visible sepctrum or chromatogram analysis methods are shown in Figures 2B and 2C, respectively.
실시예 3. 크로신 배당체 혼합물의 1차 정제Example 3. Primary purification of crocin glycoside mixture
상기에서 100 ㎫ 압력으로 제조된 크로신 배당체에 포함된 당을 다음과 같은 방법으로 제거하고 동결건조 시료를 수득하였다.The sugar contained in the crocin glycoside prepared above at a pressure of 100 MPa was removed by the following method, and a freeze-dried sample was obtained.
구체적으로, 초고압 반응시킨 실시예 1에서 제조된 혼합액을 HP-20 레진으로 채워진 오픈컬럼에 첨가하여, 이의 상부 레진에 흡착되게 하였다. 이후, 1차 증류수를 용출액으로 사용하여 배당체를 분리시켜 1차 정제를 수행하였다. 1차 정제에 의해 수득된 산물에 함유된 잔류 에탄올을 감압농축기로 증발시켜 제거한 뒤, 이를 -80℃에서 동결건조하여 파우더 형태의 크로신 배당체 혼합물을 수득하였다.Specifically, the mixed solution prepared in Example 1 subjected to ultra-high pressure reaction was added to an open column filled with HP-20 resin, and was adsorbed to the upper resin of the open column. Afterwards, primary purification was performed by separating glycosides using primary distilled water as an eluent. The residual ethanol contained in the product obtained by the first purification was removed by evaporation using a vacuum concentrator, and then lyophilized at -80°C to obtain a crocin glycoside mixture in powder form.
실시예 4. 크로신 배당체의 2차 정제Example 4. Secondary purification of crocin glycosides
실시예 3에서 수득한 파우더 형태의 크로신 배당체 혼합물을 DMSO에 100 ㎎/㎖의 농도가 되도록 용해시켰다. 상기 용해액을 Prep용 C18 컬럼(Kinetex 5 μ, C18 100A, AXIA Packed Column 250×21.2 ㎜)이 장착된 Prep-LC에 주입하고, 물과 아세토니트릴 혼합액을 용출액으로 사용하여 크로신 배당체를 단일물질로 용리시켰다.The powdered crocin glycoside mixture obtained in Example 3 was dissolved in DMSO to a concentration of 100 mg/ml. The solution was injected into Prep-LC equipped with a Prep C18 column (Kinetex 5 μ, C18 100A, AXIA Packed Column 250×21.2 mm), and a mixture of water and acetonitrile was used as an eluent to extract crocin glycoside as a single substance. It was eluted with .
실시예 5. 크로신 배당체의 구조분석Example 5. Structural analysis of crocin glycosides
먼저, 실시예 4에서 수득한 크로신 배당체의 단일물질(크로신-1당, 크로신-2당 및 크로신-3당)을 각각 1 ㎎씩 DMSO에 용해시켜 시료로서 준비하였다. 준비된 시료에 포함된 각 크로신 배당체 단일물질의 질량을 MALDI-TOF-MS 질량분석장비를 사용하여 측정하였다. 측정 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, 크로신-1당은 1161.6270(크로신+Na+5 글루코스), 크로신-2당은 1323.6794(크로신+Na+6 글루코스), 크로신-3당은 1485.7325(크로신+Na+7 글루코스)의 질량을 나타냈다.First, 1 mg of each crocin glycoside single substance (crocin-1 sugar, crocin-2 sugar, and crocin-3 sugar) obtained in Example 4 was dissolved in DMSO to prepare a sample. The mass of each crocin glycoside single substance included in the prepared sample was measured using MALDI-TOF-MS mass spectrometry equipment. As a result of the measurement, as shown in Figure 3, crocin-1 sugar is 1161.6270 (crocin + Na + 5 glucose), crocin-2 sugar is 1323.6794 (crocin + Na + 6 glucose), and crocin-3 sugar is 1161.6270 (crocin + Na + 5 glucose). It showed a mass of 1485.7325 (crocin+Na+7 glucose).
상기 크로신 배당체 단일물질의 질량 분석 결과를 참고하여 크로신의 아글리콘(aglycone) 형태인 크로세틴(crocetin)의 당부위에 에스터 결합된 포도당의 갯수를 예측하였다. 크로신에 추가로 결합된 포도당의 결합 형태 및 위치는 핵자기공명분광기(Bruker NMR, 850 ㎒)를 이용하여 분석하였다. 1차원 NMR 분석은 1H와 13C를, 2차원 NMR 분석은 COSY, HSQC, HMBC, NOESY 및 TOCSY를 수행하였다. 그 결과 NMR 분석으로 획득한 크로신 배당체의 각 탄소 위치에 해당하는 화학 이동(chemical shift) 결과를 하기 표 1 및 2에 나타내었고 이를 기초로 예상한 각 배당체의 구조를 도 4에 나타내었다.The number of glucose ester bound to the sugar moiety of crocetin, an aglycone form of crocin, was predicted by referring to the mass spectrometry results of the single crocin glycoside substance. The binding form and location of glucose additionally bound to crocin were analyzed using nuclear magnetic resonance spectroscopy (Bruker NMR, 850 MHz). One-dimensional NMR analysis was performed for 1 H and 13 C, and two-dimensional NMR analysis was performed for COZY, HSQC, HMBC, NOESY, and TOCSY. As a result, the chemical shift results corresponding to each carbon position of the crocin glycoside obtained by NMR analysis are shown in Tables 1 and 2 below, and the structures of each glycoside predicted based on these are shown in Figure 4.
표 1, 2 및 도 4에 나타낸 바와 같이, 크로신-1당은 크로세틴에 삼중포도당(tri-glucose) 그룹과 겐티오비오스(gentiobiose) 그룹으로 결합되어 있는 구조이며, 새롭게 결합된 포도당은 기존 겐티오비오스 그룹에 α결합으로 첨가되어 삼중포도당 그룹을 형성하였다.As shown in Tables 1, 2, and Figure 4, crocin-1 sugar has a structure in which a tri-glucose group and a gentiobiose group are bound to crocetin, and the newly bound glucose is the existing sugar. It was added to the gentiobiose group through an α bond to form a triple glucose group.
한편, NMR 데이터 중, 짝지음 상수(coupling constant(J)) 값의 크기로 포도당 사이의 결합 형태를 판별할 수 있다(J가 6미만이면 α결합, J가 6초과이면 β결합). 이에 기초하였을 때, 종래 크로신 당부위인 겐티오비오스 그룹은 포도당 사이에 β-1,6 결합 형태를 갖는 것이 알려져 있는데, C-1 탄소위치에 결합된 프로톤(proton)의 짝지음 상수(J=9.8 ㎐, 8.0 ㎐)로 β-1,6 결합 형태를 확인하였다. 반면, 겐티오비오스 그룹에 새로 포도당이 첨가되어 생합성된 삼중포도당 그룹은, 세번째 포도당 연결부위의 C-1 탄소위치에 결합된 프로톤의 짝지음 상수(J=3.59 ㎐)로 α-1,6 결합 형태임을 확인하였다.Meanwhile, among NMR data, the type of bond between glucose can be determined by the size of the coupling constant (J) value (α bond if J is less than 6, β bond if J is more than 6). Based on this, it is known that the gentiobiose group, which is the conventional crocin sugar moiety, has a β-1,6 bond form between glucose, and the coupling constant of the proton bound to the C-1 carbon position (J= 9.8 Hz, 8.0 Hz), the β-1,6 bond form was confirmed. On the other hand, the triple glucose group biosynthesized by adding glucose to the gentiobiose group is α-1,6 bonded with the coupling constant (J = 3.59 Hz) of the proton bonded to the C-1 carbon position of the third glucose linkage site. The shape was confirmed.
크로신-3당은, 크로세틴에 삼중포도당 그룹과 사중포도당(tetra-glucose) 그룹이 결합된 구조로, 크로신-1당처럼 배당체화로 새로 첨가된 포도당이 α결합을 형성하였다. 당부위의 C-1 탄소위치 및 C-1'에 결합된 프로톤들의 짝지음 상수는 J=7.8 ㎐로 동일하여 모두 β-1,6 결합 형태를 나타내었다. 반면, 크로신에 새로 첨가된 3개의 포도당들의 C-1'' 및 C-1''' 탄소위치에 결합된 프로톤의 짝지음 상수는 J=3.6 ㎐로 모두 동일하여, α-1,6 결합 형태임을 확인하였다.Crocin-trisaccharide is a structure in which a triple-glucose group and a tetra-glucose group are bonded to crocetin, and like crocin-saccharide, newly added glucose through glycosidization forms an α-bond. The coupling constants of the protons bonded to the C-1 carbon position and C-1' of the sugar moiety were the same at J = 7.8 Hz, indicating a β-1,6 bond form. On the other hand, the coupling constants of the protons bonded to the C-1'' and C-1''' carbon positions of the three newly added glucoses to crocin are all the same at J = 3.6 Hz, resulting in an α-1,6 bond The shape was confirmed.
한편, 크로신-2당은 생산량이 매우 적어 NMR 분석 결과를 얻을 수 없었다. 그러나, MALDI-TOF-MS 분석 결과를 통해, 크로신-2당이 크로신-1당 또는 크로신-3당과 포도당 1개의 차이만큼 질량분석 결과에 차이가 있는 것으로 보아 두개의 포도당이 α결합으로 결합되어 있을 것이라 생각되었다. 이때, 크로신-2당의 구조는 두개의 가설로 예측할 수 있었다. 첫번째 가설로는, 크로신-2당에 결합된 2개의 포도당이 겐티오비오스 그룹에 α-Glc(1→6)-α-Glc-(1→6)의 형태로 결합한 형태를 예상하였고, 다른 가설로는, 각각의 겐티오비오스 그룹 양쪽에 포도당이 1개씩 결합하여 mono-α-(1→6)를 형성하는 것을 고려하였다. 이때, 크로신-1당 및 크로신-3당의 구조를 함께 고려하여 중간산물(intermediate)인 크로신-2당의 구조를 도 4에 기재된 바와 같이 예측하였다.Meanwhile, the production amount of crocin-disaccharide was very small, so NMR analysis results could not be obtained. However, through the MALDI-TOF-MS analysis results, the mass spectrometry results showed that the difference between crocin-2 sugars was as much as the difference between crocin-1 sugar or crocin-3 sugars and one glucose, indicating that the two glucoses were α-linked. It was thought that it would be connected. At this time, the structure of crocin-disaccharide could be predicted using two hypotheses. As a first hypothesis, it was predicted that two glucose bound to crocin-disaccharide would be bound to a gentiobiose group in the form of α-Glc(1→6)-α-Glc-(1→6), and other As a hypothesis, it was considered that one glucose was bound to each side of each gentiobiose group to form mono-α-(1→6). At this time, considering the structures of crocin-mono-saccharide and crocin-tri-saccharide together, the structure of crocin-di-saccharide, which is an intermediate product, was predicted as shown in Figure 4.
실시예 6. 크로신 배당체 단일물질의 수용성 확인Example 6. Confirmation of water solubility of crocin glycoside single substance
실시예 4에서 수득한 크로신 배당체의 단일물질(크로신-1당, 크로신-2당 및 크로신-3당)과 크로신을 고형분이 석출될 때까지 25℃ 온도하에서 300 ㎕의 물이 담긴 에펜도르프 튜브에 첨가하여 용해시켰다. 고형분이 석출되면, 이를 초음파기로 25℃에서 6분 동안 충분히 용해시키고, 원심분리하여 15,000 rpm으로 15분 동안 원심분리하였다. 용해액을 0.2 ㎛의 포어(pore) 크기를 갖는 PVDF 멤브레인 필터로 여과하고, 그 여과액을 HPLC로 정량분석하여 물에 녹은 크로신 및 크로신 배당체의 최대 농도를 결정하여 하기 표 3에 나타내었다.The single substances of the crocin glycoside (crocin-1 sugar, crocin-2 sugar, and crocin-3 sugar) obtained in Example 4 and crocin were mixed with 300 ㎕ of water at a temperature of 25°C until the solids precipitated. It was dissolved by adding it to an Eppendorf tube. When the solid content precipitated, it was sufficiently dissolved in an ultrasonicator at 25°C for 6 minutes and centrifuged at 15,000 rpm for 15 minutes. The dissolved solution was filtered through a PVDF membrane filter with a pore size of 0.2 ㎛, and the filtrate was quantitatively analyzed by HPLC to determine the maximum concentration of crocin and crocin glycosides dissolved in water, which are shown in Table 3 below. .
표 3에 나타난 바와 같이, 크로신과 비교하여 크로신 배당체는 수용성이 현저히 증가하였다. 구체적으로, 크로신의 수용성 몰농도를 기준으로 크로신-1당은 5.7배, 크로신-2당은 5.1배 및 크로신-3당은 4.6배 증가하였다. 상기 결과를 통해 α-1,6 결합을 갖는 글루코실 그룹의 배당체화가 크로신의 수용성을 향상시킴을 알 수 있었다.As shown in Table 3, compared to crocin, crocin glycosides had significantly increased water solubility. Specifically, based on the water-soluble molar concentration of crocin, crocin-1 sugar increased 5.7 times, crocin-2 sugar increased 5.1 times, and crocin-3 sugar increased 4.6 times. The above results showed that glycosylation of the glucosyl group with an α-1,6 bond improved the water solubility of crocin.
실시예 7. 크로신 배당체의 항산화 활성 확인Example 7. Confirmation of antioxidant activity of crocin glycosides
실시예 4에서 수득한 크로신 배당체의 단일물질(크로신-1당, 크로신-2당 및 크로신-3당)의 항산화 활성을 HAT(hydrogen atom transfer) 방식인 ORAC(oxygen radical absorbance capacity) 분석방법으로 확인하였다.The antioxidant activity of the single substances (crocin-1 sugar, crocin-2 sugar, and crocin-3 sugar) of the crocin glycoside obtained in Example 4 was tested using ORAC (oxygen radical absorbance capacity) using HAT (hydrogen atom transfer) method. It was confirmed by analysis method.
먼저, 461 ㎎의 AAPH 시약을 75 mM PBS(pH 7.0)에 용해시켜 170 mM 농도의 AAPH 용액을 제조하였다. 또한, 플루오레스세인(fluorescein)을 75 mM PBS(pH 7.0)에 용해시켜 2.71 mM의 저장용액(stock solution)을 제조하고, 이를 희석하여 25 nM의 플루오레스세인 용액을 준비하였다. 100 ㎕의 170 mM AAPH 용액, 100 ㎕의 25 nM 플루오레스세인 및 10 ㎕의 크로신 배당체 시료를 혼합하여 반응액을 제조하고, 이의 형광(λexcitation=485 ㎚, λemission=538 ㎚)을 37℃로 유지된 분광광도계로 총 2시간 동안 3분마다 측정하였다. 이때, 트롤록스(trolox)를 표준시약으로 사용하여 크로신 및 크로신 배당체의 항산화능을 계산하여 하기 표 4에 나타내었다.First, 461 mg of AAPH reagent was dissolved in 75mM PBS (pH 7.0) to prepare an AAPH solution with a concentration of 170mM. In addition, fluorescein was dissolved in 75mM PBS (pH 7.0) to prepare a 2.71mM stock solution, and this was diluted to prepare a 25nM fluorescein solution. A reaction solution was prepared by mixing 100 ㎕ of 170 mM AAPH solution, 100 ㎕ of 25 nM fluorescein, and 10 ㎕ of crocin glycoside sample, and its fluorescence (λ excitation = 485 ㎚, λ emission = 538 ㎚) was measured at 37. Measurements were made every 3 minutes for a total of 2 hours with a spectrophotometer maintained at °C. At this time, the antioxidant capacity of crocin and crocin glycosides was calculated using trolox as a standard reagent and is shown in Table 4 below.
표 4에 나타난 바와 같이, ORAC 분석 결과 크로신 배당체가 크로신에 비해 높은 항산화 활성을 나타내었고, 특히 크로신-2당 및 크로신-3당은 현저히 우수한 항산화 활성을 나타내었다.As shown in Table 4, as a result of ORAC analysis, crocin glycosides showed higher antioxidant activity than crocin, and in particular, crocin-di-saccharide and crocin-tri-saccharide showed significantly superior antioxidant activity.
실시예 8. 크로신 배당체의 신경세포 보호 효과 확인Example 8. Confirmation of the neuronal protective effect of crocin glycoside
실시예 4에서 수득한 크로신 배당체의 단일물질(크로신-1당, 크로신-2당 및 크로신-3당)이 글루타메이트에 의해 유발되는 신경독성에 대한 보호 효과를 나타내는지 여부를 세포생존율을 분석함으로써 확인하였다.Cell viability was tested to determine whether the single substances of crocin glycosides (crocin-1 sugar, crocin-2 sugar, and crocin-3 sugar) obtained in Example 4 exhibit a protective effect against neurotoxicity induced by glutamate. This was confirmed by analyzing.
먼저, HT22 세포주를 10% FBS(fetal bovine serum) 및 1% 페니실린 및 스트렙토마이신이 포함된 DMEM/high glucose(Hyclone, 미국) 배양 배지를 이용하여 5% CO2, 37℃의 조건 하에서 배양하여 준비하였다. 준비된 HT22 세포주를 웰당 3.0×103개가 되도록 분주하고, 하룻 동안 부착시킨 뒤, 크로신, 크로신-1당, 크로신-2당 및 크로신-3당을 각각 0.61, 1.85, 5.55, 16.6 또는 50 μM의 농도로 처리하였다. 크로신 또는 크로신 배당체를 첨가한지 2시간 뒤에 5 mM 농도의 글루타메이트를 처리하고, 세포를 21시간 동안 배양하였다. 이때, 양성대조군으로서 NAC(N-acetylcysteine)을 처리하였다. 배양 후, 세포를 PBS로 세척하고, 1 mM의 카제인AM 및 1 ㎎/㎖의 프로피디움 요오드화물(propidium iodide)을 첨가하여 살아있는 세포 및 죽은 세포의 이미지를 오페레타 하이 콘텐트 이미징 시스템(Operetta high content image system, Perkin Elmer, 미국)으로 확인하였다. 상기 확인된 결과를 이용하여 세포 생존율을 계산한 결과를 도 5A, 세포 이미지를 도 5B에 나타내었다.First, the HT22 cell line was prepared by culturing under conditions of 5% CO 2 and 37°C using DMEM/high glucose (Hyclone, USA) culture medium containing 10% FBS (fetal bovine serum) and 1% penicillin and streptomycin. did. The prepared HT22 cell line was dispensed at 3.0 Treated at a concentration of 50 μM. Two hours after adding crocin or crocin glycoside, glutamate was treated at a concentration of 5 mM, and the cells were cultured for 21 hours. At this time, NAC (N-acetylcysteine) was treated as a positive control. After incubation, the cells were washed with PBS, 1 mM casein AM and 1 mg/ml propidium iodide were added, and images of live and dead cells were captured using an Operetta high content imaging system. system, Perkin Elmer, USA). The results of calculating the cell survival rate using the confirmed results are shown in Figure 5A, and the cell image is shown in Figure 5B.
도 5A 및 5B에 나타난 바와 같이, 크로신 및 크로신 배당체는 모두 글루타메이트에 의한 신경독성으로부터 세포를 보호하는 효과를 나타내었고, 이는 양성대조군인 NAC와 유사한 수준임을 확인하였다.As shown in Figures 5A and 5B, both crocin and crocin glycosides showed an effect in protecting cells from neurotoxicity caused by glutamate, and this was confirmed to be similar to that of NAC, a positive control.
실시예 9. 크로신 배당체의 세포독성 확인Example 9. Confirmation of cytotoxicity of crocin glycoside
실시예 4에서 수득한 크로신 배당체의 단일물질(크로신-1당, 크로신-2당 및 크로신-3당)의 세포독성을 Raw264.7 세포주를 사용하여 통상적인 방법으로 확인하고, 그 결과를 도 6에 나타내었다.The cytotoxicity of the single substances (crocin-1 sugar, crocin-2 sugar, and crocin-3 sugar) of the crocin glycoside obtained in Example 4 was confirmed by a conventional method using the Raw264.7 cell line, and the The results are shown in Figure 6.
도 6에 나타난 바와 같이, 3종류의 크로신 배당체는 크로신에 비해 세포독성이 더 낮았다.As shown in Figure 6, the three types of crocin glycosides had lower cytotoxicity than crocin.
따라서, 상기로부터 본 발명에 따른 크로신 배당체는 수용성이 높고 세포독성은 낮으면서도 신경세포 보호 효과를 나타내어, 생이용성이 더 높은 소재임을 알 수 있었다.Therefore, from the above, it can be seen that the crocin glycoside according to the present invention has high water solubility and low cytotoxicity while exhibiting a neuronal protective effect, making it a material with higher bioavailability.
Claims (13)
상기 크로신 배당체는 하기 화학식 1 내지 3으로 표시되는 크로신 배당체:
[화학식 1]
[화학식 2]
[화학식 3]
.
A crocin glycoside in which one or more sugar units are linked to crocin through an α bond,
The crocin glycosides are crocin glycosides represented by the following formulas 1 to 3:
[Formula 1]
[Formula 2]
[Formula 3]
.
A pharmaceutical composition for preventing or treating brain diseases comprising the crocin glycoside of claim 1 as an active ingredient.
The pharmaceutical composition for preventing or treating brain disease according to claim 6, wherein the brain disease is a neurodegenerative brain disease.
The pharmaceutical composition for preventing or treating brain diseases according to claim 7, wherein the neurodegenerative brain disease is dementia, Alzheimer's disease, Parkinson's disease, Huntington's disease, amyophyseal sclerosis, cerebral ischemia, or cerebral hemorrhage.
A health functional food for preventing or improving brain disease containing the crocin glycoside of paragraph 1 as an active ingredient.
A health functional food for neuroprotection containing the crocin glycoside of claim 1 as an active ingredient.
상기 초고압 처리는 30 내지 200 ㎫의 압력으로 처리되는 크로신 배당체 제조방법.
A method for producing crocin glycosides according to claim 1, comprising the step of ultra-high pressure treating a mixture of crocin, sugar and glycosyltransferase,
The ultra-high pressure treatment is a method of producing crocin glycosides wherein the ultra-high pressure treatment is performed at a pressure of 30 to 200 MPa.
The method of claim 11, wherein the glycosyltransferase is dextransucrase, alternansucrase, glucansucrase, levansucrase, CGTase (cyclodextringlucanotransferase), and A method for producing a crocin glycoside according to claim 1, which is at least one selected from the group consisting of lactosidase.
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