KR102539751B1 - Method of culturing Haematococcus pluvialis by pH control - Google Patents

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Abstract

본 발명은 pH 조절을 이용한 헤마토코쿠스 플루비알리스 배양방법에 관한 것으로서, 본 발명의 산성 조건의 배지에서 헤마토코쿠스 플루비알리스(Haematococcus pluvialis)를 배양하는 공정을 포함하는 헤마토코쿠스 플루비알리스 배양방법은 배양 pH 조절이라는 간단한 방법을 통해 오염균에 의한 헤마토코쿠스 플루비알리스의 사멸을 완전히 방지할 수 있으므로 미생물 오염에 의한 해마토코쿠스 플루비알리스 세포의 바이오매스 및 아스타잔틴 생산능력 감소 현상 등의 문제점을 해결할 수 있고, 세포 배양시 미생물에 의한 오염 비활성화 상태를 장기간 유지할 수 있어, 헤마토코쿠스 플루비알리스 세포로부터 보다 일률적으로 바이오매스 및 아스타잔틴을 생산할 수 있을 뿐만 아니라, 이렇게 생산된 아스타잔틴은 강력한 항산화물질로서 의학, 식품학, 화장품 원료 등의 다양한 산업분야에서 다양하게 활용할 수 있다.The present invention relates to a method for culturing Haematococcus fluvialis using pH control, comprising the step of culturing Haematococcus pluvialis in the acidic medium of the present invention. The fluvialis culture method can completely prevent the death of Haematococcus fluvialis by contaminants through a simple method of adjusting the culture pH, so the biomass of Haematococcus fluvialis cells and astaxane caused by microbial contamination It is possible to solve problems such as a decrease in tin production capacity, and to maintain an inactivated state of contamination by microorganisms during cell culture for a long time, so that biomass and astaxanthin can be produced more uniformly from Haematococcus fluvialis cells. In addition, astaxanthin produced in this way can be used in various industries such as medicine, food science, and cosmetic raw materials as a powerful antioxidant.

Description

pH 조절을 이용한 헤마토코쿠스 플루비알리스 배양방법{Method of culturing Haematococcus pluvialis by pH control}Method of culturing Haematococcus pluvialis by pH control}

본 발명은 pH 조절을 이용한 헤마토코쿠스 플루비알리스 배양방법에 관한 것으로서, 상세하게는 헤마토코쿠스 플루비알리스를 배양할 시 배양 초기 또는 배양 기간 동안 배지의 pH를 산성 조건으로 조절함으로써 외부 미생물에 의한 오염을 방지하여 헤마토코쿠스 플루비알리스 세포의 바이오매스 및 아스타잔틴 생산 능력을 증진시킬 수 있는 헤마토코쿠스 플루비알리스 배양방법에 관한 것이다.The present invention relates to a method for culturing Haematococcus fluvialis using pH control, and more particularly, when culturing Haematococcus fluvialis, by adjusting the pH of the medium to an acidic condition at the beginning or during the culture period, external It relates to a method for culturing Haematococcus fluvialis capable of improving the biomass and astaxanthin production ability of Haematococcus fluvialis cells by preventing contamination by microorganisms.

일반적으로 적색을 띄는 케토카로티노이드(Ketocarotenoid)인 아스타잔틴(Astaxanthin, 3,3'-dihydroxy-β,β'-carotene-4,4'-dione)은 베타-카로틴(β-carotene)과 같은 화학적 구조를 가진 카로티노이드계 색소의 일종으로, 유해 활성산소를 없애는 항산화 기능성 물질로 베타-카로틴에 비해 양쪽 말단기에 하이드록실기(-OH)와 케톤기(=O)를 하나씩 더 가지는 독특한 분자 구조적 특성 때문에 기존의 항산화 물질보다 월등히 높은 항산화 활성을 갖는다. 아스타잔틴은 대표적인 항산화제인 비타민 E보다 500배, 베타-카로틴보다 20배 정도 높은 항산화 활성을 지닌다. 이러한 높은 항산화 활성기능으로 인해 아스타잔틴은 의약품, 식품 첨가제 및 동물과 치어의 사료 첨가제로 널리 사용되고 있고, 그 수요량 및 활용 범위가 급격히 확대될 것으로 예상되고 있다.Astaxanthin (3,3'-dihydroxy-β,β'-carotene-4,4'-dione), a commonly reddish ketocarotenoid, has the same chemical properties as β-carotene. A type of carotenoid-based pigment with a structure, it is an antioxidant functional substance that eliminates harmful active oxygen. It has unique molecular structural characteristics that have one more hydroxyl group (-OH) and one more ketone group (=O) at both ends compared to beta-carotene. Therefore, it has a much higher antioxidant activity than conventional antioxidants. Astaxanthin has 500 times higher antioxidant activity than vitamin E, a representative antioxidant, and 20 times higher than beta-carotene. Due to this high antioxidant activity, astaxanthin is widely used as pharmaceuticals, food additives, and feed additives for animals and fry, and its demand and application range are expected to rapidly expand.

이러한 아스타잔틴은 효모 균주인 파피아 로드지마(Phaffia rthodozyma)와 버비박테리아(Bervibacterium)에서 생성되며, 또한, 해양 동물과 담수 동물에 많이 분포되어 있지만, 새우나 가재 등의 갑각류에서 추출된 아스타잔틴은 함량이 적고, 추출 과정이 어려워 적용되지 않고 있으며, 파피아 로드지마 균주는 성장률이 높으나 아스타잔틴의 수율이 낮다는 문제점을 가지고 있다.Such astaxanthin is produced from yeast strains Phaffia rthodozyma and Bervibacterium, and is also widely distributed in marine and freshwater animals, but astaxanthin extracted from crustaceans such as shrimp and crayfish Tin is not applied due to its low content and difficult extraction process, and the Papia rodjima strain has a high growth rate but a low yield of astaxanthin.

이에, 지구상에서 아스타잔틴의 축적함량과 수율 측면에서 가장 우수한 미세조류인 헤마토코쿠스 플루비알리스(Haematococcus pluvialis)를 사용하여 빛에 의한 이산화탄소의 고정화와 동시에 아스타잔틴의 생산성을 높이기 위한 다양한 연구가 수행되고 있다.Therefore, using Haematococcus pluvialis, which is the best microalgae in terms of accumulation content and yield of astaxanthin on earth, various methods are used to fix carbon dioxide by light and simultaneously increase the productivity of astaxanthin. Research is being conducted.

그러나 미세조류를 이용한 생물학적 시스템을 실제 산업체에서 발생되는 배가스 내 이산화탄소의 포집에 적용하기 위해서는 현실적으로 보다 경제성을 갖춘 미세조류 대량배양시스템이 필요하나, 외부 미생물과 같은 오염원에 의한 헤마토코쿠스 플루비알리스의 바이오매스 및 아스타잔틴 생산성 감소는 경제성을 감소시키는 문제점이 있고, 이러한 현상은 scale-up을 위한 대량배양으로 진행될수록 상황은 더욱 악화되어 금전적 타격을 초래한다.However, in order to apply the biological system using microalgae to the capture of carbon dioxide in the flue gas generated in the actual industry, a more economical microalgae mass culture system is required in reality, but Hematococcus fluvialis caused by pollutants such as external microorganisms The decrease in biomass and astaxanthin productivity has a problem of reducing economic feasibility, and this phenomenon worsens as mass culture for scale-up progresses, resulting in financial damage.

전술한 바와 같이 헤마토코쿠스 플루비알리스의 대량 배양에서 가장 큰 난제는 박테리아, 곰팡이, 다른 미세조류 종(Scenedesmus sp. or Chlorella sp.)에 의한 오염이며(Pandey 2013, Gutman et al 2009, Shah 2016), 그 중에서도 곰팡이의 한 종류로 알려진 Paraphysoderma sedebokerenses 는 매우 빠른 속도로 헤마토코쿠스 셀을 감염시켜 3-4일 안에 모든 셀을 사멸시키기 때문에 가장 심각하게 여겨진다(Gutman 2009).As mentioned above, the biggest challenge in mass cultivation of Haematococcus fluvialis is contamination by bacteria, fungi, and other microalgal species (Scenedesmus sp. or Chlorella sp.) (Pandey 2013, Gutman et al 2009, Shah 2016), especially Paraphysoderma known as a type of fungus. sedebokerenses is considered the most serious because it infects hematococcal cells very rapidly and kills all cells within 3-4 days (Gutman 2009).

관련하여, U.S. Patent Application No. 14/351,540에서는 fungicide를 이용하여 미생물에 의한 오염률을 낮추는 방안 및 배양 온도를 낮은 온도(10-22 ℃)로 낮추는 연속 장치를 이용하는 방법을 제시하고 있으나 그 효과가 완전하지 않고 비용이 많이 든다는 문제가 있고, U.S. Patent No. 9,113,607 와 U.S. Patent No. 9,392,793 에서는 과산화수소(hydrogen peroxide)와 salt를 주입하여 미생물에 의한 오염을 감소시키는 방법을 개시하고 있으나, 과산화수소는 빠른 시간 내에 (대략 2시간) 모두 증발하기 때문에 추가적인 감염 여부를 모니터링함과 동시에 해당 방법을 반복적으로 수행해야 한다는 번거로움이 있다.Regarding, U.S. Patent Application No. 14/351,540 proposes a method of reducing the contamination rate by microorganisms using fungicide and a method of using a continuous device that lowers the culture temperature to a low temperature (10-22 ℃), but the effect is not perfect and the cost is high. There is, and the U.S. Patent No. 9,113,607 and U.S. Patent No. 9,392,793 discloses a method of reducing contamination by microorganisms by injecting hydrogen peroxide and salt, but since hydrogen peroxide evaporates quickly (approximately 2 hours), additional infection is monitored and the method is used. There is the hassle of having to do it repeatedly.

또한, 헤마토코쿠스 셀이 다른 미세 조류에 비해 성장 속도가 매우 느리기 때문에 오염원에 취약할 뿐만 아니라 전술한 방법들은 모두 오염균이 발견된 이후에 추가적인 오염을 방지하기 위한 방법이기 때문에 Paraphysoderma sedebokerenses 와 같이 헤마토코쿠스 셀을 매우 빠른 속도로 감염시키는 곰팡이에 의해 감염될 경우 근본적인 해결책이 될 수 없다는 문제점이 있다.In addition, since hematococcus cells have a very slow growth rate compared to other microalgae, they are vulnerable to contaminants, and since all of the above methods are methods to prevent additional contamination after the contaminant is discovered, Paraphysoderma There is a problem in that it cannot be a fundamental solution in the case of infection by a fungus that infects hematococcal cells very rapidly, such as sedebokerenses .

본 발명이 해결하고자 하는 과제는 헤마토코쿠스 플루비알리스의 대량 배양의 장기적인 운행 시 공정의 특성상 순수배양의 어려움으로 발생되는 외부 미생물들에 의한 오염으로 인해 헤마토코쿠스 플루비알리스 세포로부터 바이오매스 및 아스타잔틴 생산성 감소, 이에 따른 이산화탄소 전환 효율 감소 등의 문제점을 해결하고, 배양기간 내에 오염균이 유입되는 가능성 뿐만 아니라 오염균이 이미 존재하는 환경에서도 오염균으로부터의 감염을 방지할 수 있는 새로운 헤마토코쿠스 플루비알리스의 배양방법을 제공하는 것이다.The problem to be solved by the present invention is to obtain a biological solution from Haematococcus fluvialis cells due to contamination by external microorganisms caused by difficulties in pure culture due to the nature of the process during long-term operation of mass culture of Haematococcus fluvialis. It solves problems such as reduction in mass and astaxanthin productivity and consequent reduction in carbon dioxide conversion efficiency, and prevents infection from contaminants even in an environment where contaminants already exist as well as the possibility of inflow of contaminants during the cultivation period. It is to provide a new method for culturing Haematococcus fluvialis.

본 발명은 상기 과제를 해결하기 위하여,The present invention, in order to solve the above problems,

산성 조건의 배지에서 헤마토코쿠스 플루비알리스(Haematococcus pluvialis)를 배양하는 공정을 포함하는 헤마토코쿠스 플루비알리스 배양방법을 제공한다.Provided is a method for culturing Haematococcus fluvialis, which includes culturing Haematococcus pluvialis in an acidic medium.

본 발명에 따르면, 상기 산성 조건은 pH 5.5 이하일 수 있다. 또한, 상기 산성 조건은 배양 초기에는 pH 4 내지 4.5이고, 배양 기간 동안에는 pH 5.5 이하로 유지되는 조건일 수 있다.According to the present invention, the acidic condition may be pH 5.5 or less. In addition, the acidic conditions may be pH 4 to 4.5 at the initial stage of culture and maintained at pH 5.5 or less during the culture period.

본 발명에 따르면, 상기 산성 조건은 배지에 산을 첨가함으로써 조정되며, 상기 산은 황산, 염산, 질산, 아세트산, 시트르산, 숙신산, 인산, 말산, 부티르산, 프로피온산, 옥살산, 글루콘산, 타르타르산, 프탈산, 탄산 및 아스코르브산으로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있다.According to the present invention, the acidic condition is adjusted by adding an acid to the medium, which acid is sulfuric acid, hydrochloric acid, nitric acid, acetic acid, citric acid, succinic acid, phosphoric acid, malic acid, butyric acid, propionic acid, oxalic acid, gluconic acid, tartaric acid, phthalic acid, carbonic acid And it may be at least one selected from the group consisting of ascorbic acid.

본 발명에 따르면, 상기 배지는 MES 버퍼를 포함할 수 있다.According to the present invention, the medium may include MES buffer.

본 발명은 또한, 상기 헤마토코쿠스 플루비알리스 배양방법을 이용하여 아스타잔틴을 제조하는 방법을 제공한다.The present invention also provides a method for producing astaxanthin using the Hematococcus fluvialis culture method.

본 발명의 산성 조건의 배지에서 헤마토코쿠스 플루비알리스(Haematococcus pluvialis)를 배양하는 공정을 포함하는 헤마토코쿠스 플루비알리스 배양방법은 배양 pH 조절이라는 간단한 방법을 통해 오염균에 의한 헤마토코쿠스 플루비알리스의 사멸을 완전히 방지할 수 있으므로 미생물 오염에 의한 해마토코쿠스 플루비알리스 세포의 바이오매스 및 아스타잔틴 생산능력 감소 현상 등의 문제점을 해결할 수 있고, 세포 배양시 미생물에 의한 오염 비활성화 상태를 장기간 유지할 수 있어, 헤마토코쿠스 플루비알리스 세포로부터 보다 일률적으로 바이오매스 및 아스타잔틴을 생산할 수 있을 뿐만 아니라, 이렇게 생산된 아스타잔틴은 강력한 항산화물질로서 의학, 식품학, 화장품 원료 등의 다양한 산업분야에서 다양하게 활용할 수 있다.The Haematococcus fluvialis culture method comprising the step of culturing Haematococcus pluvialis in an acidic medium of the present invention is a simple method of adjusting the culture pH to reduce hematosis caused by contaminating bacteria. Since the death of Coccus fluvialis can be completely prevented, problems such as reduction in biomass and astaxanthin production capacity of Haematococcus fluvialis cells due to microbial contamination can be solved, and contamination by microorganisms during cell culture Since it can maintain an inactive state for a long period of time, not only can biomass and astaxanthin be produced more uniformly from Haematococcus fluvialis cells, but also astaxanthin produced in this way is a powerful antioxidant and is used as a raw material for medicine, food science, and cosmetics. It can be used in various industries such as

도 1은 헤마토코쿠스 플루비알리스 배양 배지에 Paraphysoderma sedebokerenses 곰팡이 오염균을 접종하여 배양시 배양 배지의 초기 pH에 따른 감염률을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 헤마토코쿠스 플루비알리스 배양 배지에 Paraphysoderma sedebokerenses 곰팡이 오염균을 접종하여 배양시 배양 배지의 초기 pH에 따른 배양 0, 6, 8, 10일차 감염률을 나타낸 그래프 및 배양 배지의 색 변화를 나타낸 사진이다.
도 3은 헤마토코쿠스 플루비알리스 배양 배지에 Paraphysoderma sedebokerenses 곰팡이 오염균을 접종하여 배양시 배양 배지의 초기 pH가 4인 경우와 pH가 7.5(대조군)인 경우의 배양 10일차 헤마토코쿠스 플루비알리스의 현미경 이미지이다.
도 4는 헤마토코쿠스 플루비알리스 배양 배지 배양시 배양 배지의 초기 pH가 3, 4, 7.5인 경우의 성장성을 비교한 결과를 나타낸 그래프이다.
Figure 1 shows the results of measuring the infection rate according to the initial pH of the culture medium when Paraphysoderma sedebokerenses fungal contaminants were inoculated into Haematococcus fluvialis culture medium and cultured.
Figure 2 is a graph showing infection rates on days 0, 6, 8, and 10 of culture according to the initial pH of the culture medium when Paraphysoderma sedebokerenses fungal contaminants are inoculated into Haematococcus fluvialis culture medium and cultured, and the color change of the culture medium This is the picture shown
Figure 3 is a Haematococcus fluvialis culture medium inoculated with Paraphysoderma sedebokerenses fungal contaminants and cultured when the initial pH of the culture medium is 4 and the pH is 7.5 (control) Hematococcus plate on day 10 of culture This is a microscope image of rubialis.
Figure 4 is a graph showing the results of comparing the growth properties when the initial pH of the culture medium is 3, 4, 7.5 when cultured in Haematococcus fluvialis culture medium.

이하, 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하기로 한다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail.

본 발명에서는 헤마토코쿠스 플루비알리스의 대량 배양의 장기적인 운행 시 공정의 특성상 순수배양의 어려움으로 발생되는 외부 미생물들에 의한 오염으로 인해 헤마토코쿠스 플루비알리스 세포로부터 바이오매스 및 아스타잔틴 생산성 감소, 이에 따른 이산화탄소 전환 효율 감소 등의 문제점을 해결하고, 배양기간 내에 오염균이 유입되는 가능성 뿐만 아니라 오염균이 이미 존재하는 환경에서도 오염균으로부터의 감염을 방지할 수 있는 새로운 헤마토코쿠스 플루비알리스의 배양방법을 제공하고자 한다.In the present invention, biomass and astaxanthin from Haematococcus fluvialis cells due to contamination by external microorganisms caused by difficulties in pure culture due to the nature of the process during long-term operation of mass culture of Haematococcus fluvialis New Haematococcus that can solve problems such as reduced productivity and consequent reduction in carbon dioxide conversion efficiency, and prevent infection from contaminants even in an environment where contaminants already exist as well as the possibility of contaminants entering during the cultivation period It is intended to provide a method for culturing fluvialis.

이를 위해, 본 발명은 산성 조건의 배지에서 헤마토코쿠스 플루비알리스(Haematococcus pluvialis)를 배양하는 공정을 포함하는 헤마토코쿠스 플루비알리스 배양방법을 제공한다.To this end, the present invention provides a method for culturing Haematococcus fluvialis, which includes culturing Haematococcus pluvialis in an acidic medium.

이때, 상기 산성 조건은 배양의 전체 과정에서 pH 5.5 이하로 유지되는 것이 바람직하며, 특히 하기 실시예의 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, 미생물에 의한 오염을 완전히 차단하면서도 셀을 큰 손실 없이 성장시키기 위해서는 배양 초기에는 배양 초기에는 pH 4 내지 4.5, 배양 기간 동안에는 pH 5.5 이하로 유지되는 것이 가장 바람직하다.At this time, the acidic condition is preferably maintained at pH 5.5 or less throughout the entire process of culture. In particular, as can be seen from the results of the following examples, in order to completely block contamination by microorganisms and grow cells without significant loss, culture Initially, it is most preferable to maintain pH 4 to 4.5 at the beginning of culture and pH 5.5 or less during the culture period.

본 발명의 배양에 사용하는 배지는 헤마토코쿠스 플루비알리스를 생육하여 소정의 조건 하에서 아스타잔틴을 생산할 수 있는 것이라면 모두 가능하며, 바람직하게는 질소원, 무기 염류 및 필요에 따라 비타민류 등을 함유하는 배지일 수 있다. The medium used for the culture of the present invention can be any medium as long as it can grow Haematococcus fluvialis and produce astaxanthin under predetermined conditions, preferably containing nitrogen sources, inorganic salts and, if necessary, vitamins. It may be a medium containing

무기 질소원으로는, 질산암모늄, 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄 등의 암모늄염류, 질산칼륨 등의 질산염류, 암모니아 및 우레아로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있다. 첨가량은 질소원의 종류에 따라 상이하며 통상적으로는 배지 1 ℓ 에 대하여 0.1-20 g, 바람직하게는 0.2-10 g 일 수 있다.The inorganic nitrogen source may be at least one selected from the group consisting of ammonium salts such as ammonium nitrate, ammonium sulfate, ammonium chloride, and ammonium phosphate, nitrates such as potassium nitrate, ammonia, and urea. The amount added varies depending on the type of nitrogen source, and may be typically 0.1-20 g, preferably 0.2-10 g, per 1 liter of the medium.

유기 질소원으로는, 예를 들어, 콘스팁리커 (여과 처리물을 포함한다), 파마 미디어, 콩깻묵, 대두 분말, 피넛 밀, 디스틸러즈 솔러블, 건조 효모, 글루탐산 소다로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있다. 첨가 농도는 질소원의 종류에 따라 상이하며 통상적으로 0-80 g/ℓ, 바람직하게는 0-30 g/ℓ일 수 있다.As the organic nitrogen source, for example, 1 selected from the group consisting of cornstarch liquor (including filtered products), pharma media, soybean meal, soybean powder, peanut meal, distillers soluble, dried yeast, and monosodium glutamate There may be more than one species. The added concentration is different depending on the type of nitrogen source and may be usually 0-80 g/L, preferably 0-30 g/L.

무기 질소원 및 유기 질소원은 배양 전 배지에 첨가하거나, 배양 도중에 축차적 또는 연속적으로 추가 공급할 수도 있다. The inorganic nitrogen source and the organic nitrogen source may be added to the medium before culturing, or additionally supplied sequentially or continuously during culturing.

무기 염류로는, 예를 들어, 인산염류, 황산마그네슘, 염화마그네슘 등의 마그네슘염류, 황산철, 염화철 등의 철염류, 염화칼슘, 탄산칼슘 등의 칼슘염류, 탄산나트륨, 염화나트륨 등의 나트륨염류, 황산망간 등의 망간염류, 염화코발트 등의 코발트염류, 황산구리 등의 구리 염류, 황산아연 등의 아연염류, 몰리브덴산나트륨 등의 몰리브덴염류, 황산니켈 등의 니켈염류, 셀렌산나트륨 등의 셀렌염류, 붕산 및 요오드화칼륨으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있다. 첨가량은 무기염의 종류에 따라 상이하며 통상적으로 배지 1 ℓ 에 대하여 0.0001-15 g일 수 있다. 무기 염류는 배양 전 배지에 첨가하거나, 배양 도중에 축차적 또는 연속적으로 추가 공급할 수도 있다.Inorganic salts include, for example, phosphates, magnesium salts such as magnesium sulfate and magnesium chloride, iron salts such as iron sulfate and iron chloride, calcium salts such as calcium chloride and calcium carbonate, sodium salts such as sodium carbonate and sodium chloride, manganese sulfate Manganese salts such as cobalt chloride, cobalt salts such as cobalt chloride, copper salts such as copper sulfate, zinc salts such as zinc sulfate, molybdenum salts such as sodium molybdate, nickel salts such as nickel sulfate, selenium salts such as sodium selenate, boric acid and It may be one or more selected from the group consisting of potassium iodide. The amount added varies depending on the type of inorganic salt and may be 0.0001-15 g per 1 liter of medium. Inorganic salts may be added to the medium before culturing, or additionally supplied sequentially or continuously during culturing.

비타민류로는, 예를 들어, 시아노코발라민, 리보플라빈, 판토텐산, 피리독신, 티아민, 아스코르브산, 엽산, 니아신, p-아미노벤조산, 비오틴, 이노시톨, 콜린 등을 사용할 수 있다. 첨가 비율은 비타민류의 종류에 따라 상이하며 통상적으로 배지 1 ℓ 에 대하여 0.001-1000 ㎎ 이고, 바람직하게는 0.01-100 ㎎ 일 수 있다. 비타민류는 배양 전 배지에 첨가하거나, 배양 도중에 축차적 또는 연속적으로 추가 공급할 수도 있다.As the vitamins, for example, cyanocobalamin, riboflavin, pantothenic acid, pyridoxine, thiamine, ascorbic acid, folic acid, niacin, p-aminobenzoic acid, biotin, inositol, choline and the like can be used. The addition ratio is different depending on the type of vitamins and is usually 0.001-1000 mg, preferably 0.01-100 mg per 1 liter of the medium. Vitamins may be added to the medium before culture, or additionally supplied sequentially or continuously during culture.

본 발명에 사용된 배지는 산성 조건의 pH를 유지하기 위해 MES 버퍼를 더 포함할 수 있으며, 구연산 버퍼, 수산화나트륨 수용액, 수산화칼륨 수용액, 탄산나트륨 수용액, 암모니아수, 암모니아 가스, 황산 수용액 또는 이들의 혼합물을 pH 조정제로 사용할 수도 있다. The medium used in the present invention may further include an MES buffer to maintain the pH of acidic conditions, and citric acid buffer, sodium hydroxide aqueous solution, potassium hydroxide aqueous solution, sodium carbonate aqueous solution, ammonia water, ammonia gas, sulfuric acid aqueous solution, or mixtures thereof It can also be used as a pH adjusting agent.

또한, 상기 산성 조건은 배지에 산을 첨가함으로써 조정되며, 상기 산은 황산, 염산, 질산, 아세트산, 시트르산, 숙신산, 인산, 말산, 부티르산, 프로피온산, 옥살산, 글루콘산, 타르타르산, 프탈산, 탄산 및 아스코르브산으로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있다.In addition, the acidic conditions are adjusted by adding acids to the medium, which acids include sulfuric acid, hydrochloric acid, nitric acid, acetic acid, citric acid, succinic acid, phosphoric acid, malic acid, butyric acid, propionic acid, oxalic acid, gluconic acid, tartaric acid, phthalic acid, carbonic acid and ascorbic acid. It may be one or more selected from the group consisting of.

또한, 상기 헤마토코쿠스 플루비알리스의 배양은 적절한 배양 용기에서 실시된다. 배양 용기는 배양 용량에 따라 적절히 선택할 수 있으며, 예를 들어, 시험관, 플라스크, 발효조, 광생물 반응기 등을 들 수 있다.In addition, the culture of Haematococcus fluvialis is carried out in an appropriate culture vessel. The culture vessel can be appropriately selected according to the culture capacity, and examples thereof include test tubes, flasks, fermenters, photobioreactors, and the like.

배양 온도는 15 내지 80 ℃, 바람직하게는 20-35 ℃, 보다 바람직하게는 23-30 ℃ 일 수 있으며, 통상적으로 1-90 일간, 바람직하게는 5-60 일간, 보다 바람직하게는 5-30일간 배양할 수 있다.The incubation temperature may be 15 to 80 ° C, preferably 20-35 ° C, more preferably 23-30 ° C, and usually 1-90 days, preferably 5-60 days, more preferably 5-30 days It can be cultured daily.

본 발명은 또한, 상기 헤마토코쿠스 플루비알리스 배양방법을 이용하여 아스타잔틴을 제조하는 방법을 제공한다.The present invention also provides a method for producing astaxanthin using the Hematococcus fluvialis culture method.

이하, 실시예를 통해서 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하기로 하되, 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail through examples, but the following examples are only for helping understanding of the present invention, and do not limit the scope of the present invention.

재료ingredient

본 발명에 사용된 균주는 Haematococcus pluvialis NIES-144로서 National Institute for Environmental Studies, Tsukuba, Japan으로부터 구입하여 사용하였다.The strain used in the present invention was Haematococcus pluvialis NIES-144, which was purchased from the National Institute for Environmental Studies, Tsukuba, Japan.

본 실험에 사용된 배지의 종류는 모두 NIES-C 배지 및 NIES-N 배지 2가지이고, 이들의 구성성분을 하기 표 1에 나타내었다.The types of media used in this experiment were both NIES-C medium and NIES-N medium, and their components are shown in Table 1 below.

Figure 112018099545218-pat00001
Figure 112018099545218-pat00001

상기 표 1에서,In Table 1 above,

- NIES-C 배지: autotrophic medium (자가영양배지, 목적: 생장)- NIES-C medium: autotrophic medium (autotrophic medium, purpose: growth)

- NIES-N 배지: autotrophic medium (자가영양배지, 목적: 생육억제, 광유발, 아스타잔틴 생산)- NIES-N medium: autotrophic medium (autotrophic medium, purpose: growth inhibition, photoinduction, astaxanthin production)

- 배지 부피 : 150 mL(플라스크), 20 L(옥외 광배양기)- Media volume: 150 mL (flask), 20 L (outdoor light incubator)

- CO2 supply : 3~5%(v/v)- CO 2 supply : 3~5%(v/v)

- 광조건 : 20 μE/m2/s during 'green' stage(vegetative growth); 150 μE/m2/s during 'red' stage(inductive growth)- Light conditions: 20 μE/m 2 /s during 'green' stage (vegetative growth); 150 μE/m 2 /s during 'red' stage (inductive growth)

실시예Example . 배양 배지의 pH에 따른 . Depending on the pH of the culture medium ParaphysodermaParaphysoderma sedebokerensessedebokerenses 곰팡이 오염균에 의한 감염률 측정 및 배양 배지의 pH가 Measurement of the infection rate by fungal contaminants and the pH of the culture medium 헤마토코쿠스의hematococcal 성장에 미치는 영향 측정 Measure impact on growth

로그대수기 (exponenial phase) 상태의 헤마토코쿠스를 pH 3~9 까지 범위의 배지(pH 3, 4, 4.5, 5, 6, 7, 7.5(control, 대조군), 8, 9) 30ml에 O.D (680nm)= 0.5 농도로 접종하고 P. sedebokerenses 곰팡이 오염균을 각 20μl 씩 접종하여 배양하면서 감염률(%)을 확인하였다. 접종한 P. sedebokerenses 곰팡이 오염균은 7일 간격으로 헤마토코쿠스 셀을 접종하여 유지시켜온 상태로, 헤마토코쿠스 셀 기준 2×105 cell/ml 농도에서 곰팡이 균 오염률이 70~80 % 범위에 올 때의 셀을 사용하여 실험을 진행하였다. 감염률은 광학현미경과 cell counter (hemocytometer)로 감염률(%) = 감염된 셀 수/전체 셀 수 x 100 으로 계산하였다.Haematococcus in the logarithmic phase (exponenial phase) was OD in 30 ml of medium ranging from pH 3 to 9 (pH 3, 4, 4.5, 5, 6, 7, 7.5 (control), 8, 9) (680nm) = 0.5 concentration, and P. sedebokerenses fungal contaminants were inoculated by 20 μl each, and the infection rate (%) was confirmed while culturing. The inoculated P. sedebokerenses fungal contamination has been maintained by inoculating hematococcal cells at 7-day intervals, and the fungal contamination rate is 70 to 80 at a concentration of 2 × 10 5 cell / ml based on hematococcal cells. Experiments were conducted using cells in the % range. The infection rate was calculated as infection rate (%) = number of infected cells/total number of cells x 100 using an optical microscope and a cell counter (hemocytometer).

또한, 상기 곰팡이 오염균을 접종하지 않고, 배양 배지의 초기 pH를 3, 4, 7.5로 설정하여 배지의 pH가 헤마토코쿠스 플루비알리스의 성장에 미치는 영향을 측정하였다. In addition, the initial pH of the culture medium was set to 3, 4, or 7.5 without inoculation of the fungal contaminants, and the effect of the pH of the medium on the growth of Haematococcus fluvialis was measured.

도 1은 헤마토코쿠스 플루비알리스 배양 배지에 Paraphysoderma sedebokerenses 곰팡이 오염균을 접종하여 배양시 배양 배지의 초기 pH에 따른 감염률을 측정한 결과를 나타내며, 도 2는 배양 배지의 초기 pH에 따른 배양 0, 6, 8, 10일차 감염률을 나타낸 그래프 및 배양 배지의 색 변화를 나타낸 사진이며, 도 3은 헤마토코쿠스 플루비알리스 배양 배지에 Paraphysoderma sedebokerenses 곰팡이 오염균을 접종하여 배양시 배양 배지의 초기 pH가 4인 경우와 pH가 7.5(대조군)인 경우의 배양 10일차 헤마토코쿠스 플루비알리스의 현미경 이미지이다.1 is Paraphysoderma in Hematococcus fluvialis culture medium sedebokerenses Shows the results of measuring the infection rate according to the initial pH of the culture medium when inoculated with fungal contaminants and cultured. It is a photograph showing the color change, and Figure 3 is Paraphysoderma in Haematococcus fluvialis culture medium sedebokerenses These are microscopic images of Haematococcus fluvialis on the 10th day of culture when the initial pH of the culture medium is 4 and the pH is 7.5 (control) when inoculated with fungal contaminants.

도 4는 헤마토코쿠스 플루비알리스 배양 배지 배양시 배양 배지의 초기 pH가 3, 4, 7.5인 경우의 성장성을 비교한 결과를 나타낸 그래프이다.Figure 4 is a graph showing the results of comparing the growth properties when the initial pH of the culture medium is 3, 4, 7.5 when cultured in Haematococcus fluvialis culture medium.

실험 결과, 도 1에 나타난 바와 같이, 배지의 초기 pH 3, pH 4, pH 4.5인 경우를 제외하고는 모두 배양 18일 차에 오염률이 대략 40-100%에 이르는 것으로 나타났다. 또한, 도 2에 나타난 바와 같이 pH가 7-8로 중성 내지 약염기성 범위인 경우 약 8일만에 오염률이 80% 이상으로 나타났으며, 배양 18일 차에는 pH 6-9 범위의 셀의 오염률을 100%로 배양된 셀이 모두 오염되는 것으로 확인되었다. 이러한 결과는 도 2의 사진에서 배양 0일 차에 초록색이었던 셀들이 오염되어 갈색으로 변한 것을 통해서도 확인할 수 있다. 또한, 배지의 초기 pH가 5인 경우에는 배양 18일 차에 오염률이 약 50%로 나타났으며(도 1, 2), 30일 내에 오염률이 100%에 이르는 것을 확인하였다(도면 미도시). 반면, 배지의 초기 pH가 3, 4, 4.5 인 경우 배양 18일 차에 오염된 셀이 전혀 관찰되지 않았으며(도 1, 2), 배양 30일 까지도 오염률이 0%로 유지되는 것을 확인하였다(도면 미도시). 이러한 결과는 도 3의 현미경 이미지에서 초기 pH가 7.5인 배지에서는 배양 10일차에 곰팡이 균에 의해 셀이 모두 오염되어 갈색으로 변한 반면, 초기 pH가 4인 배지에서는 셀이 깨끗한 상태를 유지하는 것을 통해서도 확인할 수 있다. As a result of the experiment, as shown in FIG. 1, it was found that the contamination rate reached approximately 40-100% on the 18th day of culture except for the case of the initial pH 3, pH 4, and pH 4.5 of the medium. In addition, as shown in Figure 2, when the pH was in the neutral to weakly basic range of 7-8, the contamination rate was more than 80% in about 8 days, and on the 18th day of culture, the contamination of the cells in the pH range of 6-9 It was confirmed that all cells cultured at a rate of 100% were contaminated. These results can also be confirmed through the fact that the green cells on the 0th day of culture in the photograph of FIG. 2 are contaminated and turned brown. In addition, when the initial pH of the medium was 5, the contamination rate was about 50% on the 18th day of culture (Figs. 1 and 2), and it was confirmed that the contamination rate reached 100% within 30 days (not shown). ). On the other hand, when the initial pH of the medium was 3, 4, or 4.5, no contaminated cells were observed on the 18th day of culture (FIG. 1, 2), and it was confirmed that the contamination rate was maintained at 0% until the 30th day of culture. (drawing not shown). These results show that in the microscopic image of FIG. 3, all cells were contaminated by mold on the 10th day of culture in the medium with an initial pH of 7.5 and turned brown, whereas in the medium with an initial pH of 4, the cells remained clean. You can check.

또한, 도 4에 나타난 바와 같이 배양 배지의 초기 pH가 3인 경우에는 셀의 성장성이 매우 떨어지는 것을 확인할 수 있는 반면, pH 4에서는 셀이 pH 7.5에 비해서는 약 10-20% 덜 성장하지만 큰 손실 없이 잘 성장하는 것을 확인할 수 있다.In addition, as shown in Figure 4, when the initial pH of the culture medium is 3, it can be seen that the growth of the cells is very low, whereas at pH 4, the cells grow about 10-20% less than at pH 7.5, but a large loss You can see that it grows well without it.

또한, 헤마토코쿠스 플루비알리스의 배양 과정을 통해 배양 배지의 pH가 상승하는 것을 확인하였으며, 구체적으로 배양 배지의 초기 pH가 4인 경우에는 셀이 성장하면서 배양 30일 차에 pH가 5까지 상승하며, 초기 pH가 5인 경우에는 배양 30일 차에 pH가 5.5를 넘어서까지 상승하는 것을 확인하였다 (도면 미도시).In addition, it was confirmed that the pH of the culture medium increased through the culture process of Haematococcus fluvialis. Specifically, when the initial pH of the culture medium was 4, the pH increased to 5 on the 30th day of culture as the cells grew. rising, and when the initial pH was 5, it was confirmed that the pH rose beyond 5.5 on the 30th day of culture (not shown).

이러한 결과들을 종합적으로 고려해 볼때, 헤마토코쿠스 플루비알리스의 성장성 저해에 큰 영향을 미치지 않으면서, 곰팡이 균에 의한 오염을 완전히 차단하기 위해서는 배양 배지의 초기 pH를 4 내지 4.5로 설정하고, 배양 기간 동안 배양 배지의 pH를 5.5 이하로 유지시켜 주는 것이 바람직하다는 것을 확인하였다. Considering these results comprehensively, in order to completely block contamination by fungi without significantly affecting the growth inhibition of Haematococcus fluvialis, the initial pH of the culture medium was set to 4 to 4.5, and the culture During the period, it was confirmed that it is preferable to maintain the pH of the culture medium at 5.5 or less.

Claims (6)

산성 조건의 배지에서 헤마토코쿠스 플루비알리스(Haematococcus pluvialis)를 배양하는 공정을 포함하고,
상기 산성 조건은 배지에 산을 첨가함으로써 조정되며,
상기 배지의 초기 pH는 4 내지 4.5이고, 상기 배양 공정 동안 상기 배지의 pH는 5.5 이하로 유지되는 것을 특징으로 하는 헤마토코쿠스 플루비알리스에 대한 외부 미생물의 감염을 억제하는 방법.
Including the step of culturing Haematococcus pluvialis in an acidic medium,
The acidic conditions are adjusted by adding acid to the medium;
The initial pH of the medium is 4 to 4.5, and the pH of the medium is maintained at 5.5 or less during the culturing process.
삭제delete 삭제delete 제1항에 있어서,
상기 산은 황산, 염산, 질산, 아세트산, 시트르산, 숙신산, 인산, 말산, 부티르산, 프로피온산, 옥살산, 글루콘산, 타르타르산, 프탈산, 탄산 및 아스코르브산으로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 헤마토코쿠스 플루비알리스에 대한 외부 미생물의 감염을 억제하는 방법.
According to claim 1,
The acid is at least one selected from the group consisting of sulfuric acid, hydrochloric acid, nitric acid, acetic acid, citric acid, succinic acid, phosphoric acid, malic acid, butyric acid, propionic acid, oxalic acid, gluconic acid, tartaric acid, phthalic acid, carbonic acid and ascorbic acid. A method for inhibiting the infection of external microorganisms against coccus fluvialis.
제1항에 있어서,
상기 배지는 MES 버퍼를 포함하는 것을 특징으로 하는 헤마토코쿠스 플루비알리스에 대한 외부 미생물의 감염을 억제하는 방법.
According to claim 1,
The medium is a method for inhibiting the infection of external microorganisms for Haematococcus fluvialis, characterized in that it comprises an MES buffer.
제1항에 따른 방법을 이용한 아스타잔틴의 제조방법.A method for producing astaxanthin using the method according to claim 1.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
J. MICROBIOL. BIOTECHNOL., vol.16(6), pp. 849~854(2006)*
KOREAN JOURNAL OF APPLIED MICROBIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY, vol.29(4), pp.227~233(2001)*

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