KR102560138B1 - 신경교세포 표현형 기반의 siRNA 다중 스크리닝을 통해 선별된 신경교세포 인산화효소의 신경염증 조절 용도 - Google Patents

신경교세포 표현형 기반의 siRNA 다중 스크리닝을 통해 선별된 신경교세포 인산화효소의 신경염증 조절 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 신경교세포 표현형(behavior) 기반의 siRNA 다중 스크리닝을 통해 선별된 신경교세포 인산화효소의 신경염증 조절 용도에 대한 것으로, 본 발명자들은 신경교세포 활성화, 사멸/생존, 이동 및 식세포 작용과 같은 신경염증성 신경교세포 주요 활성 표현형을 조절하는데 중요한 역할을 하는 인산화효소를 구별하기 위한 새로운 연구를 진행하였다. 다양한 신경교세포 표현형을 동시에 확인하기 위해서, 본 발명자들은 신생 마우스 뇌로부터 준비된 혼합 신경교세포를 지질다당류(lipopolysaccharide; LPS)로 자극한 후, 623개의 인산화효소를 표적으로 하는 siRNA 라이브러리를 이용한 다중 및 세포-기반 스크리닝을 설계하고 수행하였다. 엄격한 기준을 사용하여 표적 인산화효소를 확인하였고, 추가 검증 및 특성화를 위해 선별을 진행하였다. 본 발명은 신경교세포 표현형을 조절하고 신경염증성 장애를 치료하기 위한 치료 표적으로 신경교세포 인산화효소를 선택하여, 잘 알려지지 않은 신경교세포의 세포 내 신호전달 네트워크에 대한 이해를 높힐 수 있을 것으로 예상된다.

Description

신경교세포 표현형 기반의 siRNA 다중 스크리닝을 통해 선별된 신경교세포 인산화효소의 신경염증 조절 용도{Use for regulating neuroinflammation of glial kinases selected by multiplexed kinome-wide siRNA screening for glial cell behaviors}
본 발명은 신경교세포 표현형(behavior) 기반의 siRNA 다중 스크리닝을 통해 선별된 신경교세포 인산화효소의 신경염증 조절 용도에 대한 것이다.
중추신경계(central nervous system; CNS)는 정교한 면역 시스템을 포함하는데, 이는 항상성을 유지시키고 감염 완화를 촉진시키는데 적극적으로 관여한다. 신경교세포(Glial cells), 즉 성상세포(astrocytes) 및 미세아교세포(microglia)는 항상성 기능 및 면역 감시에 주요 역할을 수행하는 비-신경 세포이다. 상기 세포는 신경염증 과정에서 "신경교세포 과활성 (glial hyperactivation)"이라고 일컬어지는 광범위한 형태학적 및 기능적 변화를 겪게 된다. 즉, 세포 (재)활성화, 증식, 이동 및 식세포 작용(phagocytosis)와 같은 다양한 세포활성 표현형을 나타낸다. 이러한 세포활성 표현형은 주로 신경염증 제어 및 신경 손상 후 회복 촉진하는데에 관여한다. 예를 들면, 급성 국소 신경 손상 후, 미세아교세포 및 성상세포는 활성화되고, 외부인자에 반응하여 염증 신호를 전파하기 위한 사이토카인들을 생산한다. 활성화된 신경교세포에 의해 방출된 신호는 다른 신경교세포를 손상 부위로 유인하고, 죽은 세포 또는 병원성 물질의 제거를 유도하여, 조직을 재구성하고 항상성을 회복시킨다. 하지만, 중증 또는 만성 신경교세포 활성의 경우, 이러한 표현형은 유익한 결과보다 신경퇴행 및 CNS 조직 손상과 같은 유해한 효과를 나타낸다. 반응성 신경교세포는 활성 산소 및 질소종과 같은 신경독성 분자를 방출하는데, 이는 뉴런 활성을 방해하고 비특이적 식세포 작용을 수행한다. 따라서 CNS 손상에 대한 반응성 신경교세포 반응이 유익한 것과 유해한 것 사이에서 균형이 잘 잡혀 복잡하게 혼합되어 있다는 점은 현재 분명하게 인식되고 있다. 광범위한 신경계 장애에 있어, 부적절한 신경교세포 활성은 "공통 분모"이다. 이는 신경교세포 활성화의 기초가 되는 분자적 기전을 해독하는 것이 치료 가능 표적의 발굴 및 개발을 촉진할 수 있다는 것을 의미한다. 그러나, 다양한 신경교세포 표현형을 유도하는 세포 내 신호 전달 경로에 대해서는 잘 알려져 있지 않다.
인산화효소(Kinases)는 표적 단백질 상의 세린, 트레오닌 또는 티로신 잔기를 인산화하여 단백질 기능을 조절할 뿐만 아니라 단백질 상호작용을 통해 다른 인산화효소의 활성을 조절할 수 있는 도메인을 포함하는 거대한 효소 그룹으로 구성된다. 세포 증식, 분화, 성장, 대사, 세포 골격 재배열 및 생존을 포함하는 거의 모든 세포 과정에서, 인산화효소는 주도적인 조절 역할을 수행한다.
따라서, 인산화효소의 역할을 이해하는 것은 신경교세포 표현형 또는 과잉 활성의 조절을 연구하는데 필수적이다. 현재까지 공개된 인산화효소-표적 연구는 대부분 비-CNS 질환에 집중되어 있었다. 특히 류마티스 관절염이나 암과 같은 체성 염증 또는 악성 증식에 관련된 비정상적인 인산화효소 활성 연구가 대부분 이루어졌다. 신경계 질환에 있어서는, 파킨슨병에서 뉴런의 LRRK2 및 글리코겐 생성효소 인산화효소-3β(glycogen synthase kinase-3β)와, 알츠하이머병 및 다른 신경퇴행성 장애에 있어서의 TTMK1와 같은 특정 인산화효소가 표적화되었으나 비신경계에 비해 신경교세포 인산화효소에 대해서는 현재 잘 연구되어 있지 않다.
한국등록특허 제10-1928611호 (2018.12.06. 등록)
이에, 본 발명에서는 표 2, 표 5, 표 8 및 표 11에 기재된 신경교세포 인산화효소로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 신경교세포 인산화효소를 유효성분으로 함유하는 신경염증질환 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공하는 데에 그 목적이 있다.
또한, 본 발명에서는 표 3, 표 7 및 표 10에 기재된 신경교세포 인산화효소로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 신경교세포 인산화효소 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는 신경염증질환 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공하는 데에 그 목적이 있다.
본 발명은 표 2에 기재된 신경교세포 인산화효소로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 신경교세포 인산화효소를 유효성분으로 함유하는 신경염증질환 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 표 3에 기재된 신경교세포 인산화효소로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 신경교세포 인산화효소 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는 신경염증질환 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 표 5에 기재된 신경교세포 인산화효소로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 신경교세포 인산화효소를 유효성분으로 함유하는 신경염증질환 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 표 7에 기재된 신경교세포 인산화효소로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 신경교세포 인산화효소 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는 신경염증질환 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 표 8에 기재된 신경교세포 인산화효소로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 신경교세포 인산화효소를 유효성분으로 함유하는 신경염증질환 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 표 10에 기재된 신경교세포 인산화효소로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 신경교세포 인산화효소 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는 신경염증질환 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 표 11에 기재된 신경교세포 인산화효소로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 신경교세포 인산화효소를 유효성분으로 함유하는 신경염증질환 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 표 2, 표 5, 표 8 및 표 11에 기재된 신경교세포 인산화효소로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 신경교세포 인산화효소를 유효성분으로 함유하는 신경염증질환 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 표 3, 표 7 및 표 10에 기재된 신경교세포 인산화효소로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 신경교세포 인산화효소 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는 신경염증질환 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
본 발명은 신경교세포 표현형(behavior) 기반의 siRNA 다중 스크리닝을 통해 선별된 신경교세포 인산화효소의 신경염증 조절 용도에 대한 것으로, 본 발명자들은 신경교세포 활성화, 사멸/생존, 이동 및 식세포 작용과 같은 신경염증성 신경교세포 주요 활성 표현형을 조절하는데 중요한 역할을 하는 인산화효소를 구별하기 위한 새로운 연구를 진행하였다. 다양한 신경교세포 표현형을 동시에 확인하기 위해서, 본 발명자들은 신생 마우스 뇌로부터 준비된 혼합 신경교세포를 지질다당류(lipopolysaccharide; LPS)로 자극한 후, 623개의 인산화효소를 표적으로 하는 siRNA 라이브러리를 이용한 다중 및 세포-기반 스크리닝을 설계하고 수행하였다. 엄격한 기준을 사용하여 표적 인산화효소를 확인하였고, 추가 검증 및 특성화를 위해 선별을 진행하였다. 본 발명은 신경교세포 표현형을 조절하고 신경염증성 장애를 치료하기 위한 치료 표적으로 신경교세포 인산화효소를 선택하여, 잘 알려지지 않은 신경교세포의 세포 내 신호전달 네트워크에 대한 이해를 높힐 수 있을 것으로 예상된다.
도 1은 다중 인산화효소 siRNA 스크리닝 전략의 모식도를 나타낸다.
도 2는 NO 분석에서 확인된 신경교세포의 염증 활성화를 조절하는 인산화효소들에 대해 나타낸다. (A) SSMD vs. 배수 변화(log2 스케일)에 대한 이중-플래시라이트 플롯(dual-flashlight plot)을 나타낸다. (B) DAVID bioinformatics tool을 사용한 대표적인 KEGG 경로 분석을 나타낸다. (C) ClueGO를 사용하여 생성된 GO terms에 대한 대표적인 기능성 그룹 네트워크 분석 결과를 나타낸다. (D) “T 세포 수용체 신호전달 경로”의 모식도이다. 별표는 본 발명의 스크리닝에서 확인된 인산화효소를 나타낸다.
도 3은 신경교세포 및 신경염증에서 ITK 발현 및 역할에 대해 나타낸다. (A) LPS (1 μg/ml)로 6시간 동안 자극된 MGC에서 ITK mRNA 수준을 나타낸다(n = 3 per group). (B) LPS (5 mg/kg)의 복강 투여 24시간 후, 염증 발생 뇌에서의 ITK mRNA 수준을 나타낸다. (C) LPS-유도 염증 발생 뇌의 해마에서, 인산화된 ITK(p-ITK) 및 총-ITK의 면역형광 분석 결과를 나타낸다. (D) T-세포 수용체 신호전달 경로와 관련된 인산화효소의 면역블랏 결과를 나타낸다. (E) BV-2 미세아교세포에서 ITK 억제제(BMS 509744 및 GW 2250665A)가 LPS-유도 NO 생산을 감소시킨다는 결과를 나타낸다. (F) LPS (100 ng/ml) 처리 후, ITK 억제제인 BMS-509744 (1 μg/ml)의 존재 유무에 따른 PLC-γ (ITK 기질)의 면역블롯 결과를 나타낸다.
도 4는 신경염증 및 동반 행동 변화에서의 ITK 역할을 나타낸다. (A) 해마 영역의 신경교세포의 면역조직화학 분석 결과를 나타낸다. (B) 마우스 뇌에서의 전-염증성 유전자(TNF-α, IL-1β 및 NOS2)의 발현 결과를 나타낸다(n= 5). (C) LPS-유도 행동 손상에 있어 ITK 억제 효과를 나타낸다.
도 5는 신경교세포 사멸/생존을 조절하는 인산화효소에 대해 나타낸다. (A) 다중 인산화효소 siRNA 스크리닝 과정에서 세포 사멸 분석에 따른 Z-스코어 그래프를 나타낸다. (B) DAVID bioinformatics tool을 사용한 대표적인 KEGG 경로 분석 결과를 나타낸다. (C) ClueGO로 생성된 GO terms에 대한 대표적인 기능성 그룹 네트워크 분석 결과를 나타낸다.
도 6은 상처 치유 분석에서 확인된 신경교세포 이동을 조절하는 인산화효소들에 대해 나타낸다. (A) SSMD vs. 배수 변화(log2 스케일)에 대한 이중-플래시라이트 플롯(dual-flashlight plot)을 나타낸다. (B) DAVID bioinformatics tool을 사용한 대표적인 KEGG 경로 분석 결과를 나타낸다. (C) ClueGO로 생성된 GO terms에 대한 대표적인 기능성 그룹 네트워크 분석 결과를 나타낸다. (D) “암에서의 핵심 탄소 대사”의 모식도이다. 별표는 본 발명의 스크리닝에서 확인된, 특정 신호전달 경로와 관련된 인산화효소를 나타낸다.
도 7은 신경교세포 이동 및 해당 과정 대사에서의 PDK2 역할을 나타낸다. (A) WT 마우스 유래 MGC의 상처 치유 분석에 따른 대표적인 이미지들을 나타낸다. (B) PDK2 KO 마우스 유래 MGC의 상처 치유 분석에 따른 대표적인 이미지들을 나타낸다. (C) (A) 및 (B)에서의 이동 속도(μm/h)를 정량화한 결과를 나타낸다(n = 3 per each group). (D) 생체 내(in vivo) 성상세포 이동에 있어 PDK2 억제 효과를 나타낸다.
도 8은 식세포 작용 분석에서 확인된 신경교세포 식세포 작용을 조절하는 인산화효소들에 대해 나타낸다. (A) SSMD vs. 배수 변화(log2 스케일)에 대한 이중-플래시라이트 플롯(dual-flashlight plot)을 나타낸다. (B) DAVID bioinformatics tool을 사용한 대표적인 KEGG 경로 분석 결과를 나타낸다. (C) ClueGO로 생성된 GO terms에 대한 대표적인 기능성 그룹 네트워크 분석 결과를 나타낸다. (D) “Fcγ 수용체-매개 식세포 작용”의 모식도이다. 별표는 본 발명의 스크리닝에서 확인된, 신호전달 경로와 관련된 인산화효소를 나타낸다.
도 9는 신경염증 및 신경독성에 있어서, 미세아교세포성 ITK 및 성상세포성 PDK2의 관련성을 나타내는 모식도이다.
이에, 본 발명자들은 신경교세포 활성화, 사멸/생존, 이동 및 식세포 작용과 같은 신경염증성 신경교세포 활성 표현형을 조절하는데 중요한 역할을 하는 인산화효소를 구별하기 위한 새로운 연구를 진행하였다. 다양한 신경교세포 표현형을 동시에 확인하기 위해서, 본 발명자들은 신생 마우스 뇌로부터 준비된 혼합 신경교세포를 지질다당류(lipopolysaccharide; LPS)로 자극한 후, 623개의 인산화효소를 표적으로 하는 siRNA 라이브러리를 이용한 다중 및 세포-기반 스크리닝을 설계하고 수행하였다. 4개의 다른 표현형 분석은 병렬 또는 연속 순서로 수행되었다. 엄격한 기준을 사용하여 표적 인산화효소를 확인하였고, 추가 검증 및 특성화를 위해 선별을 진행하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 표 2에 기재된 신경교세포 인산화효소로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 신경교세포 인산화효소 또는 상기 신경교세포 인산화효소의 발현 또는 활성 촉진제를 유효성분으로 함유하는 신경염증질환 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 표 3에 기재된 신경교세포 인산화효소로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 신경교세포 인산화효소의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는 신경염증질환 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.
상세하게는, 상기 약학조성물은 신경교세포 활성화를 조절할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 표 5에 기재된 신경교세포 인산화효소로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 신경교세포 인산화효소 또는 상기 신경교세포 인산화효소의 발현 또는 활성 촉진제를 유효성분으로 함유하는 신경염증질환 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.
상세하게는, 상기 약학조성물은 신경교세포 생존을 조절할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 표 7에 기재된 신경교세포 인산화효소로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 신경교세포 인산화효소의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는 신경염증질환 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 표 8에 기재된 신경교세포 인산화효소로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 신경교세포 인산화효소 또는 상기 신경교세포 인산화효소의 발현 또는 활성 촉진제를 유효성분으로 함유하는 신경염증질환 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.
상세하게는, 상기 약학조성물은 신경염증 손상 부위로의 신경교세포 이동성을 조절할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 표 10에 기재된 신경교세포 인산화효소로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 신경교세포 인산화효소의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는 신경염증질환 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 표 11에 기재된 신경교세포 인산화효소로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 신경교세포 인산화효소 또는 상기 신경교세포 인산화효소의 발현 또는 활성 촉진제를 유효성분으로 함유하는 신경염증질환 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.
상세하게는, 상기 약학조성물은 신경교세포의 식세포 작용(phagocytosis)을 조절할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상세하게는, 상기 신경교세포 인산화효소의 발현 억제제는 상기 신경교세포 인산화효소 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오타이드, 작은 간섭 RNA(small interfering RNA; siRNA), 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA; shRNA) 또는 CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas9 일 수 있고, 상기 신경교세포 인산화효소의 활성 억제제는 상기 신경교세포 인산화효소 단백질에 특이적으로 결합하는 화합물, 펩티드, 펩티드 미메틱스, 앱타머, 항체 또는 천연물일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상세하게는, 상기 신경교세포 인산화효소의 발현 또는 활성 촉진제는 상기 신경교세포 인산화효소 단백질에 특이적으로 결합하는 화합물, 펩티드, 펩티드 미메틱스, 앱타머, 항체 또는 천연물일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
바람직하게는, 상기 신경염증질환은 다발성 경화증, 신경모세포종, 뇌졸중, 알츠하이머 병, 파킨슨 병, 루게릭 병, 헌팅턴 병, 크로이츠펠트야콥병, 외상 후 스트레스 장애, 우울증, 정신분열증 및 근위축성측색경화증으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 약학 조성물은 화학물질, 뉴클레오타이드, 안티센스, siRNA 올리고뉴클레오타이드 및 천연물 추출물을 유효성분으로 포함할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물 또는 복합 제제는 유효 성분 이외에 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 사용하여 제조될 수 있으며, 상기 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제 등의 가용화제를 사용할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 투여를 위해서 유효 성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1 종 이상 포함하여 약학 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용 가능한 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물의 약제 제제 형태는 과립제, 산제, 피복정, 정제, 캡슐제, 좌제, 시럽, 즙, 현탁제, 유제, 점적제 또는 주사 가능한 액제 및 활성 화합물의 서방출형 제제 등이 될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 흉골내, 경피, 비측내, 흡입, 국소, 직장, 경구, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 투여할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물의 유효성분의 유효량은 질환의 예방 또는 치료 요구되는 양을 의미한다. 따라서, 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효 성분 및 다른 성분의 종류 및 함량, 제형의 종류 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다. 이에 제한되는 것은 아니나, 예컨대, 성인의 경우, 1일 1회 내지 수회 투여시, 본 발명의 조성물은 1일 1회 내지 수회 투여시, 화합물일 경우 0.1ng/kg~10g/kg, 폴리펩타이드, 단백질 또는 항체일 경우 0.1ng/kg~10g/kg, 안티센스 뉴클레오타이드, siRNA, shRNAi, miRNA일 경우 0.01ng/kg~10g/kg의 용량으로 투여할 수 있다.
또한, 본 발명은 표 2, 표 5, 표 8 및 표 11에 기재된 신경교세포 인산화효소로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 신경교세포 인산화효소를 유효성분으로 함유하는 신경염증질환 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 표 3, 표 7 및 표 10에 기재된 신경교세포 인산화효소로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 신경교세포 인산화효소 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는 신경염증질환 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
상세하게는, 상기 신경교세포 인산화효소 발현 억제제는 상기 신경교세포 인산화효소 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오타이드, 작은 간섭 RNA(small interfering RNA; siRNA) 또는 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA; shRNA)일 수 있고, 상기 신경교세포 인산화효소 활성 억제제는 상기 신경교세포 인산화효소 단백질에 특이적으로 결합하는 화합물, 펩티드, 펩티드 미메틱스, 앱타머, 항체 또는 천연물일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
바람직하게는, 상기 신경염증질환은 다발성 경화증, 신경모세포종, 뇌졸중, 알츠하이머 병, 파킨슨 병, 루게릭 병, 헌팅턴 병, 크로이츠펠트야콥병, 외상 후 스트레스 장애, 우울증, 정신분열증 및 근위축성측색경화증으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 건강기능식품 조성물은 분말, 과립, 정제, 캡슐, 시럽 또는 음료의 형태로 제공될 수 있으며, 상기 건강기능식품 조성물은 유효성분 이외에 다른 식품 또는 식품 첨가물과 함께 사용되고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합양은 그의 사용 목적 예를 들어 예방, 건강 또는 치료적 처치에 따라 적합하게 결정될 수 있다.
상기 건강기능식품 조성물에 함유된 유효성분의 유효용량은 상기 약학조성물의 유효용량에 준해서 사용할 수 있으나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며, 유효성분은 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있음은 확실하다.
상기 건강식품의 종류에는 특별한 제한이 없고, 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등을 들 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
<실험예>
하기의 실험예들은 본 발명에 따른 각각의 실시예에 공통적으로 적용되는 실험예를 제공하기 위한 것이다.
1. 시약
Escherichia coli 0111:B4 유래 지질다당류(lipopolysaccharide; LPS), 올리고마이신(oligomycin), FCCP, 로테논(rotenone), 미토마이신 C(mitomycin C) 및 5-브로모-2'-데옥시유리딘(5-bromo-2'-deoxyuridine; BrdU)은 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)로부터 구입하였다. 다음의 인산화효소 억제제는 Tocris (Abingdon, UK)로부터 구입하였다: LRRK2-IN-1, BMS 509744, GSK650394 및 GW-2250665A. IRAK-1/4 억제제 1은 Sigma-Aldrich로부터 구입하였다. SBI-0206965는 Selleckchem (Houston, TX)으로부터 얻었다. PM2tide는 Enzo Life Sciences (Farmingdale, NY)로부터 얻었다. MLKL 억제제는 Calbiochem으로부터 얻었다. GNF-2는 이전 보고에 따라 준비하였다. AZD7545는 경북대학교(대구, 대한민국) 이인규 교수로부터 제공받았다.
2. 신경교세포 배양
마우스 신생아 혼합 신경교세포 배양(Mouse neonatal mixed glial cultures; MGC)은 이전 보고에서 약간 변형하여 진행하였다. 간단히 설명하면, 3주령 C57BL/6 마우스의 전체 뇌를 잘게 자르고, 나일론 메쉬를 사용하여 기계적으로 분쇄하였다. 얻어진 세포는 배양 플라스크에 접종하였고, 5% CO2 대기에서 37℃로, 10% 열-불활성화된 FBS, 100 U/mL 페니실린 및 100 μg/mL 스트렙토마이신이 첨가된 DMEM에서 배양하였다. 배양 배지는 5일 후에 최초로 교체하였고, 이후에는 3일 마다 교체하였다. 세포는 배양 14-21일 후에 사용하였다. MGC 유래 순수 성상세포 배양은 이전 보고에서 약간 변형하여 진행하였다. 순수 미세아교세포 배양은 MGC로부터 약한 트립신화를 통해 얻었다. BV-2 불멸화된 마우스 미세아교세포주는 10% 우태아혈청, 100 U/mL 페니실린 및 100 μg/mL 스트렙토마이신이 첨가된 DMEM에서 유지시켰다.
3. 인산화효소 siRNA 라이브러리
623개의 마우스 인산화효소의 siRNA 라이브러리(MISSION® siRNA Mouse Kinase Panel, SI42050)는 Sigma로부터 구입하였다. 각각의 인산화효소 유전자를 표적으로 하는 3개의 다른 서열을 갖는 siRNAs가 라이브러리에 포함되었다. siRNAs는 96-웰 플레이트에 적용되었다. 제조사의 지시에 따라, 도착 즉시 10 μM 사용 스톡으로 희석하였고, 사용 전까지 -20℃에서 보관하였다.
4. 다중 포맷의 고효율 siRNA 스크리닝
고효율 스크리닝 이전에, siRNAs 농도, 형질감염 시약 및 형질감염 효율은 MGC 세포에 최적화시켰다. 스크리닝을 위해, 96-웰의 평평하고 투명한 바닥 및 검정 벽면의 폴리스티렌-처리된 조직 배양 마이크로플레이트(Corning, Flintshire, UK)의 각 웰에 14일째 MGC 세포를 시험관 내(in vitro) 접종하였다(웰 당 2,500 세포). 48시간 후, 제조사의 지시에 따라 Lipofectamine RNAiMAX reagent (Invitrogen)를 사용하여, siRNAs로 세포들을 형질감염시켰다. 이후, 다음 4개의 다른 분석을 순서대로 수행하였다(도 1).
(1) 산화질소 분석
MGC 내 산화질소(nitric oxide; NO) 생산을 측정하기 위해서, Griess reagent를 사용하여 배양 배지 내 아질산염(Nitrite; NO2) 농도를 측정하였다. 50 마이크로리터 샘플 분주물(aliquots)과 50 μL Griess reagent (1% 설파닐아미드/0.1% 나프틸에틸렌 디아민 디하이드로클로라이드/2% 인산)를 96-웰 플레이트에서 혼합하였다. 550 nm에서의 흡광도를 microplate reader (SpectraMax M5, Molecular Devices)로 측정하였다. NO2 농도를 계산하기 위한 기준으로, NaNO2를 사용하였다.
(2) 세포독성 분석
세포독성은 CytoTox 96® Non-Radioactive Cytotoxicity Assay Kit(Promega, Madison, WI)를 사용하여, 제조사의 지시에 따라, 젖산 탈수소효소(lactate dehydrogenase; LDH)의 양을 측정하여 분석하였다. MGC 세포로부터 얻은 배양 배지(50 μL)를 LDH 기질 용액(50 μL)과 함께 암소에서 20분 동안 배양하였다. 정지 용액 첨가 후, 490 nm에서의 흡광도를 microplate reader (SpectraMax M5, Molecular Devices)로 측정하였다.
(3) 상처 치유 분석
시험관 내(in vitro) 상처 치유 분석은 IncuCyte ZOOM Live-Cell Imaging system (Essen Bioscience)을 사용하여 수행하였다. 상처 유도 전에 미토마이신 C (5 μg/ml)로 2시간 동안 MGC 세포를 처리하여, 세포 증식을 억제시켰다. 상처는 IncuCyte WoundMaker™로 만들었고, IncuCyte ZOOM Live-Cell Imaging system을 통해 자동으로 상처 봉합에 대한 플레이트 분석을 수행하였다. 실시간 이미지들은 48시간 동안 2-3시간 마다 획득하였다. 세포 밀집도는 IncuCyte ZOOM software에 의해 생성되는 시간 간격 곡선을 사용하여 정량하였다.
(4) 식세포 작용 분석
식세포 작용 분석은 pH-sensitive pHrodo® Red Zymosan BioParticles (Life Technologies, Carlsbad, CA)를 사용하여, 공급자의 지시에 따라 수행하였다. pHrodo® Red 접합체는 세포 외부의 중성 pH에서는 비-형광성이지만, 포식소체(phagosomes)에서와 같이 산성 pH에서는 형광을 나타내어, 식세포 작용을 보다 정확하게 측정할 수 있다. 간단히 설명하면, Live Cell Imaging Solution (Thermo Fisher Scientific)에 희석된 Zymosan 접합체 입자(10 μg/mL)와 함께, MGC 세포를 암소에서 2시간 동안 반응시켰다. Hoechst (Life Technologies, 1:1000)를 사용하여, 핵을 대비염색하였다. 반응 후, 세포들을 완전히 씻어냈고, 2% 파라포름알데히드를 사용하여 상온에서 10분 동안 고정시켰다. 세포 형광도는 microplate reader (SpectraMax M5, Molecular Devices)로 측정하였다.
5. 데이터 품질 검증, 히트(hit) 선별 및 경로 강화 분석
데이터 품질 검증 목적으로, 개별적인 플레이트에 대한 데이터는 플레이트 내 각각의 양성대조군을 적용한 Strictly Standardized Mean Difference (SSMD) 방법에 의해 선별되었다. 데이터 품질 검증 기준은 "중간 효과"에 대한 SSMD 정의에 따라 결정되었다. 각각의 스크리닝에서 유전자들을 정렬하기 위해서, 배수-변화 접근을 조합한 SSMD 방법이 적용되었고, 3번 반복하여 수행하였다. 0.7 배 및 1.5 배의 변화와 함께 -1.65 미만 및 1.65 초과의 SSMD 컷오프를 사용하여 억제제 및 증강제를 각각 정의하였다. 신경교세포 사멸/생존 분석에 있어서, Z-스코어는 플레이트 샘플 평균에서 각각의 세포 사멸 수치를 빼고, 이를 플레이트 표준 편차(standard deviation; SD) 수치로 나누어서 계산되었다. 잠재적인 히트를 구별하기 위한 기준은 -1.65 미만의 Z-스코어 컷오프를 사용하였고, 이는 p 수치 0.05에 해당한다. 모든 분석의 재현성은 2번 반복 시험 및 Pearson’s 상관 분석에 의해 확인되었다. 유전자 온톨로지(Gene ontology; GO, Immune systems, Reactome pathway, and Reactome) 또는 the Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) 상에 기반한 인산화효소의 기능 기전은 the Database for Annotation, Visualization, and Integrated Discovery (DAVID) Bioinformatics Resources 및 the ClueGo plug-in for Cytoscape software을 사용하여 수행하였다.
6. 마우스 및 동물 관리 절차
수컷 C57BL/6 마우스(8 주령)는 Samtaco (Osan, South Korea)로부터 얻었다. 8-10 주령의 수컷 Pdk2 넉아웃(knockout; KO) 마우스는 이전에 보고한 대로 제작하여 사용하였다. 연령 일치된 WT 마우스는 C57BL/6J 마우스로부터 제작되었는데(The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME), Pdk2 KO의 유전적 배경을 안정화시키기 위해 사용하였다. 게노믹 DAN의 유전형은 PCR을 통해 확인하였다. 동물들은 12시간 명암 주기(07:00-19:00 빛)로 사육하였고, 23 ± 2℃의 일정한 온도하에서 음식 및 물은 마음대로 제공하였다. 각 개별적인 동물은 단일 실험을 위해 사용하였다. 모든 동물 실험은 경북대학교 동물실험윤리위원회의 동물 프로토콜 및 가이드라인에 따라 수행되었다(No. KNU 2018-0084).
7. LPS 투여 및 창상 손상 모델
마우스에서 신경염증을 유발하기 위해서, LPS의 전신 투여를 수행하였다. 대조군 또는 LPS (5 mg/kg)를 마우스에 복강 투여하였다. 대조군 그룹의 동물에게는 동일 부피의 식염수를 투여하였다. 투여 24시간 후, 깊은 에테르-유도 마취하에서 동물들을 죽였다. 창상 손상 모델에서, 마우스에 이소플루란(3%)을 흡입시켜 마취하였고, 정위 장치에 놓았다. 바늘(30 G)을 주입하여 창상 손상을 만들었다. PDK2 억제제(AZD7545) 또는 대조군 0.5 μL을 전전두엽 영역(전후측, -2.5 mm; 내외측, 1.5 mm; 등배측, -1.0 mm)에 작은 천공을 통해 정위법적으로 투여하였다(유속, 0.1 μL/min). PDK2 KO 마우스에서는, 오직 바늘을 주입하여 손상을 만들었다. Bonewax (Ethicon)를 이용하여 천공을 마운팅한 후, 피부를 봉합하였다. 신경교세포 증식을 측정하기 위해서, BrdU (200 mg/kg)를 수술 이후 6시간 마다 3차례 복강 투여하였다. 마우스의 뇌조직은 창상 손상 24시간 후에 얻었다.
8. 행동 분석
Y-maze는 세 개의 팔이 수평으로 존재하는 미로이다(길이: 40 cm, 너비: 3 cm, 벽 높이: 12 cm). 동물들은 처음에 중앙에 놓았으며, 순서(i.e., ABCCAB) 및 팔에 방문한 수를 측정하였고 각 동물에 대해 7분 동안 수동으로 기록하였다. 자발 선택은 연속적으로 방문(i.e., ABC, CAB 또는 BCA이며, BAB는 제외)에서 모든 3개의 팔에 대한 순차적 방문으로 정의된다. 각각의 동물 실험 종료 후, 미로는 물로 깨끗하게 청소하여 잔류 냄새를 제거하였다. 교대 비율은 다음 방정식에 따라 정의되었다. % alternation = [(number of alternations) / (total arm entries)] × 100. 전체 미로 팔의 출입 수는 운동 활동의 지표로 사용된다. SMART video tracking software (version 3.0, Harvard Apparatus, Holliston, MA)를 통해 모든 기록 및 계산은 자동적으로 수집하였다.
강제 수영 시험을 위해, 마우스의 뒷발이 바닥에 닿을 수 없는 깊이(20 cm)로 제작된, 26℃의 수돗물로 채운 수직 아크릴 실린더(높이: 60 cm, 직경: 20 cm)에 마우스를 각각 놓았다. 6분 후 물에서 동물들을 꺼냈고, 케이지로 돌려보내기 전에 재빨리 건조시켰다. 각 세션은 비디오 기록되었고, 블라인드 분석하였다. Porsolt’s 기준에 따라 세 가지 다른 행동을 판단하였다: i) 부동성: 마우스가 수동적으로 떠 있으면서, 수면 위로 코를 내미는 작은 동작만을 수행할 때, 마우스가 움직이지 않는 것으로 판단; ii) 기어오르기(또는 물장구치기): 수조의 측면을 따라, 물 안팎으로 앞발을 이용한 상향 운동; 및 iii) 수영: 단순히 머리를 수면 위로 유지할 필요 이상의 활발한 움직임(종종 수평적 움직임). 다이빙 및 얼굴을 흔드는 행동은 기록하지 않았다. 움직이지 않는데 걸린 시간을 측정하였다.
9. 면역조직화학 및 이미지 분석
(1) 이중 염색 면역조직화학
동물 조직의 면역형광분석을 위해, 0.1% Triton X-100으로 동결 뇌 절편(20 μm)을 침투시켰고, 1% 소혈청알부민(bovine serum albumin) 및 5% 정상 당나귀 혈청(normal donkey serum)을 사용하여 상온에서 1시간 동안 차단시켰다. 뇌 절편은 다음의 1차 항체로 4℃에서 밤새도록 반응시켰다: anti-glial fibrillary acidic protein (GFAP, rabbit IgG, 1:500, Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX); antiionized calcium-binding adapter molecule-1 (Iba-1, goat IgG, 1:500, Wako); anti-phosphorylated interleukin-2-inducible T-cell kinase (ITK, mouse IgG, 1:200, Invitrogen); 또는 anti-ITK (mouse IgG, 1:200, Santa Cruz Biotechnology). 이후, 다음의 형광-접합 2차 항체들로 상온에서 2시간 동안 반응시켰다: FITC-conjugated anti-rabbit (donkey IgG, 1:500, Jackson Immuno Research Laboratories); FITC-conjugated antigoat (donkey IgG, 1:500, Jackson Immuno Research Laboratories); 또는 Cy3-conjugated antimouse (donkey IgG, 1:500, Jackson Immuno Research Laboratories). 최종적으로, 상기 절편을 DAPI-함유 젤라틴을 사용하여 마운팅 및 대비염색하였다.
(2) 성상세포 및 미세아교세포의 면역조직화학
뇌 조직을 가공하였고, 절편들을 면역조직화학 분석에 anti-GFAP (rabbit IgG, 1:500, Dako), anti-Iba-1 (rabbit IgG, 1:500, Wako) 또는 anti-BrdU antibodies (rat IgG, 1:200, Serotec)를 사용하여 밤새도록 적용하였다. 이후, 다음의 형광 접합 2차 항체들로 상온에서 2시간 동안 반응시켰다: FITC-conjugated anti-rabbit (1:200, Jackson Immuno Research Laboratories) 및 Cy3-conjugated Anti-rat (1:200, Jackson Immuno Research Laboratories). 데이터 수집 및 면역조직학적 세기 측정은 ImageJ를 사용하여 수행하였다. 간단히 설명하면, 각 절편에 대한 타일 이미지는 CCD color video camera (Ximea)를 사용하여 캡쳐하였다. 그후, Adobe Photoshop version CS3를 사용하여 각 절편에 대한 이미지 합성을 구성하였다. 이미지는 50% 배경 레벨에서 이진화(binary threshold) 되었으며, 이후 입자들은 서브 임계(subthreshold) 이미지로 변환되었다. 300 픽셀 이하 및 5 픽셀 이상의 영역은 GFAP- 또는 Iba-1-양성 세포로 판단하였다. 바늘 주입 위치 근처의 세포 정량은 이전 보고에서 약간 변형시킨 adapted version of Sholl analysis을 사용하여 수행하였다. 간단히 설명하면, 세포수는 손상 부위의 중심으로부터 시작하여 500 μm로 설정된 반경 크기의 동심원 내에서 계수되었다. 최종 반경은 세포 밀도가 세포의 정규 분포에 도달한 곳으로 설정하였다. 증식 세포는 GFAP- 또는 Iba-1 염색과, BrdU 염색을 병합하여 확인하였다.
10. 실시간 PCR
One-Step SYBR PrimeScript RT-PCR kit (Perfect Real Time; Takara Bio)를 사용하여 실시간 PCR을 수행하였고, 이후 ABI Prism 7000 Sequence Detection System (Applied Biosystems)을 사용하여 검출하였다. Gapdh는 내부 대조군으로 사용하였다. 프라이머들의 염기서열은 보고된 cDNA 서열을 기초로 하였다(표 1).
11. 면역블롯팅 분석
세포를 얼음으로 차갑게 한 RIPA lysis buffer (Thermo Scientific)에 용해시켰다. 세포 용해물 내 단백질 농도는 Bradford protein assay kit (Bio-Rad)를 사용하여 결정하였다. 12% SDS PAGE를 사용하여 동등한 양의 단백질(샘플당 30 μg)을 분리하였고, 폴리비닐리덴 플루오라이드 필터 멤브레인(GE Healthcare)으로 옮겼다. 멤브레인은 5% 스킴 밀크를 사용하여 차단시켰고, 다음의 1차 항체로 연속하여 반응시켰다: anti-p-Vav1 (Y174) antibody (mouse IgG, 1:1000, Santa Cruz Biotechnology); anti-Vav1 antibody (rabbit IgG, 1:1000, Cell Signaling Technology); anti-p-PLC-γ (Y783) antibody (rabbit IgG, 1:1000, Cell Signaling Technology); anti-PLC-γ antibody (rabbit IgG, 1:1000, Cell Signaling Technology); 및 anti-β-actin antibody (mouse IgG, 1:2000, Thermo Scientific). 이후, 다음의 겨자무 과산화수소(horseradish peroxidase)-접합된 2차 항체로 상온에서 2시간 동안 반응시켰다: anti-rabbit IgG antibody (1:2000, Cell Signaling Technology, Beverly, MA) 또는 anti-mouse IgG antibody (1:2000, Cell Signaling Technology). 면역블랏은 SuperSignal WestPico chemiluminescent substrate (Thermo)로 확인하였다.
12. 세포 외 대사 플럭스의 측정
XF24 Extracellular Flux Analyzer (Seahorse Bioscience Inc., Billerica, MA)를 사용하여, 산소소비율(oxygen consumption rate; OCR) 및 세포 외 산성화율(extracellular acidification rate; ECAR)를 측정하였다. 간단히 설명하면, WT 및 Pdk2 KO 마우스 유래 성상세포를 40,000/웰의 밀도로, 저농도 글루코스 DMEM 배지 (5.5 mM, 10% 우태아혈청)와 함께 Seahorse XF24 plate에 접종하였고, 24시간 동안 배양한 후, 새로운 저농도(5.5 mM) 또는 고농도(16 mM) 글루코스 DMEM 배지로 교체하였다. 분석 1시간 전, 배지를 5.5 mM 글루코스 XF24 media로 교체하였다. 로테논(Rotenone) 또는 2-데옥시-D-글루코스(2-deoxy-D-glucose; 2-DG), 카보닐 시아나이드 m-클로로페닐 하이드라진(carbonyl cyanide m-chlorophenyl hydrazine; FCCP) 및 올리고마이신(oligomycin)을 글루코스가 포함된 XF24 배지에 희석하였고, 동봉된 카트리지에 로딩하여, 5.5 및 16 mM 글루코스 농도에서 각각 최종 농도 2 μM, 1 μM 및 1 μg/mL로 맞추었다. 분석 시작 전의 특정 시점에서 배지로의 글루코스 및 약물 주입을 진행하였다. 그 후, ECAR 및 OCR을 관측하였다. 각 주기는 3분 동안 혼합, 2분 동안 지연 및 3분 동안 측정으로 설정하였다. 결과는 총 단백질 농도로 표준화시켰다. 총 단백질은 ECAR 및 OCR 기록 후 즉시 세포로부터 추출하였다.
13. 통계 분석
데이터는 평균 ± 평균의 표준오차(standard error of the mean; SEM) 또는 SD로 나타냈다. 데이터 비교는 unpaired two-tailed t-test 또는 ordinary one-way analysis of variance(ANOVA)를 사용한 후, Tukey post-hoc test를 사용하여 수행하였다. 모든 통계 분석은 Prism software version 8.0 (GraphPad Software, La Jolla, CA)을 사용하여 수행하였다. <0.05의 p-수치를 통계적 유의성이 있는 것으로 판단하였다.
< 실시예 1> 뇌 신경교세포에서 다중 인산화효소 siRNA 스크리닝
신경교세포의 염증 활성화 및 신경염증 과정에서 이들의 기능을 조절하는 인산화효소를 확인하기 위해서, 본 발명자들은 염증 유발성 엔도톡신 LPS로 자극된 초대 MGC 배양에서 623개의 인산화효소들에 대한 다중 siRNA 스크리닝을 수행하였다. 신생아 마우스 MGC 배양액은 인산화효소 siRNAs로 형질감염시켰다. 48시간 후, 신경교세포는 LPS로 추가 48시간 동안 자극되었고, 이후 4개의 다른 표현형은 다중 방식에 따라 병렬 또는 연속 순서로 확인되었다: i) 신경교세포의 염증 활성화 (NO 분석을 통해); ii) 신경교세포 사멸/생존 (세포독성 분석을 통해); iii) 신경교세포 이동 (상처 치유 분석을 통해); 및 iv) 신경교세포 식세포 작용 (Zymosan 흡수 분석을 통해)(도 1). 다중 스크리닝을 위한 순서는 생체 내(in vivo) 조건에서 자극된 신경교세포를 우선 활성화시킨 후, 이동시키고, 최종적으로 뇌의 염증 위치에서 식세포 작용을 수행한다. 더구나, 상기 다중 스크리닝은 동일 조건하에서 수행되는 다중 분석을 가능하게 하는데, 이는 실험 편차를 줄이고, 시간 및 시약을 절약할 수 있게 한다. 모든 측정은 3번 반복하여 수행하였다. 모든 분석의 재현성은 2번 반복 시험을 통해 확인하였다: Pearson’s 상관 분석은 0.6 이상이었다. 인산화효소 유전자 발현에 대한 siRNA-매개 넉다운의 효율은 대표적인 인산화효소의 실시간 PCR을 통해 검증하였다.
< 실시예 2> 신경교세포의 염증 활성화를 조절하는 신경교세포 인산화효소를 구별하기 위한 스크리닝
96-웰 플레이트에서 MGC에 대한 siRNA-매개 넉다운 및 LPS 처리 후, 배양 배지를 2개의 96-웰 플레이트로 옮겼다. 하나의 플레이트는 신경교세포 활성화를 측정하기 위한 NO 분석을 위해 사용하였고, 다른 하나의 플레이트는 세포 독성 분석(LDH 분석)을 위해 사용하였다. 원래 플레이트에 남아있는 MGC는 상처 치유 분석 및 Zymosan 입자를 이용한 식세포 작용 분석에 순차적으로 적용하였다(도 1).
분석 첫 번째 라운드에서, NO 생산은 Griess 분석을 사용하여 측정하였는데, 이는 NO 유래 아질산염(nitrite)을 측정한다. NO 생산은 신경교세포의 염증 활성화에 대한 표지자로 흔히 사용되고 있다. 히트들(Hits)은 이중-플래시라이트 플롯을 사용하여 선별되었는데, 이는 평균 배수-변화 및 SSMD가 둘 다 동시에 고려된다(도 2A). 본 발명자들은 평균 배수-변화 ≥ 0.5 (log2 스케일 상) 및 SSMD ≥ 1.65의 기준을 적용하여, NO 생산이 증가한 siRNAs(신경교세포 활성화를 억제하는 인산화효소)를 선택하였고, 평균 배수-변화 ≤ -0.5 (log2 스케일 상) 및 SSMD ≤ -1.65의 기준을 적용하여, NO 생산이 감소한 siRNAs(신경교세포 활성화를 향상시키는 인산화효소)를 선택하였다. 종합하면, 본 발명자들은 신경교세포 활성화를 억제하는 33개의 인산화효소(신경교세포 억제제) 및 신경교세포 활성화를 향상시키는 60개의 인산화효소(신경교세포 활성화제)를 확인하였다(도 2A, 표 2 및 표 3). NO 생산에 대한 siRNAs의 효과는 여러 인산화효소를 소분자 억제제로 재분석하여 확인하였다. LPS 유도 NO 생산은 Abl2, Lrrk2, Mlkl 및 ITK와 같은 신경교세포 활성화 향상 인산화효소의 억제제들에 의해서는 감소되는 반면, Ck, Irak4 및 Sgk와 같은 신경교세포 활성화 억제 인산화효소의 억제제들에 의해서는 NO 생산이 증가된다. 상기 결과는 siRNA 스크리닝 결과와 일치한다.
33개 신경교세포-억제 인산화효소 및 60개 신경교세포-활성화 인산화효소를 KEGG 경로의 강화 분석과, DAVID (유전자 기능 분류) 및 ClueGO (GO 통합)를 이용한 GO에 적용하였다(도 2B 및 도 2C). 신경교세포 억제 인산화효소에서 강화되는 가장 유의적인 KEGG 경로는 “포스파티딜이노시톨 신호전달 시스템”, “이노시톨 포스페이트 대사” 및 “암에서의 콜린 대사”와 관련되어 있는 반면, “Fc 감마 R-매개 식세포 작용”, “ErbB 신호전달 경로” 및 “케모카인 신호전달 경로”등은 신경교세포 활성화 인산화효소와 관련되어 있다(도 2B 및 표 4). ClueGO 분석 결과, 신경교세포 억제 인산화효소에서는 “골지체 막에서 PIPs 합성” 및 “원형질막에서 PIPs 합성”과 같은 리엑톰(Reactome) 경로가 상당히 강화된 것으로 나타났다. “PKC 인산화 스핑고신 인산화효소”, “세마포린 상호작용”, “FCGR 의존성 식세포 작용” 및 “mTOR 신호전달”경로는 신경교세포 활성화 인산화효소에서 강화되었다. 흥미롭게도, 리엑톰(Reactome) 경로 분석 결과, T-세포 수용체(T-cell receptor; TCR) 활성화 경로로 대표되는 “p-SYK를 통한 TEC 인산화효소의 인산화”카테고리가 신경교세포 활성화 인산화효소에서 강화되는 것으로 밝혀졌다(도 2C). 즉, siRNA 스크리닝을 통해, 신경교세포 활성화제로서 티로신-단백질 인산화효소 ZAP-70, ITK, Raf 및 단백질 인산화효소 C-θ(protein kinase C-θ; PKCθ)와 같은 여러 TCR 관련 인산화효소를 확인하였다(도 2D). 상기 인산화효소들 중, ITK 넉다운은 NO 분석에서 가장 강력한 효과를 나타냈다. 본 발명자들은 ITK가 TCR 신호전달에 있어 잘 알려진 인자이므로, 생체 내(in vivo)의 신경교세포 및 CNS에서 ITK가 발현되는지 확인하였다. LPS로 6시간 동안 처리 후 MGC에서와, LPS 투여(i.p.) 24시간 후 염증 발생 뇌에서, ITK mRNA 발현은 상승하였다(도 3A 및 도 3B). 면역조직화학 분석 결과, LPS 투여(i.p.) 후 염증 발생 뇌의 미세아교세포에서는 ITK 발현 및 인산화가 확인되었으나, 성상세포는 그렇지 않았다(도 3C). 또한, TCR 신호전달 경로의 주요 인자인 PLC-γ 및 Vav-1의 인산화는 LPS로 자극된 BV-2 마우스 미세아교세포에서 증가하였다(도 3D). 다음으로, 미세아교세포 활성화에 있어 ITK의 역할을 좀 더 확인하기 위해서, 상업적으로 구할 수 있는 ITK 억제제(BMS 509744 및 GW 2250665A)를 사용하였다. 도 3E에서 나타낸 바와 같이, BV-2 미세아교세포에서 억제제들은 용량 의존적 방식으로 LPS-유도 NO 생산을 상당히 감소시켰다. 또한, BMS 509744는 PLC-γ의 LPS-유도 인산화를 차단시켰는데(도 3F), 이는 PLC-γ의 ITK-매개 인산화가 미세아교세포 활성화에 관여한다는 것을 의미한다.
다음으로, 본 발명자들은 미세아교세포-매개 신경염증에 있어 ITK의 역할을 확인하고자 하였다. 전신 LPS 투여-유도 신경염증 모델에서, ITK 억제제 BMS 509744를 동시 투여하여, Iba-1-양성 미세아교세포 및 GFAP-양성 성상세포의 수를 측정한 결과, 미세아교세포 및 성상세포의 활성화가 상당히 감소되었다(도 4A). 또한, 상기 억제제는 신경염증 모델에서 전-염증성 사이토카인 TNF-α, IL-1β 및 Nos-2의 mRNA 발현을 감소시켰다(도 4B). 다음으로, 본 발명자들은 신경염증-연관 인지 손상 및 우울증-유사 행동이 ITK 억제제에 의해 완화되는지 시험하였다(도 4C). Y-미로 시험에서, 대조군(PBS 및 비히클-투여 마우스)에 비해 LPS-투여 마우스는 자발적 교대(spontaneous alternation)가 상당히 낮은 백분율로 나타났는데, 이는 인지 손상을 의미한다. 하지만, ITK 억제제 투여는 인지 결핍을 완화시켰다. 강제 수영-유도 절망 행동 검사에서, LPS-처리 마우스의 부동성은 ITK 억제제에 의해 상당히 감소하였다. 상기 결과는 미세아교세포 ITK가 신경염증 조건하에서의 행동 결핍에 관여한다는 것을 뒷받침한다.
siRNAs increasing nitric oxide production ( kinases inhibiting glial activation)
Kinase Gene ID log2
( FC ) 		Description
Mylk 107589 1.7 myosin,_light_polypeptide_kinase_(Mylk)
Pik3cd 18707 1.4 phosphatidylinositol_3-kinase_catalytic_deltapolypeptide_(Pik3cd),_transcript_variant_2
Pkmyt1 268930 1.4 protein_kinase,_membrane_associated_tyrosine/threonine1_(Pkmyt1)
Brd3 67382 1.1 bromodomain_containing_3_(Brd3)
Irak4 266632 1.0 interleukin-1_receptor-associated_kinase_4_(Irak4)
Nek9 217718 0.8 NIMA_(never_in_mitosis_gene_a)-related_expressed_kinase9_(Nek9)
Nrbp 192292 0.8 nuclear_receptor_binding_protein_1_(Nrbp1)
Tssk4 71099 0.8 testis-specific_serine_kinase_4_(Tssk4)
Pi4k2a 84095 0.8 phosphatidylinositol_4-kinase_type_2_alpha(Pi4k2a)
Pip5k2a 18718 0.7 phosphatidylinositol-4-phosphate_5-kinase,_type_II,alpha_(Pip5k2a)
Ryk 20187 0.7 receptor-like_tyrosine_kinase_(Ryk),_transcript_variant2
Dyrk4 101320 0.7 dual-specificity_tyrosine-(Y)-phosphorylationregulated_kinase_4_(Dyrk4)
Pi4k2b 67073 0.7 phosphatidylinositol_4-kinase_type_2_beta_(Pi4k2b),transcript_variant_1
Akt2 11652 0.7 thymoma_viral_proto-oncogene_2,_transcriptvariant_2_(Akt2)
Grk1 24013 0.7 G_protein-coupled_receptpr_kinase_1_(Grk1)
Map3k3 26406 0.7 mitogen_activated_protein_kinase_kinase_kinase_3(Map3k3)
Dgkz 104418 0.6 diacylglycerol_kinase_zeta_(Dgkz)
Gucy2f 245650 0.6 guanylate_cyclase_2f_(Gucy2f)
Taok3 330177 0.6 TAO_kinase_3_(Taok3)
Sgk 20393 0.6 serum/glucocorticoid_regulated_kinase_(Sgk)
Ckmt1 12716 0.6 creatine_kinase,_mitochondrial_1,_ubiquitous_(Ckmt1)
Map4k2 26412 0.6 mitogen_activated_protein_kinase_kinase_kinase_kinase_2(Map4k2)
Btk 12229 0.5 Bruton_agammaglobulinemia_tyrosine_kinase_(Btk)
Riok3 66878 0.5 RIO_kinase_3_(yeast)_(Riok3)
Cdk8 264064 0.5 cyclin-dependent_kinase_8_(Cdk8)
Chka 12660 0.5 choline_kinase_alpha_(Chka),_transcript_variant_1
Pik3c2a 18704 0.5 phosphatidylinositol_3-kinase,_C2_domain_containing,alpha_polypeptide_(Pik3c2a)
Csnk1g2 103236 0.5 casein_kinase_1,_gamma_2_(Csnk1g2)
Dgka 13139 0.5 diacylglycerol_kinase,_alpha_(Dgka)
Ddr2 18214 0.5 discoidin_domain_receptor_family,_member_2_(Ddr2)
Gyk 14933 0.5 glycerol_kinase_(Gyk),_transcript_variant_2
Ror1 26563 0.5 receptor_tyrosine_kinase-like_orphan_receptor_1_(Ror1)
Map2k5 23938 0.5 mitogen_activated_protein_kinase_kinase_5_(Map2k5)
Rps6ka6 67071 0.5 ribosomal_protein_S6_kinase_polypeptide_6_(Rps6ka6)
siRNAs decreasing NO production ( kinases enhancing glial activation)
Kinase Gene ID log2
( FC ) 		Description
Twf1 19230 -1.0 protein_tyrosine_kinase_9_(Ptk9)
Npr1 18160 -0.9 natriuretic_peptide_receptor_1_(Npr1)
Egfr 13649 -0.9 epidermal_growth_factor_receptor_(Egfr),_transcriptvariant_1
Mapk7 23939 -0.8 mitogen_activated_protein_kinase_7_(Mapk7)
Abl2 11352 -0.8 v-abl_Abelson_murine_leukemia_viral_oncogene_2_(arg,Abelson-related_gene)_(Abl2)
Bcr 110279 -0.8 breakpoint_cluster_region_homolog,transcript_variant_2_(Bcr)
Gsk3b 56637 -0.8 glycogen_synthase_kinase_3_beta_(Gsk3b)
Sphk1 20698 -0.7 sphingosine_kinase_1_(Sphk1),_transcript_variant_2
Csnk1g1 214897 -0.7 casein_kinase_1,_gamma_1_(Csnk1g1)
Insrr 23920 -0.7 insulin_receptor-related_receptor_(Insrr)
Mapk15 332110 -0.7 mitogen-activated_protein_kinase_15_(Mapk15)
Ltk 17005 -0.7 leukocyte_tyrosine_kinase_(Ltk),_transcript_variant_2
Ephb6 13848 -0.7 Eph_receptor_B6_(Ephb6)
Nek4 23955 -0.7 NIMA_(never_in_mitosis_gene_a)-related_expressed_kinase4_(Nek4)
Prkdc 19090 -0.6 protein_kinase,_DNA_activated,_catalytic_polypeptide(Prkdc)
Hk3 212032 -0.6 hexokinase_3_(Hk3)
Tssk3 58864 -0.6 testis-specific_serine_kinase_3_(Tssk3)
Tgfbr1 21812 -0.6 transforming_growth_factor,_beta_receptor_I_(Tgfbr1)
Ckmt2 76722 -0.6 creatine_kinase,_mitochondrial_2_(Ckmt2)
Crkl 12929 -0.6 v-crk_sarcoma_virus_CT10_oncogene_homolog_(avian)-like(Crkl)
Magi1 14924 -0.6 membrane_associated_guanylate_kinase,_WW_and_PDZ_domaincontaining_1_(Magi1),_transcript_variant_1
Stk16 20872 -0.6 serine/threonine_kinase_16_(Stk16)
Ptk7 71461 -0.5 PTK7_protein_tyrosine_kinase_7_(Ptk7)
Aak1 269774 -0.5 AP2_associated_kinase_1_(Aak1),_transcript_variant_2
Prkci 18759 -0.5 protein_kinase_C,_iota_(Prkci)
Ntrk3 18213 -0.5 neurotrophic_tyrosine_kinase,_receptor,_type_3(Ntrk3),_transcript_variant_1
Met 17295 -0.5 met_proto-oncogene_(Met)
Raf1 110157 -0.5 v-raf-leukemia_viral_oncogene_1_(Raf1)
Srpk3 56504 -0.5 serine/arginine-rich_protein_specific_kinase_3(Srpk3)
Prkcd 18753 -0.5 protein_kinase_C,_delta_(Prkcd)
Taok2 381921 -0.5 TAO_kinase_2
Tek 21687 -0.5 endothelial-specific_receptor_tyrosine_kinase_(Tek)
Camk2b 12323 -0.5 calcium/calmodulin-dependent_protein_kinase_II,_beta(Camk2b)
Igf1r 16001 -0.5 insulin-like_growth_factor_I_receptor_(Igf1r)
Riok1 71340 -0.5 RIO_kinase_1_(yeast)_(Riok1)
Pi4kb 107650 -0.5 phosphatidylinositol_4-kinase,_catalytic,_betapolypeptide_(Pik4cb)
Rock1 19877 -0.5 Rho-associated_coiled-coil_containing_protein_kinase_1(Rock1)
Itk 16428 -0.5 IL2-inducible_T-cell_kinase_(Itk)
Ilk 16202 -0.5 integrin_linked_kinase_(Ilk)
Brsk1 381979 -0.5 BR_serine/threonine_kinase_1_(Brsk1)
Limk2 16886 -0.5 LIM_motif-containing_protein_kinase_2_(Limk2),transcript_variant_2
Mos 17451 -0.5 Moloney_sarcoma_oncogene_(Mos)
Nek3 23954 -0.5 NIMA_(never_in_mitosis_gene_a)-related_expressedkinase_3_(Nek3)
Csf1r 12978 -0.5 colony_stimulating_factor_1_receptor_(Csf1r),transcript_variant_1
Limk1 16885 -0.5 LIM-domain_containing,_protein_kinase_(Limk1)
Map3k6 53608 -0.5 mitogen-activated_protein_kinase_kinase_kinase_6(Map3k6)
Ptk2b 19229 -0.5 PTK2_protein_tyrosine_kinase_2_beta_(Ptk2b)
Mapkapk5 17165 -0.5 MAP_kinase-activated_protein_kinase_5_(Mapkapk5)
Wnk4 69847 -0.5 WNK_lysine_deficient_protein_kinase_4_(Wnk4)
Adck2 57869 -0.5 aarF_domain_containing_kinase_2_(Adck2)
Trpm7 58800 -0.5 transient_receptor_potential_cation_channel,_subfamilyM,_member_7_(Trpm7)
Stk31 77485 -0.5 serine_threonine_kinase_31_(Stk31)
Lyn 17096 -0.5 Yamaguchi_sarcoma_viral_(v-yes-1)_oncogene_homolog(Lyn)
Cask 12361 -0.5 calcium/calmodulin-dependent_serine_protein_kinase(MAGUK_family)_(Cask),_transcript_variant_1
Rps6kb1 72508 -0.5 ribosomal_protein_S6_kinase,_polypeptide_1_(Rps6kb1)
Strada 72149 -0.5 RIKEN_cDNA_2610019A05_gene_(2610019A05Rik)
Stk32b 64293 -0.5 serine/threonine_kinase_32B_(Stk32b)
Twf2 23999 -0.5 protein_tyrosine_kinase_9-like_(A6-related_protein)(Ptk9l)
Bmpr1b 12167 -0.5 bone_morphogenetic_protein_receptor,_type_1B_(Bmpr1b)
Pfkp 56421 -0.5 phosphofructokinase,_platelet_(Pfkp)
KEGG pathway of glial inhibitors
Term p-value (-log10) Kinases (gene ID)
mmu04070:Phosphatidylinositol signaling system 6.53 18718, 104418, 13139, 84095, 67073, 18704, 18707
mmu04722:Neurotrophin signaling pathway 4.61 266632, 23938, 11652, 26406, 67071, 18707
mmu00562:Inositol phosphate metabolism 4.31 18718, 84095, 67073, 18704, 18707
mmu05231:Choline metabolism in cancer 3.69 104418, 13139, 11652, 18707, 12660
mmu04010:MAPK signaling pathway 3.13 26412, 330177, 23938, 11652, 26406, 67071
mmu04914:Progesterone-mediated oocyte maturation 2.68 11652, 268930, 67071, 18707
mmu04611:Platelet activation 2.18 12229, 11652, 107589, 18707
mmu00561:Glycerolipid metabolism 1.89 104418, 13139, 14933
mmu04150:mTOR signaling pathway 1.88 11652, 67071, 18707
mmu04664:Fc epsilon RI signaling pathway 1.76 12229, 11652, 18707
mmu04662:B cell receptor signaling pathway 1.74 12229, 11652, 18707
mmu00564:Glycerophospholipid metabolism 1.50 104418, 13139, 12660
mmu04620:Toll-like receptor signaling pathway 1.44 266632, 11652, 18707
mmu05142:Chagas disease (American trypanosomiasis) 1.43 266632, 11652, 18707
mmu04931:Insulin resistance 1.37 11652, 67071, 18707
KEGG pathway of glial activators
Term p-value (-log10) Kinases (gene ID)
mmu04666:Fc gamma R-mediated phagocytosis 6.55 18753, 16885, 16886, 12929, 72508, 110157, 20698, 17096
mmu04012:ErbB signaling pathway 5.18 13649, 12323, 56637, 12929, 72508, 110157, 11352
mmu04015:Rap1 signaling pathway 4.78 13649, 21687, 14924, 12929, 16001, 18759, 12978, 17295, 110157
mmu05230:Central carbon metabolism in cancer 4.64 13649, 56421, 18213, 17295, 110157, 212032
mmu04722:Neurotrophin signaling pathway 4.33 18753, 12323, 18213, 56637, 12929, 23939, 110157
mmu04062:Chemokine signaling pathway 4.10 19229, 18753, 19877, 56637, 12929, 16428, 110157, 17096
mmu04912:GnRH signaling pathway 3.97 19229, 13649, 18753, 12323, 23939, 110157
mmu04510:Focal adhesion 3.95 13649, 19877, 16202, 56637, 12929, 16001, 17295, 110157
mmu04810:Regulation of actin cytoskeleton 3.87 13649, 23920, 19877, 16885, 16886, 12929, 17451, 110157
mmu04066:HIF-1 signaling pathway 3.67 13649, 21687, 12323, 72508, 16001, 212032
mmu05200:Pathways in cancer 3.65 13649, 110279, 19877, 21812, 56637, 12929, 16001, 12978, 17295, 110157
mmu04010:MAPK signaling pathway 3.43 53608, 13649, 17165, 21812, 381921, 12929, 23939, 110157
mmu04360:Axon guidance 3.20 19877, 16885, 13848, 16886, 56637, 17295
mmu05205:Proteoglycans in cancer 3.13 13649, 12323, 19877, 72508, 16001, 17295, 110157
mmu04910:Insulin signaling pathway 3.04 56637, 12929, 72508, 18759, 110157, 212032
mmu04921:Oxytocin signaling pathway 2.90 18160, 13649, 12323, 19877, 23939, 110157
mmu05215:Prostate cancer 2.89 13649, 23920, 56637, 16001, 110157
mmu04014:Ras signaling pathway 2.86 13649, 21687, 16001, 12978, 17295, 110157, 11352
mmu04151:PI3K-Akt signaling pathway 2.58 13649, 21687, 56637, 72508, 16001, 12978, 17295, 110157
mmu05213:Endometrial cancer 2.56 13649, 16202, 56637, 110157
mmu05214:Glioma 2.28 13649, 12323, 16001, 110157
mmu05218:Melanoma 2.17 13649, 16001, 17295, 110157
mmu04520:Adherens junction 2.16 13649, 21812, 16001, 17295
mmu05220:Chronic myeloid leukemia 2.16 110279, 21812, 12929, 110157
mmu04350:TGF-beta signaling pathway 1.96 19877, 21812, 72508, 12167
mmu05206:MicroRNAs in cancer 1.78 13649, 19877, 12929, 23939, 17295, 110157
mmu04270:Vascular smooth muscle contraction 1.50 18160, 18753, 19877, 110157
mmu04152:AMPK signaling pathway 1.49 56421, 72508, 16001, 72149
mmu04068:FoxO signaling pathway 1.44 13649, 21812, 16001, 110157
mmu04550:Signaling pathways regulating pluripotency of stem cells 1.41 56637, 16001, 110157, 12167
mmu04730:Long-term depression 1.36 16001, 110157, 17096
< 실시예 3> 신경교세포 사멸/생존의 조절에 관련된 인산화효소
분석 두 번째 라운드(세포 독성 분석)에서, 신경교세포 생존능 유지에 필수적인 37개의 인산화효소를 확인하였다(도 5A 및 표 5). 인산화효소 히트들은 컷-오프 수치(Z score < -1.65; 신경교세포 독성 유도 siRNAs)를 기준으로 선별하였다. 신경교세포 생존 인산화효소에서 강화된 가장 유의성 있는 KEGG 경로는 “프럭토스 및 만노스 대사”,“암에서의 핵심 탄소 대사” 및 “갈락토스 대사”에 관련되어 있었다(도 6B 및 표 6). ClueGO 분석 결과, “해당 과정”, “EPH-Ephrin 신호전달”, “뉴로트로핀 TRK 수용체 신호전달 경로” 및 “펩티딜-트레오닌 인산화”는 GO 경로에서 상당히 강화되었다(도 5C). 상기 경로 강화 분석 결과, 신경교세포 생존에 필수적인 인산화효소들은 세포 대사에 관련되어 있다는 것을 나타냈다.
siRNAs inducing cell death ( kinases essential for glial cell survival)
Kinases Gene ID Cell death (mean, % ) Z-score Description
Ntrk1 18211 50.170 -6.43 neurotrophic_tyrosine_kinase,_receptor,type_1,_transcript_variant_2_(Ntrk1)
Tnk1 83813 47.832 -6.07 tyrosine_kinase,_non-receptor,_1_(Tnk1)
Lmtk2 231876 35.186 -4.16 lemur_tyrosine_kinase_2_(Lmtk2)
Nek11 208583 34.926 -4.12 NIMA_(never_in_mitosis_gene_a)-related_expressedkinase_11_(Nek11)
Mak 17152 34.578 -4.07 male_germ_cell-associated_kinase_(Mak)
Csnk1e 27373 34.005 -3.98 casein_kinase_1,_epsilon_(Csnk1e)
Itpk1 217837 33.441 -3.89 inositol_1,3,4-triphosphate_5/6_kinase_(Itpk1)
Pfkl 18641 32.398 -3.74 phosphofructokinase,_liver,_B-type_(Pfkl)
Tex14 83560 32.133 -3.70 testis_expressed_gene_14_(Tex14)
Map3k10 269881 31.852 -3.65 mitogen_activated_protein_kinase_kinasekinase_10,_transcript_variant_8_(Map3k10)
Prkaca 18747 30.707 -3.48 protein_kinase,_cAMP_dependent,_catalytic,_alpha(Prkaca)
BC030499 216976 30.609 -3.47 cDNA_sequence_BC030499_(BC030499)
Pctk3 18557 30.482 -3.45 PCTAIRE-motif_protein_kinase_3_(Pctk3)
Map3k6 53608 30.390 -3.43 mitogen-activated_protein_kinase_kinase_kinase_6(Map3k6)
Src 20779 30.264 -3.41 Rous_sarcoma_oncogene_(Src),_transcript_variant_1
Taf1 270627 30.044 -3.38 TAF1_RNA_polymerase_II,_TATA_box_bindingprotein_(TBP)-associated_factor,_transcript_variant_13(Taf1)
Bub1b 12236 29.991 -3.37 budding_uninhibited_by_benzimidazoles_1_homolog,_beta(S._cerevisiae)_(Bub1b)
Nrbp 192292 29.914 -3.36 nuclear_receptor_binding_protein_1_(Nrbp1)
Mapk7 23939 29.895 -3.36 mitogen_activated_protein_kinase_7_(Mapk7)
Pak3 18481 29.778 -3.34 p21_(CDKN1A)-activated_kinase_3_(Pak3)
Khk 16548 29.602 -3.31 ketohexokinase_(Khk)
Aurkb 20877 29.551 -3.31 aurora_kinase_B_(Aurkb)
Fastk 66587 29.543 -3.30 Fas-activated_serine/threonine_kinase_(Fastk)
Pfkfb2 18640 29.498 -3.30 6-phosphofructo-2-kinase/fructose-2,6-biphosphatase_2(Pfkfb2)
Epha7 13841 29.241 -3.26 Eph_receptor_A7_(Epha7)
Tk2 57813 28.275 -3.11 thymidine_kinase_2,_mitochondrial_(Tk2)
Trio 223435 28.234 -3.11 triple_functional_domain_(PTPRF_interacting)(Trio)
Hk1 15275 28.140 -3.09 hexokinase_1_(Hk1)
Gucy2c 14917 27.707 -3.03 guanylate_cyclase_2c_(Gucy2c)
Dgkd 227333 27.465 -2.99 diacylglycerol_kinase,_delta
Pfkp 56421 27.360 -2.97 phosphofructokinase,_platelet_(Pfkp)
Stk40 74178 27.105 -2.94 serine/threonine_kinase_40_(Stk40)
Camk1 52163 26.811 -2.89 calcium/calmodulin-dependent_protein_kinase_I_(Camk1)
Map3k15 270672 25.675 -2.72 mitogen-activated_protein_kinase_kinasekinase_15_(Map3k15)
Tssk4 71099 21.947 -2.15 testis-specific_serine_kinase_4_(Tssk4)
Ripk4 72388 19.494 -1.78 receptor-interacting_serine-threonine_kinase_4_(Ripk4)
Rps6kb2 58988 18.975 -1.70 ribosomal_protein_S6_kinase,_polypeptide_2_(Rps6kb2)
KEGG pathway
Term p-value (-log10) Kinase ( Entrez ID)
mmu00051:Fructose and mannose metabolism 5.83 56421, 16548, 15275, 18641, 18640
mmu05230:Central carbon metabolism in cancer 3.25 18211, 56421, 15275, 18641
mmu00052:Galactose metabolism 2.52 56421, 15275, 18641
mmu04152:AMPK signaling pathway 2.38 56421, 18641, 58988, 18640
mmu04921:Oxytocin signaling pathway 2.19 18747, 20779, 52163, 23939
mmu00010:Glycolysis / Gluconeogenesis 1.90 56421, 15275, 18641
mmu04540:Gap junction 1.69 18747, 20779, 23939
mmu04012:ErbB signaling pathway 1.68 18481, 20779, 58988
mmu04912:GnRH signaling pathway 1.67 18747, 20779, 23939
mmu04010:MAPK signaling pathway 1.59 53608, 18747, 18211, 23939
mmu04919:Thyroid hormone signaling pathway 1.46 18747, 20779, 18640
mmu01200:Carbon metabolism 1.44 56421, 15275, 18641
mmu04750:Inflammatory mediator regulation of TRP channels 1.38 18747, 20779, 18211
< 실시예 4> 신경교세포 이동 조절에 관련된 인산화효소
분석 세 번째 라운드에서, 본 발명자들은 신경교세포 이동을 조절하는 신규 인산화효소들을 확인하였다. 히트들은 이중-플래시라이트 플롯(dual-flashlight plot)을 사용하여 선택하였는데, 평균 배수-변화 및 SSMD를 모두 동시에 고려하였다(도 6A). 본 발명자들은 이동성을 증가시키는 siRNAs(신경교세포 이동성을 감소시키는 인산화효소)를 선별하기 위해, 평균 배수-변화 ≥ 0.5 (log2 스케일 상) 및 SSMD ≥ 1.65의 기준을 사용하였고, 이동성을 감소시키는 siRNAs(신경교세포 이동성을 증가시키는 인산화효소)를 선별하기 위해, 평균 배수-변화 ≤ -0.5 (log2 스케일 상) 및 SSMD ≤ -1.65의 기준을 사용하였다. 본 발명의 분석 결과, 신경교세포 이동성을 감소시키는 75개의 인산화효소(신경교세포 이동성 억제제) 및 신경교세포 이동성을 증가시키는 22개의 인산화효소(신경교세포 이동성 증진제)를 확인하였다(도 6A, 표 7 및 표 8). 여러 개의 히트 인산화효소들을 소분자 인산화효소 억제제로 재분석하여 검증하였다. Ulk1 및 Lrrk2에 대해 특이적인 인산화효소 억제제는 신경교세포 이동성을 감소시킨 반면, Pkm2 및 Pdk2에 대한 억제제는 신경교세포 이동성을 증가시켰다. 상기 결과는 siRNA 스크리닝 결과와 일치한다. KEGG 경로 및 GO 강화 분석을 사용하여, 본 발명자들은 신경교세포 이동성 억제제가 “암에서의 핵심 탄소 대사”, “인슐린 신호전달 경로”, “mTOR 신호전달 경로”, “PI3K-Akt 신호전달 경로”, “Rap1 신호전달 경로” 및 “HIF-1 신호전달 경로”에 관련되어 있고, 신경교세포 이동성 증진제는 “TCR 신호전달 경로”, “밀착 연접” 및 “axon guidance”에 관련되어 있다는 것을 확인하였다(도 6B 및 표 9). ClueGO 분석 결과, “TP53 활성 조절”,“PI3K/AKT 네트워크의 음성 조절”,“원형질막에서의 PIPs 합성” 및 “열 스트레스에 대한 세포 반응”이 신경교세포 이동성 억제제의 유의성 있는 리엑톰(Reactome) 경로인 것으로 밝혀졌다. “RAC1 상에서 GDP와 GTP를 교환하여 VAV 활성화” 및 “CD28 의존성 PI3/AKT 신호전달”과 같은 경로는 신경교세포 이동성 증진제와 연관성을 나타냈다(도 6C). 상기 경로들 중에서, 본 발명자들은 세포 이동 조절에 잠재적으로 관여하는 경로로, 탄소(글루코스) 대사에 초점을 맞추었다. 본 발명의 스크리닝에서 헥소인산화효소(Hexokinase; HK), 피루베이트 인산화효소 M(pyruvate kinase M; PKM) 및 피루베이트 탈수소효소 인산화효소 이성질체 2(pyruvate dehydrogenase kinase isoform 2; PDK2)가 신경교세포 이동성을 감소시키는 가장 유력한 인산화효소로 확인되었다(도 6D). 상기 인산화효소들 모두는 해당 대사 과정과 밀접하게 연관되어 있다. 특히, PDK2는 신경계 질환에 관련되어 있고, M1 표현형에서 대식세포의 분극화에 중요하다.
신경교세포 이동에 있어 PDK2의 조절 역할에 대해 더 조사하기 위해서, 본 발명자들은 PDK2의 약리학적 억제제(AZD7545) 및 PDK2 유전자-결핍 신경교세포를 사용하였다. 상처 치유 분석에서, AZD7545 처리 또는 PDK2 유전자 넉아웃은 LPS-프라이밍 48시간 후, MGC 이동을 상당히 증가시켰다(도 7A 내지 도 7C). 본 발명자들은 해당 과정 억제제(2-데옥시-D-글루코스, 2-DG) 또는 OXPHOS 억제제(올리고마이신 및 FCCP)로 처리한 후, 신경교세포 이동을 비교하였다. 도 7A 내지 도 7C에 나타낸 바와 같이, AZD7545 또는 PDK2 KO에 의한 신경교세포 이동의 상향조절은 2-DG에 의해 더욱 향상되었으나, 올리고마이신 또는 FCCP의 처리에 의해서는 중단되었다.
다음으로, 본 발명자들은 피질 손상 모델을 사용하여, 생체 내(in vivo) 신경교세포의 이동 비교를 분석하였다. 피질 손상은 WT 마우스의 전전두엽 피질의 국소적인 위치에 비히클 또는 AZD7545를 투여하여 동시에 제작하였다. PDK2 KO 마우스는 뇌의 동일 영역에 바늘 삽입을 통해 단독으로 손상시켰다(도 7D). 상기 모델에서 PDK2 발현은 주로 반응성 성상세포에서 관측되었다. 신경교세포의 수는 주입 위치로부터의 동심원 내 GFAP- 또는 Iba-1-양성 세포를 계수하여 면역조직화학적으로 측정하였다. 증식성 세포를 검출하기 위해 BrdU 염색을 수행하였다. 피질 손상 24시간 후, WT 동물에 비해, AZD7545-투여 또는 PDK2 KO 마우스에서 손상 위치 주변의 성상세포 축적이 상당히 증가하였다(도 7D). BrdU 염색 결과, 신경교세포 이동이 세포 증식에는 크게 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다. 이러한 효과는 미세아교세포에서는 관측되지 않았다. 따라서, 본 발명에서는 PDK2 억제가 손상 위치로 향하는 성상세포 이동을 촉진하는 것으로 나타났는데, 이는 배양된 신경교세포로부터 얻은 데이터와 일치한다. 다음으로, 본 발명자들은 성상세포의 미토콘드리아 대사 단계를 측정하여, 글루코스 대사가 성상세포 이동성에 영향을 미치는지 Seahorse XF-24 extracellular flux analyzer를 사용하여 확인하였다. 고농도 글루코스 처리 24시간 후, WT에 비해 PDK2 KO 성상세포에서 ECAR은 상당히 낮아졌고, OCR은 상당히 높아졌다. 상기 결과는 잠재적으로 PDK2 KO 성상세포 대사가 해당 과정-기반 락테이트 생산을 감소시켜 OXPHOS에 의해 주도된다는 것을 의미한다. 종합하면, 본 발명은 PDK2가 미토콘드리아 대사를 조절하여 성상세포 이동을 조절하는데, PDK2는 해당 과정을 선호하고 성상세포 이동을 억제한다는 것을 제시하였다.
siRNAs accelerating migration ( kinases decelerating glial migration)
Kinase Gene ID log2
( FC ) 		Description
Pdk2 27273 1.0 pyruvate_dehydrogenase_kinase,_isoenzyme_2_(Pdk2),mRNA
Dmpk 13400 1.0 dystrophia_myotonica-protein_kinase_(Dmpk)
Tjp2 21873 1.0 tight_junction_protein_2_(Tjp2)
Etnk2 214253 1.0 ethanolamine_kinase_2_(Etnk2)
Bmpr1a 12166 1.0 bone_morphogenetic_protein_receptor,_type_1A_(Bmpr1a),mRNA
Riok2 67045 0.9 RIO_kinase_2_(yeast)_(Riok2)
Rps6kl1 238323 0.9 ribosomal_protein_S6_kinase-like_1_(Rps6kl1)
Vrk2 69922 0.9 vaccinia_related_kinase_2_(Vrk2)
Nek5 330721 0.9 NIMA_(never_in_mitosis_gene_a)-related_expressedkinase_5_(Nek5)
Frap1 56717 0.8 FK506_binding_protein_12-rapamycin_associated_protein_1(Frap1)
Araf 11836 0.8 v-raf_murine_sarcoma_3611_viral_oncogene_homolog(Araf)
Stk24 223255 0.8 serine/threonine_kinase_24_(STE20_homolog,_yeast)(Stk24)
Wnk1 232341 0.8 WNK_lysine_deficient_protein_kinase_1_(Wnk1)
Dcamkl2 70762 0.8 doublecortin_and_CaM_kinase-like_2_(Dcamkl2)
Ror2 26564 0.8 receptor_tyrosine_kinase-like_orphan_receptor_2(Ror2)
Alk 11682 0.8 anaplastic_lymphoma_kinase_(Alk)
Hunk 26559 0.8 hormonally_upregulated_Neu-associated_kinase_(Hunk),mRNA
Oxsr1 108737 0.8 oxidative-stress_responsive_1_(Oxsr1)
Ulk3 71742 0.8 BAC_clone_RP24-506F15_from_chromosome_9,_complete_sequence
Hkdc1 216019 0.8 hexokinase_domain_containing_1_(Hkdc1)
Nek3 23954 0.7 NIMA_(never_in_mitosis_gene_a)-related_expressedkinase_3_(Nek3)
Nrbp2 223649 0.7 nuclear_receptor_binding_protein_2_(Nrbp2)
Rbks 71336 0.7 ribokinase_(Rbks)
Pip5k2a 18718 0.7 phosphatidylinositol-4-phosphate_5-kinase,_type_II,alpha_(Pip5k2a)
Cdc2a 12534 0.7 cell_division_cycle_2_homolog_A_(S._pombe)_(Cdc2a),mRNA
Stk11 20869 0.7 serine/threonine_kinase_11_(Stk11)
Pdxk 216134 0.7 pyridoxal_(pyridoxine,_vitamin_B6)_kinase_(Pdxk)
Cdc42bpb 217866 0.7 Cdc42_binding_protein_kinase_beta_(Cdc42bpb)
Pank1 75735 0.7 pantothenate_kinase_1_(Pank1)
Tesk2 230661 0.7 testis-specific_kinase_2_(Tesk2)
Fn3k 63828 0.7 fructosamine_3_kinase_(Fn3k),_transcript_variant_1,mRNA
Grk1 24013 0.7 PREDICTED:_G_protein-coupled_receptpr_kinase_1_(Grk1),mRNA
Epha6 13840 0.7 Eph_receptor_A6_(Epha6)
Pank3 211347 0.7 pantothenate_kinase_3_(Pank3)
Lrrk2 66725 0.7 leucine-rich_repeat_kinase_2_(Lrrk2)
Mulk 69923 0.7 multiple_substrate_lipid_kinase_(Mulk)
Nme5 75533 0.7 expressed_in_non-metastatic_cells_5_(Nme5)
Cdk2 12566 0.7 cyclin-dependent_kinase_2_(Cdk2),_transcript_variant1
4930444A02Rik 74653 0.6 RIKEN_cDNA_4930444A02_gene_(4930444A02Rik)
Sgk 20393 0.6 serum/glucocorticoid_regulated_kinase_(Sgk)
Pgk2 18663 0.6 phosphoglycerate_kinase_2_(Pgk2)
Map3k15 270672 0.6 PREDICTED:_mitogen-activated_protein_kinase_kinasekinase_15_(Map3k15)
Gm1078 381835 0.6 PREDICTED:_gene_model_1078,_(NCBI)_(Gm1078)
Phka1 18679 0.6 phosphorylase_kinase_alpha_1_(Phka1),_transcriptvariant_1
Stk39 53416 0.6 serine/threonine_kinase_39,_STE20/SPS1_homolog_(yeast)(Stk39)
Bckdk 12041 0.6 branched_chain_ketoacid_dehydrogenase_kinase_(Bckdk),mRNA
Nek10 238944 0.6 NIMA_(never_in_mitosis_gene_a)-_related_kinase_10(Nek10)
Mapkapk2 17164 0.6 MAP_kinase-activated_protein_kinase_2_(Mapkapk2)
Pkm2 18746 0.6 pyruvate_kinase,_muscle_(Pkm2)
Mos 17451 0.6 Moloney_sarcoma_oncogene_(Mos)
Adck1 72113 0.6 aarF_domain_containing_kinase_1_(Adck1)
Atr 245000 0.6 ataxia_telangiectasia_and_Rad3_related
Matk 17179 0.6 megakaryocyte-associated_tyrosine_kinase_(Matk)
AU021838 328099 0.6 expressed_sequence_AU021838_(AU021838)
Fgfr2 14183 0.6 fibroblast_growth_factor_receptor_2_(Fgfr2),_transcriptvariant_2
Met 17295 0.6 met_proto-oncogene_(Met)
Gprk6 26385 0.6 G_protein-coupled_receptor_kinase_6_(Gprk6),transcript_variant_2
Camk2b 12323 0.6 calcium/calmodulin-dependent_protein_kinase_II,_beta(Camk2b)
Prkaa2 108079 0.6 protein_kinase,_AMP-activated,_alpha_2_catalytic_subunit(Prkaa2)
Brdt 114642 0.6 bromodomain,_testis-specific_(Brdt)
Tyro3 22174 0.6 PREDICTED:_TYRO3_protein_tyrosine_kinase_3,_transcriptvariant_2_(Tyro3)
Rps6kb2 58988 0.6 ribosomal_protein_S6_kinase,_polypeptide_2_(Rps6kb2),mRNA
Prkci 18759 0.6 protein_kinase_C,_iota_(Prkci)
Alpk3 116904 0.5 alpha-kinase_3_(Alpk3)
Uck2 80914 0.5 uridine-cytidine_kinase_2_(Uck2)
Pik3c2b 240752 0.5 phosphoinositide-3-kinase,_class_2,_betapolypeptide,_transcript_variant_1_(Pik3c2b)
Nme7 171567 0.5 non-metastatic_cells_7,_protein_expressed_in_(Nme7),transcript_variant_2
Xylb 102448 0.5 xylulokinase_homolog_(H._influenzae)_(Xylb)
Kdr 16542 0.5 kinase_insert_domain_protein_receptor_(Kdr)
Egfr 13649 0.5 epidermal_growth_factor_receptor_(Egfr),_transcriptvariant_1
Csf1r 12978 0.5 colony_stimulating_factor_1_receptor_(Csf1r),transcript_variant_1
Bmx 12169 0.5 BMX_non-receptor_tyrosine_kinase_(Bmx)
Pik3cg 30955 0.5 phosphoinositide-3-kinase,_catalytic,_gamma_polypeptide(Pik3cg)
Braf 109880 0.5 Braf_transforming_gene_(Braf)
Nme3 79059 0.5 expressed_in_non-metastatic_cells_3_(Nme3)
siRNAs decelerating migration ( kinases accelerating glial migration)
Kinase Gene ID log2
( FC ) 		Description
Acvr1c 269275 -4.6 activin_A_receptor,_type_IC_(Acvr1c)
Trib3 228775 -4.5 tribbles_homolog_3_(Drosophila)_(Trib3),_transcriptvariant_2
Prkag1 19082 -4.3 protein_kinase,_AMP-activated,_gamma_1_non-catalyticsubunit_(Prkag1)
Prkab2 108097 -3.4 protein_kinase,_AMP-activated,_beta_2_non-catalyticsubunit_(Prkab2)
Musk 18198 -1.8 muscle,_skeletal,_receptor_tyrosine_kinase_(Musk),transcript_variant_3
Speg 11790 -0.9 SPEG_complex_locus_(Speg)
Tgfbr1 21812 -0.8 transforming_growth_factor,_beta_receptor_I_(Tgfbr1),mRNA
Uhmk1 16589 -0.8 U2AF_homology_motif_(UHM)_kinase_1_(Uhmk1)
Lck 16818 -0.7 lymphocyte_protein_tyrosine_kinase_(Lck)
Fgfr1 14182 -0.7 fibroblast_growth_factor_receptor_1_(Fgfr1)
Epha3 13837 -0.7 Eph_receptor_A3_(Epha3)
Flt4 14257 -0.7 FMS-like_tyrosine_kinase_4_(Flt4)
Galk1 14635 -0.7 galactokinase_1_(Galk1)
Ulk2 29869 -0.7 Unc-51_like_kinase_2_(C._elegans)_(Ulk2)
Pctk3 18557 -0.7 PCTAIRE-motif_protein_kinase_3_(Pctk3)
Ephb2 13844 -0.7 Eph_receptor_B2_(Ephb2)
Fyn 14360 -0.6 Fyn_proto-oncogene_(Fyn)
Map3k14 53859 -0.6 mitogen-activated_protein_kinase_kinase_kinase_14(Map3k14)
Mapk1 26413 -0.6 mitogen_activated_protein_kinase_1_(Mapk1),_transcriptvariant_2
Map3k8 26410 -0.5 mitogen_activated_protein_kinase_kinase_kinase_8(Map3k8)
Raf1 110157 -0.5 v-raf-leukemia_viral_oncogene_1_(Raf1)
Guk1 14923 -0.5 guanylate_kinase_1_(Guk1)
KEGG pathway of glial migration decelerators
Term p-value (-log10) Kinases ( Entrez ID)
mmu04150:mTOR signaling pathway 5.88 56717, 71742, 20869, 30955, 58988, 108079, 109880
mmu04910:Insulin signaling pathway 5.77 56717, 216019, 30955, 11836, 18759, 18679, 58988, 108079, 109880
mmu05230:Central carbon metabolism in cancer 5.67 18746, 13649, 56717, 216019, 14183, 30955, 17295
mmu04151:PI3K-Akt signaling pathway 5.22 13649, 56717, 14183, 20869, 30955, 20393, 12566, 12978, 58988, 108079, 17295, 16542
mmu04012:ErbB signaling pathway 4.88 13649, 56717, 12323, 30955, 11836, 58988, 109880
mmu05215:Prostate cancer 4.86 13649, 56717, 14183, 30955, 11836, 12566, 109880
mmu04068:FoxO signaling pathway 4.83 13649, 20869, 30955, 11836, 20393, 12566, 108079, 109880
mmu05205:Proteoglycans in cancer 4.57 13649, 56717, 12323, 30955, 11836, 58988, 109880, 17295, 16542
mmu05214:Glioma 4.37 13649, 56717, 12323, 30955, 11836, 109880
mmu04914:Progesterone-mediated oocyte maturation 3.76 30955, 11836, 17451, 12566, 109880, 12534
mmu04015:Rap1 signaling pathway 3.54 13649, 14183, 30955, 18759, 12978, 109880, 17295, 16542
mmu05223:Non-small cell lung cancer 3.45 13649, 11682, 30955, 11836, 109880
mmu05221:Acute myeloid leukemia 3.45 56717, 30955, 11836, 58988, 109880
mmu04066:HIF-1 signaling pathway 3.44 13649, 56717, 12323, 216019, 30955, 58988
mmu05218:Melanoma 3.05 13649, 30955, 11836, 109880, 17295
mmu04810:Regulation of actin cytoskeleton 2.76 13649, 18718, 14183, 30955, 11836, 17451, 109880
mmu01130:Biosynthesis of antibiotics 2.75 18746, 216019, 171567, 79059, 328099, 18663, 75533
mmu05200:Pathways in cancer 2.61 13649, 56717, 14183, 30955, 11836, 12566, 12978, 109880, 17295
mmu04930:Type II diabetes mellitus 2.46 18746, 56717, 216019, 30955
mmu05213:Endometrial cancer 2.42 13649, 30955, 11836, 109880
mmu04722:Neurotrophin signaling pathway 2.20 17164, 12323, 17179, 30955, 109880
mmu05212:Pancreatic cancer 2.14 13649, 30955, 11836, 109880
mmu04152:AMPK signaling pathway 2.12 56717, 20869, 30955, 58988, 108079
mmu05211:Renal cell carcinoma 2.09 30955, 11836, 109880, 17295
mmu04014:Ras signaling pathway 1.91 13649, 14183, 30955, 12978, 17295, 16542
mmu01100:Metabolic pathways 1.78 18746, 80914, 211347, 214253, 328099, 75735, 18663, 69923, 102448, 216134, 79059, 216019, 171567, 240752, 75533
mmu00240:Pyrimidine metabolism 1.64 80914, 171567, 79059, 75533
mmu04922:Glucagon signaling pathway 1.64 18746, 12323, 18679, 108079
mmu00230:Purine metabolism 1.63 18746, 171567, 79059, 328099, 75533
mmu05231:Choline metabolism in cancer 1.63 13649, 56717, 30955, 58988
mmu05219:Bladder cancer 1.59 13649, 11836, 109880
mmu04931:Insulin resistance 1.53 56717, 30955, 58988, 108079
mmu04114:Oocyte meiosis 1.51 12323, 17451, 12566, 12534
mmu01200:Carbon metabolism 1.47 18746, 216019, 328099, 18663
mmu04510:Focal adhesion 1.43 13649, 30955, 109880, 17295, 16542
KEGG pathway of glial migration accelerators
Term p-value (-log10) Kinases ( Entrez ID)
mmu04660:T cell receptor signaling pathway 5.71 16818, 26413, 14360, 53859, 26410, 110157
mmu04380:Osteoclast differentiation 3.86 16818, 26413, 21812, 14360, 53859
mmu04010:MAPK signaling pathway 3.80 26413, 21812, 14182, 53859, 26410, 110157
mmu04068:FoxO signaling pathway 3.75 26413, 19082, 21812, 108097, 110157
mmu04520:Adherens junction 3.31 26413, 21812, 14182, 14360
mmu04650:Natural killer cell mediated cytotoxicity 2.83 16818, 26413, 14360, 110157
mmu04360:Axon guidance 2.58 26413, 13837, 13844, 14360
mmu04550:Signaling pathways regulating pluripotency of stem cells 2.50 26413, 14182, 269275, 110157
mmu04910:Insulin signaling pathway 2.48 26413, 19082, 108097, 110157
mmu04921:Oxytocin signaling pathway 2.39 26413, 19082, 108097, 110157
mmu05230:Central carbon metabolism in cancer 2.07 26413, 14182, 110157
mmu05210:Colorectal cancer 2.07 26413, 21812, 110157
mmu05212:Pancreatic cancer 2.05 26413, 21812, 110157
mmu04664:Fc epsilon RI signaling pathway 2.02 26413, 14360, 110157
mmu04510:Focal adhesion 2.00 26413, 14360, 14257, 110157
mmu05218:Melanoma 1.98 26413, 14182, 110157
mmu05220:Chronic myeloid leukemia 1.97 26413, 21812, 110157
mmu04015:Rap1 signaling pathway 1.97 26413, 14182, 14257, 110157
mmu04014:Ras signaling pathway 1.89 26413, 14182, 14257, 110157
mmu04350:TGF-beta signaling pathway 1.83 26413, 21812, 269275
mmu05215:Prostate cancer 1.80 26413, 14182, 110157
mmu04668:TNF signaling pathway 1.63 26413, 53859, 26410
mmu04931:Insulin resistance 1.62 19082, 228775, 108097
mmu04071:Sphingolipid signaling pathway 1.52 26413, 14360, 110157
mmu04151:PI3K-Akt signaling pathway 1.40 26413, 14182, 14257, 110157
mmu05161:Hepatitis B 1.39 26413, 21812, 110157
< 실시예 5> 신경교세포 식세포 작용을 조절하는 인산화효소
분석 마지막 라운드에서, 본 발명자들은 식세포 작용을 억제하는 57개의 인산화효소(식세포 작용을 증가시키는 siRNAs) 또는 식세포 작용을 향상시키는 124개의 인산화효소(식세포 작용을 감소시키는 siRNAs)를 확인하였다(도 8A, 표 10 및 표 11). 히트 선별은 이중-플래시라이트 플롯(dual-flashlight plot)을 사용하여 수행하였는데, 평균 배수-변화 및 SSMD를 모두 동시에 고려하였다. 식세포 작용을 증가시키는 siRNAs(식세포 작용 억제 인산화효소)를 선별하기 위해, 평균 배수-변화 ≥ 0.5 (log2 스케일 상) 및 SSMD ≥ 1.65의 기준을 사용하였고, 식세포 작용을 감소시키는 siRNAs(식세포 작용 향상 인산화효소)를 선별하기 위해, 평균 배수-변화 ≤ -0.5 (log2 스케일 상) 및 SSMD ≤ -1.65의 기준을 사용하였다. KEGG 경로 및 GO의 강화 분석을 사용하여, 본 발명자들은 식세포 작용 억제 인산화효소에서 강화된 가장 유의성 있는 KEGG 경로로서, “MAPK 신호전달 경로”,“TCR 신호전달 경로”,“TNF 신호전달 경로”및 “ErbB 신호전달 경로”를 확인하였다. 한편, “mTOR 신호전달”,“인슐린 신호전달”,“Fc 감마 R-매개 식세포 작용”,“VEGF 신호전달”,“암에서의 핵심 탄소 대사”,“HIF-1 신호전달”,“액틴 세포골격 조절” 및 “NF-kappa B 신호전달”등은 신경교세포 식세포 작용 향상 인산화효소에 유의성 있는 경로로 확인되었다(도 8B 및 표 12). ClueGO 분석 결과, “PAK1,2,3 인산화 MAPK6,4”,“FCERI 매개 MAPK 활성화”, “PI3K/AKT 신호전달 네트워크”,“FCGR 활성화”,“FCGR 의존성 식세포 작용”, “AMPK 신호전달” 및 “인터루킨에 의한 신호전달” 등과 같은 여러 리엑톰(Reactome) 경로가 식세포 작용-조절 인산화효소에서 강화된 것으로 나타났다(도 8C). 본 발명의 스크리닝 방법을 통해 확인된 여러 식세포 작용-향상 인산화효소들은 기본적인 Fc 감마 R-매개 식세포 작용 신호전달 경로에 포함되는 것으로 확인되었다(도 8D).
siRNAs increasing phagocytosis ( kinases inhibiting phagocytosis )
Kinase Gene ID log2
( FC ) 		Description
Pak1 18479 3.3 p21_(CDKN1A)-activated_kinase_1_(Pak1)
Dtymk 21915 2.8 deoxythymidylate_kinase_(Dtymk)
Zap70 22637 2.8 zeta-chain_(TCR)_associated_protein_kinase_(Zap70)
Tssk6 83984 2.8 testis-specific_serine_kinase_6_(Tssk6)
Ak7 78801 2.7 adenylate_kinase_7_(Ak7)
Map2k4 26398 2.6 mitogen_activated_protein_kinase_kinase_4_(Map2k4)
Mvk 17855 2.5 mevalonate_kinase_(Mvk)
Acvrl1 11482 2.3 activin_A_receptor,_type_II-like_1_(Acvrl1)
Gm1078 381835 2.1 gene_model_1078,_(NCBI)_(Gm1078)
Map2k1 26395 2.1 mitogen_activated_protein_kinase_kinase_1_(Map2k1)
Ccrk 105278 2.1 cell_cycle_related_kinase_(Ccrk)
Acvr1 11477 1.6 activin_A_receptor,_type_1_(Acvr1)
Alk 11682 1.4 anaplastic_lymphoma_kinase_(Alk)
Mapk6 50772 1.2 mitogen-activated_protein_kinase_6_(Mapk6),_transcriptvariant_1
Mark3 17169 1.2 MAP/microtubule_affinity-regulating_kinase_3_(Mark3),transcript_variant_2
Obscn 380698 1.2 obscurin,_cytoskeletal_calmodulin_and_titin-interactingRhoGEF_(Obscn)
Ipmk 69718 1.2 inositol_polyphosphate_multikinase_(Ipmk)
Ror2 26564 1.1 receptor_tyrosine_kinase-like_orphan_receptor_2(Ror2)
Stk32a 269019 1.1 serine/threonine_kinase_32A_(Stk32a)
Ddr2 18214 1.0 discoidin_domain_receptor_family,_member_2_(Ddr2)
2610019A05Rik 72149 1.0 RIKEN_cDNA_2610019A05_gene_(2610019A05Rik)
Ckm 12715 0.9 creatine_kinase,_muscle_(Ckm)
Clk1 12747 0.9 CDC-like_kinase_1_(Clk1),_transcript_variant_1
Carkl 74637 0.9 carbohydrate_kinase-like_(Carkl)
Ripk3 56532 0.9 receptor-interacting_serine-threonine_kinase_3_(Ripk3)
Mastl 67121 0.9 microtubule_associated_serine/threonine_kinase-like(Mastl)
Map3k14 53859 0.9 mitogen-activated_protein_kinase_kinase_kinase_14(Map3k14)
Tssk3 58864 0.8 testis-specific_serine_kinase_3_(Tssk3)
Npr1 18160 0.7 natriuretic_peptide_receptor_1_(Npr1)
Wnk4 69847 0.7 WNK_lysine_deficient_protein_kinase_4_(Wnk4)
Mast1 56527 0.7 microtubule_associated_serine/threonine_kinase_1(Mast1)
Stk16 20872 0.7 serine/threonine_kinase_16_(Stk16)
Stk31 77485 0.7 serine_threonine_kinase_31_(Stk31)
Pdik1l 230809 0.7 PDLIM1_interacting_kinase_1_like_(Pdik1l)
Pdgfrb 18596 0.7 platelet_derived_growth_factor_receptor,_betapolypeptide_(Pdgfrb)
Pkd2l1 329064 0.7 polycystic_kidney_disease_2-like_1_(Pkd2l1)
Taf1 270627 0.7 TAF1_RNA_polymerase_II,_TATA_box_bindingprotein_(TBP)-associated_factor,_transcript_variant_13(Taf1)
Rps6kl1 238323 0.6 ribosomal_protein_S6_kinase-like_1_(Rps6kl1)
Ankk1 244859 0.6 ankyrin_repeat_and_kinase_domain_containing_1_(Ankk1)
Pdk4 18604 0.6 pyruvate_dehydrogenase_kinase,_isoenzyme_4_(Pdk4)
Brd3 67382 0.6 bromodomain_containing_3_(Brd3)
Mapk4 225724 0.6 mitogen-activated_protein_kinase_4_(Mapk4)
Uckl1 68556 0.6 uridine-cytidine_kinase_1-like_1_(Uckl1)
Hunk 26559 0.6 hormonally_upregulated_Neu-associated_kinase_(Hunk)
Taok2 381921 0.6 TAO_kinase_2
Pank3 211347 0.6 pantothenate_kinase_3_(Pank3)
Nek6 59126 0.6 NIMA_(never_in_mitosis_gene_a)-related_expressedkinase_6_(Nek6)
Pip5k1b 18720 0.6 phosphatidylinositol-4-phosphate_5-kinase,_type_1_beta(Pip5k1b)
Map2k7 26400 0.6 mitogen_activated_protein_kinase_kinase_7_(Map2k7),transcript_variant_1
siRNAs decreasing phagocytosis ( kinases enhancing phagocytosis )
Kinase Gene ID log2
( FC ) 		Description
Src 20779 -2.8 Rous_sarcoma_oncogene_(Src),_transcript_variant_1
Dmpk 13400 -2.0 dystrophia_myotonica-protein_kinase_(Dmpk)
Fgr 14191 -1.9 Gardner-Rasheed_feline_sarcoma_viral_(Fgr)_oncogenehomolog_(Fgr)
Brdt 114642 -1.9 bromodomain,_testis-specific_(Brdt)
Mapk1 26413 -1.8 mitogen_activated_protein_kinase_1_(Mapk1),_transcriptvariant_2
Dcamkl2 70762 -1.7 doublecortin_and_CaM_kinase-like_2_(Dcamkl2)
Tssk4 71099 -1.7 testis-specific_serine_kinase_4_(Tssk4)
Stk39 53416 -1.7 serine/threonine_kinase_39,_STE20/SPS1_homolog_(yeast)(Stk39)
Melk 17279 -1.6 maternal_embryonic_leucine_zipper_kinase_(Melk)
Dapk2 13143 -1.6 death-associated_kinase_2_(Dapk2)
Ephb3 13845 -1.5 Eph_receptor_B3_(Ephb3)
Mylk 107589 -1.5 myosin,_light_polypeptide_kinase_(Mylk)
Pkn1 320795 -1.5 protein_kinase_N1_(Pkn1)
Gsg2 14841 -1.5 germ_cell-specific_gene_2_(Gsg2)
Lrrk2 66725 -1.5 leucine-rich_repeat_kinase_2_(Lrrk2)
Bmpr1a 12166 -1.5 bone_morphogenetic_protein_receptor,_type_1A_(Bmpr1a)
Egfr 13649 -1.4 epidermal_growth_factor_receptor_(Egfr),_transcriptvariant_1
Pdxk 216134 -1.4 pyridoxal_(pyridoxine,_vitamin_B6)_kinase_(Pdxk)
Adck5 268822 -1.4 aarF_domain_containing_kinase_5_(Adck5)
Pip5k3 18711 -1.4 phosphatidylinositol-3-phosphate/phosphatidylinositol5-kinase,_type_III_(Pip5k3)
Map3k3 26406 -1.4 mitogen_activated_protein_kinase_kinase_kinase_3(Map3k3)
Irak4 266632 -1.3 interleukin-1_receptor-associated_kinase_4_(Irak4)
Csnk1e 27373 -1.3 casein_kinase_1,_epsilon_(Csnk1e)
Akt3 23797 -1.3 thymoma_viral_proto-oncogene_3_(Akt3)
Ptk2 14083 -1.3 PTK2_protein_tyrosine_kinase_2_(Ptk2)
Csnk2a2 13000 -1.3 casein_kinase_2,_alpha_prime_polypeptide_(Csnk2a2)
Kalrn 545156 -1.3 kalirin,_RhoGEF_kinase,_transcript_variant_8(Kalrn)
Hck 15162 -1.3 hemopoietic_cell_kinase_(Hck)
Chka 12660 -1.2 choline_kinase_alpha_(Chka),_transcript_variant_1
Prkab2 108097 -1.2 protein_kinase,_AMP-activated,_beta_2_non-catalyticsubunit_(Prkab2)
Alpk3 116904 -1.2 alpha-kinase_3_(Alpk3)
Sgk3 170755 -1.2 serum/glucocorticoid_regulated_kinase_3_(Sgk3),transcript_variant_3
Adck4 76889 -1.2 aarF_domain_containing_kinase_4_(Adck4)
Mast4 328329 -1.2 microtubule_associated_serine/threoninekinase_family_member_4_(Mast4)
Nek8 140859 -1.1 NIMA_(never_in_mitosis_gene_a)-related_expressedkinase_8_(Nek8)
Pfkfb2 18640 -1.1 6-phosphofructo-2-kinase/fructose-2,6-biphosphatase_2(Pfkfb2)
Tek 21687 -1.1 endothelial-specific_receptor_tyrosine_kinase_(Tek)
Pdk3 236900 -1.1 pyruvate_dehydrogenase_kinase,_isoenzyme_3_(Pdk3)
Tnni3k 435766 -1.1 TNNI3_interacting_kinase,_transcriptvariant_4_(Tnni3k)
Pink1 68943 -1.1 PTEN_induced_putative_kinase_1_(Pink1)
Ern1 78943 -1.1 endoplasmic_reticulum_(ER)_to_nucleus_signalling_1(Ern1)
Ryk 20187 -1.1 receptor-like_tyrosine_kinase_(Ryk),_transcript_variant2
Prkce 18754 -1.1 protein_kinase_C,_epsilon_(Prkce)
Mark1 226778 -1.1 MAP/microtubule_affinity-regulating_kinase_1_(Mark1)
Riok2 67045 -1.1 RIO_kinase_2_(yeast)_(Riok2)
Map3k4 26407 -1.1 mitogen_activated_protein_kinase_kinase_kinase_4(Map3k4)
Cdk4 12567 -1.1 cyclin-dependent_kinase_4_(Cdk4)
Dck 13178 -1.1 deoxycytidine_kinase_(Dck)
Tec 21682 -1.1 cytoplasmic_tyrosine_kinase,_Dscr28C_related(Drosophila)_(Tec)
Eif2ak3 13666 -1.0 eukaryotic_translation_initiation_factor_2_alpha_kinase3_(Eif2ak3)
Gucy2c 14917 -1.0 guanylate_cyclase_2c_(Gucy2c)
Map3k11 26403 -1.0 mitogen_activated_protein_kinase_kinase_kinase_11(Map3k11)
Frap1 56717 -1.0 FK506_binding_protein_12-rapamycin_associated_protein_1(Frap1)
Map3k2 26405 -1.0 mitogen_activated_protein_kinase_kinase_kinase_2(Map3k2)
Cdc2a 12534 -1.0 cell_division_cycle_2_homolog_A_(S._pombe)_(Cdc2a)
Ksr1 16706 -1.0 kinase_suppressor_of_ras_1_(Ksr1)
Nek7 59125 -0.9 NIMA_(never_in_mitosis_gene_a)-related_expressedkinase_7_(Nek7)
Camk2b 12323 -0.9 calcium/calmodulin-dependent_protein_kinase_II,_beta(Camk2b)
Btk 12229 -0.9 Bruton_agammaglobulinemia_tyrosine_kinase_(Btk)
Prkag1 19082 -0.9 protein_kinase,_AMP-activated,_gamma_1_non-catalyticsubunit_(Prkag1)
Epha8 13842 -0.9 Eph_receptor_A8_(Epha8)
Pi4k2b 67073 -0.9 phosphatidylinositol_4-kinase_type_2_beta_(Pi4k2b),transcript_variant_1
Pip5k1c 18717 -0.9 phosphatidylinositol-4-phosphate_5-kinase,_type_1gamma_(Pip5k1c)
Trpm6 225997 -0.9 transient_receptor_potential_cation_channel,_subfamilyM,_member_6_(Trpm6)
Stk4 58231 -0.9 serine/threonine_kinase_4_(Stk4)
Ret 19713 -0.9 ret_proto-oncogene_(Ret)
Pftk1 18647 -0.9 PFTAIRE_protein_kinase_1_(Pftk1)
Stk33 117229 -0.9 serine/threonine_kinase_33_(Stk33)
Nek5 330721 -0.9 NIMA_(never_in_mitosis_gene_a)-related_expressedkinase_5_(Nek5)
Dcamkl3 245038 -0.8 doublecortin_and_CaM_kinase-like_3(Dcamkl3)
Nek9 217718 -0.8 NIMA_(never_in_mitosis_gene_a)-related_expressed_kinase9_(Nek9)
Matk 17179 -0.8 megakaryocyte-associated_tyrosine_kinase_(Matk)
Ptk9 19230 -0.8 protein_tyrosine_kinase_9_(Ptk9)
Map3k15 270672 -0.8 mitogen-activated_protein_kinase_kinasekinase_15_(Map3k15)
Pik3cd 18707 -0.8 phosphatidylinositol_3-kinase_catalytic_deltapolypeptide_(Pik3cd),_transcript_variant_2
Acvr1b 11479 -0.8 activin_A_receptor,_type_1B_(Acvr1b)
Gucy2f 245650 -0.8 guanylate_cyclase_2f_(Gucy2f)
Ripk1 19766 -0.8 receptor_(TNFRSF)-interacting_serine-threonine_kinase1_(Ripk1)
Camkk1 55984 -0.8 calcium/calmodulin-dependent_protein_kinase_kinase_1,alpha_(Camkk1)
Ulk1 22241 -0.8 Unc-51_like_kinase_1_(C._elegans)_(Ulk1)
Map3k9 338372 -0.8 mitogen-activated_protein_kinase_kinase_kinase_9(Map3k9)
BC033915 70661 -0.8 cDNA_sequence_BC033915_(BC033915)
Pnck 93843 -0.8 pregnancy_upregulated_non-ubiquitously_expressed_CaMkinase_(Pnck)
Rps6ka6 67071 -0.8 ribosomal_protein_S6_kinase_polypeptide_6_(Rps6ka6)
Phkb 102093 -0.8 phosphorylase_kinase_beta_(Phkb)
Sphk1 20698 -0.8 sphingosine_kinase_1_(Sphk1),_transcript_variant_2
Brd4 57261 -0.7 bromodomain_containing_4_(Brd4),_transcript_variant_2
Abl1 78801 -0.7 v-abl_Abelson_murine_leukemia_oncogene_1_(Abl1)
Vrk2 69922 -0.7 vaccinia_related_kinase_2_(Vrk2)
Plk2 20620 -0.7 polo-like_kinase_2_(Drosophila)_(Plk2)
Brsk1 381979 -0.7 BR_serine/threonine_kinase_1_(Brsk1)
Dyrk3 226419 -0.7 dual-specificity_tyrosine-(Y)-phosphorylationregulated_kinase_3_(Dyrk3)
Pik3cb 74769 -0.7 phosphatidylinositol_3-kinase,_catalytic,_betapolypeptide_(Pik3cb)
Lck 16818 -0.7 lymphocyte_protein_tyrosine_kinase_(Lck)
Pim3 223775 -0.7 proviral_integration_site_3_(Pim3)
Nme5 75533 -0.7 expressed_in_non-metastatic_cells_5_(Nme5)
Rbks 71336 -0.7 ribokinase_(Rbks)
Musk 18198 -0.7 muscle,_skeletal,_receptor_tyrosine_kinase_(Musk),transcript_variant_3
Syk 20963 -0.7 spleen_tyrosine_kinase_(Syk)
Bmp2k 140780 -0.7 BMP2_inducible_kinase_(Bmp2k)
Mertk 17289 -0.6 c-mer_proto-oncogene_tyrosine_kinase(Mertk)
Phkg1 18682 -0.6 phosphorylase_kinase_gamma_1_(Phkg1)
Snf1lk 17691 -0.6 SNF1-like_kinase_(Snf1lk)
Dgkz 104418 -0.6 diacylglycerol_kinase_zeta_(Dgkz)
Xylb 102448 -0.6 xylulokinase_homolog_(H._influenzae)_(Xylb)
Ephb1 270190 -0.6 Eph_receptor_B1_(Ephb1)
Ulk2 29869 -0.6 Unc-51_like_kinase_2_(C._elegans)_(Ulk2)
Phka1 18679 -0.6 phosphorylase_kinase_alpha_1_(Phka1),_transcriptvariant_1
Erbb3 13867 -0.6 v-erb-b2_erythroblastic_leukemia_viral_oncogene_homolog3_(avian)_(Erbb3)
Pik3ca 18706 -0.6 phosphatidylinositol_3-kinase,_catalytic,_alphapolypeptide_(Pik3ca)
Itpkc 233011 -0.6 inositol_1,4,5-trisphosphate_3-kinase_C_(Itpkc)
Braf 109880 -0.6 Braf_transforming_gene_(Braf)
KEGG pathway of glial phagocytosis inhibitors
Term p-value (log) Kinases ( Entrez ID)
mmu04010:MAPK signaling pathway 4.26 18596, 26398, 381921, 26395, 18479, 53859, 26400
mmu04660:T cell receptor signaling pathway 3.77 26395, 18479, 22637, 53859, 26400
mmu04668:TNF signaling pathway 3.64 26398, 26395, 56532, 53859, 26400
mmu04012:ErbB signaling pathway 2.73 26398, 26395, 18479, 26400
mmu04664:Fc epsilon RI signaling pathway 1.80 26398, 26395, 26400
mmu04810:Regulation of actin cytoskeleton 1.66 18596, 26395, 18720, 18479
mmu04666:Fc gamma R-mediated phagocytosis 1.63 26395, 18720, 18479
mmu04912:GnRH signaling pathway 1.59 26398, 26395, 26400
mmu04014:Ras signaling pathway 1.58 18596, 26395, 18479, 22637
mmu04620:Toll-like receptor signaling pathway 1.48 26398, 26395, 26400
mmu05231:Choline metabolism in cancer 1.48 18596, 26395, 18720
mmu04650:Natural killer cell mediated cytotoxicity 1.45 26395, 18479, 22637
mmu04380:Osteoclast differentiation 1.30 26395, 53859, 26400
mmu05169:Epstein-Barr virus infection 1.24 26398, 53859, 26400
mmu01100:Metabolic pathways 1.24 78801, 21915, 17855, 68556, 12715, 211347, 18720, 69718
mmu05164:Influenza A 1.07 26398, 26395, 26400
KEGG pathway of glial phagocytosis enhancers
Term p-value (log) Kinases ( Entrez ID)
mmu04012:ErbB signaling pathway 9.13 13649, 26413, 56717, 74769, 12323, 20779, 13867, 14083, 109880, 23797, 18707, 18706
mmu04150:mTOR signaling pathway 8.28 26413, 56717, 74769, 29869, 67071, 22241, 109880, 23797, 18707, 18706
mmu04068:FoxO signaling pathway 8.18 170755, 13649, 26413, 74769, 19082, 27373, 58231, 20620, 109880, 23797, 108097, 18707, 18706
mmu04910:Insulin signaling pathway 6.93 18682, 26413, 56717, 74769, 19082, 102093, 18679, 109880, 23797, 108097, 18707, 18706
mmu04666:Fc gamma R-mediated phagocytosis 6.90 26413, 74769, 18717, 18754, 15162, 23797, 20963, 18707, 20698, 18706
mmu04722:Neurotrophin signaling pathway 6.51 266632, 26413, 74769, 12323, 17179, 26406, 67071, 109880, 23797, 18707, 18706
mmu05231:Choline metabolism in cancer 6.20 13649, 26413, 56717, 74769, 18717, 104418, 23797, 18707, 18706, 12660
mmu04370:VEGF signaling pathway 5.71 26413, 74769, 20779, 14083, 23797, 18707, 20698, 18706
mmu05230:Central carbon metabolism in cancer 5.52 13649, 26413, 56717, 74769, 19713, 23797, 18707, 18706
mmu04066:HIF-1 signaling pathway 5.14 13649, 26413, 56717, 21687, 74769, 12323, 23797, 18707, 18706
mmu04931:Insulin resistance 4.90 56717, 74769, 19082, 18754, 67071, 23797, 108097, 18707, 18706
mmu04380:Osteoclast differentiation 4.47 16818, 26413, 74769, 12229, 21682, 23797, 20963, 18707, 18706
mmu04152:AMPK signaling pathway 4.42 56717, 74769, 19082, 55984, 18640, 23797, 108097, 18707, 18706
mmu04611:Platelet activation 4.35 26413, 74769, 12229, 20779, 107589, 23797, 20963, 18707, 18706
mmu04810:Regulation of actin cytoskeleton 4.33 13649, 26413, 74769, 18717, 20779, 18711, 14083, 107589, 109880, 18707, 18706
mmu04070:Phosphatidylinositol signaling system 4.32 74769, 18717, 18711, 104418, 67073, 233011, 18707, 18706
mmu04664:Fc epsilon RI signaling pathway 4.26 26413, 74769, 12229, 23797, 20963, 18707, 18706
mmu04922:Glucagon signaling pathway 4.24 18682, 19082, 12323, 102093, 18679, 17691, 23797, 108097
mmu05160:Hepatitis C 4.23 13666, 13649, 26413, 74769, 19766, 109880, 23797, 18707, 18706
mmu04660:T cell receptor signaling pathway 4.21 16818, 26413, 74769, 21682, 12567, 23797, 18707, 18706
mmu04662:B cell receptor signaling pathway 4.19 26413, 74769, 12229, 23797, 20963, 18707, 18706
mmu00562:Inositol phosphate metabolism 4.19 74769, 18717, 18711, 67073, 233011, 18707, 18706
mmu05220:Chronic myeloid leukemia 4.12 26413, 74769, 12567, 109880, 23797, 18707, 18706
mmu04930:Type II diabetes mellitus 3.88 26413, 56717, 74769, 18754, 18707, 18706
mmu04919:Thyroid hormone signaling pathway 3.87 26413, 56717, 74769, 20779, 18640, 23797, 18707, 18706
mmu04062:Chemokine signaling pathway 3.87 26413, 14191, 74769, 20779, 14083, 15162, 109880, 23797, 18707, 18706
mmu04151:PI3K-Akt signaling pathway 3.77 21687, 13649, 14083, 320795, 170755, 56717, 26413, 74769, 12567, 23797, 18707, 20963, 18706
mmu04510:Focal adhesion 3.69 13649, 26413, 74769, 20779, 14083, 107589, 109880, 23797, 18707, 18706
mmu04912:GnRH signaling pathway 3.63 13649, 26413, 12323, 20779, 26405, 26406, 26407
mmu04020:Calcium signaling pathway 3.39 18682, 13649, 12323, 13867, 102093, 18679, 107589, 233011, 20698
mmu04915:Estrogen signaling pathway 3.38 13649, 26413, 74769, 20779, 23797, 18707, 18706
mmu04620:Toll-like receptor signaling pathway 3.31 266632, 26413, 74769, 19766, 23797, 18707, 18706
mmu04650:Natural killer cell mediated cytotoxicity 3.22 16818, 26413, 74769, 109880, 20963, 18707, 18706
mmu04921:Oxytocin signaling pathway 3.14 13649, 26413, 19082, 12323, 20779, 55984, 107589, 108097
mmu04917:Prolactin signaling pathway 3.11 26413, 74769, 20779, 23797, 18707, 18706
mmu04010:MAPK signaling pathway 3.07 13649, 26413, 26405, 26406, 26407, 67071, 58231, 109880, 23797, 26403
mmu04015:Rap1 signaling pathway 2.89 13649, 26413, 21687, 74769, 20779, 109880, 23797, 18707, 18706
mmu04071:Sphingolipid signaling pathway 2.84 26413, 74769, 18754, 23797, 18707, 20698, 18706
mmu05152:Tuberculosis 2.74 266632, 26413, 12323, 20779, 16706, 23797, 20963, 20698
mmu04014:Ras signaling pathway 2.71 13649, 26413, 21687, 74769, 16706, 58231, 23797, 18707, 18706
mmu04550:Signaling pathways regulating pluripotency of stem cells 2.60 11479, 26413, 74769, 23797, 18707, 18706, 12166
mmu04064:NF-kappa B signaling pathway 2.56 266632, 16818, 12229, 13000, 19766, 20963
mmu04210:Apoptosis 2.53 74769, 19766, 23797, 18707, 18706
mmu05161:Hepatitis B 2.48 26413, 74769, 20779, 12567, 23797, 18707, 18706
mmu05142:Chagas disease (American trypanosomiasis) 2.44 266632, 26413, 74769, 23797, 18707, 18706
mmu04668:TNF signaling pathway 2.34 26413, 74769, 19766, 23797, 18707, 18706
mmu04725:Cholinergic synapse 2.27 26413, 74769, 12323, 23797, 18707, 18706
mmu04920:Adipocytokine signaling pathway 2.24 56717, 19082, 55984, 23797, 108097
mmu05164:Influenza A 2.15 13666, 266632, 26413, 74769, 23797, 18707, 18706
mmu04960:Aldosterone-regulated sodium reabsorption 2.14 26413, 74769, 18707, 18706
mmu05100:Bacterial invasion of epithelial cells 2.12 74769, 20779, 14083, 18707, 18706
mmu04973:Carbohydrate digestion and absorption 2.08 74769, 23797, 18707, 18706
mmu04750:Inflammatory mediator regulation of TRP channels 2.08 74769, 12323, 20779, 18754, 18707, 18706
mmu04540:Gap junction 1.97 13649, 26413, 20779, 26405, 12534
mmu05169:Epstein-Barr virus infection 1.94 74769, 19766, 23797, 20963, 18707, 18706
mmu04024:cAMP signaling pathway 1.86 26413, 74769, 12323, 109880, 23797, 18707, 18706
mmu04923:Regulation of lipolysis in adipocytes 1.72 74769, 23797, 18707, 18706
mmu04720:Long-term potentiation 1.55 26413, 12323, 67071, 109880
mmu04520:Adherens junction 1.45 13649, 26413, 20779, 13000
mmu04360:Axon guidance 1.40 26413, 270190, 14083, 13845, 13842
본 발명을 통해, 신경교세포의 신경염증 표현형의 치료 조절을 위한 잠재적인 인산화효소 표적으로 ITK 및 PDK2를 제시하였다(도 9). ITK의 억제는 신경독성 미세아교세포 활성화를 억제시키는 반면, PDK2의 억제는 손상 위치로의 신경보호성 성상세포 이동을 촉진할 수 있다. 따라서, 다중 신경교세포 인산화효소 스크리닝은 세포-기반 표현형 스크리닝에 대해 보다 효율적으로 접근할 수 있을 뿐만 아니라 신경교세포 인산화효소를 표적으로 하는 신경염증 및 관련 CNS 질환에 대한 치료 로드맵을 제공한다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (17)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. ITK 활성 억제제인 N-[5-[[5-[(4-아세틸-1-피페라지닐)카보닐]-4-메톡시-2-메틸페닐]티오]-2-티아졸일]-4-[[(1,2,2-트리메틸프로필)아미노]메틸]벤즈아미드(N-[5-[[5-[(4-Acetyl-1-piperazinyl)carbonyl]-4-methoxy-2-methylphenyl]thio]-2-thiazolyl]-4-[[(1,2,2-trimethylpropyl)amino]methyl]benzamide)를 유효성분으로 함유하며, 미세아교세포의 활성을 억제하는 것을 특징으로 하는 알츠하이머 병 또는 파킨슨 병에서의 신경염증 예방 또는 치료용 약학조성물.
  4. 삭제
  5. 삭제
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  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 삭제
  14. 삭제
  15. 삭제
  16. 삭제
  17. ITK 활성 억제제인 N-[5-[[5-[(4-아세틸-1-피페라지닐)카보닐]-4-메톡시-2-메틸페닐]티오]-2-티아졸일]-4-[[(1,2,2-트리메틸프로필)아미노]메틸]벤즈아미드(N-[5-[[5-[(4-Acetyl-1-piperazinyl)carbonyl]-4-methoxy-2-methylphenyl]thio]-2-thiazolyl]-4-[[(1,2,2-trimethylpropyl)amino]methyl]benzamide)를 유효성분으로 함유하며, 미세아교세포의 활성을 억제하는 것을 특징으로 하는 알츠하이머 병 또는 파킨슨 병에서의 신경염증 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
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WO2020033955A1 (en) * 2018-08-10 2020-02-13 Aclaris Therapeutics, Inc. Pyrrolopyrimidine itk inhibitors

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The Journal of Neuroscience, 35(1), 221-233쪽(2015.)*

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