KR102524401B1 - Contrast agent for optical imaging for early diagnosing rheumatoid arthritis - Google Patents
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Abstract
본 발명은 류마티스 관절염의 조기 진단을 위한 광학 영상용 조영제 조성물 및 그 제조 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 금 나노입자; 및 상기 금 나노입자의 표면을 감싸도록 형성된 폴리에틸렌글리콜(polyethyleneglycol, PEG) 코팅층을 포함하고, 상기 금 나노입자 상에 위치하는 복수 개의 단백질 G(protein G) 및 상기 단백질 G에 연결된 항체를 더 포함하거나, 상기 폴리에틸렌글리콜 코팅층에 연결되는 서열번호 1로 표시되는 펩타이드를 더 포함하는, 관절염 진단용 조영제 조성물에 관한 것이다.The present invention relates to a contrast agent composition for optical imaging for early diagnosis of rheumatoid arthritis and a method for preparing the same, and more particularly, to a composition comprising gold nanoparticles; and a polyethylene glycol (PEG) coating layer formed to cover the surface of the gold nanoparticles, further comprising a plurality of protein Gs located on the gold nanoparticles and an antibody linked to the protein Gs. , It relates to a contrast medium composition for diagnosing arthritis, further comprising a peptide represented by SEQ ID NO: 1 connected to the polyethylene glycol coating layer.
Description
본 발명은 류마티스 관절염의 조기 진단을 위한 광학 영상용 조영제 조성물 및 그 제조 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a contrast medium composition for optical imaging for early diagnosis of rheumatoid arthritis and a method for preparing the same.
류마티스 관절염 (rheumatoid arthritis)은 성인에서 가장 흔하게 발병하는 염증성 관절염으로, 그 원인이 아직 완전히 알려지지 않았으나, 자가면역 기전으로 인한 염증 반응으로 이해되고 있다. 류마티스 관절염의 병변은 관절강을 안쪽으로 둘러싸고 있는 활막의 염증(synovitis)이다. 활막 내에서 염증이 시작되면 더 많은 염증세포가 활막에 침윤되고, 활막 세포들이 증식하며, 신생혈관이 생성되는 과정을 통해 활막 조직은 더욱 증식되고 활성화된다. 병이 진행됨에 따라 염증반응의 결과로 활막 조직 주위의 관절 연골이 손상되고 골파괴가 나타나 결국 관절의 변형이 일어나며 장애가 생기게 된다. Rheumatoid arthritis is the most common inflammatory arthritis in adults, the cause of which is not yet fully understood, but is understood to be an inflammatory response caused by an autoimmune mechanism. The lesion of rheumatoid arthritis is inflammation of the synovial membrane that lines the joint cavity (synovitis). When inflammation starts in the synovial membrane, more inflammatory cells infiltrate the synovial membrane, synovial cells proliferate, and synovial tissues are further proliferated and activated through the process of generating new blood vessels. As the disease progresses, as a result of the inflammatory reaction, the articular cartilage around the synovial tissue is damaged and bone destruction occurs, resulting in joint deformation and disability.
류마티스 관절염에서 이러한 관절의 손상은 비가역적이며 70~80%의 환자에서 발병 초기에 발생하는 것으로 알려져 있다. 류마티스 관절염 환자에서 흔히 관찰되는 기능적 장애 및 골밀도의 감소 역시 류마티스 관절염의 발병 초기에 가장 많이 발생하고 이들의 발생은 관절 손상의 정도와 밀접한 연관성이 있는 것으로 알려져 있다. 그러므로, 류마티스 관절염을 조기에 진단하여 적극적으로 치료하는 것이 필요하다. In rheumatoid arthritis, damage to these joints is irreversible and is known to occur in the early stages of onset in 70-80% of patients. It is known that functional impairment and reduction in bone density, which are commonly observed in patients with rheumatoid arthritis, also occur most frequently in the early stages of the onset of rheumatoid arthritis, and their occurrence is closely related to the degree of joint damage. Therefore, it is necessary to diagnose rheumatoid arthritis early and actively treat it.
류마티스 관절염을 진단 평가하기 위한 영상 방법에는 X 선 검사, 초음파, CT, MRI, 전신골스캔과 PET 등이 있다. X 선 검사와 초음파는 비교적 저렴한 비용의 검사 방법이지만, 현 시점의 관절염 활성 정도를 평가하기에는 제한점이 있다. CT는 구조적 손상(structural damage)을 확인하는 좋은 검사 방법이나, 관절염 활성 정도를 반영하지 못하고 방사선 노출의 위험성이 있으며, 조영제에 의한 과민반응이나 신장 기능 저하의 위험성이 있다. MRI는 관절염 활성 정도를 평가하는데 좋은 영상 검사법이지만 검사 비용이 비싸고 검사 시간이 오래 걸린다는 단점이 있다. 전신골 스캔은 관절의 염증 정도를 반영하는 검사이지만 관절염의 정량적 평가는 어렵다. PET 검사는 관절의 염증 정도를 어느 정도 정량화 할 수 있지만 방사성 동위원소에 의한 위험성이 있고 검사 비용이 매우 높은 단점이 있다.Imaging methods for diagnosing and evaluating rheumatoid arthritis include X-ray examination, ultrasound, CT, MRI, whole body bone scan, and PET. X-ray examination and ultrasound are relatively low-cost examination methods, but there are limitations in evaluating the degree of arthritis activity at the present time. Although CT is a good test method for confirming structural damage, it does not reflect the degree of arthritic activity, and there is a risk of radiation exposure, hypersensitivity reaction by a contrast agent, or renal function deterioration. MRI is a good imaging method for evaluating the degree of arthritis activity, but it has the disadvantage of high cost and long examination time. Whole body bone scan is a test that reflects the degree of joint inflammation, but it is difficult to quantitatively evaluate arthritis. PET scan can quantify the degree of joint inflammation to some extent, but it has the disadvantage of high risk of radioactive isotopes and very high test cost.
본 발명의 일 목적은 류마티스 관절염의 조기 진단을 가능하게 하는 광학 영상용 조영제 조성물을 제공하고자 한다. One object of the present invention is to provide a contrast agent composition for optical imaging enabling early diagnosis of rheumatoid arthritis.
본 발명의 다른 목적은 류마티스 관절염의 조기 진단을 가능하게 하는 광학 영상용 조영제 조성물의 제조 방법을 제공하고자 한다.Another object of the present invention is to provide a method for preparing a contrast agent composition for optical imaging enabling early diagnosis of rheumatoid arthritis.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.However, the technical problem to be achieved by the present invention is not limited to the above-mentioned problems, and other problems not mentioned will be clearly understood by those skilled in the art from the following description.
본 발명의 일 구현 예에 따르면, 금 나노입자; 및 상기 금 나노입자의 표면을 감싸도록 형성된 폴리에틸렌글리콜(polyethyleneglycol, PEG) 코팅층을 포함하고, According to one embodiment of the present invention, gold nanoparticles; and a polyethylene glycol (PEG) coating layer formed to cover the surface of the gold nanoparticles,
상기 금 나노입자 상에 위치하는 복수 개의 단백질 G(protein G) 및 상기 단백질 G에 연결된 항체를 더 포함하거나, 상기 폴리에틸렌글리콜 코팅층에 연결되는 서열번호 1로 표시되는 펩타이드를 더 포함하는, 관절염 진단용 조영제 조성물에 관한 것이다. A contrast medium for diagnosing arthritis, further comprising a plurality of protein Gs located on the gold nanoparticles and an antibody linked to the protein G, or further comprising the peptide represented by SEQ ID NO: 1 linked to the polyethylene glycol coating layer It's about the composition.
본 발명에서 상기 금 나노입자는 구형(nanosphere), 쉘 형태(nanoshell), 또는 막대형(nanorod)을 가질 수 있으나, 바람직하게는 막대형일 수 있다.In the present invention, the gold nanoparticle may have a nanosphere, a nanoshell, or a rod shape, but is preferably a rod shape.
본 발명에서 상기 금 나노입자의 직경은 3 nm 내지 50 nm, 바람직하게는 10 내지 40 nm의 직경을 가지는 것일 수 있다. In the present invention, the gold nanoparticles may have a diameter of 3 nm to 50 nm, preferably 10 to 40 nm.
본 발명에서 상기 폴리에틸렌글리콜(PEG)은 HS-(CH2CH2)175-COOH 또는 분자량이 1,000 내지 50,000인 HS-폴리(에틸렌 글리콜)-CH3(HS-poly(ethylene glycol)-CH3)일 수 있다.In the present invention, the polyethylene glycol (PEG) is HS-(CH 2 CH 2 ) 175 -COOH or HS-poly(ethylene glycol)-CH 3 having a molecular weight of 1,000 to 50,000 ( HS-poly(ethylene glycol)-CH 3 ) can be
본 발명에서 상기 항체는 관절염의 진단을 위한 타겟 항원에 특이적인 항체로, 예를 들면, TNF-알파(TNF-alpha), 과립구 큰포식세포 집락 자극인자(granulocyte macrophage-colony stimulating factor; GM-CSF), αvβ3 인테그린(αvβ3 integrins), 혈관내피성장인자(vascular endothelial growth factor; VEGF), 기질 금속함유 단백분해효소(matrix metalloproteinase; MMP), 셀렉틴(selectin), 야누스 키나제 1(Janus kinase 1; JaK1), 야누스 키나제 2(Janus kinase 2; JaK2), 야누스 키나제 3(Janus kinase 3; JaK3), 티로신 키나제 2(tyrosine kinase 2; Tyk2), 브루톤 티로신 키나제(Bruton's tyrosine kinase; BTK), 포스포이노시티드 3-키나제(Phosphoinositide 3-kinase; PI3K), 인터루킨-1(interleukin 1; IL-1), 인터루킨-6(interleukin 6; IL-6), 인터루킨-17(interleukin 17; IL-17), 인터루킨-12 p40(interleukin 12 p40; IL-12p40), 인터루킨-23 p19(interleukin 23 p19; IL-23p19), 인터루킨-22(interleukin 22; IL-22), 세포독성 T 림프구 관련 항원 4(Cytotoxic T Lymphocyte associated Antigen 4; CTLA-4), CD20, 혈관세포 부착분자-1(vascular cell adhesion molecule-1; VCAM-1), S100 단백질 패밀리(S100 proteins), AXL 수용체 단백질 티로신 키나제(AXL receptor protein tyrosine kinase), 대식세포 집락자극인자(큰포식세포 집락자극인자, macrophage colony stimulating factor; M-CSF), 세포예정사 리간드(programmed cell death ligand 2; PDCD1LG2), TNF 수용체 2(tumor necrosis factor receptor 2), TNF 수용체 슈퍼패밀리1B(tumor necrosis factor receptor superfamily 1B; TNFRSF1B), 히알루론산결합단백질 2(hyaluronan-binding protein 2), 세마포린 4A(semaphorin 4A; SEMA4D) 또는 파골세포 자극인자 1(osteoclast stimulating factor 1)에 특이적으로 결합하는 항체일 수 있고, 바람직하게는 TNF-알파(TNF-alpha) 또는 인터루킨-6(IL-6)에 특이적으로 결합하는 항체일 수 있다. In the present invention, the antibody is an antibody specific to a target antigen for diagnosis of arthritis, for example, TNF-alpha, granulocyte macrophage-colony stimulating factor (GM-CSF) ), αvβ3 integrins, vascular endothelial growth factor (VEGF), matrix metalloproteinase (MMP), selectin, Janus kinase 1 (JaK1) , Janus kinase 2 (JaK2), Janus kinase 3 (JaK3), tyrosine kinase 2 (Tyk2), Bruton's tyrosine kinase (BTK), phosphoinositide Phosphoinositide 3-kinase (PI3K), interleukin-1 (IL-1), interleukin-6 (IL-6), interleukin-17 (IL-17), interleukin-1 12 p40 (
본 발명에 상기 "항체"는 항원과 특이적으로 결합하여 항원-항체 반응을 일으키는 물질을 가리킨다. 본 발명의 목적상, 항체는 상기 바이오마커 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미한다. 본 발명의 항체는 다클론 항체, 단클론 항체 및 재조합 항체를 모두 포함한다. 상기 항체는 당업계에 널리 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 다클론 항체는 상기 단백질의 항원을 동물에 주사하고 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 과정을 포함하는 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 생산될 수 있다. 이러한 다클론 항체는 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소, 개 등의 임의의 동물로부터 제조될 수 있다. 또한, 단클론 항체는 당업계에 널리 공지된 하이브리도마 방법(hybridoma method; Kohler 및 Milstein (1976) European Journal of Immunology 6:511-519 참조), 또는 파지 항체 라이브러리 기술(Clackson et al, Nature, 352:624-628, 1991; Marks et al, J. Mol. Biol., 222:58, 1-597, 1991 참조)을 이용하여 제조될 수 있다. 상기 방법으로 제조된 항체는 겔 전기영동, 투석, 염 침전, 이온교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 등의 방법을 이용하여 분리, 정제될 수 있다. 또한, 본 발명의 항체는 2개의 전장의 경쇄 및 2개의 전장의 중쇄를 갖는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란, 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv 등이 있다.In the present invention, the "antibody" refers to a substance that specifically binds to an antigen and causes an antigen-antibody reaction. For the purposes of the present invention, an antibody refers to an antibody that specifically binds to the biomarker protein. Antibodies of the present invention include both polyclonal antibodies, monoclonal antibodies and recombinant antibodies. Such antibodies can be readily prepared using techniques well known in the art. For example, polyclonal antibodies can be produced by a method well known in the art, including a process of injecting an antigen of the protein into an animal and collecting blood from the animal to obtain serum containing the antibody. Such polyclonal antibodies can be prepared from any animal, such as goat, rabbit, sheep, monkey, horse, pig, cow, dog, and the like. In addition, monoclonal antibodies can be prepared using the hybridoma method well known in the art (see Kohler and Milstein (1976) European Journal of Immunology 6:511-519), or the phage antibody library technique (Clackson et al, Nature, 352). :624-628, 1991; Marks et al, J. Mol. Biol., 222:58, 1-597, 1991). Antibodies prepared by the above methods may be separated and purified using methods such as gel electrophoresis, dialysis, salt precipitation, ion exchange chromatography, and affinity chromatography. In addition, the antibodies of the present invention include functional fragments of antibody molecules as well as complete forms having two full-length light chains and two full-length heavy chains. A functional fragment of an antibody molecule means a fragment having at least an antigen-binding function, and includes Fab, F(ab'), F(ab')2, and Fv.
본 발명에서 상기 서열번호 1로 표시되는 펩티드는 하기 화학식 1로 표시되는 구조의 사이클릭 RGD(cyclic-Arginine-Glycine-Aspartic acid)일 수 있다:In the present invention, the peptide represented by SEQ ID NO: 1 may be cyclic-Arginine-Glycine-Aspartic acid (RGD) having a structure represented by
[화학식 1][Formula 1]
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 조영제의 구조를 도시한 것으로, 금 나노입자(10), 바람직하게는 금 나노막대(gold nanorod) 상에 복수 개의 단백질 G(30)가 위치하며, 상기 금 나노막대를 감싸도록 폴리에틸렌글리콜(PEG) 코팅층(20)이 형성되고, 상기 단백질 G에는 항체(40)가 연결된 구조를 이룰 수 있다. 1 shows the structure of a contrast agent according to an embodiment of the present invention, wherein a plurality of
도 2는 본 발명의 다른 실시예에 따른 조영제의 구조를 도시한 것으로, 금 나노입자(10), 바람직하게는 금 나노막대(gold nanorod) 상에 폴리에틸렌글리콜(PEG) 코팅층(20)이 형성되고, 상기 폴리에틸렌글리콜(PEG) 코팅층에 서열번호 1로 표시되는 펩타이드(50)가, 바람직하게는 공유 결합으로 연결된 구조를 이룰 수 있다. 2 shows the structure of a contrast agent according to another embodiment of the present invention, wherein a polyethylene glycol (PEG)
본 발명의 조영제 조성물은 단순히 관절에 통증이 있는 관절통과 구분하여 관절염의 진단을 위해 사용할 수 있고, 특히 관절염의 조기 진단을 위해 사용할 수 있다. 본 발명에서 상기 관절염은 류마티스 관절염, 미분화성 관절염, 소아기 특발성 관절염, 척추관절염, 강직척추염, 반응관절염, 건선관절염, 장질환과 연관된 관절염, 골관절염, 통풍, 가성통풍, 전신홍반루푸스, 전신경화증, 쇼그렌증후군, 다발성근염, 피부근염, 혈관염, 성인형스틸씨병, 세균관절염, 결핵관절염, 바이러스 관절염, 라임병, 골관절염, 섬유근통, 재발성 류마티즘, 재발다발연골염, 사르코이드증, 류마티스다발근통, 급성관절통증, 윤활낭염 및 힘줄염으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인 것일 수 있으나, 바람직하게는 류마티스 관절염일 수 있다.The contrast agent composition of the present invention can be used for the diagnosis of arthritis by distinguishing it from arthralgia, which is simply pain in the joints, and can be particularly used for the early diagnosis of arthritis. In the present invention, the arthritis is rheumatoid arthritis, undifferentiated arthritis, juvenile idiopathic arthritis, spondyloarthritis, ankylosing spondylitis, reactive arthritis, psoriatic arthritis, arthritis associated with intestinal disease, osteoarthritis, gout, pseudogout, systemic lupus erythematosus, systemic sclerosis, Sjogren's Syndrome, polymyositis, dermatomyositis, vasculitis, adult form Still's disease, bacterial arthritis, tuberculosis arthritis, viral arthritis, Lyme disease, osteoarthritis, fibromyalgia, recurrent rheumatism, relapsing polychondritis, sarcoidosis, polymyalgia rheumatica, acute joint pain , It may be any one selected from the group consisting of bursitis and tendonitis, but preferably may be rheumatoid arthritis.
본 발명에서 상기 조영제 조성물은 광학 영상화(optical imaging) 또는 광음향 영상화(potoacoustic imaging)용으로 사용될 수 있다.In the present invention, the contrast medium composition may be used for optical imaging or photoacoustic imaging.
본 발명에서 상기 "조영제"란 생체 내에서 완전 (즉, 원상태) 포유동물 신체의 관심있는 부위의 광학 영상화에 적합한 화합물을 의미한다. 바람직하게는, 포유동물은 인간이다. 영상화는 침투성 (예를 들어 수술 중 또는 내시경) 또는 비-침투성일 수도 있다. 생검 (예를 들어, 내시경 장치에서 생검 채널을 통해) 또는 종양 절제 (예를 들어, 종양 가장자리 확인을 통하여 수술중 절차 동안에)를 수월하게 하기 위하여 영상화가 임의로 사용될 수도 있다.In the present invention, the "contrast agent" means a compound suitable for optical imaging of a region of interest in a complete (ie, intact) mammalian body in vivo. Preferably, the mammal is a human. Imaging may be invasive (eg intraoperative or endoscopic) or non-invasive. Imaging may optionally be used to facilitate a biopsy (eg, through a biopsy channel in an endoscopic device) or tumor resection (eg, during an intraoperative procedure through identification of tumor margins).
본 발명에서 상기 "광학 영상화(optical imaging)"란, 녹색 내지 근 적외선 영역의 광 (파장 500-1200 nm)과의 상호작용을 기초로 하여, 질병의 검출, 단계결정 또는 진단, 질병 발생의 모니터링조사, 또는 질병 치료의 모니터링 조사를 위해 영상을 형성하는 어떠한 방법을 의미한다. 광학 영상화는, 어떠한 기구도 사용하지 않는 직접적인 가시화 및 다양한 스코프, 카테터 및 광학 영상화 장치, 예를 들어, 단층촬영 표시를 위한 컴퓨터-보조 하드웨어와 같은 기구의 사용을 포함한 모든 방법을 더욱 포함한다. 형식 및 측정 기술은 이에 한정되지 않지만 발광 영상화; 내시경; 형광 내시경; 광학적 간섭성 단층촬영; 투과 영상화; 시간차 투과 영상화; 공촛점 영상화; 비선형 현미경; 광음향 영상화; 음향-광학 영상화; 분광법; 반사 분광법; 간섭법; 결맞춤 간섭법; 확산 광학 단층촬영법 및 형광 매개 확산 광학 단층촬영법 (연속 파, 시간 도메인 및 주파수 도메인 시스템), 및 광 산란, 흡수, 편광, 발광, 형광 수명, 양자 수율 및 소광의 측정을 포함한다. 이러한 기술의 추가의 세부사항은 문헌 ([Tuan Vo-Dinh (편집자): "Biomedical Photonics Handbook" (2003), CRC Press LCC]; [Mycek & Pogue (편집자): "Handbook of Biomedical Fluorescence" (2003), Marcel Dekker, Inc.]; [Splinter & Hopper: "An Introduction to Biomedical Optics" (2007), CRC Press LCC])에 의해 제공된다. In the present invention, the term "optical imaging" is based on interaction with light (wavelength 500-1200 nm) in the green to near-infrared region, detection of disease, staging or diagnosis, monitoring of disease occurrence It means any method of forming an image for investigation, or monitoring investigation of disease treatment. Optical imaging further includes all methods including direct visualization without the use of any instruments and the use of instruments such as various scopes, catheters and optical imaging devices, eg computer-aided hardware for tomographic display. Formats and measurement techniques include, but are not limited to, luminescence imaging; Endoscope; fluorescence endoscopy; optical coherence tomography; transmission imaging; temporal transmission imaging; confocal imaging; nonlinear microscope; optoacoustic imaging; acousto-optical imaging; spectroscopy; reflection spectroscopy; interference method; coherent interferometry; diffusion optical tomography and fluorescence-mediated diffusion optical tomography (continuous wave, time domain and frequency domain systems), and measurements of light scattering, absorption, polarization, luminescence, fluorescence lifetime, quantum yield and extinction. Further details of this technique can be found in [Tuan Vo-Dinh (Editor): "Biomedical Photonics Handbook" (2003), CRC Press LCC]; [Mycek & Pogue (Editor): "Handbook of Biomedical Fluorescence" (2003) , Marcel Dekker, Inc.]; [Splinter & Hopper: "An Introduction to Biomedical Optics" (2007), CRC Press LCC]).
본 발명에서 상기 광학 영상화를 위해 사용되는 녹색 내지 근-적외선 영역의 광의 파장은 500 내지 1200 nm, 바람직하게는 550 내지 1000 nm, 가장 바람직하게는 600 내지 900 nm일 수 있다. The wavelength of light in the green to near-infrared region used for optical imaging in the present invention may be 500 to 1200 nm, preferably 550 to 1000 nm, and most preferably 600 to 900 nm.
본 발명에서 "광음향 영상화(potoacoustic imaging)"는 광음향 효과에 기반한 생물 의학의 이미징 모달리티(biomedical imaging modality)에 해당한다. 광음향 영상화 시 비전리 레이저 펄스는 생물학적 조직으로 전달된다. 전달된 에너지의 일부는 흡수되어 열로 전환되고, 일시적으로 열탄성 팽창을 일으켜 MHz와 같은 광대역 초음파 방출을 일으킨다. 발생된 초음파 파장은 초음파 변환기에 의해 탐지되고 분석되어 이미지를 생성한다. 광학 흡수는 물리적 특성과 밀접하게 관련되어 있다. 따라서 초음파 방출의 크기, 즉 광음향 신호는 국소적 에너지 축적에 비례하며, 물리적으로 특정의 광학 흡수 조영을 나타낸다. 타겟 부위의 2D 또는 3D 이미지를 형성할 수 있다. In the present invention, "photoacoustic imaging" corresponds to a biomedical imaging modality based on a photoacoustic effect. In optoacoustic imaging, non-ionizing laser pulses are delivered to biological tissue. A portion of the transferred energy is absorbed and converted to heat, causing a transient thermoelastic expansion resulting in broadband ultrasonic emission such as MHz. The generated ultrasonic waves are detected and analyzed by an ultrasonic transducer to create an image. Optical absorption is closely related to physical properties. Thus, the magnitude of the ultrasonic emission, i.e. the optoacoustic signal, is proportional to the local energy accumulation and physically exhibits a specific optical absorption contrast. A 2D or 3D image of the target site can be formed.
본 발명의 조영제 조성물은 비경구 또는 경구 방식으로 투여될 수 있다. 비경구 투여를 하는 경우, 정맥내 주입, 근육내 주입, 관절내(intra-articular) 주입, 활액내(intra-synovial) 주입, 수망강내 주입, 간내(intrahepatic) 주입, 병변내(intralesional) 주입 또는 두개강내(intracranial) 주입 등으로 투여할 수 있다. 본 발명의 조영제 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. The contrast medium composition of the present invention may be administered parenterally or orally. For parenteral administration, intravenous infusion, intramuscular infusion, intra-articular infusion, intra-synovial infusion, intrathecal infusion, intrahepatic infusion, intralesional infusion, or It can be administered by intracranial injection or the like. A suitable dosage of the contrast medium composition of the present invention may be variously prescribed depending on factors such as formulation method, administration method, patient's age, weight, sex, morbid condition, food, administration time, administration route, excretion rate, and reaction sensitivity. can
본 발명의 다른 구현 예에 따르면, 금 나노입자를 준비하는 단계; 및 상기 금 나노입자의 표면을 감싸도록 폴리에틸렌글리콜(PEG)을 코팅하는 단계;를 포함하고, According to another embodiment of the present invention, preparing gold nanoparticles; and coating polyethylene glycol (PEG) to cover the surface of the gold nanoparticles,
상기 폴리에틸렌글리콜(PEG)을 코팅하는 단계에 앞서 상기 금 나노입자 상에 복수 개의 단백질 G(protein G)을 위치시키는 단계 및 상기 단백질 G에 항체를 연결시키는 단계를 더 포함하거나, 상기 폴리에틸렌글리콜을 코팅하는 단계에 후속적으로 상기 폴리에틸렌글리콜에 서열번호 1로 표시되는 펩타이드를 연결하는 단계를 더 포함하는, 관절염 진단용 조영제 조성물의 제조 방법에 관한 것이다. Prior to the step of coating the polyethylene glycol (PEG), the step of placing a plurality of protein G on the gold nanoparticles and linking the antibody to the protein G, or coating the gold nanoparticles with the polyethylene glycol. It relates to a method for preparing a contrast medium composition for diagnosing arthritis, further comprising the step of linking the peptide represented by SEQ ID NO: 1 to the polyethylene glycol, subsequent to the step of performing the step.
금 나노입자를 준비하는 단계Preparing gold nanoparticles
본 발명에서 상기 금 나노입자는 구형(nanosphere), 쉘 형태(nanoshell), 또는 막대형(nanorod)을 가질 수 있으나, 바람직하게는 막대형일 수 있다.In the present invention, the gold nanoparticle may have a nanosphere, a nanoshell, or a rod shape, but is preferably a rod shape.
본 발명에서 상기 금 나노입자의 직경은 3 nm 내지 50 nm, 바람직하게는 10 내지 40 nm의 직경을 가지는 것일 수 있다. In the present invention, the gold nanoparticles may have a diameter of 3 nm to 50 nm, preferably 10 to 40 nm.
본 발명에서 상기 금 나노입자를 제조하기 위해서는, (1) 세틸트리암모늄 브로마이드(cetyltrimethylammonium bromide; CTAB)와 염화 금산(Chloroauric acid, HAuCl4)을 혼합하여 얻어진 혼합물에 소듐 보로하이드라이드(Sodium borohydride, NaBrH4)를 첨가하여 금 씨드(seed) 용액을 제조하는 단계; In order to prepare the gold nanoparticles in the present invention, ( 1 ) Sodium borohydride (Sodium borohydride, NaBrH 4 ) to prepare a gold seed solution;
(2) 세틸트리암모늄 브로마이드(CTAB), 질산은(Silver nitrate, AgNO3) 및 염화 금산(HAuCl4)을 혼합하여 얻어진 혼합물에 아스코르브산(ascorbic acid)을 첨가하는 단계; 및(2) adding ascorbic acid to a mixture obtained by mixing cetyltriammonium bromide (CTAB), silver nitrate (AgNO 3 ) and chloroauric acid (HAuCl 4 ); and
(3) 상기 (1) 단계에서 얻어진 금 씨드 용액과 상기 (2) 단계에서 얻어진 혼합물을 혼합하여 금 나노입자를 형성하는 단계를 포함할 수 있다. (3) mixing the gold seed solution obtained in step (1) with the mixture obtained in step (2) to form gold nanoparticles.
본 발명에서 상기 (1) 단계 후 20 내지 30 ℃에서 30 분 내지 6 시간, 바람직하게는 1 시간 내지 3 시간 동안 유지시키는 단계를 추가로 수행할 수 있다. In the present invention, after step (1), a step of maintaining at 20 to 30 ° C. for 30 minutes to 6 hours, preferably for 1 hour to 3 hours may be additionally performed.
본 발명에서 상기 (2) 단계 시 아스코르브산을 첨가하기에 앞서, 상기 세틸트리암모늄 브로마이드(CTAB), 질산은(AgNO3) 및 염화 금산(HAuCl4)을 혼합한 뒤 교반하는 단계를 추가로 수행할 수 있다. In the present invention, prior to adding ascorbic acid in step (2), the cetyltriammonium bromide (CTAB), silver nitrate (AgNO 3 ) and chloroauric acid (HAuCl 4 ) are mixed and stirred. can do.
또한, 본 발명에서 상기 (2) 단계 후 20 내지 40 ℃의 온도 하에서 100 내지 200 rpm의 교반 속도로 교반하는 단계를 추가로 수행할 수 있다. In addition, in the present invention, after step (2), a step of stirring at a stirring speed of 100 to 200 rpm at a temperature of 20 to 40 ° C may be additionally performed.
본 발명에서는 상기 (3) 단계 후 10,000 내지 30,000 rpm, 바람직하게는 10,000 내지 20,000 rpm의 조건 하에서 10 분 내지 2 시간, 바람직하게는 20 분 내지 40 분 동안 원심 분리하는 단계를 추가로 수행할 수 있다. In the present invention, after step (3), a step of centrifuging for 10 minutes to 2 hours, preferably 20 minutes to 40 minutes under conditions of 10,000 to 30,000 rpm, preferably 10,000 to 20,000 rpm may be further performed. .
폴리에틸렌글리콜(PEG)을 코팅하는 단계Coating with polyethylene glycol (PEG)
본 발명에서는 상기와 같이 금 나노입자가 준비되면 그 표면을 감싸도록 폴리에틸렌글리콜(PEG)을 코팅하는 단계를 수행할 수 있다.In the present invention, when the gold nanoparticles are prepared as described above, a step of coating polyethylene glycol (PEG) may be performed to cover the surface of the gold nanoparticles.
본 발명에서 상기 금 나노입자의 표면에 폴리에틸렌글리콜(PEG)을 코팅하기 위해서는, 상기 금 나노입자와 폴리에틸렌글리콜(PEG)로, HS-(CH2CH2)175-COOH 또는 분자량이 1,000 내지 50,000인 HS-폴리(에틸렌 글리콜)-CH3(HS-poly(ethylene glycol)-CH3)과 혼합하는 단계를 수행할 수 있다. In the present invention, in order to coat the surface of the gold nanoparticles with polyethylene glycol (PEG), the gold nanoparticles and polyethylene glycol (PEG), HS-(CH 2 CH 2 ) 175 -COOH or a molecular weight of 1,000 to 50,000 A step of mixing with HS-poly(ethylene glycol)-CH 3 ( HS-poly(ethylene glycol)-CH 3 ) may be performed.
본 발명에서 상기 금 나노입자에 항체를 연결시키는 경우, 상기 폴리에틸렌글리콜은 분자량이 1,000 내지 50,000인 HS-폴리(에틸렌 글리콜)-CH3(HS-poly(ethylene glycol)-CH3)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. In the present invention, when the antibody is linked to the gold nanoparticles, the polyethylene glycol may be HS-poly(ethylene glycol)-CH 3 ( HS-poly(ethylene glycol)-CH 3 ) having a molecular weight of 1,000 to 50,000, It is not limited thereto.
본 발명에서 상기 금 나노입자에 서열번호 1로 표시되는 펩타이드를 연결시키는 경우, 상기 폴리에틸렌글리콜은 HS-(CH2CH2)175-COOH일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. In the present invention, when the peptide represented by SEQ ID NO: 1 is linked to the gold nanoparticles, the polyethylene glycol may be HS-(CH 2 CH 2 ) 175 -COOH, but is not limited thereto.
또한, 본 발명에서는 상기 혼합하는 단계에 후속적으로 20 내지 40 ℃의 온도 하에서 6 시간 내지 48 시간, 바람직하게는 12 시간 내지 24 시간 동안 교반하는 단계를 추가로 수행할 수 있다. In addition, in the present invention, a step of stirring for 6 hours to 48 hours, preferably 12 hours to 24 hours at a temperature of 20 to 40 ° C. may be additionally performed following the mixing step.
본 발명에서는 상기 교반하는 단계에 후속적으로 5,000 내지 20,000 rpm, 바람직하게는 5,000 내지 15,000 rpm의 조건 하에서 10 분 내지 2 시간, 바람직하게는 20 분 내지 40 분 동안 원심 분리하는 단계를 추가로 수행할 수 있다. In the present invention, a step of centrifuging for 10 minutes to 2 hours, preferably 20 minutes to 40 minutes under the conditions of 5,000 to 20,000 rpm, preferably 5,000 to 15,000 rpm may be further performed following the stirring step. can
복수 개의 단백질 G(protein G)을 위치시키는 단계Positioning a plurality of protein G
다만, 본 발명에서는 상기 금 나노입자의 표면을 감싸도록 폴리에틸렌글리콜(PEG)을 코팅하기에 앞서, 상기 금 나노입자 상에 복수 개의 단백질 G(protein G)을 위치시키는 단계를 수행할 수 있다. However, in the present invention, prior to coating polyethylene glycol (PEG) to cover the surface of the gold nanoparticles, a step of positioning a plurality of protein G on the gold nanoparticles may be performed.
본 발명에서 상기 금 나노입자 상에 복수 개의 단백질 G(protein G)을 위치시키기 위해서는, 상기 금 나노입자와 단백질 G(protein G)를 혼합하는 단계를 수행할 수 있다.In the present invention, in order to place a plurality of protein G on the gold nanoparticle, a step of mixing the gold nanoparticle and protein G may be performed.
본 발명에서 상기 혼합은 0 ℃ 초과 10 ℃ 이하, 바람직하게는 1 ℃ 내지 5 ℃의 온도 하에서 2 시간 내지 48 시간, 바람직하게는 6 시간 내지 24 시간 동안 수행될 수 있다. In the present invention, the mixing may be performed for 2 hours to 48 hours, preferably 6 hours to 24 hours at a temperature of greater than 0 °C and less than 10 °C, preferably 1 °C to 5 °C.
본 발명에서는 상기 단백질 G를 위치시키는 단계 후 10,000 내지 30,000 rpm, 바람직하게는 10,000 내지 20,000 rpm의 조건 하에서 1 분 내지 1 시간, 바람직하게는 5 분 내지 30 분 동안 원심 분리하는 단계를 추가로 수행할 수 있다. In the present invention, the step of centrifuging for 1 minute to 1 hour, preferably 5 minutes to 30 minutes under conditions of 10,000 to 30,000 rpm, preferably 10,000 to 20,000 rpm after the step of positioning the protein G is further performed. can
항체를 연결시키는 단계linking the antibody
본 발명에서 상기 금 나노입자 상에 복수 개의 단백질 G를 위치시킨 뒤에는, 상기 단백질 G에 항체를 연결시키는 단계를 수행할 수 있다. In the present invention, after placing a plurality of protein G on the gold nanoparticle, a step of linking an antibody to the protein G may be performed.
본 발명에서 상기 항체는 관절염의 진단을 위한 타겟 항원에 특이적인 항체로, 예를 들면, TNF-알파(TNF-alpha), 과립구 큰포식세포 집락 자극인자(granulocyte macrophage-colony stimulating factor; GM-CSF), αvβ3 인테그린(αvβ3 integrins), 혈관내피성장인자(vascular endothelial growth factor; VEGF), 기질 금속함유 단백분해효소(matrix metalloproteinase; MMP), 셀렉틴(selectin), 야누스 키나제 1(Janus kinase 1; JaK1), 야누스 키나제 2(Janus kinase 2; JaK2), 야누스 키나제 3(Janus kinase 3; JaK3), 티로신 키나제 2(tyrosine kinase 2; Tyk2), 브루톤 티로신 키나제(Bruton's tyrosine kinase; BTK), 포스포이노시티드 3-키나제(Phosphoinositide 3-kinase; PI3K), 인터루킨-1(interleukin 1; IL-1), 인터루킨-6(interleukin 6; IL-6), 인터루킨-17(interleukin 17; IL-17), 인터루킨-12 p40(interleukin 12 p40; IL-12p40), 인터루킨-23 p19(interleukin 23 p19; IL-23p19), 인터루킨-22(interleukin 22; IL-22), 세포독성 T 림프구 관련 항원 4(Cytotoxic T Lymphocyte associated Antigen 4; CTLA-4), CD20, 혈관세포 부착분자-1(vascular cell adhesion molecule-1; VCAM-1), S100 단백질 패밀리(S100 proteins), AXL 수용체 단백질 티로신 키나제(AXL receptor protein tyrosine kinase), 대식세포 집락자극인자(큰포식세포 집락자극인자, macrophage colony stimulating factor; M-CSF), 세포예정사 리간드(programmed cell death ligand 2; PDCD1LG2), TNF 수용체 2(tumor necrosis factor receptor 2), TNF 수용체 슈퍼패밀리1B(tumor necrosis factor receptor superfamily 1B; TNFRSF1B), 히알루론산결합단백질 2(hyaluronan-binding protein 2), 세마포린 4A(semaphorin 4A; SEMA4D) 또는 파골세포 자극인자 1(osteoclast stimulating factor 1)에 특이적으로 결합하는 항체일 수 있고, 바람직하게는 TNF-알파(TNF-alpha) 또는 인터루킨-6(IL-6)에 특이적으로 결합하는 항체일 수 있다. In the present invention, the antibody is an antibody specific to a target antigen for diagnosis of arthritis, for example, TNF-alpha, granulocyte macrophage-colony stimulating factor (GM-CSF) ), αvβ3 integrins, vascular endothelial growth factor (VEGF), matrix metalloproteinase (MMP), selectin, Janus kinase 1 (JaK1) , Janus kinase 2 (JaK2), Janus kinase 3 (JaK3), tyrosine kinase 2 (Tyk2), Bruton's tyrosine kinase (BTK), phosphoinositide Phosphoinositide 3-kinase (PI3K), interleukin-1 (IL-1), interleukin-6 (IL-6), interleukin-17 (IL-17), interleukin-1 12 p40 (interleukin 12 p40; IL-12p40), interleukin-23 p19 (interleukin 23 p19; IL-23p19), interleukin-22 (interleukin 22; IL-22), Cytotoxic T Lymphocyte associated antigen 4 Antigen 4; CTLA-4), CD20, vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1), S100 protein family (S100 proteins), AXL receptor protein tyrosine kinase, Macrophage colony stimulating factor (macrophage colony stimulating factor; macrophage colony stimulating factor; M-CSF), programmed cell death ligand 2 (PDCD1LG2), TNF receptor 2 (tumor necrosis factor receptor 2), TNF receptor superfamily 1B (TNFRSF1B), hyaluronic acid binding protein 2 (hyaluronan-binding protein 2), semaphorin 4A (SEMA4D) or an antibody that specifically binds to osteoclast stimulating factor 1 (osteoclast stimulating factor 1), preferably TNF-alpha (TNF- alpha) or an antibody that specifically binds to interleukin-6 (IL-6).
본 발명에서 상기 단백질 G에 상기 항체를 연결하기 위해서는, 상기와 같이 표면에 복수 개의 단백질 G가 위치한 금 나노입자를 항체와 혼합하는 단계를 수행할 수 있다.In the present invention, in order to link the antibody to the protein G, a step of mixing the gold nanoparticles having a plurality of protein G on the surface with the antibody may be performed.
본 발명에서 상기 혼합은 0 ℃ 초과 10 ℃ 이하, 바람직하게는 1 ℃ 내지 5 ℃의 온도 하에서 2 시간 내지 48 시간, 바람직하게는 6 시간 내지 24 시간 동안 수행될 수 있다. In the present invention, the mixing may be performed for 2 hours to 48 hours, preferably 6 hours to 24 hours at a temperature of greater than 0 °C and less than 10 °C, preferably 1 °C to 5 °C.
본 발명에서는 상기 항체를 연결시키는 단계 후 10,000 내지 30,000 rpm, 바람직하게는 10,000 내지 20,000 rpm의 조건 하에서 1 분 내지 1 시간, 바람직하게는 5 분 내지 30 분 동안 원심 분리하는 단계를 추가로 수행할 수 있다. In the present invention, a step of centrifuging for 1 minute to 1 hour, preferably 5 minutes to 30 minutes under conditions of 10,000 to 30,000 rpm, preferably 10,000 to 20,000 rpm after the step of linking the antibodies may be further performed. there is.
본 발명에서는 상기 금 나노입자 상에 복수 개의 단백질 G를 위치시킨 뒤, 상기 단백질 G에 항체를 연결한 후 상기 금 나노입자의 표면을 감싸도록 폴리에틸렌글리콜(PEG)을 코팅함으로써 금 나노입자와 항체 사이 결합 효율을 현저히 높일 수 있고 그에 따라 체내 안정성과 관절염의 진단의 효율을 높임으로써 광학 영상화용으로 사용될 수 있을 뿐만 아니라 상기 관절염의 조기 진단 또한 가능하도록 한다. In the present invention, after placing a plurality of protein G on the gold nanoparticles, linking antibodies to the protein G, and then coating polyethylene glycol (PEG) to cover the surface of the gold nanoparticles, the gap between the gold nanoparticles and the antibody The binding efficiency can be remarkably increased, and thus the stability in the body and the efficiency of diagnosis of arthritis can be increased, so that it can be used for optical imaging as well as early diagnosis of the arthritis.
펩타이드를 연결하는 단계step of linking peptides
본 발명에서는 상기 금 나노입자의 표면을 감싸도록 폴리에틸렌글리콜(PEG)을 코팅한 후 상기 폴리에틸렌글리콜(PEG)에 서열번호 1로 표시되는 펩타이드를 연결하는 단계를 수행할 수 있다. In the present invention, after coating polyethylene glycol (PEG) to cover the surface of the gold nanoparticle, a step of connecting the peptide represented by SEQ ID NO: 1 to the polyethylene glycol (PEG) may be performed.
본 발명에서 상기 서열번호 1로 표시되는 펩티드는 하기 화학식 1로 표시되는 구조의 사이클릭 RGD(cyclic-Arginine-Glycine-Aspartic acid)일 수 있다:In the present invention, the peptide represented by SEQ ID NO: 1 may be cyclic-Arginine-Glycine-Aspartic acid (RGD) having a structure represented by
[화학식 1][Formula 1]
본 발명에서 상기 연결은 공유 결합일 수 있다.In the present invention, the linkage may be a covalent bond.
본 발명에서 상기 폴리에틸렌글리콜(PEG)에 서열번호 1로 표시되는 펩타이드를 연결하기 위해서는, 상기 폴리에틸렌글리콜(PEG)이 코팅된 금 나노입자와 서열번호 1로 표시되는 펩타이드를 혼합하는 단계를 수행할 수 있다.In the present invention, in order to link the peptide represented by SEQ ID NO: 1 to the polyethylene glycol (PEG), a step of mixing the gold nanoparticles coated with polyethylene glycol (PEG) and the peptide represented by SEQ ID NO: 1 can be performed. there is.
본 발명에서 상기 혼합 시 1-에틸-3(3-디메틸 아미노프로필) 카보디이미드(1-ethyl-3-(3-dimethyl aminopropyl) carbodiimide, EDC) 및 N-하이드록시숙신이미드(N-hydroxysuccinimide, NHS) 중 적어도 하나를 추가하며 수행될 수 있다. In the present invention, when the mixture is 1-ethyl-3 (3-dimethyl aminopropyl) carbodiimide (EDC) and N-hydroxysuccinimide (N-hydroxysuccinimide , NHS) can be performed by adding at least one of them.
또한, 본 발명에서는 상기 혼합하는 단계에 후속적으로 20 내지 40 ℃의 온도 하에서 6 시간 내지 48 시간, 바람직하게는 12 시간 내지 24 시간 동안 교반하는 단계를 추가로 수행할 수 있다.In addition, in the present invention, a step of stirring for 6 hours to 48 hours, preferably 12 hours to 24 hours at a temperature of 20 to 40 ° C. may be additionally performed following the mixing step.
조영제 조성물contrast agent composition
본 발명에서 상기의 방법으로 제조된 조영제 조성물은 관절염의 진단을 위해 사용할 수 있고, 특히 관절염의 조기 진단을 위해 사용할 수 있다. 본 발명에서 상기 관절염은 류마티스 관절염, 미분화성 관절염, 소아기 특발성 관절염, 척추관절염, 강직척추염, 반응관절염, 건선관절염, 장질환과 연관된 관절염, 골관절염, 통풍, 가성통풍, 전신홍반루푸스, 전신경화증, 쇼그렌증후군, 다발성근염, 피부근염, 혈관염, 성인형스틸씨병, 세균관절염, 결핵관절염, 바이러스 관절염, 라임병, 골관절염, 섬유근통, 재발성 류마티즘, 재발다발연골염, 사르코이드증, 류마티스다발근통, 급성관절통증, 윤활낭염 및 힘줄염으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인 것일 수 있으나, 바람직하게는 류마티스 관절염일 수 있다.In the present invention, the contrast medium composition prepared by the above method can be used for diagnosis of arthritis, and in particular, can be used for early diagnosis of arthritis. In the present invention, the arthritis is rheumatoid arthritis, undifferentiated arthritis, juvenile idiopathic arthritis, spondyloarthritis, ankylosing spondylitis, reactive arthritis, psoriatic arthritis, arthritis associated with intestinal disease, osteoarthritis, gout, pseudogout, systemic lupus erythematosus, systemic sclerosis, Sjogren's Syndrome, polymyositis, dermatomyositis, vasculitis, adult form Still's disease, bacterial arthritis, tuberculosis arthritis, viral arthritis, Lyme disease, osteoarthritis, fibromyalgia, recurrent rheumatism, relapsing polychondritis, sarcoidosis, polymyalgia rheumatica, acute joint pain , It may be any one selected from the group consisting of bursitis and tendonitis, but preferably may be rheumatoid arthritis.
본 발명에서 상기 조영제 조성물은 광학 영상화(optical imaging) 또는 광음향 영상화(potoacoustic imaging)용으로 사용될 수 있다.In the present invention, the contrast medium composition may be used for optical imaging or photoacoustic imaging.
본 발명에서 상기 광학 영상화를 위해 사용되는 녹색 내지 근-적외선 영역의 광의 파장은 500 내지 1200 nm, 바람직하게는 550 내지 1000 nm, 가장 바람직하게는 600 내지 900 nm일 수 있다. The wavelength of light in the green to near-infrared region used for optical imaging in the present invention may be 500 to 1200 nm, preferably 550 to 1000 nm, and most preferably 600 to 900 nm.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 조영제의 제조 공정을 나타낸 것으로, 금 나노입자를 준비하고, 상기 금 나노입자 상에 복수 개의 단백질 G(protein G)을 위치시킨 뒤 이에 항체를 연결시킨 후 상기 금 나노입자의 표면을 감싸도록 폴리에틸렌글리콜(PEG)을 코팅함으로써, 관절염 진단을 위한 조영제 조성물을 제조할 수 있다. 3 shows a manufacturing process of a contrast medium according to an embodiment of the present invention, after preparing gold nanoparticles, placing a plurality of protein G on the gold nanoparticles, and linking antibodies thereto; A contrast agent composition for diagnosing arthritis can be prepared by coating polyethylene glycol (PEG) to cover the surface of the gold nanoparticles.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 조영제의 제조 공정을 나타낸 것으로, 금 나노입자를 준비하고, 상기 금 나노입자의 표면을 감싸도록 폴리에틸렌글리콜(PEG)을 코팅한 뒤, 상기 폴리에틸렌글리콜(PEG)에 서열번호 1로 표시되는 펩타이드인 사이클릭 RGD(cyclic RGD)를 공유 결합시킴으로써 관절염 진단을 위한 조영제 조성물을 제조할 수 있다.4 shows a manufacturing process of a contrast agent according to an embodiment of the present invention, in which gold nanoparticles are prepared, polyethylene glycol (PEG) is coated to cover the surface of the gold nanoparticles, and then the polyethylene glycol (PEG) is coated. A contrast agent composition for diagnosing arthritis can be prepared by covalently binding cyclic RGD, which is a peptide represented by SEQ ID NO: 1, to ).
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 목적하는 개체에게 본 발명의 관절염 진단용 조영제 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 관절염 진단 방법에 관한 것이다. According to another embodiment of the present invention, it relates to a method for diagnosing arthritis, comprising the step of administering the contrast medium composition for diagnosing arthritis of the present invention to a target subject.
본 발명에서 상기 "목적하는 개체"란 관절염이 발병하였거나 발병 여부가 불확실한 개체로, 관절염이 발병 가능성이 높은 개체를 의미한다. 여기서, 상기 개체는 인간을 포함하는 포유 동물로, 예를 들면, 인간, 래트, 마우스, 모르모트, 햄스터, 토끼, 원숭이, 개, 고양이, 소, 말, 돼지, 양 및 염소로 구성된 군으로부터 선택될 수 있고, 바람직하게는 인간일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. In the present invention, the "object of interest" refers to an individual who has or is uncertain whether or not arthritis has developed, and is highly likely to develop arthritis. Here, the subject is a mammal including humans, for example, humans, rats, mice, guinea pigs, hamsters, rabbits, monkeys, dogs, cats, cows, horses, pigs, sheep and goats. It may be, preferably a human, but is not limited thereto.
본 발명에서 상기 조영제 조성물의 투여 시 비경구 또는 경구 방식으로 수행될 수 있다. 비경구 투여를 하는 경우, 정맥내 주입, 근육내 주입, 관절내(intra-articular) 주입, 활액내(intra-synovial) 주입, 수망강내 주입, 간내(intrahepatic) 주입, 병변내(intralesional) 주입 또는 두개강내(intracranial) 주입 등으로 투여할 수 있다. Administration of the contrast medium composition in the present invention may be performed in a parenteral or oral manner. For parenteral administration, intravenous infusion, intramuscular infusion, intra-articular infusion, intra-synovial infusion, intrathecal infusion, intrahepatic infusion, intralesional infusion, or It can be administered by intracranial injection or the like.
또한, 본 발명에서 상기 조영제 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. In addition, the appropriate dosage of the contrast medium composition in the present invention varies depending on factors such as formulation method, administration method, patient's age, weight, sex, morbid condition, food, administration time, administration route, excretion rate and reaction sensitivity. may be prescribed.
본 발명에서 상기 투여하는 단계에 후속적으로 광학 영상(optical imaging) 또는 광음향 영상(potoacoustic imaging)을 촬영하는 단계를 더 포함할 수 있다. In the present invention, the step of taking an optical image (optical imaging) or photoacoustic image (photoacoustic imaging) subsequent to the step of administering may further include.
본 발명에서 상기 광학 영상화를 위해 사용되는 녹색 내지 근-적외선 영역의 광의 파장은 500 내지 1200 nm, 바람직하게는 550 내지 1000 nm, 가장 바람직하게는 600 내지 900 nm일 수 있다.The wavelength of light in the green to near-infrared region used for optical imaging in the present invention may be 500 to 1200 nm, preferably 550 to 1000 nm, and most preferably 600 to 900 nm.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 목적하는 개체에게 본 발명의 관절염 진단용 조영제 조성물을 투여하는 단계; 및According to another embodiment of the present invention, administering the contrast agent composition for diagnosing arthritis of the present invention to a target subject; and
상기 개체의 목적하는 부위의 영상을 촬영하는 단계를 포함하는, 영상 획득 방법에 관한 것이다.It relates to an image acquisition method comprising the step of capturing an image of a target part of the object.
본 발명에서 상기 "목적하는 부위"란 관절염이 발병하였거나 발병 여부가 의심되는 신체 부위로, 예를 들면, 신체의 각 관절 부위일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. In the present invention, the "target site" refers to a body part where arthritis has occurred or is suspected, for example, each joint part of the body, but is not limited thereto.
본 발명에서 상기 영상은 광학 영상(optical imaging) 또는 광음향 영상(potoacoustic imaging)일 수 있다. In the present invention, the image may be optical imaging or photoacoustic imaging.
본 발명의 영상 획득 방법에서 상기 목적하는 개체의 정의, 조영제 조성물의 투여 방식 또는 투여량 및 광학 영상화를 위해 사용되는 광의 파장은 상기 진단 방법에 기재된 바와 중복되어 명세서의 과도한 복잡을 피하기 위해 이하 그 기재를 생략한다. In the image acquisition method of the present invention, the definition of the object, the administration method or dosage of the contrast agent composition, and the wavelength of light used for optical imaging are overlapped with those described in the diagnosis method, so to avoid excessive complexity of the specification, the description below omit
본 발명에서 제공하는 조영제 조성물은 광학 영상화(optical imaging) 또는 광음향 영상화(potoacoustic imaging)에 적용이 가능하며, 상기 조영제 조성물을 사용하는 경우 류마티스 관절염 등 관절염의 조기 진단을 가능하도록 한다. The contrast medium composition provided in the present invention can be applied to optical imaging or photoacoustic imaging, and when the contrast medium composition is used, early diagnosis of arthritis such as rheumatoid arthritis is possible.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 조영제의 구조를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 조영제의 구조를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 조영제의 제조 공정을 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 조영제의 제조 공정을 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 실시예 1에서 제조한 금 나노막대 조영제를 FESEM(Field Emission Scanning Electron Microscopy)로 관찰한 사진을 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 실험예 1에서, 본 발명의 실시예 1에서 제작된 금 나노막대 조영제에 대한 흡수 스펙트럼을 UV-Vis/NIR 분광계를 이용하여 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 실험예 3에서 실시예 1 및 비교예 1의 조영제 조성물의 류마티스 관절염 조직 조영 효과 평가를 위한 실험 계획도를 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명의 실험예 3에서 류마티스 관절염 마우스 모델에 실시예 1 및 비교예 1의 조영제 조성물을 투여한 뒤 류마티스 관절염 조직의 근적외선 흡수 영상을 촬영한 사진을 나타낸 것이다.
도 9는 본 발명의 실험예 4에서 본 발명의 실시예 1 및 2와, 비교예 1에 따른 조영제의 류마티스 관절염 조직 조영 효과 평가를 위한 실험 계획도를 나타낸 것이다.
도 10은 본 발명의 실험예 4에서 류마티스 관절염 마우스 모델에 실시예 1 및 비교예 1의 조영제 조성물을 투여한 뒤 류마티스 관절염 조직의 근적외선 흡수 영상을 촬영한 사진을 나타낸 것이다.
도 11은 본 발명의 실험예 4에서 류마티스 관절염 마우스 모델에 실시예 1 및 비교예 1의 조영제 조성물을 투여한 뒤 류마티스 관절염 조직의 근적외선 흡수 영상의 촬영 후 NIR 흡수 강도를 측정한 그래프를 나타낸 것이다.
도 12는 본 발명의 실험예 4에서 류마티스 관절염 마우스 모델에 실시예 2의 조영제 조성물을 투여한 뒤 류마티스 관절염 조직의 근적외선 흡수 영상을 촬영한 사진을 나타낸 것이다.
도 13은 본 발명의 실험예 4에서 류마티스 관절염 마우스 모델에 실시예 2의 조영제 조성물을 투여한 뒤 류마티스 관절염 조직의 근적외선 흡수 영상의 촬영 후 NIR 흡수 강도를 측정한 그래프를 나타낸 것이다.
도 14는 본 발명의 실험예 4에서 류마티스 관절염 마우스 모델에 실시예 1 및 2와, 비교예 1의 조영제 조성물을 투여한 뒤 류마티스 관절염 조직의 근적외선 흡수 영상의 촬영 후, 각 조영제 조성물에 있어 관절염 유발율에 따른 NIR 흡수 강도를 비교한 그래프를 나타낸 것이다.
도 15는 본 발명의 실험예 5에서 류마티스 관절염 마우스 모델에 실시예 1의 조영제 조성물을 투여한 뒤 광음향 영상을 촬영한 사진을 나타낸 것이다.
도 16은 본 발명의 실험예 6에서 류마티스 관절염 마우스 모델에 실시예 1의 조영제 조성물을 투여한 뒤 광음향 영상을 촬영한 사진을 나타낸 것이다.
도 17은 본 발명의 실험예 7에서 류마티스 관절염 마우스 모델에 실시예 1의 조영제 조성물을 투여하고 30분 경과 후 류마티스 관절염 조직의 광음향 영상을 촬영한 사진을 나타낸 것이다.
도 18은 본 발명의 실험예 7에서 류마티스 관절염 마우스 모델에 실시예 2의 조영제 조성물을 투여하고 30분 경과 후 류마티스 관절염 조직의 광음향 영상을 촬영한 사진을 나타낸 것이다.
도 19는 본 발명의 실험예 7에서 류마티스 관절염 마우스 모델에 실시예 1의 조영제 조성물을 투여하고 6시간 경과 후 류마티스 관절염 조직의 광음향 영상을 촬영한 사진을 나타낸 것이다.
도 20은 본 발명의 실험예 7에서 류마티스 관절염 마우스 모델에 실시예 2의 조영제 조성물을 투여하고 6시간 경과 후 류마티스 관절염 조직의 광음향 영상을 촬영한 사진을 나타낸 것이다.
도 21은 본 발명의 실험예 7에서 류마티스 관절염 마우스 모델에 실시예 1의 조영제 조성물을 투여하고 24시간 경과 후 류마티스 관절염 조직의 광음향 영상을 촬영한 사진을 나타낸 것이다.
도 22는 본 발명의 실험예 7에서 류마티스 관절염 마우스 모델에 실시예 2의 조영제 조성물을 투여하고 24시간 경과 후 류마티스 관절염 조직의 광음향 영상을 촬영한 사진을 나타낸 것이다.
도 23은 본 발명의 실험예 7에서 류마티스 관절염 마우스 모델에 실시예 1 및 2의 조영제 조성물을 투여하여 광음향 영상을 촬영한 뒤 각 조영제 조성물에 있어 관절염 유발율에 따른 평균 픽셀 강도를 비교한 그래프를 나타낸 것이다.
도 24는 본 발명의 실험예 8에서 류마티스 관절염 마우스 모델에 실시예 1의 조영제 조성물을 투여한 뒤 면역조직화학염색을 통해 염증성 사이토카인인 TNF-α와 VCAM-1의 발현을 확인한 사진을 나타낸 것이다.
도 25는 본 발명의 실험예 9에서 류마티스 관절염 마우스 모델에 실시예 1 및 비교예 1의 조영제 조성물을 투여한 뒤 관절염 중증도에 따른 혈청 내 염증성 사이토카인인 TNF-α의 발현을 ELISA 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 26은 본 발명의 실험예 10에서 류마티스 관절염 마우스 모델에 실시예 1 및 비교예 1의 조영제 조성물을 투여한 뒤 폐, 심장, 콩팥, 비장 및 간에 있어서 조직의 g 당 주입량의 퍼센티지를 측정한 그래프를 나타낸 것이다.
도 27은 본 발명의 실험예 10에서 류마티스 관절염 마우스 모델에 실시예 1 및 비교예 1의 조영제 조성물을 투여한 뒤 주요 장기를 헤마톡실린 & 에오신(H&E) 염색을 실시한 후 광학현미경으로 관찰한 사진을 나타낸 것이다.
도 28은 본 발명의 실험예 12에서 류마티스 관절염 마우스 모델에 실시예 1 및 비교예 1의 조영제 조성물을 투여한 뒤 마우스의 체중 변화를 측정한 그래프를 나타낸 것이다.1 shows the structure of a contrast agent according to an embodiment of the present invention.
2 shows the structure of a contrast agent according to an embodiment of the present invention.
3 illustrates a manufacturing process of a contrast agent according to an embodiment of the present invention.
4 illustrates a manufacturing process of a contrast medium according to an embodiment of the present invention.
5 shows a photograph of the gold nanorod contrast agent prepared in Example 1 of the present invention observed by FESEM (Field Emission Scanning Electron Microscopy).
6 shows the result of analyzing the absorption spectrum of the gold nanorod contrast agent prepared in Example 1 of the present invention in Experimental Example 1 of the present invention using a UV-Vis/NIR spectrometer.
7 shows an experimental plan for evaluating the contrast agent compositions of Example 1 and Comparative Example 1 in Experimental Example 3 of the present invention for the evaluation of rheumatoid arthritis tissue contrast effects.
FIG. 8 shows photographs of near-infrared absorption images of rheumatoid arthritis tissues after administering the contrast agent compositions of Example 1 and Comparative Example 1 to a rheumatoid arthritis mouse model in Experimental Example 3 of the present invention.
FIG. 9 shows an experimental plan for evaluating the contrast agent according to Examples 1 and 2 of the present invention and Comparative Example 1 in Experimental Example 4 of the present invention for evaluating the imaging effect of rheumatoid arthritis tissue.
10 shows a photograph of a near-infrared absorption image of a rheumatoid arthritis tissue after administering the contrast agent compositions of Example 1 and Comparative Example 1 to a rheumatoid arthritis mouse model in Experimental Example 4 of the present invention.
FIG. 11 is a graph showing NIR absorption intensity after administering the contrast agent compositions of Example 1 and Comparative Example 1 to a rheumatoid arthritis mouse model in Experimental Example 4 of the present invention and taking a near-infrared absorption image of rheumatoid arthritis tissue.
FIG. 12 shows a photograph of a near-infrared absorption image of a rheumatoid arthritis tissue after administration of the contrast medium composition of Example 2 to a rheumatoid arthritis mouse model in Experimental Example 4 of the present invention.
13 is a graph showing NIR absorption intensity measured after administration of the contrast agent composition of Example 2 to a rheumatoid arthritis mouse model in Experimental Example 4 of the present invention and after taking a near-infrared absorption image of rheumatoid arthritis tissue.
FIG. 14 shows the induction of arthritis in each contrast agent composition after taking a near-infrared absorption image of rheumatoid arthritis tissue after administering the contrast agent compositions of Examples 1 and 2 and Comparative Example 1 to a rheumatoid arthritis mouse model in Experimental Example 4 of the present invention. It shows a graph comparing the NIR absorption intensity according to the rate.
15 shows a photoacoustic image taken after administering the contrast medium composition of Example 1 to a rheumatoid arthritis mouse model in Experimental Example 5 of the present invention.
16 shows a photoacoustic image taken after administering the contrast agent composition of Example 1 to a rheumatoid arthritis mouse model in Experimental Example 6 of the present invention.
17 shows a photoacoustic image of a
18 shows a photoacoustic image of a
FIG. 19 shows a photoacoustic image of a
20 shows a photoacoustic image of a
21 shows a photoacoustic image of a
22 shows a photoacoustic image of a
23 is a graph comparing average pixel intensity according to the induction rate of arthritis in each contrast agent composition after photoacoustic images were taken by administering the contrast agent compositions of Examples 1 and 2 to a rheumatoid arthritis mouse model in Experimental Example 7 of the present invention; is shown.
24 shows a photograph confirming the expression of inflammatory cytokines TNF-α and VCAM-1 through immunohistochemical staining after administration of the contrast medium composition of Example 1 to a rheumatoid arthritis mouse model in Experimental Example 8 of the present invention. .
25 shows the result of ELISA analysis of the expression of the inflammatory cytokine TNF-α in serum according to the severity of arthritis after administration of the contrast agent compositions of Example 1 and Comparative Example 1 to a rheumatoid arthritis mouse model in Experimental Example 9 of the present invention. it is shown
26 is a graph showing the percentage of injection amount per g of tissue in lung, heart, kidney, spleen, and liver after administering the contrast agent compositions of Example 1 and Comparative Example 1 to a rheumatoid arthritis mouse model in Experimental Example 10 of the present invention; is shown.
27 is a photograph observed under an optical microscope after administration of the contrast agent compositions of Example 1 and Comparative Example 1 to a rheumatoid arthritis mouse model in Experimental Example 10 of the present invention, followed by hematoxylin & eosin (H&E) staining of major organs. is shown.
28 is a graph showing changes in body weight of mice after administering the contrast agent compositions of Example 1 and Comparative Example 1 to a rheumatoid arthritis mouse model in Experimental Example 12 of the present invention.
이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in detail by the following examples. However, the following examples are only to illustrate the present invention, and the content of the present invention is not limited by the following examples.
실시예Example
[준비예 1] 금 나노입자의 제조[Preparation Example 1] Preparation of gold nanoparticles
5 ml의 CTAB (0.2 M)에 5 ml의 HAuCl4 (1 μl)을 넣어준 후 차가운 60 μl NaBrH4을 넣어주고 2분 동안 교반하여 금 씨드(gold seed) 용액을 제조하였다. 금 씨드 용액을 실온에 3 시간 이상 보관한 후 사용하였다. 5 ml의 CTAB (0.2 M)에 30 μl의 AgNO3 (0.01M), 5 ml의 HAuCl4 (1 μl)를 넣어준 후 교반하였다. 반응 용액에 55 μl 아스코르브산(ascorbic acid) (0.1M)을 넣어주자 노란색의 반응 용액이 무색으로 변하였다. 반응 용액을 1시간 동안 교반 배양(shaking incubation) (150 rpm, 30 ℃) 한 뒤 앞서 제조한 12 μl의 금 씨드 용액을 가한 후, 24 시간 교반 배양 (150 rpm, 30 ℃)하여 금을 성장시켜 무색 용액이 적갈색(reddish-brown)으로 변화는 것을 관찰할 수 있었다. 이렇게 합성된 금 나노막대(gold nanorods; GNR) 반응 용액을 2번 원심 분리 (15,000 rpm, 30분)하여 과량의 CTAB을 제거한 후, 초순수(DI water)에 재분산시켰다.After adding 5 ml of HAuCl 4 (1 μl) to 5 ml of CTAB (0.2 M), cold 60 μl of NaBrH 4 was added and stirred for 2 minutes to prepare a gold seed solution. The gold seed solution was stored at room temperature for more than 3 hours before use. After adding 30 μl of AgNO 3 (0.01M) and 5 ml of HAuCl 4 (1 μl) to 5 ml of CTAB (0.2 M), the mixture was stirred. When 55 μl ascorbic acid (0.1M) was added to the reaction solution, the yellow reaction solution turned colorless. After shaking the reaction solution for 1 hour (shaking incubation) (150 rpm, 30 ℃), after adding 12 μl of the previously prepared gold seed solution, stirring culture (150 rpm, 30 ℃) for 24 hours to grow gold It was observed that the colorless solution turned reddish-brown. The gold nanorods (GNR) reaction solution thus synthesized was centrifuged twice (15,000 rpm, 30 minutes) to remove excess CTAB, and then redispersed in DI water.
[실시예 1] 류마티스 관절염 조기 진단용 표적성 항체 리간드(anti-TNF-α antibody)가 결합된 금 나노입자의 제조[Example 1] Preparation of gold nanoparticles conjugated with target antibody ligand (anti-TNF-α antibody) for early diagnosis of rheumatoid arthritis
도 3에 나타낸 방법으로 금 나노입자의 표면에 복수 개의 단백질 G를 위치시키고, 상기 단백질 G에 항체를 연결시키며, 상기 금 나노입자의 표면을 감싸도록 PEG가 코팅된 조영제를 제조하였다. 구체적으로, 상기 준비예 1에서 합성된 금 나노막대 수용액을 단백질 G 수용액과 12시간 동안, 4 ℃에서 반응시킨 후, 3번 원심 분리 (15,000 rpm, 10분)를 시행하여 미반응 단백질 G를 제거하였다. 이후, Remicade 수용액과 4 ℃에서 12시간 동안 반응시킨 후, 3번 원심 분리 (15,000 rpm, 10분)를 시행하여 미반응 Remicade를 제거하였다. 금 나노막대의 체내 안전성을 위하여 분자량 5,000의 HS-poly(ethylene glycol)-CH3 수용액과 실온에서 24시간 동안 반응시킨 후, 15,000 rpm 원심분리를 통하여 미반응한 PEG을 제거하고, 초순수(DI water)에 재 분산시켰다. 이렇게 수득된 금 나노막대를 FESEM(Field Emission Scanning Electron Microscopy)로 관찰한 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 금 나노막대의 직경 크기는 대략 30 nm인 것을 확인할 수 있었다. A contrast agent coated with PEG was prepared by placing a plurality of protein G on the surface of gold nanoparticles, linking antibodies to the protein G, and covering the surface of the gold nanoparticles by the method shown in FIG. 3 . Specifically, the gold nanorod aqueous solution synthesized in Preparation Example 1 was reacted with the protein G aqueous solution for 12 hours at 4 ° C, followed by centrifugation three times (15,000 rpm, 10 minutes) to remove unreacted protein G. did Thereafter, after reacting with the Remicade aqueous solution at 4 ° C. for 12 hours, centrifugation was performed three times (15,000 rpm, 10 minutes) to remove unreacted Remicade. For in vivo stability of gold nanorods, after reacting with 5,000 molecular weight HS-poly(ethylene glycol)-CH 3 aqueous solution at room temperature for 24 hours, unreacted PEG was removed by centrifugation at 15,000 rpm, and ultrapure water (DI water ) was redispersed. As a result of observing the obtained gold nanorods by FESEM (Field Emission Scanning Electron Microscopy), as shown in FIG. 5, it was confirmed that the gold nanorods had a diameter of about 30 nm.
[실시예 2] 류마티스 관절염 조기 진단용 표적성 항체 리간드(anti-IL-6 antibody)가 결합된 금 나노입자의 제조[Example 2] Preparation of gold nanoparticles conjugated with target antibody ligand (anti-IL-6 antibody) for early diagnosis of rheumatoid arthritis
도 3에 나타낸 방법으로 금 나노입자의 표면에 복수 개의 단백질 G를 위치시키고, 상기 단백질 G에 항체를 연결시키며, 상기 금 나노입자의 표면을 감싸도록 PEG가 코팅된 조영제를 제조하였다. 구체적으로, 상기 준비예 1에서 합성된 금 나노막대 수용액을 단백질 G 수용액과 12시간 동안, 4 ℃에서 반응시킨 후, 3번 원심 분리 (15,000 rpm, 10분)를 시행하여 미반응 단백질 G를 제거하였다. 이후, 토실리주맙(Tocilizumab) 수용액과 4 ℃에서 12시간 동안 반응시킨 후, 3번 원심 분리 (15,000 rpm, 10분)를 시행하여 미반응 토실리주맙을 제거하였다. 금 나노막대의 체내 안전성을 위하여 분자량 5,000의 HS-poly(ethylene glycol)-CH3 수용액과 실온에서 24시간 동안 반응시킨 후, 15,000 rpm 원심분리를 통하여 미반응한 PEG을 제거하고, 초순수(DI water)에 재 분산시켰다.A contrast agent coated with PEG was prepared by placing a plurality of protein G on the surface of gold nanoparticles, linking antibodies to the protein G, and covering the surface of the gold nanoparticles by the method shown in FIG. 3 . Specifically, the gold nanorod aqueous solution synthesized in Preparation Example 1 was reacted with the protein G aqueous solution for 12 hours at 4 ° C, followed by centrifugation three times (15,000 rpm, 10 minutes) to remove unreacted protein G. did Thereafter, after reacting with an aqueous solution of Tocilizumab at 4° C. for 12 hours, unreacted Tocilizumab was removed by centrifugation (15,000 rpm, 10 minutes) three times. For in vivo stability of gold nanorods, after reacting with 5,000 molecular weight HS-poly(ethylene glycol)-CH 3 aqueous solution at room temperature for 24 hours, unreacted PEG was removed by centrifugation at 15,000 rpm, and ultrapure water (DI water ) was redispersed.
[실시예 3] 류마티스 관절염 조기 진단용 표적성 단백질 리간드(RGD)가 결합된 금 나노입자의 제조[Example 3] Preparation of target protein ligand (RGD) bound gold nanoparticles for early diagnosis of rheumatoid arthritis
도 4에 나타낸 방법으로 RGD가 PEG를 통해 금 나노입자의 표면에 연결된 조영제를 제조하였다. 구체적으로, 상기 준비예 1에서 합성된 금 나노막대(50 mmol)의 금 박막 위에 기능성 PEG (HS-(CH2CH2)175-COOH, 10 mmol)와 24시간 동안 실온에서 교반시킨 후, 미반응 기능성 PEG는 10,000 rpm 원심분리를 통해 제거하였다. 그 후, 기능성 PEG와 동몰의 EDC(1-ethyl-3(3-dimethyl aminopropyl) carbodiimide, 10 mmol) 및 NHS(N-hydroxysuccinimide, 10 mmol)를 이용하여 기능성 PEG와 동몰의 RGD(서열번호 1의 펩타이드)(10 mmol)를 실온에서 24 시간 동안 교반 반응시켜 RGD가 PEG에 공유 결합된 금 나노막대를 제조하였다. 도면에 도시하지는 않았지만, 이렇게 하여 수득한 금 나노막대에서 말레이미드 (maleimide)의 1H-NMR 피크가 6.7 ppm에서 관찰되었는 바, RGD가 금 나노막대 위의 PEG와 공유 결합된 것임을 알 수 있었다.A contrast agent in which RGD was linked to the surface of gold nanoparticles through PEG was prepared by the method shown in FIG. 4 . Specifically, after stirring with functional PEG (HS-(CH 2 CH 2 ) 175 -COOH, 10 mmol) on the gold thin film of the gold nanorods (50 mmol) synthesized in Preparation Example 1 at room temperature for 24 hours, Reactive functional PEG was removed by centrifugation at 10,000 rpm. Then, functional PEG and equimolar RGD (SEQ ID NO: 1 peptide) (10 mmol) was stirred at room temperature for 24 hours to prepare gold nanorods in which RGD was covalently bonded to PEG. Although not shown in the figure, the 1 H-NMR peak of maleimide was observed at 6.7 ppm in the gold nanorods thus obtained, indicating that RGD was covalently bonded to PEG on the gold nanorods.
[비교예 1][Comparative Example 1]
본 발명의 금 나노입자 조영제의 효과를 비교하기 위하여, 금 나노입자의 표면에 PEG만 코팅된 조영제를 비교예 1로 제작하였다. 구체적으로는, 상기 준비예 1에서 합성된 금 나노막대(50 mmol)의 금 박막 위에 기능성 PEG (HS-(CH2CH2)175-COOH, 10 mmol)와 24시간 동안 실온에서 교반시킨 후, 미반응 기능성 PEG는 10,000 rpm 원심분리를 통해 제거하였다.In order to compare the effect of the gold nanoparticle contrast agent of the present invention, a contrast agent coated only with PEG on the surface of gold nanoparticles was prepared in Comparative Example 1. Specifically, after stirring with functional PEG (HS-(CH 2 CH 2 ) 175 -COOH, 10 mmol) on the gold thin film of the gold nanorods (50 mmol) synthesized in Preparation Example 1 at room temperature for 24 hours, Unreacted functional PEG was removed by centrifugation at 10,000 rpm.
[실험예 1] 본 발명에 따른 조영제의 흡수 스펙트럼 분석[Experimental Example 1] Absorption spectrum analysis of the contrast agent according to the present invention
상기 실시예 1에서 제작된 금 나노막대 조영제에 대한 흡수 스펙트럼을 UV-Vis/NIR 분광계를 이용하여 분석하여 그 결과를 도 6에 나타내었다. The absorption spectrum of the gold nanorod contrast agent prepared in Example 1 was analyzed using a UV-Vis/NIR spectrometer, and the results are shown in FIG. 6 .
그 결과, 도 6에서 보는 바와 같이 본 발명의 실시예 1 및 2의 금 나노입자의 흡수 피크는 NIR 영역에 위치하며, 대략 800 nm인 것을 확인할 수 있었다.As a result, as shown in FIG. 6, it was confirmed that the absorption peak of the gold nanoparticles of Examples 1 and 2 of the present invention was located in the NIR region and was approximately 800 nm.
[실험예 2] 본 발명에 따른 조영제의 흡수 스펙트럼 분석[Experimental Example 2] Absorption spectrum analysis of the contrast agent according to the present invention
상기 준비예 1, 실시예 1 내지 3, 그리고 비교예 1에서 제작된 금 나노막대 조영제에 대하여 동적광산란(Dynamic Light Scattering)(DLS, Zetasizer Nano ZS, Malvem Instruments Lt)을 통해 제타-전위(Zeta-potential)를 측정하였다. 또한, 실시예 3에서 제작된 금 나노막대를 증류수에 용해시킨 뒤 고압 액체 크로마토그래피(high-pressure liquid chromatography; HPLC)를 이용하여 상기 금 나노막대에 포함된 RGD 함량을 평가하였다. Bio-Rad 단백질 어쎄이 시약(Bio-Rad laboratories, Inc.)을 이용하여 Bradford 방법에 의해 실시예 1 및 2에서 제작된 금 나노막대에 포함된 항-TNF-α 항체(Remicade) 및 항-IL-6 항체(Tocilizumab)의 함량을 평가하였다. 단, 소 혈청 알부민을 표준 시료로 사용하였다. 각 결과는 하기 표 1에 나타내었다. For the gold nanorod contrast agents prepared in Preparation Example 1, Examples 1 to 3, and Comparative Example 1, dynamic light scattering (DLS, Zetasizer Nano ZS, Malvem Instruments Lt) potential) was measured. In addition, after dissolving the gold nanorods prepared in Example 3 in distilled water, the RGD content contained in the gold nanorods was evaluated using high-pressure liquid chromatography (HPLC). Anti-TNF-α antibody (Remicade) and anti-IL- The content of 6 antibodies (Tocilizumab) was evaluated. However, bovine serum albumin was used as a standard sample. Each result is shown in Table 1 below.
(mV) zeta-potential
(mV)
[실험예 3] 본 발명에 따른 조영제의 류마티스 관절염 조직 조영 효과 평가(1)[Experimental Example 3] Evaluation of contrast agent according to the present invention for contrasting rheumatoid arthritis tissue (1)
도 7은 본 발명에 따른 조영제의 류마티스 관절염 조직 조영 효과 평가를 위한 실험 계획도를 나타낸 것으로, 2차 면역을 통해 류마티스 관절염 동물 모델을 제작한 뒤, 본 발명에 따른 조영제를 투여한 후 류마티스 관절염 조직 조영 효과를 평가하였다. 구체적 실험 방법은 다음과 같다: Figure 7 shows an experimental plan for evaluating the contrast agent according to the present invention for contrasting rheumatoid arthritis tissues. After making a rheumatoid arthritis animal model through secondary immunization and administering the contrast agent according to the present invention, rheumatoid arthritis tissue The contrast effect was evaluated. The specific test method is as follows:
1. 류마티스 관절염 마우스 모델의 준비1. Preparation of the Rheumatoid Arthritis Mouse Model
자가면역질환 중 하나인 류마티스 관절염 동물 모델은 DBA1/J 마우스에 Type II 콜라겐에 0.01 mol/L의 아세트산과 완전 프로인트 항원 보강제(complete Freund's adjuvant)를 혼합한 후 100 ㎍을 마우스 꼬리 근육에 피하 주사하고 14일 후 동량을 주입하여 관절염을 유도하였다. 류마티스 관절염 마우스의 증상으로는 붉어짐, 부풀기 등이 있는데, 관절염 징후를 Mann-Chitney U test의 기준에 따라 발병율(incidence, %)을 결정하고, 각 마우스의 네 발을 육안으로 관찰하여 부풀어 오른 정도를 하기 표 2의 기준에 따라 류마티스 관절염 유발 정도(arthritic score)를 부여하였다. 동물 당 부여된 스코어(score)의 최소값은 0이고, 최대값은 16이 되도록 하였다.As an animal model for rheumatoid arthritis, one of the autoimmune diseases, type II collagen was mixed with 0.01 mol/L of acetic acid and complete Freund's adjuvant in DBA1/J mice, and then 100 μg was subcutaneously injected into the mouse tail muscle. After 14 days, the same amount was injected to induce arthritis. Symptoms of rheumatoid arthritis mice include redness and swelling. The incidence (%) of arthritis signs was determined according to the criteria of the Mann-Chitney U test, and the degree of swelling was determined by visually observing the four feet of each mouse. was assigned an arthritic score according to the criteria in Table 2 below. The minimum value of the score given per animal was 0, and the maximum value was 16.
2. 본 발명에 따른 조영제의 류마티스 관절염 조직의 광학적 영상 효과 평가상기 실시예 1 및 비교예 1에서 제조한 금 나노입자 200 ㎍을 식염수에 분산시켜 얻어진 금 나노입자 용액 100 ㎕을 상기 1.의 류마티스 관절염 마우스에 정맥 주사 후, 24시간 후에 류마티스 관절염 조직의 근적외선 흡수 영상(GE Health Care, eXplore Optix, Pre-clinical Optical Imaging System)을 얻었고 그 결과는 도 8에 나타내었다. 2. Evaluation of the optical imaging effect of the contrast agent according to the present invention on rheumatoid arthritis tissue After intravenous injection into arthritic mice, 24 hours later, near-infrared absorption images (GE Health Care, eXplore Optix, Pre-clinical Optical Imaging System) of rheumatoid arthritis tissues were obtained, and the results are shown in FIG. 8 .
도 8에서 염증이 일어나지 않은, 즉 류마티스 관절염이 발현되지 않은 음성 대조군 그룹에서는 금 나노입자의 흡수가 거의 일어나지 않아 붉은색과 노란색 계통의 흡수 강도를 보여주었다. 하지만 염증이 일어난 류마티스 관절염이 발현된 그룹에는 금 나노입자의 흡수가 증가하여 파란색과 보라색으로 변하는 것을 확인할 수 있었다. 특히 조영제로 비교예 1의 조영제에 비하여 실시예 1의 조영제를 사용한 경우, 스코어 0의 류마티스 관절염 초기 단계에서도 파란색과 보라색으로 변하여 조기 진단이 가능한 것을 확인할 수 있었다. In FIG. 8 , in the negative control group in which inflammation did not occur, ie, rheumatoid arthritis was not expressed, almost no gold nanoparticles were absorbed, showing absorption intensities of red and yellow colors. However, it was confirmed that in the group where the inflamed rheumatoid arthritis was expressed, the absorption of gold nanoparticles increased and the color changed to blue and purple. In particular, when the contrast medium of Example 1 was used as the contrast medium compared to the contrast medium of Comparative Example 1, even in the early stage of rheumatoid arthritis with a score of 0, the color changed to blue and purple, confirming that early diagnosis was possible.
[실험예 4] 본 발명에 따른 조영제의 류마티스 관절염 조직 조영 효과 평가(2)[Experimental Example 4] Evaluation of the contrast agent according to the present invention for contrasting rheumatoid arthritis tissue (2)
도 9는 본 발명에 따른 조영제의 류마티스 관절염 조직 조영 효과 평가를 위한 실험 계획도를 나타낸 것으로, 2차 면역을 통해 다양한 정도의 류마티스 관절염 동물 모델을 제작한 뒤, 본 발명에 따른 조영제를 투여한 후 류마티스 관절염 조직 조영 효과를 평가하였다. 구체적 실험 방법은 다음과 같다: Figure 9 shows an experimental plan for evaluating the contrast agent according to the present invention to contrast tissue with rheumatoid arthritis. After making rheumatoid arthritis animal models of various degrees through secondary immunization and administering the contrast agent according to the present invention, The effect of contrasting rheumatoid arthritis tissue was evaluated. The specific test method is as follows:
1. 류마티스 관절염 마우스 모델의 준비1. Preparation of the Rheumatoid Arthritis Mouse Model
상기 실험예 3의 1.과 동일한 방법으로 스코어 0 부터 4까지 다양한 정도의 류마티스 관절염 마우스 모델을 준비하였다. Rheumatoid arthritis mouse models with scores ranging from 0 to 4 were prepared in the same manner as in 1 of Experimental Example 3.
2. 류마티스 관절염 정도에 본 발명의 조영제의 조영 효과 평가2. Evaluation of the contrast effect of the contrast medium of the present invention on the degree of rheumatoid arthritis
실시예 1 및 2, 및 비교예 1에서 제조한 금 나노입자 200 ㎍이 식염수에 분산된 금 나노입자 용액 100 ㎕을 준비하였다. 상기 1.에서 준비한 5 단계의 류마티스 관절염 마우스 모델에 상기 금 나노입자 용액 100 ㎕을 정맥 주사한 후, 24시간 후에 류마티스 관절염 조직의 근적외선 흡수 영상을 얻었다. 실시예 1 및 비교예 1의 조영제를 사용하여 얻은 영상 사진은 도 10에 나타내었고, 류마티스 관절염의 정도(스코어) 별 실시예 1 및 비교예 1의 조영제에 따른 NIR 흡수 강도를 측정하여 그 결과는 도 11에 나타내었다. 또한, 실시예 2의 조영제를 사용하여 얻은 영상 사진은 도 12에, 류마티스 관절염의 정도에 따른 NIR 흡수 강도를 측정한 그래프는 도 13에 나타내었다. 한편, 실시예 1 및 2와, 비교예 1의 조영제 별 류마티스 관절염의 정도에 따른 NIR 흡수 강도를 비교한 그래프를 도 14에 나타내었다. 100 μl of a gold nanoparticle solution in which 200 μg of the gold nanoparticles prepared in Examples 1 and 2 and Comparative Example 1 were dispersed in saline was prepared. 100 μl of the gold nanoparticle solution was intravenously injected into the rheumatoid arthritis mouse model prepared in
도 10 내지 14에서 보는 바와 같이, 류마티스 관절염의 스코어가 증가함에 따라 금 나노입자의 흡수가 증가하여 붉은색과 노란색 계통의 흡수 강도가 파란색과 보라색의 강한 흡수 강도로 변함을 확인할 수 있었다. 특히 조영제로 비교예 1의 조영제를 사용한 경우 스코어 2 이상의 경우에서도 여전히 붉은색과 노란색 계통의 흡수 강도를 보이는 반면, 실시예 1 또는 2의 조영제를 사용한 경우, 동일한 정도의 류마티스 관절염에서 흡수 강도가 파란색과 보라색으로 변한 것을 볼 수 있고, 특히 스코어 0 내지 1 정도에서도 류마티스 관절염의 조기 진단이 가능한 것을 확인할 수 있었다. 또한, 실시예 1의 조영제를 사용한 경우가 가장 효과적으로 조기 진단이 가능함을 알 수 있었는데, 이는 조기 류마티스 관절염에 타겟팅하는 항체가 폴리에틸렌글리콜에 결합하는 것보다 단백질 G(protein G)에 더 효과적으로 결합한 결과에 기인한 것임을 알 수 있다.As shown in FIGS. 10 to 14, it was confirmed that the absorption of gold nanoparticles increased as the rheumatoid arthritis score increased, and the absorption intensity of red and yellow colors changed to strong absorption intensities of blue and purple colors. In particular, when the contrast medium of Comparative Example 1 was used as a contrast medium, the absorption intensity of red and yellow systems was still shown even when the score was 2 or higher, whereas when the contrast medium of Example 1 or 2 was used, the same level of absorption intensity was observed in rheumatoid arthritis. It can be seen that the color changed to purple, and in particular, it was confirmed that early diagnosis of rheumatoid arthritis is possible even with a score of 0 to 1. In addition, it was found that early diagnosis was possible most effectively when the contrast medium of Example 1 was used. It can be seen that it is caused by
[실험예 5] 본 발명에 따른 조영제를 이용한 류마티스 관절염 조직의 광음향 영상(1)[Experimental Example 5] Photoacoustic image of rheumatoid arthritis tissue using the contrast agent according to the present invention (1)
상기 실험예 3의 1.과 동일한 방법으로 스코어 5의 류마티스 관절염 마우스 모델을 준비한 뒤, 실시예 1에서 제조한 금 나노입자 100 ㎍이 식염수에 분산된 금 나노입자 용액 100 ㎕을 정맥 주사한 후, 24시간 경과한 뒤에 류마티스 관절염 조직의 광음향 영상을 촬영하여 그 결과를 도 15에 나타내었다. A rheumatoid arthritis mouse model with a score of 5 was prepared in the same manner as 1 of Experimental Example 3, and then 100 μl of a gold nanoparticle solution in which 100 μg of gold nanoparticles prepared in Example 1 was dispersed in saline was injected intravenously, After 24 hours, photoacoustic images were taken of the rheumatoid arthritis tissue, and the results are shown in FIG. 15 .
도 15에서 보는 바와 같이, 류마티스 관절염 유발하지 않은 음성 대조군과 비교하여 류마티스 관절염 유도 모델에서는 붉은색과 노란색 계통의 흡수 강도가 증가하여 상기 실시예 1의 조영제가 류마티스 염증 부위에 많이 존재함을 확인할 수 있었다.As shown in FIG. 15, compared to the negative control group that did not induce rheumatoid arthritis, in the rheumatoid arthritis induced model, the absorption intensity of the red and yellow systems increased, confirming that the contrast agent of Example 1 was present in a large amount in the rheumatoid inflammatory region. there was.
[실험예 6] 본 발명에 따른 조영제를 이용한 류마티스 관절염 조직의 광음향 영상(2)[Experimental Example 6] Photoacoustic image (2) of rheumatoid arthritis tissue using the contrast agent according to the present invention
상기 실험예 3의 1.과 동일한 방법으로 스코어 1 및 2의 류마티스 관절염 마우스 모델을 준비한 뒤, 실시예 1에서 제조한 금 나노입자 100 ㎍이 식염수에 분산된 금 나노입자 용액 100 ㎕을 정맥 주사한 후, 24시간 경과한 뒤에 류마티스 관절염 조직의 광음향 영상을 촬영하여 그 결과를 도 16에 나타내었다. After preparing rheumatoid arthritis mouse models with scores of 1 and 2 in the same manner as in 1 of Experimental Example 3, 100 μl of a gold nanoparticle solution in which 100 μg of gold nanoparticles prepared in Example 1 was dispersed in saline was intravenously injected. After 24 hours, photoacoustic images were taken of the rheumatoid arthritis tissue, and the results are shown in FIG. 16 .
도 16에서 보는 바와 같이, 류마티스 관절염 부위에서 상기 실시예 1의 조영제가 많이 존재하여 붉은색과 노란색 계통의 흡수 강도가 증가하였고, 관절염 정도가 심할수록, 즉 스코어가 높을수록 상기 실시예 1의 조영제가 더욱 많이 존재하여 더욱 붉은색과 노란색 계통의 흡수 강도가 증가하는 것을 확인할 수 있었다.As shown in FIG. 16, a large amount of the contrast medium of Example 1 was present at the site of rheumatoid arthritis, and the absorption intensity of the red and yellow systems increased. It was confirmed that the absorption intensity of the red and yellow systems increased more as more were present.
[실험예 7] 본 발명에 따른 조영제를 이용한 류마티스 관절염 조직의 광음향 영상(3)[Experimental Example 7] Photoacoustic image (3) of rheumatoid arthritis tissue using the contrast agent according to the present invention
상기 실험예 3의 1.과 동일한 방법으로 각 발의 관절염 중증도 스코어가 0, 1 및 2에 해당하는 류마티스 관절염 마우스 모델을 준비한 뒤, 실시예 1 및 2에서 제조한 금 나노입자 100 ㎍이 식염수에 분산된 금 나노입자 용액 100 ㎕을 정맥 주사한 후, 0.5, 6, 24시간 경과한 뒤에 류마티스 관절염 조직의 광음향 영상을 촬영하여 염증 비표적성 및 표적성 항체에 따른 영상 정량 결과를 도 17에 나타내었다. 촬영 조건으로는 680nm, 730nm, 760nm, 800nm, 850nm, 900nm의 6가지 파장으로 촬영을 하였고 파장당 10 프레임을 촬영하여 그 결과는 도 17 내지 22에 나타내었다. 또한, 광음향 영상을 얻은 뒤 동일한 면적의 ROI를 설정하여 정량값을 분석하였으며 정량값들의 평균을 도 23에 나타내었다.Rheumatoid arthritis mouse models having arthritis severity scores of 0, 1, and 2 in each foot were prepared in the same manner as in 1 of Experimental Example 3, and then 100 μg of the gold nanoparticles prepared in Examples 1 and 2 were dispersed in saline After intravenous injection of 100 μl of the gold nanoparticle solution, 0.5, 6, and 24 hours later, photoacoustic images were taken of rheumatoid arthritis tissues, and the results of image quantification according to inflammation non-targeting and targeting antibodies are shown in FIG. 17 . As the shooting conditions, shooting was performed at six wavelengths of 680 nm, 730 nm, 760 nm, 800 nm, 850 nm, and 900 nm, and 10 frames were shot per wavelength, and the results are shown in FIGS. 17 to 22. In addition, after obtaining an optoacoustic image, an ROI of the same area was set to analyze quantitative values, and the average of the quantitative values is shown in FIG. 23 .
그 결과, 도 17 내지 23에서 보는 바와 같이 관절염 중증도가 증가할수록, 음성 대조군에 비하여 실시예 1 및 2의 금 나노입자를 주입한 경우 광음향 이미징 정량값이 모두 증가하였다. 또한, 실시예 1 및 2의 금 나노입자 모두, 특히는 항-IL-6 항체가 결합된 실시예 2의 금 나노입자를 주입하는 경우 스코어 0 수준의 초기 류마티스 관절염 또한 진단이 가능한 것을 확인할 수 있었고, 금 나노입자의 주입 후 30분 안에도 진단이 가능한 것을 확인할 수 있었다. As a result, as shown in FIGS. 17 to 23, as the severity of arthritis increased, all the photoacoustic imaging quantitative values increased when the gold nanoparticles of Examples 1 and 2 were injected compared to the negative control group. In addition, when injecting both the gold nanoparticles of Examples 1 and 2, especially the gold nanoparticles of Example 2 to which the anti-IL-6 antibody was coupled, it was confirmed that early rheumatoid arthritis with a score of 0 could also be diagnosed. , it was confirmed that diagnosis was possible even within 30 minutes after injection of gold nanoparticles.
[실험예 8] 본 발명에 따른 조영제를 이용한 류마티스 관절염 조직 내 염증성 사이토카인의 발현 확인[Experimental Example 8] Confirmation of expression of inflammatory cytokines in rheumatoid arthritis tissue using the contrast agent according to the present invention
상기 실험예 3의 1.과 동일한 방법으로 스코어 0 내지 4의 류마티스 관절염 마우스 모델을 준비한 뒤, 실시예 1에서 제조한 금 나노입자 200 ㎍이 식염수에 분산된 금 나노입자 용액 100 ㎕을 정맥 주사한 후, 관절염 중증도에 따른 염증성 사이토카인인 TNF-α와 VCAM-1의 발현을 확인하였다. 이를 위해 동물의 관절 조직을 포르말린으로 고정한 후, 4%의 포름산(formic acid)에서 탈석회화 과정을 거쳐 파라핀에 고정하였다. 조직을 4 ㎛ 절편한 후, 면역조직화학염색을 시행하여 그 결과를 도 24의 (a)에 나타내었고, 비교를 위해 조영제를 사용하지 않은 결과를 (b)에 나타내었다. A rheumatoid arthritis mouse model having a score of 0 to 4 was prepared in the same manner as 1 of Experimental Example 3, and then 100 μl of a gold nanoparticle solution in which 200 μg of gold nanoparticles prepared in Example 1 was dispersed in saline was intravenously injected. Afterwards, the expression of TNF-α and VCAM-1, which are inflammatory cytokines according to the severity of arthritis, was confirmed. To this end, the joint tissue of the animal was fixed in formalin, and then fixed in paraffin through a decalcification process in 4% formic acid. After the tissue was sectioned at 4 μm, immunohistochemical staining was performed, and the results are shown in FIG. 24 (a). For comparison, the results without using a contrast agent are shown in (b).
도 24에서 보는 바와 같이, 류마티스 관절염의 중증도가 증가할수록 염증이 일어난 관절 부위에서 TNF-α와 VCAM-1의 발현이 모두 증가하였으며, 특히 실시예 1의 조영제가 주입된 모든 관절염 마우스의 관절에서 같은 결과를 확인하였다.As shown in FIG. 24, as the severity of rheumatoid arthritis increased, the expression of both TNF-α and VCAM-1 increased in the inflamed joint area. The results were confirmed.
[실험예 9] 본 발명에 따른 조영제를 이용한 류마티스 관절염 마우스의 혈청 내 염증성 사이토카인의 발현 확인[Experimental Example 9] Expression of inflammatory cytokines in the serum of rheumatoid arthritis mice using the contrast agent according to the present invention
상기 실험예 3의 1.과 동일한 방법으로 스코어 0 내지 4의 류마티스 관절염 마우스 모델을 준비한 뒤, 실시예 1 및 비교예 1에서 제조한 금 나노입자 200 ㎍이 식염수에 분산된 금 나노입자 용액 100 ㎕을 정맥 주사한 후, 관절염 중증도에 따른 혈청 내 염증성 사이토카인인 TNF-α의 발현을 ELISA 통해 분석하여 그 결과를 도 25에 나타내었다. A rheumatoid arthritis mouse model having a score of 0 to 4 was prepared in the same manner as 1 of Experimental Example 3, and then 100 μl of a gold nanoparticle solution in which 200 μg of gold nanoparticles prepared in Example 1 and Comparative Example 1 were dispersed in saline After intravenous injection, the expression of the inflammatory cytokine TNF-α in serum according to the severity of arthritis was analyzed by ELISA, and the results are shown in FIG. 25 .
도 25에서 보는 바와 같이, 육안으로는 염증이 관찰되지 않는 관절염 스코어가 0일 때, 류마티스 관절염 마우스의 혈청 내에서 TNF-α의 발현이 가장 높았으며, 관절염의 스코어가 증가할수록 혈청 내 TNF-α의 발현은 감소하였는데, 비교예 1의 조영제에 비하여 실시예 1의 조영제를 사용한 경우 모든 스코어에서 혈청 내 TNF-α의 발현 수준이 더욱 낮은 것을 확인할 수 있었다. As shown in FIG. 25, when the arthritis score was 0, in which no inflammation was observed with the naked eye, the expression of TNF-α was highest in the serum of rheumatoid arthritis mice, and as the arthritis score increased, TNF-α in the serum increased. The expression of was decreased, and when the contrast agent of Example 1 was used compared to the contrast agent of Comparative Example 1, it was confirmed that the expression level of TNF-α in serum was lower in all scores.
[실험예 10] 본 발명에 따른 조영제의 조직 독성 평가[Experimental Example 10] Evaluation of tissue toxicity of the contrast agent according to the present invention
조영제의 반복 투여에 따른 독성을 평가하기 위하여, 상기 실험예 3의 1.과 동일한 방법으로 스코어 4의 류마티스 관절염 마우스 모델을 준비한 뒤, 실시예 1 및 비교예 1에서 제조한 금 나노입자를 4 mg/ml 농도로 100 ㎕씩 7회 투여한 후, 1일 경과한 뒤 모든 실험 동물의 유안부검 소견을 관찰 기록하고, 주요 장기로 폐, 심장, 콩팥, 비장 및 간에 있어서 조직의 g 당 주입량의 퍼센티지를 측정하여 그 결과를 도 26에 나타내었고, 각 조직 별 절대 중량을 측정하여 그 결과는 하기 표 3에 나타내었다. 단, 하기 표 3에서 각 값은 평균±표준 편차로 나타내었다. 또한, 주요 장기의 일부 조직을 10% 중성 포르말린에 18시간 이상 고정시킨 다음, 탈수를 거쳐 파라핀 포매 후 4 ㎛의 절편을 제작하고, 헤마톡실린 & 에오신(hematoxylin & eosin, H&E) 염색을 실시한 뒤, 광학현미경으로 관찰한 결과를 도 27에 나타내었다.In order to evaluate the toxicity of repeated administration of the contrast medium, a rheumatoid arthritis mouse model with a score of 4 was prepared in the same manner as in Experimental Example 3 1, and then 4 mg of the gold nanoparticles prepared in Example 1 and Comparative Example 1 were prepared. After administering 7 times at a concentration of 100 μl / ml, observe and record the findings of eye autopsy of all experimental animals after 1 day, and percentage of injection amount per g of tissue in lung, heart, kidney, spleen and liver as major organs was measured and the results are shown in FIG. 26, and the absolute weight of each tissue was measured and the results are shown in Table 3 below. However, in Table 3 below, each value is expressed as an average ± standard deviation. In addition, some tissues of major organs were fixed in 10% neutral formalin for more than 18 hours, dehydrated, paraffin-embedded, and 4 μm sections were made, and hematoxylin & eosin (H&E) staining was performed. , The results of observation with an optical microscope are shown in FIG. 27 .
도 26 및 표 3에서 보는 바와 같이, 정상 마우스에 비하여 류마티스 관절염 마우스 모델에서 조직 내 조영제의 축적량 및 조직의 절대량의 증가가 관찰되었으나, 비교예 1의 조영제 대비 실시예 1의 조영제에서 유의적 증가는 관찰되지 않았으며, 그로 인해 독성이 유발되는 것 또한 확인하지 못하였다. As shown in FIG. 26 and Table 3, in the rheumatoid arthritis mouse model compared to normal mice, an increase in the amount of accumulation of contrast agent in the tissue and the absolute amount of tissue was observed, but a significant increase in the contrast agent of Example 1 compared to the contrast agent of Comparative Example 1 It was not observed, and it was not confirmed that toxicity was caused by it.
도 27에서 보는 바와 같이, 정상 마우스 대조군을 포함한 모든 실험군에 걸쳐 금 나노입자의 조영제 투여와 관련된 조직병리학적 변화가 관찰되지 않았다.As shown in FIG. 27, no histopathological changes related to the administration of gold nanoparticles as a contrast agent were observed in all experimental groups including the control group of normal mice.
[실험예 11] 본 발명에 따른 조영제의 혈액 독성 평가[Experimental Example 11] Evaluation of blood toxicity of the contrast agent according to the present invention
상기 실험예 10에서 실험이 종료된 후, 마우스를 CO2 마취 하에 경추탈골법으로 희생시키고 개복하여 혈액을 대퇴대정맥으로부터 23 G의 주사기를 이용하여 채취하였다. 채취한 혈액을 3000 rpm에서 10분 동안 원심 분리하여 혈청을 분리한 뒤, 금 나노입자를 주입한 정상 마우스와 류마티스 관절염 마우스 모델에서 적혈구, 백혈구, 헤모글로빈, 적혈구 용적, 평균 적혈구 용적, 평균 혈구 헤모글로빈, 평균 혈구 헤모글로빈 농도를 측정하여 그 결과를 하기 표 4에 나타내었다. 단, 하기 표 4에서 각 값은 평균±표준 편차로 나타내었다. After the experiment was completed in Experimental Example 10, the mouse was sacrificed by cervical dislocation under CO 2 anesthesia, and blood was collected from the femoral vein using a 23 G syringe by laparotomy. The collected blood was centrifuged at 3000 rpm for 10 minutes to separate the serum, and then the red blood cells, white blood cells, hemoglobin, hematocrit, mean hematocrit, mean hemoglobin, Average blood hemoglobin concentration was measured and the results are shown in Table 4 below. However, in Table 4 below, each value is expressed as an average ± standard deviation.
표 4에서 보는 바와 같이, 실시예 1의 금 나노로드 조영제를 주입한 정상 마우스와 류마티스 관절염 마우스 모델 모두에서 적혈구, 백혈구, 헤모글로빈, 적혈구 용적, 평균 적혈구 용적, 평균 혈구 헤모글로빈, 평균 혈구 헤모글로빈 농도는 유의한 차이가 없었다. As shown in Table 4, in both normal mice and rheumatoid arthritis mouse models injected with the gold nanorod contrast agent of Example 1, red blood cells, white blood cells, hemoglobin, red blood cell volume, mean red blood cell volume, mean blood cell hemoglobin, and mean blood hemoglobin concentration were significant. There was no difference.
(K/μl)WBC
(K/μl)
(±1.58)6.13
(±1.58)
(±0.95)4.51
(±0.95)
(±2.72)5.48
(±2.72)
(±0.55)5.71
(±0.55)
(±0.81)3.41
(±0.81)
(±0.44)12.28
(±0.44)
(±2.82)11.81
(±2.82)
(±0.53)12.52
(±0.53)
(±0.62)11.04
(±0.62)
(±0.55)13.14
(±0.55)
(±3.15)13.25
(±3.15)
(±0.58)13.23
(±0.58)
(±0.89)14.68
(±0.89)
(±82.86)1144.00
(±82.86)
(±228.5)480.50
(±228.5)
(±70.00)1014.00
(±70.00)
(±72.65)1107.4
(±72.65)
(±2.80)52.70
(±2.80)
(±11.15)49.05
(±11.15)
(±1.78)47.17
(±1.78)
(±2.15)44.78
(±2.15)
(±0.20)41.70
(±0.20)
(±0.50)41.70
(±0.50)
(±0.31)37.67
(±0.31)
(±0.41)40.57
(±0.41)
(±0.16)10.73
(±0.16)
(±0.00)11.20
(±0.00)
(±0.04)10.57
(±0.04)
(±0.13)13.30
(±0.13)
(±0.39)27.83
(±0.39)
(±0.30)26.90
(±0.30)
(±0.24)28.03
(±0.24)
(±0.46)32.77
(±0.46)
평균 적혈구 용적; MCH: 평균 적혈구 혈색소량; MCHC: 평균 적혈구 혈색소 농도WBC: white blood cells; RBC: red blood cells; Hb: hemoglobin; PLT: platelets; HCT: Hematocrit; MCV:
mean hematocrit; MCH: mean red blood cell hemoglobin; MCHC: mean red blood cell hemoglobin concentration
[실험예 12] 본 발명에 따른 조영제에 의한 체중 변화 평가[Experimental Example 12] Evaluation of weight change by contrast medium according to the present invention
상기 실험예 10과 동일한 방법으로 스코어 5의 류마티스 관절염 마우스 모델을 준비한 뒤, 실시예 1 및 비교예 1에서 제조한 금 나노막대를 4 mg/ml 농도로 100 ㎕씩 매일 7회 투여한 후, 마우스의 체중 변화를 측정하여 그 결과를 도 28에 나타내었다. A rheumatoid arthritis mouse model with a score of 5 was prepared in the same manner as in Experimental Example 10, and the gold nanorods prepared in Example 1 and Comparative Example 1 were administered at a concentration of 4 mg/ml in 100 μL 7 times a day. The change in body weight was measured and the results are shown in FIG. 28 .
도 28에서 보는 바와 같이, 실시예 1의 조영제를 투여한 정상 마우스와 류마티스 관절염 마우스에서 유의한 체중 변화는 관찰되지 않았다. As shown in FIG. 28, no significant change in body weight was observed in normal mice and rheumatoid arthritis mice to which the contrast medium of Example 1 was administered.
10: 금 나노입자
20: 폴리에틸렌글리콜
30: 단백질 G
40: 항체
50: 펩티드10: gold nanoparticles
20: polyethylene glycol
30: protein G
40: antibody
50: peptide
<110> Industry-Academic Cooperation Foundation, Yonsei University <120> Contrast agent for optical imaging for early diagnosing rheumatoid arthritis <130> PDPB192194k01 <150> KR 10-2019-0146814 <151> 2019-11-15 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RGD sequence <400> 1 Arg Gly Asp 1 <110> Industry-Academic Cooperation Foundation, Yonsei University <120> Contrast agent for optical imaging for early diagnosis rheumatoid arthritis <130> PDPB192194k01 <150> KR 10-2019-0146814 <151> 2019-11-15 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 3 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> RGD sequence <400> 1 Arg Gly Asp One
Claims (21)
상기 금 나노입자 상에 위치하는 복수 개의 단백질 G(protein G) 및 상기 단백질 G에 연결된 항체를 더 포함하는 관절염 진단용 조영제 조성물로서,
상기 항체는 인터루킨-6(interleukin 6; IL-6)에 특이적으로 결합하는 항체인 것인, 관절염 진단용 조영제 조성물.
gold nanoparticles; and a polyethylene glycol (PEG) coating layer formed to cover the surface of the gold nanoparticles,
A contrast agent composition for diagnosing arthritis further comprising a plurality of protein Gs located on the gold nanoparticles and an antibody linked to the protein G,
Wherein the antibody is an antibody that specifically binds to interleukin 6 (IL-6), a contrast agent composition for diagnosing arthritis.
상기 금 나노입자는 구형(nanosphere), 쉘 형태(nanoshell), 또는 막대형(nanorod)인, 관절염 진단용 조영제 조성물.According to claim 1,
The gold nanoparticles are spherical (nanosphere), shell (nanoshell), or rod-shaped (nanorod), the contrast agent composition for diagnosing arthritis.
상기 금 나노입자의 직경은 3 nm 내지 50 nm인, 관절염 진단용 조영제 조성물.According to claim 1,
The gold nanoparticles have a diameter of 3 nm to 50 nm, a contrast agent composition for diagnosing arthritis.
상기 관절염은 류마티스 관절염, 미분화성 관절염, 소아기 특발성 관절염, 척추관절염, 강직척추염, 반응관절염, 건선관절염, 장질환과 연관된 관절염, 골관절염, 통풍, 가성통풍, 전신홍반루푸스에 동반되는 관절염, 전신경화증에 동반되는 관절염, 쇼그렌증후군에 동반되는 관절염, 다발성근염에 동반되는 관절염, 피부근염에 동반되는 관절염, 혈관염에 동반되는 관절염, 성인형스틸씨병, 세균관절염, 결핵관절염, 바이러스 관절염, 골관절염, 재발성 류마티즘, 재발다발연골염, 및 류마티스다발근통에 동반되는 관절염으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인, 관절염 진단용 조영제 조성물.According to claim 1,
The arthritis is rheumatoid arthritis, undifferentiated arthritis, juvenile idiopathic arthritis, spondyloarthritis, ankylosing spondylitis, reactive arthritis, psoriatic arthritis, arthritis associated with intestinal disease, osteoarthritis, gout, pseudogout, arthritis accompanying systemic lupus erythematosus, systemic sclerosis Accompanying arthritis, arthritis associated with Sjogren's syndrome, arthritis associated with polymyositis, arthritis associated with dermatomyositis, arthritis associated with vasculitis, adult type Still's disease, bacterial arthritis, tuberculous arthritis, viral arthritis, osteoarthritis, recurrent rheumatism , Relapsing polychondritis, and any one selected from the group consisting of arthritis accompanying polymyalgia rheumatoid arthritis, a contrast agent composition for diagnosis.
상기 조영제 조성물은 광학 영상화(optical imaging) 또는 광음향 영상화(photoacoustic imaging)용인, 관절염 진단용 조영제 조성물.According to claim 1,
The contrast medium composition is for optical imaging or photoacoustic imaging, the contrast medium composition for diagnosing arthritis.
상기 조영제 조성물은 경구 투여되거나, 정맥 내 주입, 근육내 주입, 관절내(intra-articular) 주입, 활액내(intra-synovial) 주입, 수망강내 주입, 간내(intrahepatic) 주입, 병변내(intralesional) 주입 또는 두개강내(intracranial) 주입되는, 관절염 진단용 조영제 조성물.According to claim 1,
The contrast agent composition is administered orally, intravenously, intramuscularly, intra-articularly, intra-synovially, intrathecally, intrahepaticly, or intralesionally. Or intracranial (intracranial) injected, contrast agent composition for diagnosis of arthritis.
상기 폴리에틸렌글리콜(PEG)을 코팅하는 단계에 앞서 상기 금 나노입자 상에 복수 개의 단백질 G(protein G)을 위치시키는 단계; 및 상기 단백질 G에 항체를 연결시키는 단계;를 더 포함하는, 관절염 진단용 조영제 조성물의 제조 방법으로서,
상기 항체는 인터루킨-6(interleukin 6; IL-6)에 특이적으로 결합하는 항체인 것인, 관절염 진단용 조영제 조성물의 제조 방법.
preparing gold nanoparticles; and coating polyethylene glycol (PEG) to cover the surface of the gold nanoparticles,
positioning a plurality of protein Gs on the gold nanoparticles prior to the step of coating the polyethylene glycol (PEG); And linking the antibody to the protein G; further comprising a method for producing a contrast agent composition for diagnosing arthritis,
Wherein the antibody is an antibody that specifically binds to interleukin-6 (IL-6), a method for preparing a contrast agent composition for diagnosing arthritis.
상기 금 나노입자는 구형(nanosphere), 쉘 형태(nanoshell), 또는 막대형(nanorod)인, 관절염 진단용 조영제 조성물의 제조 방법.According to claim 9,
The gold nanoparticles are spherical (nanosphere), shell (nanoshell), or rod-shaped (nanorod), the manufacturing method of the contrast medium composition for diagnosis of arthritis.
상기 금 나노입자의 직경은 3 nm 내지 50 nm인, 관절염 진단용 조영제 조성물의 제조 방법.According to claim 9,
The method of preparing a contrast medium composition for diagnosing arthritis, wherein the gold nanoparticles have a diameter of 3 nm to 50 nm.
상기 금 나노입자를 준비하는 단계는,
(1) 세틸트리암모늄 브로마이드(cetyltrimethylammonium bromide; CTAB)와 염화 금산(Chloroauric acid, HAuCl4)을 혼합하여 얻어진 혼합물에 소듐 보로하이드라이드(Sodium borohydride, NaBrH4)를 첨가하여 금 씨드(seed) 용액을 제조하는 단계;
(2) 세틸트리암모늄 브로마이드(CTAB), 질산은(Silver nitrate, AgNO3) 및 염화 금산(HAuCl4)을 혼합하여 얻어진 혼합물에 아스코르브산(ascorbic acid)을 첨가하는 단계; 및
(3) 상기 (1) 단계에서 얻어진 금 씨드 용액과 상기 (2) 단계에서 얻어진 혼합물을 혼합하여 금 나노입자를 형성하는 단계를 포함하는, 관절염 진단용 조영제 조성물의 제조 방법.According to claim 9,
The step of preparing the gold nanoparticles,
(1) A gold seed solution by adding sodium borohydride (NaBrH 4 ) to a mixture obtained by mixing cetyltrimethylammonium bromide (CTAB) and chloroauric acid (HAuCl 4 ) Preparing;
(2) adding ascorbic acid to a mixture obtained by mixing cetyltriammonium bromide (CTAB), silver nitrate (AgNO 3 ) and chloroauric acid (HAuCl 4 ); and
(3) mixing the gold seed solution obtained in step (1) and the mixture obtained in step (2) to form gold nanoparticles.
상기 (2) 단계 시 아스코르브산을 첨가하기에 앞서, 상기 세틸트리암모늄 브로마이드(CTAB), 질산은(AgNO3) 및 염화 금산(HAuCl4)을 혼합한 뒤 교반하는 단계를 추가로 수행하는, 관절염 진단용 조영제 조성물의 제조 방법.According to claim 12,
Prior to adding ascorbic acid in step (2), the cetyltriammonium bromide (CTAB), silver nitrate (AgNO 3 ) and chloroauric acid (HAuCl 4 ) are mixed and then stirred, arthritis A method for preparing a contrast medium composition for diagnosis.
상기 폴리에틸렌글리콜(PEG)을 코팅하는 단계는,
상기 금 나노입자와 폴리에틸렌글리콜(PEG)을 혼합하는 단계; 및
20 내지 40 ℃의 온도 하에서 6 시간 내지 48 시간 동안 교반하는 단계를 포함하는, 관절염 진단용 조영제 조성물의 제조 방법.According to claim 9,
The step of coating the polyethylene glycol (PEG),
mixing the gold nanoparticles and polyethylene glycol (PEG); and
A method for preparing a contrast medium composition for diagnosing arthritis, comprising stirring at a temperature of 20 to 40 °C for 6 to 48 hours.
상기 단백질 G(protein G)을 위치시키는 단계는,
상기 금 나노입자와 단백질 G(protein G)를 0 ℃ 초과 10 ℃ 이하의 온도 하에서 2 시간 내지 48 시간 동안 혼합하는 단계를 포함하는, 관절염 진단용 조영제 조성물의 제조 방법.According to claim 9,
The step of locating the protein G,
A method for preparing a contrast medium composition for diagnosing arthritis, comprising mixing the gold nanoparticles and protein G at a temperature of more than 0 ° C and less than 10 ° C for 2 hours to 48 hours.
상기 항체를 연결시키는 단계는,
상기 복수 개의 단백질 G가 위치한 금 나노입자를 항체와 0 ℃ 초과 10 ℃ 이하의 온도 하에서 2 시간 내지 48 시간 동안 혼합하는 단계를 포함하는, 관절염 진단용 조영제 조성물의 제조 방법.According to claim 9,
The step of linking the antibody,
A method for preparing a contrast medium composition for diagnosing arthritis, comprising mixing the gold nanoparticles in which the plurality of proteins G are located with an antibody at a temperature of more than 0 ° C and less than 10 ° C for 2 hours to 48 hours.
상기 관절염은 류마티스 관절염, 미분화성 관절염, 소아기 특발성 관절염, 척추관절염, 강직척추염, 반응관절염, 건선관절염, 장질환과 연관된 관절염, 골관절염, 통풍, 가성통풍, 전신홍반루푸스에 동반되는 관절염, 전신경화증에 동반되는 관절염, 쇼그렌증후군에 동반되는 관절염, 다발성근염에 동반되는 관절염, 피부근염에 동반되는 관절염, 혈관염에 동반되는 관절염, 성인형스틸씨병, 세균관절염, 결핵관절염, 바이러스 관절염, 골관절염, 재발성 류마티즘, 재발다발연골염, 및 류마티스다발근통에 동반되는 관절염 으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인, 관절염 진단용 조영제 조성물의 제조 방법.According to claim 9,
The arthritis is rheumatoid arthritis, undifferentiated arthritis, juvenile idiopathic arthritis, spondyloarthritis, ankylosing spondylitis, reactive arthritis, psoriatic arthritis, arthritis associated with intestinal disease, osteoarthritis, gout, pseudogout, arthritis accompanying systemic lupus erythematosus, systemic sclerosis Accompanying arthritis, arthritis associated with Sjogren's syndrome, arthritis associated with polymyositis, arthritis associated with dermatomyositis, arthritis associated with vasculitis, adult type Still's disease, bacterial arthritis, tuberculous arthritis, viral arthritis, osteoarthritis, recurrent rheumatism A method for preparing a contrast agent composition for diagnosing arthritis, which is any one selected from the group consisting of polychondritis, relapsing polychondritis, and arthritis accompanying polymyalgia.
상기 조영제 조성물은 광학 영상화(optical imaging) 또는 광음향 영상화(photoacoustic imaging)용인, 관절염 진단용 조영제 조성물의 제조 방법.
According to claim 9,
The method of manufacturing a contrast medium composition for diagnosing arthritis, wherein the contrast medium composition is for optical imaging or photoacoustic imaging.
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| Ashish Agarwal 외. Dual-mode imaging with radiolabeled gold nanorods. Journal of Biomedical Optics. 2011, Vol. 16(5), 051307-1~051307-7* |
| S. Centi 외. Ready-to-use protein G-conjugated gold nanorods for biosensing and biomedical applications. Journal of Nanobiotechnology. 2018, Vol. 16(5), pp. 1-11* |
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