KR102532123B1 - 근적외선 조사를 동반하는 비가역적 전기천공법의 적용 방법 - Google Patents
근적외선 조사를 동반하는 비가역적 전기천공법의 적용 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명의 실시 예에 따른 세포의 자멸사를 유도하기 위한 비가역적 전기천공 시스템의 적용 방법은, 상기 세포에 조사될 근적외선의 조사 조건을 설정하는 단계, 상기 조사 조건에 따라 상기 근적외선을 상기 세포에 조사하는 단계, 그리고 상기 세포에 비가역적 전기천공을 제공하기 위한 고전압 또는 고전류의 펄스를 인가하는 단계를 포함한다.
Description
본 발명은 전기천공 시스템에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 근적외선 조사를 전처리로 적용하여 비가역적 전기천공법의 효과를 향상시킬 수 있는 비가역적 전기천공법의 적용 방법에 관한 것이다.
비가역적 전기천공법(Irreversible Electroporation: 이하, IRE)은 전극의 양 끝단에 고전압 또는 고전류를 흐르게 하여 전극 사이에 강한 전기장을 생성하여 고형암과 같은 악성 종양을 세포 단위로 소작하여 제거하는 방법이다. 이러한 방법은 주요 혈관 및 장기에 인접하여 수술적 치료가 불가능한 환자에게 새로운 국소 치료법으로 제한적인 범위에서 이용되고 있다.
IRE는 직류의 고전류 구형파 펄스에 의해서 세포막의 일시적인 투과성을 유도하는 방법이다. 인가된 전기장이 투과성 임계값 이상으로 막횡단 전위를 증가시켜 수성의 기공(Pore)을 형성할 때 투과성이 유도된다. 높은 전기 에너지에 의해 기공을 봉인할 수 없고, 세포는 사멸될 수 있다. 또한, 기공은 이물질을 세포 내로 전달할 수 있게 한다. 항암제와 칼슘은 종양 조직에서 비가역적 전기천공의 선택성과 효율성을 증가시키기 위해 최근에 사용되고 있다. 이러한 시도는 방사선 암치료법에 비해 부작용이 적고 비용이 저렴하여 주목받고 있다.
하지만, IRE는 조직에서 고전압을 사용하기 때문에 임상 적용에 한계가 있다. IRE의 절제는 종종 전기장 분포로 인해 비가역적 전기천공 영역, 가역적 전기천공 영역 및 손상되지 않은 영역의 3개의 영역을 갖는다. 그 결과 직경이 3cm 이상인 큰 종양은 불완전하게 절제된다. 이러한 단점을 극복하기 위해서는 전극에서 전기분해를 피할 수 없고 때때로 근육수축을 유발하는 상당히 높은 전압이 도입되어야 한다. 이러한 문제를 해결하기 위해 일부 연구에서는 필요한 전기장 강도를 낮추는 보다 효율적인 방법을 모색하고 있다. 예를 들면, 타깃 주변의 이온성 물질의 분포는 전기천공의 효과를 향상시킬 수 있는 것으로 알려져 있다. 어떤 연구에서는 전기천공된 조직을 둘러싼 양이온성 펩타이드가 인가될 전기장의 강도를 감소시킬 수 있음을 보여준다. 다른 연구에서는 전기천공 전에 세포의 과분극을 유도하기 때문에 세포에 이오노마이신을 추가하면 전기천공의 효과가 더 높아진다는 것을 보여주었다. 하지만, 전기천공에 사용되는 이러한 화학물질은 콜라겐 섬유로 인해 널리 확산되기 어렵고, 예상치 못한 부작용을 일으킬 수 있다.
따라서, 화학물질을 사용하지 않고 부작용이 적고 저렴한 비용으로 비가역적 전기천공법의 단점들을 극복할 수 있는 기술이 절실한 실정이다.
본 발명의 목적은, 저비용으로도 부작용을 줄이고도 높은 효율을 제공할 수 있는 비가역적 전기천공법의 적용 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 일 실시 예에 따른 세포의 자멸사를 유도하기 위한 비가역적 전기천공 시스템의 적용 방법은, 상기 세포에 조사될 근적외선의 조사 조건을 설정하는 단계, 상기 조사 조건에 따라 상기 근적외선을 상기 세포에 조사하는 단계, 그리고 상기 세포에 비가역적 전기천공을 제공하기 위한 고전압 또는 고전류의 펄스를 인가하는 단계를 포함한다.
이 실시 예에서, 상기 근적외선은 800nm 내지 900nm, 또는 1000nm 내지 1200nm의 파장의 광을 생성하는 발광 다이오드(LED)로부터 제공된다.
이 실시 예에서, 상기 근적외선은 1,000μW/cm2 내지 10,000μW/cm2의 전력 밀도를 갖는다.
이 실시 예에서, 상기 근적외선은 1J/cm2 내지 10J/cm2의 세기로 상기 세포에 조사된다.
이 실시 예에서, 상기 근적외선을 연속적(continuous wave)으로 혹은 10% 내지 60%의 듀티 사이클(Duty cycle) 및 3kHz 내지 300kHz의 펄스(Pulsed wave)로 상기 세포에 조사된다.
이 실시 예에서, 상기 조사 조건은, 상기 세포의 막횡단 전위에서 과분극을 유도하고, 상기 세포의 세포질 활성 산소종(ROS)을 감소시키기 위한 근적외선 파장 또는 강도에 대응한다.
상술한 본 발명의 실시 예에 따르면, 고전압 펄스의 인가 전에 근적외선 조사를 전처리로 적용하여 저비용으로도 높은 효율의 비가역적 전기천공법을 제공할 수 있다.
도 1은 본 발명의 실시 예에 따른 근적외선 조사를 동반하는 비가역적 전기천공법의 적용 방법을 보여주는 도면이다.
도 2는 본 발명의 근적외선 조사를 전처리로 사용하는 비가역적 전기천공법을 간략히 보여주는 순서도다.
도 3은 근적외선의 조사 후의 세포 생존율, 세포질 막횡단 전위(CMP), 미토콘드리아 막횡단 전위(MMP) 및 세포내 활성 산소종(ROS)의 수준을 측정한 값을 간략히 보여주는 그래프들이다.
도 4는 본 발명의 근적외선(NIR)을 조사하는 비가역적 전기천공법의 효과를 검증하기 위한 테스트 절차를 보여주는 순서도이다.
도 5는 본 발명의 근적외선 전처리를 적용한 비가역적 전기천공법(IRE) 직후 암세포의 원형질막 분해 향상 효과를 보여주는 도면들이다.
도 6은 근적외선(NIR) 전처리 유무에 따른 비가역적 전기천공법(IRE)의 효과들을 비교하여 보여주는 도면들이다.
도 7은 근적외선의 조사에 따른 세포의 전기적 특징을 보여주는 도면들이다.
도 2는 본 발명의 근적외선 조사를 전처리로 사용하는 비가역적 전기천공법을 간략히 보여주는 순서도다.
도 3은 근적외선의 조사 후의 세포 생존율, 세포질 막횡단 전위(CMP), 미토콘드리아 막횡단 전위(MMP) 및 세포내 활성 산소종(ROS)의 수준을 측정한 값을 간략히 보여주는 그래프들이다.
도 4는 본 발명의 근적외선(NIR)을 조사하는 비가역적 전기천공법의 효과를 검증하기 위한 테스트 절차를 보여주는 순서도이다.
도 5는 본 발명의 근적외선 전처리를 적용한 비가역적 전기천공법(IRE) 직후 암세포의 원형질막 분해 향상 효과를 보여주는 도면들이다.
도 6은 근적외선(NIR) 전처리 유무에 따른 비가역적 전기천공법(IRE)의 효과들을 비교하여 보여주는 도면들이다.
도 7은 근적외선의 조사에 따른 세포의 전기적 특징을 보여주는 도면들이다.
이하, 본 발명의 일부 실시 예들을 예시적인 도면을 참조하여 상세하게 설명한다. 각 도면의 구성요소들에 참조 부호를 부가함에 있어서, 동일한 구성 요소들에 대해서는 비록 다른 도면상에 표시되더라도 가능한 한 동일한 부호를 가질 수 있다. 또한, 본 발명을 설명함에 있어, 관련된 공지 구성 또는 기능에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명은 생략할 수 있다.
또한, 본 발명의 구성요소를 설명하는 데 있어서, 제 1, 제 2, A, B, (a), (b) 등의 용어를 사용할 수 있다. 이러한 용어는 그 구성 요소를 다른 구성 요소와 구별하기 위한 것일 뿐, 그 용어에 의해 해당 구성 요소의 본질, 차례, 순서 또는 개수 등이 한정되지 않는다. 어떤 구성 요소가 다른 구성 요소에 "연결", "결합" 또는 "접속"된다고 기재된 경우, 그 구성 요소는 그 다른 구성 요소에 직접적으로 연결되거나 또는 접속될 수 있지만, 각 구성 요소 사이에 다른 구성 요소가 "개재"되거나, 각 구성 요소가 다른 구성 요소를 통해 "연결", "결합" 또는 "접속"될 수도 있다고 이해되어야 할 것이다.
도 1은 본 발명의 실시 예에 따른 근적외선 조사를 동반하는 비가역적 전기천공법의 적용 방법을 보여주는 도면이다. 비가역적 전기천공 시스템(100)은 근적외선을 조사하기 위한 LED(110), 고전압 펄스를 인가하기 위한 비가역적 전기천공기(120)를 포함할 수 있다.
고전압 펄스를 인가하기 전에 수행되는 전처리 절차로서, LED(110)를 사용하여 근적외선(NIR)이 암세포(10)에 조사된다. 여기서, 암세포(10)는 인간 자궁경부암 세포인 'HeLa 세포'일 수 있다. 암세포(10)는 배양 접시(115) 상에 부착된 상태로 배양될 수 있다. 그리고 비가역적 전기천공법(IRE)을 적용하기 전의 전처리 과정으로서 근적외선(NIR)이 조사될 것이다. 근적외선은 800nm 내지 900nm, 또는 1000nm 내지 1200nm의 파장의 광들이 사용될 수 있다. 또한, 근적외선은 1,000μW/cm2 내지 10,000μW/cm2의 전력 밀도로 제공될 수 있고, 1J/cm2 내지 10J/cm2의 세기로 세포에 조사될 수 있다. 근적외선을 연속적(continuous wave)으로 혹은 10% 내지 60%의 듀티 사이클(Duty cycle) 및 3kHz 내지 300kHz 주파수의 펄스(Pulsed wave)로 상기 세포에 조사될 수 있을 것이다.
실시 예에서, 근적외선의 조사는 810nm 파장을 갖고, 3 J/cm2 세기의 근적외선이 활용될 수 있을 것이다. 균일한 빛 전달을 위해 복수의 LED 광원은 16개의 어레이 형태로 배열될 수 있다. 하지만, 근적외선의 조사 방식은 본 발명의 방식에만 국한되지 않음은 잘 이해될 것이다. 근적외선의 조사가 완료되면, 비가역적 전기천공기(120)의 전극(125)에 의해서 암세포(10)에 대한 고전압 펄스(또는, 고전기장 펄스)가 인가될 것이다.
이상의 본 발명의 비가역적 전기천공 시스템(100)은 전처리 동작으로 근적외선을 암세포(10)에 조사할 수 있다. 비가역적 전기천공법(IRE)은 부작용이 적고 회복이 빠르기 때문에 절제술로 주목받고 있다. 그러나 인가된 고전압의 높은 전류는 근육 수축을 유발할 수 있다. 근적외선(NIR)은 최근 모드 의존적 방식으로 막을 가로질러 과분극을 유도하는 것으로 보고되었다. 본 발명과 같이 3 J/cm2의 근적외선(NIR)으로 전처리하면, 암세포(10)의 막전위의 변화를 유도하여 비가역적 전기천공법(IRE)에 의한 세포자멸사를 약 2배 향상시킬 수 있다. 근적외선(NIR)은 화학물질보다 더 나은 공간적, 시간적 분포 제어를 가지므로 시술의 공간 선택성을 높이고, 비가역적 전기천공법(IRE) 치료의 부작용을 줄일 수 있다.
도 2는 본 발명의 근적외선 조사를 전처리로 사용하는 비가역적 전기천공법을 간략히 보여주는 순서도다. 도 2를 참조하면, 본 발명의 비가역적 전기천공법(IRE)은 암세포나 환부에 고전압 펄스를 인가하기 전에 근적외선 조사를 전처리 과정으로 포함한다.
S110 단계에서, 전처리 과정으로서 제공되는 근적외선 조사를 위한 조건 설정이 이루어진다. 예를 들면, 근적외선(NIR)의 파장, 강도, 조사 시간 등에 대한 설정이 이루어질 것이다. 근적외선(NIR)의 강도나 조사 시간은 세포 생존율, 세포질 막횡단 전위(CMP), 미토콘드리아 막횡단 전위(MMP) 및 세포내 활성 산소종(ROS)의 양 등의 실험치를 기초로 결정될 수 있다.
S120 단계에서, 설정된 조사 시간 또는 강도에 따라 근적외선(NIR)이 암세포나 환부에 조사된다. 예를 들면, 3 J/cm2의 세기로 810nm 파장의 근적외선(NIR)으로 전처리가 수행될 수 있다.
S130 단계에서, 비가역적 전기천공법(IRE)을 통해서 환부나 암세포에 대한 절제나 소작이 진행된다. 즉, 비가역적 전기천공법(IRE)의 적용을 위해 미리 결정된 수의 고전압 또는 고전류의 펄스가 환부에 인가된다.
이상의 순서도에 따르면, 본 발명의 비가역적 전기천공법(IRE)에서는 고전압 펄스를 인가하기 전의 전처리로서 근적외선(NIR)의 조사가 선행된다. 근적외선(NIR)의 조사를 통하여 암세포(10, 도 1 참조)의 막전위의 변화를 유도하여 비가역적 전기천공법(IRE)에 의한 세포자멸사를 획기적으로 향상시킬 수 있다.
도 3은 근적외선의 조사 후의 세포 생존율, 세포질 막횡단 전위(CMP), 미토콘드리아 막횡단 전위(MMP) 및 세포내 활성 산소종(ROS)의 수준을 측정한 값을 간략히 보여주는 그래프들이다. 도 3을 참조하면, 근적외선(NIR)의 조사 시간 또는 조사 강도를 상술한 측정값들을 기초로 결정할 수 있다.
(a)의 그래프는 근적외선의 조사 강도에 따른 세포 생존율(Viability)을 보여준다. 근적외선(NIR) 조사 직후 세포 생존율(Viability)의 평가를 위해 비색법에 의한 DNA 합성의 정량화에 사용된 'WST-1 분석'을 사용하였다. 세포 생존율(Viability)은 근적외선(NIR) 조사가 4 J/cm2 강도 미만(적색 상자)일 때 영향을 받지 않았고 5 J/cm2 강도에서 약간 감소함을 알 수 있다.
(b)의 그래프는 근적외선의 조사 강도에 따른 세포질 막횡단 전위(CMP)를 간략히 보여준다. 세포질 막횡단 전위(CMP)는 FLIPR 염료로 평가되는데, 이는 염료가 표백될수록 과분극을 나타내고, 염료가 강화됨에 따라 탈분극을 나타낸다. 2~4 J/cm2 세기의 근적외선에 노출된 세포(*로 표시됨)는 대조군과 비교하여 과분극을 보였다.
(c)의 그래프는 근적외선의 조사 강도에 따른 미토콘드리아 막횡단 전위(MMP)를 간략히 보여준다. 미토콘드리아 막횡단 전위(MMP)는 JC-1 염료로 평가되었다. 따라서, JC-1 염료가 미토콘드리아 내부 막에서 응집되어 편광된 미토콘드리아에서는 적색 형광을 나타내고 다른 곳에서는 녹색 형광을 나타낸다. 적색 대 녹색 형광 강도의 비율은 미토콘드리아 막횡단 전위(MMP)의 정도를 결정하는 데 사용되었다. 1~2 J/cm2의 강도(적색 상자로 표시)의 근적외선에 노출된 세포는 대조군과 비교하여 과분극을 보였다.
(d)의 그래프는 근적외선의 조사 강도에 따른 세포내 활성 산소종(Reactive Oxygen Species: 이하, ROS)의 수준을 보여준다. 세포내 활성 산소종(ROS)의 생산은 근적외선(NIR) 선량에 선형적으로 의존하지는 않았다. 2 J/cm2의 근적외선(NIR) 조사를 받은 세포는 증가된 세포내 활성 산소종(ROS) 양을 나타낸 반면, 3~5 J/cm2의 근적외선(NIR) 조사를 받은 세포는 대조군과 비교하여 세포내 활성 산소종(ROS)의 감소를 나타냈다.
본 발명에서는 상술한 조건을 고려하여 비가역적 전기천공법(IRE)을 위해 3J/cm2 강도의 근적외선(NIR)을 조사하였다. 이는, 세포의 증식에 해로운 영향을 미치지 않으면서, 세포질 막횡단 전위(CMP) 과분극을 유도하고, 미토콘드리아 막횡단 전위(MMP)에 영향을 미치지 않으며, 세포내 활성 산소종(ROS) 수준을 감소시키는 비가역적 전기천공(IRE)을 가능하게 한다.
도 4는 본 발명의 근적외선(NIR)을 조사하는 비가역적 전기천공법의 효과를 검증하기 위한 테스트 절차를 보여주는 순서도이다. 도 4를 참조하면, 근적외선(NIR)을 조사하는 전처리 과정을 포함하는 경우에 대조군에 대비한 세포 사멸 비율을 측정할 수 있다.
S210 단계에서, 비가역적 전기천공법을 적용하기 위해 근적외선(NIR)이 조사될 세포가 배양된다. 세포는 인간 자궁경부암 세포주인 'HeLa 세포'가 사용될 수 있다. 'HeLa 세포'는 10% 소태아혈청(FBS), 1% 항생제(페니실린(100U/ml), 그리고 스트렙토마이신(100μg/ml)이 보충된 RPMI 1640 배지, 그리고 5% 이산화탄소(CO2)가 포함된 가습 환경에서 37°C에서 배양되었다. 그런 다음 테스트 24시간 전에 직경 35mm 배양 접시에 3×105개의 세포가 파종되었다.
S220 단계에서, 배양된 세포에 대한 근적외선(NIR)의 조사가 비가역적 전기천공법의 전처리로서 수행된다. 배양 세포의 근적외선(NIR) 조사를 위해 발광 다이오드(LED) 어레이와 8-비트 마이크로프로세서 기반 컨트롤러(UM_MC95FG308_V3.20_EN)로 구성된 장치가 사용될 수 있다. 발광 다이오드(LED) 어레이는 파장이 810nm인 LED들이 5mm 간격으로 총 16개가 배열될 수 있다. 배양 접시를 통한 균일한 빛 전달을 위해 세포 배양 플레이트를 LED 어레이 끝에서 19.3mm 떨어진 곳에 배치될 수 있다. 전력 측정기(PM-USB-100, Thorlabs, USA)를 사용하여 빛의 균일성을 평가하기 위해 5개 위치에서 빛의 전력 밀도가 측정된다. 전력 밀도는 3,627±2.67 μW/cm2로 조사면적 전체에 걸쳐 대체로 균일하다. 이 장치는 빛이 배지로부터의 흡수 손실 없이 접시 바닥을 통해 세포로 전파되도록 설계되었다. 세포는 연속파 모드에서 1~5 J/cm2로 조사되었다. 각 실험 전에 광 전력 밀도를 평가했다.
S230 단계에서, 근적외선(NIR)의 조사에 따른 세포 영향을 분석하기 위한, 세포 생존력(Cell viability), 세포질 막횡단 전위(CMP), 미토콘드리아 막횡단 전위(MMP), 세포내 활성 산소종(ROS), 세포 커패시턴스(Capacitance) 및 컨덕턴스(Conductance)의 측정이 수행된다.
세포 생존력(Cell viability)은 수용성 테트라졸륨 솔트(Water-Soluble Tetrazolium salt-1; WST-1) 조합체(EZ-Cytox, EZ-3000, Korea)를 이용하여 조사되었다. 테스트 24시간 전에 96-웰 플레이트(well plate)에 1.0×104 개의 세포가 파종되었다. 그리고 플레이트 리더(Tecan, USA)를 사용하여 450 nm에서의 흡광도를 측정하였다. 또한, 비가역적 전기천공법(IRE) 적용 후 평가를 위해 큐벳에서 IRE 처리된 세포를 96-웰 플레이트에 접종하고 6시간 후에 생존력 분석을 수행했다.
세포질 막횡단 전위(CMP)는 제조사의 프로토콜에 따라 형광 이미징 플레이트 리더(FLIPR; Molecular Devices, CA, USA)를 사용하여 측정되었다. 'FLIPR' 용액을 배양 배지와 동일한 부분으로 혼합하여 작업 용액을 제조하였다. 1~5 J/cm2의 근적외선(NIR) 조사 후 세포를 'Dulbecco'의 인산염 완충 식염수(DPBS)로 1회 세척하고 'FLIPR' 작업 용액을 첨가했다. 세포를 37 ℃에서 30분 동안 배양한 다음 DPBS로 세척했다. 채취한 세포의 형광 측정은 유세포분석기(BD FACSVerse™; Becton, Dickinson and Company, USA)로 수행하였고, 각 실험 조건의 중앙값은 'BD FACSuite™'소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 대조군과 비교한 각 조건의 상대적 강도를 폴드(fold) 값으로 표현하였다.
미토콘드리아 막횡단 전위(MMP)는 JC-1 미토콘드리아 막 전위 분석 키트(ab113850, Abcam, USA)를 사용하여 근적외선(NIR) 처리 직후에 평가되었다. 수확된 세포를 DPBS로 세척하고, 1배 희석 완충액에서 10μM JC-1에서 30분 동안 인큐베이션하고, 1배 희석 완충액으로 2회 세척하였다. 또한, 2.0×105 세포를 50μL의 버퍼와 함께 96-웰 블랙 폴리스티렌 플레이트(CLS3603, Corning, USA) 내의 각 웰의 50μL로 옮겼다. 형광은 다중 모드 마이크로플레이트 판독기(SPARK 10M, Tecan, Austria)를 사용하여 평가되었다. 미토콘드리아 막횡단 전위(MMP)는 RFU(빨간색/녹색)에서 JC-1의 비율로 계산되었다.
세포내 활성 산소종(ROS)의 역할을 테스트하기 위해 ROS 스캐빈저 N-acetyl-l-cysteine(NAC: 1mM, Sigma A7250) 처리를 실험 전에 30분 동안 배양 접시의 세포에 적용하였다. 그리고 근적외선(NIR) 처리후, 2',7'-Dichlorodihydrofluorescein diacetate(H2DCFDA; D399, ThermoFisher Scientific)를 사용하여 세포내 활성 산소종(ROS) 수준을 분석했다. 미리 설정된 조건에 따라 세포에 근적외선(NIR)을 조사하고 프로브가 감광제로 작용하는 것을 방지하기 위해 5분 동안 배양하였다. 완료 후 세포를 세척하고 H2DCFDA를 최종 농도 10μM로 첨가하고 DPBS에 희석하였다. 세포를 37℃에서 30분 동안 용액에서 인큐베이션하였다. DPBS로 3회 세척한 후, 다시 30분 동안 세포를 배양하고 세포당 형광을 유세포 분석기로 측정하였다. 대조군과 비교한 각 그룹의 상대적 강도는 배수 변화로 표현하였다.
더불어, 근적외선(NIR) 조사 후 전기적 응답을 조사하기 위해 8~10 Ω/square의 저항률을 갖는 투명 전극으로 ITO(Indium Tin Oxide) 코팅 유리 슬라이드가 사용될 수 있다. 유리는 25mm×76mm의 사이즈로 절단될 수 있다. ITO 표면은 FeCl3(2%~5%(wt/wt))와 함께 HCl(1:1 v/v 희석, 진한 산/물)을 사용하여 에칭되어 거리가 5mm인 평행 전극을 생성했다. 식각의 완료는 저항(Protek 608, Protek, Korea)을 측정하여 확인하였다. 폴리디메틸실록산(PDMS; Sigma Aldrich, USA)과 실리콘 엘라스토머 경화제(9:1 w/w)를 혼합하고 밤새 경화시켰다. 직경 10mm의 원형 구멍을 펀칭한 후 ITO 유리 기판에 PDMS 블록을 10분 동안 산소 플라즈마 후 접합하였다. 그런 다음 에틸 알코올로 소독하고 PBS로 철저히 세척하고 2.0×106 세포를 PDMS 웰에 파종하고 12시간 동안 배양하였다. 용량과 전도도는 LCR meter(LCR-6002, GWINSTEK, USA)를 사용하여 50Hz에서 2,000Hz 범위의 1.0V 레벨에서 50Hz 단위로 병렬로 측정되었다. 온도를 유지하기 위해 이산화탄소(CO2) 인큐베이터에서 측정을 수행했다.
S240 단계에서, 비가역적 전기천공법(IRE)의 적용을 위한 전기장 분포 시뮬레이션이 수행된다. 오픈 소스 'OpenFOAM'에서 개발한 Epo codeTM(Standard Co. Ltd., Korea)를 사용하여 전극 사이에 인가된 전계 강도를 시뮬레이션하였다. 전기장에 대한 지배 방정식은 전기 준정적 근사를 사용하여 아래 수학식 1에서와 같이 전위(Φ)의 경도를 취하여 결정된다.
여기서, σ는 배양 전도도이다. 전기적 경계는 'Φ = V(소스)' 및 'Φ = 0(싱크)'으로 설정되었다. 다른 모든 경계는 전기 절연체로 처리되었다.
S250 단계에서, 타깃 세포에 대한 비가역적 전기천공법(IRE)이 적용된다. S240 단계에서의 시뮬레이션을 기반으로 하여 1Hz의 주파수에서 100㎲ 너비의 직사각형 직류 펄스 8개, 전압 300, 375 및 450V(거리 비율: 각각 1200, 1500 및 1800V/cm), FBS가 없는 배지에 적용하고 5분 동안 배양했다. 이러한 전력을 출력하기 위해 폭 100㎲, 간격 1초의 구형파를 발생시키는 펄스 발생기(Epo; The Standard, Co. Ltd., Korea)를 사용하였다. 또한, 이러한 에너지를 전달하기 위해 특별히 설계된 전극(Cuvette Plus, 4mm 간격, 800μL, BTX, USA)을 사용했다. 수확된 세포를 1.0×105 세포가 들어 있는 800μL의 큐벳으로 옮겼다. 근적외선(NIR) 조사를 통한 전처리를 위해 위와 같이 근적외선을 적용한 후 세포를 모아 큐벳으로 옮기고 내적외선(IRE)을 적용하였다.
S260 단계에서, 비가역적 전기천공법(IRE)의 후 5분 후에 세포를 0.5 mL의 차가운 PBS로 세척했다. 이들을 저온 결합 완충액에 재현탁하고 1.25μL의 Annexin V-FITC(EzWay Annexin V-FITC apoptosis detection kit; Komabiotech Co. Ltd., Korea)를 첨가하였다. 15분 동안 세포를 배양한 후, 결합 완충액을 제거하고 10μL의 요오드화 프로피디움(PI)을 첨가한 후 새로운 저온 결합 완충액에 재현탁시켰다. FACS(BD FACSVerseTM; Becton, Dickinson and Company, USA)를 사용하여 형광 분석을 수행했다. 세포 사멸 분석을 위해 비가역적 전기천공법(IRE) 처리 후 수집된 세포를 배양 접시에서 6시간 동안 배양한 다음 다시 수확하였다. 세포를 Annexin-V와 PI로 염색하고 대조군과 비교한 각 조건의 상대적인 백분율을 폴드(fold) 값으로 표현하였다.
S270 단계에서, 투과 전자 현미경을 사용한 관찰 및 mRNA 양의 측정이 수행된다. 비가역적 전기천공법(IRE)을 위한 펄스 인가 후 6시간 후에, 미토콘드리아 구조 보존과 막대비를 최적화하기 위해 세포를 37℃에서 2% 파라포름알데히드 및 2.5% 글루타르알데히드(Ted Pella, Redding, CA, USA)가 포함된 0.15M 소디움 카코딜레이트(pH = 7.4)에 고정하고, 미리 냉각된 고정액에 넣었다. 이들 셀은 1 시간 동안 얼음 위에서 0.1M 나트륨 카코딜레이트(pH = 7.4) 중 1% 사산화오스뮴, 0.8% 페로시안화 칼륨 및 3mM 염화칼슘으로 고정했고; 얼음처럼 차가운 증류수로 세척하고; 4℃에서 2% 우라닐 아세테이트로 염색하고; 등급이 매겨진 에탄올을 사용하여 탈수되고; Durcupan 수지(Fluka, St. Louis, MO, USA)에 매립되었다. 70nm의 초박형 섹션을 'Uranyl acetate'와 'Lead salt'로 염색하고 80kV에서 JEOL 1200FX(JEOL, Japan)를 사용하여 관찰했다. 또한, 이미지는 Nikon Cool Scan 시스템(Nikon Instruments Inc., USA)을 사용하여 1,800 dpi로 디지털화되어 이미지 픽셀 어레이가 4,033×6,010이고 픽셀 해상도가 1.77 nm이다.
세포 사멸과 관련된 mRNA 양의 측정을 위해, 비가역적 전기천공법(IRE)에 따른 펄싱 6시간 후 세포를 채취하여 용해하고 RNeasy Mini Kit(Qiagen)를 이용하여 총 RNA를 추출하였다. 총 RNA는 제조사의 프로토콜에 따라 역전사 효소와 무작위 프라이머(cDNA 합성 키트, Toyobo)를 사용하여 상보적 디옥시리보핵산(cDNA)으로 변환되었다. cDNA 합성을 위해 각 샘플에서 동일한 양의 추출된 총 RNA를 사용했다. 합성된 cDNA는 CFX96TM Real-Time System(Bio-Rad)을 이용하여 실시간 중합효소 연쇄반응에 사용하였다. 상대적인 유전자 발현은 비교 주기 역치 방법을 사용하여 평가되었다. mRNA 발현의 상대적인 양은 RPL13α의 것으로 정규화되었고 대조군과 비교하여 배수 변화로 표현되었다. 세포 사멸 및 괴사에 대한 프라이머 서열은 다음의 수학식 2와 같았다.
S280 단계에서, 테스트 결과를 이용한 통계 및 분석이 수행된다. 모든 테스트들은 3회 이상 반복하였으며 데이터는 평균과 표준 편차(SD)로 표현하였다. 통계적 유의성은 'Microsoft Excel'을 사용하여 짝을 이루지 않은 Student's t-test(양측, 동일한 SD)를 사용하여 평가되었다.
도 5는 본 발명의 근적외선 전처리를 적용한 비가역적 전기천공법(IRE) 직후 암세포의 원형질막 분해 향상 효과를 보여주는 도면들이다. 도 5를 참조하면, (a)는 전기장 분포의 시뮬레이션 결과를 보여주고, (b)는 근적외선(NIR) 전처리 유무에 따른 전기장 강도에 따른 Annexin-V 염료의 상대 MFI를, 그리고 (c)는 근적외선(NIR) 전처리 유무에 따른 전기장 강도에 따른 PI 염료 셀의 상대 MFI를 보여준다. 여기서 '*'는 각각 제어값에 비하여 0.05 미만(< 0.05)의, '**'는 0.01 미만(< 0.01)의, 그리고 '***'는 0.001 미만(< 0.001)의 P-값을 나타낸다. '#'는 0.05 미만(< 0.05) 및 '##'는 0.01 미만(< 0.01)의 비조사 그룹에 대한 'Student's t-test(n = 3)에 의한 P-값을 나타낸다.
(a)를 참조하면, 인가 전압 300V, 375V, 450V, 500V에 대해 전극 간에 분포가 균일하게 분포하였다. 시뮬레이션 결과를 바탕으로 인가 전압이 전극 사이의 과전류로 인해 아크를 발생시키는지 조사하였다. 500V는 테스트에서 제외되었다. 비가역적 전기천공법(IRE)의 효율은 전기 펄스 직후에 평가되었다. 포스파티딜세린(PS)을 염색하고 PI 투과를 측정하여 막 전위 및 음전하 분자 수송을 분석하였다. 포스파티딜세린(PS)은 세포막의 내부 소엽에만 국한되어 있으며, 여기에서 여러 주요 신호 전달 경로의 활성화에 필요한 단백질 도킹 부위의 일부를 형성한다. 세포가 막 완전성을 잃거나 세포 사멸이 시작될 때 외부에 노출된다.
(b)를 참조하면, 근적외선(NIR) 전처리 유무에 따른 전기장 강도에 따른 Annexin-V 염료의 상대 MFI가 도시되어 있다. 특히, 근적외선(NIR)으로 전처리된 경우, 포스파티딜세린(PS) 신호는 적용된 전기장 강도에 따라 증가했다.
(c)를 참조하면, 근적외선(NIR) 전처리 유무에 따라 전기장 강도에 따른 프로피디움 아이오다이드(Propidium iodide, 이하, PI)는 염료 셀의 상대 MFI가 도시된다. 전계 강도가 1,500V/cm를 초과할 때 효과가 현저하게 나타난다. PI는 막 무결성을 테스트하기 위해 널리 사용되는 막 불투과성, 음전하의 염료이다. PI 강도는 또한 적용된 전기장 강도와 함께 증가했으며, 특히 근적외선(NIR)으로 전처리된 경우에 증가하였다. 이러한 결과는 근적외선(NIR) 전처리가 높은 전기 펄스에 의해 세포막의 왜곡을 가속화한다는 것을 확인시켜 준다.
도 6은 근적외선(NIR) 전처리 유무에 따른 비가역적 전기천공법(IRE)의 효과들을 비교하여 보여주는 도면들이다. 3J/cm2의 강도의 근적외선(NIR)을 전처리로 조사한 후에, 1,200V/cm, 1,500V/cm, 1,800V/cm 전기장 펄스를 인가하였다.
(a)는 근적외선(NIR) 전처리 유무에 따른 전기장 강도에 따른 WST-1 분석 결과를 보여준다. 비가역적 전기천공법(IRE)의 효율성은 비가역적 전기천공법(IRE)의 적용 6시간 후 세포 사멸 또는 세포자멸사 유도에 의해 추정되었다. 세포 생존, 막 완전성, 미토콘드리아 형태 및 세포 사멸 관련 유전자의 전사가 조사되었다. 세포 생존율은 인가된 전기장 세기에 따라 감소하였고, 특히, 근적외선(NIR) 전처리에서 더 크게 감소하였다.
(b)는 근적외선(NIR) 전처리 유무에 따른 전기장 강도에 따른 세포자멸사 비율을 보여준다. (a)에 도시된 세포 생존율의 감소가 아폽토시스(세포자멸사)와 관련이 있음을 확인했다. 사멸 세포는 Annexin-V FITC 양성 염색으로 분류되었으며, 근적외선(NIR) 전처리에 의해 세포 사멸 속도가 유의하게 향상되었음을 확인할 수 있다.
(c)는 근적외선(NIR) 전처리 유무에 관계없이 비가역적 전기천공법(IRE) 처리된 HeLa 세포에서 미토콘드리아의 대표적인 TEM 이미지를 보여준다. TEM 이미지에 따르면, '근적외선(NIR) 전처리+비가역적 전기천공법(IRE)'을 적용한 세포의 미토콘드리아가 심하게 왜곡되어 세포 사멸이 가속화되었음을 의미한다. 미토콘드리아 변성은 흰색 화살표로 표시된 것처럼 미토콘드리아 외막이 파열되면서 발생한다. 미토콘드리아의 파열은 근적외선 전처리의 유무와 상관없이 비가역적 전기천공법(IRE)을 적용한 HeLa 세포에서 부분적으로 그리고 전체적으로 관찰되었다. 미토콘드리아의 전체 파열은 근적외선(NIR) 전처리를 적용한 쪽이 근적외선(NIR) 전처리를 적용하지 않은 비가역적 전기천공법(IRE)보다 훨씬 더 많았다.
(d)는 BAX, p53, SOD1 및 GSR의 상대적 mRNA 발현 수준을 보여준다. 이러한 세포 사멸 현상은 유전자 수준에서도 나타난다. 세포 사멸 관련 유전자, BAX (Bcl-2 관련 X 단백질) 및 p53의 증가된 전사 수준을 확인할 수 있다. BAX는 미토콘드리아 막 이온 채널의 개방과 시토크롬 c의 방출을 유도하는 pro-apoptotic 단백질이다. p53은 많은 스트레스 자극에 반응하여 활성화되며 BAX를 비롯한 세포자멸사 관련 유전자의 전사를 직접 조절한다. HeLa 세포는 p53에 돌연변이가 없다. 또한, 산화 스트레스 관련 유전자인 SOD1(과산화물 디스뮤타제 1) 및 글루타티온 환원효소(GSR)의 전사 수준을 조사했다. SOD1은 외부 미토콘드리아 막에서 분자 산소와 과산화수소로 변환하여 과도한 자유 슈퍼옥사이드 라디칼을 파괴하는 역할을 하며 GSR은 글루타티온 항산화 방어 시스템의 핵심 구성원이다. 이들 유전자의 발현 감소는 근적외선(NIR) 전처리된 샘플에서 높은 산화 스트레스에 의해 세포자멸사 증가가 시작되지 않았음을 의미한다. 이는 약리학적 항산화제로 널리 사용되는 항산화제의 첨가로 확인되었다.
(e)는 NAC 없이 WST-1의 분석 결과를 보여준다. 'NIR+IRE'에 의한 세포 생존율의 감소는 NAC 처리에 의해 회복되지 않았다. 이러한 결과는 강화된 IRE-유도 세포자멸사가 강화된 산화 스트레스로 인한 것이 아님을 시사한다.
도 7은 근적외선의 조사에 따른 세포의 전기적 특징을 보여주는 도면들이다. 도 7을 참조하면, 근적외선(NIR)의 조사에 따른 세포의 커패시턴스 및 전도도 변화가 간략히 도시되어 있다.
(a)에는 세포 배양 ITO 유리 장치의 임피던스를 측정하기 위한 회로의 개략도를 보여준다. 커패시턴스와 컨덕턴스는 근적외선(NIR)의 조사에 따라 실시간으로 측정되었다. 임피던스 측정에서 셀룰러 커패시턴스의 기여도를 최대화하기 위해 테스트 전에 세포가 존재하는 전극의 전체 범위를 확인했다. 1kHz 교류(AC) 데이터를 사용하여 근적외선(NIR)의 조사가 있는 셀의 전기적 변화를 조사하였다. 병렬 상대 커패시턴스 및 상대 전도도는 근적외선(NIR)의 조사 전의 대조군 값으로 나눈 값이었다.
(b)는 근적외선(NIR)의 조사 시간에 따른 세포의 상대 정전용량 변화를 보여준다. 근적외선(NIR)의 에너지 밀도가 2J/cm2 이상으로 증가할 때, 커패시턴스가 감소하기 시작했음을 보여준다.
(c) 근적외선(NIR)의 조사 시간에 따른 세포의 상대 전도도의 변화를 보여준다. 커패시턴스와는 대조적으로, 전도도는 근적외선(NIR)의 조사 직후에 증가하였고 값은 거의 일정하게 유지되었다. 전도도는 약 1.3 J/cm2에서 약간 떨어졌다가 다시 증가했는데, 이는 막 단백질의 기능과 관련이 있을 수 있다. 그러나 그 변화는 오차 범위 내에 있었다. 3 J/cm2의 근적외선(NIR) 조사의 끝에서 정전용량은 처음부터 0.4% 감소하고 컨덕턴스는 0.6% 증가했다. 이것은 근적외선(NIR)이 세포의 전기적 특성의 변화를 유도한다는 것을 의미한다. 무세포 커패시턴스가 감소하고 전도도가 약간 증가했는데, 이는 FBS 함유 배지의 광수용체 때문일 수 있다. 이 참조 값은 세포의 측정 데이터에서 추출되었다.
이상의 설명에서와 같이, 근적외선(NIR) 조사 전처리가 시험관 내에서 비가역적 전기천공법(IRE)에 따른 유도 세포자멸사를 향상시켰음을 성공적으로 입증했다. 세포막은 전기 펄스에 의해 쉽게 방해를 받았으며, 이는 도 5의 설명과 같이 근적외선(NIR) 조사에 의한 PS 전위 및 PI 수송의 증가로 나타났다. 세포 사멸 신호는 비가역적 전기천공법(IRE)에서 6시간 후 DNA 합성 감소, PS 전위 증가, 미토콘드리아 응축 및 세포 사멸 관련 mRNA 합성 증가로 나타났다(도 6 참조).
본 발명에서 미토콘드리아 활성화 또는 세포 내 ROS 향상을 입증한 810nm 근적외선(NIR) 광을 사용하였다. 그러나 이러한 결과는 810nm 근적외선(NIR)에 대한 세포 반응이 조사 강도에 의존한다는 것을 보여주었다. CMP는 2~4 J/cm2에서 과분극되었고 MMP는 1~2 J/cm2의 더 낮은 강도에서 과분극되었다(도 3(c) 및 3(d)). 도 3(e)는 3~5 J/cm2에서 세포 내 ROS가 크게 감소함을 보여준다. 세포의 증식에 해로운 영향을 미치지 않고 CMP 과분극을 유도하고 MMP에 영향을 미치지 않으며, ROS 수준을 감소시키는 IRE 인가를 위해 3 J/cm2 근적외선(NIR) 조사를 사용했다. 이러한 조건에서 근적외선(NIR) 사전 자극이 ROS 생성보다 막 과분극을 통해 IRE 유도 세포 사멸을 촉진한다고 가정했다. 향상된 세포 사멸에서 ROS의 관련성은 감소된 항산화 유전자 발현과 항산화 화학 물질로부터의 회복이 없는 것으로 확인되었다.
따라서, CMP 과분극이 더 높은 IRE-유도 세포자멸사에 대한 이유 중 하나일 수 있다고 추정된다. 외부에서 인가된 전기 펄스에 의해 유발된 막횡단 전위가 휴지 중인 전지의 CMP에 중첩됨에 따라 전지의 양극을 향한 쪽은 과분극되고 음극을 향한 쪽은 탈분극된다. 이전 연구에서는 과분극이 탈분극보다 통계적으로 유의한 전기천공 효율을 나타냈다고 보고되었다. 양이온성 펩타이드의 첨가는 양극을 향한 세포막을 더 음으로 만들고 양이온은 원형질막과 정전기적으로 상호작용하여 더 큰 음전하를 생성하여 막을 가로질러 정전기 전위를 증가시킨다. CMP가 전기천공을 유발하는 임계 전압에 영향을 줄 수 있음을 보여주었다. CMP는 막을 통한 전기천공 유도 분자 전달과 양의 상관 관계가 있음을 보여주었다.
광생물 조절은 연구 및 임상 분야에서 널리 사용되지만 근적외선(NIR)이 세포 행동을 조절하는 메커니즘은 아직 명확하게 이해되지는 않는다. 미토콘드리아 호흡 사슬의 시토크롬 c 산화효소는 광생체 조절의 주요 광수용체로 간주되어 왔다. 그러나 세포 복합 반응은 하나의 발색단으로 설명될 수 없으며, 다른 잠재적 메커니즘(예: 계면 수층)과 발색단(예: 빛에 민감한 이온 채널)이 제안되어 있다. 펄스 근적외선(NIR)은 단시간에 온도 변화를 통해 막 커패시턴스와 커패시턴스 전류를 증가시킨다고 제안되었다. 임피던스 측정은 근적외선(NIR) 조사로 커패시턴스가 약간 감소하고 컨덕턴스가 약간 증가하는 것으로 나타났다. 이것은 원형질막 구조의 변화 또는 전하의 증가를 나타낸다. 이것이 IRE 효율이 향상되고 CMP가 증가하는 또 다른 원인이라고 추측된다. 이 현상은 물리적 반응보다는 생물학적 반응을 포함할 수 있다.
본 발명의 결과는 또한 세포질 및 미토콘드리아 막에 과분극을 위한 창이 있으며 후자는 NIR 자극에 더 취약한 것으로 보이다. 이것은 단순히 물리적 현상으로 설명될 수 없다. 이전 연구에 따르면 근적외선(NIR) 조사는 파장, 조사 강도 또는 조사 모드(연속파(CW) 또는 펄스파(PW))에 따라 세포질막을 가로질러 탈분극 또는 과분극을 유발할 수 있다. NIR이 파장에 따라 미토콘드리아 활성을 조절할 수 있음을 보여주었다. NIR이 강도 창에서 미토콘드리아 기능을 활성화할 수 있음을 보여주었다. NIR은 다른 펄스 조건에서 CMP와 ROS를 조절할 수 있음을 보여주었다. 강도 의존성은 세포내 ROS 수준에서도 관찰되었다. 이러한 용량 의존적 세포 생리학적 현상을 이해하기 위해서는 다양한 세포 성분에 의한 조화 작업이 향후 연구되어야 한다.
요약하면, 근적외선(NIR) 유도 과분극은 비가역적 전기천공법(IRE) 효율을 증가시켜 잠재적으로 필요한 인가 전압을 감소시킬 수 있다. 근적외선(NIR) 조사에 의한 용량 의존적 생리학적 조절은 비가역적 전기천공법(IRE) 치료의 공간 선택성을 향상시키는 데 사용할 수 있다. 이러한 결과는 고전압의 위험을 줄이기 위한 비가역적 전기천공법(IRE)의 임상적 사용에 기여할 수 있다.
상술된 내용은 본 발명을 실시하기 위한 구체적인 실시 예들이다. 본 발명은 상술된 실시 예들뿐만 아니라, 단순하게 설계 변경되거나 용이하게 변경할 수 있는 실시 예들 또한 포함할 것이다. 또한, 본 발명은 실시 예들을 이용하여 용이하게 변형하여 실시할 수 있는 기술들도 포함될 것이다. 따라서, 본 발명의 범위는 상술된 실시 예들에 국한되어 정해져서는 안되며 후술하는 특허청구범위뿐만 아니라 이 발명의 특허청구범위와 균등한 것들에 의해 정해져야 할 것이다.
Claims (6)
- 세포의 자멸사를 유도하기 위한 비가역적 전기천공 시스템의 적용 방법에 있어서:
상기 세포에 조사될 근적외선의 조사 조건을 설정하는 단계;
상기 조사 조건에 따라 상기 근적외선을 상기 세포에 조사하는 단계; 그리고
상기 세포에 비가역적 전기천공을 제공하기 위한 고전압 또는 고전류의 펄스를 인가하는 단계를 포함하되,
상기 조사 조건을 설정하는 단계는, 상기 근적외선의 조사 후 생존율에 영향을 미치지 않고, 세포질 막횡단 전위(CMP)의 과분극을 유도하고, 미토콘드리아 막횡단 전위(MMP)의 분극은 유지되고, 세포질 활성 산소종(ROS)을 감소시키기 위한 근적외선 강도나 조사 시간을 검출하는 단계를 포함하는 적용 방법. - 제 1 항에 있어서,
상기 근적외선은 800nm 내지 900nm, 또는 1000nm 내지 1200nm 파장의 광을 생성하는 발광 다이오드(LED)로부터 제공되는 적용 방법. - 제 1 항에 있어서,
상기 근적외선은 1,000μW/cm2 내지 10,000μW/cm2의 전력 밀도를 갖는 적용 방법. - 제 1 항에 있어서,
상기 근적외선은 1J/cm2 내지 10J/cm2의 세기로 상기 세포에 조사되는 것을 특징으로 하는 적용 방법. - 제 1 항에 있어서,
상기 근적외선을 연속적으로 혹은 10% 내지 60%의 듀티 사이클(Duty cycle) 및 3kHz 내지 300kHz의 펄스로 상기 세포에 조사되는 것을 특징으로 하는 적용 방법.
- 삭제
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