KR102556405B1 - 미생물 발효에 의한 Proteinase K 생산 공정을 제어하는 방법 및 장치 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 근적외선 분광분석기(Near Infrared Spectrophotometer)와 화학계량학(Chemometrics)을 이용하여 미생물 발효에 의한 단백질 생산 공정을 제어하는 방법 및 장치에 관한 것이다. 보다 구체적으로는, 본 발명은 효모(Pichia pastrois) 미생물을 이용하여 Proteinase K를 발효할 때 근적외선 분광분석기와 화학계량학을 이용하여 발효액 중의 여러 성분 지표를 실시간으로 동시에 측정하여 모니터링하고, 이때 발생하는 각 성분의 전기적 신호를 활용하여 발효 공정을 실시간으로 자동 제어하는 방법 및 이를 위한 장치에 관한 것이다.
Description
본 발명은 근적외선 분광분석기(Near Infrared Spectrophotometer)와 화학계량학(Chemometrics)을 이용하여 미생물 발효에 의한 단백질 생산 공정을 제어하는 방법 및 장치에 관한 것이다. 보다 구체적으로는, 본 발명은 효모(Pichia pastrois) 미생물을 이용하여 Proteinase K를 발효할 때 근적외선 분광분석기와 화학계량학을 이용하여 발효액 중의 여러 성분 지표를 동시에 측정하여 모니터링하고, 이때 발생하는 각 성분의 전기적 신호를 활용하여 발효 공정을 실시간으로 자동 제어하는 방법 및 이를 위한 장치에 관한 것이다.
발효 공정은 미생물을 이의 생육과 목적하는 생산 물질의 생산이 가능한 배지에 접종하여 미생물이 배지 성분의 소비를 통해 생육과 동시에 목적하는 생산 물질을 효율적으로 생산하기 위한 환경을 제공하고 관리하는 공정으로서, 미생물의 생리에 적합한 물리적, 화학적 공정 최적화가 필수적이다.
발효 공정 최적화와 관련된 물리적 인자들 중 교반수, 온도, 내압, pH, 용존산소 등은 이미 신뢰도가 높은 측정센서 등 계측기가 개발되어 있는 덕분에 온라인 실시간 분석이 보편화되어 현재의 기술로도 실시간 모니터링과 제어가 가능하다. 하지만, 현재 발효 공정 관리에 통상적으로 적용되는 상기 인자들 외에 발효 공정의 실시간 관리나 최적화에 필수적인 주요 배지성분의 농도 변화, 미생물의 생육 프로파일, 목적 생산물질과 부산물의 생성 트렌드 등 발효 환경의 경시적 변화의 경우에는 이를 즉각적으로 분석할 수 있는 측정기(센서 등)나 분석방법이 개발되어 있지 않다. 이러한 이유로, 현재까지의 발효 공정 실험과 생산 현장 관리는 발효액 시료를 채취하여 별도의 전용 분석기에서 각각의 성분을 개별적으로 분석하는 오프라인 분석 방법이나 경험에 의존하고 있어서 발효 공정의 최적화나 공정 관리, 특히 실시간 공정 관리의 적용은 화학공정 대비 매우 낮은 수준이다. 미생물에 의한 생화학 반응의 비실시간 분석 결과를 이용하는 것은 발효 최적화 또는 관리에 효율성이 낮고, 분석작업에 많은 시간과 인력이 필요한 단점이 있다.
뿐만 아니라, 최근에는 많은 종류의 유전자 변형 생물체(Genetically Modified Organisms, GMO)에 속하는 미생물이 연구 또는 생산 현장에 적용되고 있고 사멸 전의 유전자 변형 미생물 균주의 외부 환경 유출에 대한 규정 수위가 엄격해지고 있는데, 주로 배양 공정 분석을 위해 채취하는 배양액 샘플링이 생산 또는 연구 현장에서 미생물 배양 시 발생하는 주요 유출 경로 중의 하나로 인식되고 있다.
한편, 최근 전자, 정보 통신 및 광학기기의 발전과 분광분석 스펙트럼의 정보를 정확하고 신속하게 처리할 있는 인공지능(AI) 화학계량학의 급속한 발전으로 인하여 분광분석 기술의 확대 적용이 가능하게 되었다. 그 중에서도, 근적외선 분광분석 기술은 시료의 전처리 없이 단시간에 여러 성분을 연속적으로 동시에 분석할 수 있어, 각각의 성분별로 분석해 오던 기존의 습식 분석법에 비해 여러 가지 성분을 한번의 분석으로 시료 전처리없이 동시에 분석할 수 있다. 따라서, 분석시간, 비용, 및 노동력 등을 현저히 감소시킬 수 있을뿐만 아니라 전처리 등을 위해 사용되는 시간과 유해한 화학 약품의 사용 없이 신속한 정량 분석이 가능하다. 종래에 근적외선 분광분석 기술은 주로 사과나 밀감 등의 당도를 비파괴 전수 분석하는 등 농산물의 품질 분석에 사용되거나(한국 산업식품공학회 11권 1호 p38~48; 한국화학회지 2005, Vol.49, No. 6; 한국공작기계학회 Vol. 15, No. 5), 석유화학공정의 공정 관리(한국 근적외분광분석학회 2001. June 01, P. 1082~1082; 한국근적외분광분석 학회 2002, Nov.01, p63~73) 등에 이용되어 왔다.
본 발명은 상술한 종래 기술의 문제점을 모두 해결하는 것을 그 목적으로 한다.
본 발명은 미생물의 발효에 따른 발효액 성분 변화에 대한 정보를 실시간 모니터링할 수 있는 검량 모델을 제공하는 것을 다른 목적으로 한다.
본 발명은 미생물 발효에 따른 발효액 성분 변화에 대한 실시간 정보에 대응하여 발효 공정을 실시간 자동 제어하는 것을 다른 목적으로 한다.
본 발명은 미생물 발효를 인시투(in situ) 모니터링함으로써 미생물 발효 시스템 외부로 미생물 유출이 없도록 제어할 수 있는 것을 다른 목적으로 한다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 대표적인 구성은 다음과 같다.
본 발명의 일 태양에 따르면, 미생물 발효에 의한 단백질 생산 공정을 실시간 제어하는 방법으로서, (i) 하나 이상의 발효액 성분 지표의 각각에 특이적인 둘 이상의 근적외선 파장 영역을 이용하여 얻은 검량 모델을 제공하는 단계, 및 (ii) 상기 둘 이상의 근적외선 파장 영역의 광원으로 상기 발효액 성분 지표 각각의 변화를 모니터링하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.
본 발명의 다른 태양에 따르면, 미생물 발효에 의해 단백질을 생산하기 위한 발효 시스템으로서, (i) 하나 이상의 발효액 성분 지표의 변화를 모니터링하기 위해 상기 발효액 성분 지표 각각에 특이적인 둘 이상의 근적외선 파장 영역을 이용하여 얻은 검량 모델을 포함하고 미생물 발효에 의한 단백질 생산 공정을 실시간 모니터링 및 제어하는 컨트롤부를 포함하는 발효 시스템이 제공된다.
이 외에도, 본 발명을 구현하기 위한 다른 방법, 다른 시스템 및 상기 방법을 실행하기 위한 비일시성의 컴퓨터 프로그램을 기록하는 컴퓨터 판독 가능한 기록 매체가 더 제공된다.
본 발명에 따른 미생물 발효에 의한 단백질 생산 공정을 실시간 제어하는 방법은, 발효 공정의 주요 성분 지표의 변화를 실시간으로 모니터링하고 이때 발생하는 각 성분의 전기적 신호를 활용하여 발효 공정을 실시간으로 자동 제어하여 정확한 공정 관리와 생산성을 최대화할 수 있는 효과를 발휘한다. 또한, 본 발명의 방법은 발효 배양 중 샘플링 없이 여러가지 성분을 동시에 실시간으로 분석할 수 있으므로 발효 공정에 유전자 변형 미생물이 사용되는 경우 그러한 미생물의 외부 유출 문제를 근본적으로 해결할 수 있다.
도 1은 근적외선 분광 분석기와 발효 공정을 나타내는 모식도이다.
도 2는 Proteinase K 발효액의 원시 스펙트럼(Raw Spectrum)(Wavenumber: cm-1)을 나타낸다.
도 3은 Proteinase K 발효액의 Proteinase K(단백질) 농도 스펙트럼의 선택 영역(Calibration, Wavenumber: cm-1)을 나타낸다.
도 4는 Proteinase K 발효액의 Proteinase K 농도 측정 스펙트럼(1차 미분(1st Derivative))을 나타낸다.
도 5는 Proteinase K 발효액의 Proteinase K 농도의 켈리브레이션(Calibration) 검량식 모델을 나타낸다.
도 6은 Proteinase K 발효액의 Proteinase K 농도의 발리데이션 검량식 모델을 나타낸다.
도 7은 Proteinase K 발효액의 탄소원인 글리세롤(Glycerol) 농도 스펙트럼의 선택 영역(Calibration Wavenumber: cm-1)을 나타낸다.
도 8은 Proteinase K 발효액의 탄소원인 글리세롤 농도 측정 스펙트럼(1차 미분)을 나타낸다.
도 9는 Proteinase K 발효액의 탄소원인 글리세롤 농도의 켈리브레이션 검량식 모델을 나타낸다.
도 10은 Proteinase K 발효액의 탄소원인 글리세롤 농도의 발리데이션 검량식 모델을 나타낸다.
도 11은 Proteinase K 발효액의 탄소원인 메탄올(Methanol) 농도 스펙트럼의 선택 영역(Calibration, Wavenumber: cm-1)을 나타낸다.
도 12는 Proteinase K 발효액의 탄소원인 메탄올 농도 측정 스펙트럼(1차 미분)을 나타낸다.
도 13은 Proteinase K 발효액의 탄소원인 메탄올 농도의 켈리브레이션 검량식 모델을 나타낸다.
도 14는 Proteinase K 발효액의 탄소원인 메탄올 농도의 발리데이션 검량식 모델을 나타낸다.
도 15는 Proteinase K 발효액의 균체 생육도를 나타내는 흡광도(Optical density) 스펙트럼의 선택 영역(Calibration, Wavenumber: cm-1)을 나타낸다.
도 16은 Proteinase K 발효액의 균체 생육도를 나타내는 흡광도 측정 스펙트럼(1차 미분)을 나타낸다.
도 17은 Proteinase K 발효액의 균체 생육도를 나타내는 흡광도의 켈리브레이션 검량식 모델을 나타낸다.
도 18은 Proteinase K 발효액의 균체 생육도를 나타내는 흡광도의 발리데이션 검량식 모델을 나타낸다.
도 19는 근적외선 분광분석기를 발효조에 연결하여 온라인 상태에서 Proteinase K 농도, 탄소원인 글리세롤과 메탄올 농도, 균의 생육을 나타내는 흡광도(OD) 경향을 검량식 모델로 모니터링하고 탄소원의 농도를 관리하기 위해 탄소원인 글리세롤과 메탄올을 실시간으로 자동 투입하고 컨트롤한 결과를 나타낸다.
도 2는 Proteinase K 발효액의 원시 스펙트럼(Raw Spectrum)(Wavenumber: cm-1)을 나타낸다.
도 3은 Proteinase K 발효액의 Proteinase K(단백질) 농도 스펙트럼의 선택 영역(Calibration, Wavenumber: cm-1)을 나타낸다.
도 4는 Proteinase K 발효액의 Proteinase K 농도 측정 스펙트럼(1차 미분(1st Derivative))을 나타낸다.
도 5는 Proteinase K 발효액의 Proteinase K 농도의 켈리브레이션(Calibration) 검량식 모델을 나타낸다.
도 6은 Proteinase K 발효액의 Proteinase K 농도의 발리데이션 검량식 모델을 나타낸다.
도 7은 Proteinase K 발효액의 탄소원인 글리세롤(Glycerol) 농도 스펙트럼의 선택 영역(Calibration Wavenumber: cm-1)을 나타낸다.
도 8은 Proteinase K 발효액의 탄소원인 글리세롤 농도 측정 스펙트럼(1차 미분)을 나타낸다.
도 9는 Proteinase K 발효액의 탄소원인 글리세롤 농도의 켈리브레이션 검량식 모델을 나타낸다.
도 10은 Proteinase K 발효액의 탄소원인 글리세롤 농도의 발리데이션 검량식 모델을 나타낸다.
도 11은 Proteinase K 발효액의 탄소원인 메탄올(Methanol) 농도 스펙트럼의 선택 영역(Calibration, Wavenumber: cm-1)을 나타낸다.
도 12는 Proteinase K 발효액의 탄소원인 메탄올 농도 측정 스펙트럼(1차 미분)을 나타낸다.
도 13은 Proteinase K 발효액의 탄소원인 메탄올 농도의 켈리브레이션 검량식 모델을 나타낸다.
도 14는 Proteinase K 발효액의 탄소원인 메탄올 농도의 발리데이션 검량식 모델을 나타낸다.
도 15는 Proteinase K 발효액의 균체 생육도를 나타내는 흡광도(Optical density) 스펙트럼의 선택 영역(Calibration, Wavenumber: cm-1)을 나타낸다.
도 16은 Proteinase K 발효액의 균체 생육도를 나타내는 흡광도 측정 스펙트럼(1차 미분)을 나타낸다.
도 17은 Proteinase K 발효액의 균체 생육도를 나타내는 흡광도의 켈리브레이션 검량식 모델을 나타낸다.
도 18은 Proteinase K 발효액의 균체 생육도를 나타내는 흡광도의 발리데이션 검량식 모델을 나타낸다.
도 19는 근적외선 분광분석기를 발효조에 연결하여 온라인 상태에서 Proteinase K 농도, 탄소원인 글리세롤과 메탄올 농도, 균의 생육을 나타내는 흡광도(OD) 경향을 검량식 모델로 모니터링하고 탄소원의 농도를 관리하기 위해 탄소원인 글리세롤과 메탄올을 실시간으로 자동 투입하고 컨트롤한 결과를 나타낸다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
본 발명의 일 태양에 따르면, 미생물 발효에 의한 단백질 생산 공정을 실시간 제어하는 방법으로서, (i) 하나 이상의 발효액 성분 지표의 각각에 특이적인 둘 이상의 근적외선 파장 영역을 이용하여 얻은 검량 모델을 제공하는 단계, 및 (ii) 상기 둘 이상의 근적외선 파장 영역의 광원으로 상기 발효액 성분 지표 각각의 변화를 모니터링하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.
본 발명자들은, 단백질 생산을 위한 미생물 발효 시 발효액에 존재하는 미생물, 단백질, 배지 성분 등과 같은 하나 이상의 발효액 성분을 실시간으로 모니터링 및/또는 제어하기 위한 방법을 개발하기 위해 예의 노력한 결과, 각 발효액 성분을 특이적으로 검출/검량할 수 있는 둘 이상의 근적외선 파장 영역을 밝혀내고, 상기 둘 이상의 근적외선 파장 영역을 사용하여 발생하는 각 성분의 전기적 신호를 수치화할 수 있는 검량 모델을 구축함으로써 본 발명을 완성하였다.
상기 방법은 상기 모니터링을 통해 발생하는 각 성분 지표의 전기적 신호에 대응하여 발효 공정을 실시간 제어하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 모니터링은 프로브(probe) 형태로 발효관에 부착된 근적외선 분광분석기를 통해 수행될 수 있다.
일 구현예에서, 상기 모니터링은 발효액의 샘플링 없이 인 시투(in situ)로 수행될 수 있다.
상기 근적외선 분광분석기는 프로브 형태로 발효관에 부착되어, 샘플링 없이 상기 단백질 발효액 성분 지표의 변화가 모니터링될 수 있다. 예를 들어, 외부 환경으로의 유출이 바람직하지 않은 유전자 변형 미생물 균주가 사용되는 경우, 발효관에 밀폐 상태로 연결된 근적외선 분광분석기 프로브를 측정 센서로 사용하여 발효액 성분 지표를 모니터링하는 밀폐 공정 관리(Contained process control)인 온탱크(On-Tank) 또는 인라인(In-Line) 무샘플링 발효 공정 분석 관리가 이용될 수 있다.
상기 미생물은 탄소원으로부터 발효를 통해 단백질을 생산할 수 있는 한 어떠한 미생물이라도 포함될 수 있다. 예를 들어, 상기 미생물은 LMO(Living modified organisms)를 포함하는 유전자 변형 생물체(GMO)에 속하는 미생물일 수 있다. 구체적으로 상기 미생물은 박테리아 또는 효모일 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 미생물은 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)일 수 있다.
상기 단백질은 미생물이 생산하거나 재조합 기술에 의해 생산할 수 있도록 조작된 임의의 단백질을 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 상기 단백질은 Proteinase K일 수 있다.
상기 단백질의 생산을 위한 미생물 발효의 탄소원으로 글리세롤, 메탄올, 또는 이들의 조합이 사용될 수 있다.
상기 미생물 발효는 회분식, 연속식 또는 유가식 배양일 수 있다. 바람직하게는 상기 미생물 발효는 연속식 또는 유가식 배양일 수 있다.
상기 미생물 발효에서 모니터링이 필요한 발효액 성분은 미생물 발효에 사용되는 미생물, 탄소원, 질소원, 다른 유기 성분, 무기 성분, 생산하고자 하는 단백질일 수 있다. 상기 발효액 성분 지표는 상기 발효액 성분의 발효액 내 농도 변화를 알 수 있는 임의의 지표일 수 있다. 예컨대, 발효액에 존재하는 각 성분의 농도일 수 있다. 미생물의 경우, 미생물의 생육도 또는 농도를 나타내는 흡광도일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 미생물 발효는 Proteinase K 생산을 위한 효모의 연속식 또는 유가식 배양에 의해 이루어질 수 있다. 상기 미생물 발효의 탄소원으로는 글리세롤 및 메탄올이 사용될 수 있다.
이 때, 상기 발효액 성분 지표는 Proteinase K 농도, 글리세롤 농도, 메탄올 농도, 및 미생물 생육도(흡광도)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있다.
본 명세서에 사용된 근적외선 파장은, 가시광선과 중적외선 사이에 존재하는 800 내지 2500 nm(12,000 내지 4,000 cm-1)의 근적외선(Near Infrared, NIR) 영역의 파장을 의미한다.
상기 방법에서 검량 모델의 제공 또는 모니터링은 근적외선 분광분석기를 이용하여 수행될 수 있다.
상기 검량 모델의 제공 또는 모니터링을 위해 하나의 발효액 성분 지표에 대해 둘 이상의 근적외선 파장 영역을 조합하여 사용할 수 있다. 구체적으로, 하나의 발효액 성분 지표의 검량 모델을 제공하거나 모니터링하기 위해 2개의 근적외선 파장 영역을 조합하여 사용하는 것이 바람직할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 둘 이상의 파장 영역은 상기 Proteinase K 농도의 경우 9403.5 내지 7498.1 cm-1의 파장 영역 및 6101.9 내지 5446.2 cm-1의 파장 영역을 포함하고; 상기 글리세롤 농도의 경우 8886.7 내지 7745.0 cm-1의 파장 영역 및 5870.4 내지 5420.0 cm-1의 파장 영역을 포함하고; 상기 메탄올 농도의 경우 8457.7 내지 7498.1 cm-1의 파장 영역 및 6101.9 내지 5446.2 cm-1의 파장 영역을 포함하고; 상기 미생물 생육도의 경우 8535.3 내지 7503.4 cm-1의 파장 영역 및 5797.2 내지 5439.5 cm-1의 파장 영역을 포함할 수 있다.
상기 방법에 사용되는 검량 모델은, (a) 상기 발효액의 시료를 일정 시간 간격으로 n개 채취하는 단계, (b) 채취된 n개 시료 중 m개 시료에 대해 근적외선 분광분석기를 이용하여 칼리브레이션(Calibration)용 원시 스펙트럼을 측정하는 단계, (c) 상기 원시 스펙트럼이 측정된 m개 시료에 대해 이화학적 표준 분석을 수행하는 단계, (d) 단계 (b)에서 측정된 원시 스펙트럼을 통계학적으로 전처리하는 단계, (e) 단계 (d)에서 전처리된 스펙트럼 중 정량하고자 하는 하나 이상의 발효액 성분 지표 각각에 특이적인 둘 이상의 근적외선 파장 영역을 선별하고, 선별된 영역의 스펙트럼으로부터 화학계량학(Chemometrics)을 통해 칼리브레이션 검량 모델을 구축하는 단계, 및 (f) 상기 원시 스펙트럼 측정에 사용되지 않은 n-m개 시료를 단계 (e)에서 개발된 칼리브레이션 검량식 모델에 적용하여 얻은 결과를, 단계 (c)에서 얻은 상기 이화학적 표준 분석 결과와 비교하여 검정하고 최적화하는 단계를 포함하는 방법에 의해 얻어질 수 있다.
상기 n 및 m은 자연수이고, n은 m보다 큰 자연수이다. 바람직하게는, 상기 n 및 m은 50 이상, 100 이상, 150 이상, 200 이상, 250 이상, 300 이상, 350 이상, 400 이상, 450 이상, 500 이상의 자연수일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 검량 모델의 정확도를 증가시키기 위해 그보다 큰 자연수일 수 있다.
또한 상기 n 및 m의 차이는 10 이상, 50 이상, 100 이상, 150 이상, 200 이상, 250 이상 또는 300 이상일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
상기 n 및 m은 통계 처리를 위해 검량 모델을 도출해 내기 위해 적합하게 큰 수인 것으로, 통상의 기술자에 의해 용이하게 선택되어 사용될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 "화학계량학"이란 스펙트럼이나 크로마토그램과 같은 다양한 분석화학 데이터에서 원하는 정보를 도출하여 정성 및 정량분석을 가능하게 하는 수학적 통계 알고리즘을 총칭하는 것이다. 화학계량학에서는 주로 다변량 분석(Multivariate analysis)이 사용될 수 있다. 다변량 분석은 단변량 분석과는 대조되는 방법으로 여러 개의 독립변수에 대한 여러 개의 종속변수를 동시에 분석하는 통계적 기법이다. 화학계량학의 통계적 분석에는 다중선형회귀분석법(Multiple Linear Regression, MLR), 주성분회귀분석법(Principl Component Regression, PCL), 부분최소자승법(Partial Least Squares, PLS), 변형부분최소자승법(Modified Partial Least Squares, MPLS) 등이 사용될 수 있고, 특히, 부분최소자승법(Partial Least Squares, PLS)가 사용될 수 있다.
본 명세서에서, 용어 "부분최소자승법(PLS)"은 "부분최소자승회귀분석법(Partial least square regression, PLSR)"이라는 용어와 상호 교환적으로 사용될 수 있다.
상기 검량 모델을 통해, 미생물 발효 과정에서 변화되는 시시각각 변화하는 발효액 성분 지표들 각각의 변화를 실시간 모니터링하는 것이 가능하고, 상기 발효 공정이 실시간으로 자동 제어될 수 있다.
본 발명의 다른 태양에 따르면, 미생물 발효에 의해 단백질을 생산하기 위한 발효 시스템으로서, (i) 하나 이상의 발효액 성분 지표의 변화를 모니터링하기 위해 상기 발효액 성분 지표 각각에 특이적인 둘 이상의 근적외선 파장 영역을 이용하여 얻은 검량 모델을 포함하고 미생물 발효에 의한 단백질 생산 공정을 실시간 모니터링 및 제어하는 컨트롤부를 포함하는 발효 시스템이 제공된다.
일 구현예에서, 상기 발효 시스템은 (ii) 미생물 발효를 위한 발효부 및 (iii) 근적외선 분광분석부를 추가로 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 컨트롤부는 상기 하나 이상의 발효액 성분 지표의 변화를 모니터링하여 발생하는 각 성분 지표의 전기적 신호에 대응하여 발효 공정을 실시간으로 자동 제어할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 발효부는 미생물 발효를 위해 필요한 발효조, 교반기, 배양액 공급 관, 가스 관 등 미생물 발효를 위해 당업계에 공지된 임의의 수단, 장치 등을 포함할 수 있으며 이에 제한되지 않는다.
일 구현예에서, 상기 근적외선 분광분석부는 발효부에 프로브 형태로 장착되어 있을 수 있다. 상기 근적외선 분광분석기는 프로브 형태로 발효관에 부착되어, 샘플링 없이 상기 단백질 발효액 성분 지표의 변화가 실시간 모니터링될 수 있다. 예를 들어, 외부 환경으로의 유출이 바람직하지 않은 유전자 변형 미생물 균주가 사용되는 경우, 발효관에 밀폐 상태로 연결된 근적외선 분광분석기 프로브를 측정 센서로 사용하여 발효액 성분 지표를 모니터링하는 밀폐 공정 관리(Contained process control)인 온탱크(On-Tank) 또는 인라인(In-Line) 무샘플링 발효 공정 분석 관리 시스템이 이용될 수 있다.
일 구현예에서, 상기 발효 시스템은 밀폐식일 수 있다. 예컨대, 상기 발효 시스템은 온탱크(On-tank) 측정 설비를 통해 미생물 발효에 의한 단백질 생산 공정의 발효 상태를 확인할 수 있다.
상기 미생물은 탄소원으로부터 발효를 통해 단백질을 생산할 수 있는 한 어떠한 미생물이라도 포함될 수 있다. 예를 들어, 상기 미생물은 LMO(Living modified organisms)를 포함하는 유전자 변형 생물체(GMO)에 속하는 미생물일 수 있다. 구체적으로 상기 미생물은 박테리아 또는 효모일 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 미생물은 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 발효액 성분 지표는 Proteinase K 농도, 글리세롤 농도, 메탄올 농도, 및 미생물 생육도(흡광도)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있다. 예컨대, 상기 하나 이상의 발효액 성분 지표는 미생물 생육을 위한 탄소원인 글리세롤 농도를 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 둘 이상의 파장 영역은 상기 Proteinase K 농도의 경우 9403.5 내지 7498.1 cm-1의 파장 영역 및 6101.9 내지 5446.2 cm-1의 파장 영역을 포함하고; 상기 글리세롤 농도의 경우 8886.7 내지 7745.0 cm-1의 파장 영역 및 5870.4 내지 5420.0 cm-1의 파장 영역을 포함하고; 상기 메탄올 농도의 경우 8457.7 내지 7498.1 cm-1의 파장 영역 및 6101.9 내지 5446.2 cm-1의 파장 영역을 포함하고; 상기 미생물 생육도의 경우 8535.3 내지 7503.4 cm-1의 파장 영역 및 5797.2 내지 5439.5 cm-1의 파장 영역을 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 근적외선 분광분석부는, 상기 실시간 모니터링 시에, 상기 Proteinase K 농도의 경우 9403.5 내지 7498.1 cm-1의 파장 영역 및 6101.9 내지 5446.2 cm-1의 파장 영역을 포함하고; 상기 글리세롤 농도의 경우 8886.7 내지 7745.0 cm-1의 파장 영역 및 5870.4 내지 5420.0 cm-1의 파장 영역을 포함하고; 상기 메탄올 농도의 경우 8457.7 내지 7498.1 cm-1의 파장 영역 및 6101.9 내지 5446.2 cm-1의 파장 영역을 포함하고; 상기 미생물 생육도의 경우 8535.3 내지 7503.4 cm-1의 파장 영역 및 5797.2 내지 5439.5 cm-1의 파장 영역을 포함하는 파장 영역의 광원을 방출하도록 셋팅될 수 있다.
도 1을 참조하면, 상기 컨트롤부는 상기 발효부와 유선 또는 무선 통신으로 연결되어 있어서 근적외선 분광분석부로부터 방출된 상기 파장 영역의 광원을 통하여 얻은 발효부 내 발효액 성분 지표의 전기적 신호를 수신하여 기 확립된 검량 모델에 의해 전환된 발효액 성분 지표를 모니터링하고, 그에 대응하여 탄소원 공급 등을 실시간 제어할 수 있다.
상기 발효 시스템에 관한 용어, 미생물 발효, 생산되는 단백질, 발효액 성분 지표, 검량 모델 등에 대해서는 상기 미생물 발효에 의한 단백질 생산 공정을 실시간 제어하는 방법에 관한 설명을 참조할 수 있다.
이상 설명된 본 발명에 따른 구현예들은 다양한 컴퓨터 구성요소를 통하여 수행될 수 있는 프로그램 명령어의 형태로 구현되어 비일시성의 컴퓨터 판독 가능한 기록 매체에 기록될 수 있다. 상기 비일시성의 컴퓨터 판독 가능한 기록 매체는 프로그램 명령어, 데이터 파일, 데이터 구조 등을 단독으로 또는 조합하여 포함할 수 있다. 상기 비일시성의 컴퓨터 판독 가능한 기록 매체에 기록되는 프로그램 명령어는 본 발명을 위하여 특별히 설계되고 구성된 것들이거나 컴퓨터 소프트웨어 분야의 당업자에게 공지되어 사용 가능한 것일 수도 있다. 비일시성의 컴퓨터 판독 가능한 기록 매체의 예에는, 하드 디스크, 플로피 디스크 및 자기 테이프와 같은 자기 매체, CD-ROM, DVD와 같은 광기록 매체, 플롭티컬 디스크(floptical disk)와 같은 자기-광 매체(magneto-optical media), 및 ROM, RAM, 플래시 메모리 등과 같은 프로그램 명령어를 저장하고 수행하도록 특별히 구성된 하드웨어 장치가 포함된다. 프로그램 명령어의 예에는, 컴파일러에 의해 만들어지는 것과 같은 기계어 코드뿐만 아니라 인터프리터 등을 사용해서 컴퓨터에 의해서 실행될 수 있는 고급 언어 코드도 포함된다. 상기 하드웨어 장치는 본 발명에 따른 처리를 수행하기 위해 하나 이상의 소프트웨어 모듈로서 작동하도록 구성될 수 있으며, 그 역도 마찬가지이다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.
이제 본 발명에 적용된 주요 관리인자의 검량식 모델 개발을 위한 공정을 Proteinase K 발효를 예로 들어 구체적으로 설명한다.
(P1) Proteinase K 발효액 중의 Proteinase K 농도, 탄소원인 글리세롤과 메탄올 농도 및 균체 생육도(흡광도) 관련 근적외 흡수 스펙트럼의 획득
연속적으로 진행되는 Proteinase K 발효 공정의 발효액 시료를 일정 시간 간격(2시간 간격)으로 순차적으로 300개를 채취한 후 그 중 200개의 시료를 근적외선 분광분석기를 이용하여 12,000 cm-1 내지 4,000 cm-1의 전파장 영역에서 2 nm의 일정한 파장 단위로 스캐닝하여 원시 스펙트럼을 얻었다. 이때 광원의 통과 거리는 2 mm이고 측정 모드는 투과반사(Transmission reflection) 모드였으며, FT-NIR 기기는 매트릭스 에프 FT-NIR(FT-NIR Matrix-F Bruker Optics: 독일)을 사용하였다. 동일한 상기 시료 200개를 이화학적 표준 분석 방법을 이용하여 탄소원인 글리세롤 농도는 고속액체크로마토그래피(HPLC) 방법으로, 또 다른 탄소원인 메탄올 농도는 가스크로마토그래피(GC)로, Proteinase K(Protein) 농도는 Bradford Protein Assay (Kit)방법으로 균체 생육도의 측정은 분광광도계를 사용하여 600 nm에서 측정하여 검량식 모델 개발을 위한 표준 시료 분석치로 활용하였다. 상기 발효액의 시료는 페드 베치(Fed Batch)로 진행되는 발효액을 2시간 단위로 순차적으로 채취하여 사용할 수 있으며 검량식의 광범위화 및 유의적인 검량식 모델 개발을 위하여 300개의 시료를 채취하였으며 본 발명에서는 발효 사이클당 24 내지 30개의 샘플을 채취하였고, 각 발효액 당 200개의 시료를 칼리브레이션 검량식 모델(Calibration Model) 개발을 위한 원시 스펙트럼 측정용으로 사용하였고 나머지 100개의 시료는 발리데이션 검량식 모델(Validation Model)의 검정용 시료로 활용하였다. 300개의 시료는 발효 공정에 전체에 골고루 분포된 시료로 선별하였다.
(P2) 시료의 이화학적 표준 분석
Proteinase K 발효 1회 운전(발효배지에 Proteinase K 생산 균주를 접종한 후 생육과 목적 생산물질의 원료인 탄소원(글리세롤과 메탄올)을 추가하면서 일정 시간 발효하는 전체 발효 공정) 시 약 25 배치(총 200개)의 시료를 채취하여 이화학적 표준 분석을 실시하였다. 시료 30 ml를 채취하여 10 ml는 FT-NIR의 스펙트럼을 즉시 측정하고 나머지 시료는 냉장 보관하였다. 상기 냉장 보관 시료를 상온에서 용해한 후 기존의 표준 분석기를 활용하여 각각 분석하였다. 즉, Proteinase K 농도는 Bradford Protein Assay (Kit)법, 탄소원인 글리세롤 농도는 고속액체크로마토그래피(LC) 방법으로, 메탄올 농도는 가스크로마토그래피(GC)로, 균체 생육도의 측정은 분광분석기를 사용하여 600 nm에서 측정하여 FT_NIR 검량식 모델 개발을 위한 표준 분석치로 활용하였다.
(P3) 원시 스펙트럼의 전처리(Preprocessing)
상기 (P1)에서 확보한 발효액의 원시 스펙트럼으로부터 정확한 정량 검량식 모델을 구하기 위해서 기기 조건과 시료의 변화에 따른 스펙트럼의 변수 제거 및 측정 스펙트럼에 포함된 노이즈를 제거하여야 한다. 스펙트럼의 보정 및 전처리는 BRUKER사 OPUS Quantitative Method(독일) 프로그램을 사용하였다. 이와 같은 전처리는 원시 스펙트럼이 가지고 있는 노이즈를 제거하고 바탕선을 일치시켜 견고하고 정확도와 재현성 높은 검량식 모델 개발에 필요한 양질의 스펙트럼을 확보하기 위해서 필요한 과정이다.
본 발명에서는 투과반사 스펙트럼에 일반적으로 적용하는 1차 미분법, 2차 미분법, 노리스-윌리암스 미분 (Norris-Williams derivatives), 사비즈키-골래이 미분법 (Savitzky-Golay polynomial derivatives)중 1차 미분법을 적용시켜 원시 스펙트럼을 수학적 전처리(Math treatment)하여 노이즈를 제거하고 바탕선을 일치시켜 스펙트럼의 유용 정보의 활용도를 증진시켜 보다 정확하고 재현성 있는 검량식 모델 개발용 전처리 스펙트럼을 선택하여 활용하였다.
(P4) 전처리된 스펙트럼의 영역 선별과 회귀분석을 통한 칼리브레이션 검량식 모델 개발
본 발명에서 이용되는 발효 공정액의 경우 많은 불순물과 이물질이 함유되어 있어 정량하려는 성분의 스펙트럼이 특이한 특정 파장 영역을 선별하고 이 선별된 영역의 스펙트럼으로부터 화학계량학을 통해 칼리브레이션 검량식 모델을 개발하게 된다. 이때, 적용가능한 화학계량학의 통계적인 분석방법은 다중선형회귀분석법(Multiple Linear Regression, MLR), 주성분회귀분석법(Principl Component Regression, PCL), 부분최소자승법(Partial Least Squares, PLS), 변형부분최소자승법(Modified Partial Least Squares, MPLS) 등의 방법이 있으며 본 발명은 그 중 부분최소자승법(PLS)을 이용하여 검량식 모델 개발을 수행하였다. 최적의 칼리브레이션 검량식 모델의 선별은 예측 표준편차(Standard error of Calibration, SEC), 상관계수(Coefficient of determination in calibration, R2) 등의 통계치를 이용하여 선택하였다.
(P5) 선택된 칼리브레이션 검량식 모델의 검정 및 최적화
선택된 칼리브레이션 검량식 모델의 분석하고자하는 새로운 시료에 대한 적용 가능성을 검증하기 위하여 칼리브레이션 검량식 모델에 분석 시료로 사용하지 않은 새로운 100개의 검정용 시료의 스펙트럼을 적용하여 얻은 결과를 이화학적 표준 분석 결과를 비교하여 검정하였다. 칼리브레이션 검량식 모델의 적용성 검정은 SEP(Standard error of prediction), R2(Coefficient of determination in prediction), Bias(Average difference between reference and NIR values)와 SD(Standard deviation) 등의 통계치를 이용하여 채택한 칼리브레이션 검량식 모델에 미지시료(100개)를 적용하여 정확성과 재현성을 교차 검정하였다. 상기와 같이 최적화된 최종의 발리데이션 검량식 모델(Validation model)을 활용하는 경우, 본 발명에서 분석하고자 하는 발효액의 Proteinase K 농도, 탄소원인 글리세롤과 메탄올농도, 균체 생육도인 흡광도 등을 실시간으로 동시에 정확하고 재현성있게 측정할 수 있고 그 측정 시간도 기존의 이화학적 분석 방법과 비교할 수 없을 정도로 신속한 수초내에 완료되어 상기의 4가지 분석항목인 Proteinase K 농도, 글리세롤과 메탄올 농도, 균체 생육도인 흡광도를 10여초 이내에 500회의 전파장을 스캐닝한 후 평균을 구하여 1회의 스펙트럼으로 측정하여 다양한 물질 농도를 실시간 모니터링할 수 있음을 확인하였다.
(P6) 공정 자동화를 통한 시간 발효 공정의 제어 관리
이와 더불어 FT-NIR에 의한 발효 공정의 실시간 동시 다중 물질분석 시 발생하는 각 성분 농도의 고유 전기적 신호를 자동화 시스템으로 연결시켜 생산성 향상을 위해 공급되는 탄소원인 글리세롤과 메탄올의 배지 내 농도를 설정하여 주면 배양액 내의 생산성 향상의 핵심 원료 공급을 자동으로 관리할 수 있게 되어 미생물이 목표 생산물질을 최대로 생산할 수 있는 환경을 조성해 줄 수 있다. 따라서, 이러한 방법은 생산성 향상은 물론 발효 공정의 실시간 제어관리에 활용될 수 있어 지금까지 불가능했던 실시간 발효 자동 제어가 가능한 획기적인 방법임을 확인할 수 있었다.
실시예 1. 미생물을 이용한 Proteinase K 발효액 내 Proteinase K 농도의 측정 방법 개발
실시예 1.1. FT-NIR의 설치 및 시료의 채취
발효관의 발효 상태를 온라인으로 실시간 측정하여 모니터링하고 이때 발생하는 각각의 신호를 전기적으로 변환시켜 발효 공정 제어에 활용하기 위해 발효관에 NIR 프로브를 직접 설치하고 기존의 발효 공정 관리용 컴퓨터와 연결하여 NIR의 측정 신호를 발효 공정제어에 사용할 수 있도록 Proteinase K 발효 공정 모니터링과 제어 시스템을 구성하였다(도 1 참조).
연속적으로 진행되는 발효 공정의 FT-NIR의 원시 스펙트럼을 측정하면서 이화학적 표준 분석을 수행하기 위해, 시료를 1 내지 2시간 간격으로 약 30 ml씩 채취하였으며 본 시료의 일부(10 ml)는 발효 경시별 스펙트럼 측정용으로 사용하고 나머지는 즉시 냉장하여 이화학적 표준 분석용 시료로 사용하였다. 시료는 10 내지 15회 발효 배양 기간 동안 채취하였으며, 시료의 수는 300개로 필요 시 반복 발효 실험을 실시하여 더 많은 시료를 채취하여 사용하였다.
실시예 1.2. 원시 스펙트럼의 측정 및 시료의 이화학적 표준 분석
실시예 1.2.1. 시료의 스펙트럼 측정
발효관 1회 가동(발효용 배지에 균주를 접종하여 130시간 페드 배치 배양(Fed Batch Culture)의 전체 공정) 시 약 25 내지 30개의 시료를 채취하였으며 시료의 일부(10 ml)를 FT-NIR로 12,000 cm-1에서 4,000 cm-1의 전 파장 영역에서 빔(Beam) 통과 거리 2 mm, 파장 간격 2 nm 스펙트럼의 측정 모드는 투과반사 모드로 설정하여 원시 스펙트럼을 측정, 수집하였다(도 2). 이때, NIR 기기는 매트릭스 에프 FT-NIR(FT-NIR Matrix-F Bruker Optics; 독일)을 사용하였다. 또한, 도면에 도시된 모든 스펙트럼에서, x축은 파수(Wavenumber: cm-1)를 나타내고, y축은 흡광 단위(Absorbance Unit)를 나타낸다.
실시예 1.2.2. Proteinase K 농도의 이화학적 표준 분석
냉장 보관중인 시료를 상온으로 용해한 후 Proteinase K 농도를 분석하는 Bardford Protein Assay Kit를 활용하여 각각의 농도를 분석하였다.
실시예 1.3. Proteinase K 스펙트럼 영역의 선별 및 칼리브레이션 검량식 모델의 개발
상기 실시예 1.2에서 측정된 Proteinase K 농도 원시 스펙트럼 및 시료 Proteinase K 농도의 이화학적 표준 분석결과를 상기 (P2), (P3) 및 (P4)에 언급한 방법으로 처리하여 칼리브레이션 검량식 모델을 도출하였다. 더 구체적으로 설명하면, 먼저 300개 시료의 원시 스펙트럼을 1차 미분으로 전처리하여 안정적인 스펙트럼을 얻고(도 3 참조), Proteinase K에 특이적인 스펙트럼 영역, 즉, 도 4에 나타낸 바와 같은 2가지 파장 영역을 선별하여 칼리브레이션 검량식 모델의 개발을 추진하였다. 칼리브레이션 검량식 모델 개발을 위해 사용한 화학계량학 방법은 PLS였으며 최적의 칼리브레이션 검량식 모델은 예측 표준편차(SEC), 상관계수(R2) 등의 통계치를 이용하여 선택하였다. 이렇게 개발된 칼리브레이션 검량식 모델 곡선은, 도 5에 나타난 바와 같이 Y축은 발효액 내의 Proteinase K 농도의 FT-NIR 분석치이고, X축은 Bardford Protein Assay Kit로 분석하여 얻어진 Proteinase K 농도의 표준 분석치로 매우 높은 수준의 상관관계가 있음을 알 수 있다.
실시예 1.4. 개발된 Proteinase K 칼리브레이션 검량식 모델의 검정
200개 시료의 스펙트럼을 이용하여 개발된 칼리브레이션 검량식 모델이 칼리브레이션 검량식 모델 개발에 사용하지 않은 새로운 시료에 대해 적용 가능한지를 검정하기 위해 기준비된 100개의 새로운 시료의 스펙트럼과 이화학적 표준 분석 방법에 의한 Proteinase K 농도를 대입, 비교 검정하고, 그 결과를 도 6(X축과 Y축은 도 5에 대해 설명한 바와 같음)과 표 1에 나타냈다.
도 6과 표 1로부터 알 수 있는 바와 같이 R2 값, RMSEE 값, Bias 값 등은 통계적인 유의차가 없는 것으로 확인되었다. 즉, FT-NIR에 의해 측정된 분석 결과와 표준 이화학적 분석 결과가 매우 유사하여 발리데이션 검량식 모델의 개발이 성공적으로 이루어졌으며 이를 활용하면 발효액 중의 Proteinase K 농도가 정확하고 재현성 있게 측정됨을 확인할 수 있어 기존의 오프라인 분석방법(Bardford Protein Assay Kit 방법)을 대체할 수 있는 FT-NIR에 의한 발효액 중의 Proteinase K 농도의 실시간 연속 모니터링 방법의 개발을 완수하게 되었다.
| R2 | RMSEE | RPD | Bias | Offset | Slop | Corr.Coeff | |
| Calibration | 99.26 | 14.2 | 11.9 | - | 1.655 | 0.993 | 0.9965 |
| Validation | 98.62 | 17.2 | 9.61 | -0.149 | 1.990 | 0.992 | 0.9946 |
실시예 2. 미생물을 이용한 Proteinase K 발효액 내 글리세롤(탄소원) 농도의 측정 방법 개발
실시예 2.1. FT-NIR의 설치 및 시료의 채취
실시예 1.1과 동일한 방법으로 실시하였다. 이때, 사용된 시료는 실시예 1과 동일한 시료이다.
실시예 2.2. 스펙트럼의 측정과 전처리 및 글리세롤 농도의 이화학적 분석
실시예 1과 동일한 방법으로 실시하였고, 글리세롤 농도 분석용 원시 스펙트럼도 Proteinase K 농도 분석용 원시 스펙트럼과 동일한 스펙트럼을 이용하였다. 1차 미분에 의한 원시 스펙트럼의 전처리 또한 Proteinase K 농도 측정용 스펙트럼과 동일한 스펙트럼을 사용하였다. 이는 1회의 스펙트럼 분석으로 여러가지 성분을 동시에 분석할 수 있는 FT-NIR 분석의 최대의 장점과 특성이다.
한편, 본 발명에서 글리세롤은 Proteinase K 발효액의 대표적인 당 성분이며, HPLC를 이용한 사전 분석 결과 Glycerol이 주된 당 성분으로 규정되었다. 상기 글리세롤 농도의 이화학적 표준 분석은 HPLC 분석기(LC_40A. SHIMADZU. JAPAN)를 이용하여 이루어졌다.
실시예 2.3. 글리세롤 스펙트럼 영역의 선별 및 칼리브레이션 검량식 모델의 개발
글리세롤 농도를 측정하기 위한 스펙트럼의 영역을 도 7에 나타난 바와 같이 2가지 파장 영역으로 선택하고, 상기 실시예 2.1 및 실시예 2.2에서 측정된 글리세롤 농도 원시 스펙트럼 및 시료 글리세롤 농도의 이화학적 표준 분석결과를 상기 (P2), (P3) 및 (P4)에 언급한 방법으로 처리하여 칼리브레이션 검량식 모델을 도출하였다(도 8 참조).
칼리브레이션 검량식 모델 개발을 위해 사용한 화학계량학 방법은 PLS였으며 최적의 칼리브레이션 검량식 모델은 예측 표준편차(SEC), 상관 계수(R2) 등의 통계치를 이용하여 선택하였다. 이렇게 개발된 칼리브레이션 검량식 모델 곡선은, 도 9에 나타난 바와 같이 Y축은 발효액 내의 글리세롤 농도의 FT-NIR 분석치이고 X축은 실제 이화학 분석치, 즉, HPLC 분석으로 얻은 글리세롤 농도의 표준 분석치로 매우 높은 수준의 상관관계가 있음을 알 수 있다.
실시예 2.4. 개발된 글리세롤 칼리브레이션 검량식 모델의 검정
200개 시료의 스펙트럼을 이용하여 개발된 칼리브레이션 검량식 모델(도9)이미지의 새로운 시료에 대해 적용 가능한지를 검정하기 위해 기준비된 100개의 새로운 시료의 스펙트럼과 이화학적 표준 분석 방법에 의한 글리세롤 농도를 대입, 비교 검정하고, 그 결과를 도 10(X축과 Y축은 도 9에 대해 설명한 바와 같음)과 표 2에 나타냈다.
도 10과 표 2로부터 알 수 있는 바와 같이 R2 값, RMSEE값, Bias 값 등은 통계적인 유의차가 없는 것으로 확인되었다. 즉, FT-NIR에 의해 측정된 분석 결과와 표준 이화학적 분석 결과가 매우 유사하여 발리데이션 검량식 모델의 개발이 성공적으로 이루어졌으며, 이를 활용하면 발효액 중의 글리세롤 농도를 정확하고 재현성 있게 측정됨을 확인할 수 있었다. 다시 말하면, 이화학적 표준 분석치와 FT_NIR에 의한 분석치가 매우 높은 유의적 상관관계를 나타내고 있어 FT-NIR로 Proteinase K 발효액 중의 글리세롤 농도의 경시적 변화를 실시간으로 모니터링할 수 있는 것으로 확인되었다. 따라서, 지금까지 발효 현상의 경시적 변화의 실시간 모니터링과 제어의 가장 큰 문제 중의 하나였던 당의 모니터링과 제어가 해결됨에 따라 Proteinase K 발효의 실시간 모니터링과 자동 제어 공정의 개발이 가능하게 되었다.
| R2 | RMSEE | RPD | Bias | Offset | Slop | Corr.Coeff | |
| Calibration | 99.83 | 0.734 | 24.4 | - | 0.022 | 0.998 | 0.9992 |
| Validation | 99.73 | 0.889 | 19.2 | -0.00494 | 0.039 | 0.997 | 0.9986 |
실시예 3. 미생물을 이용한 Proteinase K 발효액 내 메탄올(탄소원) 농도의 측정 방법 개발
실시예 3.1. FT-NIR의 설치 및 시료의 채취
실시예 1.1과 동일한 방법으로 실시하였다. 이때, 사용된 시료는 실시예 1과 동일한 시료이다.
실시예 3.2. 스펙트럼의 측정과 전처리 및 메탄올 농도의 이화학적 분석
실시예 1과 동일한 방법으로 실시하였고, 메탄올 농도 분석용 원시 스펙트럼도 Proteinase K 농도 분석용 원시 스펙트럼과 동일한 스펙트럼을 이용하였다. 1차 미분에 의한 원시 스펙트럼의 전처리 또한 Proteinase K 농도 측정용 스펙트럼과 동일한 스펙트럼을 사용하였다.
메탄올의 이화학적 표준 분석은 가스크로마토그래피(GC-2010Pluse. SHIMADZU. JAPAN)를 이용하여 분석하였다.
실시예 3.3. 메탄올 스펙트럼 영역의 선별 및 칼리브레이션 검량식 모델의 개발
메탄올 농도를 측정하기 위한 스펙트럼의 영역을 도 11에 나타난 바와 같이 2가지 파장 영역으로 선택하고, 상기 실시예 3.1 및 실시예 3.2에서 측정된 메탄올 농도 원시 스펙트럼 및 시료 메탄올 농도의 이화학적 표준 분석결과를 상기 (P2), (P3) 및 (P4)에 언급한 방법으로 처리하여 칼리브레이션 검량식 모델을 도출하였다(도 12 참조)
칼리브레이션 검량식 모델 개발을 위해 사용한 화학계량학 방법은 PLS였으며 최적의 칼리브레이션 검량식 모델은 예측 표준편차(SEC), 상관 계수(R2) 등의 통계치를 이용하여 선택하였다. 이렇게 개발된 칼리브레이션 검량식 모델 곡선은, 도 13에 나타난 바와 같이 X축은 GC 분석으로 얻어진 메탄올 농도의 표준 분석치이고 Y축은 발효액 내의 메탄올 농도의 FT-NIR 분석치로 매우 높은 수준의 상관관계가 있음을 알 수 있다.
실시예 3.4. 개발된 메탄올 칼리브레이션 검량식 모델의 검정
200개 시료의 스펙트럼을 이용하여 개발된 칼리브레이션 검량식 모델(도 13)이 미지의 새로운 시료에 대해 적용 가능한지를 검정하기 위해 기준비된 100개의 새로운 시료의 스펙트럼과 이화학적 표준 분석 방법에 의한 메탄올 농도를 대입, 비교 검정하고, 그 결과를 도 14(X축과 Y축은 도 13에 대해 설명한 바와 같음)와 표 3에 나타냈다.
도 14와 표 3으로부터 알 수 있는 바와 같이, R2 값, RMSEE 값 등은 통계적인 유의차가 없는 것으로 확인되었다. 즉, FT-NIR에 의해 측정된 분석 결과와 표준 이화학적 분석의 결과가 매우 유사하여 발리데이션 검량식 모델의 개발이 성공적으로 이루어졌으며, 이를 활용하면 발효액 중의 메탄올 농도가 정확하고 재현성 있게 측정됨을 확인할 수 있었다. 다시 말하면, 이화학적 표준 분석치와 FT-NIR에 의한 분석치가 매우 높은 유의적 상관관계를 나타내고 있어 FT-NIR로 Proteinase K 발효액 중의 메탄올 농도의 경시적 변화를 실시간으로 정확하고 재현성 있게 모니터링할 수 있는 것으로 확인되었다. 따라서, 지금까지 발효 현상의 경시적 변화의 실시간 모니터링과 제어의 가장 큰 장벽 중의 하나였던 메탄올 농도의 실시간 측정이 가능해져 Proteinase K 발효 공정의 온라인 실시간 모니터링과 자동 제어 공정 개발이 가능하게 되었다.
| R2 | RMSEE | RPD | Bias | Offset | Slop | Corr.Coeff | |
| Calibration | 99.37 | 0.063 | 12.6 | - | 0.008 | 0.994 | 0.9968 |
| Validation | 98.31 | 0.0984 | 7.69 | -0.0006 | 0.018 | 0.987 | 0.9915 |
실시예 4. 미생물을 이용한 Proteinase K 발효액의 흡광도(OD) 측정 방법 개발
실시예 4.1. FT-NIR의 설치 및 시료의 채취
실시예 1.1과 동일한 방법으로 실시하였다. 이때, 사용된 시료는 실시예 1과 동일한 시료이다.
실시예 4.2. 스펙트럼의 측정과 전처리 및 흡광도의 이화학적 분석
실시예 1과 동일한 방법으로 실시하였고, 흡광도 분석용 원시 스펙트럼도 Proteinase K 농도 분석용 원시 스펙트럼과 동일한 스펙트럼을 이용하였다. 1차 미분에 의한 원시 스펙트럼의 전처리 또한 Proteinase K 농도 측정용 스펙트럼과 동일한 스펙트럼을 사용하였다.
흡광도의 이화학적 표준 분석은 분광분석기(LIBAR S80W BIOCHROM USA)를 사용하여 600 nm에서 수행하였고, 얻어진 값을 표준 분석치로 활용하였다.
실시예 4.3. 흡광도 스펙트럼 영역의 선별 및 칼리브레이션 검량식 모델의 개발
흡광도를 측정하기 위한 스펙트럼의 영역을 도 15에 나타난 바와 같이 2가지 파장 영역으로 선택하고, 상기 실시예 4.1 및 실시예 4.2에서 측정된 흡광도 원시 스펙트럼 및 시료 흡광도의 이화학적 표준 분석결과를 상기 (P2), (P3) 및 (P4)에 언급한 방법으로 처리하여 칼리브레이션 검량식 모델을 도출하였다(도 16 참조)
칼리브레이션 검량식 모델 개발을 위해 사용한 화학계량학 방법은 PLS였으며 최적의 칼리브레이션 검량식 모델은 예측 표준편차(SEC), 상관 계수(R2) 등의 통계치를 이용하여 선택하였다. 이렇게 개발된 칼리브레이션 검량식 모델 곡선은, 도 17에 나타난 바와 같이 Y축은 발효액의 흡광도의 FT-NIR 분석치이고 X축은 실제 이화학 분석치, 즉, 600 nm에서 분광분석기로 얻은 표준 분석치로 균체 생육도를 나타내는 흡광도 측정치도 매우 높은 수준의 상관관계가 있음을 알 수 있다.
실시예 4.4. 개발된 흡광도 칼리브레이션 검량식 모델의 검정
200개 시료의 스펙트럼을 이용하여 개발된 칼리브레이션 검량식 모델(도 17)이 미지의 새로운 시료에 대해 적용 가능한지를 검정하기 위해 기준비된 100개의 새로운 시료의 스펙트럼과 이화학적 표준 분석 방법에 의한 흡광도를 대입, 비교 검정하고, 그 결과를 도 18(X축과 Y축은 도 17에 대해 설명한 바와 같음)과 표 4에 나타냈다.
도 18과 표 4로부터 알 수 있는 바와 같이, R2 값, RMSEE 값, Bias 값 등은 통계적인 유의차가 없는 것으로 확인되었다. 즉, FT-NIR에 의해 측정된 흡광도(OD) 분석치와 표준 이화학적 분석의 결과가 매우 유사하여 발리데이션 검량식 모델의 개발이 성공적으로 이루어졌으며, 이를 활용하여 Proteinase K 발효시 경시적으로 변화하는 균체 생육도를 정확하고 재현성 있게 측정할 수 있는 것으로 확인되었다. 따라서, 지금까지 발효 현상의 경시적 변화의 실시간 모니터링과 제어의 가장 큰 문제 중의 하나인 균체 생육도의 실시간 측정이 가능해져 Proteinase K 발효 공정의 온라인 실시간 모니터링과 자동 제어 공정 개발이 가능하게 되었다.
| R2 | RMSEE | RPD | Bias | Offset | Slop | Corr.Coeff | |
| Calibration | 99.26 | 14.2 | 11.9 | - | 1.655 | 0.993 | 0.9965 |
| Validation | 98.62 | 17.2 | 9.61 | -0.149 | 1.990 | 0.992 | 0.9946 |
실시예 5. FT-NIR을 이용한 Proteinase K 발효 공정의 모니터링과 컨트롤 결과
상기 실시예 1 내지 실시예 4를 통해서 개발된 발효 주요 인자, 즉, Proteinase K(protein)농도, 탄소원인 글리세롤과 메탄올 농도, 균체 생육도를 나타내는 흡광도(OD600nm) 등을 측정할 수 있는 검량식 모델이 장착된 FT-NIR 시스템을 실제 발효 공정에 적용하여 복수의 발효 성분을 동시에 연속적으로 측정하여 모니터링하고 이때 발생하는 전기적 신호를 활용하여 Proteinase K 발효 공정을 실시간으로 제어할 수 있는지 실험하였다. 그 결과를 도 19에 나타냈다.
구체적으로 설명하면, 발효관에 설치된 프로브를 통하여 실시간으로 측정되는 스펙트럼이 검량식 모델을 통해 계산되어 FT-NIR에 의해 Proteinase K 발효액 중의 Proteinase K 농도, 탄소원인 글리세롤과 메탄올 농도, 균체 생육도를 나타내는 흡광도(OD600nm) 등이 실시간으로 정확하고 재현성 있게 분석되어 모니터링될뿐만 아니라 모니터링 시 발생하는 신호를 전기적 신호로 전환하여 기존의 발효 공정 제어 프로그램인 PLC(Programmable logic controller)와 연계하여 발효 공정을 실시간으로 자동 제어할 수 있었다.
또한, 도 19에 나타난 바와 같이, 시료를 오프라인으로 채취 후 이화학적 표준 분석 결과와 FT-NIR의 측정치, 즉, 목적 생산물질인 Proteinase K 농도, 탄소원인 글리세롤과 메탄올 농도, 균체 생육도인 흡광도(OD600nm) 모두가 표준 분석치와 차이가 거의 없는 매우 양호한 분석치를 나타내고 있어, FT-NIR에 의한 Proteinase K 발효 공정의 실시간 모니터링과 그 신호를 이용한 발효 공정의 실시간 자동 제어가 매우 양호하게 진행됨을 확인하였다.
Claims (21)
- 미생물 발효에 의한 Proteinase K의 생산 공정을 실시간 제어하는 방법으로서,
(i) 하나 이상의 발효액 성분 지표의 각각에 특이적인 둘 이상의 근적외선 파장 영역을 이용하여 얻은 검량 모델을 제공하는 단계, 및
(ii) 상기 둘 이상의 근적외선 파장 영역의 광원으로 상기 발효액 성분 지표 각각의 변화를 모니터링하는 단계를 포함하며,
상기 발효액 성분 지표는 Proteinase K 농도, 글리세롤(Glycerol) 농도, 메탄올(Methanol) 농도, 및 미생물 생육도(흡광도)를 포함하고; 상기 둘 이상의 파장 영역은, 상기 Proteinase K 농도의 경우 9403.5 내지 7498.1 cm-1의 파장 영역 및 6101.9 내지 5446.2 cm-1의 파장 영역을 포함하고; 상기 글리세롤 농도의 경우 8886.7 내지 7745.0 cm-1의 파장 영역 및 5870.4 내지 5420.0 cm-1의 파장 영역을 포함하고; 상기 메탄올 농도의 경우 8457.7 내지 7498.1 cm-1의 파장 영역 및 6101.9 내지 5446.2 cm-1의 파장 영역을 포함하고; 상기 미생물 생육도의 경우 8535.3 내지 7503.4 cm-1의 파장 영역 및 5797.2 내지 5439.5 cm-1의 파장 영역을 포함하며; 상기 검량 모델에 의한 상기 발효액 성분 지표 각각의 측정 결과는 이화학적 표준 분석 결과와 비교하여 통계적으로 유의한 차이를 나타내지 않는 것을 특징으로 하는
방법. - 제1항에 있어서,
상기 방법은 상기 모니터링을 통해 발생하는 각 성분 지표의 전기적 신호에 대응하여 발효 공정을 실시간 제어하는 단계를 추가로 포함하는
방법. - 제1항에 있어서,
상기 모니터링은 프로브(probe) 형태로 발효관에 밀폐식으로 부착된 근적외선 분광분석기를 통해 수행되는
방법. - 제1항에 있어서,
상기 모니터링은 발효액의 샘플링 없이 수행가능하여 배양 미생물이 발효 시스템 외부로 유출되지 않는
방법. - 제4항에 있어서,
상기 배양 미생물은 유전자 변형 미생물인
방법. - 제1항에 있어서,
상기 미생물은 효모인
방법. - 제1항에 있어서,
상기 미생물은 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)인
방법. - 미생물 발효에 의해 Proteinase K를 생산하기 위한 발효 시스템으로서,
(i) 하나 이상의 발효액 성분 지표의 변화를 모니터링하기 위해 상기 발효액 성분 지표 각각에 특이적인 둘 이상의 근적외선 파장 영역을 이용하여 얻은 검량 모델을 포함하고 미생물 발효에 의한 단백질 생산 공정을 실시간 모니터링 및 제어하는 컨트롤부를 포함하며,
상기 발효액 성분 지표는 Proteinase K 농도, 글리세롤(Glycerol) 농도, 메탄올(Methanol) 농도 및 미생물 생육도(흡광도)를 포함하고; 상기 둘 이상의 파장 영역은, 상기 Proteinase K 농도의 경우 9403.5 내지 7498.1 cm-1의 파장 영역 및 6101.9 내지 5446.2 cm-1의 파장 영역을 포함하고; 상기 글리세롤 농도의 경우 8886.7 내지 7745.0 cm-1의 파장 영역 및 5870.4 내지 5420.0 cm-1의 파장 영역을 포함하고; 상기 메탄올 농도의 경우 8457.7 내지 7498.1 cm-1의 파장 영역 및 6101.9 내지 5446.2 cm-1의 파장 영역을 포함하고; 상기 미생물 생육도의 경우 8535.3 내지 7503.4 cm-1의 파장 영역 및 5797.2 내지 5439.5 cm-1의 파장 영역을 포함하며; 상기 검량 모델에 의한 상기 발효액 성분 지표 각각의 측정 결과는 이화학적 표준 분석 결과와 비교하여 통계적으로 유의한 차이를 나타내지 않는 것을 특징으로 하는
발효 시스템. - 제8항에 있어서,
(ii) 미생물 발효를 위한 발효부 및
(iii) 근적외선 분광분석부를 추가로 포함하는
발효 시스템. - 제9항에 있어서,
상기 근적외선 분광분석부는 발효부에 프로브 형태로 장착되어 있는
발효 시스템. - 제8항에 있어서,
상기 컨트롤부는 상기 하나 이상의 발효액 성분 지표의 변화를 실시간으로 동시에 모니터링하여 발생하는 각 성분 지표의 전기적 신호에 대응하여 발효 공정을 실시간 자동으로 제어하는
발효 시스템. - 제8항에 있어서,
상기 미생물은 LMO(Living modified organisms) 균주인
발효 시스템. - 제8항에 있어서,
상기 미생물은 효모인 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)인
발효 시스템. - 제9항에 있어서,
상기 발효 시스템은 밀폐식인
발효 시스템. - 제14항에 있어서,
상기 미생물은 상기 발효 시스템 외부로 유출되지 않는
발효 시스템. - 제9항에 있어서,
상기 발효 시스템은 온탱크(On-tank) 또는 인라인(In-Line) 측정 설비를 통해 발효액의 샘플링 없이 미생물 발효에 의한 단백질 생산 공정의 발효 상태를 확인할 수 있는
발효 시스템. - 제8항에 있어서,
상기 글리세롤은 상기 미생물 생육을 위한 탄소원인
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| JP2011196948A (ja) | 2010-03-23 | 2011-10-06 | Yukijirushi Shubyo Kk | 含有成分量推定方法、評価値推定方法、及びこれら方法を実行するためのプログラム |
| KR101605995B1 (ko) * | 2015-08-18 | 2016-04-01 | 충남대학교산학협력단 | 막걸리 품질 예측 분광분석 방법 |
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| KR101544586B1 (ko) | 2013-12-27 | 2015-08-17 | 대한민국(농촌진흥청장) | 근적외선 시스템을 이용한 사료 원료의 메탄 발생량 분석 방법 및 장치 |
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