KR102546423B1 - A cell line for culturing african swine fever virus and vaccine using the same - Google Patents

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Abstract

본 발명은 아프리카돼지열병 바이러스(African swine fever virus, ASFV)를 대량 증식시킬 수 있는 수탁번호 KCTC14568BP로 기탁된 CA-CAS-01-A 세포주 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명의 세포주 및 이로부터 생산되는 ASFV는 아프리카돼지열병의 예방 및 피해 경감에 유용하게 이용될 수 있을 것이다.The present invention relates to a CA-CAS-01-A cell line deposited with accession number KCTC14568BP capable of mass-proliferating African swine fever virus (ASFV) and its use, the cell line of the present invention and production therefrom ASFV will be useful for preventing and reducing damage from African swine fever.

Description

아프리카돼지열병 바이러스 배양을 위한 세포주 및 이를 이용한 백신{A cell line for culturing african swine fever virus and vaccine using the same}Cell line for culturing African swine fever virus and vaccine using the same {A cell line for culturing african swine fever virus and vaccine using the same}

본 발명은 아프리카돼지열병 바이러스 배양을 위한 세포주 및 이를 이용한 백신에 관한 것이다.The present invention relates to a cell line for culturing African swine fever virus and a vaccine using the same.

아프리카돼지열병은 바이러스성 출혈 돼지 전염병으로, 돼지과(Suidae)에 속하는 동물에만 감염되며, 주로 감염된 돼지의 분비물 등에 의해 직접 전파된다. 아프리카돼지열병 바이러스(African swine fever virus, ASFV)는 아프리카돼지열병의 원인체로, 병원성에 따라 보통 고병원성, 중병원성, 저병원성으로 분류된다. 고병원성은 보통 심급성(감염 1~4일 후 돼지가 죽음) 및 급성형(감염 3~8일 후 돼지가 죽음) 질병을, 중병원성 균주는 급성(감염 11~15일 후 돼지가 죽음) 및 아급성형(감염 20일 후 돼지가 죽음) 질병을 일으킨다. 저병원성은 풍토병화된 지역에서만 보고돼 있으며, 준임상형 또는 만성형 질병을 일으킨다. 폐사율은 고병원성 바이러스에 감염된 경우 거의 100%이며 만성형에서는 20% 이하로 알려져 있다. ASFV는 아스파바이러스과(Asfarviridae) 중 1종으로, 이중가닥 DNA를 유전체로 하는 바이러스로서 189,000개 염기쌍 내에 189개가 넘는 유전자와 정20면체의 구조를 가지고 있는 상대적으로 큰 바이러스이며, 23개의 유전형(genotype)을 갖는 것으로 알려졌다.African swine fever is a viral hemorrhagic swine epidemic that infects only animals belonging to the swine family (Suidae), and is mainly transmitted directly by the secretions of infected pigs. African swine fever virus (ASFV) is the causative agent of African swine fever, and is usually classified into highly pathogenic, moderately pathogenic, and low pathogenic according to pathogenicity. Highly pathogenic strains are moderately acute (death of pigs 1-4 days after infection) and acute (death of pigs 3-8 days after infection), severe pathogenic strains are acute (death of pigs 11-15 days after infection) and acute (death of pigs 11-15 days after infection) Causes subacute (pig death 20 days after infection) disease. Low pathogenicity has been reported only in endemic areas and causes subclinical or chronic disease. Mortality is known to be almost 100% when infected with a highly pathogenic virus and less than 20% in the chronic form. ASFV is a virus whose genome is double-stranded DNA, and is a relatively large virus with more than 189 genes within 189,000 base pairs and an icosahedral structure, and has 23 genotypes. is known to have

아프리카돼지열병을 예방 또는 치료하기 위한 백신을 개발하고자 다양한 연구, 예를 들어, 혈액 백혈구, 정제 및 불활성화된 비리온, 감염된 글루타르 알데히드-고정 대식세포, 세제-처리된 감염된 폐포 대식세포의 배양 상등액, DNA 백신, 약독화 생바이러스(attenuated live virus) 백신, 불활화 백신 또는 바이러스 벡터 등을 이용한 백신 개발이 다양한 연구 그룹에 의해 수행되어 왔다. 그러나, ASFV는 유전자형이 다양하고 구조가 복잡하며, 일반적인 세포에 대한 감염이 어려워, 바이러스 감수성이 있는 것으로 알려진 PAM primary cell로 백신 제조를 위한 바이러스를 배양하거나 분리하는 것이 매우 어려운 실정이다. ASFV 조지아주(Georgia stains)가 베로(Vero) 세포주에서 적응(adaptation)되어 증식하는 것으로 알려졌으나, 백신으로서의 방어능은 현저히 떨어지는 것으로 알려졌다. ASFV 스페인주(Spanish strains) 또한 백신으로서 제조하기에는 적합하지 않은 것으로 확인되었다. 일반적으로, ASFV는 추가적인 계대배양을 통하여 바이러스 증식률을 높이는 것이 어렵고, 베로 세포주에서 100계대 이상 적응된 ASFV는 세포에서의 안정성과 증식성은 좋으나 백신화 되었을 때, 실질적인 방어능을 보여주지 못하는 것으로 알려졌다.Various studies to develop a vaccine for preventing or treating African swine fever, e.g. culture of blood leukocytes, purified and inactivated virions, infected glutaraldehyde-fixed macrophages, detergent-treated infected alveolar macrophages Vaccine development using supernatants, DNA vaccines, attenuated live virus vaccines, inactivated vaccines or viral vectors has been performed by various research groups. However, ASFV has a variety of genotypes, a complex structure, and difficulty in infecting general cells, so it is very difficult to culture or isolate the virus for vaccine production using PAM primary cells known to be susceptible to the virus. It is known that ASFV Georgia stains are adapted and proliferated in Vero cell lines, but the protective ability as a vaccine is known to be remarkably low. ASFV Spanish strains were also found to be unsuitable for manufacture as a vaccine. In general, it is difficult for ASFV to increase the virus proliferation rate through additional subculture, and ASFV adapted for more than 100 passages in Vero cell line has good stability and proliferation in cells, but it is known that it does not show substantial protective ability when vaccinated.

한편, 한국공개특허 제2011-0123918호에는 '돼지생식기호흡기증후군 바이러스 분리를 위한 PAM-pCD163 세포주 및 이를 이용한 백신'이 개시되어 있고, 한국공개특허 제2015-0019910호에는 '불멸화된 돼지 신장유래 세포주 및 이를 이용한 돼지써코 바이러스 2형의 증식방법'이 개시되어 있으나, 본 발명의 '아프리카돼지열병 바이러스 배양을 위한 세포주 및 이를 이용한 백신'에 대해서는 기재된 바가 없다.Meanwhile, Korean Patent Publication No. 2011-0123918 discloses 'PAM-pCD163 cell line for isolation of porcine reproductive and respiratory syndrome virus and vaccine using the same', and Korean Patent Publication No. 2015-0019910 discloses 'immortalized porcine kidney-derived cell line'. and a method for propagating porcine circovirus type 2 using the same, but there is no description of the 'cell line for culturing African swine fever virus and vaccine using the same' of the present invention.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 아프리카돼지열병 바이러스(African swine fever virus, ASFV)의 증식이 가능한 세포주를 확립하기 위해, 동물 유래 다양한 신장(kidney) 세포주에 ASFV를 감염시킨 후 계대배양을 지속하며 ASFV의 분리 및 증식여부를 확인한 결과, MA104 세포주(Africa green monkey kidney cell)가 다른 신장 세포주에 비해 10 계대(passage) 이상에서도 ASFV를 지속적으로 증식시킬 수 있음을 확인하였다. 또한, MA104 세포주 유래 단일 세포 클론들 중 ASFV 증식능이 다른 클론들에 비해 우수하며, 자연적으로 약독화된 ASFV를 생산하는 특성이 있는 단일 세포 클론을 확인하였고 이를 CA-CAS-01-A 세포주로 명명함으로써, 본 발명을 완성하였다.The present invention was derived from the above needs, and the present inventors infected ASFV with various animal-derived kidney cell lines in order to establish a cell line capable of propagating African swine fever virus (ASFV). As a result of continued subculture and confirmation of ASFV isolation and proliferation, it was confirmed that the MA104 cell line (Africa green monkey kidney cell) could continuously proliferate ASFV even after 10 passages or more compared to other renal cell lines. . In addition, among the MA104 cell line-derived single cell clones, a single cell clone with superior ASFV proliferative ability compared to other clones and naturally producing attenuated ASFV was identified and named CA-CAS-01-A cell line. By doing so, the present invention was completed.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 아프리카돼지열병 바이러스(African swine fever virus)를 대량 증식시킬 수 있는 수탁번호 KCTC14568BP로 기탁된 CA-CAS-01-A 세포주를 제공한다.In order to solve the above problems, the present invention provides a CA-CAS-01-A cell line deposited with accession number KCTC14568BP capable of mass-proliferating African swine fever virus.

또한, 본 발명은 상기 세포주에 아프리카돼지열병 바이러스를 감염시킨 후 배양하는 단계를 포함하는 아프리카돼지열병 바이러스의 대량 생산 방법을 제공한다.In addition, the present invention provides a method for mass production of African swine fever virus comprising the step of infecting the cell line with African swine fever virus and then culturing it.

또한, 본 발명은 상기 방법으로 생산된 아프리카돼지열병 바이러스를 포함하는 백신 조성물을 제공한다.In addition, the present invention provides a vaccine composition containing the African swine fever virus produced by the above method.

본 발명의 CA-CAS-01-A 세포주는 아프리카돼지열병 바이러스(ASFV)의 분리 및 배양이 가능한 새로운 ASFV 증식용 세포주로, 본 발명의 세포주로부터 생산(중식)되는 ASFV는 병독성이 없는 자연적으로 약독화된 형태로 아프리카돼지열병의 예방 및 피해 경감에 유용하게 이용될 수 있을 것이다.The CA-CAS-01-A cell line of the present invention is a new ASFV propagation cell line capable of isolating and culturing African swine fever virus (ASFV), and ASFV produced (propagated) from the cell line of the present invention is naturally attenuated without virulence It will be useful in the prevention and damage reduction of African swine fever in the form of a localized form.

도 1은 다양한 세포주의 아프리카돼지열병 바이러스(ASFV)에 대한 감수성 결과이다. A는 계대(passage)에 따른 각 세포주별 ASFV 유전자 발현 수준을 확인한 결과이고, B는 1 계대에서 각 세포주의 세포 사진이다. B 이미지 우측 상단의 수치는 각 세포별 감수성을 ASF 바이러스 P72 유전자를 real-time으로 측정하여 Ct값으로 나타낸 것을 가리키며, ASF 바이러스가 감염되어 세포질 내부에 있는 바이러스를 ASF 바이러스 P30 유전자로 확인된 부분을 화살표로 표기하였다.
도 2A는 MA104 모세포 및 MA104 유래 단일 세포 클론들의 ASFV에 대한 감수성을 Ct값과 TCID50으로 확인한 것으로 7 계대에서 분석한 결과이고, 도 2B는 Marc145, Vero 및 COS 세포와 이들의 단일 세포 클론들의 ASFV에 대한 감수성 분석 결과이다. CAS-01 (=CA-CAS-01-A) 및 C1~C12: MA104 단일 세포 클론, M1~3: Marc145 단일 세포 클론, V1 및 V2: Vero 단일 세포 클론, S1 및 S2: COS 단일 세포 클론.
도 3은 ASFV 분리주로 감염된 CA-CAS-01-A 세포주에서 계대에 따른 바이러스 역가를 분석한 TCID50 결과이다.
도 4는 CA-CAS-01-A 세포주에서 국내 분리주 2종(Korea.Pig.Yeoncheon1-FC.2019와 Korea.Pig.Paju1-FC.2019)과 베트남 분리주 1종(Vietam.Pig.Hochiminh-KVL.2019)을 계대배양 후 1, 2, 4, 6, 10 계대에 따른 세포 적응 과정을 ASF 바이러스 P30 유전자를 이용하여 확인한 세포 사진을 보여준다.
도 5는 ASFV 분리주(Korea.Pig.Yeoncheon1-FC.2019)로 감염된 CA-CAS-01-A 세포주에서 생산된 ASFV의 유전체 결손 부위를 보여주는 모식도이다. ASFV.Yc1_FC p1: 1회 계대배양 후 회수된 ASFV, ASFV-CAP-YC p9: 9회 계대배양 후 회수된 ASFV, ASFV-CAP-YC p13: 13회 계대배양 후 회수된 ASFV.
도 6은 CA-CAS-01-A 세포주에서 생산된 ASFV를 접종한 돼지의 체온(A) 및 생존율(B)을 분석한 결과이다.
도 7은 CA-CAS-01-A 세포주에서 생산된 ASFV를 접종한 돼지의 경구 스왑(A), 직장 스왑(B), 비강 스왑(C), 혈청(D) 및 전혈(E)에서 바이러스 역가를 확인한 결과이다.1 is a result of susceptibility to African swine fever virus (ASFV) of various cell lines. A is the result of confirming the ASFV gene expression level for each cell line according to passage (passage), and B is a photograph of cells of each cell line in the first passage. The number on the upper right of image B indicates that the sensitivity of each cell is measured in real-time for the ASF virus P72 gene and expressed as a Ct value. indicated by an arrow.
Fig. 2A shows the susceptibility of MA104 parental cells and MA104-derived single cell clones to ASFV confirmed by Ct value and TCID 50 , and is the result of analysis at 7 passages. This is the result of the sensitivity analysis for CAS-01 (=CA-CAS-01-A) and C1~C12: MA104 single cell clone, M1~3: Marc145 single cell clone, V1 and V2: Vero single cell clone, S1 and S2: COS single cell clone.
Figure 3 is a TCID 50 result of analyzing the virus titer according to passage in the CA-CAS-01-A cell line infected with the ASFV isolate.
Figure 4 shows two domestic isolates (Korea.Pig.Yeoncheon1-FC.2019 and Korea.Pig.Paju1-FC.2019) and one Vietnamese isolate (Vietam.Pig.Hochiminh-KVL) in the CA-CAS-01-A cell line. 2019) after subculture and cell adaptation process according to passages 1, 2, 4, 6, and 10 is shown using the ASF virus P30 gene.
Figure 5 is a schematic diagram showing the genome defect site of ASFV produced in CA-CAS-01-A cell line infected with ASFV isolate (Korea.Pig.Yeoncheon1-FC.2019). ASFV.Yc1_FC p1: ASFV recovered after passage 1, ASFV-CAP-YC p9: ASFV recovered after passage 9, ASFV-CAP-YC p13: ASFV recovered after passage 13.
Figure 6 is the result of analyzing the body temperature (A) and survival rate (B) of pigs inoculated with ASFV produced in the CA-CAS-01-A cell line.
Figure 7 shows the virus titers in oral swabs (A), rectal swabs (B), nasal swabs (C), serum (D) and whole blood (E) of pigs inoculated with ASFV produced in the CA-CAS-01-A cell line. is the result of checking

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 아프리카돼지열병 바이러스(African swine fever virus, ASFV)를 대량 증식시킬 수 있는 수탁번호 KCTC14568BP로 기탁된 CA-CAS-01-A 세포주를 제공한다.In order to achieve the object of the present invention, the present invention provides a CA-CAS-01-A cell line deposited with accession number KCTC14568BP capable of mass-proliferating African swine fever virus (ASFV).

본 발명에 따른 CA-CAS-01-A 세포주는 MA104 세포주(African green monkey kidney cell line) 유래로, ASFV 분리주(야외주)를 MA104 세포에 감염시킨 후 계대배양을 하며 바이러스 증식을 관찰하여, 지속적인 계대배양(~passage 16)에도 ASFV의 증식이 가능한 세포 클론으로부터 확립한 것이다. 또한, 상기 CA-CAS-01-A 세포주는 ASFV 야외주(Korea.Pig.Yeoncheon1-FC.2019)를 감염시켰으나, 생산되는 바이러스인 ASFV-CAP-YC는 자연적으로 약독화된 것이 특징이다. 이에 본 발명자들은 상기 CA-CAS-01-A 세포주를 한국생명공학연구원 생물자원센터에 2021년 05월 12일자로 상기 세포주를 기탁하였다(수탁번호 KCTC14568BP).The CA-CAS-01-A cell line according to the present invention is derived from the MA104 cell line (African green monkey kidney cell line), and after infecting MA104 cells with an ASFV isolate (outdoor strain), the cells are subcultured and viral proliferation is observed, It was established from a cell clone capable of proliferating ASFV even in subculture (~passage 16). In addition, the CA-CAS-01-A cell line infected an ASFV outdoor strain (Korea.Pig.Yeoncheon1-FC.2019), but the produced virus, ASFV-CAP-YC, is characterized by being naturally attenuated. Accordingly, the present inventors deposited the CA-CAS-01-A cell line at the Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology Biological Resource Center on May 12, 2021 (accession number KCTC14568BP).

용어, "약독화(attenuation)"란 병원체의 필수 대사에 관여하는 유전자가 변이되어 체내에서 질병을 일으키지 못하고 면역 체계만을 자극해서 면역성을 유도하는 것을 의미한다. 바이러스의 약독화는 자외선(UV) 조사, 약품처리 또는 시험관 내 고차 연속 계대배양 등에 의해 달성될 수 있다. 약독화는 또한 명확한 유전 변화를 만듦으로써, 예를 들어 독성을 제공하는 것으로 알려진 바이러스 서열의 특정 결실 또는 바이러스 게놈 내로의 서열의 삽입에 의해 달성될 수 있다.The term "attenuation" means that a gene involved in essential metabolism of a pathogen is mutated so that it does not cause a disease in the body and induces immunity by stimulating only the immune system. Attenuation of the virus can be achieved by ultraviolet (UV) irradiation, chemical treatment, or high-order serial passage in vitro. Attenuation can also be achieved by making distinct genetic changes, for example by specific deletion of viral sequences known to confer virulence or insertion of sequences into the viral genome.

본 발명은 또한, (a) 상기 CA-CAS-01-A 세포주에 아프리카돼지열병 바이러스(ASFV) 분리주를 감염시킨 후 배양하는 단계; 및The present invention also comprises the steps of (a) infecting the CA-CAS-01-A cell line with an African swine fever virus (ASFV) isolate and then culturing; and

(b) 상기 (a) 단계의 배양액으로부터 아프리카돼지열병 바이러스를 정제하는 단계;를 포함하는, 아프리카돼지열병 바이러스의 대량 생산 방법을 제공한다.(b) purifying the African swine fever virus from the culture medium of step (a);

본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에 있어서, 상기 (a) 단계의 ASFV 분리주는 바람직하게는, Korea.Pig.Yeoncheon1-FC.2019, Korea.Pig.Paju1-FC.2019 또는 Vietnam.Pig.Hochiminh.KVL.2019 분리주일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.In the method according to one embodiment of the present invention, the ASFV isolate in step (a) is preferably Korea.Pig.Yeoncheon1-FC.2019, Korea.Pig.Paju1-FC.2019 or Vietnam.Pig.Hochiminh The .KVL.2019 isolate may be, but is not limited thereto.

또한, 상기 감염은 ASFV의 배양액 또는 ASFV에 감염된 동물 조직의 파쇄액(homogenate) 등을 CA-CAS-01-A 세포주에 처리하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 감염 소요 시간과 바이러스 증식 기간은 바이러스의 종류에 따라 다양할 수 있으며, 일반적으로 감염 소요 시간은 대개 3시간에서 12시간 정도이며, 증식 기간은 3-7일이다.In addition, the infection may be performed by treating the CA-CAS-01-A cell line with a culture medium of ASFV or a homogenate of animal tissue infected with ASFV, but is not limited thereto. The time required for infection and the period of virus propagation may vary depending on the type of virus, and generally, the time required for infection is usually 3 to 12 hours, and the propagation period is 3 to 7 days.

또한, 본 발명에 따른 방법에 있어서, 상기 (b) 단계의 ASFV는 자연적으로 약독화된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.In addition, in the method according to the present invention, ASFV in step (b) may be naturally attenuated, but is not limited thereto.

또한, 상기 CA-CAS-01-A 세포주의 배양은 당업계에 공지된 통상적인 방법 및 공지된 배지를 이용할 수 있다.In addition, the CA-CAS-01-A cell line can be cultured using conventional methods and known media known in the art.

본 발명에 따른 방법에 있어서, 상기 ASFV에 따른 감염과 증식이 종료되면, CA-CAS-01-A 세포와 배양 상층액을 수거한 후, 통상의 방법으로 정제하여 ASFV를 회수할 수 있다.In the method according to the present invention, when the infection and proliferation according to the ASFV is terminated, the CA-CAS-01-A cells and the culture supernatant are collected, and then purified by a conventional method to recover ASFV.

본 발명은 또한, 상기 방법으로 생산된 아프리카돼지열병 바이러스를 포함하는 백신 조성물을 제공한다.The present invention also provides a vaccine composition containing the African swine fever virus produced by the above method.

본 발명에 따른 백신 조성물은 ASFV에 감염된 CA-CAS-01-A 세포주의 배양 단계로부터 얻은 증식된 바이러스 배양액을 이용하여 제조할 수 있으며, 생백신 또는 불활화(inactivated) 백신의 형태로 제조될 수 있다. 불활화 백신인 경우 포르말린 또는 BEI(binaryethyleneimine) 처리 등의 특정한 방법으로 바이러스를 불활화시키고, 불활화된 바이러스를 통상의 방법으로 정제하여, 바이러스 원액의 무균실험 및 바이러스 함량실험 등을 실시하고, 보존제 및 완충액 생리식염수를 가하여 희석 혼합 또는 안정제를 첨가하여 제조한다.The vaccine composition according to the present invention can be prepared using the proliferated virus culture medium obtained from the culture step of the CA-CAS-01-A cell line infected with ASFV, and can be prepared in the form of a live vaccine or an inactivated vaccine. . In the case of an inactivated vaccine, the virus is inactivated by a specific method such as formalin or BEI (binaryethyleneimine) treatment, and the inactivated virus is purified by a conventional method, and the sterility test and virus content test of the virus stock solution are performed, and the preservative and a buffered physiological saline solution to dilute the mixture or the addition of a stabilizer.

본 발명에 따른 CA-CAS-01-A 세포주를 이용하여 생산된 ASFV는 자연적으로 약독화된 바이러스이므로, 상기 백신 조성물은 바람직하게는 약독화 생백신의 형태일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.Since ASFV produced using the CA-CAS-01-A cell line according to the present invention is a naturally attenuated virus, the vaccine composition may preferably be in the form of a live attenuated vaccine, but is not limited thereto.

약독화 백신은 병원균의 독성을 줄였으나 여전히 살아 있는 형태의 백신이다. 약독화 생백신의 경우 항체 면역 반응과 세포성 면역반응을 모두 유도할 수 있고, 면역원성이 지속적이어서 효능 촉진을 위한 백신보조제 주사를 필요로 하는 경우가 적은 것이 장점이다.Attenuated vaccines are vaccines in which the virulence of pathogens has been reduced, but still live. In the case of a live attenuated vaccine, it is advantageous that it can induce both an antibody immune response and a cellular immune response, and it is less likely to require injection of a vaccine adjuvant to promote efficacy because of its continuous immunogenicity.

본 발명의 일 구현 예에 따른 백신 조성물에 있어서, 상기 CA-CAS-01-A 세포주를 이용하여 생산된 자연적으로 약독화된 ASFV는 MGF 110-3L partial, MGF 110-4L, MGF 1105L6L, MGF 110-7L, 285L, ASFV G ACD 00160, MGF 100-1R, ASFV G ACD 00190, MGF 110-9L, MGF 110-11L_14L, ASFV G ACD 00240 MGF 110-12L, MGF 110-13La_b, ASFV G ACD 00270, MGF 360-4L, MGF 360-6L, MGF 300-1L, MGF 300-2R, MGF 300-4L, MGF 360-8L, MGF 360-9L, MGF 360-10L, MGF 360-11L, MGF 505-1R, L7L, L8L, L9R, L10L 및 L11 유전자가 결손되어 약독화된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.In the vaccine composition according to one embodiment of the present invention, the naturally attenuated ASFV produced using the CA-CAS-01-A cell line is MGF 110-3L partial , MGF 110-4L , MGF 1105L6L , MGF 110 -7L , 285L , ASFV G ACD 00160 , MGF 100-1R , ASFV G ACD 00190 , MGF 110-9L , MGF 110-11L_14L , ASFV G ACD 00240 MGF 110-12L , MGF 110-13La_b , ASFV G ACD 00270 , MGF 360-4L , MGF 360-6L , MGF 300-1L , MGF 300-2R , MGF 300-4L , MGF 360-8L , MGF 360-9L , MGF 360-10L , MGF 360-11L , MGF 505-1R , L7L , L8L , L9R , L10L and L11 genes may be deleted and attenuated, but is not limited thereto.

본 발명의 상기 자연적으로 약독화된 ASFV는 African swine fever virus isolate ASFV Georgia 2007/1 genome assembly, complete genome (NCBI Reference Sequence: NC_044959.2)의 서열 기준 8,460 내지 29,258 번째 염기(결손 1 자리) 및 181,463 내지 184,693 번째 염기(결손 2 자리)가 결손된 것일 수 있으며, 상기 결손 1 및 2 자리 내에는 전술한 약독화와 관련된 유전자들이 다수 포함되어 있다.The naturally attenuated ASFV of the present invention is based on the sequence of African swine fever virus isolate ASFV Georgia 2007/1 genome assembly, complete genome (NCBI Reference Sequence: NC_044959.2) at bases 8,460 to 29,258 (defective 1 site) and 181,463 to 184,693 bases (deletion 2 site) may be missing, and a plurality of genes related to the aforementioned attenuation are included in the deletion 1 and 2 sites.

또한, 본 발명의 상기 백신 조성물은 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 보조제(adjuvant)를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 상기 담체 외에 본 발명의 백신 조성물은 부형제 및/또는 희석제를 추가로 더 포함할 수 있다.In addition, the vaccine composition of the present invention may further include a pharmaceutically acceptable carrier and/or adjuvant. In addition to the carrier, the vaccine composition of the present invention may further include an excipient and/or a diluent.

본 명세서에서 사용되는 용어 "약학적으로 허용가능한"이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 물질을 말한다. 상기 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.As used herein, the term "pharmaceutically acceptable" refers to a substance that is physiologically acceptable and does not usually cause allergic reactions such as gastrointestinal disorders and dizziness or similar reactions when administered to humans. Examples of the carrier, excipient and diluent include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia gum, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methyl cellulose, polyvinylpyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil. In addition, fillers, anti-coagulants, lubricants, wetting agents, flavoring agents, emulsifiers and preservatives may be further included.

상기 "보조제(adjuvant)"는 백신의 면역반응을 향상시킬 목적으로 투여되는 약학적 또는 면역학적 제제를 의미한다. 상기 보조제로는 알루미늄 하이드록사이드, 알루미늄 포스페이트, 알룸(포타슘알루미늄 설페이트), MF59, virosome, AS04[알루미늄 하이드록사이드 및 모노포스포릴 리피드 A(MPL)의 혼합물], AS03(DL-α-tocopherol, squalene 및 유화제인 polysorbate 80의 혼합물), CpG, Flagellin, Poly I:C, AS01, AS02, ISCOMs 또는 ISCOMMATRIX가 사용될 수 있다.The "adjuvant" refers to a pharmaceutical or immunological agent administered for the purpose of enhancing the immune response of a vaccine. The adjuvants include aluminum hydroxide, aluminum phosphate, alum (potassium aluminum sulfate), MF59, virosome, AS04 [a mixture of aluminum hydroxide and monophosphoryl lipid A (MPL)], AS03 (DL-α-tocopherol, A mixture of squalene and emulsifier polysorbate 80), CpG, Flagellin, Poly I:C, AS01, AS02, ISCOMs or ISCOMMATRIX may be used.

본 발명의 백신 조성물은 포유동물에 투여시, 활성 성분의 신속한 방출, 또는 지속 또는 지연된 방출이 가능하도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다. 제형은 분말, 과립, 정제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀, 멸균 주사용액, 멸균 분말 형태를 포함한다.The vaccine composition of the present invention may be formulated using methods known in the art to enable rapid release, or sustained or delayed release of the active ingredient upon administration to a mammal. Dosage forms include powders, granules, tablets, emulsions, syrups, aerosols, soft or hard gelatin capsules, sterile injectable solutions, and sterile powder forms.

본 발명에 따른 백신 조성물은 다양한 경로로 투여될 수 있으며, 예를 들면, 경구, 비경구, 예를 들면 좌제, 경피, 정맥, 복강, 근육 내, 병변 내, 비강, 척추관 내 투여로 투여될 수 있으며, 또한 서방형 또는 연속적 또는 반복적 방출을 위한 이식 장치를 사용하여 투여될 수 있다. 투여 횟수는 원하는 범위 내에서 하루에 1회, 또는 수 회로 나누어 투여할 수 있으며, 투여 기간도 특별히 한정되지 않는다.The vaccine composition according to the present invention can be administered by various routes, for example, oral, parenteral, for example, suppository, transdermal, intravenous, intraperitoneal, intramuscular, intralesional, intranasal, or intrathecal administration. It can also be administered using an implantable device for sustained release or continuous or repeatable release. The number of administrations can be administered once a day or divided into several times within a desired range, and the administration period is not particularly limited.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in detail by examples. However, the following examples are only to illustrate the present invention, and the content of the present invention is not limited to the following examples.

실시예 1. ASFV 분리주 감염에 따른 감수성 세포주 스크리닝Example 1. Screening of susceptible cell lines according to ASFV isolate infection

본 발명자는 ASFV 배양을 위해 ASFV 감수성 세포주를 스크리닝하였다. 사용된 세포주는 (주)중앙백신연구소에서 보유하고 있는, MA104, PAM, PK15, Marc145, Vero, BHK CD163 세포주를 이용하였다. 세포 유지배지는 세포주 모두 α-MEM (5% FBS, 1% antibiotics)를 사용하였고, 37℃, 5% CO2 조건에서 2~3일 간격으로 계대배양하며 유지하였다.The present inventors screened ASFV-susceptible cell lines for ASFV culture. The cell lines used were MA104, PAM, PK15, Marc145, Vero, BHK CD163 cell lines owned by JoongAng Vaccine Research Institute. The cell maintenance medium used α-MEM (5% FBS, 1% antibiotics) for all cell lines, and was subcultured and maintained at 2-3 day intervals at 37°C and 5% CO 2 conditions.

본 발명에 사용된 세포주Cell line used in the present invention 세포주명cell line name 기원origin MA104MA104 African green monkey kidneyAfrican green monkey kidney PAMPAM Porcine macrophagesPorcine macrophages PK15PK15 Porcine kidneyPorcine kidney Marc145Marc145 A clone of the African green monkey kidney cell line MA-104A clone of the African green monkey kidney cell line MA-104 VeroVero African green monkey kidney epitherialAfrican green monkey kidney epitherial BHK CD163BHK CD163 baby Hamster kidneybaby hamster kidney COSCOS African green monkey kidney fibroblast-like cell lineAfrican green monkey kidney fibroblast-like cell line

각 세포주의 ASFV 감수성을 확인하기 위해, 75 cm2 플라스크에 각각의 세포를 1 x 106 cells/well로 준비한 뒤, ASFV 배양액(농림축산검역본부: 약 18 Ct값, 베트남 Raho-6: 약 18 Ct값)을 처리하여 감염시켰다. 그 후, 37℃, 5% CO2 조건에서 7일 간격으로 계대배양하였고, 1, 3, 5 및 10 계대(passage) 째의 배양액을 회수하고 상층액과 세포를 -80℃에서 동결한 후 37℃ 온탕기에서 해동 1회 실시한 후 배양액을 이용하여 qPCR (quantitative PCR)을 수행하였다. 계대 배양 시 전(previous) 계대 배양액을 이용하여 세포들을 감염시켰다. qRCR은 ASFV의 P72에 특이적인 프라이머 세트를 이용하여 하기의 조건으로 수행하였다. 양성 대조군은 국내 분리주인 Korea.Pig.Paju1-FC.2019를 사용하였다.In order to confirm the ASFV susceptibility of each cell line, after preparing each cell at 1 x 10 6 cells/well in a 75 cm 2 flask, ASFV culture medium (Agriculture, Food and Rural Affairs Quarantine Agency: about 18 Ct value, Vietnam Raho-6: about 18 Ct value) were treated and infected. Thereafter, subculture was performed at 37°C, 5% CO 2 condition at 7-day intervals, and the culture medium of the 1st, 3rd, 5th and 10th passages was recovered, and the supernatant and cells were frozen at -80°C and then 37 After thawing once in a warm water heater, qPCR (quantitative PCR) was performed using the culture medium. During subculture, the cells were infected using the previous subculture. qRCR was performed under the following conditions using a primer set specific to ASFV P72. As a positive control group, Korea.Pig.Paju1-FC.2019, a domestic isolate, was used.

qPCR에 사용된 프라이머 정보Primer information used for qPCR 프라이머명Primer name 염기서열 (5'→3')Base sequence (5'→3') 서열번호sequence number P72_ForwardP72_Forward CTG CTC ATG GTA TCA ATC TTA TCG ACTG CTC ATG GTA TCA ATC TTA TCG A 1One P72_ReverseP72_Reverse GAT ACC ACA AGA TC(AG) GCC GTGAT ACC ACA AGA TC(AG) GCC GT 22

qPCR 조건qPCR conditions 단계step 반응 조건reaction conditions 횟수number UNG (Uracil-DNA Glycosylase) 처리UNG (Uracil-DNA Glycosylase) Treatment 50℃, 2분50℃, 2 minutes 1회1 time 전변성premutation 95℃, 10분95℃, 10 minutes 1회1 time 변성denaturalization 95℃, 15초95℃, 15 seconds 40회40 times 결합Combination 58℃, 1분58℃, 1 minute

그 결과, MA104 세포주만이 10 계대째에서도 지속적으로 ASFV 바이러스가 증식되고 있음을 확인할 수 있었다(도 1). 이에, MA104 세포주를 ASFV 배양을 위한 세포주 확립에 사용하였다.As a result, it was confirmed that only the MA104 cell line continued to proliferate the ASFV virus even at the 10th passage (FIG. 1). Thus, the MA104 cell line was used to establish a cell line for ASFV culture.

실시예 2. MA104 세포주 유래 단일 세포 클론간 ASFV 특이적 감수성 비교Example 2. Comparison of ASFV-specific susceptibility between MA104 cell line-derived single cell clones

본 발명자는 MA104 세포주를 단계 희석하여 단일 세포 클론으로 준비한 뒤, 실시예 1과 동일한 조건으로 ASFV를 감염시킨 후 총 7회의 계대배양을 진행한 후 ASFV의 P72에 특이적인 프라이머 세트를 이용하여 qPCR을 진행하였으며, TCID50 (tissue culture infective dose 50) 실험으로 바이러스를 정량하였다. 또한, CAS-01과 모세포가(MA104) 동일한 Marc145 및 Vero 세포주와 이들의 단일 세포 클론, 그리고 African green monkey kidney 유래 COS 세포주와 이의 단일 세포 클론을 동일 조건으로 감염 및 비교하였다.The present inventor prepared a single cell clone by diluting the MA104 cell line step by step, infected ASFV under the same conditions as in Example 1, conducted a total of 7 subcultures, and performed qPCR using a primer set specific to P72 of ASFV. and virus was quantified by TCID 50 (tissue culture infective dose 50) experiment. In addition, the Marc145 and Vero cell lines and their single-cell clones, and the African green monkey kidney-derived COS cell line and their single-cell clones, which have the same parental cells (MA104) as CAS-01, were infected and compared under the same conditions.

그 결과, MA104 세포는 6.9 log10TCID50/㎖ 농도의 바이러스가 확인되었으며, CAS-01로 명명된 세포는 7.5 log10TCID50/㎖ 농도의 바이러스가 확인되었다. 또한, 동일한 MA104 유래 단일 세포 클론이지만, C10으로 명명된 세포는 3.6 log10TCID50/㎖ 농도의 바이러스가 확인되어, 단일 세포 클론별로 바이러스 증식성에 현저한 차이가 있음을 확인할 수 있었다(도 2A). Marc145 및 Vero 세포주는 각각 6.5 log10TCID50/㎖ 및 4.5 log10TCID50/㎖ 농도의 바이러스가 확인되었으며, COS 세포주는 6.5 log10TCID50/㎖ 농도의 바이러스가 확인되었다(도 2B). 상기 결과를 통해, 동일한 출처 유래의 세포주라 할지라도, 단일 세포 클론별 바이러스 감수성에 차이가 있음을 알 수 있었고, ASFV의 증식 및 배양을 위해 CAS-01 세포주를 선택하여 차후 실험을 진행하였으며, 상기 세포주의 이름을 'CA-CAS-01-A'로 명명하고, 한국생명공학연구원 생물자원센터(KCTC)에 2021년 5월 12일자로 기탁하였다(수탁번호: KCTC 14568BP).As a result, MA104 cells had a virus concentration of 6.9 log 10 TCID 50 /ml, and cells designated as CAS-01 had a virus concentration of 7.5 log 10 TCID 50 /ml. In addition, although it is the same MA104-derived single cell clone, the cell designated C10 was confirmed to have a virus concentration of 3.6 log 10 TCID 50 /ml, and it was confirmed that there was a significant difference in virus proliferation for each single cell clone (FIG. 2A). Virus concentrations of 6.5 log 10 TCID 50 /ml and 4.5 log 10 TCID 50 /ml were confirmed in the Marc145 and Vero cell lines, respectively, and viruses were confirmed in the COS cell line at a concentration of 6.5 log 10 TCID 50 /ml (FIG. 2B). Through the above results, it was found that there is a difference in virus susceptibility for each single cell clone, even for cell lines derived from the same source, and CAS-01 cell line was selected for the propagation and culture of ASFV and subsequent experiments were conducted. The cell line was named 'CA-CAS-01-A' and deposited with the Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology (KCTC) on May 12, 2021 (accession number: KCTC 14568BP).

실시예 3. ASFV 감염 후 계대(passage)에 따른 CA-CAS-01-A 세포주에서 바이러스 증식성Example 3. Virus proliferation in CA-CAS-01-A cell line following passage after ASFV infection

본 발명자는 CA-CAS-01-A 세포주에 Korea.Pig.Yeoncheon1-FC.2019, Korea.Pig.Paju1-FC.2019 또는 Vietnam.Pig.Hochiminh.KVL.2019 분리주를 감염시킨 후 계대배양에 따른 바이러스 증식성을 분석하였다. 각각의 바이러스는 농림축산검역본부 김용주 박사로부터 제공받아 사용하였다. 바이러스 감염 농도는 상기 실시예 1과 동일하게 진행하였다.The present inventors infected the CA-CAS-01-A cell line with Korea.Pig.Yeoncheon1-FC.2019, Korea.Pig.Paju1-FC.2019 or Vietnam.Pig.Hochiminh.KVL.2019 isolates, followed by subculture. Viral proliferation was assayed. Each virus was provided and used by Dr. Kim Yong-joo of the Agriculture, Forestry and Livestock Quarantine Center. Virus infection concentration was performed in the same manner as in Example 1 above.

그 결과, 각각의 초기 ASFV 분리주에(계대 1회) 감염된 CA-CAS-01-A 세포주는 배양이 진행된 결과 바이러스 역가가 Korea.Pig.Yeoncheon1-FC.2019 분리주는 5.2 log10TCID50/㎖, Korea.Pig.Paju1-FC.2019 분리주 및 Vietnam.Pig.Hochiminh.KVL.2019 분리주는 4.5 log10TCID50/㎖ 농도의 바이러스가 확인되었고, 총 9회 계대배양한 각 ASFV 분리주를 감염시키고 감염 후 일자에 따른 바이러스 증식성을 확인한 결과 감염 후 6일째에, Korea.Pig.Yeoncheon1-FC.2019 분리주에 대해서 8.2 log10TCID50/㎖, Korea.Pig.Paju1-FC.2019 분리주는 8.0 log10TCID50/㎖ 그리고 Vietnam.Pig.Hochiminh.KVL.2019 분리주에 대해서 7.2 log10TCID50/㎖ 농도의 바이러스가 확인되어, CA-CAS-01-A 세포주에 적응 계대 후 세 바이러스 모두 증식성이 크게 오른 것을 확인할 수 있었다(도 3 및 도 4).As a result, as a result of culturing the CA-CAS-01-A cell line infected with each initial ASFV isolate (passage 1), the virus titer of the Korea.Pig.Yeoncheon1-FC.2019 isolate was 5.2 log 10 TCID 50 /ml, Korea.Pig.Paju1-FC.2019 isolates and Vietnam.Pig.Hochiminh.KVL.2019 isolates were confirmed to have viruses at a concentration of 4.5 log 10 TCID 50 /ml. As a result of confirming the virus proliferation according to the date, on the 6th day after infection, the Korea.Pig.Yeoncheon1-FC.2019 isolate had 8.2 log 10 TCID 50 /ml, and the Korea.Pig.Paju1-FC.2019 isolate had 8.0 log 10 TCID. 50 / ㎖ and Vietnam.Pig.Hochiminh.KVL.2019 isolates, viruses with a concentration of 7.2 log 10 TCID 50 / ㎖ were confirmed, and after adaptation to CA-CAS-01-A cell line, all three viruses significantly increased proliferation It was confirmed (Figs. 3 and 4).

실시예 4. CA-CAS-01-A 세포주로부터 증식되는 ASFV 특성Example 4. Characteristics of ASFV propagated from CA-CAS-01-A cell line

본 발명자는 CA-CAS-01-A 세포주로부터 증식되는 ASFV의 특성을 확인하기 위해, 1회, 9회 및 13회 계대배양한 배양액으로부터 바이러스를 회수하여 이들의 유전체 서열을 MiSeq System 장비(Illumina, USA)와 CLC Genomics Workbench 프로그램을 이용하여 분석하였다. 그 결과, 도 5에 개시된 바와 같이 9회 및 13회 계대배양한 후 회수된 ASFV (각각 ASFV-CAP-YC p9 및 ASFV-CAP-YC p13)는 최초 감염 바이러스의 유전체와 달리 5' 및 3' 부위에 큰 유전자 결손이 일어난 것을 확인할 수 있었다. 각 결손 부위에 위치하는 유전자는 하기 표 4와 같다. 특히 결손된 유전자 중 다수의 유전자가 약독화(attenuation)과 연관된 것으로 확인되었다.In order to confirm the characteristics of ASFV propagated from the CA-CAS-01-A cell line, the present inventors recovered viruses from cultures cultured 1, 9, and 13 times and converted their genome sequences to MiSeq System equipment (Illumina, USA) and CLC Genomics Workbench program. As a result, as shown in FIG. 5, the ASFV (ASFV-CAP-YC p9 and ASFV-CAP-YC p13, respectively) recovered after subculture 9 and 13 times, unlike the genome of the first infected virus, have 5' and 3' It was confirmed that a large gene defect occurred in the region. Genes located at each defective site are shown in Table 4 below. In particular, a number of genes among the deleted genes have been identified as being associated with attenuation.

CA-CAS-01-A 세포주로부터 생산되는 ASFV (ASFV-CAP-YC)의 결손 부위Defective site of ASFV (ASFV-CAP-YC) produced from CA-CAS-01-A cell line Gene deletedGene deleted Deletion site 1Deletion site 1 MGF 110-3L partial, MGF 110-4L, MGF 1105L6L, MGF 110-7L, 285L, ASFV G ACD 00160, MGF 100-1R, ASFV G ACD 00190, MGF 110-9L, MGF 110-11L_14L, ASFV G ACD 00240 MGF 110-12L, MGF 110-13La_b, ASFV G ACD 00270, MGF 360-4L, MGF 360-6L, MGF 300-1L, MGF 300-2R, MGF 300-4L, MGF 360-8L, MGF 360-9L, MGF 360-10L, MGF 360-11L, MGF 505-1R , ASF G ACD 00120, MGF 110-8L, ASF G ACD 00210, ASF G ACD 00300, ASF G ACD 00320, ASF G ACD 00330, ASF G ACD 00350, ASF G ACD 00360, X69R MGF 110-3L partial, MGF 110-4L, MGF 1105L6L, MGF 110-7L, 285L, ASFV G ACD 00160, MGF 100-1R, ASFV G ACD 00190, MGF 110-9L, MGF 110-11L_14L, ASFV G ACD 00240 MGF 110-12L, MGF 110-13La_b, ASFV G ACD 00270, MGF 360-4L, MGF 360-6L, MGF 300-1L, MGF 300-2R, MGF 300-4L, MGF 360-8L, MGF 360-9L, MGF 360-10L, MGF 360-11L, MGF 505-1R , ASF G ACD 00120, MGF 110-8L, ASF G ACD 00210, ASF G ACD 00300, ASF G ACD 00320, ASF G ACD 00330, ASF G ACD 00350, ASF G ACD 00360, X69R Deletion site 2Deletion site 2 L7L, L8L, L9R, L10L, L11L , ASF G ACD 01870, MGF 100-3L, MGF 360-18R L7L, L8L, L9R, L10L, L11L , ASF G ACD 01870, MGF 100-3L, MGF 360-18R Bold: 약독화에 영향을 주는 유전자Bold: genes affecting attenuation

실시예 5. CA-CAS-01-A 세포주로부터 증식되는 ASF 바이러스 항원(ASFV-CAP-YC)의 약독화(안전성) 확인Example 5. Confirmation of attenuation (safety) of ASF virus antigen (ASFV-CAP-YC) propagated from CA-CAS-01-A cell line

본 발명자는 CA-CAS-01-A 세포주로부터 증식 및 약독화된 계대 14번째 ASF 항원(ASFV)에 대한 약독화(안전성)를 확인하기 위하여 102 또는 106 TCID50/㎖의 ASFV를 3주령 돼지(랜드레이스_Landrace 또는 덴마크랜드레이스_Danish Landrace, 수컷)에 접종하여 확인하였다. 그 결과, 도 6에 개시된 바와 같이 ASF 항원을 접종한 돼지 개체에서 접종 후 24일까지 체온 및 생존율에 아무런 영향이 없음을 확인할 수 있었다. 또한, 도 7에 개시된 바와 같이 경구 스왑, 직장 스왑, 비강 스왑에서는 바이러스가 검출되지 않았고, 항원 접종 후 3일째부터 혈청에서는 102~103 TCID50/㎖으로 검출되다가 19일째 완전히 사라고, 전혈에서는 103~105 TCID50/㎖으로 검출되다가 점차 바이러스 검출량이 감소하였다. 또한, 접종한 모든 개체의 체온, 생존률과 임상증상을 3주 동안 관찰한 결과 모든 그룹에서 100% 생존률을 보였으며, ASFV 감염에 의한 특이적인 임상증상이 관찰되지 않았다.In order to confirm the attenuation (safety) of the ASF antigen (ASFV) on the 14th passage of the attenuated and propagated CA-CAS-01-A cell line, the present inventors tested 10 2 or 10 6 TCID 50 / ml of ASFV at 3 weeks of age. It was confirmed by inoculating pigs (Landrace or Danish Landrace, male). As a result, as shown in FIG. 6, it was confirmed that there was no effect on body temperature and survival rate until 24 days after inoculation in pigs inoculated with the ASF antigen. In addition, as shown in FIG. 7, the virus was not detected in oral swabs, rectal swabs, and nasal swabs, and was detected as 10 2 to 10 3 TCID 50 /ml in serum from the 3rd day after antigen inoculation, and then completely killed on the 19th day, in whole blood 10 3 ~ 10 5 TCID was detected at 50 / ml, and then the virus detection amount gradually decreased. In addition, as a result of observing the body temperature, survival rate and clinical symptoms of all inoculated individuals for 3 weeks, 100% survival rate was shown in all groups, and no specific clinical symptoms due to ASFV infection were observed.

한국생명공학연구원Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology KCTC14568BPKCTC14568BP 2021051220210512

<110> Choong Ang Vaccine Lab. <120> A cell line for culturing african swine fever virus and vaccine using the same <130> PN21334 <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 ctgctcatgg tatcaatctt atcga 25 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 gataccacaa gatcaggccg t 21 <110> Choong Ang Vaccine Lab. <120> A cell line for culturing african swine fever virus and vaccine using the same <130> PN21334 <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 25 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer <400> 1 ctgctcatgg tatcaatctt atcga 25 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer <400> 2 gataccacaa gatcaggccg t 21

Claims (9)

아프리카돼지열병 바이러스(African swine fever virus)를 증식시킬 수 있는 수탁번호 KCTC14568BP로 기탁된 CA-CAS-01-A 세포주로서,
상기 CA-CAS-01-A 세포주는 아프리카돼지열병 바이러스 분리주의 감염 후 계대배양 과정에서 약독화된 아프리카돼지열병 바이러스를 생산하는 것을 특징으로 하는 CA-CAS-01-A 세포주.As a CA-CAS-01-A cell line deposited with accession number KCTC14568BP that can propagate African swine fever virus,
The CA-CAS-01-A cell line is a CA-CAS-01-A cell line, characterized in that it produces an attenuated African swine fever virus during subculture after infection of the African swine fever virus isolate. 제1항에 있어서, 상기 약독화된 아프리카돼지열병 바이러스는 MGF 110-3L partial, MGF 110-4L, MGF 1105L6L, MGF 110-7L, 285L, ASFV G ACD 00160, MGF 100-1R, ASFV G ACD 00190, MGF 110-9L, MGF 110-11L_14L, ASFV G ACD 00240 MGF 110-12L, MGF 110-13La_b, ASFV G ACD 00270, MGF 360-4L, MGF 360-6L, MGF 300-1L, MGF 300-2R, MGF 300-4L, MGF 360-8L, MGF 360-9L, MGF 360-10L, MGF 360-11L, MGF 505-1R, L7L, L8L, L9R, L10L 및 L11 유전자가 결손된 것을 특징으로 하는 CA-CAS-01-A 세포주.The method of claim 1, wherein the attenuated African swine fever virus is MGF 110-3L partial, MGF 110-4L, MGF 1105L6L, MGF 110-7L, 285L, ASFV G ACD 00160, MGF 100-1R, ASFV G ACD 00190 , MGF 110-9L, MGF 110-11L_14L, ASFV G ACD 00240 MGF 110-12L, MGF 110-13La_b, ASFV G ACD 00270, MGF 360-4L, MGF 360-6L, MGF 300-1L, MGF 300-2R, CA-CAS characterized by deletion of MGF 300-4L, MGF 360-8L, MGF 360-9L, MGF 360-10L, MGF 360-11L, MGF 505-1R, L7L, L8L, L9R, L10L and L11 genes -01-A cell line. 삭제delete (a) 제1항의 CA-CAS-01-A 세포주에 아프리카돼지열병 바이러스 분리주를 감염시킨 후 배양하는 단계; 및
(b) 상기 (a) 단계의 배양액으로부터 약독화된 아프리카돼지열병 바이러스를 정제하는 단계;를 포함하는, 약독화된 아프리카돼지열병 바이러스의 대량 생산 방법. (a) culturing after infecting the CA-CAS-01-A cell line of claim 1 with an African swine fever virus isolate; and
(b) purifying the attenuated African swine fever virus from the culture solution of step (a); 삭제delete 제4항의 방법으로 생산된 약독화된 아프리카돼지열병 바이러스를 포함하는, 아프리카돼지열병 예방용 백신 조성물.A vaccine composition for preventing African swine fever, comprising the attenuated African swine fever virus produced by the method of claim 4. 삭제delete 제6항에 있어서, 상기 약독화는 MGF 110-3L partial, MGF 110-4L, MGF 1105L6L, MGF 110-7L, 285L, ASFV G ACD 00160, MGF 100-1R, ASFV G ACD 00190, MGF 110-9L, MGF 110-11L_14L, ASFV G ACD 00240 MGF 110-12L, MGF 110-13La_b, ASFV G ACD 00270, MGF 360-4L, MGF 360-6L, MGF 300-1L, MGF 300-2R, MGF 300-4L, MGF 360-8L, MGF 360-9L, MGF 360-10L, MGF 360-11L, MGF 505-1R, L7L, L8L, L9R, L10L 및 L11 유전자가 결손된 것을 특징으로 하는 백신 조성물.The method of claim 6, wherein the attenuation is MGF 110-3L partial , MGF 110-4L , MGF 1105L6L , MGF 110-7L , 285L , ASFV G ACD 00160 , MGF 100-1R , ASFV G ACD 00190 , MGF 110-9L ; L , _ _ _ _ _ _ A vaccine composition characterized in that MGF 360-8L , MGF 360-9L , MGF 360-10L , MGF 360-11L , MGF 505-1R , L7L , L8L , L9R , L10L and L11 genes are deleted. 제6항에 있어서, 상기 조성물은 약학적으로 허용되는 담체 또는 보조제(adjuvant)를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 백신 조성물.The vaccine composition according to claim 6, further comprising a pharmaceutically acceptable carrier or adjuvant.
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