KR102518742B1

KR102518742B1 - 크립토코커스 네오포르만스의 체온에 대한 내열성을 조절하는 포스파타아제 및 이를 이용한 항진균제 스크리닝 방법

Info

Publication number: KR102518742B1
Application number: KR1020210042530A
Authority: KR
Inventors: 반용선; 정은지; 진재형; 이경태; 이동기; 김진영; 이승헌; 홍주현
Original assignee: 연세대학교 산학협력단
Priority date: 2020-05-08
Filing date: 2021-04-01
Publication date: 2023-04-11
Also published as: KR20210137384A; KR20210137382A; KR20210137386A; KR102518756B9; KR102518785B1; KR20210137381A; KR102518769B9; KR102518750B9; KR102518764B9; KR20210137383A; KR102518786B9; KR102518742B9; KR102518764B1; KR102518786B1; KR20210137380A; KR102518785B9; KR102518769B1; KR102518750B1; KR20210137385A; KR102518756B1

Abstract

GUA1, YVH1, PHS1, NEM1, SIW14, INP5201, DBR1, SSU72, MRE11, 및 FBP26은 크립토코커스 네오포르만스의 병원성과의 관련성 및 체온에 대한 내열성을 조절하는 기능이 새롭게 규명된 포스파타아제 유전자로써, 이들 유전자를 타겟으로 하는 새로운 항진균제 스크리닝에 이용될 수 있다.

Description

크립토코커스 네오포르만스의 체온에 대한 내열성을 조절하는 포스파타아제 및 이를 이용한 항진균제 스크리닝 방법{Phosphatase that modulates thermotolerance for mammalian body temperatures of Cryptococcus neoformans, and method for screening antifungal agents using the same}

본 발명은 크립토코커스 네오포르만스의 체온에 대한 내열성을 조절하는 포스파타아제 및 이를 이용한 항진균제 스크리닝 방법에 관한 것이다.

모든 살아있는 유기체는 변화하는 환경에 대해 동적으로 반응(dynamic response)하며, 이러한 반응은 복잡한 신호 전달 경로에 의해 이루어진다. 환경 신호(environmental cue)가 발생하면 유기체는 수용체 단백질과 같은 센서를 통해 신호를 수신하고, 이어지는 스트레스에 대응하기 위해 하위인자(downstream effector)들을 활성화한다. 환경 신호가 소멸하거나 유기체가 환경에 적응하면 해당 신호전달경로는 일반적으로 적시에 비활성화되고(desensitized) 추후 재활성화될 수 있다. 이러한 신호전달경로의 활성화 및 비활성화 과정은 많은 경우 키나아제(kinase)에 의한 인산화(phosphorylation) 및 포스파타아제(phosphatase)에 의한 탈인산화(dephosphorylation)에 의해 이루어지며, 이는 신호 전달을 온-오프하는 번역 후 변형(post-translational modification)이다. 따라서 신호전달경로에서 키나아제 및 포스파타아제의 조절은 세포 항상성을 유지하는데 중요하다.

병원성 곰팡이는 이러한 신호전달경로를 활용하여 숙주 내의 다양한 조직에서 감염(infection), 군집화(colonization), 증식(proliferation), 및 파종성 감염(dissemination) 중에 발생하는 환경 변화에 적응한다.

크립토코커스 네오포르만스(Cryptococcus neoformans)는 면역이 저하된 환자에서 뇌수막염을 유발하며 전세계적으로 매년 18만 이상의 사망을 초래한다. 크립토코커스 네오포르만스의 전사인자(transcription factor; TF) 및 키나아제에 대한 대규모 기능 분석에 의해 178개의 TF 및 183개의 키나아제가 확인되었다. 이 중 155개의 TF 및 129개의 키나아제가 in vitro 및 in vivo에서 기능적 특징이 규명되었고(functionally characterized), 45개의 TF 및 63개의 키나아제가 병원성에 관여하는 것으로 알려졌다. 그럼에도 불구하고 신호 구성 요소(signaling component)들이 어떻게 조절되고 합동(coordination)되어 병원성을 나타내는지는 명확히 규명되지 않았다.

TF 및 키나아제 네트워크를 명확히 규명하기 위해서는 이들에 대응되는 포스파타아제 네트워크의 공동 분석이 필수적이다. 종래에는 기질 특이성이 높은 키나아제가 약물의 표적으로 더 적절하다고 여겨졌기 때문에 포스파타아제는 주목받지 못했다.

그러나, 최근 여러 종류의 병원성 진균에서 밝혀진 기능성 포스파톰(phosphatome) 데이터에 의하면, 포스파타아제가 진균의 성장, 세포주기, 분화, 스트레스 반응 및 대사를 조절함으로써 항상성을 유지하는데 중요한 역할을 한다는 점이 밝혀졌다.

자낭균(ascomycete)에서는, 유전자 다형 해석(genome-wide analyses)에 의해 아스페르길루스 푸미가투스(Aspergillus fumigatus)의 32개의 포스파타아제를 동정하고(identify) 이 중 24개를 기능적으로 특성화하였으며, 이들 대부분이 스트레스 반응, 철 동화(iron assimilation), 독소 생성(toxin production), 및 저항(resistance)에 기여함이 규명되었다.

또한 밀곰팡이병(wheat scab)을 일으키는 푸사리움 그라미네아룸(Fusarium graminearum)에서 82개의 포스파타아제 유전자를 확인하였으며 이 중 71개를 파괴하고 15 종의 표현형 특성을 통해 기능적으로 분석한 결과 25개의 포스파타아제가 식물 병원성 진균의 병독성(virulence)에 관여함을 확인하였다.(Yun, Y. et al. Functional analysis of the Fusarium graminearum phosphatome. New Phytol. 207, 119-134 (2015).)

그러나 크립토코커스 네오포르만스에서 병원성과 연관된 포스파타아제에 일부 소수의 유전자를 제외하고는 게놈 수준에서는 알려진 바가 없다.

(비특허문헌 0001) Yun, Y. et al. Functional analysis of the Fusarium graminearum phosphatome. New Phytol. 207, 119-134 (2015).

일 구체예에 따르면 크립토코커스 네오포르만스의 체온에 대한 내열성을 조절하는 포스파타아제로서 병원성과의 관련성이 새롭게 규명된 포스파타아제 유전자 및 이를 이용한 항진균제 스크리닝 방법을 제공한다.

일 양상은, 크립토코커스속 진균의 체온에 대한 내열성(thermotolerance for mammalian body temperatures)을 조절하는 포스파타아제를 발현하는 유전자인 GUA1, YVH1, PHS1, NEM1, SIW14, INP5201, DBR1, SSU72, MRE11, 및 FBP26으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유전자의 mRNA 또는 이로부터 발현된 단백질을 후보물질과 접촉시키는 단계; 상기 mRNA 또는 단백질의 발현 수준을 측정하거나, 또는 단백질의 활성을 측정하는 단계; 및 상기 측정된 발현수준 또는 활성이 대조군보다 유의하게 감소한 경우 상기 후보물질을 항진균 활성이 있는 것으로 결정하는 단계를 포함하는 항진균제 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명자는 병원성 진균인 크립토코커스 네오포르만스의 139개 후보 포스파타아제 유전자 중에서 불활성화시켰을 때 Galleria mellonella 유충에 대한 병독성이 감소하거나, 또는 뮤린에 대한 감염성이 감소한 31개 유전자를 선별하고, 이 중에서 병원성과 관련된 7종류의 표현형(O-당사슬 형성, 세포막 안정성, DNA 손상반응, 혈액뇌장벽 통과, 캡슐 형성, 멜라닌 생합성, 체온에 대한 내열성(thermotolerance for mammalian body temperatures))에서 변화를 나타낸 21개의 포스파타아제를 선별하였다. 최종 선별된 유전자는 크립토코커스 네오포르만스의 병독성 및 감염성과 밀접하게 관련된 표현 형질을 조절하는 것으로 새롭게 규명된 포스파타아제 유전자이며, 항진균제의 신규한 타겟이 될 수 있다. 최종 선별된 21개의 포스파타아제 유전자는 하기 표 1에 개시되어 있다.

SEQ ID	H99 lD	Name
1	00182	VPS29
2	00390	YMR1
3	01054	SSU72
4	01177	NEM1
5	01203	YVH1
6	01254	OCA101
7	01436	SIT4
8	01877	GUA1
9	02109	INP5201
10	02487	PHS1
11	02490	MRE11
12	03222	DBR1
13	03296	SIW14
14	03893	SDP102
15	03963	OCA1
16	03996	GDA1
17	04221	FBP26
18	04224	PSR1
19	06647	CDC1
20	07317	INP5202
21	07692	YND1

상기 크립토코커스속 진균은 예를 들면 병원성 진균으로써 크립토코커스 네오포르만스(Cryptococcus neoformans), 크립토코커스 가티(Cryptococcus gattii), 크립토코커스 알비두스(Cryptococcus albidus), 또는 크립토코커스 유니구툴라투스(Cryptococcus uniguttulatus)일 수 있다.

상기 항진균 활성은 크립토코커스속 진균 또는 병원성 크립토코커스속 진균에 대한 활성일 수 있다.

상기 GUA1 유전자는 서열번호 8의 아미노산 서열로 이루어진 포스파타아제를 암호화하는 유전자, 또는 서열번호 29의 염기 서열로 이루어진 유전자일 수 있다.

상기 YVH1 유전자는 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 포스파타아제를 암호화하는 유전자, 또는 서열번호 26의 염기 서열로 이루어진 유전자일 수 있다.

상기 PHS1 유전자는 서열번호 10의 아미노산 서열로 이루어진 포스파타아제를 암호화하는 유전자, 또는 서열번호 31의 염기 서열로 이루어진 유전자일 수 있다.

상기 NEM1 유전자는 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 포스파타아제를 암호화하는 유전자, 또는 서열번호 25의 염기 서열로 이루어진 유전자일 수 있다.

상기 SIW14 유전자는 서열번호 13의 아미노산 서열로 이루어진 포스파타아제를 암호화하는 유전자, 또는 서열번호 34의 염기 서열로 이루어진 유전자일 수 있다.

상기 INP5201 유전자는 서열번호 9의 아미노산 서열로 이루어진 포스파타아제를 암호화하는 유전자, 또는 서열번호 30의 염기 서열로 이루어진 유전자일 수 있다.

상기 DBR1 유전자는 서열번호 12의 아미노산 서열로 이루어진 포스파타아제를 암호화하는 유전자, 또는 서열번호 33의 염기 서열로 이루어진 유전자일 수 있다.

상기 SSU72 유전자는 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 포스파타아제를 암호화하는 유전자, 또는 서열번호 24의 염기 서열로 이루어진 유전자일 수 있다.

상기 MRE11유전자는 서열번호 11의 아미노산 서열로 이루어진 포스파타아제를 암호화하는 유전자, 또는 서열번호 32의 염기 서열로 이루어진 유전자일 수 있다.

상기 FBP26 유전자는 서열번호 17의 아미노산 서열로 이루어진 포스파타아제를 암호화하는 유전자, 또는 서열번호 38의 염기 서열로 이루어진 유전자일 수 있다.

상기 발현 감소 후보 물질은 저분자 화합물, 항체, 안티센스 뉴클레오티드, siRNA, dsRNA, 핵산, 단백질, 펩티드, 추출물, 또는 천연물을 포함할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 접촉시키는 단계는 분리된 mRNA, 단백질을 후보물질과 접촉시키거나, 또는 상기 유전자를 발현하는 크립토코커스속 진균을 후보물질과 접촉시키는 것일 수 있다. 크립토코커스속 진균과 후보 물질을 접촉시키는 경우, 후보물질이 진균 내로 침투하기에 충분한 시간 동안 배양시켜 수행할 수 있다. 상기 접촉시키는 단계는 in vitro에서 수행되는 것일 수 있다.

상기 mRNA 발현 수준의 측정은 통상기술자에게 잘 알려진 방법으로 수행될 수 있으며, 예를 들면 역전사 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소 반응, 실시간 역전사 중합효소반응, RNase 보호 분석법(RPA), 노던 블롯팅, DNA 칩(Microarray) 또는 RNA sequencing 분석에 의해 수행될 수 있다.

상기 단백질의 발현 수준 측정은 통상기술자에게 잘 알려진 방법으로 수행될 수 있으며, 예를 들면 웨스턴 블랏, ELISA (enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 조직면역 염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), 유세포분석(Fluorescence Activated Cell Sorter, FACS), 또는 단백질 칩(protein chip) 으로 수행될 수 있다.

상기 활성 억제 후보물질은 저분자 화합물, 항체, 안티센스 뉴클레오티드, siRNA, dsRNA, 핵산, 단백질, 펩티드, 추출물, 또는 천연물을 포함할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 단백질의 활성 측정은 통상의 기술자에게 알려진 효소 활성 측정 방법이 사용될 수 있으며, 예를 들면 표지된 인산을 이용해 포스파타아제의 기질에 대한 인산화 정도를 측정하거나, 기질의 인산화 자리에 특이적인 항체의 결합 정도를 정량분석하는 방법을 사용할 수 있다.

일 구체예에 따른 스크리닝 방법은 크립토코커스 네오포르만스의 병원성과의 관련성이 새롭게 규명된 포스파타아제 유전자를 이용하므로 새로운 항진균제를 스크리닝 할 수 있다.

도 1은 C. 네오포르만스의 포스파타아제 결실에 의한 in vitro 상의 클러스터별 표현형 변화 및 in vivo 발현 프로파일링을 나타낸 것이다. 도 1에 사용된 약어는 다음과 같다. 25: 25℃; 30: 30℃; 37: 37℃; 39: 39℃; CAP: capsule production; MEL: melanin production; URE: urease production; MAT: mating; HPX: hydrogen peroxide; TBH: tert-butyl hydroperoxide; MD: menadione; DIA: diamide; MMS: methyl methanesulphonate; HU: hydroxyurea; 5FC: 5-flucytosine; AMB: amphotericin B; FCZ: fluconazole; FDX: fludioxonil; TM: tunicamycin; DTT: dithiothreitol; CDS: cadmium sulfate; SDS: sodium dodecyl sulfate; CR: Congo red; CFW: calcofluor white; KCR: YPD + 1.5M KCl; NCR: YPD + 1.5M NaCl; SBR: YPD + 2M sorbitol; KCS: YP + 1M KCl; NCS: YP + 1M NaCl; SBS: YP + 2M sorbitol.
도 2는 Galleria mellonella 곤충 치사 분석에 의한 병독성 조절 포스파타아제의 동정 결과를 나타낸 것이다. (n ≥ 15)
도 3은 STM 기반 뮤린 감염 모델에 의한 감염성 조절 포스파타아제의 동정 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 포스파타아제 변이체의 30℃ 및 37℃에서의 성장 속도를 나타낸 것이다.
도 5는 3가지 다른 멜라닌 유도 배지(Niger seed, dopamine, epinephrine 배지)를 이용하여 변이체의 멜라닌 생산을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 영양 과다 조건(R) 및 결핍 조건(S)에서 멜라닌 발현 조절 유전자인 LAC1의 유전자 발현 정도를 확인한 결과이다.
도 7은 영양 과다 조건(R) 및 결핍 조건(S)에서 멜라닌 발현과 관련된 유전자인 BZP4 및 HOB1의 유전자 발현 정도를 확인한 결과이다.
도 8은 캡슐 유도 배지(FBS agar medium)을 이용하여 캡슐 생산 분석을 수행한 결과이다. 캡슐의 두께(thickness, 전체 직경 - cell body 직경)는 WT 세포(n=50) 및 각 포스파타아제 변이체(n=50)로 측정하였다.
도 9는 레트로머 복합체 관련 유전자 돌연변이들의 표현형 히트맵을 나타낸 것이다. 결실 유전자 및 균주는 vps29Δ (YSB4881, YSB4882), vps26Δ (YSB5671, YSB5672), vps35Δ (YSB5615, YSB5616), vps5Δ (YSB5683, YSB5684), 및 vps17Δ (YSB5724)이다.
도 10은 레트로머 복합체 돌연변이의 곤충 치사 분석 결과이다.
도 11은 레트로머 복합체 돌연변이의 STM 기반 뮤린 감염 분석 결과이다.
도 12는 C. 네오포르만스 야생형(WT), gda1Δ(YSB4750), ynd1Δ(YSB4856)의 세포벽 만노단백질(mannoprotein)에 결합된 O-linked 글리칸의 HPLC 프로파일을 나타낸 것이다.
도 13은 C. 네오포르만스 야생형(WT), gda1Δ(YSB4750), ynd1Δ(YSB4856)의 O-글리칸 성분을 나타낸 것이다.
도 14는 실험결과로부터 예상되는 Gda1p 및 Ynd1p의 기능을 도식화한 것이다.
도 15는 in vitro Blood-Brain Barrier-통과 분석(BBB-crossing assay)에서 C. 네오포르만스 야생형 및 변이체들의 BBB 이동(migration) 능력을 나타낸 것이다.
도 16은 인간 뇌 미세혈관 내피세포주(hCMEC/D3 세포주)를 이용한 BBB-adhesion assay 결과를 나타낸 것이다.
도 17은 C. 네오포르만스의 야생형 및 포스파타아제 변이체들에서 숙주모방조건(host-mimic condition; HMC)으로 발현이 유도된 뇌 감염 관련 유전자의 발현 정도를 나타낸 것이다.
도 18은 C. 네오포르만스에 의한 뇌 감염과 관련된 신호 네트워크를 통합적으로 이해하기 위해 STRING 분석에 의한 기능적 단백질 연관 네트워크(functional protein association network)를 생성한 결과이다.
도 19는 병원성 진균들의 병원성 연관 포스파타아제를 분석한 결과이다.

이하 하나 이상의 구체예를 실시예를 통해 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

본 발명자는 크립토코커스 네오포르만스(Cryptococcus neoformans)에서 포스파타아제로 추정되는(putative) 139개의 유전자 중 109개를 대상으로 219 종류의 시그니쳐 태그 유전자 결실 돌연변이 균주(signature-tagged gene-deletion mutant strain) 라이브러리를 구축하였다. 여기에 종전 연구(Jung, K. W. et al. Systematic functional profiling of transcription factor networks in Cryptococcus neoformans. Nat. Commun. 6, 6757 (2015).)에서 구축한 6개의 포스파타아제에 대한 11개의 시그니쳐 태그 돌연변이체도 이용하였다. 총 114개의 포스파타아제를 대상으로 구축된 230 종류의 시그니쳐 태그 돌연변이체를 사용하여, 30 종류의 in vitro 조건에서 그들의 표현형을 분석하고, 2 가지 실험모델(곤충 및 murine)을 사용하여 독성 분석을 수행했다. 포스파타아제 현상 데이터(Phosphatase Phenome Data) 세트들은 Phosphatase Phenome Database (http://phosphatase.cryptococcus.org)에 공개하였다.

실험방법

1. 연구 윤리 규정 준수 (Ethnic statement)

동물 보호 및 모든 실험은 연세대학교의 동물실험윤리위원회(Institutional Animal Care and Use Committee, IACUC)의 윤리 지침에 따라 수행되었다.

2. C. 네오포르만스 포스파타아제 및 레트로머 돌연변이 구축

NAT-split 마커 및 double joint PCR(DJ-PCR), 및 노르세오트리신 저항성 마커 (nourseothricin acetyl transferase; NAT)를 포함하는 유전자 파괴 카세트(gene disruption cassette)를 사용한 상동 재조합을 통해 C. 네오포르만스 혈청형 A H99S 균주로부터 포스파타아제 및 레트로머 돌연변이 균주를 구축했다.

포스파타아제 및 레트로머 돌연변이 균주 제작에 사용된 프라이머들, 예를 들면 각 유전자에 대한 L1 Primer(5' flanking region primer 1), L2 Primer(5' flanking region primer 2), R1 Primer(3' flanking region primer 1), R2 Primer(3' flanking region primer 2), SO primer(diagnostic screening primer, pairing with B79), PO primer(Southern blot probe primer), STM primer, STM common primer에 대한 정보는 서열번호 43 내지 서열번호 211에 개시되어 있다.

그 외 프라이머들, B1026 (M13 Forward extended), B1027 (M13 Reverse extended), B79 (Screening primer), B1454 (NAT split marker primer 1), B1455 (NAT split marker primer 2), B1886 (NEO split marker primer 1), B1887 (NEO split marker primer 2), B679 (qRT-PCR primer for ACT1), B680 qRT-PCR primer for ACT1), B8953 (qRT-PCR primer for LAC1), B8954 (qRT-PCR primer for LAC1), B3737 (qRT-PCR primer for BZP4), B8521 (qRT-PCR primer for BZP4), B6394 (qRT-PCR primer for HOB1), B8519 (qRT-PCR primer for HOB1), B8654 (qRT-PCR primer for ITR1A), B8655 (qRT-PCR primer for ITR1A), B8658 (qRT-PCR primer for ITR3C), B8659 (qRT-PCR primer for ITR3C), B8656 (qRT-PCR primer for MPR1), B8657 (qRT-PCR primer for MPR1), B8598 (qRT-PCR primer for FZC31), B4951 (qRT-PCR primer for FZC31), B9243 (qRT-PCR primer for GAT201), B9422 (qRT-PCR primer for GAT201), B9061 (qRT-PCR primer for PDR802), B4913 (qRT-PCR primer for PDR802)는 서열번호 212 내지 서열번호 238에 개시되어 있다.

상기 프라이머 및 프로브들에 대한 상세한 정보는 본 발명자의 논문 Genome-wide functional analysis of phosphatases in the pathogenic fungus Cryptococcus neoformans, Bahn YS et al., Nature Communications volume 11, Article number: 4212 (2020)의 supplementary data 4를 참고할 수 있다. (https://www.nature.com/articles/s41467-020-18028-0#Sec28)

H99S 유전체 DNA로부터 L1/L2(5' flanking region primer set) 및 R1/R2(3' flanking region primer set) 프라이머쌍으로 PCR을 실시하여 표적 유전자의 5' flanking 영역 및 3' flanking 영역을 증폭했다.

시그니처 태그된 NAT 마커는 각각의 고유한 시그니처 태그 서열을 갖는 NAT 유전자를 포함하는 pNAT-STM 플라스미드로부터의 프라이머 M13Fe(M13 forward extended) 및 M13Re (M13 reverse extended)를 사용한 PCR을 실시하여 증폭하였다.

1차 PCR에서 5' flanking 영역, 3' flanking 영역, 및 NAT 마커를 증폭하여 주형 DNA를 생성하고, 2차 PCR에서는 각각 프라이머쌍 L1/NSL(B1455 NAT split marker primer 2) 및 R2/NSR(B1454 NAT split marker primer 1)으로 NAT-split 유전자파괴(gene-disruption) 카세트의 5'-영역 및 3'-영역을 구축하였다.

NAT 유전자파괴 카세트를 도입하는 생물학적 형질전환(Biolistic transformation)은 다음 방법으로 실시하였다. H99S 균주를 50ml YPD 배지에서 30℃로 16시간 동안 배양하고 스핀다운(spin-down)을 실시하였다. 5ml 증류수에서 재현탁하고 1M 소르비톨이 포함된 YPD 한천 배지에 도포하고 30℃에서 3시간 동안 추가 배양하였다. 유전자 파괴 카세트를 600㎍의 0.6㎛ 금 마이크로캐리어 비드 (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)와 결합하고 입자 전달 시스템 (PDS-100, Bio-Rad)을 사용하여 세포에 도입했다. 세포막 완전성을 회복하기 위해 30℃에서 4 시간 동안 배양한 후 세포를 스크랩하고, 노르세오트리신(100㎍/ml)을 포함하는 YPD 한천 배지에 도말(spread)하였다. 진단 PCR(Diagnostic PCR)로 NAT-양성 형질 전환체를 확인했다. 서던 블롯 분석으로 스크리닝된 각 형질전환체의 유전자형을 확인했다. 각 포스파타아제 유전자에 대해 적어도 두 개의 독립적인 돌연변이 균주를 구축했다.

3. nCounter in vivo 유전자 발현 프로파일링 분석.

이전 연구에서 보고된 RNA 샘플(Lee, K. T. et al. Fungal kinases and transcription factors regulating brain infection in Cryptococcus neoformans. Nat. Commun. 11, 1521 (2020))을 사용하여 nCounter 유전자 발현 분석 (NanoString)을 수행하여 139개의 포스파타아제의 생체 내 발현 수준을 정량화했다.

전체 RNA 샘플은 비강 흡입을 통해 5 x 10⁵ 세포로 감염된 6 주령 암컷 A / J 마우스로부터 얻었다. 3 마리의 마우스 그룹은 각각 3, 7, 14, 21 dpi(day post-infection)에 희생시키고, 폐, 뇌, 비장 및 신장을 수득하고 동결 건조시켰다. 건조된 장기를 균질화하고 상용 RNA 추출 키트(easy-BLUE, Intron Biotechnology)로 total RNA를 추출했다.

In vitro 기저(basal) 조건 (30℃; YPD 배지)에서 성장한 C. 네오포르만스로부터 분리한 전체 RNA 10ng 또는 C. 네오포르만스 감염 마우스 조직에서 분리한 전체 RNA 10㎍을 포함하는 샘플을 nCounter 멀티 플렉스 플랫폼 (NanoString, Seattle, WA, USA)의 제조업체 표준 프로토콜에 따라 설정하고 맞춤형(custom) 프로브 코드 세트로 반응 시켰다. 고해상도(600 fields) 옵션의 디지털 분석기로 스캔하였으며 nSolver 소프트웨어(NanoString)로 정규화하였다(normalized).

8 개의 하우스 키핑(house-keeping) 유전자(mitochondrial protein, CNAG_00279; microtubule-binding protein, CNAG_00816; aldose reductase, CNAG_02722; cofilin, CNAG_02991; actin, CNAG_00483; tubulin β chain, CNAG_01840; tubulin α-1A chain, CNAG_03787; histone H3, CNAG_04828)는 표현 정규화(expression normalization)에 사용되었다.

폴드-변화(fold-change)를 표현하기 위해 정규화된 데이터를 log₂ 점수로 변환하고 Morpheus(Broad Institute, Cambridge, MA, USA, http://software.broadinstitute.org/morpheus)에 의한 평균 연결(average linkage) 및 one minus Pearson 상관관계(correlation)를 사용하여 클러스터링을 수행했다.

4. 성장 및 화학적 감수성 테스트

시험관 내 스트레스 조건에 대한 각 포스파타아제 돌연변이의 감수성을 분석하기 위해, C. 네오포르만스를 30℃에서 16시간 동안 성장시키고, 연속적으로 10배(1-10⁴) 희석하고, 하기 환경 스트레스 유도 화학물질을 포함하는 YPD 한천 배지에 스팟 접종하였다. (Jung, K. W. et al. Systematic functional profiling of transcription factor networks in Cryptococcus neoformans. Nat. Commun. 6, 6757 (2015) 방법 참고)

[환경 스트레스 유도 화학물질]

포도당 과다(YPD) 또는 포도당 결핍(효모 추출물-펩톤; YP) 조건 하에서 삼투압 스트레스(소르비톨) 및 양이온/염 스트레스 (NaCl 및 KCl);

산화 스트레스 [과산화수소(H₂O₂), tert-butyl hydroperoxide(유기 과산화물), menadione(superoxide anion generator), diamide(thiolspecific oxidant)];

독성 중금속 스트레스 [황산 카드뮴 (CdSO4)]; genotoxic 스트레스 (methyl methanesulphonate 및 hydroxyurea);

막 불안정화 스트레스 [sodium dodecyl sulfate (SDS)];

세포벽 불안정화 스트레스 (calcofluor white 및 Congo red);

ER 스트레스 [tunicamycin 및 dithiothreitol(DTT)];

및 항진균제 감수성(fludioxonil, fluconazole, amphotericin B, 및 flucytosine).

세포를 30℃에서 1일 내지 5일간 배양하고 매일 사진을 찍었다. 다양한 온도에서 C. 네오포르만스 균주의 성장을 조사하기 위해 YPD 한천 배지에서 연속 희석된 세포를 스팟 접종하고 25℃, 37℃ 및 39℃에서 배양하고 매일 배양 사진을 찍었다. 포스파타아제 돌연변이체의 성장 속도를 정량적으로 조사하기 위해 WT 균주 (H99S) 및 포스파타아제 돌연변이체를 30℃에서 밤새 배양하고 신선한 액체 YPD 배지에 계대 배양했다[광학밀도 OD₆₀₀ = 0.2]. 세포는 다중 채널 생물 반응기(Biosan Laboratories, Inc., Warren, MI, USA)에서 30℃ 또는 37℃에서 배양하였으며 OD 600nm는 40 내지 90 시간 동안 자동 측정하였다.

5. 교배 분석 (mating assay)

일방 교배 효율(unilateral mating efficiency)을 측정하기 위해, H99S 균주 및 MATa KN99a 균주로 구축된 각 혈청형 A MATα 포스파타아제 돌연변이를 YPD 배지에서 30℃로 16시간 동안 배양하고, PBS로 2회 세척하였다. 세포를 동일한 농도 (10⁷ cells/ml)로 혼합하고, V8 mating 배지(pH 5)에 스팟 접종한 후 7 내지 14 일 동안 암실에서 25℃로 배양하였다. 매주 필라멘트 성장(filamentous growth)을 관찰하고 사진을 촬영하였다.

6. In vitro 병독성 인자 생산 분석

캡슐 생산 효율성을 테스트하기 위해, 각 돌연변이를 30℃에서 배양하고, Dulbecco's modified Eagle agar 배지에 스팟 접종하고 37℃에서 2일간 배양하였다. 배양된 세포를 스크랩하고, 증류수로 세척하고, 10% 포르말린으로 고정시키고 증류수로 다시 세척하였다. 고정된 세포를 3×10⁸ cells/ml 농도로 조정하고 세포 현탁액 50 ㎕를 microhaematocrit capillary tube(Kimble Chase, Rockwood, TN, USA)에 주입했다. 중력으로 세포를 농축(pack)시키기 위해 Capillary tube를 10일 동안 수직으로 배치하였다. 농축된 세포(packed cell)의 부피 비율(packed cell phase/total phase)를 측정하고, 야생형 H99S 균주의 농축세포용적(packed cell volume)으로 각 비율을 정규화하여 각 돌연변이체의 상대적인 농축세포용적(packed cell volume)를 계산하였다. 상대적인 농축된 세포 부피 비율의 통계적 차이는 Prism 8 (GraphPad, San Diego, USA)의 Bonferroni's multiple comparison test를 사용한 일원배치 분산 분석(one-way analysis of variance, ANOVA)에 의해 결정되었다.

다른 배지에서 캡슐 생산 효율을 측정하기 위해, 각 배양액 5㎕를 Littman's agar medium 및 FBS agar medium(10% foetal bovine serum 및 90% PBS)에 스팟 접종하고, 37℃에서 2일간 배양하고, 세포를 스크랩하고, 증류수로 재현탁하였다. 재현탁한 세포는 India ink (BactiDrop; Remel, San Diego, CA, USA)로 염색하고 DIC (Differential Interference Contrast) 현미경(BX51, Olympus, Tokyo, Japan)으로 관찰했다. 캡슐 두께는 캡슐 직경에서 세포 직경을 빼서 측정했다(총 직경-세포체 직경). 캡슐 두께의 정량적 측정을 위해 H99S 균주 및 각 포스파타아제 돌연변이체 50 개의 세포를 측정했다.

멜라닌 생산 효율을 조사하기 위해 각 포스파타아제 돌연변이를 YPD 배지에서 30℃로 16시간 동안 배양하고 PBS로 세척한 다음 0.1% 또는 0.2% 포도당을 포함하는 Niger seed, dopamine, 또는 epinephrine 배지(리터당 1g L- 아스파라긴, 3g KH₂PO₄, 250mg MgSO₄, 1mg thiamine, 5㎍ biotin, 100mg L-DOPA 또는 epinephrine hydrochloride)에 3㎕를 스팟 접종하였다. 스팟 접종된 세포를 37℃에서 배양하고 1일 내지 3 일 후에 사진을 찍었다. 37℃에서 성장 결함이 있는 포스파타아제 돌연변이체는 30℃에서 멜라닌 및 캡슐 생산 효율을 조사했다.

우레아제(Urease) 생산을 확인하기 위해 각 포스파타아제 돌연변이체를 30℃ 에서 16시간 배양하고 PBS로 세척한 후, 10ml 의료용 튜브(SPL Life Sciences, 경기도, 대한민국)에 담긴 액체 Christensen's media에 접종(세포 10⁶개)한 다음 진탕 배양기에서 30℃로 1 내지 3 일 동안 배양하고 매일 사진을 찍었다.

7. 발현 분석

멜라닌 조절 유전자 (LAC1, HOB1, MBS1, BZP4)의 발현 수준을 측정하기 위해 H99S 균주 및 포스파타아제 돌연변이체(mre11Δ, ccr4Δ, vps29Δ, yvh1Δ, fbp26Δ, inp5201Δ, cac1Δ, ptp2Δ, ptc2Δ, dbr1Δ, ppg1Δ, nem1Δ 및 gua1Δ)를 YPD 액체 배지에서 30℃로 16시간 동안 배양하고, 신선한 액체 YPD 배지로 서브컬쳐하였다(OD₆₀₀ = 0.2).

세포가 초기 로그 단계(logarithmic phase)(OD₆₀₀ = 0.6 내지 0.8)에 도달하면 세포 배양의 절반을 샘플링하여 기본 샘플을 준비했다. 나머지 세포 배양물을 PBS로 3회 세척하고 영양 결핍 조건(글루코스가 없는 황산암모늄이 포함된 YNB 배지)에서 2시간 동안 배양한 다음, 즉시 액체 질소로 펠릿화하고 동결 건조했다.

BBB 통과 관련 유전자(BBB crossing-related gene: ITR1A, ITR3C, MPR1, FZC31, GAT201 및 PDR802)의 발현 수준을 측정하기 위해, H99S 균주 및 포스파타아제 돌연변이[sit4Δ (YSB4094), siw14Δ (YSB4570), ssu72Δ (YSB4242), gda1Δ (YSB4750) 및 xpp1Δ (YSB5941)]를 30℃로 16시간 동안 YPD 브로스에서 배양하고, 50ml의 신선한 YPD 브로쓰에서 서브컬쳐하고, OD₆₀₀이 0.8에 도달할 때까지 추가 배양하였다. 그 다음 배양액을 25ml 튜브 2개에 분리하고 원심 분리한 다음 멸균 증류수로 3 회 세척하였다.

하나의 튜브는 기본 발현 수준을 모니터링하기 위해 액체 질소에 보관되었고, 다른 튜브는 10% FBS를 포함하는 동일한 부피의 RPMI1640 배지에 재현탁되었다. 120 rpm으로 수평 진탕(horizontal shaking)하는 CO₂ 배양기에서 37℃로 3시간 배양한 후, 세포를 원심 분리하고 밤새 동결 건조시켰다. 시판되는 RNA 추출 키트(easy-BLUE, iNtRON Biotechnology, Gyeonggi, Korea)를 사용하여 각 샘플에서 Total RNA를 추출하고, RTase(Thermo Scientific, Waltham, MA, USA)를 사용하여 cDNA를 합성했다. 서열번호 219 내지 238의 표적 유전자 특이적 프라이머쌍을 사용하여 qRT-PCR(Quantitative reverse transcription-PCR)을 수행했다. 상기 표적 유전자 특이적 프라이머쌍은 Genome-wide functional analysis of phosphatases in the pathogenic fungus Cryptococcus neoformans, Bahn YS et al., Nature Communications volume 11, Article number: 4212 (2020)를 참고할 수 있다.

8. cwMPs (cell wall mannoproteins) O-linked 글리칸의 HPLC 분석

cwMP에서 O-linked 글리칸의 분석은 Thak, E. J., Kim, J., Lee, D. J., Kim, J. Y. & Kang, H. A. Structural analysis of N-/O-glycans assembled on proteins in yeasts. J. Microbiol. 56, 11-23 (2018)에 기재된 방법으로 수행하였다.

O-linked 올리고사카라이드(oligosaccharide)는 개질된(modified) 하이드라진분해(hydrazinolysis)에 의해 정제된 cwMP로부터 방출되었다. 건조된 cwMP (50㎍)를 hydrazine monohydrate에 재현탁하고 60℃로 4시간 동안 배양했다. 반응물을 냉각 및 건조(desiccation)시키고, 펠렛을 NaHCO₃에 용해시키고, (CH₃CO)₂O와 혼합하고, 얼음 위에서 30분 동안 배양하였다.

O-글리칸을 Dowex 50WX8-400 resins (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)로 정제하고 2-AA로 표지했다(labelled). 정제된 O-글리칸은 90% solvent A(아세토 니트릴 중 2% 아세트산 및 1% tetrahydrofuran) 및 10% solvent B (물에서 5% 아세트산, 3% triethylamine 및 1% tetrahydrofuran)을 사용하여 TSKgel Amide-80 컬럼(0.46 × 25cm, Tosoh Corp., Tokyo, Japan)에서 HPLC를 사용하여 분석하였다. 샘플 주입 후에, solvent B의 비율을 1.0 ml/min의 유속에서 60 분에 걸쳐 90 %로 증가시키고 O-글리칸을 형광검출기(2475, Waters Corp., Milford, MA, USA)로 검출했다. 여기 파장 및 방출 파장은 각각 360 nm 및 425 nm이다. 크로마토그래피 소프트웨어 (Empower 2, Waters)를 사용하여 데이터를 분석했다.

9. 곤충모델 기반 in vivo 병독성 분석

체중이 200 내지 300mg에 이르고 종령 유충기에 있는(final larval instar) 최소 15 개의 G. mellonella 애벌레(Vanderhorst Wholesale, Inc., Saint Marys, OH, USA)를 사용했다. 각각의 포스파타아제 변이체 및 야생형 H99S 균주를 30℃에서 밤새 인큐베이션하고, 펠릿화하고, PBS로 3 회 세척하고, 10⁶ cells/ml의 농도로 PBS에 재현탁시켰다. 각 유충마다 4000 개의 C. 네오포르만스 세포를 10㎕ 바늘 및 반복 디스펜서가 장착된 100㎕ 실린지(PB600-1, Hamilton Company, Reno, NV, USA)를 사용하여 두 번째에서 마지막 전각(proleg) 사이에 주입했다. 음성 대조군 G. mellonella는 PBS 만 주입했다. 감염된 유충을 페트리 접시에 놓고 가습 환경에서 37℃로 배양하면서 매일 모니터링했다. 애벌레는 검게 변하고 만졌을 때 아무런 움직임도 보이지 않는 상태에 이르면 사망한 것으로 판정하였다. 실험 중에 번데기화된(pupate) 유충은 통계 분석을 위해 검열하였다. Prism 8 (GraphPad, San Diego, CA, USA)을 사용하여 생존 곡선을 설명하고 로그 순위 테스트(Mantel-Cox)로 분석했다. 각 포스파타아제 돌연변이마다 두 개의 독립적인 균주를 조사했다.

10. STM-기반 쥐과(murine) 감염성 분석

41 개의 고유한 시그니처-태그 NAT 선별 마커(signature-tagged NAT selection marker)가 있는 포스파타아제 돌연변이체 세트를 30℃에서 16 시간 동안 배양했다. ste50Δ (STM # 282) 및 ire1Δ (STM # 169) 돌연변이체는 각각 독성(virulent) 및 무독성(avirulent) 대조군 균주로 사용되었다.

돌연변이체와 대조군 균주를 펠릿화하고, PBS로 3 회 세척하고, PBS에 재현 탁한 다음 동일한 양(5 x 10⁵ cells)으로 풀링(pool)하였다.

7 주령 암컷 A/J 마우스 (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME, USA) Avertin (2,2,2-tribromoethanol, T48402, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)의 복강 내 주사로 마취됨)를 비강 내 흡입(intranasal inhalation)을 통해 세포수 5 x 10⁵의 풀링된(pooled) 돌연변이체(50㎕ PBS)로 감염시켰다.

투입 포스파타아제 게놈 DNA 라이브러리(input phosphatase genomic DNA library)를 준비하기 위해, 풀링된 균주 200㎕를 100㎍/ml chloramphenicol이 포함된 YPD 배지에 도말(spread)하고 30℃에서 3 일 동안 배양한 다음 스크래핑하여 수집했다.

감염된 마우스들은 14 dpi에 이르렀을 때 인도적 실험 종결을 위해 과량의 마취제 투여 (Avertin) 로 희생시켰다. 감염된 마우스의 폐와 뇌를 회수하고 5ml의 PBS로 균질화하였다. 그 다음 균질화 된 조직을 100㎍ /ml 클로람페니콜을 함유하는 YPD 배지에 도말(spread)하고 30℃에서 3 일 동안 배양한 다음 스크래핑하여 수집했다. CTAB(cetyl trimethylammonium bromide) 방법을 사용하여 수집된 투입(input) 및 산출(output) 세포에서 게놈 DNA를 추출했다.

qRT-PCR 시스템(CFX96, Bio-Rad, Hercules, CA, USA)을 사용하여 태그 특이 적 프라이머로 Quantitative PCR을 수행했다. STM 점수는 2^-ΔΔCt 방법을 사용하여 계산되었으며, 게놈 DNA 양의 상대적 변화를 계산하였다. 투입(input) 대 산출(output) 샘플의 평균 폴드-변화는 로그 점수 (log₂ 2 ^{-(Ct, Target-Ct, Actin) output- (Ct, Target-Ct, Actin)input)})로 계산되었다.

11. In vitro BBB 통과(BBB-crossing) 및 BBB 부착(BBB-adhesion) 분석

인간 뇌 미세혈관 내피세포(hCMEC/D3 세포주, Merck & Co., Kenilworth, NJ, USA)는 기존에 알려진 방법을 기반으로 다음과 같이 배양되었다.

요약하면, EGM-2 배지(Lonza Group, Basel, Switzerland)에서 5 x 10⁴ hCMEC/D3 세포를 준비하고, BBB-통과 분석을 위해 콜라겐(Corning, Inc.)으로 코팅된 8㎛ 다공성막(BD Biosciences)에 파종(seeding)하고, BBB-접착 분석을 위해 12웰 플레이트(BD Biosciences)에 파종했다. 파종 다음날, 2.5% 인간 혈청이 보충된 EGM-2 배지로 교체하고 4 일 동안 추가로 배양하였다. C. 네오포르만스 접종 하루 전, 배지를 0.5x 희석된 EGM-2 배지로 교체하고 세포를 37℃ 및 5% CO₂에서 유지하였다. 세포 사이 밀착연접(tight junction)의 무결성(integrity)은 epithelial volt/ohm meter(EVOM2 device, World Precision Instruments)에 의해 ~200 Ω/cm²의 TEER(trans-endothelial electrical resistance)가 측정됨을 확인함으로써 검증되었다.

BBB-통과 분석을 위해, C. 네오포르만스 WT (H99), mpr1Δ 돌연변이 및 포스파타아제 결실 돌연변이의 5 x 10⁵ 세포를 PBS 500 ㎕에 첨가하고 다공성막에 접종하였다. 5% CO₂ 및 37℃에서 24시간 배양한 후 CFU를 계수하여 다공성막을 통과하는 세포수를 측정했다. 세포 접종 전후에는 전술한 바와 같이 TEER에 의해 tight junction 무결성을 측정하였다. BBB 이동 비율(BBB migration ratio)은 각 테스트 균주의 output CFU를 WT의 input CFU로 나누어 계산했다.

BBB 부착 분석을 위해, 5 x 10⁵ 세포를 포함하는 100㎕ PBS를 12웰 플레이트에서 성장한 hCMEC/D3 세포의 단층(monolayer)에 접종하고 5% CO₂ 및 37℃ 조건에서 24시간 동안 배양했다. 배양 후, 배양물을 PBS로 3 회 세척하고, 37℃에서 30분 동안 멸균 증류수로 인큐베이션하여 숙주 세포를 용해(burst)시키고 수집하여 CFU 정량화를 실시하였다. BBB-부착율(BBB-adhesion ratio)은 각 테스트 균주의 부착된 CFU를 WT C. 네오포르만스의 CFU로 나누어 계산하였다.

12. C. 네오포르만스 포스파타아제 데이터에 대한 데이터베이스 구축

C. 네오포르만스 포스파타아제 돌연변이 라이브러리의 표현형 및 게놈 데이터 (phenomic and genomic data)에 대한 접근을 용이하게하기 위해 Cryptococcus neoformans Phosphatase Phenome Database (http://phosphatase.cryptococcus.org) 및 Cryptococcus neoformans Phenome Gateway Database (http://www.cryptococcus.org/)를 개발했다.

13. 통계분석

GraphPad Prism 버전 8을 사용하여 통계 분석을 수행했다. 캡슐 생산 분석 및 발현 분석을 위해 Bonferroni의 다중 비교 테스트가 포함된 ANOVA가 사용되었다. 살충 분석의 통계 분석은 로그 순위(Mantel-Cox) 테스트를 사용했다. 뮤린 STM 분석에서 ste50Δ (양성 대조군)와 돌연변이체간의 통계적 유의성은 Bonferroni의 다중 비교 테스트와 함께 일원 분산 분석에 의해 계산되었다.

실시예 1: C.neoformans의 포스파타아제 유전자 동정

FungiDB C. 네오포르만스(H99 균주) 게놈 데이터베이스 (http://fungidb.org/fungidb)에서 포스파타아제로 주석표시된 유전자를 조사하고, 이들의 단백질 서열을 분석하여 포스파타아제 관련 도메인의 존재를 검증하였다. 이를 통해 C. 네오포르만스의 139개 추정 포스파타아제 유전자를 선별하였다. (하기 표 2 참고)

number	H99 lD	Gene name	number	H99 lD	Gene name
1	CNAG_00057	FPP1	71	CNAG_03262	INM101
2	CNAG_01519	EEP1	72	CNAG_03296	SIW14
3	CNAG_02681	APH3	73	CNAG_03396	NPY1
4	CNAG_02944	APH1	74	CNAG_03491	NDX3
5	CNAG_03673	PPZ1	75	CNAG_03541	PTC7
6	CNAG_04354	XPP1	76	CNAG_03657	LDP1
7	CNAG_04453	IPC1	77	CNAG_03679	ACY1
8	CNAG_04782	PPU1	78	CNAG_03706	GLC7
9	CNAG_06115	APH4	79	CNAG_03765	TPS2
10	CNAG_06967	APH2	80	CNAG_03871	LTP1
11	CNAG_07629	EPP1	81	CNAG_03893	SDP102
12	CNAG_00076	NDX6	82	CNAG_03949	PHO13
13	CNAG_00146	PBY101	83	CNAG_03957	-
14	CNAG_00175	-	84	CNAG_03963	OCA1
15	CNAG_00182	VPS29	85	CNAG_03984	YCH1
16	CNAG_00263	PTP4	86	CNAG_03996	GDA1
17	CNAG_00265	IDI1	87	CNAG_04049	PPP5
18	CNAG_00316	HAM1	88	CNAG_04104	AKP3
19	CNAG_00390	YMR1	89	CNAG_04113	PTP3
20	CNAG_00408	PPH3	90	CNAG_04120	FCP1
21	CNAG_00427	PTC5	91	CNAG_04221	FBP26
22	CNAG_00498	CDC14	92	CNAG_04224	PSR1
23	CNAG_00500	PTC1	93	CNAG_04236	-
24	CNAG_00533	TIM50	94	CNAG_04268	APN2
25	CNAG_00554	ISC1	95	CNAG_04475	HPP3
26	CNAG_00790	DPP1	96	CNAG_04718	PCD101
27	CNAG_00810	HAD4	97	CNAG_04731	PCD102
28	CNAG_01054	SSU72	98	CNAG_04732	PCD1
29	CNAG_01177	NEM1	99	CNAG_04796	CNA1
30	CNAG_01203	YVH1	100	CNAG_04833	TEP1
31	CNAG_01254	OCA101	101	CNAG_04852	NDX4
32	CNAG_01314	PPP1	102	CNAG_05080	CWH43
33	CNAG_01346	HPP2	103	CNAG_05155	PTP2
34	CNAG_01357	SDP101	104	CNAG_05286	LDP2
35	CNAG_01412	PAH1	105	CNAG_05301	CRN1
36	CNAG_01436	SIT4	106	CNAG_05306	PTC701
37	CNAG_01496	PPT1	107	CNAG_05529	HAD5
38	CNAG_01498	AKP2	108	CNAG_05567	PPP3
39	CNAG_01518	PMU1	109	CNAG_05568	PRY1
40	CNAG_01532	INP52	110	CNAG_05617	GPI13
41	CNAG_01572	CDC25	111	CNAG_05639	PPS1
42	CNAG_01604	-	112	CNAG_05692	LCB3
43	CNAG_01744	HAD1	113	CNAG_05892	SHB17
44	CNAG_01823	INM1	114	CNAG_06064	PTP1
45	CNAG_01864	NDX5	115	CNAG_06065	SAC101
46	CNAG_01877	GUA1	116	CNAG_06080	SAC1
47	CNAG_01900	NDX1	117	CNAG_06122	HAD6
48	CNAG_01901	NDX2	118	CNAG_06132	HAD8
49	CNAG_02001	INP5203	119	CNAG_06141	DUT101
50	CNAG_02109	INP5201	120	CNAG_06232	HPP1
51	CNAG_02161	ASP1	121	CNAG_06236	NGL3
52	CNAG_02177	PPH22	122	CNAG_06251	PPP4
53	CNAG_02236	PPG1	123	CNAG_06418	PTC6
54	CNAG_02375	FIG4	124	CNAG_06499	DPP101
55	CNAG_02453	PTP5	125	CNAG_06549	CET1
56	CNAG_02470	PPP2	126	CNAG_06587	OCA2
57	CNAG_02487	PHS1	127	CNAG_06617	-
58	CNAG_02490	MRE11	128	CNAG_06647	CDC1
59	CNAG_02545	IPP1	129	CNAG_06698	HAD9
60	CNAG_02740	RPP1	130	CNAG_06900	-
61	CNAG_02772	PMU101	131	CNAG_06966	AKP1
62	CNAG_02861	HIS2	132	CNAG_06969	HAD7
63	CNAG_02878	GEP4	133	CNAG_07317	INP5202
64	CNAG_02986	YSA1	134	CNAG_07354	MET22
65	CNAG_03014	CAX4	135	CNAG_07372	OXK1
66	CNAG_03052	PTC2	136	CNAG_07434	HAD3
67	CNAG_03078	NPP1	137	CNAG_07547	GPM1
68	CNAG_03190	CCR4	138	CNAG_07692	YND1
69	CNAG_03202	CAC1	139	CNAG_07740	HAD2
70	CNAG_03222	DBR1

C. 네오포르만스의 포스파타아제 유전자 분석 결과 다음 3가지 사실을 발견하였다. (1) C. 네오포르만스의 포스파타아제의 보존 정도는 키나아제보다는 낮지만 전사인자(TF)보다는 높다, (2) C. 네오포르만스의 티로신 키나아제의 종류는 3개에 불과하여 부족함에도 불구하고 21개의 단백질 티로신 포스파타아제(PTP)가 포함되어 있다, (3) C. 네오포르만스는 다른 진균류와 유사한 수의 추정 포스파타아제 유전자를 포함하고 있다.

실시예 2: C. 네오포르만스 포스파타아제 돌연변이 라이브러리 구축

상기 실시예 1의 139개 추정 포스파타아제 유전자에 대한 결실 돌연변이체를 제작하고 in vitro 및 in vivo 표현형 특징(phenotypic trait)을 분석하였다.

139 개의 추정 포스파타아제 유전자 중 15 개(PTP1, PTP2, YSA1, CNA1, CAC1, TPS2, CCR4, HAD1, EPP1, XPP1, APH1, ASP1, ISC1, PPG1, PPH3)는 이전 연구에서 기능적으로 특성화되었다. 또한 이전 연구에서 키나아제 돌연변이 라이브러리 구축을 위해 키나아제 도메인이 있는 2개의 포스파타아제 유전자(OXK1 및 FBP26) 결실 균주를 제작하였고, TF 돌연변이 라이브러리 구축을 위해 DNA 결합 도메인이 있는 포스파타아제 유전자(APN2) 결실 균주를 제작하였다.

종전 연구에서 구축한 11개의 시그니쳐 태그 돌연변이 균주(PTP1, PTP2, OXK1, FBP26, 및 APN2에 대해 각각 2개; CAC1에 대해 1개) 외에, 일련의 고유 올리고뉴클레오티드 시그니쳐 태그를 포함하는 노르세오트리신 저항성 마커(nourseothricin resistance marker)를 사용하여 대규모 상동성 재조합 기반 유전자 결실(large-scale homologous recombination-based gene deletion)을 수행했다. 고품질의 포스파타아제 돌연변이 라이브러리를 구축하기 위해 각 유전자에 대해 2개 이상의 독립적인 돌연변이를 제작하고 진단 PCR(diagnostic PCR) 및 Southern blot 분석을 통해 유전자형을 확인하였다.

그 결과 109개의 포스파타아제를 대표하는 219개의 돌연변이 균주가 새롭게 제작되었다. 이전에 제작된 11개 변이 균주와 더불어 114개의 포스파타아제를 대표하는 230개의 돌연변이 균주에 대한 분석이 수행되었다. (25개는 제외되었으며 이유는 후술함) 하기 표 3에서, 3741 및 2744는 control이며, 4341, 4342, 1429, 1430, 4288, 4289, 275, 277, 1704, 1705, 42는 종전 연구에서 제작된 11개 균주이고, 나머지는 새롭게 제작된 219개 변이 균주이다.

Gene ID	Gene name	Strain names (YSB #)	Genotypes	Parents
CNAG_07507	STE50	3741	MATα ste50Δ::NAT-STM#234 (STM positive control)	H99S
CNAG_03670	IRE1	2744	MATα ire1Δ::NAT-STM#169 (STM negative control)	H99S
CNAG_04221	FBP26	4341, 4342	MATα fbp26Δ::NAT-STM#146(previously constructed)	H99S
CNAG_04268	APN2	1429, 1430	MATα apn2Δ::NAT-STM#102(previously constructed)	H99S
CNAG_07372	OXK1	4288, 4289	MATα oxk1Δ::NAT-STM#122 (previously constructed)	H99S
CNAG_05155	PTP2	275, 277	MATα ptp2Δ::NAT-STM#184 (previously constructed)	H99S
CNAG_06064	PTP1	1704, 1705	MATα ptp1Δ::NAT-STM#125(previously constructed)	H99S
CNAG_03202	CAC1	42	MATα cac1Δ::NAT-STM#159(previously constructed)	H99S
CNAG_02986	YSA1	5013, 5014	MATα ysa1Δ::NAT-STM#116	H99S
CNAG_00057	FPP1	4596, 4597	MATα fpp1Δ::NAT-STM#184	H99S
CNAG_01519	EEP1	4659, 4662	MATα eep1Δ::NAT-STM#191	H99S
CNAG_02681	APH3	4051, 4052	MATα aph3Δ::NAT-STM#150	H99S
CNAG_02944	APH1	3478, 3479	MATα aph1Δ::NAT-STM#191	H99S
CNAG_03673	PPZ1	5788, 5789	MATα ppz1Δ::NAT-STM#295	H99S
CNAG_04354	XPP1	5941, 5942, 6628	MATα xpp1Δ::NAT-STM#234	H99S
CNAG_04782	PPU1	6630, 6631	MATα ppu1Δ::NAT-STM#212	H99S
CNAG_06967	APH2	3484, 3485	MATα aph2Δ::NAT-STM#159	H99S
CNAG_07629	EPP1	4922, 4924	MATα epp1Δ::NAT-STM#240	H99S
CNAG_00076	NDX6	5140, 5141	MATα ndx6Δ::NAT-STM#159	H99S
CNAG_00146	PBY101	5153, 5154	MATα pby101Δ::NAT-STM#5	H99S
CNAG_00182	VPS29	4881, 4882	MATα vps29Δ::NAT-STM#295	H99S
CNAG_00263	PTP4	5387, 5388	MATα ptp4Δ::NAT-STM#123	H99S
CNAG_00316	HAM1	5184, 5186	MATα ham1Δ::NAT-STM#212	H99S
CNAG_00390	YMR1	4262, 4554	MATα ymr1Δ::NAT-STM#5	H99S
CNAG_00408	PPH3	3776, 3778	MATα pph3Δ::NAT-STM#146	H99S
CNAG_00427	PTC5	5943, 5944	MATα ptc5Δ::NAT-STM#43	H99S
CNAG_00498	CDC14	3620, 5359	MATα cdc14Δ::NAT-STM#116	H99S
CNAG_00500	PTC1	289, 290	MATα ptc1Δ::NAT-STM#146	H99S
CNAG_00554	ISC1	4264, 4265	MATα isc1Δ::NAT-STM#43	H99S
CNAG_00810	HAD4	4194, 4197	MATα had4Δ::NAT-STM#116	H99S
CNAG_01054	SSU72	4242, 4243	MATα ssu72Δ::NAT-STM#119	H99S
CNAG_01177	NEM1	4771, 4772	MATα nem1Δ::NAT-STM#177	H99S
CNAG_01203	YVH1	4590, 4591	MATα yvh1Δ::NAT-STM#5	H99S
CNAG_01254	OCA101	4075, 4077	MATα oca101Δ::NAT-STM#210	H99S
CNAG_01314	PPP1	5058, 5059	MATα ppp1Δ::NAT-STM#184	H99S
CNAG_01346	HPP2	4728, 4730	MATα hpp2Δ::NAT-STM#204	H99S
CNAG_01357	SDP101	3613, 3614	MATα sdp101Δ::NAT-STM#6	H99S
CNAG_01436	SIT4	4094, 4095	MATα sit4Δ::NAT-STM#232	H99S
CNAG_01496	PPT1	5554, 5555	MATα ppt1Δ::NAT-STM#184	H99S
CNAG_01498	AKP2	5064, 5069	MATα akp2Δ::NAT-STM#6	H99S
CNAG_01518	PMU1	4026, 4027	MATα pmu1Δ::NAT-STM#205	H99S
CNAG_01532	INP52	4793, 4794	MATα inp52Δ::NAT-STM#201	H99S
CNAG_01744	HAD1	4665, 4666	MATα had1Δ::NAT-STM#204	H99S
CNAG_01823	INM1	4608, 4609	MATα inm1Δ::NAT-STM#191	H99S
CNAG_01864	NDX5	5466, 5467	MATα ndx5Δ::NAT-STM#150	H99S
CNAG_01877	GUA1	6161, 6163	MATα gua1Δ::NAT-STM#213	H99S
CNAG_01900	NDX1	5248, 5249	MATα ndx1Δ::NAT-STM#210	H99S
CNAG_01901	NDX2	5504, 5505	MATα ndx2Δ::NAT-STM#211	H99S
CNAG_02001	INP5203	4692, 4693	MATα inp5203Δ::NAT-STM#205	H99S
CNAG_02109	INP5201	4607, 4929	MATα inp5201Δ::NAT-STM#122	H99S
CNAG_02161	ASP1	5250, 5251	MATα asp1Δ::NAT-STM#240	H99S
CNAG_02236	PPG1	5772, 5940	MATα ppg1Δ::NAT-STM#123	H99S
CNAG_02375	FIG4	4574, 4575	MATα fig4Δ::NAT-STM#150	H99S
CNAG_02453	PTP5	5469, 5470	MATα ptp5Δ::NAT-STM#191	H99S
CNAG_02470	PPP2	4819, 4822	MATα ppp2Δ::NAT-STM#290	H99S
CNAG_02487	PHS1	4022, 4023	MATα phs1Δ::NAT-STM#225	H99S
CNAG_02490	MRE11	4694, 5050	MATα mre11Δ::NAT-STM#242	H99S
CNAG_02772	PMU101	4670, 4671	MATα pmu101Δ::NAT-STM#208	H99S
CNAG_03014	CAX4	4790, 4791	MATα cax4Δ::NAT-STM#211	H99S
CNAG_03052	PTC2	1772, 1773	MATα ptc2Δ::NAT-STM#224	H99S
CNAG_03078	NPP1	5019, 5021	MATα npp1Δ::NAT-STM#119	H99S
CNAG_03190	CCR4	5591, 5594	MATα ccr4Δ::NAT-STM#210	H99S
CNAG_03202	CAC1	5650	MATα cac1Δ::NAT-STM#159	H99S
CNAG_03222	DBR1	4963, 4964	MATα dbr1Δ::NAT-STM#288	H99S
CNAG_03262	INM101	4529, 4530	MATα inm101Δ::NAT-STM#201	H99S
CNAG_03296	SIW14	4570, 4571	MATα siw14Δ::NAT-STM#225	H99S
CNAG_03396	NPY1	5105, 5107	MATα npy1Δ::NAT-STM#122	H99S
CNAG_03491	NDX3	5192, 5193	MATα ndx3Δ::NAT-STM#201	H99S
CNAG_03541	PTC7	1860, 1861	MATα ptc71Δ::NAT-STM#53	H99S
CNAG_03657	LDP1	4382, 4383	MATα ldp1Δ::NAT-STM#231	H99S
CNAG_03679	ACY1	5838, 5839	MATα acy1Δ::NAT-STM#43	H99S
CNAG_03765	TPS2	4373, 4433	MATα tps2Δ::NAT-STM#232	H99S
CNAG_03871	LTP1	4044, 4045	MATα ltp1Δ::NAT-STM#230	H99S
CNAG_03893	SDP102	3467, 3468	MATα sdp102Δ::NAT-STM#119	H99S
CNAG_03949	PHO13	4374, 4376	MATα pho13Δ::NAT-STM#234	H99S
CNAG_03963	OCA1	4054, 4055	MATα oca1Δ::NAT-STM#230	H99S
CNAG_03984	YCH1	4637, 4638	MATα ych1Δ::NAT-STM#208	H99S
CNAG_03996	GDA1	4750, 5821	MATα gda1Δ::NAT-STM#6	H99S
CNAG_04049	PPP5	4298, 4299	MATα ppp5Δ::NAT-STM#288	H99S
CNAG_04104	AKP3	5484, 5485	MATα akp3Δ::NAT-STM#58	H99S
CNAG_04113	PTP3	4680, 4754	MATα ptp3Δ::NAT-STM#231	H99S
CNAG_04224	PSR1	5003, 5005	MATα psr1Δ::NAT-STM#125	H99S
CNAG_04475	HPP3	4003, 4004	MATα hpp3Δ::NAT-STM#211	H99S
CNAG_04718	PCD101	5416, 5417	MATα pcd101Δ::NAT-STM#146	H99S
CNAG_04731	PCD102	5422, 5424	MATα pcd102Δ::NAT-STM#125	H99S
CNAG_04732	PCD1	5045, 5053	MATα pcd1Δ::NAT-STM#123	H99S
CNAG_04796	CNA1	4067, 4068	MATα cna1Δ::NAT-STM#290	H99S
CNAG_04833	TEP1	4622, 4623	MATα tep1Δ::NAT-STM#205	H99S
CNAG_04852	NDX4	5046, 5047	MATα ndx4Δ::NAT-STM#204	H99S
CNAG_05080	CWH43	4508, 4509	MATα cwh43Δ::NAT-STM#213	H99S
CNAG_05286	LDP2	4721, 4722	MATα ldp2Δ::NAT-STM#218	H99S
CNAG_05301	CRN1	5095, 5096	MATα crn1Δ::NAT-STM#218	H99S
CNAG_05306	PTC701	1867, 1868	MATα ptc701Δ::NAT-STM#58	H99S
CNAG_05529	HAD5	5098, 5099	MATα had5Δ::NAT-STM#205	H99S
CNAG_05567	PPP3	4396, 4399	MATα ppp3Δ::NAT-STM#288	H99S
CNAG_05568	PRY1	5101, 5102	MATα pry1Δ::NAT-STM#211	H99S
CNAG_05692	LCB3	4755, 5051, 5052	MATα lcb3Δ::NAT-STM#219	H99S
CNAG_05892	SHB17	4060, 4061	MATα shb17Δ::NAT-STM#212	H99S
CNAG_06065	SAC101	4470, 4718	MATα sac101Δ::NAT-STM#220	H99S
CNAG_06122	HAD6	5476, 5477	MATα had6Δ::NAT-STM#219	H99S
CNAG_06132	HAD8	4464, 4475	MATα had8Δ::NAT-STM#242	H99S
CNAG_06141	DUT101	5112, 5128	MATα dut101Δ::NAT-STM#208	H99S
CNAG_06232	HPP1	4092, 4093	MATα hpp1Δ::NAT-STM#213	H99S
CNAG_06236	NGL3	4459, 4472	MATα ngl3Δ::NAT-STM#273	H99S
CNAG_06251	PPP4	4784, 4785	MATα ppp4Δ::NAT-STM#296	H99S
CNAG_06418	PTC6	1875, 1876	MATα ptc6Δ::NAT-STM#102	H99S
CNAG_06499	DPP101	4479, 4480	MATα dpp101Δ::NAT-STM#290	H99S
CNAG_06587	OCA2	4841, 4842	MATα oca2Δ::NAT-STM#231	H99S
CNAG_06647	CDC1	5542, 5574	MATα cdc1Δ::NAT-STM#296	H99S
CNAG_06698	HAD9	4485, 4486	MATα had9Δ::NAT-STM#58	H99S
CNAG_06966	AKP1	4892, 4893	MATα akp1Δ::NAT-STM#150	H99S
CNAG_06969	HAD7	4688, 4946	MATα had7Δ::NAT-STM#220	H99S
CNAG_07317	INP5202	4511, 4538	MATα inp5202Δ::NAT-STM#102	H99S
CNAG_07434	HAD3	4624, 4626	MATα had3Δ::NAT-STM#116	H99S
CNAG_07547	GPM1	4089, 4090	MATα gpm1Δ::NAT-STM#219	H99S
CNAG_07692	YND1	4856, 6157	MATα ynd1Δ::NAT-STM#119	H99S
CNAG_07740	HAD2	4506, 4507	MATα had2Δ::NAT-STM#123	H99S
CNAG_00508	VPS17	5724	MATα vps17Δ::NAT-STM#220	H99S
CNAG_01315	VPS5	5683, 5684	MATα vps5Δ::NAT-STM#221	H99S
CNAG_01426	VPS26	5671, 5672	MATα vps26Δ::NAT-STM#5	H99S
CNAG_01837	VPS35	5615, 5616	MATα vps35Δ::NAT-STM#210	H99S
Double KO	OCA101, OCA1	6634, 6635	MATα oca101Δ::NAT oca1Δ::NEO	YSB4075

파괴 전략(disruption strategies), 프라이머 서열, southern blot 결과, 및 돌연변이 현상 데이터는 본 발명자가 구축한 Cryptococcus neoformans Phosphatase Phenome Database (http://phosphatase.cryptococcus.org)에서 확인할 수 있다.나머지 25개(H99 ID/Gene name으로서 01572/CDC25, 06080/SAC1, 04120/FCP1, 04453/IPC1, 06549/CET1, 03706/GLC7, 00533/TIM50, 00265/IDI1, 02545/IPP1, 02740/RPP1, 02861/HIS2, 07354/MET22, 01412/PAH1, 05617/GPI13, 05639/PPS1, 00790/DPP1, 03957/-, 02177/PPH22, 02878/GEP4, 01604/-, 06900/-, 06617/-, 00175/-, 06115/APH4, 04236/-)의 포스파타아제 유전자의 경우, 생존 가능한 형질전환체를 얻지 못하거나, 야생형과 돌연변이체 대립 유전자를 모두 보유하는 잠재적 이상배수체(potential aneuploidy) 돌연변이체만이 획득되었다. 이는 나머지 25개 유전자가 생존에 필수적인 유전자일 수 있음을 시사한다.

실시예 3: 포스파톰의 표현형 및 in vivo 발현 프로파일링

실시예 2에서 준비한 114개 유전자에 대한 230 개의 C. 네오포르만스의 포스파타아제 결실 변이체를 이용하여 30 종류의 in vitro 조건에서 표현형을 조사하였다. 30 종류의 조건은 다양한 온도(25, 30, 37 및 39℃)에서 성장, 교배 효율, 독성 인자 생성(캡슐, 멜라닌 및 우레아제), 스트레스 반응(삼투/양이온 염, 산화, 유전 독성, ER, 세포막/벽 및 중금속 스트레스) 및 항진균제 감수성이다. (하기 표 4 참고)

		Abb.	Description	Tested condition
1	Growth at different temperature	25	incubated at 25^oC	Cells were incubated at 25^oC for 1-6 days.
2		30	incubated at 30^oC	Cells were incubated at 30^oC for 1-6 days.
3		37	incubated at 37^oC	Cells were incubated at 37^oC for 1-6 days.
4		39	incubated at 39^oC	Cells were incubated at 39^oC for 1-6 days.
5	Mating	MAT	Mating	Cells were incubated with opposite mating type cells onto the V8 media in the dark for 15 days.
6	Virulence factors	MEL	Melanin	Cells were spotted onto the Niger seed media containing glucose and further incubated at 37C for 1-4 days.
7		CAP	Capsule	Cells were incubated onto the solid-agared DME media and relative packed cell volume was measured
8		URE	Urease	Cells were spotted onto the Christensen's agar media and further incubated at 30^oC for 1-4 days.
9	Osmotic/cation salt stress	NCR	NaCl treatment under glucose-rich condition	Cells were spotted onto the YPD media containing 1.5 M NaCl for 1-6 days.
10		KCR	KCl treatment under glucose-rich condition	Cells were spotted onto the YPD media containing 1.5 M KCl for 1-6 days.
11		SBR	Sorbitol treatment under glucose-rich condition	Cells were spotted onto the YPD media containing 2 M sorbitol for 1-6 days.
12		NCS	NaCl treatment under glucose-starved condition	Cells were spotted onto the YP media containing 1 M NaCl for 1-6 days.
13		KCS	KCl treatment under glucose-starved condition	Cells were spotted onto the YP media containing 1 M KCl for 1-6 days.
14		SBS	Sorbitol treatment underglucose-starved condition	Cells were spotted onto the YP media containing 2 M sorbitol for 1-6 days.
15	Oxidative stress	HPX	Hydrogen peroxide	Cells were spotted onto the YPD media containing 2.5 ~ 3.5 mM concentration of hydrogen peroxide for 1-6 days.
16		TBH	Tert-butyl hydroperoxide	Cells were spotted onto the YPD media containing 0.6 ~ 0.8 mM concentration of tert-butyl hydroperoxide for 1-6 days.
17		MD	Menadione	Cells were spotted onto the YPD media containing 0.01 ~ 0.03 mM concentration of menadione for 1-6 days.
18		DIA	Diamide	Cells were spotted onto the YPD media containing 2 ~ 3.5 mM concentration of diamide for 1-6 days.
19	Genotoxic stress	MMS	Metyl methanesulfonate	Cells were spotted onto the YPD media containing 0.02 ~ 0.06% MMS for 1-6 days.
20	Genotoxic stress	HU	Hydroxyurea	Cells were spotted onto the YPD media containing 90 ~ 110 mM concentration of HU for 1-6 days.
21	ER Stress	TM	Tunicamycin	Cells were spotted onto the YPD media containing 0.2 ~ 0.4 μg/ml concentration of TM for 1-6 days.
22	ER Stress	DTT	Dithiothreitol	Cells were spotted onto the YPD media containing 15 ~ 20 mM concentration of DTT for 1-6 days.
23	Heavy metal stress	CDS	CdSO₄	Cells were spotted onto the YPD media containing 20 ~ 35 μM concentration of for CdSO4 1-6 days.
24	Cell wall/membrane stress	CR	Congo-red	Cells were spotted onto the YPD media containing 0.8 ~ 1% congo-red for 1-6 days.
25		CFW	Calcofluor white	Cells were spotted onto the YPD media containing 3 ~ 5 mg/ml concentration of CFW for 1-6 days.
26		SDS	Sodium dodecyl sulfate	Cells were spotted onto the YPD media containing 0.03 ~ 0.05% SDS for 1-6 days.
27	Antifungal drug susceptibility	5FC	Flucytosine	Cells were spotted onto the YPD media containing 300 ~ 500 μg/ml concentration of flucytosine for 1-6 days.
28		AMB	Amphotericin B	Cells were spotted onto the YPD media containing 0.8 ~ 1.8 μg/ml concentration of Amphotericin B for 1-6 days.
29		FCZ	Fluconazole	Cells were spotted onto the YPD media containing 10 ~ 18 μg/ml concentration of fluconazole for 1-6 days.
30		FDX	Fludioxonil	Cells were spotted onto the YPD media containing 0.5 ~ 5 μg/ml concentration of fludioxonil for 1-6 days.

도 1은 C. 네오포르만스의 포스파타아제 결실에 의한 in vitro 상의 클러스터별 표현형 변화 및 in vivo 발현 프로파일링을 나타낸 것이다. 하기 표 5 내지 표 10는 30가지 표현형에 대한 데이터를 클러스터별로 구체적으로 나타낸 것이다. 도 1 및 표 5 내지 10에서, 각 수치는 -3 : 강한 감소/감수성, -2 : 약간(moderately) 감소/감수성, -1 : 약한(weakly) 감소/감수성, 0 : 야생형 유사, +1 약한 증가/내성, +2 : 약간 증가/내성, +3 : 강한 증가/내성이다. 하기 표 5는 각 유전자의 결실이 25, 30, 37 및 39℃에서의 성장에 미치는 영향을 확인한 결과이다.

		Growth at different temperature
H99 lD	*Name*	25	30	37	39
00057	FPP1	0	0	0	0
00076	NDX6	0	0	0	0
00146	PBY101	0	0	0	1
00182	VPS29	0	0	0	0
00263	PTP4	0	0	0	0
00316	HAM1	0	0	0	0
00390	YMR1	0	0	0	0
00408	PPH3	0	0	0	0
00427	PTC5	0	0	0	0
00498	CDC14	0	0	0	0
00500	PTC1	0	0	0	0
00554	ISC1	0	0	0	0
00810	HAD4	0	0	0	0
01054	SSU72	0	0	-1	-1
01177	NEM1	0	-1	-2	-3
01203	YVH1	0	-2	-1	-1
01254	OCA101	-1	-1	0	0
01314	PPP1	0	0	0	0
01346	HPP2	0	0	0	0
01357	SDP101	0	0	0	0
01436	SIT4	0	0	0	0
01496	PPT1	0	0	0	0
01498	AKP2	0	0	0	0
01518	PMU1	0	0	0	0
01519	EEP1	0	0	0	0
01532	INP52	0	0	0	0
01744	HAD1	-1	0	0	0
01823	INM1	0	0	0	0
01864	NDX5	0	0	0	0
01877	GUA1	0	-2	-1	-2
01900	NDX1	0	0	0	0
01901	NDX2	0	0	0	0
02001	INP5203	0	0	0	0
02109	INP5201	0	-1	-1	-2
02161	ASP1	0	0	0	0
02236	PPG1	0	-2	-3	-3
02375	FIG4	0	0	0	-2
02453	PTP5	0	0	0	0
02470	PPP2	0	0	0	-1
02487	PHS1	0	0	-1	-1
02490	MRE11	0	0	-2	-2
02681	APH3	0	0	0	0
02772	PMU101	0	0	0	0
02944	APH1	0	0	0	0
02986	YSA1	0	0	0	0
03014	CAX4	0	0	0	0
03052	PTC2	-1	-1	0	0
03078	NPP1	0	0	0	0
03190	CCR4	0	-1	-2	-3
03202	CAC1	0	0	0	0
03222	DBR1	0	-2	-1	-2
03262	INM101	0	0	0	0
03296	SIW14	0	-1	-1	-1
03396	NPY1	0	0	0	0
03491	NDX3	0	0	0	0
03541	PTC7	0	0	0	0
03657	LDP1	0	0	0	0
03673	PPZ1	0	0	0	0
03679	ACY1	0	0	0	0
03765	TPS2	0	0	-3	-3
03871	LTP1	0	0	0	0
03893	SDP102	0	0	0	0
03949	PHO13	0	0	0	0
03963	OCA1	0	0	0	0
03984	YCH1	0	0	0	0
03996	GDA1	0	0	0	0
04049	PPP5	0	0	0	0
04104	AKP3	0	0	0	0
04113	PTP3	0	0	0	0
04221	FBP26	-1	-1	-1	-1
04224	PSR1	0	0	0	0
04268	APN2	0	0	0	-1
04354	XPP1	0	0	0	0
04475	HPP3	0	0	0	0
04718	PCD101	0	0	0	0
04731	PCD102	0	0	0	0
04732	PCD1	0	0	0	0
04782	PPU1	0	0	0	0
04796	CNA1	0	0	-2	-3
04833	TEP1	0	0	0	0
04852	NDX4	0	0	0	0
05080	CWH43	0	0	0	0
05155	PTP2	0	-1	0	0
05286	LDP2	0	0	0	0
05301	CRN1	0	0	0	0
05306	PTC701	0	0	0	0
05529	HAD5	0	0	0	0
05567	PPP3	0	0	0	0
05568	PRY1	0	0	0	0
05892	SHB17	0	0	0	0
06064	PTP1	0	0	0	0
06065	SAC101	0	0	0	0
06122	HAD6	0	0	0	0
06132	HAD8	0	0	0	0
06141	DUT101	0	0	0	0
06232	HPP1	0	0	0	0
06236	NGL3	0	0	0	0
06251	PPP4	0	0	0	0
06418	PTC6	0	0	0	0
06499	DPP101	0	0	0	2
06587	OCA2	0	0	0	0
06647	CDC1	0	0	0	0
06698	HAD9	0	0	0	0
06966	AKP1	0	0	0	0
06967	APH2	0	0	0	0
06969	HAD7	0	0	0	0
07317	INP5202	0	0	0	0
07372	OXK1	0	0	-1	0
07434	HAD3	0	0	0	0
07547	GPM1	0	0	0	0
07629	EPP1	0	0	0	0
07692	YND1	0	0	0	0
07740	HAD2	0	0	0	0

하기 표 6은 각 유전자의 결실이 교배 효율 및 독성 인자에 미치는 영향을 나타낸 것이다.

		Mating	Virulence factors
H99 lD	*Name*	MAT	MEL	CAP	URE
00057	FPP1	0	0	0	3
00076	NDX6	0	0	0	0
00146	PBY101	-2	0	0	0
00182	VPS29	0	-1	0	2
00263	PTP4	0	0	0	0
00316	HAM1	0	0	0	0
00390	YMR1	0	0	0	0
00408	PPH3	0	0	0	0
00427	PTC5	0	0	0	0
00498	CDC14	0	0	0	0
00500	PTC1	1	0	0	0
00554	ISC1	0	0	0	0
00810	HAD4	0	0	0	0
01054	SSU72	-3	-1	0	0
01177	NEM1	-3	-2	1	3
01203	YVH1	-2	-1	0	-3
01254	OCA101	-3	0	0	0
01314	PPP1	0	0	0	0
01346	HPP2	0	0	-2	0
01357	SDP101	0	0	0	0
01436	SIT4	0	0	2	0
01496	PPT1	0	0	0	0
01498	AKP2	0	0	0	0
01518	PMU1	0	0	0	0
01519	EEP1	0	0	0	0
01532	INP52	0	0	0	0
01744	HAD1	-2	0	0	0
01823	INM1	0	0	0	0
01864	NDX5	0	0	-1	0
01877	GUA1	-3	-3	0	-3
01900	NDX1	0	0	0	0
01901	NDX2	0	0	0	0
02001	INP5203	0	0	0	0
02109	INP5201	-3	-3	3	3
02161	ASP1	0	0	0	0
02236	PPG1	-3	-3	0	3
02375	FIG4	0	0	1	0
02453	PTP5	0	0	0	-2
02470	PPP2	0	0	0	0
02487	PHS1	0	0	3	0
02490	MRE11	0	-1	0	0
02681	APH3	0	0	0	0
02772	PMU101	0	0	0	0
02944	APH1	0	0	0	0
02986	YSA1	0	0	0	0
03014	CAX4	0	1	0	0
03052	PTC2	-3	-3	0	0
03078	NPP1	0	0	0	0
03190	CCR4	-2	-1	2	3
03202	CAC1	-3	-3	-3	1
03222	DBR1	-3	-3	3	3
03262	INM101	0	0	0	0
03296	SIW14	-2	1	0	-1
03396	NPY1	0	0	0	0
03491	NDX3	0	0	0	0
03541	PTC7	0	0	0	0
03657	LDP1	0	0	0	0
03673	PPZ1	0	0	0	0
03679	ACY1	0	0	0	0
03765	TPS2	0	-2	0	1
03871	LTP1	0	0	0	0
03893	SDP102	0	0	-1	0
03949	PHO13	0	0	0	0
03963	OCA1	0	0	-1	0
03984	YCH1	0	0	0	0
03996	GDA1	-1	0	0	0
04049	PPP5	0	0	-1	0
04104	AKP3	0	0	0	0
04113	PTP3	0	0	0	0
04221	FBP26	-3	-3	0	0
04224	PSR1	0	-1	-2	0
04268	APN2	0	0	0	0
04354	XPP1	0	-1	0	2
04475	HPP3	0	0	0	0
04718	PCD101	0	0	0	0
04731	PCD102	0	0	1	0
04732	PCD1	0	0	0	0
04782	PPU1	0	0	0	0
04796	CNA1	-2	-3	2	2
04833	TEP1	0	0	0	0
04852	NDX4	0	0	0	0
05080	CWH43	0	0	-1	0
05155	PTP2	-3	-3	-2	0
05286	LDP2	0	0	0	0
05301	CRN1	2	0	0	0
05306	PTC701	0	0	0	0
05529	HAD5	0	0	0	0
05567	PPP3	0	0	0	0
05568	PRY1	0	0	0	0
05892	SHB17	0	0	0	0
06064	PTP1	0	0	0	0
06065	SAC101	0	0	0	0
06122	HAD6	0	0	0	0
06132	HAD8	0	0	0	0
06141	DUT101	0	0	0	0
06232	HPP1	0	0	0	0
06236	NGL3	0	0	-1	0
06251	PPP4	0	0	0	0
06418	PTC6	-1	0	0	0
06499	DPP101	0	0	0	0
06587	OCA2	0	0	0	0
06647	CDC1	0	0	2	0
06698	HAD9	0	0	0	0
06966	AKP1	0	0	0	0
06967	APH2	0	0	0	0
06969	HAD7	0	0	0	0
07317	INP5202	0	0	0	0
07372	OXK1	0	-2	0	0
07434	HAD3	0	0	0	0
07547	GPM1	0	0	0	0
07629	EPP1	0	0	0	0
07692	YND1	0	0	-2	0
07740	HAD2	0	0	0	0

하기 표 7은 각 유전자의 결실이 삼투 스트레스에 미치는 영향을 확인한 결과이다.

		Osmotic/cation salt stress
H99 lD	*Name*	KCR	NCR	SBR	KCS	NCS	SBS
00057	FPP1	0	0	0	0	0	0
00076	NDX6	0	0	0	0	0	0
00146	PBY101	0	0	0	0	0	0
00182	VPS29	0	0	0	0	0	0
00263	PTP4	0	0	0	0	0	0
00316	HAM1	0	0	0	0	0	0
00390	YMR1	0	0	0	0	0	0
00408	PPH3	0	0	0	0	0	0
00427	PTC5	0	0	0	0	0	0
00498	CDC14	0	0	0	0	0	0
00500	PTC1	0	0	0	0	0	0
00554	ISC1	0	-3	0	0	-3	0
00810	HAD4	0	0	0	0	0	0
01054	SSU72	-2	-3	-2	-1	-2	-1
01177	NEM1	-1	-3	-1	-1	-1	-1
01203	YVH1	0	0	0	0	0	0
01254	OCA101	0	0	0	0	0	0
01314	PPP1	0	0	0	0	0	0
01346	HPP2	0	0	0	0	0	0
01357	SDP101	0	0	0	0	0	0
01436	SIT4	0	0	0	0	0	0
01496	PPT1	0	0	0	0	0	0
01498	AKP2	0	0	0	0	0	0
01518	PMU1	0	0	0	0	0	0
01519	EEP1	0	0	0	0	0	0
01532	INP52	0	0	0	0	0	0
01744	HAD1	-1	-1	-1	0	0	0
01823	INM1	0	0	0	0	0	0
01864	NDX5	0	0	0	0	0	0
01877	GUA1	-3	-3	-3	-2	-2	-2
01900	NDX1	0	0	0	0	0	0
01901	NDX2	0	0	0	0	0	0
02001	INP5203	0	0	0	0	0	0
02109	INP5201	-2	-3	-1	-2	-2	-2
02161	ASP1	0	0	0	0	0	0
02236	PPG1	-1	-3	-1	0	-3	0
02375	FIG4	0	0	0	0	0	0
02453	PTP5	0	0	0	0	0	0
02470	PPP2	0	0	0	0	0	0
02487	PHS1	-2	-2	0	-2	-2	0
02490	MRE11	0	0	0	0	0	0
02681	APH3	0	0	0	0	0	0
02772	PMU101	0	0	0	0	0	0
02944	APH1	0	0	0	0	0	0
02986	YSA1	0	0	0	0	0	0
03014	CAX4	0	0	0	0	0	0
03052	PTC2	0	0	-1	0	0	0
03078	NPP1	0	0	0	0	0	0
03190	CCR4	0	0	0	0	0	0
03202	CAC1	0	0	0	0	0	0
03222	DBR1	-2	-2	-2	-2	-3	-2
03262	INM101	0	0	0	0	0	0
03296	SIW14	-1	-1	0	-1	-1	0
03396	NPY1	0	0	0	0	0	0
03491	NDX3	0	0	0	0	0	0
03541	PTC7	0	0	0	0	0	0
03657	LDP1	0	0	0	0	0	0
03673	PPZ1	0	-2	0	0	0	0
03679	ACY1	0	0	0	0	0	0
03765	TPS2	0	0	0	0	0	0
03871	LTP1	0	0	0	0	0	0
03893	SDP102	0	0	0	0	0	0
03949	PHO13	0	0	0	0	0	0
03963	OCA1	0	0	0	0	0	0
03984	YCH1	0	0	0	0	0	0
03996	GDA1	0	-2	-2	0	-3	-1
04049	PPP5	0	0	0	0	0	0
04104	AKP3	0	0	0	0	0	0
04113	PTP3	0	0	0	0	0	0
04221	FBP26	0	-1	-1	0	-1	-1
04224	PSR1	0	0	0	0	0	0
04268	APN2	0	0	0	0	0	0
04354	XPP1	0	0	0	0	0	0
04475	HPP3	0	0	0	0	0	0
04718	PCD101	0	0	0	0	0	0
04731	PCD102	0	0	0	0	0	0
04732	PCD1	0	0	0	0	0	0
04782	PPU1	0	0	0	0	0	0
04796	CNA1	-2	-3	-2	-1	-2	-2
04833	TEP1	0	0	0	0	0	0
04852	NDX4	0	0	0	0	0	0
05080	CWH43	0	0	0	0	0	0
05155	PTP2	-1	-1	-1	-1	-1	-1
05286	LDP2	0	0	0	0	0	0
05301	CRN1	0	0	0	0	0	0
05306	PTC701	0	0	0	0	0	0
05529	HAD5	0	0	0	0	0	0
05567	PPP3	0	0	0	0	0	0
05568	PRY1	0	0	0	0	0	0
05892	SHB17	0	0	0	0	0	0
06064	PTP1	0	0	0	0	0	0
06065	SAC101	0	0	0	0	0	0
06122	HAD6	0	0	0	0	0	0
06132	HAD8	0	0	0	0	0	0
06141	DUT101	0	0	0	0	0	0
06232	HPP1	0	0	0	0	0	0
06236	NGL3	0	0	0	0	0	0
06251	PPP4	0	0	0	0	0	0
06418	PTC6	0	-2	0	0	0	0
06499	DPP101	0	0	0	0	0	0
06587	OCA2	0	0	0	0	0	0
06647	CDC1	0	0	0	0	0	0
06698	HAD9	0	0	0	0	0	0
06966	AKP1	0	0	0	0	0	0
06967	APH2	0	0	0	0	0	0
06969	HAD7	0	0	0	0	0	0
07317	INP5202	0	0	0	0	0	0
07372	OXK1	1	0	0	0	0	0
07434	HAD3	0	0	0	0	0	0
07547	GPM1	0	0	0	0	0	0
07629	EPP1	0	0	0	0	0	0
07692	YND1	0	0	0	0	0	0
07740	HAD2	0	0	0	0	0	0

하기 표 8은 각 유전자의 결실이 산화 스트레스에 미치는 영향을 확인한 결과이다.

		Oxidative stress
H99 lD	*Name*	DIA	HPX	MD	TBH
00057	FPP1	0	0	0	0
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00316	HAM1	0	0	0	0
00390	YMR1	0	0	0	0
00408	PPH3	-1	0	0	0
00427	PTC5	0	0	0	0
00498	CDC14	0	0	0	0
00500	PTC1	0	0	0	0
00554	ISC1	-2	0	0	-1
00810	HAD4	0	0	0	0
01054	SSU72	-2	-1	-1	-1
01177	NEM1	-2	-2	-1	-3
01203	YVH1	0	-1	-1	-1
01254	OCA101	0	0	1	-1
01314	PPP1	0	0	0	0
01346	HPP2	0	0	0	0
01357	SDP101	0	0	0	0
01436	SIT4	-1	-1	-1	-1
01496	PPT1	-1	0	0	0
01498	AKP2	0	0	0	0
01518	PMU1	0	0	0	0
01519	EEP1	0	0	0	0
01532	INP52	0	0	0	0
01744	HAD1	-1	0	-1	0
01823	INM1	0	0	0	0
01864	NDX5	0	0	0	0
01877	GUA1	0	-2	-1	-1
01900	NDX1	0	0	0	0
01901	NDX2	0	0	0	0
02001	INP5203	0	0	0	0
02109	INP5201	-2	-2	-2	-2
02161	ASP1	0	0	0	0
02236	PPG1	-3	-1	-1	-1
02375	FIG4	0	0	0	0
02453	PTP5	0	-2	0	0
02470	PPP2	0	0	0	0
02487	PHS1	-3	-1	0	-3
02490	MRE11	-1	-2	0	-1
02681	APH3	0	0	0	0
02772	PMU101	0	0	0	0
02944	APH1	0	0	0	0
02986	YSA1	0	0	0	0
03014	CAX4	0	0	0	0
03052	PTC2	-1	0	-1	-1
03078	NPP1	0	0	0	0
03190	CCR4	-1	-1	0	-2
03202	CAC1	1	-1	0	-1
03222	DBR1	-1	-1	-1	-2
03262	INM101	0	0	0	0
03296	SIW14	-1	0	0	-2
03396	NPY1	0	0	0	0
03491	NDX3	0	0	0	0
03541	PTC7	0	0	0	0
03657	LDP1	0	0	0	0
03673	PPZ1	1	-2	0	-1
03679	ACY1	0	0	0	0
03765	TPS2	0	0	0	1
03871	LTP1	0	0	0	0
03893	SDP102	0	0	0	0
03949	PHO13	0	0	0	0
03963	OCA1	-1	0	0	-2
03984	YCH1	0	0	0	0
03996	GDA1	-1	0	0	0
04049	PPP5	0	0	0	0
04104	AKP3	0	0	0	0
04113	PTP3	0	0	0	0
04221	FBP26	-3	0	-2	0
04224	PSR1	-1	0	0	0
04268	APN2	0	0	0	0
04354	XPP1	0	0	0	0
04475	HPP3	0	0	0	0
04718	PCD101	0	0	0	0
04731	PCD102	0	0	0	0
04732	PCD1	0	0	0	0
04782	PPU1	0	0	0	0
04796	CNA1	-3	0	0	-1
04833	TEP1	0	0	0	0
04852	NDX4	0	0	0	0
05080	CWH43	0	0	0	0
05155	PTP2	-3	0	-1	-1
05286	LDP2	0	0	0	0
05301	CRN1	0	0	0	0
05306	PTC701	0	0	0	0
05529	HAD5	0	0	0	0
05567	PPP3	0	0	0	0
05568	PRY1	0	0	0	0
05892	SHB17	0	0	0	0
06064	PTP1	0	0	0	0
06065	SAC101	0	0	0	0
06122	HAD6	0	0	0	0
06132	HAD8	0	0	0	0
06141	DUT101	0	0	0	0
06232	HPP1	0	0	0	0
06236	NGL3	0	0	0	0
06251	PPP4	0	0	0	0
06418	PTC6	-1	0	0	-1
06499	DPP101	0	0	0	0
06587	OCA2	0	0	0	0
06647	CDC1	0	0	0	0
06698	HAD9	0	0	0	0
06966	AKP1	0	0	0	0
06967	APH2	0	0	0	0
06969	HAD7	0	0	0	0
07317	INP5202	0	0	0	0
07372	OXK1	-2	0	-1	0
07434	HAD3	0	0	0	0
07547	GPM1	0	0	0	0
07629	EPP1	0	0	0	0
07692	YND1	0	0	0	0
07740	HAD2	0	0	0	0

하기 표 9는 유전자 결실이 유전독성, ER 스트레스, 중금속 스트레스, 세포벽/막 스트레스에 미치는 영향을 확인한 결과이다.

		Genotoxic stress		ER stress		Heavy metal	Cell wall/membrane stress
H99 lD	*Name*	HU	MMS	TM	DTT	CDS	CFW	CR	SDS
00057	FPP1	0	0	0	0	0	0	0	0
00076	NDX6	0	0	0	0	0	0	0	0
00146	PBY101	0	0	1	0	0	0	0	0
00182	VPS29	0	0	-1	-1	-2	0	0	-2
00263	PTP4	0	0	0	0	0	0	0	0
00316	HAM1	0	0	0	0	0	0	0	0
00390	YMR1	0	0	0	0	-1	0	0	-1
00408	PPH3	0	-2	0	0	0	0	0	0
00427	PTC5	0	0	0	0	0	0	0	0
00498	CDC14	0	0	0	0	0	0	0	0
00500	PTC1	0	0	0	0	0	0	0	0
00554	ISC1	-1	0	0	-1	-1	0	0	0
00810	HAD4	0	-2	0	0	0	0	0	0
01054	SSU72	-3	-1	0	-3	-1	-1	-1	-2
01177	NEM1	-3	-3	0	-2	-1	-2	-2	-2
01203	YVH1	-2	-3	1	-1	0	0	0	-2
01254	OCA101	-1	0	0	-2	1	0	0	0
01314	PPP1	0	0	0	0	0	0	0	0
01346	HPP2	0	0	0	0	0	0	0	0
01357	SDP101	0	0	0	0	0	0	0	0
01436	SIT4	-2	-1	2	0	1	-1	-1	1
01496	PPT1	0	0	0	0	0	0	0	0
01498	AKP2	0	0	0	0	0	0	0	0
01518	PMU1	0	0	0	0	0	0	0	0
01519	EEP1	0	0	0	0	0	0	0	0
01532	INP52	0	0	0	0	0	0	0	0
01744	HAD1	0	0	1	0	0	-1	-1	-3
01823	INM1	0	0	0	0	0	0	0	0
01864	NDX5	0	0	0	0	0	0	0	0
01877	GUA1	0	0	0	-1	0	0	0	-3
01900	NDX1	0	0	0	0	-1	0	0	-1
01901	NDX2	0	0	0	0	0	0	0	0
02001	INP5203	0	0	0	0	0	0	0	0
02109	INP5201	-2	-2	2	-1	1	-2	-2	-2
02161	ASP1	0	0	0	0	0	0	0	0
02236	PPG1	-3	-3	-3	0	0	-2	-2	-3
02375	FIG4	0	0	0	0	-1	0	0	0
02453	PTP5	0	0	0	0	-1	0	0	0
02470	PPP2	0	0	1	0	0	0	0	1
02487	PHS1	-3	0	0	-2	-1	-3	-3	-2
02490	MRE11	-3	-3	-1	-1	-1	0	0	0
02681	APH3	0	0	0	0	0	0	0	0
02772	PMU101	0	0	0	0	0	0	0	0
02944	APH1	0	0	0	0	0	0	0	0
02986	YSA1	0	0	0	0	0	0	0	0
03014	CAX4	0	0	0	0	0	0	0	0
03052	PTC2	-1	-2	0	-1	-1	0	0	1
03078	NPP1	0	0	0	0	0	0	0	0
03190	CCR4	-2	0	3	-1	0	0	0	-1
03202	CAC1	-1	0	2	-1	0	0	0	1
03222	DBR1	-2	-2	2	0	-2	-1	-1	-3
03262	INM101	0	0	0	0	0	0	0	0
03296	SIW14	-3	-2	-1	-1	0	-1	-1	-2
03396	NPY1	0	0	0	0	0	0	0	0
03491	NDX3	0	0	0	0	0	0	0	0
03541	PTC7	0	0	0	0	0	0	0	0
03657	LDP1	0	0	0	0	0	0	0	0
03673	PPZ1	-1	-1	0	0	-2	0	-1	1
03679	ACY1	0	0	0	0	0	0	0	0
03765	TPS2	0	0	-3	0	0	0	0	-3
03871	LTP1	0	0	0	0	0	0	0	0
03893	SDP102	0	0	0	0	0	0	0	1
03949	PHO13	0	0	0	0	0	0	0	0
03963	OCA1	-2	0	-1	0	0	0	0	-1
03984	YCH1	0	0	0	0	0	0	0	0
03996	GDA1	-1	0	-2	-2	-1	0	0	-2
04049	PPP5	0	0	0	0	0	0	0	0
04104	AKP3	0	0	0	0	0	0	0	0
04113	PTP3	0	0	-2	0	0	0	0	-1
04221	FBP26	-1	0	0	-1	0	-1	-1	-3
04224	PSR1	0	0	0	0	1	0	0	-2
04268	APN2	0	-1	0	-1	0	0	0	0
04354	XPP1	0	-1	0	0	0	-1	-1	-1
04475	HPP3	0	0	0	0	0	0	0	0
04718	PCD101	0	0	0	0	0	0	0	0
04731	PCD102	0	0	0	0	0	0	0	0
04732	PCD1	0	0	0	0	0	0	0	0
04782	PPU1	0	0	0	0	0	0	0	0
04796	CNA1	-3	0	-3	-3	-1	-3	-3	-3
04833	TEP1	0	0	0	0	0	0	0	0
04852	NDX4	0	0	0	0	0	0	0	0
05080	CWH43	0	0	0	0	0	0	0	0
05155	PTP2	-2	-1	-2	-1	-2	-1	-2	0
05286	LDP2	0	0	1	-2	1	0	0	0
05301	CRN1	0	0	0	0	0	0	0	0
05306	PTC701	0	0	0	0	0	0	0	0
05529	HAD5	0	0	0	0	0	0	0	0
05567	PPP3	0	0	0	0	0	0	0	0
05568	PRY1	0	0	0	0	0	0	0	0
05892	SHB17	0	0	0	0	0	0	0	0
06064	PTP1	0	0	0	0	-2	0	0	1
06065	SAC101	0	0	0	0	0	0	0	0
06122	HAD6	0	0	0	0	0	0	0	0
06132	HAD8	0	0	0	0	0	0	0	0
06141	DUT101	0	0	0	0	0	0	0	0
06232	HPP1	0	0	0	0	0	0	0	0
06236	NGL3	0	0	0	0	0	0	0	0
06251	PPP4	0	0	0	0	0	0	0	0
06418	PTC6	0	0	0	0	0	0	0	-1
06499	DPP101	0	0	0	0	0	0	0	0
06587	OCA2	0	0	0	0	0	0	0	0
06647	CDC1	0	0	-1	0	0	0	0	-1
06698	HAD9	0	0	0	0	0	0	0	0
06966	AKP1	0	0	0	0	0	0	0	0
06967	APH2	0	0	0	0	0	0	0	0
06969	HAD7	0	0	0	0	0	0	0	0
07317	INP5202	0	0	0	0	2	0	0	-1
07372	OXK1	0	1	2	-1	1	0	0	-1
07434	HAD3	0	0	0	0	0	0	0	0
07547	GPM1	0	0	0	0	0	0	0	0
07629	EPP1	0	0	0	0	0	0	0	0
07692	YND1	0	0	-1	0	3	0	0	-1
07740	HAD2	0	0	0	0	0	0	0	0

하기 표 10은 유전자 결실이 항진균제 감수성에 미치는 영향을 확인한 결과이다.

		Antifungal drugs susceptibility
H99 lD	*Name*	AMB	FCZ	5FC	FDX
00057	FPP1	0	1	0	0
00076	NDX6	0	0	0	0
00146	PBY101	0	1	0	0
00182	VPS29	0	0	0	0
00263	PTP4	0	0	0	0
00316	HAM1	0	0	0	0
00390	YMR1	-1	0	0	-1
00408	PPH3	0	-1	0	0
00427	PTC5	0	0	0	0
00498	CDC14	0	0	0	0
00500	PTC1	0	-1	0	0
00554	ISC1	-2	0	0	-2
00810	HAD4	0	0	0	0
01054	SSU72	-1	0	-1	-3
01177	NEM1	-1	-3	-2	-3
01203	YVH1	0	0	0	-2
01254	OCA101	0	3	0	-1
01314	PPP1	0	0	0	0
01346	HPP2	0	1	0	1
01357	SDP101	0	0	0	0
01436	SIT4	-1	0	-3	-2
01496	PPT1	0	0	0	0
01498	AKP2	0	0	0	0
01518	PMU1	0	0	0	0
01519	EEP1	0	0	0	0
01532	INP52	0	0	0	0
01744	HAD1	-1	0	-1	0
01823	INM1	0	1	0	0
01864	NDX5	0	0	0	0
01877	GUA1	-3	0	-3	-3
01900	NDX1	0	0	0	0
01901	NDX2	0	0	0	0
02001	INP5203	0	0	0	0
02109	INP5201	-2	-2	-2	-2
02161	ASP1	0	0	0	0
02236	PPG1	-1	-2	-3	-3
02375	FIG4	0	0	0	0
02453	PTP5	0	0	0	0
02470	PPP2	0	0	1	0
02487	PHS1	-3	-3	0	-1
02490	MRE11	0	-1	-1	0
02681	APH3	0	0	0	0
02772	PMU101	0	0	0	0
02944	APH1	0	0	0	0
02986	YSA1	0	0	0	0
03014	CAX4	0	0	0	0
03052	PTC2	0	0	-2	-3
03078	NPP1	0	0	0	1
03190	CCR4	-2	-1	3	-1
03202	CAC1	0	-1	0	1
03222	DBR1	-2	-1	-2	0
03262	INM101	0	0	0	0
03296	SIW14	0	-3	0	-1
03396	NPY1	0	0	0	0
03491	NDX3	0	0	0	0
03541	PTC7	0	0	0	0
03657	LDP1	0	0	0	0
03673	PPZ1	0	0	1	-2
03679	ACY1	0	0	0	0
03765	TPS2	0	0	-1	1
03871	LTP1	0	0	0	0
03893	SDP102	0	0	0	-1
03949	PHO13	0	0	0	0
03963	OCA1	0	-2	0	-2
03984	YCH1	0	0	0	0
03996	GDA1	-1	0	-3	-2
04049	PPP5	0	0	0	1
04104	AKP3	0	0	0	0
04113	PTP3	0	-2	0	0
04221	FBP26	-2	1	-1	-1
04224	PSR1	0	0	0	3
04268	APN2	0	0	-2	0
04354	XPP1	0	0	0	1
04475	HPP3	0	0	0	0
04718	PCD101	0	0	0	0
04731	PCD102	0	0	0	0
04732	PCD1	0	0	0	0
04782	PPU1	0	0	0	0
04796	CNA1	0	-2	-3	-2
04833	TEP1	0	0	0	0
04852	NDX4	0	0	0	0
05080	CWH43	0	0	0	0
05155	PTP2	0	-2	-2	-3
05286	LDP2	0	0	0	0
05301	CRN1	0	0	0	0
05306	PTC701	0	0	0	0
05529	HAD5	0	0	0	0
05567	PPP3	0	0	0	0
05568	PRY1	0	0	0	0
05892	SHB17	0	0	0	0
06064	PTP1	0	0	0	0
06065	SAC101	0	0	0	0
06122	HAD6	0	0	0	0
06132	HAD8	0	0	0	0
06141	DUT101	0	0	0	0
06232	HPP1	0	0	0	0
06236	NGL3	0	0	0	0
06251	PPP4	0	0	0	0
06418	PTC6	0	-2	0	-2
06499	DPP101	0	0	0	0
06587	OCA2	0	0	0	0
06647	CDC1	0	0	0	-1
06698	HAD9	0	0	0	0
06966	AKP1	0	0	0	0
06967	APH2	0	0	0	0
06969	HAD7	0	0	0	0
07317	INP5202	-2	-1	0	-1
07372	OXK1	0	0	0	-1
07434	HAD3	0	0	0	0
07547	GPM1	0	0	0	0
07629	EPP1	0	0	0	0
07692	YND1	0	0	-1	-2
07740	HAD2	0	0	0	0

표현형 분석에 따르면 114개 유전자 중 60개의 유전자 변이(약 53%, 60/114)에서 적어도 하나의 식별가능한 표현형을 나타내었다. 표현형 변화를 나타내는 포스파타아제 중 43개 유전자(약 72%, 43/60)는 종전에 기능적으로 분석된 바가 없었다. 포스파타아제 현상 데이터를 해당 BLAST 매트릭스 데이터와 비교한 결과, 실시예 2에서 파쇄(disruption)할 수 없었던 25개의 추정 필수 포스파타아제와 복수 표현형 특성(multiple phenotypic traits)을 나타내는 포스파타아제는 진화적 보존 정도가 상대적으로 더 높다는 점을 발견했다.또한, 야생형 C. 네오포르만스 균주 H99S에 의한 감염 3일, 7일, 14일 및 21 일 후(days post-infection, dpi) 수득된 조직들(폐, 뇌, 비장 및 신장)에서 각 포스파타아제 유전자의 발현 수준을 평가하여 뮤린모델 감염 동안 139 개의 포스파타아제 유전자 각각의 전사 조절 양상을 모니터링했다. 전사 양상 모니터링을 위해 139개의 새로운 포스파타아제 프로브 및 nCounter 유전자 발현 프로파일이 사용되었다. 각 포스파타아제의 생체 내 발현 수준은 8 개의 하우스 키핑 유전자의 평균 생체 내 발현 수준으로 정규화되었고 기초 성장 조건 하의 수준과 비교되었다.

균주 H99S에 의한 초기 감염 동안(감염 3 내지 7일 후, 3-7 dpi) 폐, 뇌, 신장 및 비장에서 많은 수의 포스파타아제 유전자의 생체 내 발현이 증가하였고, 표현 형질에 관여하는 포스파타아제의 유전자 각각의 생체 내 발현도 변화하였다. 일반적으로 비강 내 흡입 감염 모델의 초기 감염 단계에서는 기존의 곰팡이 부담 분석(fungal burden assay)의 검출 한계로 인해 cryptococcal CFU가 폐를 제외한 뇌 및 기타 기관에서 거의 검출되지 않는다. 그러나 본 연구에서는 증폭없이 단일 유전자 전사체를 검출할 수 있는 Nanostring nCounter 플랫폼을 사용했다. 따라서, 초기 감염 기간 동안 적은 수의 C. neoformans 세포가 폐에서 다른 기관으로 혈류 적으로 전파되면 phosphatase 전사체가 감염 후 3 내지 7일(dpi)에 검출될 수 있다.

실시예 4: C. 네오포르만스의 병원성을 지배하는 포스파타아제

C. 네오포르만스의 병원성에 필요한 포스파타아제를 확인하기 위해 Galleria mellonella 유충 모델을 이용한 병독성(virulence) 분석 및 (2) 시그니쳐 태그 돌연변이유발(signature-tagged mutagenesis, STM)에 기반한 쥐과(murine) 흡입 감염 모델의 폐 및 뇌에 대한 감염성 분석을 수행하여 대규모 감염성 및 독성 분석을 실시했다.

곤충에 대한 병독성 분석 결과 23개의 포스파타아제 유전자(CNA1, TPS2, CAC1, PTP2, VPS29, PPH3, GDA1, YVH1, SSU72, PHS1, SIW14, DBR1, PSR1, YND1, INP5201, INP5202, HAD1, SIT4, PPG1, GUA1, NEM1, FBP26, OCA101)가 결실되면 치사율이 감소하였다. 따라서 이들 유전자는 병독성과 관련된 것으로 확인되었다. (도 2 참고)

STM 기반 쥐의 폐 및 뇌 감염성 분석 결과 24개의 포스파타아제 유전자(TPS2, CNA1, VPS29, PHS1, SIW14, CAC1, SSU72, PPG1, INP5201, CCR4, DBR1, GUA1, YMR1, NEM1, OCA1, PTP2, FBP26, PSR1, MRE11, CDC1, XPP1, SDP102, SDP101, OCA101)가 폐와 뇌에서 ste50 보다 STM score가 낮아졌으므로 감염성과 관련된 것으로 확인되었으며, 이 중 67% (16/24, TPS2, CNA1, VPS29, PHS1, SIW14, CAC1, SSU72, PPG1, INP5201, DBR1, GUA1, NEM1, PTP2, FBP26, PSR1, OCA101)는 곤충 모델의 병독성 분석에서 확인된 유전자와 중복되었다. (도 3 참고, Ire1은 감염성이 낮아진것에 대한 control이고, ste50은 WT을 대표함)

이 중 CNA1 (칼시뉴린의 촉매 서브 유닛), CAC1 (adenylyl cyclase), HAD1 (할로산 탈할로게나제) 및 PTP2 (포스포티로신 포스파타아제)는 종전 연구에서 C. 네오포르만스의 병독성과 연관된 것으로 보고된 바 있기 때문에 상기 분석 결과의 신뢰성을 높여준다.

곤충 및 쥐과 흡입 감염 모델에서 병원성을 나타낸 31개의 병원성 관련 포스파타아제 돌연변이(CNA1, TPS2, CAC1, PTP2, VPS29, PPH3, GDA1, YVH1, SSU72, PHS1, SIW14, DBR1, PSR1, YND1, INP5201, INP5202, HAD1, SIT4, PPG1, GUA1, NEM1, FBP26, OCA101, CCR4, YMR1, OCA1, MRE11, CDC1, XPP1, SDP102, SDP101) 중 SDP101을 제외한 30 개는 적어도 하나의 표현형 특성을 보였으며, 이 중 상당수는 다른 감염 조직보다 폐에서 더 높은 발현을 나타냈다.

31개 유전자의 In vitro 표현형 확인결과는 다음과 같다. 막 완전성(membrane integrity) (26/31; 84 %), DNA 손상 반응 (20/31; 65 %), 멜라닌 생성 (18/31; 58 %), 세포벽 완전성(cell wall integrity) (13/31; 42 %) 및 37 ℃에서 성장 (14/31; 45 %).

그러나, sdp101Δ 변이는 in vitro 표현형을 나타내지 않았다. SDP101과 유사한 이중 특이성 MAPK 포스파타아제인 SDP102의 결실은 약간의 표현형 변경과 감염성 감소를 초래하므로, SDP101 및 SDP102는 C. 네오포르만스의 병원성에 중복된 역할(redundant role)을 할 수 있음을 시사한다. SDP101 및 SDP102 사이의 기능적 상관 관계를 확인하기 위해 spd101Δ sdp102Δ 이중 돌연변이 균주를 제작하려고 시도했지만 성공하지 못했다.

마찬가지로 INP5201은 INP5202와 유사하지만 inp5201Δ inp5202Δ 이중 돌연변이를 제작하지 못했다. 이는 inp5201Δ 돌연변이가 30℃에서 심각한 성장 결함을 보였기 때문일 수 있다.

따라서 SDP101 및 SDP102의 변이, 그리고 INP5201 및 INP5202의 변이는 합성 치사 관계(synthetic lethal relationship)를 가질 수 있다.

반대로, OCA1과 OCA101도 유사하지만, 성공적으로 oca1Δ oca101Δ 이중 돌연변이를 얻었다. 그러나 단일 돌연변이와 비교하여 oca1Δ oca101Δ 이중 돌연변이에서 부가되거나 시너지를 나타내는 표현형 특성을 찾지 못했다. 따라서 OCA1 및 OCA101은 C. 네오포르만스의 병원성에 독립적으로 기여할 수 있다.

31 개의 병원성 관련 포스파타아제 중 5종(TPS2, SIW14, HAD1, OCA101, 및 OCA1)은 인간에서 명백한 상동체(ortholog)가 없다. 따라서 상기 5종의 병원성 관련 포스파타아제는 우수한 크립토코커스 특이적 항진균제(anti-cryptococcal) 타겟이 될 수 있다. TPS2, HAD1 및 OCA1은 칸디다스 알비칸스(C. albicans)의 병독성에도 중요한 역할을 하므로, TPS2, HAD1 및 OCA1를 표적으로 하는 약물은 광범위한 항진균 활성을 가질 수 있다.

실시예 5: 포유류 체온에서의 성장에 관여하는 포스파타아제

실시예 4에서 선별된 31종의 C. 네오포르만스의 병원성 관련 포스파타아제 (CNA1, TPS2, CAC1, PTP2, VPS29, PPH3, GDA1, YVH1, SSU72, PHS1, SIW14, DBR1, PSR1, YND1, INP5201, INP5202, HAD1, SIT4, PPG1, GUA1, NEM1, FBP26, OCA101, CCR4, YMR1, OCA1, MRE11, CDC1, XPP1, SDP102, SDP101)의 병리학적 기능을 규명하였다.

첫번째로, 포유류 체온에 대한 내열성은 인간 곰팡이 병원체의 중요한 병독성 인자이므로 30℃ 및 37℃에서 각 돌연변이의 성장을 정량적으로 측정했다. gua1Δ, yvh1Δ, fbp26Δ, siw14Δ, dbr1Δ, ccr4Δ, ppg1Δ, nem1Δ 및 inp5201Δ 돌연변이체는 30℃ 및 37℃ 모두 성장이 저해되었다. (상기 표 5 및 도 4 참고) ccr4Δ, ppg1Δ, nem1Δ, dbr1Δ 및 inp5201Δ 돌연변이체는 30℃ 보다 37℃에서 더 많은 성장 결함을 나타냈다. ssu72Δ, phs1Δ, mre11Δ, tps2Δ 및 cna1Δ 돌연변이체는 37℃에서 성장이 저해되었으나 30℃에서는 영향을 받지 않았다.

총 14 개의 포스파타아제 돌연변이체(gua1Δ, yvh1Δ, phs1Δ, nem1Δ, cna1Δ, ppg1Δ, siw14Δ, inp5201Δ, ccr4Δ, dbr1Δ, ssu72Δ, tps2Δ, mre11Δ, fbp26Δ)는 WT과 비교하면 37℃에서 성장이 저하되었고, 뮤린 감염성 또는 곤충 독성이 감소되었다. 이 중 ppg1Δ, cna1Δ 및 tps2Δ 돌연변이체는 37℃에서 가장 심각한 성장 결함을 나타냈고, 배양 기간을 더 연장하여도 WT 수준으로 성장하지 않았다. ppg1Δ, cna1Δ 및 tps2Δ 돌연변이체는 폐 및 뇌의 STM 값이 크게 감소한 것으로 나타났다. oca101Δ 돌연변이체는 30℃에서 다소 성장 장애를 나타냈지만 37℃에서는 성장이 저해되지 않았으므로, Oca101의 C. neoformans 내에서 병원성 관련 역할은 온도와 관련이 없음을 나타낸다. 상기 내용을 종합해볼 때, C. 네오포르만스의 37℃에서의 생장 능력이 병원성과 상당히 밀접한 관계가 있음을 시사한다.

실시예 6: 멜라닌 및 캡슐 생산에 관여하는 포스파타아제

C. 네오포르만스는 병독성 인자로서 폴리페놀 색소인 멜라닌 및 다당류(polysaccharide) 캡슐을 가지고 있으며 둘다 항식세포(antiphagocytic) 활성에 기여한다. 이 중 멜라닌 색소는 활성산소종 소거 활성(scavenging activity)에 의해 항산화제 역할도 한다.

6-1. 멜라닌 생산 관여 포스파타아제

Niger seed medium에서 멜라닌 생성에 결함이 있는 19 개의 포스파타아제 돌연변이체 중 13 개의 돌연변이체(mre11Δ, ccr4Δ, vps29Δ, yvh1Δ, fbp26Δ, inp5201Δ, cac1Δ, ptp2Δ, ptc2Δ, dbr1Δ, ppg1Δ, nem1Δ 및 gua1Δ)는 L-DOPA 및 에피네프린 배지에서도 멜라닌 생성 결함을 나타냈다.(표 6 및 도 5 참고)

ptc2Δ 돌연변이를 제외한 나머지 돌연변이는 감염성 또는 병독성이 감소하였으며, 이는 멜라닌 생성이 병원성과 강한 상관 관계가 있음을 시사한다.

대조적으로, SIW14 결실은 모든 멜라닌 유도 배지에서 멜라닌 생성을 증가 시켰지만(도 5) 오히려 병독성을 약화시켰으므로(도 2), SIW14가 매개하는 다른 세포 기능이 병독성을 촉진할 수 있음을 시사한다.

다음으로 상기 포스파타아제들이 영양 결핍 조건 하에서 C. 네오포르만스의 멜라닌 생산을 위한 속도 제한 효소인 laccase를 코딩하는 LAC1 유전자 발현 유도에 직접 관여하는지 여부를 조사했다.

도 6에 따르면, PTP2, CCR4, INP5201, CAC1, DBR1, FBP26, GUA1, NEM1 및 PPG1의 결실은 영양 결핍시 LAC1 유전자의 발현 유도 정도가 현저하게 감소되었고, 특히 PTP2, CCR4, CAC1 및 PPG1의 결실은 LAC1 유전자 발현 유도가 강력히 억제되었다.

Ptp2는 Hog1 MAPK의 음성 피드백 조절자로 보고되었다. Hog1 결실은 LAC1 유도 및 멜라닌 생성을 증가시킨다. 최근 본 발명자에 의해 LAC1 유전자의 발현 유도는 Bzp4, Usv101, Hob1 및 Mbs1 4 가지 핵심 TF에 의해 제어되는 것으로 보고되었다. 이 중 BZP4 및 HOB1 유전자의 발현은 영양 결핍에 의해 유도되고 BZP4 유도는 HOB1에 의존한다. 따라서 LAC1 유전자 발현 유도정도를 조절하는 포스파타아제가 BZP4 및 HOB1 유전자의 유도를 조절하는지 여부를 조사했다. 대부분의 멜라닌 결손 포스파타아제 돌연변이에서 영양 결핍에 의한 BZP4 유전자 발현 유도 정도가 현저하게 감소했지만, 특히 CCR4 결실은 BZP4의 발현 유도 정도를 크게 감소시켰고, 특히 영양 결핍시의 HOB1 발현 유도 정도를 크게 억제했다(도 7). 따라서 Ccr4-Hob1-Bzp4 의존적 신호 전달 경로는 C. neoformans에서 LAC1 유전자 발현 유도 및 멜라닌 생성에 중요한 역할을 하는 것으로 보인다.

6-2. 캡슐 생산 관여 포스파타아제

캡슐 생산에 관여하는 포스파타아제를 조사했다. 캡슐 생산은 농축세포용적(packed cell volume)에 의해 정량적으로 측정하였다. Cac1, Ptp2, Psr1, Ndx5, Hpp2, Oca1, Sdp102, Ynd1, Ngl3, Ppp5 및 Cwh43의 결실은 농축세포용적을 감소시켰으며 Inp5201, Dbr1, Phs1, Cdc1, Cna1, Sit4, Ccr4, Nem1, Pcd102 및 Fig4의 결실은 농축세포용적을 증가시켰다. (표 6 및 도 8 참고)

이들 돌연변이체의 실제 캡슐 두께를 조사했다. 이 중 6 개 돌연변이체 (cac1Δ, sdp102Δ, ndx5Δ, ptp2Δ, ynd1Δ 및 psr1Δ)는 세포 부피 분석에서 표현형의 농축세포용적의 감소와 일치하는 캡슐 생산 감소를 나타냈으며, 이들 중 5 개 (cac1Δ, ptp2Δ, sdp102Δ, ynd1Δ, psr1Δ)는 병독성이 감소되었다. 대조적으로, inp5201Δ 돌연변이는 캡슐 생산이 크게 향상되었으나 병독성은 크게 감소되었는데(STM <-7), 이는 멜라닌 생산 결함에서 기인한 것으로 생각된다.

전반적으로 멜라닌과 다당류 캡슐을 생산하는 능력은 C. 네오포르만스의 잠재적 병원성과 높은 상관 관계를 나타내었다.

실시예 7: 레트로머(retromer) 복합체와 C. 네오포르만스의 병독성

병독성 관련 포스파타아제 중 Vps29 (CNAG_00182)는 S. cerevisiae에서 처음 발견된 레트로머(retromer) 복합체의 구성 요소로 추정되고 있다.

효모의 레트로머는 골지후 세포기관(post-Golgi organelles)으로부터 용해 구획(lytic compartment)으로의 단백질 세포내 수송을 매개하는 세포질 이종오량체 단백질 복합체(cytosolic heteropentameric protein complex)이다. 효모 레트로머는 Vps29, Vps35 및 Vps26이 포함된 CRC(Cargo-Recognition Core) 컴플렉스와 Vps5 및 Vps17이 포함된 SNX(Membrane-Deforming Sorting Nexin) 컴플렉스로 구성된다.

Vps29의 기능이 레트로머 복합체의 보존된 역할에서 비롯되었는지 여부를 확인하기 위해 C. 네오포르만스의 다른 레트로머 구성 요소를 기능적으로 특성화했다. C. 네오포르만스 유전체에서 Vps35 (CNAG_01837), Vps26 (CNAG_01426), Vps5 (CNAG_01315) 및 Vps17 (CNAG_00508)와 상동성있는 단백질을 인코딩하는 나머지 레트로머 구성요소 유전자를 모두 확인했다. 이는 레트로머 복합체가 병원성 곰팡이에서 진화적으로 보존되어 있음을 시사한다.

H99 균주에서 각 유전자를 삭제하고 표현형 분석을 수행하였다. VPS35 및 VPS26의 결실은 VPS29 결실보다 더 극적인 표현형 변화를 가져 왔으며, 이는 Vps35 및 Vps26이 C. 네오포르만스에서 중요한 CRC 복합 성분임을 의미한다. 대조적으로 SNX의 구성요소인 VPS5 및 VPS17 결실은 표현형 변화가 VPS29 결실과 비교하면 상대적으로 크지 않았다.(도 9)

곤충 살해 분석에서 CRC 복합체 돌연변이는 독성이 현저히 감소된 반면 SNX 복합체 돌연변이는 독성이 야생형 균주와 큰 차이가 없었다. (도 10) 그러나 쥐과(murine) 기반 STM 분석에서 CRC 복합체 돌연변이 및 SNX 복합체 돌연변이는 폐 및 뇌 감염성이 현저히 감소되었다. (도 11) 실험 결과를 종합하면, 레트로머 CRC 복합체 및 SNX 복합체 모두가 C. 네오포르만스의 병원성에 중요하다는 것을 의미한다.

실시예 8: C. 네오포르만스의 O- 만노실화를 조절하는 gda1 및 ynd1

S. cerevisiae에서 Gda1 및 Ynd1은 GDP-만노스 및 GMP 사이의 역수송 교환 비율(antiport exchange ratio)에 영향을 주어 O-linked 및 N-linked된 당단백질(glycoprotein) 및 당스핑고지질(glycosphingolipid)의 만노실화(mannosylation)를 조절하는 골지막 결합 아피라제(golgi membrane bound apyrase)이다. Gda1은 GDP에 고도로 특이적인 활성(highly specific activity)을 나타내는 반면 Ynd1은 훨씬 더 광범위한 활성 스펙트럼을 나타낸다. 따라서 GDA1 및 YND1이 이중 결실되는 경우 하나만 결실되는 것보다 더 심각한 당화 결손(glycosylation defect)을 초래한다.

C. 네오포르만스의 gda1Δ 변이 및 ynd1Δ 변이가 O-glycosylation에서 결함을 나타내는지 여부를 조사하기 위해 야생형, gda1Δ 균주 및 ynd1Δ 균주의 O- 글리칸 프로파일을 비교했다.

C. 네오포르만스의 세포벽 만노단백질(cell wall mannoproteins)인 cwMPs에 결합된 O-결합 올리고당(O-linked oligosaccharides)를 하이드라진분해(hydrazinolysis)로 획득하고, 2-aminobenzoic acid (2-AA)로 표지하고, 형광 검출 기능이 있는 HPLC를 사용하여 분석하였다.

도 12에 따르면, C. 네오포르만스 야생형 균주의 O-결합 올리고당은 주로 2 내지 4개의 만노스 잔기(Man2-Man4; M2-M4)로 구성되었으며, 약간의 자일로스(X1M2-X1M4) 포함 O-글리칸종(O-glycan species) 및 약간의 α1,2-만노트리오스(α1,2-mannotriose, M3*)종을 포함하였다. 그러나, gda1Δ 돌연변이의 O-글리칸 프로파일은 M4 피크가 극적으로 감소했으며 M1 피크는 야생형 균주에 비해 증가했다. 특히, 야생형에서는 함량이 낮았던 자일로스 함유종이 gda1Δ 균주의 O-글리칸에서 증가하였다.

도 13에 따르면, ynd1Δ 돌연변이체는 M1 피크가 증가하고 M4 피크가 다소 감소했지만, 그 감소된 정도는 gda1Δ 돌연변이체의 M4 피크 감소에 이르진 않았다. 상기 O-글리칸 프로필의 변화는 gda1Δ 균주 및 ynd1Δ 균주에서 GDPase 활성이 감소하여 세포질에서 골지 내강(lumen of the Golgi)으로의 GDP-mannose 공급이 저하됨으로써 O-글리칸의 신장 과정에 심각한 결함이 있음을 나타낸다. (도 14 참고) 상기 실험 결과를 기초로 C. 네오포르만스의 gda1 및 ynd1은 골지 N-글리코실화 및 O-글리코실화에 필요한 막결합 아피라제(membrane bound apyrase)를 암호화하는 것으로 생각된다.

gda1Δ는 ynd1Δ보다 주요 O-글리칸이 극적으로 감소하였으며, 이는 Gda1 단백질이 주요 O-글리칸 생합성 경로에서 GDP-만노스 공급을 담당하는 주요 GDPase임을 의미한다. ynd1Δ의 캡슐 크기 감소는 Ynd1 단백질이 캡슐 생합성을 위한 GDP-만노스 공급에도 관여할 수 있음을 시사한다. 그러나, gda1Δ ynd1Δ 이중 돌연변이는 얻지 못했다. 이는 두 단백질이 C. 네오포르만스에서 합성 치사 관계임을 의미한다. 곤충 살해 분석에서 gda1Δ 변이 및 ynd1Δ 변이 모두 병독성이 감소하였기 때문에, 실험결과를 종합하면 O-만노실화가 C. 네오포르만스의 독성에 중요하다는 것을 알 수 있다.

실시예 9: 혈액-뇌 장벽(BBB) 통과(crossing)에 관여하는 포스파타아제

C. 네오포르만스의 인체 감염시 가장 큰 문제는 치명적인 수막뇌염을 일으키는 뇌 감염이다. 모든 포스파타아제 돌연변이체에 대한 뇌 STM 점수(brain STM score)는 일반적으로 폐 STM 점수와 유사했지만 일부는 낮은 뇌 STM 점수를 나타냈다. (도 3 참고: TPS2, YMR1, FBP26, MRE11, CDC1 및 XPP1). 그러나 비강 내 흡입(intranasal inhalation pass)을 통해 투여된 포스파타아제 돌연변이 균주는 폐를 먼저 통과하기 때문에 뇌에 도달하는 돌연변이 균주는 흡입된 돌연변이풀 대비하여 분포가 균일하지 않아 폐와 뇌 STM 점수를 직접 비교하기가 어려운 문제가 있었다.

뇌 감염에서 포스파타아제의 역할을 규명하기 위해, 37℃에서 성장이 히트맵 표기상 -2 이상으로 현격하게 감소된 변이를 제외한 나머지 병원성 관련 포스파타아제 돌연변이체를 이용하여 BBB를 통과하는(traverse) 능력을 모니터링했다.

도 15에 따르면, 5개 변이체(xpp1Δ, ssu72Δ, siw14Δ, sit4Δ 및 gda1Δ)는 BBB 통과능력이 현저히 감소한 것으로 나타났다. BBB에 대한 부착(adhesion)이 효과적인 BBB 통과를 위한 전제 조건일 수 있기 때문에 BBB-adhesion assay를 실시하였다. 도 16에 따르면 gda1Δ을 제외한 xpp1Δ, ssu72Δ, siw14Δ 및 sit4Δ 돌연변이체는 BBB 부착이 감소된 것으로 나타났다. 실험결과에 따르면 gda1Δ에 의한 단백질 또는 지질의 O-만노실화 감소가 BBB 통과에 영향을 미치지만 BBB 부착에는 관여하지 않는 것으로 생각된다.

C. 네오포르만스를 in vitro BBB 통과 및 접착 분석에 사용한 조직 배양 배지에 37℃로 배양한 결과 성장이 활발하지 않음을 발견했다. 이는 낮은 포도당 농도 (0.1 % 포도당) 때문일 수 있다.

본 발명자는 최근 논문에서 in vitro의 숙주 모방 조건(HMC(host-mimic conditions); 5 % CO₂, 37℃, 10% FBS를 포함하는 RPMI 배지)에 의해 BBB 부착을 촉진할 수 있는 TF(PDR802, FZC31 및 GAT201)들이 발현 유도될 수 있음을 보고하였다.

이에 기초하여, xpp1Δ, ssu72Δ, siw14Δ 및 sit4Δ 돌연변이체에서 숙주모방조건(HMC)으로 뇌감염 관련 유전자(이노시톨 수송체 유전자(ITR1a 및 ITR3c) 및 MPR1) 및 상기 TF 유전자의 발현이 유도될 수 있는지를 조사했다.

도 17에 따르면, SSU72 결실은 HMC 매개 MPR1 발현 유도를 가장 현저하게 감소시켰다. 이는 ssu72Δ 돌연변이의 BBB 통과 및 부착 결함이 MPR1 발현 유도 감소에 의해 발생할 수 있음을 시사한다. 그러나 도 16에 따르면 ssu72Δ 돌연변이는 mpr1Δ 돌연변이보다도 BBB 통과 및 부착에서 결함이 많기 때문에, Ssu72의 다른 세포적 기능이 BBB 통과 및 부착에 관여할 수 있다. SIT4 결실 및 GDA1 결실은 HMC 매개 ITR3c 발현 유도를 현저하게 감소시켰다. GDA1 결실은 또한 FZC31 유도에 영향을 미쳤다. 그러나 GAT201 및 PDR802의 발현은 SIT4, SIW14, SSU72, GDA1 또는 XPP1의 결실에 의해 영향을 받지 않았다.

C. 네오포르만스에 의한 뇌 감염과 관련된 신호 네트워크를 통합적으로 이해하기 위해, BBB 통과와 관련된 포스파타아제, TF, 및 키나아제에 대한 연구 데이터를 결합하고 STRING 분석을 사용하여 기능적 유전자 네트워크를 생성했다.

도 18에 따르면, 글루코스 감지(Sit4-Snf1-Gal83), RNA 가공(RNA processing)(Ssu72) 및 퓨린 대사(Xpp1-Met3)와 관련된 유전자가 C. 네오포르만스의 BBB 통과에 중요하다는 것을 발견했다.

상기 실험결과를 종합하면, C. 네오포르만스는 뇌 감염을 위해 복잡한 신호 네트워크를 활용함을 나타낸다.

실시예 10: 곰팡이 병원성 관련 포스파타아제 비교

C. 네오포르만스의 포스파타아제 돌연변이의 병독성 데이터 및 다른 식물 또는 동물 병원성 진균의 데이터와 비교하여 핵심적인 병원성 관련 포스파타아제를 선별했다.

도 19에 따르면, 인간 병원균인 크립토코커스 네오포르만스 및 칸디다 알비칸스(Candida albicans)에서 일치하는 13 개의 포스파타아제(Cna1/Cmp1, Sit4, Oca1, Yvh1, Sdp101/Cpp1, Ptp2/Ptp3, Cac1/Cyr1, Ccr4, Had1/Rhr2, Tps2, Inp5201/Inp51, Ppg1 및 Gua1)는 병원성을 나타내기 위한 핵심적인 포스파타아제로 생각된다. 13 개의 포스파타아제 중 CnaA, SitA 및 OrlA(Tps2 ortholog)는 아스퍼질러스 푸미가투스(Aspergillus fumigatus)의 병독성에도 관여하는 것으로 확인되었다. (SitA는 A. fumigatus의 Sit4에 대한 ortholog)

푸사리움 그라미네아룸(Fusarium graminearum)의 병원성 관련 포스파타아제와 비교했을 때 동물 및 식물 곰팡이 병원균의 병독성에 8 가지 포스파타아제(Sit4, Yvh1, Sdp2 / Msg5 (Sdp101 orthologue), Ptp2, Ac1(Cac1 orthologue), Tps2, Inp53 (Inp5201 orthologue) 및 Ppg1)가 필요한 것으로 나타났다. Sit4는 TOR 경로에, Cac1은 cAMP 경로에, Ppg1과 Yvh1은 세포 성장, 영양소 감지 및 곰팡이 병원체의 스트레스 반응에 관여한다. Cna1 및 Had1 매개 칼시뉴린 경로, Tps2 매개 트레할로스 경로 및 Msg5 매개 Mpk1/Slt2 MAPK 경로는 모두 세포벽 무결성 유지에 필요하다. HOG 경로의 주요 음성 피드백 조절제인 Ptp2는 곰팡이 병원체의 적응 및 스트레스 반응에 관여한다. Inp51, Inp52 및 Inp53은 소포 수송(vesicle trafficking), 액틴 세포골격(actin cytoskeleton) 및 세포벽 무결성(cell wall integrity)을 제어하는 포스포이노시티드 신호 전달(phosphoinositide signalling)에 관여한다.

이러한 데이터를 기반으로, 세포 성장, 영양소 감지(nutrient sensing), 세포벽 무결성, 스트레스 반응 및 포스포이노시티드 신호 전달과 관련된 포스파타아제 및 신호 전달 경로는 곰팡이 병원성에서 중추적인 역할을 하는 것으로 판단된다.

그러나 PPH3 결실은 C. neoformans 및 F. graminearum의 병독성을 감소 시키지만 C. albicans의 병독성을 향상시킨다. 이와 대조적으로, ptc2 또는 ptc3의 결실은 각각 C. albicans 또는 F. graminearum 의 병독성을 감소시키지만 C. neoformans 병독성을 감소시키지 않는다. 따라서 포스파타아제는 곰팡이의 종류마다 병독성에 관여하는 정도의 차이가 있을 수 있다.

표현형의 변화를 나타내지 않은 54개의 돌연변이체는 감염성 및 병독성의 결함을 나타내지 않았다. 상기 54개의 포스파타아제는 C. 네오포르만스의 병리학적 기능에 관여하지 않는 것으로 판단된다.

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Claims

크립토코커스 네오포르만스에 후보물질을 접촉시키는 단계;
크립토코커스 네오포르만스의 체온에 대한 내열성을 조절하는 포스파타아제를 발현하는 유전자인 SSU72; 및 GUA1, YVH1, PHS1, NEM1, SIW14, INP5201, DBR1, MRE11, 및 FBP26으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유전자의 mRNA 또는 이로부터 발현된 단백질의 발현수준을 측정하거나, 또는 단백질의 활성을 측정하는 단계; 및
상기 측정된 발현수준 또는 활성이 후보물질과 접촉하지 않은 대조군보다 유의하게 감소한 경우 상기 후보물질을 항진균 활성이 있는 것으로 결정하는 단계를 포함하는, 크립토코커스 네오포르만스에 대한 항진균제 스크리닝 방법.
삭제
제1항에 있어서,
상기 mRNA 발현 수준의 측정은 역전사 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소 반응, 실시간 역전사 중합효소반응, RNase 보호 분석법(RPA), 노던 블롯팅, DNA 칩(Microarray) 또는 RNA sequencing 분석으로 수행하는 것인,
항진균제 스크리닝 방법.
제1항에 있어서,
상기 단백질의 발현 수준 측정은 웨스턴 블랏, ELISA (enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 조직면역 염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), 유세포분석(Fluorescence Activated Cell Sorter, FACS), 또는 단백질 칩(protein chip) 으로 수행하는 것인,
항진균제 스크리닝 방법.