KR102584640B1 - 금 나노입자가 탑재된 양이온성 셀룰로오스 나노섬유, 이의 제조방법 및 이를 활용한 인체 혈중 포도당 간편 정량방법 - Google Patents

금 나노입자가 탑재된 양이온성 셀룰로오스 나노섬유, 이의 제조방법 및 이를 활용한 인체 혈중 포도당 간편 정량방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 양이온성 셀룰로오스 나노섬유와 금 나노입자 전구체의 혼합용액에 대하여 별도의 환원제를 사용하지 않고 마이크로파를 조사하는 방법만으로 과산화효소 유사활성을 가진 금 나노입자 셀룰로오스 나노섬유 복합체를 제조할 수 있는 장점이 있다.
본 발명의 금 나노입자 셀룰로오스 나노섬유 복합체는 금 나노입자가 양이온성 셀룰로오스 나노섬유의 표면에서 인-시츄(in-situ) 합성된다. 따라서 상기 금 나노입자는 나노섬유의 표면에 잘 분산된 상태로 합성 및 성장하므로 금 나노입자와 셀룰로오스 나노섬유(지지체) 사이의 추가적인 부착공정이 필요하지 않으며 상기 부착공정에서 발생하는 금 나노입자의 과산화효소 유사활성 저하의 우려가 없는 장점이 있다.
본 발명의 금 나노입자 셀룰로오스 나노섬유 복합체는 양전하로 하전되어 있어 분산성이 우수한 장점이 있으며 필름의 형상으로 제조하면 과산화효소 유사활성을 이용한 과산화수소 또는 포도당 검출반응 후 회수가 용이할 뿐 아니라 간단한 세척만으로도 활성이 복구되어 5회 이상 재사용이 가능한 장점이 있다.

Description

금 나노입자가 탑재된 양이온성 셀룰로오스 나노섬유, 이의 제조방법 및 이를 활용한 인체 혈중 포도당 간편 정량방법{Cationic Cellulose Nanofibers Loaded With Gold Nanoparticles, Manufacturing Method Thereof and Simple Method for Quantifying Human Blood Glucose Using It}
본 발명은 금 나노입자가 탑재된 양이온성 셀룰로오스 나노섬유, 이의 제조방법 및 이를 활용한 인체 혈중 포도당 간편 정량방법에 관한 것이다.
셀룰로오스 나노섬유, 실리카, 탄소화합물, 천연고분자 및 합성고분자와 같은 고체 지지체(supporting material)에 금속 나노 입자(metal nanoparticles, MNP)를 함성하고 이를 고정하는 기술은 광학, 전자, 촉매 및 바이오 센서와 같은 다양한 분야에 응용이 가능하다. 상기 지지체 중 셀룰로오스 나노섬유(cellulose nanofibrils, CNF)는 낮은 밀도, 뛰어난 기계적 특성, 높은 종횡비, 우수한 생체 적합성 및 화학적 안정성등의 특성을 가진 재생가능 바이오 폴리머로서 평가된다.
MNP 합성에 있어서 키토산, 검, 전분, 및 알긴산나트륨과 같은 바이오폴리머를 주형으로 사용하게 되면 MNP의 표면에 바이오 폴리머와 같은 유기물이 감싸져 촉매 효율을 저하시키는 문제점이 있었다. 그러나 상기 CNF는 MNP가 덮이지 않아 촉매 특성이 손실되지 않을 뿐 아니라 그 표면에 높은 산소 밀도를 가져 매우 효율적인 MNP의 인-시츄(in-situ) 합성 및 안정화가 가능한 것으로 알려져 있다. 따라서 상기 CNF는 MNP의 합성용 지지체로서 적절한 것으로 알려져 있다.
나노셀룰로오스에 금 나노입자(gold nanoparticles, AuNPs)을 고정화하는 다양한 방법이 개발되고 있다. 예를 들어 상기 AuNPs를 TEMPO 산화 셀룰로오스 나노결정(CNC), TEMPO 산화 셀룰로오스 나노섬유(CNF), 셀룰로오스 에테르(cellulose ether), 유황 표지 셀룰로오스(thio-labeled cellulose), 셀룰로오스 트리아세테이트(cellulose triacetate), 셀룰로오스 리포에이트(cellulose lipoate) 및 카르복시메틸 셀룰로오스(carboxymethyl cellulose)와 같은 셀룰로오스 나노결정(CNC), 셀룰로오스 섬유 및 화학적으로 변형된 셀룰로오스에 고정시키는 방법이 개발된바 있다. 그러나 상기와 같은 방법은 대부분 독성 환원제를 사용하거나 반응 시간이 긴 단점이 있었다.
양이온(+)으로 대전된 AuNP는 표적 약물 전달, 감지, 진단 및 이미징 분야에서 광범위하게 응용이 가능하다. 그러나 양이온(+)으로 대전된 AuNP은 음(-)으로 대전된 AuNP에 대비하여 성공적으로 합성한 결과가 미미한 실정이다. 게다가 지금까지 알려진 양이온(+)으로 대전된 AuNP의 합성방법은 대부분 수소화붕소나트륨, 히드라진 수화물 및 수소와 같이 위험하거나 거친 환원제를 사용하는 방법에 국한된 한계가 있었다.
천연 효소는 기질 특이적 촉매 효율이 높을 뿐 아니라 대부분의 세포 대사 과정에 관여하므로 농업, 식품 가공, 의약품 생산, 생화학 산업 및 환경 과학 분야에서 널리 사용된다. 그러나 천연 효소는 추출이 어렵고 안정성이 낮을 뿐 아니라 저장 수명이 짧으며 엄격한 작업 조건에서 수행되어야 하는 단점이 있어 상용화가 어려운 실정이다.
상기와 같은 천연 효소의 단점을 극복하기 위해 천연 효소를 모방할 수 있는 새로운 나노 물질인 나노자임(nanozyme)이 개발되고 있다. 알려진 연구결과에 따르면 귀금속, 금속 산화물 나노입자, 탄소 나노물질, 바이메탈 나노구조 및 금속-유기 골격과 같은 나노물질은 산화효소, 뉴클레아제, 에스테라아제, 과산화효소, 카탈라아제 및 슈퍼옥사이드 디스뮤타아제의 활성을 모방하는 것으로 알려졌다. 이러한 나노 물질 중 AuNP는 높은 안정성, 낮은 독성 및 기능화 가능성으로 주목을 받고 있다. 그러나 대부분의 AuNP는 표면 코팅제로 인해 촉매 활성이 저하될 뿐 아니라 회수 및 재사용에 어려움이 있는 단점이 있었다.
본 명세서에서 언급된 특허문헌 및 참고문헌은 각각의 문헌이 참조에 의해 개별적이고 명확하게 특정된 것과 동일한 정도로 본 명세서에 참조로 삽입된다.
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본 발명은 금 나노입자(Au Nanopaticle)가 양이온성 셀룰로오스 나노섬유(Cationic Cellulose Nano-fibril)의 표면에 결합되고 양(+)의 제타 포텐셜(zeta potential)값을 가지는 것을 특징으로 하는 금 나노입자 셀룰로오스 나노섬유 복합체, 상기 복합체를 필름형상의 제조한 금 나노입자 셀룰로오스 나노섬유 복합체 필름 및 이의 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 다른 목적 및 기술적 특징은 이하의 발명의 상세한 설명, 청구의 범위 및 도면에 의해 보다 구체적으로 제시된다.
본 발명은 금 나노입자(Au Nanopaticle)가 양이온성 셀룰로오스 나노섬유(Cationic Cellulose Nano-fibril)의 표면에 결합되고 양(+)의 제타 포텐셜(zeta potential)값을 가지는 것을 특징으로 하는 금 나노입자 셀룰로오스 나노섬유 복합체를 제공한다.
상기 금 나노입자는 구형의 형상을 가지며 상기 양이온성 셀룰로오스 나노섬유 표면의 히드록시기(OH-group)와 수소결합을 형성하여 결합된 것을 특징으로 하며 상기 양이온성 셀룰로오스 나노섬유는 4가 암모늄 기능기(moiety)가 표면을 점유하여 양(+)의 제타 포텐셜(zeta potential)값을 가지는 것을 특징으로 한다.
본 발명은 금 나노입자(Au Nanopaticle)가 양이온성 셀룰로오스 나노섬유(Cationin Cellulose Nano-fibril)의 표면에 결합되어 양(+)의 제타 포텐셜(zeta potential)값을 가지는 것을 특징으로 하는 금 나노입자 셀룰로오스 나노섬유 복합체 필름을 제공한다.
상기 금 나노입자 셀룰로오스 나노섬유 복합체 필름은 과산화수소 검출한계가 0.25 내지 0.35μM인 것을 특징으로 하며 포도당 검출한계가 0.6 내지 0.7μM인 것을 특징으로 한다.
본 발명은 양이온성 셀룰로오스 나노섬유를 제조하는 제 1 단계; 상기 양이온성 셀룰로오스 나노섬유 용액을 제조하고 금 나노입자 전구체를 첨가하여 금 나노입자 셀룰로오스 나노섬유 복합체 전구체 용액을 제조하는 제 2 단계; 및 상기 금 나노입자 셀룰로오스 나노섬유 복합체 전구체 용액에 마이크로파(800W)를 조사하여 금 나노입자 셀룰로오스 나노섬유 복합체를 합성하는 제 3 단계; 를 포함하는 것을 특징으로 하는 금 나노입자 셀룰로오스 나노섬유 복합체의 제조방법을 제공한다.
상기 금 나노입자 셀룰로오스 나노섬유 복합체의 제조방법은 상기 양이온성 셀룰로오스 나노섬유가 금 나노입자 전구체로부터 생성된 금 이온(Au3+)에 대한 환원제로 작용하여 금 나노입자(Au Nanopaticle)를 합성하고 상기 금 나노입자가 수소결합을 통해 결합하여 성장하는 지지체 역할을 하는 것을 특징으로 하며 상기 금 나노입자 셀룰로오스 나노섬유 복합체의 제조방법은 상기 양이온성 셀룰로오스 나노섬유가 금 나노입자 전구체로부터 생성된 금 이온(Au3+)에 대한 환원제로 작용하여 금 나노입자(Au Nanopaticle)를 합성하고 상기 금 나노입자가 수소결합을 통해 결합하여 성장하는 지지체 역할을 하는 것을 특징으로 한다.
본 발명은 양이온성 셀룰로오스 나노섬유와 금 나노입자 전구체의 혼합용액에 대하여 별도의 환원제를 사용하지 않고 마이크로파를 조사하는 방법만으로 과산화효소 유사활성을 가진 금 나노입자 셀룰로오스 나노섬유 복합체를 제조할 수 있는 장점이 있다.
본 발명의 금 나노입자 셀룰로오스 나노섬유 복합체는 금 나노입자가 양이온성 셀룰로오스 나노섬유의 표면에서 인-시츄(in-situ) 합성된다. 따라서 상기 금 나노입자는 나노섬유의 표면에 잘 분산된 상태로 합성 및 성장하므로 금 나노입자와 셀룰로오스 나노섬유(지지체) 사이의 추가적인 부착공정이 필요하지 않으며 상기 부착공정에서 발생하는 금 나노입자의 과산화효소 유사활성 저하의 우려가 없는 장점이 있다.
본 발명의 금 나노입자 셀룰로오스 나노섬유 복합체는 양전하로 하전되어 있어 분산성이 우수한 장점이 있으며 필름의 형상으로 제조하면 과산화효소 유사활성을 이용한 과산화수소 또는 포도당 검출반응 후 회수가 용이할 뿐 아니라 간단한 세척만으로도 활성이 복구되어 5회 이상 재사용이 가능한 장점이 있다.
도 1은 본 발명의 TEM 분석결과를 보여준다. 패널 (A), (B) 및 (C)는 C.CNF 0.1%, 0.5% 및 1.0%에서 합성된 복합체의 TEM 이미지를 보여주며 패널(a), (b), 및 (c)는 C.CNF 0.1%, 0.5% 및 1.0%에서 합성된 복합체의 히스토그램을 보여준다.
도 2는 본 발명의 TEM 분석결과를 보여준다. 패널 (A)는 C.CNF의 TEM 이미지를 보여주며, 패널 (B)는 금 나노입자 셀룰로오스 나노섬유 복합체의 TEM 이미지를 보여주며, 패널 (C)는 금 입자의 크기분포 히스토그램을 보여주며, 패널 (D)는 SAED 패턴을 보여주며, 패널 (E)는 HR-TEm 이미지를 보여주며, 패널 (F)는 원소맵핑 결과((a): STEM 이미지, (b): 금, (c): 탄소, (d): 질소)를 보여준다.
도 3은 본 발명의 X-선 회절분석, FT-IR 분석, XPS 분석 결과를 보여준다. 패널 (A)는 양이온성 셀룰로오스 나노섬유와 금 나노입자 셀룰로오스 나노섬유 복합체의 X-선 회절분석 결과를 보여주며, 패널 (B)는 양이온성 셀룰로오스 나노섬유와 금 나노입자 셀룰로오스 나노섬유 복합체의 FT-IR분석 결과를 보여주며, 패널 (C)는 금 나노입자 셀룰로오스 나노섬유 복합체의 XPS분석 결과를 보여주며, 패널 (D)는 금 나노입자 셀룰로오스 나노섬유 복합체의 고해상도 Au 4f 스펙트럼을 보여준다.
도 4는 본 발명의 TMB 반응 결과를 UV-Vis 스팩트럼으로 분석한 결과를 보여준다.
도 5는 본 발명의 금 나노입자 셀룰로오스 나노섬유 복합체의 합성 조건에 따른 결과를 보여준다.
도 6은 본 발명의 금 나노입자 셀룰로오스 나노섬유 복합체 필름을 이용한 과산화수소 및 포도당 검출 결과를 보여준다. 패널 (A), (B) 및 (C)는 과산화수소를 검출한 결과이며 패널 (D), (E) 및 (F)는 포도당을 검출한 결과이다.
도 7은 본 발명의 금 나노입자 셀룰로오스 나노섬유 복합체 필름을 이용한 포도당 및 유사당 검출결과(패널 (A))를 보여주며 금 나노입자 셀룰로오스 나노섬유 복합체 필름의 재사용에 따른 활성변화(패널 (B))를 보여준다.
도 8은 본 발명의 금 나노입자 셀룰로오스 나노섬유 복합체 필름의 제조과정 및 금 나노입자 셀룰로오스 나노섬유 복합체 필름을 이용한 포도당 검출 기작을 보여준다.
도 9는 과산화효소 활성 및 이를 이용한 과산화수소의 검출 기작을 보여준다.
본 발명은 금 나노입자(Au Nanopaticle)가 양이온성 셀룰로오스 나노섬유(Cationic Cellulose Nano-fibril)의 표면에 결합되고 양(+)의 제타 포텐셜(zeta potential)값을 가지는 것을 특징으로 하는 금 나노입자 셀룰로오스 나노섬유 복합체를 제공한다.
상기 금 나노입자는 구형의 형상을 가지며 상기 양이온성 셀룰로오스 나노섬유 표면의 히드록시기(OH-group)와 수소결합을 형성하여 결합된 것을 특징으로 한다.
상기 양이온성 셀룰로오스 나노섬유는 4가 암모늄 기능기(moiety)가 표면을 점유하여 양(+)의 제타 포텐셜(zeta potential)값을 가지는 것을 특징으로 한다. 바람직하게는 상기 4가 암모늄 기능기는 (-N(CH3)3+) 작용기의 상태로 양이온성 셀룰로오스 나노섬유의 표면을 점유한 것을 특징으로 하며 상기 제타 포텐셜은 +40 내지 43mV인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 금 나노입자 셀룰로오스 나노섬유 복합체 역시 양(+)의 제타 포텐셜(zeta potential)값을 가진다. 상기 복합체의 제타 포텐셜값은 상기 양이온성 셀룰로오스 나노섬유의 제타 포텐셜값으로부터 주로 기인한다. 그러나 상기 금 나노입자가 양이온성 셀룰로오스 나노섬유의 표면에 결합하기 때문에 금 나노입자 셀룰로오스 나노섬유 복합체의 제타 포텐셜값은 상기 양이온성 셀룰로오스 나노섬유의 제타 포텐셜값보다 적은 양의 값을 가진다. 바람직하게는 본 발명의 금 나노입자 셀룰로오스 나노섬유 복합체의 제타 포텐셜값은 39 내지 40mV이다.
본 발명의 금 나노입자 셀룰로오스 나노섬유 복합체는 별도의 환원제를 첨가하지 않음에도 불구하고 양이온성 셀룰로오스 나노섬유가 환원제의 역할을 수행하여 금 나노입자를 합성할 수 있을 뿐 아니라 상기 양이온성 셀룰로오스 나노섬유가 금 나노입자의 지지체로서 작용하여 금 나노입자의 합성과 성장을 동시에 유도하므로 금 나노입자 셀룰로오스 나노섬유 복합체를 효율적으로 제조할 수 있는 장점이 있다.
본 발명의 금 나노입자 셀룰로오스 나노섬유 복합체는 하기의 단계를 포함하는 제조방법으로 제조할 수 있다.
제 1 단계: 양이온성 셀룰로오스 나노섬유를 제조하는 단계;
제 2 단계: 상기 양이온성 셀룰로오스 나노섬유 용액을 제조하고 금 나노입자 전구체를 첨가하여 금 나노입자 셀룰로오스 나노섬유 복합체 전구체 용액을 제조하는 단계;
제 3 단계: 상기 금 나노입자 셀룰로오스 나노섬유 복합체 전구체 용액에 마이크로파(800W)를 조사하여 금 나노입자 셀룰로오스 나노섬유 복합체를 합성하는 단계.
제 1 단계: 양이온성 셀룰로오스 나노섬유를 제조하는 단계.
본 발명의 양이온성 셀룰로오스 나노섬유는 종래의 셀룰로오스 나노섬유와 달리 4가 암모늄 기능기(moiety)가 표면을 점유하여 양(+)의 제타 포텐셜(zeta potential)값을 가지는 것을 특징으로 한다. 이를 위하여 본 발명에서는 셀룰로오스 나노섬유(CNF)를 글리시딜트리메틸암모늄클로라이드(glycidyltrimethylammonium chloride, GTMAC)과 반응시켜 그 표면이 4가 암모늄 기능기로 점유되도록 한다. 상기 4가 암모늄 기능가가 표면에 점유되어 양(+)의 제타 포텐셜(zeta potential)값을 가지는 양이온성 셀룰로오스 나노섬유는 용액상에서 전기적 반발력이 형성되므로 응집하지 않고 잘 분산되는 장점이 있다.
제 2 단계: 금 나노입자 셀룰로오스 나노섬유 복합체 전구체 용액을 제조하는 단계.
상기 제조한 양이온성 셀룰로오스 나노섬유를 물에 녹여 양이온성 셀룰로오스 나노섬유 용액을 제조한 후 금 나노입자 전구체를 첨가하여 금 나노입자 셀룰로오스 나노섬유 복합체 전구체 용액을 제조한다. 상기 금 나노입자 전구체는 물에 용해되어 환원 가능한 금 이온(Au3+)을 형성하는 것이면 제한 없이 사용할 수 있다. 바람직하게는 상기 금 나노입자 전구체는 HAuCl43·H20이다. 상기 HAuCl43·H20가 물에 용해되면 음이온성 염화금(AuCl4 -)이 생성된다. 상기 염화금은 음전하를 가지므로 상기 양이온성 셀룰로오스 나노섬유의 양전하를 가지는 4가 암모늄 기능기에 흡착되어 중간체를 형성하게 된다. 상기 중간체의 염화금은 셀룰로오스의 히드록시기(OH-group)에 의해 환원되어 금 나노입자를 형성하게 되고 상기 금 나노입자를 핵으로 금 나노입자가 더 성장하게 되는 것이다. 상세하게는 상기 중간체의 염화금은 국소적으로 금 이온(Au3+)으로 해리되어 히드록시기(OH-group)에 의해 환원되므로 금속성의 금(Au0) 나노입자로 합성 되는 것이다.
제 3 단계: 금 나노입자 셀룰로오스 나노섬유 복합체를 합성하는 단계
상기 제조한 금 나노입자 셀룰로오스 나노섬유 복합체 전구체 용액에 대하여 마이크로파(800W)를 조사하여 금 나노입자 셀룰로오스 나노섬유 복합체를 합성한다. 상기 마이크로파가 조사되면 상기 양이온성 셀룰로오스 나노섬유가 금 나노입자 전구체로부터 생성된 금 이온(Au3+)에 대한 환원제 역할을 하여 금 나노입자를 합성하게 되고 상기 금 나노입자는 셀룰로오스와 수소결합을 통해 결합된 상태에서 성장하게 된다. 본 발명의 실시예에 따르면 상기 마이크로파의 조사가 없으면 금 나노입자의 합성 및 성장이 이루어지지 않는다.
본 발명의 실시예에 따르면 상기 금 나노입자 셀룰로오스 나노섬유 복합체는 양이온성 셀룰로오스 나노섬유 0.8 내지 1.2% 및 HAuCl4 0.8 내지 1.2mM을 포함하는 금 나노입자 셀룰로오스 나노섬유 복합체 전구체 용액에 대하여 마이크로파(800W)를 25 내지 35초간 조사하여 제조한다. 바람직하게는 상기 금 나노입자 셀룰로오스 나노섬유 복합체는 양이온성 셀룰로오스 나노섬유 1% 및 HAuCl4 1mM을 포함하는 금 나노입자 셀룰로오스 나노섬유 복합체 전구체 용액에 대하여 마이크로파(800W)를 30초간 조사하여 제조한다.
본 발명은 금 나노입자(Au Nanopaticle)가 양이온성 셀룰로오스 나노섬유(Cationin Cellulose Nano-fibril)의 표면에 결합되어 양(+)의 제타 포텐셜(zeta potential)값을 가지는 것을 특징으로 하는 금 나노입자 셀룰로오스 나노섬유 복합체 필름을 제공한다. 상기 금 나노입자 셀룰로오스 나노섬유 복합체 필름은 상기 제조방법으로 제조한 금 나노입자 셀룰로오스 나노섬유 복합체를 분산액으로 제조한 후 열풍 건조하여 필름형상으로 제조한 것을 의미한다. 상기 금 나노입자 셀룰로오스 나노섬유 복합체 및 금 나노입자 셀룰로오스 나노섬유 복합체 필름은 금 나노입자로 인한 과산화효소 유사활성을 가진다. 본 발명의 실시예에 따르면 본 발명의 금 나노입자 셀룰로오스 나노섬유 복합체 및 금 나노입자 셀룰로오스 나노섬유 복합체 필름은 과산화효소 유사활성을 이용하여 과산화수소 및 포도당의 정량적 검출이 가능하다.
본 발명의 금 나노입자 셀룰로오스 나노섬유 복합체 필름은 필름의 형상을 가져 반응액으로부터 회수 및 세척이 용이할 뿐 아니라 반복적인 사용에도 그 활성이 저해 되지 않아 재사용성이 우수한 정점이 있다.
본 발명의 금 나노입자 셀룰로오스 나노섬유 복합체 필름은 과산화수소의 검출한계가 0.25 내지 0.35μM이며 포도당의 검출한계가 0.6 내지 0.7μM인 것을 특징으로 한다. 또한 간단한 세척만으로도 5회 이상 재사용이 가능한 장점이 있다.
하기 실시예를 통해 본 발명을 상세히 설명한다.
실시예
1. 실험방법
1.1. 실험재료
셀룰로오스 나노섬유(cellulose nano-fibril, CNF)는 CelluForce (Montreal, Canada)에서 구입하였다. 테트라부틸암모늄 하이드록사이드 30-하이드레이트(Tetrabutylammonium hydroxide 30-hydrate, TBAH ≥98.0%), 글리시딜트리메틸암모늄 클로라이드(glycidyltrimethylammonium chloride, GTMAC ≥ 90%), 클로로아우르산(chloroauric acid, HAuCl4.·3H2O), 테레프탈산(terephthalic acid, TA), 30% H2O2 용액, 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(tetramethylbenzidine, TMB), 포도당 산화효소(glucose oxidase, GOx), 포도당, 유당, 과당, 말토오스는 Sigma-Aldrich Co(St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다.
다른 시약 및 화학물질은 분석 등급을 사용하였으며 추가적인 정제 없이 사용하였다.
모든 용액은 Milli-Q water로 사용하였다.
1.2. 양이온성 양이온성 셀룰로오스 나노섬유의 제조
양이온성 CNF의 제조는 에폭시:하이드록실=3:1 비율에서 GTMAC를 사용하여 수행하였다. 먼저, CNF를 용매 교환 공정(아세톤으로 2회, DMSO로 2회)을 통해 DMSO에 분산시켰다. TBAH 1.0g을 ~1% CNF 현탁액을 함유하는 둥근 바닥 플라스크에 첨가하였으며 질소가스분위기에서 30분간 급속 교반 하는 방법으로 탈기시켰다. 그 후 GTMAC 7.47㎖를 상기 플라스크에 주입하고 온도를 65℃로 올렸다. 반응은 질소 분위기에서 5시간 동안 수행되었으며 냉각 후 2차 용매 교환(2회)을 수행하여 생성물을 물에 재분산(아세톤에 이어 물로 2회)시켰으며 수득된 생성물을 동결 건조하였다.
1.3. 금 나노입자/양이온성 셀룰로오스 나노섬유 복합체의 합성
금 나노입자(AuNPs)가 양이온성 셀룰로오스 나노섬유(C.CNF)의 표면에 고정된 복합체(AuNPs@C.CNF)를 인-시츄(in-situ) 합성하였다. 상기 인-시츄 합성은 C.CNF를 HAuCl4의 환원제 및 지지체로 사용하며 마이크로파(Midea, MC-E230KW, 800W)를 조사하는 환경에서 수행하였다. 먼저 C.CNF 1.0g을 Milli-Q 워터 100㎖에 첨가하고 교반하여 C.CNF 1% 스톡(stock) 용액을 얻었다. 상기 C.CNF 1% 스톡 용액 6㎖과 HAuCl4 2㎖을 유리 바이알(20㎖)에서 넣고 혼합하여 C.CNF와 HAuCl4가 각각 1% 및 1mM의 농도로 포함된 C.CNF/HAuCl4 혼합물 용액을 얻었다. 상기 C.CNF/HAuCl4 혼합물 용액에 대하여 마이크로웨이브(800W)를 30초 동안 조사하여 AuNPs@C.CNF을 합성하였다. 상기 AuNPs@C.CNF가 합성되고 분산된 용액(AuNPs@C.CNF 분산액)은 붉은 색이다. 상기 AuNPs@C.CNF 분산액을 8000rpm으로 10분간 원심분리하고 AuNPs@C.CNF 펠렛을 수득한 후 Milli-Q 워터로 3회 세척하였다. 상기 AuNPs@C.CNF의 합성조건은 마이크로웨이브(800W)의 조사시간, C.CNF의 농도 및 HAuCl4의 농도를 각각 5 내지 35초, 0.1 내지 1%, 및 0.1 내지 1mM 범위 안에서 다양하게 변화시키는 방법으로 최적화하였다.
상기 합성된 AuNPs@C.CNF 분산액 6㎖은 테플론 페트리 접시에서 담은 후 50℃ 열풍오븐에서 6시간동안 건조시켜 AuNPs@C.CNF 필름을 제조하였다. 상기 AuNPs@C.CNF 필름 1 ㎎을 10% HNO3 용액에 용해시킨 후 ICP-OES(ICP-OES, OPTIMA 7300DV)를 이용하여 AuNPs@C.CNF의 금 함량을 측정하였다. 측정결과 AuNPs@C.CNF 필름(1mg)에 2.6%(26μg)의 금이 함유된 것을 확인하였다.
1.4. 과산화수소의 검출
바이알(2㎖)에 AuNPs@C.CNF 필름 2.5㎎과 0.5M 아세테이트 완충액(pH 4.0) 1㎖을 혼합하고 다양한 농도의 과산화수소 300㎕ 및 5mM TMB 200㎕를 첨가하여 상기 AuNPs@C.CNF 필름이 완전히 침지되도록 하고 40℃에서 20분 동안 배양한 후 450 내지 800 nm 범위에서 흡광도를 측정하였다.
1.5. 효소활성 연구
AuNPs@C.CNF에 대하여 효소활성분석을 수행하였다. 상기 효소활성분석은 0.5M 아세테이트 완충용액(pH 4.0) 1㎖에 AuNPs@C.CNF 20㎕을 넣은 후 TMB와 과산화수소의 농도를 변화시켜 분석하였으며 분광광도계를 이용하여 흡광도(652㎚)를 측정하는 방법으로 반응물을 분석하였다. 효소활성은 하기 Michaelis-Menten 방정식을 사용하여 계산되었다.
[Michaelis-Menten 방정식]
V = Vmax[S]/(Km+[S]),
여기서 V는 초기 반응 속도를 의미하며, Vmax는 최대 반응 속도를 의미하며, [S] 기질 농도를 의미하며, Km은 Michaelis 상수를 의미하며, Km 및 Vmax는 Lineweaver-Burk 플롯 방정식을 사용하여 1/V= (Km/Vmax) (1/[S]) + (1/Vmax)로 표현된다.
1.6. 수산기 형성 확인
AuNPs@C.CNF 필름 1.5 내지 3㎎, 50mM 과산화수소 300㎕ 및 테레프탈산 200㎕을 0.5M 아세트산 완충용액(pH 4.0) 1㎖에 넣은 후 40℃에서 20분간 배양하고 형광분광광도계(슬릿폭=2㎚, λex=315㎚, F-2500, Hitachi, Japan)를 이용하여 방출 스펙트럼을 분석하였다
1.7. 포도당 검출
포도당 검출 시험은 하기와 같이 수행하였다. (1) 5.0㎎/㎖ 포도당 산화효소(GOx) 20㎕와 다양한 농도의 포도당 80㎕를 인산염 완충액(pH 7.4) 200㎕에 첨가하여 GOx 혼합물을 제조한 후 37℃에서 15분간 배양하여 과산화수소(H2O2)가 생성된 GOx 반응혼합물을 제조하였다. (2) AuNPs@C.CNF 2.5㎎과 5mM TMB 200㎕를 0.5 M 아세테이트 완충용액 1㎖에 첨가하고 상기 포도당 및 GOx 반응혼합물과 혼합하여 AuNPs@C.CNF 혼합물을 제조하였다. (3) 상기 AuNPs@C.CNF 혼합물을 40℃에서 20분간 반응시키고 흡광도를 측정하였다. 비교예로서 상기 포도당을 유당(lactose), 과당(fructose), 자당(sucrose) 및 맥아당(maltose)으로 대체하여 동일한 실험을 수행하였다.
1.8. 혈당검출
혈청 샘플은 충남대학교병원 바이오 뱅크에서 제공받았다. 혈청 샘플은 원심분리하여 펠렛으로 단백질을 제거한 후 상층액을 수득하여 0.1M PBS(pH 7)으로 100배 희석하였다. 포도당의 검출은 상기 포도당 분석방법에 따라 수행하였다. 비교예로서 표준 포도당 산화 효소-과산화 효소법(GOD-POD method)으로 샘플을 분석하였다. 혈당검출에 대한 모든 실험은 관련 기관의 윤리 위원회의 승인을 받아 진행하였다.
2. 실험결과
본 발명은 제조단계 및 독성 화학물질의 사용을 최소화하고 에너지 소모율이 높은 종래의 합성방법을 최적화하여 이를 개선한 것으로 지속 가능성이 높은 친환경 나노 물질 제조방법을 제공한다. 본 발명의 제조방법은 마이크로파를 이용한 단일 단계를 가진 제조방법으로 독성이 있는 환원제를 사용하지 않음에도 불구하고 초고속으로 나노물질인 양전하로 하전된 금 나노입자(AuNP)를 제조할 수 있는 장점이 있다. 또한 본 발명의 양전하로 하전된 금 나노입자를 셀룰로오스 나노섬유에 고정시켜 제조한 AuNPs@C.CNF 필름은 높은 과산화효소 유사활성을 가져 혈청내 포도당의 비색검출에 적용할 수 있는 장점이 있다(도 8).
2.1. 양이온성 셀룰로오스 나노섬유
본 발명의 양이온성 셀룰로오스 나노섬유(cationic cellulose nanofibrils, C.CNF)는 셀룰로오스 나노섬유(cellulose nanofibrils, CNF)와 GTMAC의 반응을 통해 제조하였다. 상기 반응을 통하여 제조한 C.CNF는 4가 암모늄 기능기(moiety)가 CNF의 표면에 점유된 것을 특징으로 한다. 상기 암모늄 기능기의 점유는 FT-IR 및 1차원 NMR 실험을 통해 확인하였다.
상기 C.CNF는 CNF 표면에 점유된 4가 암모늄 기능기 사이에 전기적 반발력이 형성되므로 높은 수준의 (+)제타 포텐셜(zeta potential) 특성을 보이며 이는 CNF 묶음의 해체를 유도하게 되므로 C.CNF가 현탁액 상태에서 안정하게 유지되는 원인이 된다.
2.2. AuNPs@C.CNF의 합성
C.CNF에 의한 Au3+의 환원 반응은 반응 혼합물의 착색(brick red)으로 확인이 가능하다. 실험결과 마이크로파 조사가 없는 경우 아무런 착색이 이루어지지 않는 것으로 확인되었다. 이는 C.CNF가 마이크로파 조사가 없는 실온(22 내지 25℃)의 환경에서는 환원제로서 금 나노입자(AuNP) 형성 반응에 관여하지 않는다는 것을 의미한다.
AuNPs@C.CNF의 합성조건을 최적화하기 위하여 반응시간, 전구체인 C.CNF 및 HAuCl4의 농도 조건을 변경하는 방법으로 실험을 수행하였다. C.CNF 분산액의 농도는 AuNP의 크기, 형태 및 형성에 상당한 영향을 미치는 것으로 알려져 있다. 이를 확인하기 위하여 HAuCl4의 농도 및 마이크로파 조사시간을 각각 1.0mM 및 30초로 고정 한 후 C.CNF 분산액의 C.CNF 농도를 0.1 내지 1.25% 범위에서 다양한 농도로 변경하여 합성반응을 수행하였으며 표면 플라스몬 공명(Surface plasmon resonance) 실험을 통하여 반응물을 분석하였다.
실험결과 반응액의 C.CNF의 농도가 증가함에 따라 SPR 피크(525nm)가 증가하는 것이 확인되었다. C.CNF 1.0%에서 가장 강한 SPR 피크를 보이는 것이 확인되었으며 C.CNF 0.10 내지 0.25% 범위에서는 긴 파장의 SPR 피크가 낮은 강도로 관찰되었는데 이는 AuNP 형성을 위한 C.CNF 농도가 불충분하였기 때문으로 판단된다. C.CNF 0.5 내지 1.0% 범위에서는 SPR 피크(525nm)의 위치 변화 없이 강도가 점차적으로 증가한 것이 확인되었는데 이는 AuNP의 합성이 안정적으로 진행되었기 ‹š문으로 판단된다. C.CNF 0.5 내지 1.0% 범위에서는 SPR 피크의 위치 및 강도가 모두 의미있는 수준의 변화를 보이지 않았다. 결과적으로 AuNP 합성에 있어서 1.0mM HAuCl4 및 마이크로파 30초 조사조건인 경우 C.CNF 분산액의 최적 C.CNF 농도는 1.0%인 것으로 판단된다.
AuNP의 크기 및 모양을 최적화하기 위하여 Au3+의 농도 및 마이크로파의 조사 조건을 각각 1.0mM 및 30초로 고정하고 C.CNF의 농도를 변화시켜 AuNP 합성반응을 수행하였다. 도 1은 본 발명의 AuNPs@C.CNF에 대한 TEM 이미지 및 관련 히스토그램을 보여준다. 실험결과 모든 농도의 C.CNF에서 AuNPs가 구형을 가진 단량체의 상태로 합성되고 분산되어 있는 것이 확인되었다. C.CNF의 농도가 0.1%에서 1.0%로 증가하게 되면 입자 크기는 감소하고 C.CNF 표면의 AuNPs의 분포는 보다 균일해지는 것이 확인되었다. C.CNF를 0.1%, 0.5%, 및 1.0%의 농도로 사용하는 경우 AuNPs@C.CNF의 평균 입자크기는 각각 19±5nm, 14±2nm, 및 12±3nm인 것으로 확인되었다. C.CNF 농도가 0.1%에서 0.5%로 증가하는 경우 AuNPs@C.CNF의 평균 입자크기가 증가된 것이 확인되었는데 이는 금 나노입자의 성장에 대한 통제가 수월하지 않았기 때문으로 판단된다. 이에 반하여 C.CNF 1.0%로 더 증가하게 되면 나노 입자의 크기는 감소하는 것으로 확인되는데 이는 높은 농도의 C.CNF가 사용되어 AuNPs@C.CNF 합성을 위한 핵(nucleation) 생성이 촉진되고 AuNP 사이의 충돌이 감소하여 응집이 일어나지 않기 때문으로 판단된다. 상기 결과는 UV-Vis 분석을 통해서도 동일하게 확인된다.
C.CNF 농도 및 마이크로파의 조사기간을 각각 1.0% 및 30초로 고정하고 HAuCl4의 농도를 0.1 내지 0.125mM 범위로 변경하여 AuNPs@C.CNF을 합성한 후 SPR 분석을 수행하였다. 실험 결과 HAuCl4의 농도가 0.1mM에서 1.0mM로 증가하는 경우 SPR 피크(525nm)가 점차 강해지는 것이 확인되었는데 이는 AuNP의 합성이 증가하였기 때문으로 판단된다. 이에 반하여 HAuCl4의 농도가 1.0mM에서 1.25mM로 증가하여도 SPR 피크의 변화가 확인되지 않았는데 이는 HAuCl4가 AuNP의 합성에 모두 사용되었기 때문으로 판단된다. Mie의 이론에 따르면 5~15nm 크기의 나노 입자가 구형의 형상을 가지면 가시광선영역(525nm)에서 하나의 SPR 피크로 관찰되며 상기 나노입자가 이방성(anisotropic) 형상을 가지면 두 개 이상의 SPR 피크로 분리되어 관찰된다. 따라서 본 발명의 경우 하나의 피크로 관찰된다. 따라서 상기 합성된 AuNPs@C.CNF는 구형의 형상인 것으로 판단된다. 결과적으로 C.CNF 농도 및 마이크로파의 조사기간을 각각 1.0% 및 30초로 고정한 경우 HAuCl4의 최적 농도는 1.0mM이다.
C.CNF 농도 및 HAuCl4의 농도를 각각 1.0% 및 1.0Mm로 고정하고 마이크로파의 조사시간을 5 내지 35초로 변경하여 AuNPs@C.CNF을 합성한 후 SPR 분석을 수행하였다. 실험결과 마이크로파 조사시간 10초부터 SPR 피크(535nm)가 관찰되었으며 마이크로파의 조사시간이 30초까지 증가하면 SPR 피크(525nm)의 강도 역시 증가하는 것이 확인되었다. 결과적으로 C.CNF 농도 및 HAuCl4의 농도를 각각 1.0% 및 1.0Mm로 고정하는 경우 최적의 마이크로파 조사시간은 30초이다. 참고로 마이크로파 조사시간이 35초인 경우 SPR 피크의 강도는 동일하나 파장이 535nm로 더 길어지는 것이 확인되었는데 이는 합성된 AuNPs@C.CNF의 크기가 증가하였기 때문으로 판단된다.
2.3. AuNPs@C.CNF의 특성분석
도 2는 본 발명의 AuNPs@C.CNF에 대한 투과 전자 현미경(Transmission Electron Microscopy, TEM) 분석결과를 보여준다. 도 2의 패널 A는 우라닐 아세테이트로 염색된 본 발명의 양이온성 CNF(C.CNF)를 TEM으로 분석한 결과를 보여준다. 분석결과 본 발명의 C.CNF는 평균 직경이 5 내지 10nm이며 길이는 수 마이크론 수준인 것으로 확인되었다. 또한 본 발명의 C.CNF는 표면에 존재하는 4가 암모늄 기능기로 인하여 전기적 반발력이 유지되므로 응집하지 않고 잘 분리된 섬유의 상태로 존재하는 것이 확인된다.
C.CNF의 표면은 많은 수산기와 넓은 표면적을 가지고 양전하를 가지는 AuNPs@C.CNF 형성을 위한 고정 사이트로서 적절하다. AuNPs@C.CNF에 대한 TEM 분석을 통하여 최적의 조건에서 생성된 AuNP의 형태학적 특징을 분석하였다. 도 2의 패널 B에 따르면 본 발명의 AuNP는 구형의 형상을 가지며 응집 없이 잘 분리되된 상태로 C.CNF의 표면에 잘 고정된 것으로 확인되었다. 그러나 일부에서 AuNP 합성으로 인해 셀룰로오스 섬유의 직경이 증가하고 묵음(bundle)이 형성되는 것이 확인되는데 이는 합성과정에서 일부 섬유가 응집하였기 때문으로 판단된다. 도 2의 패널 C는 본 발명의 AuNPs@C.CNF에 대한 입자크기 분포 히스토그램을 보여준다. 상기 입자 크기 분포 히스토그램은 150여개의 입자로부터 분석하였다. 분석결과 본 발명의 AuNPs@C.CNF는 6 내지 20nm의 굵기 분포를 가지는 것으로 확인되었으며 가우스 피팅 분석을 실시한 결과 평균 직경은 12±3nm인 것으로 확인되었다. 도 2의 패널 D는 본 발명의 AuNPs@C.CNF에 대한 제한시야전자회절(selected area electron diffraction, SAED)패턴을 분석한 결과를 보여준다. 분석결과 높은 해상도를 가진 회절 반점이 확인되는데 이는 AuNP의 순도가 높다는 것을 의미한다. 도 2의 패널 E는 본 발명의 AuNPs@C.CNF에 대한 고해상도 투과전자현미경(High Resoultion-transmission electron microscopy, HR-TEM) 분석결과를 보여준다. 분석결과 격자 간격(lattice spacing)이 0.23nm인 것으로 확인되며 이는 Au의 면심입방체(FCC) 결정 구조 특성(111)과 잘 일치한다. 도 2의 패널 F는 본 발명의 AuNPs@C.CNF에 대한 TEM 원소 맵핑 분석결과를 보여준다. 분석결과 AuNPs@C.CNF에는 금(Au), 탄소, 산소 및 질소를 포함한 기타 원소가 존재하는 것이 확인된다.
정전기적 반발은 나노입자의 분산 안정성에 중요한 역할을 한다. 본 발명에서는 제타포텐셜(ζ-potential)값을 나노입자 현탄액의 안정성을 나타내는 지료로서 사용한다. 본 발명의 C.CNF는 제타 포텐셜값이 양의 값인 +41.90mV인 것으로 확인되는데 이는 표면에 양전하를 가진 4가 암모늄 기능기가 존재하기 때문으로 판단된다. 이에 반하여 AuNPs@C.CNF의 제타 포텐셜값은 양의 값인 +39.39 mV로서 약간 저하된 것으로 확인되는데 그 이유는 양전하를 가진 4가 암모늄 작용기에 AuNP가 부착되었기 때문으로 판단된다. 결과적으로 본 발명의 AuNPs@C.CNF은 현탄액에서 높은 양의 제타 포텐셜값(+39.39 mV)을 가지므로 정전기적 반발에 의하여 높은 분산 안정성을 가지는 것으로 판단되었다. 이는 6개월간 상온에서 보관한 결과 응집이 관찰되지 않은 결과에 의해 지지된다.
X선-회절 분석을 통하여 본 발명의 C.CNF 및 AuNPs@C.CNF에 대한 결정구조를 분석하였다. 도 3은 본 발명의 C.CNF 및 AuNPs@C.CNF에 대한 X선-회절 분석 결과를 보여준다. 도 3의 패널 A에 따르면 C.CNF 및 AuNPs@C.CNF는 셀룰로오스 I 결정구조에 해당하는 회절 피크(22.31°(200), 15.65°(110), 및 7.78°(1-10))를 보이는 것으로 확인되었다. 이는 AuNP가 C.CNF의 결정 구조에 실질적인 영향을 미치지 않았다는 것을 의미한다. 결정화도 지수(crystallinity index, CI) 분석결과 AuNPs 형성 전 후에 상기 CI가 56.0%에서 32.3%로 눈에 띄게 감소하는 것으로 확인되었다. 상기 CI의 감소는 셀룰로오스 매트릭스 내에 AuNPs가 합성되고 성장함에 따라 분자 배향이 변화되고 무작위성이 증가되었기 때문으로 판단된다. AuNPs@C.CNF의 XRD 패턴을 분석한 결과 4개의 추가적인 피크(37.96°(111), 44.09°(200), 64.49°(220), 및 77.46°(311))가 확인되었으며 상기 피크는 AuNP의 FCC 구조 반사평면으로 확인된다.
회절피크 중 (111) 피크가 가장 높은 강도와 고해상도를 보였으나 나머지 피크는 낮은 강도 및 낮은 해상도를 가지는 것으로 확인되었다. 이는 AuNP 결정이 (111) 평면을 따라 주로 성장하였다는 것을 의미한다. 회절피크(111) (2θ=37.96)로부터 계산한 AuNPs@C.CNF의 평균 결정크기는 11.3nm이었으며 이는 상기 TEM 결과와 잘 일치하는 것이 확인되었다.
FT-IR 분석을 이용하여 AuNPs의 환원 및 안정화 기능기를 확인하였다. 도 3의 패널 B는 C.CNF and AuNPs@C.CNF에 대한 FT-IR 분석결과를 보여준다. 상기 C.CNF의 경우 셀룰로오스의 특징적인 피크인 3330㎝-1,(OH기의 신축진동), 2900 cm-1 (-CH2의 비대칭 진동) 및 1618 cm-1(-CH2의 굽힙진동) 피크가 넓고 강하게 확인되었다. 다른
1420㎝-1, 1364㎝-1 및 1313㎝-1의 피크들은 각각 -CH2의 대칭굽힘, -CH의 대칭굽힘 및 -CH2의 로킹모드를 의미한다. 추가적으로 C-O-C 기의 비대칭 신축에 해당하는 1162㎝-1, 무수 포도당 고리의 비대칭 신축에 해당하는 1107㎝-1, CO 신축에 해당하는 1055㎝-1, in-plane-CH 굽힘에 해당하는 1037㎝-1 및 -CH 셀룰로오스의 변형에 해당하는 908㎝-1 피크가 확인되었다. 상기 결과 중 가장 주요한 피크는 1408㎝-1 피크로서 C.CNF의 4가 암모늄 작용기인 트리메틸기(-N(CH3)3+)에 기인한다.
AuNPs@C.CNF의 경우 1710㎝-1에서 새로운 피크가 관찰되는데 이는 카르보닐 작용기(C=O)에서 기인하는 것으로 AuNP 합성시 OH-기가 Au3+이온에 전자를 제공함으로 카르보닐 또는 카르복실 형태로 산화된다는 것을 의미하며 상기 카르보닐기는 배위 결합을 통해 AuNP에 대한 지지제로 작용하게 된다. 추가적으로 양전하를 가지는 (-N(CH3)3+) 작용기(1408㎝-1 피크)는 AuNP가 합성되더라도 사라지지 않고 남아 있는 것으로 확인된다. 따라서 상기 (-N(CH3)3+) 작용기는 양의 제타 포텐셜을 가지도록 하는 작용기로서 정전기적 반발에 의한 AuNP의 안정화에 기여하는 것으로 판단된다. 참고로 다른 피크의 경우 AuNP가 형성된 이후에도 변하지 않은 채로 남아 있는 것이 확인되는데, 이는 환원 과정에서 C.CNF의 고리 구조가 변경되지 않았음을 의미한다.
C.CNF의 산화는 반응성이 높은 1차 알코올을 통해 발생할 수 있으나 2차 알코올에서는 발생하지 않는 것으로 알려져 있다. C.CNF와 AuNPs@C.CNF의 수소 결합 에너지를 비교 평가하여 OH-기의 AuNPs 안정화에 대한 기여정도를 분석하였다. 수소결합에너지(hydrogen bond energy, HE)는 하기의 식을 통하여 계산하였다.
[수학식]
HE=K-1(υo-υ/υo)
상기 수학식에서 υo는 표준 자유 OH-주파수(3650㎝-1)를 의미하며, υ는 수소결합샘플 OH-주파수를 의미하며, K는 상수(3.8×10-3kJ-1)를 의미한다.
계산결과 C.CNF와 AuNPs@C.CNF의 수소결합에너지(HE)는 각각 22.85kJ 및 24.15kJ인 것으로 확인되었다. OH-신축에 해당하는 피크는 수소결합에너지의 증가를 의미한다. 본 발명의 C.CNF와 AuNPs@C.CNF는 OH-신축에 해당하는 피크가 3333㎝-1에서 3315㎝-1로 위치이동 한 것이 확인되는데 이는 AuNP와 C.CNF의 OH-기 사이에 수소결합이 형성되었다는 것을 의미한다.
XPS 분석을 통하여 AuNPs@C.CNF에 존재하는 금(Au)의 화학적 상태를 분석하였다. 도 3의 패널 C는 AuNPs@C.CNF의 XPS 분석결과를 보여준다. 분석결과 AuNPs@C.CNF에는 C1(286.0eV), O1(530.9eV), N1(401.0eV) 및 Au 4f(84.0eV)이 존재하는 것으로 확인되었다. Au 4f 영역은 단일 비대칭 이중선(84.05eV(4f7/2) 및 87.72eV(4f5/2))으로 수렴하는데 이는 AuNPs@C.CNF에 존재하는 상기 금이 금속 상태(Au(0))이라는 것을 의미한다. 또한 금이온(Au3+)에 해당하는 피크(86.9eV 및 90.6eV)는 확인되지 않았는데 이는 AuNPs@C.CNF의 합성시 금이온(Au3+)이 모두 금속으로 환원되었다는 것을 의미한다.
2.4. AuNPs@C.CNF의 합성 기작
본 발명의 인-시츄(In-situ) 합성 과정에 있어서 C.CNF는 금 이온(Au3+)에 대한 환원제 및 AuNPs에 대한 지지체로서의 역할을 동시에 수행한다.
AuNPs 합성 메커니즘은 이중 단계 프로세스로서 핵 생성 후 나노 입자 성장하는 단계를 포함 할 수 있다. 상기 이중 단계 프로세스 중 첫째 단계는 C.CNF(+41.90mV)를 포함하는 양의 제타 포텐셜과 음으로 하전된 AuCl4- 사이에 형성된 정전기적 인력으로 중간 복합체가 형성된 후 Au3+의 일부가 OH-기에 의해 환원되고 상기 형성된 Au원자를 중심으로 Au 클러스터가 형성되어 AuNPs가 성장하는 단계이다. 두 번째 단계로는 상기 AuNP가 C.CNF의 카르보닐 및 OH-기와 강한 결합(수소결합)을 하여 안정화되며 추가 유착을 방지하는 단계이다.
2.5. AuNPs@C.CNF 필름의 과산화효소 유사 활성
양전하로 하전된 금 나노입자(AuNP)의 과산화효소 유사활성은 이미 보고된바 있다. 일반적으로 AuNP의 과산화효소 유사활성은 표면 코팅제로 인해 촉매 활성이 저하되는 문제점이 있을 뿐 아니라 입자의 회수가 어렵고 활성의 복구가 어려워 재사용성이 미미한 단점이 있었다.
본 발명에서는 TMB 및 과산화수소를 이용하여 양전하를 가지는 AuNPs@C.CNF 필름의 과산화효소 유사활성을 분석하였다. 도 4는 본 발명의 AuNPs@C.CNF 필름의 과산화효소 유사활성을 분석한 결과를 보여준다. AuNPs@C.CNF 필름/TMB/과산화수소 혼합 용액은 반응을 통해 TMB 산화물(ox-TMB)이 생성되어 652nm에 최대 흡광도 피크(파란색)를 보이는 반면 AuNPs@C.CNF 필름/과산화수소 혼합용액, AuNPs@C.CNF 필름/TMB 혼합용액 및 TMB/과산화효소 혼합용액은 흡광도 변화를 보이지 않은 것으로 확인되었다. 상기 결과는 AuNPs@C.CNF 필름이 과산화효소 활성을 가져 과산화수소에 의해 TMB가 산화되었다는 것을 보여준다. 이에 반하여 AuNPs@C.CNF 필름/TMB/과산화수소 혼합 용액에 황산을 첨가한 경우 파란색(652nm)에서 노란색(450nm)으로 색이 변화하는 것이 확인되었는데 이는 AuNPs@C.CNF 필름이 강력한 과산화효소 유사 활성을 갖는다는 것을 의미한다.
추가적으로 음전하를 가지는 AuNPs@T.CNF(제타 포텐셜=-44.97mV)를 제조하고 과산화효소 활성을 측정하였다. 상기 T.CNF는 TEMPO modified CNF를 의미한다. 실험결과 AuNPs@T.CNF 필름에 대비하여 AuNPs@C.CNF 필름의 과산화효소 유사활성이 더 높은 것으로 확인되었다. 이는 AuNPs@T.CNF보다 AuNPs@C.CNF에 과산화수소가 보다 쉽게 흡착되기 때문으로 판단되며 과산화효소로부터 생성된 OH-라디칼(·OH)이 부분적 전자 교환 상호작용에 의해 안정화되기 때문으로 판단된다.
2.6. AuNPs@C.CNF 필름의 과산화효소 유사활성 기작
나노자임의 과산화효소 유사 활성은 1) OH-라디칼(·OH)의 생성; 2) 수퍼 옥사이드 라디칼(O2·-)의 생성 단계; 3) 전자의 이동 단계를 통해 발현된다.
AuNPs@C.CNF 필름의 과산화효소 유사활성은 AuNP에 의해 과산화수소가 OH-라디칼(·OH)로 분해되는 촉매 성능에 기반 하는 것으로 판단된다. 상기 메커니즘을 확인하기 위하여 테레프탈산(Terephthalic Acid, TA)을 OH-라디칼 검출 프로브로 사용하여 실험을 수행하였다. 상기 TA는 형광을 보이지 않다가 OH-라디칼과 반응하게 되면 2-히드록시테르프탈산(2-hydroxyterphthalic acid)으로 변하여 형광(λem=425nm)을 보이는 특징이 있다. 먼저 과산화수소/TA 혼합용액을 제조하여 형광을 보이지 않는 것을 확인하였다. 그러나 AuNPs@C.CNF 필름을 첨가한 결과 형광을 보이는 것을 확인하였으며 형광의 세기는 AuNPs@C.CNF 필름의 양이 증가함에 따라 증가하는 것으로 확인되었다. 상기 결과는 AuNPs@C.CNF 필름에 의해 OH-라디칼이 생성되고 상기 OH-라디칼이 TA와 반응하여 2-히드록시테르프탈산(2-hydroxyterphthalic acid)을 생성하였다는 것을 의미한다. 상기 과산화수소 검출 메커니즘은 AuNPs@C.CNF 필름의 과산화효소 유사 활성에 의해 생성된 OH-라디칼에 의해 무색 TMB 용액이 청색의 ox-TMB로 산화되는 메커니즘으로 설명된다(도 9). 상기 색변화는 특정장비 없이 눈으로도 확인 가능하며 ox-TMB의 흡광도(652nm)는 과산화수소의 농도에 비례한다.
2.7. 검출조건의 최적화
전계 방출형 주사전자현미경(Field emission Scanning Electron Microscope, FEG-SEM)을 이용하여 AuNPs@C.CNF 필름의 AuNP에 대한 형태적 변화를 확인하였다. 실험결과 AuNPs@C.CNF 필름의 C.CNF에는 작은 금 입자가 고정된 것이 확인되었으며 이와 함께 응집된 금 입자 덩어리로 존재하는 것이 확인되었다. 상기 응집된 금 입자가 AuNPs@C.CNF 필름의 과산화효소 유사활성에 미치는 영향을 확인하기 위하여 AuNPs@C.CNF 분산액 및 AuNPs@C.CNF 필름의 과산화효소 유사활성을 특정하고 이를 비교분석하였다. 실험 결과 AuNPs@C.CNF 필름의 경우 금 입자 응집으로 인해 과산화효소 유사활성이 약간 감소한 것으로 확인되었다. 그러나 AuNPs@C.CNF 필름의 경우 AuNPs@C.CNF이 분산되어 존재하는 분산액에 대비하여 물리적 회수 및 재사용이 용이한 장점이 있는 것으로 확인되었다.
AuNPs@C.CNF 필름이 가지는 최적의 과산화효소 유사활성을 확인하기 위하여 반응시간, AuNPs@C.CNF 필름의 양, 반응온도 및 반응액의 pH를 포함한 다양한 요인을 변화시켜 실험하고 반응물에 대한 흡광도(652㎚)를 측정하였다(도 5).
AuNPs@C.CNF 필름의 반응시간에 따른 과산화효소 유사활성의 변화에 대하여 확인하였다. 실험 결과 반응시간 2분 이 후 부터 반응물이 생성되기 시작하여 약한 강도의 흡광도(652nm)가 관찰되기 시작하였으며 반응시간 20분까지 흡광도가 증가하다가 20분 이 후 흡광도가 거의 일정하게 유지되는 것이 확인되었다(도 5의 패널 A).
AuNPs@C.CNF 필름의 양에 따른 과산화효소 유사활성의 변화를 확인하였다. 실험결과 AuNPs@C.CNF 필름의 양이 0.5㎎에서 2.5㎎으로 증가함에 따라 흡광도(652㎚)가 증가하는 것으로 확인되었다(도 5의 패널 B). 그러나 AuNPs@C.CNF 필름의 양을 2.5㎎에서 3.0㎎으로 더 증가시키게 되면 흡광도가 오히려 감소하는 것으로 확인되었다. 따라서 본 발명의 AuNPs@C.CNF 필름은 2㎎의 양으로 20분 동안 반응하는 경우 가장 높은 과산화효소 유사활성을 나타내는 것으로 확인되었다.
AuNPs@C.CNF 필름의 반응온도 및 pH에 따른 과산화효소 유사활성의 변화에 대하여 확인하였다. 반응온도와 pH는 각각 10 내지 80℃ 범위 및 아세테이트 완충용액 pH 2.0 내지 9.0 범위로 조정하였다. 반응온도를 10℃에서 40℃로 증가시키고 pH를 2.0에서 4.0으로 증가시킨 결과 온도 및 pH가 증가함에 따라 흡광도(652㎚) 역시 증가하는 것으로 확인되었으며 반응 온도 및 pH가 40℃ 및 4.0 보다 더 증가하는 경우 흡광도가 오히려 감소하는 것으로 확인되었다(도 5의 패널 C 및 D). 따라서 본 발명의 AuNPs@C.CNF 필름은 반응온도 및 pH가 각각 40℃ 및 4.0인 겨우 가장 높은 과산화효소 유사활성을 가지는 것으로 확인되었다.
2.8. 효소활성 연구
AuNPs@C.CNF 필름의 과산화효소 유사활성은 다음을 통하여 계산하였다: 1) 기질로서 과산화수소의 농도를 1.25mM로 고정하고 발색체로서 TMB의 농도를 변화 및 2) 다양한 농도의 과산화수소 및 TMB의 농도를 1mM로 유지하여 Michaelis-Menten 플롯을 산출(도 5의 패널 F). 또한 Michaelis 상수(Km) 및 최대 초기 속도(Vmax)는 라인위버-버크(Lineweare-Burk) 플롯 1/V vs 1/[S]을 사용하여 산출하였다. 분석결과 TMB 0.149mM 조건에서 AuNPs@C.CNF의 Km 및 Vmax값은 각각 0.149mM 및 10.68×10-8Ms-1인 것으로 확인되었으며 과산화수소의 Km 및 Vmax값은 각각 0.359mM 및 11.38×108Ms-1인 것으로 확인되어 과산화효소 유사활성을 갖는 다른 나노물질과 유사한 활성을 가지는 것으로 확인되었다. 상기 결과는 본 발명의 AuNPs@C.CNF 필름이 효율적인 과산화효소 유사활성 물질로서 실제 적용이 가능하다는 것을 보여준다.
2.9. 과산화수소의 검출
본 발명의 AuNPs@C.CNF 필름은 TMB의 과산화수소 농도 의존적인 촉매 산화 활성을 보인다. 따라서 본 발명의 AuNPs@C.CNF 필름은 환경적 분석 또는 생물학적 분석 분야에서 목적에 따른 포도당 검출에 사용 가능 할 것으로 판단된다.
상기 최적 조건하에서 일정 조건의 AuNPs@C.CNF film/TMB 반응 용액에 대한 과산화수소의 농도를 변화시켜 실험하였다. 그 결과 과산화수소 농도 0 내지 400μM에서 흡광도(652㎚)가 급격히 증가하는 것으로 확인되었다. 반응용액에 과산화수소를 첨가하지 않는 경우 흡광도 및 색 변화가 없는 것이 확인된 반면 반응 용액에 과산화수소가 0.5 내지 400μM로 첨가되는 경우 과산화수소의 농도에 따라 흡광도가 증가하고 반응액의 색 또한 딥블루(deep blue)로 진하게 변화하는 것이 확인되었다(도 6의 패널 B). 특히 과산화수소 0.5 내지 30 μM 범위에서는 흡광도와 과산화수소의 농도가 선형 관계(R2=0.992)를 보이는 것으로 확인되었으며 이는 선형 회귀 방정식 A652nm=0.00995 [H2O2]+0.03165으로 표현되는 것으로 확인되었다(도 6의 패널 C). 검출한계(LOD, LOD=3σ/m 방정식(σ: 공백 신호의 표준 편차; m: 선형 맞춤의 기울기))를 계산한 결과 LOD=0.30μM인 것으로 확인되었다.
2.10. 포도당의 검출
당뇨병 환자의 증가로 인해 포도당 측정에 대한 수요가 증가하고 있는 실정이다. 포도당(glucose)이 포도당 산화효소(Glucose Oxidase, GOx)에 의해 산화되면 글루콘산(gluconic acid)과 과산화수소가 생성된다. 이때 상기 과산화수소의양을 측정하게되면 포도당의 양을 측정할 수 있게 된다. 본 발명의 AuNPs@C.CNF 필름을 사용하면 TMB를 산화시킬 수 있다. 따라서 본 발명의 AuNPs@C.CNF 필름의 과산화효소 유사활성으로 인해 상기 포도당에 의한 TMB의 흡광도(652nm) 변화와 반응용액의 변색 정도를 모니터링하개 되면 샘플의 포도당을 정량적으로 측정 할 수 있게 된다. 실험결과 포도당의 농도가 증가함에 따라 반응용액의 변색(딥블루)이 증가되었으며 이에 따라 흡광도(652nm) 역시 증가하는 것으로 확인되었다(도 6의 패널 D 및 E). 포도당 1 내지 1000μM 범위에서 포도당의 농도와 흡광도의 세기는 잘 일치하는 것으로 확인되었다(도 6의 패널 F). 포도당 1 내지 60μM 범위에서는 선형 응답(linear response) R2=0.994을 보이는 것으로 확인되었으며 선형상관방정식(linear correlation equation)은 A652nm=0.0044[Glucose]+0.01532인 것으로 확인되었다. 또한 검출한계(detection limit, LOD)는 LOD=0.67μM인 것으로 확인되었다.
표 1은 과산화효소 유사활성을 가지는 본 발명의 AuNPs@C.CNF 필름과 다른 나노물질에 대한 과산화수소 및 포도당 검출성능을 보여준다. 본 발명의 AuNPs@C.CNF 필름은 AuNPs 및 기타 나노입자의 과산화효소 유사활성을 이용한 다른 비색 감지방법에 대비하여 그 성능이 더 우수한 것으로 확인되었다.
본 발명의 AuNPs@C.CNF 필름이 다른 종류의 나노자임 시스템 보다 우수한 성능을 보이는 이유는 과산화효소 유사활성을 보이는 금 나노입자의 표면이 유기종(organic species)에 의해 덥혀 있지 않기 때문으로 판단된다. 다른 종류의 나노자임 시스템은 과산화효소 유사활성을 보이는 나노물질을 지지체에 고정시키는 과정에서 일종의 접착물질 또는 보호물질을 사용하게 된다. 이때 상기 접착물질 또는 보호물질은 나노물질의 표면을 코팅하게 되는데 이러한 코팅은 나노물질의 활성을 저하시키는 원인이 된다. 이에 반하여 본 발명의 AuNPs@C.CNF 필름은 금 나노입자를 지지체에 고정하기 위해 일종의 접착물질 또는 보호물질을 사용하지 않는다. 본 발명의 AuNPs@C.CNF 필름은 금 나노입자가 C.CNF의 표면에서 고정되고 성장하므로 추가적인 접착물질 또는 보호물질을 사용할 이유가 없다. 따라서 본 발명의 AuNPs@C.CNF 필름은 금 나노입자가 접착물질 또는 보호물질에 의해 코팅되지 않았으므로 활성저하가 일어나지 않는 것이다.
정상인의 혈당(blood sugar)은 3.0 내지 8.0mM인 것으로 알려져 있다. 본 발명의 AuNPs@C.CNF 필름을 이용하면 희석된 인간 혈청 샘플로부터 혈당을 측정할 수 있다. 이를 확인하기 위하여 대조군 실험으로서 맥아당, 유당, 과당, 자당 등 4 가지의 포도당 유사체를 사용하여 동일한 조건에서 수행하고 이를 비교하였다. 도 7의 패널 A는 포도당이 성공적으로 검출된 결과를 보여준다. 또한 포도당(1mM)보다 높은 농도의 포도당 유사체(5mM)를 사용한 경우에도 무시할만한 수준의 흡광도 변화만이 관찰된다. 따라서 본 발명의 AuNPs@C.CNF 필름을 이용한 혈당 검출방법은 포도당에 대한 매우 선택적인 검출방법으로서 사용 가능할 것으로 판단된다.
2.11. 안정성
본 발명의 AuNPs@C.CNF 필름에 대하여 과산화수소 반응을 수행한 후 FEG-SEM을 수행하여 안정성을 분석하였다. 분석결과 반응 이후에도 본 발명의 AuNPs@C.CNF 필름이 특별한 응집이나 심각한 형태 변화를 보이지 않는 것으로 확인되었다. 이는 본 발명의 AuNPs@C.CNF 필름이 높은 안정성을 가진다는 것을 의미한다. 추가적으로 본 발명의 AuNPs@C.CNF 필름에 대한 저장 수명을 분석한 결과 상온에서 30일 동안 보관하여도 특별한 응집이나 심각한 형태 변화 없이 높은 활성을 유지하는 것으로 확인되었다.
2.12. 재활용성
종래의 금속 나노입자(Metal Nano-particle, MNP)는 액체상태 및 파우더 상태로 촉매 공정에 사용된 후 나노자임을 회수하기 어려운 문제점이 있었다. 특히 사용된 금속 나노입자를 회수하기 위해서는 여과, 자기 분리 및 초원심분리등의 방법을 사용하게 되는데 상기 방법은 에너지 및 시간이 많이 소요되고 많은 양의 물을 필요로 하기 때문에 재활용에 대한 효율성이 떨어지는 문제점이 있었다. 이에 반하여 본 발명의 나노자임인 AuNPs@C.CNF 필름은 입자가 아닌 필름의 형상을 가지므로 여과, 자기 분리 및 초원심분리등의 방법 없이 단순하게 반응용액으로부터 반응이 끝난 AuNPs@C.CNF 필름을 꺼내어 세척하기만 되는 장점이 있다.
본 발명의 AuNPs@C.CNF 필름에 대한 재사용성을 평가하기 위하여 사용한 반응에 사용한 AuNPs@C.CNF 필름을 핀셋으로 수거한 후 Milli Q 워터로 세척 건조하고 반복적인 재사용 실험을 진행하였다. 실험결과 4 사이클 사용(3번 재사용)에도 효율적인 활성을 유지하는 것이 확인되었으며 5 사이클(4번 재사용)이 후 부터 무시할 만 한 수준의 미미한 활성저하가 확인되었다(도 7의 패널 B). 상기 5 사이클 이 후 확인되는 활성저하는 반응물의 반복적인 흡착으로 인해 표면 활성 부위의 일부가 비활성 되었기 때문으로 판단된다. 따라서 본 발명의 AuNPs@C.CNF 필름은 특별한 공정 없이 손쉽게 회수할 수 있을 뿐 아니라 반복적인 재사용을 통한 효율적인 포도당 검출이 가능한 장점이 있다.
2.13. 인간 혈청 샘플에서의 혈당 검출
본 발명의 AuNPs@C.CNF 필름을 이용하여 인간 혈청 샘플에서 포도당을 정량적으로 검출하였다. 또한 동일한 조건으로 표준 GOD-POD 방법을 수행하여 그 결과를 비교하였다. 실험결과 본 AuNPs@C.CNF 필름을 이용한 혈당측정 결과는 표준 GOD-POD 방법의 결과와 잘 일치하는 것으로 확인되었다.
3. 결론
본 발명에서는 마이크로 조사방법을 이용한 인-시츄(in-situ) 방법으로 양이온성 셀룰로오스 나노섬유(C.CNF)에서 양이온성 금 나노입자가 합성되고 이와 동시에 양이온성 셀룰로오스 나노섬유의 표면에 결합된 AuNPs@C.CNF를 제조한다. 본 발명의 AuNPs@C.CNF는 양이온성 셀룰로오스 나노섬유가 금 나노입자의 합성과정에서 환원제로 사용될 뿐 아니라 금나노 입자의 고정을 위한 지지체로서 사용된다. 본 발명의 양이온성 셀룰로오스 나노섬유에 존재하는 4가 암모늄 기능기(quaternary ammonium moiety)는 염화금 이온(AuCl4 -)의 흡착을 위한 고정 부위로서 작용하게 되고 상기 흡착된 염화금 이온은 히드록실 작용기(hydroxyl functional group)에 의해 금 나노입자(AuNP)로 환원된다.
본 발명의 전체적인 합성과정은 간단하고 비용이 저렴하여 양전하로 대전된 금 나노입자의 대량생산에 효과적인 것으로 판단된다.
본 발명의 AuNPs@C.CNF 필름은 과산화수소 조건에서 TMB 기질에 대한 높은 과산화효소 유사활성을 보이는 것으로 확인되었으며 포도당 산화효소와 연계된 포도당 및 과산화수소의 비색검출반응에 응용되어 효과적인 혈당측정방법으로 사용될 수 있다는 것이 확인되었다. 본 발명의 AuNPs@C.CNF 필름은 금 나노입자의 표면에서 과산화수소가 OH-라디칼로 분해되는 기작에 의한 것으로 확인되었다. 본 발명의 AuNPs@C.CNF 필름은 회수가 용이하고 과산화수소의 검출 감도가 높을 뿐 아니라 금 나노입자를 코팅하고 있는 유기물이 전혀 없어 최소 5회 이상 재사용이 가능한 것으로 확인되었다.
따라서 본 발명의 AuNPs@C.CNF 필름을 이용한 과산화수소 검출 방법은 과산화수소 및 포도당에 대한 높은 검출 감도와 선택성을 가질 뿐 아니라 회수가 용이하고 재활용이 가능한 장점이 있으므로 생물, 의학, 생명공학 및 환경화학 분야에서 효과적인 검출기재로서 사용이 가능할 것으로 판단된다.
본 명세서에서 설명된 구체적인 실시예는 본 발명의 바람직한 구현예 또는 예시를 대표하는 의미이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 한정되지는 않는다. 본 발명의 변형과 다른 용도가 본 명세서 특허청구범위에 기재된 발명의 범위로부터 벗어나지 않는다는 것은 당업자에게 명백하다.

Claims (9)

  1. 금 나노입자(Au Nanopaticle)가 +40 내지 43mV의 제타 포텐셜(zeta potential)값을 가진 양이온성 셀룰로오스 나노섬유(Cationic Cellulose Nano-fibril)의 표면에 결합된 포도당 검출용 금 나노입자 셀룰로오스 나노섬유 복합체로서,
    상기 복합체는 +39 내지 40mV의 제타 포텐셜(zeta potential)값을 가지며, 과산화수소 검출한계가 0.25 내지 0.35μM이며, 포도당 검출한계가 0.6 내지 0.7μM인 것을 특징으로 하는 포도당 검출용 금 나노입자 셀룰로오스 나노섬유 복합체.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 금 나노입자는 구형의 형상을 가지며 상기 양이온성 셀룰로오스 나노섬유 표면의 히드록시기(OH-group)와 수소결합을 형성하여 결합된 것을 특징으로 하는 금 나노입자 셀룰로오스 나노섬유 복합체.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 양이온성 셀룰로오스 나노섬유는 4가 암모늄 기능기(moiety)가 표면을 점유하여 양(+)의 제타 포텐셜(zeta potential)값을 가지는 것을 특징으로 하는 금 나노입자 셀룰로오스 나노섬유 복합체.
  4. 금 나노입자(Au Nanopaticle)가 +40 내지 43mV의 제타 포텐셜(zeta potential)값을 가진 양이온성 셀룰로오스 나노섬유(Cationic Cellulose Nano-fibril)의 표면에 결합된 포도당 검출용 금 나노입자 셀룰로오스 나노섬유 복합체 필름으로서, 상기 복합체는 +39 내지 40mV의 제타 포텐셜(zeta potential)값을 가지며, 과산화수소 검출한계가 0.25 내지 0.35μM이며, 포도당 검출한계가 0.6 내지 0.7μM인 것을 특징으로 하는 포도당 검출용 금 나노입자 셀룰로오스 나노섬유 복합체 필름.
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 셀룰로오스 나노섬유를 글리시딜트리메틸암모늄 클로라이드(glycidyltrimethylammonium chloride)와 반응시켜 +40 내지 43mV의 제타 포텐셜(zeta potential)값을 가진 양이온성 셀룰로오스 나노섬유를 제조하는 제 1 단계;
    상기 양이온성 셀룰로오스 나노섬유를 용액으로 제조한 후 금 나노입자 전구체를 첨가하여 금 나노입자 셀룰로오스 나노섬유 복합체 전구체 용액을 제조하는 제 2 단계; 및
    상기 금 나노입자 셀룰로오스 나노섬유 복합체 전구체 용액에 마이크로파(800W)를 조사하여 +39 내지 40mV의 제타 포텐셜(zeta potential)값을 가지는 금 나노입자 셀룰로오스 나노섬유 복합체를 합성하는 제 3 단계;
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 금 나노입자 셀룰로오스 나노섬유 복합체의 제조방법으로서,
    상기 금 나노입자 셀룰로오스 나노섬유 복합체는 과산화수소 검출한계가 0.25 내지 0.35μM이며, 포도당 검출한계가 0.6 내지 0.7μM인 것을 특징으로하는 금 나노입자 셀룰로오스 나노섬유 복합체의 제조방법.
  8. 제 7 항에 있어서, 상기 금 나노입자 셀룰로오스 나노섬유 복합체의 제조방법은 상기 양이온성 셀룰로오스 나노섬유가 금 나노입자 전구체로부터 생성된 금 이온(Au3+)에 대한 환원제로 작용하여 금 나노입자(Au Nanopaticle)를 합성하고 상기 금 나노입자가 수소결합을 통해 결합하여 성장하는 지지체 역할을 하는 것을 특징으로 하는 금 나노입자 셀룰로오스 나노섬유 복합체의 제조방법.
  9. 제 8 항에 있어서, 상기 양이온성 셀룰로오스 나노섬유는 4가 암모늄 기능기(moiety)가 표면을 점유하여 양(+)의 제타 포텐셜(zeta potential)값을 가지는 것을 특징으로 하며, 상기 금 나노입자 전구체는 클로로아우르산(HAuCl4·3H2O)인 것을 특징으로 하는 금 나노입자 셀룰로오스 나노섬유 복합체의 제조방법.
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