KR102524985B1 - Multi layer cell sheet including multi cell and the method for manufacturing thereof - Google Patents

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Abstract

본 발명은 다중 세포를 포함하는 다층 세포 시트 및 이의 제조방법에 관한 것으로서, 본 발명에 따른 다중 세포를 포함하는 다층 세포 시트는 다중 세포층 및 상기 다중 세포층의 적어도 일 부분 상에 형성된 혈관 내피 세포층을 포함하는 것을 특징으로 한다. 본 발명에 따른 다중 세포를 포함하는 다층 세포 시트는 오가노이드를 제작하는 데 활용될 수 있다는 장점이 있다.The present invention relates to a multi-layer cell sheet comprising multiple cells and a method for manufacturing the same, wherein the multi-layer cell sheet comprising multiple cells according to the present invention includes multiple cell layers and a vascular endothelial cell layer formed on at least a portion of the multiple cell layers. It is characterized by doing. The multi-layered cell sheet comprising multiple cells according to the present invention has the advantage of being able to be used to prepare organoids.

Description

다중 세포를 포함하는 다층 세포 시트 및 이의 제조방법 {MULTI LAYER CELL SHEET INCLUDING MULTI CELL AND THE METHOD FOR MANUFACTURING THEREOF}Multi-layer cell sheet containing multiple cells and method for manufacturing the same

본 발명은 다중 세포를 포함하는 다층 세포 시트 및 이의 제조방법에 관한 것이다.The present invention relates to a multi-layered cell sheet including multiple cells and a method for manufacturing the same.

생체 내에서 세포들은 3차원으로 세포외기질, 성장 인자 등 여러 조합 속에서 복잡한 상호작용을 하며 성장, 분화 및 증식한다. 이를 효과적으로 모사하기에 기존의 2차원 세포 배양 방식은 한계점을 가지고 있다. 2차원 세포 배양 방식은 세포를 단일층으로 증식함으로써 형태적인 차이가 있을 뿐만 아니라, 증식, 분화 및 분비물의 차이, 약물 반응성 등의 모든 면에서 차이를 보인다.In vivo, cells grow, differentiate, and proliferate through complex interactions in various combinations of extracellular matrix and growth factors in three dimensions. Existing two-dimensional cell culture methods have limitations in effectively mimicking them. The two-dimensional cell culture method not only has morphological differences by proliferating cells in a single layer, but also shows differences in all aspects such as proliferation, differentiation and secretion, and drug reactivity.

최근 이를 극복하기 위해 3차원의 세포 배양 방식에 대한 연구가 활발하게 이루어지고 있다. 3차원 세포 배양 모델은 생체 대응성이 뛰어나서, 세포, 세포외기질, 세포배양용기, 세포 성장인자 등 다양한 조합에 따라서 세포배양모델이 달라질 수 있는 다양성을 가지고 있다. 다양한 방식의 3차원 배양 방식이 개발되고 있으나, 표준화된 기술이 아직 등장하지는 못했고 생체대응성이 상용화되기에는 아직 부족하다는 평가를 받고 있다.Recently, in order to overcome this problem, research on 3D cell culture methods has been actively conducted. The 3D cell culture model has excellent biological response, and has the diversity that the cell culture model can be changed according to various combinations such as cells, extracellular matrix, cell culture container, and cell growth factor. Although various types of 3D culture methods have been developed, standardized technologies have yet to emerge and bioreactivity is evaluated as insufficient for commercialization.

3차원 세포 배양 방식은 생체와 유사한 환경을 체외에서 인공적으로 조성하여 세포가 모든 차원에서 성장하거나 주변 환경과 상호작용할 수 있도록 하는 세포 배양 모델을 의미한다. 3차원 세포 배양 방식과 관련하여, 3차원 겔 속에 세포가 존재하는 것을 특징으로 하는 3차원 미세 세포 배양 시스템이 제시된 바 있으나, 세포 배양 후 세포의 계대 배양 또는 세포를 이용한 분석시에 겔 내부에 존재하는 세포를 분리하기 어렵고, 특히, 세포 부착 및 증식이 까다로운 줄기세포 또는 일차 배양세포의 경우 세포 분리 시 세포가 손상되는 단점이 발생하였다.The 3D cell culture method refers to a cell culture model that artificially creates an environment similar to a living body outside the body so that cells can grow in all dimensions or interact with the surrounding environment. Regarding the three-dimensional cell culture method, a three-dimensional fine cell culture system characterized by the presence of cells in a three-dimensional gel has been proposed, but exists inside the gel during cell subculture or analysis using cells after cell culture. In the case of stem cells or primary cultured cells, which are difficult to isolate, and in particular, cell attachment and proliferation are difficult, cells are damaged during cell separation.

상술한 문제를 해결하기 위해, 본 발명은 세포 및 세포외기질을 포함하는 다층 세포 시트를 제공하는 것을 그 목적으로 한다.In order to solve the above problems, an object of the present invention is to provide a multilayer cell sheet comprising cells and an extracellular matrix.

일 실시예에 따르면, 본 발명은 간소엽(Liver lobule)과 유사한 구조를 가지도록 간세포 및 혈관 내피 세포를 포함하는 다층 세포 시트인 것으로서, 다양한 형태 및 크기를 가지도록 제조하는 것이다.According to one embodiment, the present invention is a multilayer cell sheet including hepatocytes and vascular endothelial cells to have a structure similar to a liver lobule, and is manufactured to have various shapes and sizes.

그러나, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 이상에서 언급한 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 해당 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.However, the problem to be solved by the present invention is not limited to the problems mentioned above, and other problems not mentioned will be clearly understood by those skilled in the art from the description below.

본 발명의 일 측면에 따른 다중 세포를 포함하는 다층 세포 시트는, 다중 세포층; 및 상기 다중 세포층의 적어도 일 부분 상에 형성된 혈관 내피 세포층;을 포함한다.A multi-layered cell sheet comprising multiple cells according to an aspect of the present invention includes multiple cell layers; and a vascular endothelial cell layer formed on at least a portion of the multi-cell layer.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 다중 세포는, 간세포, 조골세포, 근아세포, 신경아세포, 섬유아세포, 신경교아세포, 신장세포, 지대세포, 상피세포, 심혈관세포, 각질세포, 평활근세포, 심장근세포, 신경교세포, 호르몬 분비세포 및 췌장섬세포로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함하는 것일 수 있다.According to one embodiment of the present invention, the multiple cells, hepatocytes, osteoblasts, myoblasts, neuroblasts, fibroblasts, glial cells, renal cells, astrocytes, epithelial cells, cardiovascular cells, keratinocytes, smooth muscle cells, heart It may include one or more selected from the group consisting of muscle cells, glial cells, hormone secreting cells, and pancreatic islet cells.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 혈관 내피 세포는, 피브로넥틴(Fibronectin), 라미닌(Laminin) 및 콜라겐 타입 Ⅳ(Collagen type Ⅳ)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 세포외기질을 포함하는 것일 수 있다.According to one embodiment of the present invention, the vascular endothelial cells may contain at least one extracellular matrix selected from the group consisting of fibronectin, laminin, and collagen type IV. .

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 다층 세포 시트는, 한층의 세포 시트 두께가 70 ㎛ 내지 100 ㎛인 것이고, 밑면적은 45,000 ㎛2 내지 50,000 ㎛2 인 것일 수 있다.According to one embodiment of the present invention, the multilayer cell sheet may have a thickness of 70 μm to 100 μm and a base area of 45,000 μm 2 to 50,000 μm 2 .

본 발명의 다른 측면에 따른 다중 세포를 포함하는 다층 세포 시트의 제조방법은, 단백질 용액을 준비하는 단계; 상기 단백질 용액을 패터닝하여 단백질 기재를 형성하는 단계; 상기 단백질 기재 상에 다중 세포를 시딩하여 배양하는 단계; 상기 다중 세포 상에 혈관 내피 세포를 시딩하여 배양하는 단계; 및 상기 단백질 기재를 제거하는 단계;를 포함한다.A method for manufacturing a multi-layered cell sheet including multiple cells according to another aspect of the present invention includes preparing a protein solution; patterning the protein solution to form a protein substrate; Seeding and culturing multiple cells on the protein substrate; Seeding and culturing vascular endothelial cells on the multiple cells; and removing the protein substrate.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 단백질은, 콜라겐, 젤라틴, 엘라스틴, 피브로넥틴, 피브린, 라미닌 비트로넥틴, 폴리-L-라이신, 폴리-D-라이신, 폴리-L-오르티닌 및 아르기닌-글리신-아스파틱 산 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함하는 것일 수 있다.According to one embodiment of the present invention, the proteins, collagen, gelatin, elastin, fibronectin, fibrin, laminin vitronectin, poly-L-lysine, poly-D-lysine, poly-L-ortinine and arginine-glycine- It may contain at least one selected from the group consisting of aspartic acid.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 단백질 용액은, 농도가 2 mg/mL 내지 2.5 mg/mL인 것일 수 있다.According to one embodiment of the present invention, the protein solution may have a concentration of 2 mg/mL to 2.5 mg/mL.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 단백질 기재를 형성하는 단계는, PDMS를 포함하는 몰드를 이용하여 컨택트-프린팅으로 수행되는 것일 수 있다.According to one embodiment of the present invention, the step of forming the protein substrate may be performed by contact-printing using a mold containing PDMS.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 다중 세포를 배양하는 단계는, 6일 내지 8일동안 수행되는 것이고, 상기 혈관 내피 세포를 배양하는 단계는, 1일 내지 4일동안 수행되는 것일 수 있다.According to one embodiment of the present invention, the step of culturing the multiple cells may be performed for 6 to 8 days, and the step of culturing the vascular endothelial cells may be performed for 1 to 4 days.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 단백질 기재를 제거하는 단계는, 콜라게나아제, 셀룰라아제, 아밀라아제, 알지네이트 리아제, 겔라나아제, 히알루로니다아제, 키티나아제, 키토사나아제, 자이알리나아제, 만나아제, 글루코실트란스퍼라아제, 글루코시다아제, 펙티나아제, 락타아제, 말타아제, 수크라아제, 글루카나아제, 콘드로이타나아제, 아가라아제, 갈락토시다아제, 프럭타나아제, 갈락타나아제, 덱스트라나아제, 플루라나아제, 아말라아제, 및 인버타아제로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 효소를 이용하는 것일 수 있다.According to one embodiment of the present invention, the step of removing the protein substrate is collagenase, cellulase, amylase, alginate lyase, gellanase, hyaluronidase, chitinase, chitosanase, gyialinase , mannanase, glucosyltransferase, glucosidase, pectinase, lactase, maltase, sucrase, glucanase, chondroitanase, agarase, galactosidase, fructase, galacta It may be to use one or more enzymes selected from the group consisting of Nase, Dextranase, Fluranase, Amalase, and Invertase.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 단백질 기재를 제거하는 단계는, pH 7.4 내지 7.8에서 수행되는 것일 수 있다.According to one embodiment of the present invention, the step of removing the protein substrate may be performed at pH 7.4 to 7.8.

본 발명은 세포 및 세포외기질을 포함하는 다층 세포 시트를 제공할 수 있다.The present invention can provide a multilayer cell sheet comprising cells and an extracellular matrix.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 간소엽(Liver lobule)과 유사한 구조를 가지도록 설계되어 간세포 및 혈관 내피 세포를 포함하는 다층 세포 시트인 것으로서, 다양한 형태 및 크기를 가지도록 제조할 수 있다는 장점이 있다.According to one embodiment of the present invention, it is designed to have a structure similar to a liver lobule and is a multi-layered cell sheet including hepatocytes and vascular endothelial cells, and has the advantage of being able to be manufactured to have various shapes and sizes. there is.

도 1은, 본 발명의 일 실시예에 따른 다중 세포를 포함하는 다층 세포 시트의 개념도이다.
도 2는, 본 발명의 일 실시예에 따른 PDMS 몰드를 이용하여 콜라겐을 패터닝하는 단계를 나타낸 순서도이다.
도 3은, 본 발명의 일 실시예에 따른 다층 세포 시트를 제조하는 단계를 나타낸 순서도이다.
도 4 내지 도 6은, 본 발명의 일 실시예에 따른 간 세포를 포함하는 다층 세포 시트의 셀 이미지이다.1 is a conceptual diagram of a multi-layered cell sheet including multiple cells according to an embodiment of the present invention.
Figure 2 is a flow chart showing the step of patterning collagen using a PDMS mold according to an embodiment of the present invention.
3 is a flow chart showing steps for manufacturing a multi-layered cell sheet according to an embodiment of the present invention.
4 to 6 are cell images of a multilayer cell sheet including liver cells according to an embodiment of the present invention.

이하에서, 첨부된 도면을 참조하여 실시예들을 상세하게 설명한다. 그러나, 실시예들에는 다양한 변경이 가해질 수 있어서 특허출원의 권리 범위가 이러한 실시예들에 의해 제한되거나 한정되는 것은 아니다. 실시예들에 대한 모든 변경, 균등물 내지 대체물이 권리 범위에 포함되는 것으로 이해되어야 한다.Hereinafter, embodiments will be described in detail with reference to the accompanying drawings. However, since various changes can be made to the embodiments, the scope of the patent application is not limited or limited by these embodiments. It should be understood that all changes, equivalents or substitutes to the embodiments are included within the scope of rights.

실시예에서 사용한 용어는 단지 설명을 목적으로 사용된 것으로, 한정하려는 의도로 해석되어서는 안된다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 명세서에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서 상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.Terms used in the examples are used only for descriptive purposes and should not be construed as limiting. Singular expressions include plural expressions unless the context clearly dictates otherwise. In this specification, terms such as "include" or "have" are intended to designate that there is a feature, number, step, operation, component, part, or combination thereof described in the specification, but one or more other features It should be understood that the presence or addition of numbers, steps, operations, components, parts, or combinations thereof is not precluded.

다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 실시예가 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥 상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.Unless defined otherwise, all terms used herein, including technical or scientific terms, have the same meaning as commonly understood by a person of ordinary skill in the art to which the embodiment belongs. Terms such as those defined in commonly used dictionaries should be interpreted as having a meaning consistent with the meaning in the context of the related art, and unless explicitly defined in the present application, they should not be interpreted in an ideal or excessively formal meaning. don't

또한, 첨부 도면을 참조하여 설명함에 있어, 도면 부호에 관계없이 동일한 구성 요소는 동일한 참조부호를 부여하고 이에 대한 중복되는 설명은 생략하기로 한다. 실시예를 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 실시예의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.In addition, in the description with reference to the accompanying drawings, the same reference numerals are given to the same components regardless of reference numerals, and overlapping descriptions thereof will be omitted. In describing the embodiment, if it is determined that a detailed description of a related known technology may unnecessarily obscure the gist of the embodiment, the detailed description will be omitted.

또한, 실시 예의 구성 요소를 설명하는 데 있어서, 제 1, 제 2, A, B, (a), (b) 등의 용어를 사용할 수 있다. 이러한 용어는 그 구성 요소를 다른 구성 요소와 구별하기 위한 것일 뿐, 그 용어에 의해 해당 구성 요소의 본질이나 차례 또는 순서 등이 한정되지 않는다. 어떤 구성 요소가 다른 구성요소에 "연결", "결합" 또는 "접속"된다고 기재된 경우, 그 구성 요소는 그 다른 구성요소에 직접적으로 연결되거나 접속될 수 있지만, 각 구성 요소 사이에 또 다른 구성 요소가 "연결", "결합" 또는 "접속"될 수도 있다고 이해되어야 할 것이다.In addition, in describing the components of the embodiment, terms such as first, second, A, B, (a), and (b) may be used. These terms are only used to distinguish the component from other components, and the nature, order, or order of the corresponding component is not limited by the term. When an element is described as being “connected,” “coupled to,” or “connected” to another element, that element may be directly connected or connected to the other element, but there may be another element between the elements. It should be understood that may be "connected", "coupled" or "connected".

어느 하나의 실시 예에 포함된 구성요소와, 공통적인 기능을 포함하는 구성요소는, 다른 실시 예에서 동일한 명칭을 사용하여 설명하기로 한다. 반대되는 기재가 없는 이상, 어느 하나의 실시 예에 기재한 설명은 다른 실시 예에도 적용될 수 있으며, 중복되는 범위에서 구체적인 설명은 생략하기로 한다.Components included in one embodiment and components including common functions will be described using the same names in other embodiments. Unless stated to the contrary, descriptions described in one embodiment may be applied to other embodiments, and detailed descriptions will be omitted to the extent of overlap.

본 발명의 일 측면에 따른 다중 세포를 포함하는 다층 세포 시트는, 다중 세포층; 및 상기 다중 세포층의 적어도 일 부분 상에 형성된 혈관 내피 세포층;을 포함한다.A multi-layered cell sheet comprising multiple cells according to an aspect of the present invention includes multiple cell layers; and a vascular endothelial cell layer formed on at least a portion of the multi-cell layer.

도 1은, 본 발명의 일 실시예에 따른 다중 세포를 포함하는 다층 세포 시트의 개념도이다.1 is a conceptual diagram of a multi-layered cell sheet including multiple cells according to an embodiment of the present invention.

도 1을 참조하면, 본 발명의 일 실시예에 따른 다층 세포 시트는, 다중 세포층(120) 및 상기 다중 세포층의 적어도 일 부분 상에 형성된 혈관 내피 세포층(140)을 포함할 수 있다.Referring to FIG. 1 , a multilayer cell sheet according to an embodiment of the present invention may include multiple cell layers 120 and a vascular endothelial cell layer 140 formed on at least a portion of the multiple cell layers.

본 발명의 일 실시예에 따른 다중 세포를 포함하는 다층 세포 시트는, 오가노이드로서 활용 가능한 것일 수 있다.A multi-layered cell sheet including multiple cells according to an embodiment of the present invention may be used as an organoid.

동물 실험법에 대한 대체 방식으로서 인간의 장기의 구조 및 기능을 모사한 오가노이드를 제작할 필요성이 대두되고 있으며, 현대에 들어서 식습관 변화에 따른 간질환 발병율이 증가하고 있다.As an alternative method to animal testing, the need to produce organoids that mimic the structure and function of human organs is emerging, and the incidence of liver disease is increasing due to changes in eating habits in modern times.

이러한 필요성에 발맞추어 간의 미세 구조를 재현하는 요소 기술로서, 본 발명에 따른 다중 세포를 포함하는 다층 세포 시트가 이용될 수 있고, 또한 3D 프린팅을 이용하여 간소엽 구조를 모사하는 오가노이드를 제작하는 데 활용될 수 있다.As an element technology for reproducing the microstructure of the liver in line with this need, the multi-layered cell sheet containing multiple cells according to the present invention can be used, and also using 3D printing to produce organoids that mimic the liver lobular structure can be utilized for

상기 다중 세포는, 간세포, 조골세포, 근아세포, 신경아세포, 섬유아세포, 신경교아세포, 신장세포, 지대세포, 상피세포, 심혈관세포, 각질세포, 평활근세포, 심장근세포, 신경교세포, 호르몬 분비세포 및 췌장섬세포로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함하는 것일 수 있다.The multiple cells are hepatocytes, osteoblasts, myoblasts, neuroblasts, fibroblasts, glial cells, kidney cells, astrocytes, epithelial cells, cardiovascular cells, keratinocytes, smooth muscle cells, cardiomyocytes, glial cells, hormone secreting cells, and It may include one or more selected from the group consisting of pancreatic islet cells.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 다중 세포는, 간 세포인 것일 수 있다.According to one embodiment of the present invention, the multiple cells may be liver cells.

일 실시형태에 따르면, 상기 다중 세포는, HepG2, HCT116, HUH1, PCL/PRF/5, 및 HUH7 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함하는 것일 수 있다.According to one embodiment, the multiple cells may include one or more selected from the group consisting of HepG2, HCT116, HUH1, PCL/PRF/5, and HUH7.

본 발명의 일 예시에 따르면, 상기 다중 세포는, HepG2인 것이 바람직할 수 있다.According to an example of the present invention, the multiple cells may be HepG2.

일 실시형태에 따르면, 상기 혈관 내피 세포는, 피브로넥틴(Fibronectin), 라미닌(Laminin) 및 콜라겐 타입 Ⅳ(Collagen type Ⅳ)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 세포외기질을 포함하는 것일 수 있다.According to one embodiment, the vascular endothelial cells may contain at least one extracellular matrix selected from the group consisting of fibronectin, laminin, and collagen type IV.

일 실시형태에 따르면, 상기 다층 세포 시트는, 두께가 70 ㎛ 내지 100 ㎛인 것이고, 밑면적이 45,000 ㎛2 내지 50,000 ㎛2인 것일 수 있다.According to one embodiment, the multilayer cell sheet may have a thickness of 70 μm to 100 μm and a base area of 45,000 μm 2 to 50,000 μm 2 .

일 실시형태에 따르면, 상기 다층 세포 시트는, 상기 다층 세포 시트의 무게중심을 지나도록 형성되는 가상의 직선이 상기 다층 세포 시트와 만나는 두 점 사이의 길이가 1 ㎚ 내지 1 ㎜인 것일 수 있다.According to one embodiment, in the multi-layered cell sheet, the length between two points where a virtual straight line formed passing through the center of gravity of the multi-layered cell sheet meets the multi-layered cell sheet may be 1 nm to 1 mm.

본 발명의 또 다른 측면에 따른 다중 세포를 포함하는 다층 세포 시트의 제조방법은, 단백질 용액을 준비하는 단계; 상기 단백질 용액을 패터닝하여 단백질 기재를 형성하는 단계; 상기 단백질 기재 상에 다중 세포를 시딩하여 배양하는 단계; 상기 다중 세포 상에 혈관 내피 세포를 시딩하여 배양하는 단계; 및 상기 단백질 기재를 제거하는 단계;를 포함한다.A method for manufacturing a multi-layered cell sheet including multiple cells according to another aspect of the present invention includes preparing a protein solution; patterning the protein solution to form a protein substrate; Seeding and culturing multiple cells on the protein substrate; Seeding and culturing vascular endothelial cells on the multiple cells; and removing the protein substrate.

본 발명의 일 측면에 따른 다중 세포를 포함하는 다층 세포 시트의 제조방법은, 실험예룰 통해 더 자세히 서술하도록 한다.A method for manufacturing a multi-layered cell sheet including multiple cells according to an aspect of the present invention will be described in more detail through experimental examples.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 다중 세포는, 간 세포인 것일 수 있다.According to one embodiment of the present invention, the multiple cells may be liver cells.

일 실시형태에 따르면, 상기 단백질은, 콜라겐, 젤라틴, 엘라스틴, 피브로넥틴, 피브린, 라미닌 비트로넥틴, 폴리-L-라이신, 폴리-D-라이신, 폴리-L-오르티닌 및 아르기닌-글리신-아스파틱 산으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함하는 것일 수 있다.According to one embodiment, the protein is collagen, gelatin, elastin, fibronectin, fibrin, laminin vitronectin, poly-L-lysine, poly-D-lysine, poly-L-ortinine and arginine-glycine-aspartic acid. It may include one or more selected from the group consisting of.

본 발명의 일 예시에 따라, 상기 단백질은, 콜라겐이 바람직한 것일 수 있다.According to an example of the present invention, the protein may be preferably collagen.

일 실시형태에 따르면, 상기 단백질 용액은, 농도가 2 mg/mL 내지 2.5 mg/mL인 것일 수 있다.According to one embodiment, the protein solution may have a concentration of 2 mg/mL to 2.5 mg/mL.

일 실시형태에 따르면, 상기 단백질 기재를 형성하는 단계는, PDMS를 포함하는 몰드를 이용하여 컨택트-프린팅으로 수행되는 것일 수 있다.According to one embodiment, the step of forming the protein substrate may be performed by contact-printing using a mold including PDMS.

다만, 상기 기재는 본 발명의 일 예시에 따른 것이고, 단백질 기재를 패터닝 혹은 전사시킬 수 있는 물질이면 몰드로서 이용 가능하다.However, the substrate is according to one example of the present invention, and any material capable of patterning or transferring a protein substrate can be used as a mold.

일 실시형태에 따르면, 상기 다중 세포를 배양하는 단계는, 6일 내지 8일동안 수행되는 것이고, 상기 혈관 내피 세포를 배양하는 단계는, 1일 내지 4일동안 수행되는 것일 수 있다.According to one embodiment, the step of culturing the multiple cells may be performed for 6 to 8 days, and the step of culturing the vascular endothelial cells may be performed for 1 to 4 days.

일 실시형태에 따르면, 상기 단백질 기재를 제거하는 단계는, 콜라게나아제, 셀룰라아제, 아밀라아제, 알지네이트 리아제, 겔라나아제, 히알루로니다아제, 키티나아제, 키토사나아제, 자이알리나아제, 만나아제, 글루코실트란스퍼라아제, 글루코시다아제, 펙티나아제, 락타아제, 말타아제, 수크라아제, 글루카나아제, 콘드로이타나아제, 아가라아제, 갈락토시다아제, 프럭타나아제, 갈락타나아제, 덱스트라나아제, 플루라나아제, 아말라아제 및 인버타아제로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 효소를 이용하는 것일 수 있다.According to one embodiment, the step of removing the protein substrate is collagenase, cellulase, amylase, alginate lyase, gellanase, hyaluronidase, chitinase, chitosanase, gyialinase, mannanase , glucosyltransferase, glucosidase, pectinase, lactase, maltase, sucrase, glucanase, chondroitanase, agarase, galactosidase, fructanases, galactanases, It may be to use one or more enzymes selected from the group consisting of dextranase, pullulanase, amalase and invertase.

단백질 기재를 제거하기 위해서는, 적용된 단백질을 분해할 수 있는 효소를 이용하는 것이 바람직한 것일 수 있다. 일 예시에 따라서, 단백질 기재로서, 콜라겐을 이용한 경우, 상기 단백질 기재를 제거하기 위해서는 콜라게나아제를 이용하는 것일 수 있다.To remove the protein substrate, it may be desirable to use an enzyme capable of degrading the applied protein. According to one example, when collagen is used as the protein substrate, collagenase may be used to remove the protein substrate.

일 실시형태에 따르면, 상기 단백질 기재를 제거하는 단계는, pH 7.4 내지 7.8에서 수행되는 것일 수 있다.According to one embodiment, the step of removing the protein substrate may be performed at pH 7.4 to 7.8.

이하, 실시예 및 비교예에 의하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail by examples and comparative examples.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.However, the following examples are only for illustrating the present invention, and the content of the present invention is not limited to the following examples.

실험예Experimental example

1. PDMS 몰드의 제작1. Fabrication of PDMS mold

PDMS prepolymer (Sylgard 184 A)와 경화제(Sylgard 184 B)를 10 : 1의 비율로 혼합하여 PDMS 용액을 제조하였다. 상기 PDMS 용액을 포토리소그래피(SU-8)로 제작된 패턴이 새겨진 마스터 몰드 위에 부은 뒤, 진공 챔버에 30분 정도 넣어 혼합 과정에서 발생한 기포를 제거하였다.A PDMS solution was prepared by mixing a PDMS prepolymer (Sylgard 184 A) and a curing agent (Sylgard 184 B) at a ratio of 10:1. After pouring the PDMS solution onto a master mold with a pattern made by photolithography (SU-8), it was placed in a vacuum chamber for about 30 minutes to remove air bubbles generated during the mixing process.

이후, 70 ℃ 온도의 오븐에 2 시간 동안 넣어두고 상기 몰드를 경화시켰다. 경화된 PDMS 몰드를 마스터 몰드에서 분리하여 적절히 잘라 원하는 크기의 몰드를 제작하였다.Thereafter, the mold was cured by putting it in an oven at 70° C. for 2 hours. The cured PDMS mold was separated from the master mold and properly cut to prepare a mold of a desired size.

2. PDMS 몰드를 이용한 콜라겐 패터닝2. Collagen patterning using PDMS mold

소수성 페트리 디쉬에 Collagen type Ⅰ 용액을 뿌린 뒤 고르게 도포하였다. 이후, PDMS 몰드로 도포된 콜라겐의 표면을 찍어서 콜라겐 용액을 PDMS 몰드로 전사시켰고, 이를 다시 새로운 소수성 페트리 디쉬에 찍어서 패터닝된 콜라겐을 제조하였다.Collagen type Ⅰ solution was sprayed on a hydrophobic petri dish and then applied evenly. Thereafter, the surface of the applied collagen was stamped with the PDMS mold to transfer the collagen solution to the PDMS mold, and the patterned collagen was prepared by stamping the surface of the coated collagen into a new hydrophobic Petri dish.

도 2는, 본 발명의 일 실시예에 따른 PDMS 몰드를 이용하여 콜라겐을 패터닝하는 단계를 나타낸 순서도이다.Figure 2 is a flow chart showing the step of patterning collagen using a PDMS mold according to an embodiment of the present invention.

도 2를 참조하면, PDMS 몰드를 이용하여 콜라겐 기재를 형성하는 것은, Collagen type Ⅰ 용액(240)을 페트리 디쉬(220)에 도포한 뒤, 특정 패턴을 가지도록 제조된 PDMS 몰드(200)를 상기 콜라겐 용액에 찍어 새로운 페트리 디쉬(260) 상에 콜라겐 용액을 전사시켜 콜라겐 기재(280)를 형성하는 단계를 포함할 수 있다.Referring to FIG. 2 , forming a collagen substrate using a PDMS mold is to apply a Collagen type I solution 240 to a Petri dish 220, and then a PDMS mold 200 manufactured to have a specific pattern. A step of forming the collagen substrate 280 by dipping in the collagen solution and transferring the collagen solution onto a new Petri dish 260 may be included.

3. 다층 세포 시트의 제조3. Fabrication of multilayer cell sheets

콜라겐이 패터닝된 페트리 디쉬에 간세포로서, HepG2 세포를 시딩하였다. 직경 60 ㎜ 페트리 디쉬 기준으로 약 100 만 마리의 세포를 시딩하였다. 이후, 인큐베이터에서 7일 동안 배양하여 간 세포 시트를 형성하였고, 다시 혈관 내피 세포를 간 세포 시트 위에 시딩하여 2 내지 3일 동안 배양하여 다층 세포 시트를 제조하였다.HepG2 cells were seeded as hepatocytes in collagen-patterned Petri dishes. About 1 million cells were seeded based on a 60 mm diameter Petri dish. Thereafter, the liver cell sheet was formed by culturing in an incubator for 7 days, and then the vascular endothelial cells were seeded on the liver cell sheet and cultured for 2 to 3 days to prepare a multilayer cell sheet.

도 3은, 본 발명의 일 실시예에 따른 다층 세포 시트를 제조하는 단계를 나타낸 순서도이다.3 is a flow chart showing steps for manufacturing a multi-layered cell sheet according to an embodiment of the present invention.

도 3을 참조하면, 콜라겐 기재(280) 상에 간 세포(300)를 시딩한다. 이 때, 콜라겐 기재(280)가 아닌 페트리 디쉬 상에 시딩된 간 세포는 제거하는 단계를 포함할 수 있다. 이후, 혈관 내피 세포(320)를 시딩하여 간 세포(300) 상에 형성되도록 한다.Referring to FIG. 3 , liver cells 300 are seeded on a collagen substrate 280 . In this case, a step of removing the liver cells seeded on the Petri dish rather than on the collagen substrate 280 may be included. Thereafter, vascular endothelial cells 320 are seeded to form on the liver cells 300 .

4. 다층 세포 시트의 분리4. Separation of multilayer cell sheets

기저에 존재하는 콜라겐을 제거하기 위해, Collagenase type Ⅳ를 섞은 용액(농도 2 mg/mL)을 상기 다층 세포 시트가 형성된 페트리 디쉬에 넣고 인큐베이터에서 5분 정도 경과 후에 피펫팅을 통하여 세포 시트를 디쉬 표면과 분리하여 수확하였다.In order to remove the underlying collagen, a solution (concentration of 2 mg/mL) mixed with Collagenase type IV was put into the Petri dish in which the multi-layered cell sheet was formed, and after about 5 minutes in the incubator, the cell sheet was pipetted on the surface of the dish. and was harvested separately.

도 3을 참조하면, 간 세포 및 혈관 내피 세포가 순차적으로 형성된 다층 세포 시트(100)의 콜라겐 기재(280)를 제거하기 위해 콜라게나아제를 이용할 수 있다. 효소에 의해 콜라겐 기재(280)를 제거함으로써 다층 세포 시트(100)를 페트리 디쉬로부터 분리할 수 있다.Referring to FIG. 3 , collagenase may be used to remove the collagen substrate 280 of the multilayer cell sheet 100 on which liver cells and vascular endothelial cells are sequentially formed. The multilayer cell sheet 100 may be separated from the Petri dish by removing the collagen substrate 280 with an enzyme.

5. 다층 세포 시트의 Live/Dead Cell Assessment5. Live/Dead Cell Assessment of Multilayer Cell Sheets

상기 제작된 다층 세포 시트에 대하여 Live/Dead Cell Assessment를 수행하였다.Live/Dead Cell Assessment was performed on the prepared multilayer cell sheet.

도 4 내지 도 6은, 본 발명의 일 실시예에 따른 간 세포를 포함하는 다층 세포 시트의 셀 이미지이다.4 to 6 are cell images of a multilayer cell sheet including liver cells according to an embodiment of the present invention.

도 4를 참조하면, 콜라겐 기재 상에만 간 세포 및 혈관 내피 세포가 형성되어 있는 것을 확인할 수 있으며, 직경 약 100 ㎛의 다층 세포 시트 상에 형성된 세포들이 살아있는 것을 확인할 수 있다.Referring to FIG. 4 , it can be confirmed that liver cells and vascular endothelial cells are formed only on the collagen substrate, and it can be confirmed that the cells formed on the multilayer cell sheet having a diameter of about 100 μm are alive.

도 5 및 도 6을 참조하면, 죽은 세포가 거의 없이 몰드의 구조와 같이 일정한 간격을 두고 다층 세포 시트가 형성되어 있는 것을 확인할 수 있다.Referring to FIGS. 5 and 6 , it can be confirmed that multi-layered cell sheets are formed at regular intervals like a structure of a mold with almost no dead cells.

이상과 같이 실시예들이 비록 한정된 도면에 의해 설명되었으나, 해당 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 상기를 기초로 다양한 기술적 수정 및 변형을 적용할 수 있다. 예를 들어, 설명된 기술들이 설명된 방법과 다른 순서로 수행되거나, 및/또는 설명된 시스템, 구조, 장치, 회로 등의 구성요소들이 설명된 방법과 다른 형태로 결합 또는 조합되거나, 다른 구성요소 또는 균등물에 의하여 대치되거나 치환되더라도 적절한 결과가 달성될 수 있다.As described above, although the embodiments have been described with limited drawings, those skilled in the art can apply various technical modifications and variations based on the above. For example, the described techniques may be performed in an order different from the method described, and/or components of the described system, structure, device, circuit, etc. may be combined or combined in a different form than the method described, or other components may be used. Or even if it is replaced or substituted by equivalents, appropriate results can be achieved.

그러므로, 다른 구현들, 다른 실시예들 및 특허청구범위와 균등한 것들도 후술하는 청구범위의 범위에 속한다.Therefore, other implementations, other embodiments, and equivalents of the claims are within the scope of the following claims.

Claims (12)

단백질 용액을 준비하는 단계;
상기 단백질 용액을 패터닝하여 단백질 기재를 형성하는 단계;
상기 단백질 기재 상에 다중 세포를 시딩하여 배양하는 단계;
상기 다중 세포 상에 혈관 내피 세포를 시딩하여 배양하는 단계; 및
상기 단백질 기재를 제거하는 단계;를 포함하는 다층 세포 시트의 제조방법으로서,
상기 다중 세포는, 간세포, 조골세포, 근아세포, 신경아세포, 섬유아세포, 신경교아세포, 신장세포, 지대세포, 심혈관세포, 각질세포, 평활근세포, 심장근세포, 신경교세포, 호르몬 분비세포 및 췌장섬세포로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함하고,
상기 혈관 내피 세포는, 피브로넥틴(Fibronectin), 라미닌(Laminin) 및 콜라겐 타입 Ⅳ(Collagen type Ⅳ)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 세포외기질을 포함하는 것이고,
상기 단백질 기재를 형성하는 단계는,
PDMS 몰드를 제조하는 단계; 및
상기 단백질 용액을 소수성 페트리 디쉬에 도포한 뒤, 상기 PDMS 몰드로 상기 단백질 용액의 표면을 찍어서 상기 단백질 용액을 PDMS 몰드로 전사시키고, 새로운 소수성 페트리 디쉬에 상기 상기 단백질 용액을 전사시켜 단백질 기재를 형성하는 단계;
를 포함하고,
상기 단백질 기재를 제거하는 단계는, 콜라게나아제, 셀룰라아제, 아밀라아제, 알지네이트 리아제, 겔라나아제, 히알루로니다아제, 키티나아제, 키토사나아제, 자이알리나아제, 만나아제, 글루코실트란스퍼라아제, 글루코시다아제, 펙티나아제, 락타아제, 말타아제, 수크라아제, 글루카나아제, 콘드로이타나아제, 아가라아제, 갈락토시다아제, 프럭타나아제, 갈락타나아제, 덱스트라나아제, 플루라나아제, 아말라아제 및 인버타아제로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 효소를 이용하는 것이고,
상기 단백질 기재를 제거하는 단계는, pH 7.4 내지 7.8에서 수행되는 것이고,
상기 다층 세포 시트는, 한 층의 세포 시트 두께가 70 ㎛ 내지 100 ㎛인 것이고, 밑면적은 45,000 ㎛2 내지 50,000 ㎛2 인 것인,
다중 세포를 포함하는 다층 세포 시트의 제조방법.
preparing a protein solution;
patterning the protein solution to form a protein substrate;
Seeding and culturing multiple cells on the protein substrate;
Seeding and culturing vascular endothelial cells on the multiple cells; and
A method for manufacturing a multi-layered cell sheet comprising the step of removing the protein substrate,
The multiple cells are hepatocytes, osteoblasts, myoblasts, neuroblasts, fibroblasts, glial cells, kidney cells, astrocytes, cardiovascular cells, keratinocytes, smooth muscle cells, cardiac myocytes, glial cells, hormone secreting cells and pancreatic islet cells. Including one or more selected from the group consisting of,
The vascular endothelial cells include at least one extracellular matrix selected from the group consisting of fibronectin, laminin, and collagen type IV,
Forming the protein substrate,
manufacturing a PDMS mold; and
After applying the protein solution to a hydrophobic Petri dish, the surface of the protein solution is stamped with the PDMS mold to transfer the protein solution to the PDMS mold, and the protein solution is transferred to a new hydrophobic Petri dish to form a protein substrate step;
including,
In the step of removing the protein base, collagenase, cellulase, amylase, alginate lyase, gellanase, hyaluronidase, chitinase, chitosanase, gyialinase, mannanase, glucosyltransferase , glucosidase, pectinase, lactase, maltase, sucrase, glucanase, chondroitanase, agarase, galactosidase, fructanase, galactanase, dextranase, flu At least one enzyme selected from the group consisting of lanase, amalase and invertase is used,
The step of removing the protein substrate is performed at pH 7.4 to 7.8,
In the multi-layer cell sheet, the thickness of one layer of the cell sheet is 70 μm to 100 μm, and the base area is 45,000 μm 2 to 50,000 μm 2 ,
A method for producing a multi-layered cell sheet comprising multiple cells.
 제1항에 있어서,
상기 단백질은, 콜라겐, 젤라틴, 엘라스틴, 피브로넥틴, 피브린, 라미닌 비트로넥틴, 폴리-L-라이신, 폴리-D-라이신, 폴리-L-오르티닌 및 아르기닌-글리신-아스파틱 산으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함하는 것인,
다중 세포를 포함하는 다층 세포 시트의 제조방법.
According to claim 1,
The protein is selected from the group consisting of collagen, gelatin, elastin, fibronectin, fibrin, laminin vitronectin, poly-L-lysine, poly-D-lysine, poly-L-ortinine and arginine-glycine-aspartic acid which includes one or more
A method for producing a multi-layered cell sheet comprising multiple cells.
 제1항에 있어서,
상기 단백질 용액은, 농도가 2 mg/mL 내지 2.5 mg/mL인 것인,
다중 세포를 포함하는 다층 세포 시트의 제조방법.
According to claim 1,
The protein solution has a concentration of 2 mg / mL to 2.5 mg / mL,
A method for producing a multi-layered cell sheet comprising multiple cells.
 삭제delete 제1항에 있어서,
상기 다중 세포를 배양하는 단계는, 6일 내지 8일동안 수행되는 것이고,
상기 혈관 내피 세포를 배양하는 단계는, 1일 내지 4일동안 수행되는 것인,
다중 세포를 포함하는 다층 세포 시트의 제조방법.
According to claim 1,
The step of culturing the multiple cells is performed for 6 to 8 days,
The step of culturing the vascular endothelial cells is performed for 1 to 4 days,
A method for producing a multi-layered cell sheet comprising multiple cells.
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