KR102517749B1 - Pharmaceutical formulation for treating vitiligo - Google Patents
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Abstract
본 발명은 피브리노겐을 포함하는 제1 컴파트먼트; 및 멜라닌세포와 지방유래 성체줄기세포의 혼합 세포 및 트롬빈을 포함하는 제2 컴파트먼트로 구성된, 백반증 치료용 약학 제제를 제공한다. 본 발명의 약학 제제는 피브리노겐 및 트롬빈의 가교화를 통하여 멜라닌세포와 지방유래 성체줄기세포의 혼합 세포를 균일하게 투여할 수 있다.The present invention is a first compartment containing fibrinogen; and a second compartment containing mixed cells of melanocytes and adipose-derived adult stem cells and thrombin. The pharmaceutical formulation of the present invention can uniformly administer mixed cells of melanocytes and adipose-derived adult stem cells through crosslinking of fibrinogen and thrombin.
Description
본 발명은 백반증 치료용 약학 제제에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 피브리노겐 및 트롬빈의 가교화를 통하여 멜라닌세포와 지방유래 성체줄기세포의 혼합 세포를 균일하게 투여할 수 있는 백반증 치료용 약학 제제에 관한 것이다.The present invention relates to a pharmaceutical formulation for the treatment of vitiligo, and more particularly, to a pharmaceutical formulation for the treatment of vitiligo, which can uniformly administer mixed cells of melanocytes and adipose-derived adult stem cells through crosslinking of fibrinogen and thrombin. .
백반증(vitiligo)은 멜라닌세포(melanocytes)의 상실로 인하여 야기되는 탈색소 질환이다. 재생의학의 발달에 따라, 줄기세포를 이용한 다양한 세포 치료법이 연구되고 있으며, 백반증 치료를 위하여 피부에서 분리해낸 멜라닌세포를 이식하는 세포 치료법이 또한 연구되고 있다. 백반증 치료를 위한 세포 치료법은 자가 표피를 이식하거나 멜라닌세포를 체외에서 배양하여 이식하는 방법 등을 포함한다. Vitiligo is a depigmentation disease caused by loss of melanocytes. With the development of regenerative medicine, various cell therapies using stem cells are being studied, and cell therapies in which melanocytes isolated from the skin are transplanted for the treatment of vitiligo are also being studied. Cell therapy for the treatment of vitiligo includes a method of transplanting autologous epidermis or culturing and transplanting melanocytes in vitro.
그러나 멜라닌세포는 순수 분리가 어렵고, 체외 배양에 따른 변형 가능성이 높고 증식속도가 느린 문제점이 있다. 이러한 문제점을 해결하기 위해 각질형성세포(keratinocytes) 혹은 섬유아세포(fibroblasts) 등의 세포와의 혼합이식이 시도된 바 있다(대한민국 특허등록 제10-0806695호). 최근, 본 출원인은 지방유래 성체줄기세포(예를 들어, 지방유래 간엽줄기세포)와의 공동 배양(혹은 혼합 배양) 방법을 통하여 멜라닌세포의 수를 증가시키는 방법을 보고한 바 있다(대한민국 특허등록 제10-1266943호, Kim, et. al., Co-culture of melanocytes with adipose-derived stem cells as a potential substitute for co-culture with keratinocytes. Acta Derm Venereol (2012) 92:16-23, Lim, et al., Adipose-derived stem cells improve efficacy of melanocyte transplantation in animal skin. Biol Ther (2014) 22(4):328-333). 간엽줄기세포는 인체 여러 부위에서 분리가 가능하며, 지방조직에서 유래한 간엽줄기세포(adipose tissue-derived stem cells, ASCs)는 원료조직을 쉽게 많은 양을 얻을 수 있으면서 채취에 따른 인체의 부담이 매우 낮은 장점이 있다. 따라서, 지방유래 간엽줄기세포 및 멜라닌세포의 사용은 각질형성세포를 이용할 경우에 발생하는 원료 조직의 수급에 따른 어려움과 체외 배양 시에 제한적인 생산량을 해결할 수 있는 것으로 기대된다. However, melanocytes have problems in that they are difficult to isolate from pure cells, have a high possibility of deformation due to in vitro culture, and have a slow proliferation rate. In order to solve this problem, a mixed transplant with cells such as keratinocytes or fibroblasts has been attempted (Korean Patent Registration No. 10-0806695). Recently, the present applicant has reported a method for increasing the number of melanocytes through co-cultivation (or mixed culture) with adipose-derived adult stem cells (eg, adipose-derived mesenchymal stem cells) (Korean Patent Registration No. No. 10-1266943, Kim, et.al., Co-culture of melanocytes with adipose-derived stem cells as a potential substitute for co-culture with keratinocytes. Acta Derm Venereol (2012) 92:16-23, Lim, et al., Adipose-derived stem cells improve efficacy of melanocyte transplantation in animal skin. Biol Ther (2014) 22(4):328-333). Mesenchymal stem cells can be isolated from various parts of the human body, and adipose tissue-derived stem cells (ASCs) can easily obtain a large amount of raw tissue, but the burden on the human body due to collection is very high. There are low advantages. Therefore, the use of adipose-derived mesenchymal stem cells and melanocytes is expected to solve the difficulty of supply and demand of raw tissue that occurs when keratinocytes are used and the limited production during in vitro culture.
한편, 백반증의 세포 치료를 위하여 멜라닌세포와 지방유래 성체줄기세포의 혼합 세포를 실험동물의 피하에 이식할 경우, 투여된 혼합 세포가 생착된 위치가 실제 멜라닌세포가 존재하는 피부 기저막 부위가 아닌 피하에 투여됨으로써 원하는 백반증 치료 효과를 얻기가 곤란한 문제점이 있다. 따라서, 피부찰상법(dermabrasion) 등의 표피박리술을 통하여 세포(즉, 멜라닌세포와 지방유래 성체줄기세포의 혼합 세포)를 정상 피부조직내 멜라닌세포가 존재하는 피부 기저막 부위에 효과적으로 생착시켜 이탈되지 않도록 할 수 있는 세포 전달체(cell delivery system)의 개발이 요구된다. On the other hand, when a mixed cell of melanocytes and adipose-derived adult stem cells is subcutaneously transplanted to an experimental animal for cell treatment of vitiligo, the place where the administered mixed cells are engrafted is subcutaneously, not the skin basement membrane area where melanocytes actually exist. There is a problem in that it is difficult to obtain the desired vitiligo treatment effect by being administered to. Therefore, through epidermal exfoliation such as dermabrasion, cells (ie, mixed cells of melanocytes and adipose-derived adult stem cells) are effectively engrafted to the skin basement membrane area where melanocytes exist in normal skin tissue so that they do not escape. The development of a cell delivery system that can do this is required.
본 발명자들은 멜라닌세포와 지방유래 성체줄기세포의 혼합 세포를 피부 기저막 부위에 효과적으로 생착시킬 수 있는 세포 전달체를 개발하기 위하여 다양한 연구를 수행하였다. 본 발명자들은 혼합 세포의 기저막 부위로의 생착을 위하여, 피브리노겐 및 트롬빈의 가교화를 이용한 세포 전달체를 개발하였으며, 얻어진 세포 전달체가 멜라닌세포와 지방유래 성체줄기세포의 혼합 세포를 기저막 부위에 균일하게 생착시킬 수 있다는 것을 발견하였다. The present inventors have conducted various studies to develop a cell delivery vehicle capable of effectively engrafting mixed cells of melanocytes and adipose-derived adult stem cells to the basement membrane of the skin. The present inventors developed a cell delivery system using crosslinking of fibrinogen and thrombin for engraftment of mixed cells to the basement membrane region. found that it can be done.
따라서, 본 발명은 상기 피브리노겐 및 트롬빈의 가교화를 이용한 세포 전달체를 형성하는 약학 제제를 제공하는 것을 목적으로 한다.Accordingly, an object of the present invention is to provide a pharmaceutical preparation for forming a cell carrier using the crosslinking of fibrinogen and thrombin.
본 발명의 일 태양에 따라, 피브리노겐을 포함하는 제1 컴파트먼트; 및 멜라닌세포와 지방유래 성체줄기세포의 혼합 세포 및 트롬빈을 포함하는 제2 컴파트먼트로 구성된, 백반증 치료용 약학 제제가 제공된다.According to one aspect of the present invention, the first compartment containing fibrinogen; and a second compartment containing mixed cells of melanocytes and adipose-derived adult stem cells and thrombin, and a pharmaceutical preparation for the treatment of vitiligo is provided.
본 발명의 약학 제제에 있어서, 제1 컴파트먼트 중의 피브리노겐의 농도는 1 mg/ml 내지 500 mg/ml, 바람직하게는 5 mg/ml 내지 100 mg/ml의 범위일 수 있다. In the pharmaceutical formulation of the present invention, the concentration of fibrinogen in the first compartment may range from 1 mg/ml to 500 mg/ml, preferably from 5 mg/ml to 100 mg/ml.
일 구현예에서, 상기 멜라닌세포와 지방유래 성체줄기세포의 혼합 세포는 멜라닌세포를 배양하여 수확한 세포와 지방유래 성체줄기세포를 배양하여 수확한 세포의 혼합물일 수 있으며, 상기 혼합물 중의 멜라닌세포와 지방유래 성체줄기세포의 세포수 비율은 1 : 1 내지 5 일 수 있다. 다른 구현예에서, 상기 멜라닌세포와 지방유래 성체줄기세포의 혼합 세포는 멜라닌세포 및 지방유래 성체줄기세포를 공동 배양하여 수확된 세포일 수 있으며, 바람직하게는 멜라닌세포 및 지방유래 성체줄기세포를 1 : 1 내지 5 의 세포수 비율로 혼합하여 공동 배양하여 수확된 세포일 수 있다. In one embodiment, the mixed cells of melanocytes and adipose-derived adult stem cells may be a mixture of cells harvested by culturing melanocytes and cells harvested by culturing adipose-derived adult stem cells, and the melanocytes and The cell number ratio of adipose-derived adult stem cells may be 1:1 to 5. In another embodiment, the mixed cells of melanocytes and adipose-derived adult stem cells may be cells harvested by co-cultivating melanocytes and adipose-derived adult stem cells, preferably melanocytes and adipose-derived adult stem cells in 1 : It may be a cell harvested by mixing and co-cultivating at a cell number ratio of 1 to 5.
일 구현예에서, 상기 지방유래 성체줄기세포는 지방유래 간엽줄기세포일 수 있다. In one embodiment, the adipose-derived adult stem cells may be adipose-derived mesenchymal stem cells.
다른 구현예에서, 제2 컴파트먼트 중의 멜라닌세포와 지방유래 성체줄기세포의 혼합 세포의 농도는 1 X 105 내지 3 X 109 cells/ml의 범위일 수 있다. In another embodiment, the concentration of the mixed cells of melanocytes and adipose-derived adult stem cells in the second compartment may be in the range of 1 X 10 5 to 3 X 10 9 cells/ml.
본 발명의 약학 제제에 있어서, 제2 컴파트먼트 중의 트롬빈의 농도는 1 IU/ml 내지 500 IU/ml, 바람직하게는 5 IU/ml 내지 100 IU/ml의 범위일 수 있다. 일 구현예에서, 제1 컴파트먼트 중의 피브리노겐의 농도는 약 10 mg/ml이고, 제2 컴파트먼트 중의 트롬빈의 농도는 약 10 IU/ml일 수 있다.In the pharmaceutical formulation of the present invention, the concentration of thrombin in the second compartment may range from 1 IU/ml to 500 IU/ml, preferably from 5 IU/ml to 100 IU/ml. In one embodiment, the concentration of fibrinogen in the first compartment may be about 10 mg/ml and the concentration of thrombin in the second compartment may be about 10 IU/ml.
본 발명의 약학 제제는 바람직하게는 피부찰상법을 통한 투여용 제제일 수 있다.The pharmaceutical preparation of the present invention may preferably be a preparation for administration through a skin scraping method.
본 발명에 따른 약학 제제는 정상피부조직내 멜라닌세포가 존재하는 피부 기저막 부위에 멜라닌세포와 지방유래 성체줄기세포의 혼합 세포를 효과적으로 생착시켜 이탈을 방지할 수 있다. 특히, 본 발명의 약학 제제는 피부 기저막 부위에서 피브리노겐 및 트롬빈의 가교화를 통한 세포 전달체 형태로 재구성되어 상기 혼합 세포를 기저막 부위에 균일하게 생착시킬 수 있다.The pharmaceutical preparation according to the present invention can effectively engraft mixed cells of melanocytes and adipose-derived adult stem cells into the basement membrane of the skin where melanocytes exist in normal skin tissue, thereby preventing their detachment. In particular, the pharmaceutical preparation of the present invention is reconstituted in the form of a cell carrier through crosslinking of fibrinogen and thrombin in the basement membrane region of the skin, so that the mixed cells can be uniformly engrafted to the basement membrane region.
도 1은 피부찰상법을 실시하여 누드 마우스의 피부의 기저막을 노출시킨 후, 상이한 비율의 피브리노겐 및 트롬빈 농도를 갖는 제1 컴파트먼트 및 제2 컴파트먼트를 환부에 적용하여 멜라닌세포의 생착 정도를 평가한 결과를 나타낸다.
도 2는 피부찰상법을 실시하여 누드 마우스의 피부의 기저막을 노출시킨 후, 본 발명에 따른 약학 제제(A) 및 히알루론산을 담체로 사용하여 제조한 제제(B)를 환부에 적용하여 멜라닌세포의 존재부위 및 세포의 분포 정도를 평가한 결과를 나타낸다.
도 3은 피부찰상법을 실시하여 누드 마우스의 피부의 기저막을 노출시킨 후 본 발명에 따른 약학 제제를 환부에 도포한 후, 테가덤TM(TegadermTM)으로 감싸 1주일 동안 유지하여 멜라닌세포의 생착 정도와 생착부위를 평가한 결과이다. 도 3에서 A, B, C, 및 D는 각각 피브리노겐 10 mg/ml + 혼합 세포 + 트롬빈 10 IU/ml(A), 피브리노겐 10 mg/ml + 혼합 세포 + 트롬빈 50 IU/ml(B), 피브리노겐 10 mg/ml + 혼합 세포 + 트롬빈 250IU/ml(C), 및 피브리노겐 10 mg/ml + 혼합 세포 + 트롬빈 500 IU/ml(D)를 처리한 결과를 나타낸다.
도 4는 본 발명의 약학 제제를 피하 이식을 통하여 누드 마우스의 환부에 적용한 후, 2주 후(A) 및 3주 후(B) 각각의 실험동물을 희생시켜 피부조직을 채취하여 절편을 만들어 이식부위의 멜라닌세포 생착 정도와 분포위치를 평가한 결과이다.1 shows the degree of engraftment of melanocytes by applying a first compartment and a second compartment having different ratios of fibrinogen and thrombin concentration to the affected area after exposing the basement membrane of the skin of a nude mouse by a skin scraping method. shows the evaluation result.
Figure 2 shows melanocytes by applying a pharmaceutical formulation (A) according to the present invention and a formulation (B) prepared using hyaluronic acid as a carrier to the affected area after exposing the basement membrane of the skin of nude mice by a skin scratching method. Shows the results of evaluating the presence of and the degree of cell distribution.
Figure 3 shows that after exposing the basement membrane of the skin of nude mice by skin scratching method, the pharmaceutical preparation according to the present invention was applied to the affected area, and then wrapped with Tegaderm TM and maintained for 1 week to reduce the number of melanocytes. This is the result of evaluating the degree of engraftment and the engraftment site. In FIG. 3, A, B, C, and D are 10 mg/ml of fibrinogen + mixed cells + 10 IU/ml of thrombin (A), 10 mg/ml of fibrinogen + mixed cells + 50 IU/ml of thrombin (B), and fibrinogen, respectively. The results of treatment with 10 mg/ml + mixed cells + thrombin 250 IU/ml (C) and fibrinogen 10 mg/ml + mixed cells + thrombin 500 IU/ml (D) are shown.
Figure 4 is after applying the pharmaceutical formulation of the present invention to the affected area of a nude mouse through subcutaneous transplantation, after 2 weeks (A) and 3 weeks (B), each experimental animal was sacrificed, skin tissue was collected, and a section was made and transplanted. This is the result of evaluating the degree of engraftment and distribution of melanocytes in the site.
본 발명은 피브리노겐을 포함하는 제1 컴파트먼트; 및 멜라닌세포와 지방유래 성체줄기세포의 혼합 세포 및 트롬빈을 포함하는 제2 컴파트먼트로 구성된, 백반증 치료용 약학 제제를 제공한다.The present invention is a first compartment containing fibrinogen; and a second compartment containing mixed cells of melanocytes and adipose-derived adult stem cells and thrombin.
상기 제1 컴파트먼트는 백반증 환부에 먼저 도포된 다음, 제1 컴파트먼트가 도포된 환부에 제2 컴파트먼트가 도포됨으로써, 피브리노겐과 트롬빈의 가교화를 통한 세포 전달체 형태로 재구성된다. 따라서, 본 발명에 따른 약학 제제는 정상피부조직내 멜라닌세포가 존재하는 피부 기저막 부위에 멜라닌세포와 지방유래 성체줄기세포의 혼합 세포를 효과적으로 생착시켜 이탈을 방지할 수 있다. 특히, 본 발명의 약학 제제는 피부 기저막 부위에서 피브리노겐 및 트롬빈의 가교화를 통한 세포 전달체 형태로 재구성되어 상기 혼합 세포를 기저막 부위에 균일하게 생착시킬 수 있다.The first compartment is first applied to the vitiligo affected area, and then the second compartment is applied to the affected area to which the first compartment is applied, thereby reconstituting the cell delivery system through cross-linking of fibrinogen and thrombin. Therefore, the pharmaceutical preparation according to the present invention can effectively engraft mixed cells of melanocytes and adipose-derived adult stem cells into the basement membrane of the skin where melanocytes exist in normal skin tissue, thereby preventing their detachment. In particular, the pharmaceutical preparation of the present invention is reconstituted in the form of a cell carrier through crosslinking of fibrinogen and thrombin in the basement membrane region of the skin, so that the mixed cells can be uniformly engrafted to the basement membrane region.
본 발명의 약학 제제에 있어서, 제1 컴파트먼트 중의 피브리노겐의 농도는 제2 컴파트먼트에 함유되는 트롬빈의 농도에 따라 상이할 수 있으나, 예를 들어 1 mg/ml 내지 500 mg/ml, 바람직하게는 5 mg/ml 내지 100 mg/ml, 더욱 바람직하게는 5 mg/ml 내지 20 mg/ml의 범위일 수 있으며, 특히 바람직하게는 약 10 mg/ml일 수 있다. In the pharmaceutical formulation of the present invention, the concentration of fibrinogen in the first compartment may vary depending on the concentration of thrombin contained in the second compartment, but is, for example, 1 mg/ml to 500 mg/ml, preferably. Preferably it may range from 5 mg/ml to 100 mg/ml, more preferably from 5 mg/ml to 20 mg/ml, and particularly preferably from about 10 mg/ml.
상기 멜라닌세포와 지방유래 성체줄기세포의 혼합 세포는 멜라닌세포를 배양하여 수확한 세포와 지방유래 성체줄기세포를 배양하여 수확한 세포의 혼합물일 수 있으며, 상기 혼합물 중의 멜라닌세포와 지방유래 성체줄기세포의 세포수 비율은 1 : 1 내지 5, , 바람직하게는 약 1 : 2 일 수 있다. The mixed cells of melanocytes and adipose-derived adult stem cells may be a mixture of cells harvested by culturing melanocytes and cells harvested by culturing adipose-derived adult stem cells, and the melanocytes and adipose-derived adult stem cells in the mixture The cell number ratio may be 1:1 to 5, preferably about 1:2.
또한, 상기 멜라닌세포와 지방유래 성체줄기세포의 혼합 세포는 멜라닌세포 및 지방유래 성체줄기세포를 공동 배양하여 수확된 세포일 수 있으며, 바람직하게는 멜라닌세포 및 지방유래 성체줄기세포를 1 : 1 내지 5, 바람직하게는 약 1 : 2 의 세포수 비율로 혼합하여 공동 배양하여 수확된 세포일 수 있다. 상기 공동 배양 및 세포의 수확은 본 출원인이 보고한 공지의 방법(Lim, et al., Adipose-derived stem cells improve efficacy of melanocyte transplantation in animal skin. Biol Ther (2014) 22(4):328-333)에 따라 수행될 수 있다.In addition, the mixed cells of melanocytes and adipose-derived adult stem cells may be cells harvested by co-cultivating melanocytes and adipose-derived adult stem cells, preferably melanocytes and adipose-derived adult stem cells in a 1:1 to 1:1 ratio. 5, preferably about 1:2, the cells may be harvested by mixing and co-cultivating. The co-cultivation and harvesting of cells are performed by a known method reported by the present applicant (Lim, et al., Adipose-derived stem cells improve efficacy of melanocyte transplantation in animal skin. Biol Ther (2014) 22(4):328-333 ) can be performed according to
일 구현예에서, 상기 지방유래 성체줄기세포는 지방유래 간엽줄기세포일 수 있다. In one embodiment, the adipose-derived adult stem cells may be adipose-derived mesenchymal stem cells.
다른 구현예에서, 제2 컴파트먼트 중의 멜라닌세포와 지방유래 성체줄기세포의 혼합 세포의 농도는 1 X 105 내지 3 X 109 cells/ml의 범위일 수 있다. In another embodiment, the concentration of the mixed cells of melanocytes and adipose-derived adult stem cells in the second compartment may be in the range of 1 X 10 5 to 3 X 10 9 cells/ml.
본 발명의 약학 제제에 있어서, 제2 컴파트먼트 중의 트롬빈의 농도는 제1 컴파트먼트에 함유되는 피브리노겐의 농도에 따라 상이할 수 있으나, 예를 들어 1 IU/ml 내지 500 IU/ml, 바람직하게는 5 IU/ml 내지 100 IU/ml, 더욱 바람직하게는 5 IU/ml 내지 20 IU/ml의 범위일 수 있으며, 특히 바람직하게는 약 10 IU/ml일 수 있다. 일 구현예에서, 제1 컴파트먼트 중의 피브리노겐의 농도는 약 10 mg/ml이고, 제2 컴파트먼트 중의 트롬빈의 농도는 약 10 IU/ml일 수 있다.In the pharmaceutical formulation of the present invention, the concentration of thrombin in the second compartment may vary depending on the concentration of fibrinogen contained in the first compartment, but is, for example, 1 IU/ml to 500 IU/ml, preferably. Preferably it may be in the range of 5 IU/ml to 100 IU/ml, more preferably 5 IU/ml to 20 IU/ml, and particularly preferably about 10 IU/ml. In one embodiment, the concentration of fibrinogen in the first compartment may be about 10 mg/ml and the concentration of thrombin in the second compartment may be about 10 IU/ml.
본 발명의 약학 제제는 피부과 분야에서 통상적으로 사용되는 표피박리술(epidermal stripping method), 예를 들어 피부찰상법(dermabrasion)을 통한 투여용 제제일 수 있다.The pharmaceutical preparation of the present invention may be a preparation for administration through an epidermal stripping method commonly used in the field of dermatology, for example, a dermabrasion method.
본 발명의 약학 제제를 구성하는 상기 제1 컴파트먼트 및 제2 컴파트먼트는 매질로서 주사용수, 생리식염수, 인산완충식염수(phosphate buffered saline, PBS) 등의 생리학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 또한, 상기 제1 컴파트먼트 및 제2 컴파트먼트는 약학적으로 허용가능한 첨가제, 예를 들어, 보존제, 완충제, 무통화제, 멜라닌세포 배양액, 지방유래 성체줄기세포 배양액, 혼합 세포 배양액 등을 포함할 수 있으며, 주입제(injection), 도포제, 스프레이제 등의 형태로 제제화될 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 약학 제제는 다양한 백반증 환자의 환부에 상기 혼합 세포를 기준으로 1일 1 X 103cells/cm2 내지 3 x 107cells/cm2 , 바람직하게는 1 X 105 cells/cm2 내지 5 X 105 cells/cm2, 더욱 바람직하게는 약 3 X 105 cells/cm2 로 투여될 수 있다. 적절한 투여량은 백반증 환자의 연령 및 증상에 따라 일반적으로 변경될 수 있다. 본 발명의 약학 제제는 백반증 환자의 환부에 적용된 후, 필요에 따라 테가덤TM(TegadermTM) 등의 필름 드레싱제를 부착시켜 더욱 안정하게 세포의 생착 및 유실 방지를 추가로 도모할 수 있다.The first compartment and the second compartment constituting the pharmaceutical preparation of the present invention may contain a physiologically acceptable carrier such as water for injection, physiological saline, phosphate buffered saline (PBS), etc. as a medium. can In addition, the first compartment and the second compartment contain pharmaceutically acceptable additives such as preservatives, buffers, analgesics, melanocyte culture medium, adipose-derived adult stem cell culture medium, mixed cell culture medium, and the like. It can be formulated in the form of an injection, a coating agent, a spray agent, and the like. In addition, the pharmaceutical preparation according to the present invention is applied to the affected area of various vitiligo patients at 1 X 10 3 cells/cm 2 to 3 X 10 7 cells/cm 2 , preferably 1 X 10 5 cells/cm 2 per day, based on the mixed cells. cm 2 to 5 X 10 5 cells/cm 2 , more preferably about 3 X 10 5 cells/cm 2 . An appropriate dosage can generally be changed according to the age and symptoms of the patient with vitiligo. After the pharmaceutical preparation of the present invention is applied to the affected area of a patient with vitiligo, if necessary, a film dressing such as Tegaderm TM may be attached thereto to more stably prevent engraftment and loss of cells.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 제한되는 것은 아니다. Hereinafter, the present invention will be described in more detail through examples. However, these examples are for illustrating the present invention, and the scope of the present invention is not limited to these examples.
실시예Example
본 출원인이 보고한 공지의 방법(Lim, et al., Adipose-derived stem cells improve efficacy of melanocyte transplantation in animal skin. Biol Ther (2014) 22(4):328-333)에 따라, 멜라닌세포와 지방유래 간엽줄기세포를 각각 2.5×104 cells 및 5×104 cells의 농도로 혼합하여 공동 배양하여 수확된 세포를, 멜라닌세포와 지방유래 간엽줄기세포의 혼합 세포로서 사용하였다. 상기 혼합 세포는 배양액을 300 x g로 원심분리하여 상등액을 제거하여 수확하였으며, 수확된 세포를 하기 실시예 1에서 사용하였다. 또한, 본 출원인이 보고한 공지의 방법(Kim, et. al., Co-culture of melanocytes with adipose-derived stem cells as a potential substitute for co-culture with keratinocytes. Acta Derm Venereol (2012) 92:16-23)에 따라 멜라닌세포 및 지방유래 간엽줄기세포를 각각 별도로 배양하여 수확된 세포를 하기 실시예 2에서 사용하였다.A known method reported by the present applicant (Lim, et al., Adipose-derived stem cells improve efficacy of melanocyte transplantation in animal skin. Biol According to Ther (2014) 22(4):328-333), melanocytes and adipose-derived mesenchymal stem cells were mixed and co-cultured at a concentration of 2.5×10 4 cells and 5×10 4 cells, respectively, and harvested cells, It was used as a mixed cell of melanocytes and adipose-derived mesenchymal stem cells. The mixed cells were harvested by centrifuging the culture medium at 300 xg to remove the supernatant, and the harvested cells were used in Example 1 below. In addition, a known method reported by the present applicant (Kim, et. al., Co-culture of melanocytes with adipose-derived stem cells as a potential substitute for co-culture with keratinocytes. Acta Derm Venereol (2012) 92:16- 23), melanocytes and adipose-derived mesenchymal stem cells were separately cultured and harvested cells were used in Example 2 below.
실시예Example 1: 약학 제제의 제조 1: Preparation of pharmaceutical preparations
(1) 제1 컴파트먼트의 제조(1) Manufacture of the first compartment
생리식염수 10 ml에 피브리노겐을 10 mg/ml의 농도로 용해시켜 제1 컴파트먼트를 제조하였다.A first compartment was prepared by dissolving fibrinogen at a concentration of 10 mg/ml in 10 ml of physiological saline.
(2) 제2 컴파트먼트의 제조(2) Manufacture of the second compartment
생리식염수 10 ml에 트롬빈을 10 IU/ml, 50 IU/ml, 250 IU/ml, 및 500 IU/ml의 농도로 각각 용해시킨 후, 200 ㎕씩 취하여 멜라닌세포와 지방유래 간엽줄기세포의 혼합 세포를 각각 3 X 106 cells 첨가하여, 분산액 형태의 제2 컴파트먼트 A (혼합 세포 및 트롬빈 10 IU/ml 함유), 제2 컴파트먼트 B (혼합 세포 및 트롬빈 50 IU/ml 함유), 제2 컴파트먼트 C (혼합 세포 및 트롬빈 250 IU/ml 함유), 및 제2 컴파트먼트 D (혼합 세포 및 트롬빈 500 IU/ml 함유)를 제조하였다.After dissolving thrombin in 10 ml of physiological saline at concentrations of 10 IU/ml, 50 IU/ml, 250 IU/ml, and 500 IU/ml, respectively, take 200 μl of the mixed cells of melanocytes and adipose-derived mesenchymal stem cells. 3 X 10 6 cells were added, respectively, and the second compartment A (containing mixed cells and 10 IU/ml of thrombin) in the form of a dispersion, the second compartment B (containing mixed cells and 50 IU/ml of thrombin), and 2 compartment C (containing mixed cells and thrombin 250 IU/ml), and a second compartment D (containing mixed cells and thrombin 500 IU/ml) were prepared.
실시예Example 2: 약학 제제의 제조 2: Preparation of pharmaceutical preparations
(1) 제1 컴파트먼트의 제조(1) Manufacture of the first compartment
생리식염수 10 ml에 피브리노겐을 10 mg/ml의 농도로 용해시켜 제1 컴파트먼트를 제조하였다.A first compartment was prepared by dissolving fibrinogen at a concentration of 10 mg/ml in 10 ml of physiological saline.
(2) 제2 컴파트먼트의 제조(2) Manufacture of the second compartment
생리식염수 10 ml에 트롬빈을 10 IU/ml의 농도로 각각 용해시킨 후, 200 ㎕씩 취하여 멜라닌세포 및 지방유래 간엽줄기세포를 다음과 같이 첨가하여 분산액 형태의 제2 컴파트먼트 E 내지 G를 제조하였다.After dissolving thrombin in 10 ml of physiological saline at a concentration of 10 IU/ml, 200 μl of each was added and melanocytes and adipose-derived mesenchymal stem cells were added as follows to prepare second compartments E to G in the form of a dispersion. did
제2 컴파트먼트 E: 멜라닌세포 1 X 106 cells + 지방유래 간엽줄기세포 3 X 106 cellsSecond compartment E: melanocytes 1 X 10 6 cells + adipose-derived mesenchymal stem cells 3 X 10 6 cells
제2 컴파트먼트 F: 멜라닌세포 1 X 106 cells + 지방유래 간엽줄기세포 1 X 106 cellsSecond compartment F: melanocytes 1 X 10 6 cells + adipose-derived mesenchymal stem cells 1 X 10 6 cells
제2 컴파트먼트 G: 멜라닌세포 3 X 106 cells + 지방유래 간엽줄기세포 1 X 106 cellsSecond compartment G: melanocytes 3 X 10 6 cells + adipose-derived mesenchymal stem cells 1 X 10 6 cells
실시예Example 3: 3: 피부찰상법에in skin scratches 의한 약학 제제의 투여 Administration of Pharmaceutical Formulations by
Balb C 누드 마우스(7주령)를 4개의 군으로 나누고(n=4), 각군의 마우스의 등 피부에 피부찰상법을 실시하여 피부의 기저막을 노출시켰다. 제1군 내지 제4군의 마우스의 환부에 제1 컴파트먼트를 20 ㎕/cm2 로 균일하게 도포한 다음, 제1군 내지 제4군의 피브리노겐이 도포된 환부에 제2 컴파트먼트 A, B, C, 및 D를 각각 20 ㎕/cm2 씩 추가로 도포하여 세포 전달체를 형성시켰다. 각군의 마우스의 환부에 테가덤TM(TegadermTM)을 부착하였다. 상기 도포가 종료된 후, 1 주후 테가덤TM을 제거하고 환부를 촬영하였으며, 그 결과는 도 1과 같다. 도 1의 결과로부터, 피부에 멜라닌세포가 효과적으로 생착되었으며, 적용된 조직에 편향되어 분포하지 않고 균일하게 분포하였으며, 이 중 제1 컴파트먼트 중의 피브리노겐의 농도가 10 mg/ml이고, 제2 컴파트먼트 중의 트롬빈의 농도가 10 IU/ml인 것이 가장 우수한 멜라닌 생성 효과를 나타내었음을 알 수 있다.Balb C nude mice (7 weeks old) were divided into 4 groups (n = 4), and skin scratching was performed on the back skin of each group to expose the basement membrane of the skin. 20 μl/cm 2 of the first compartment was uniformly applied to the affected area of the mice of groups 1 to 4, and then the second compartment A was applied to the affected area to which the fibrinogen of groups 1 to 4 was applied. , B, C, and D were additionally applied at 20 µl/cm 2 each to form a cell carrier. Tegaderm TM (Tegaderm TM ) was attached to the affected area of each group of mice. After the application was completed, Tegaderm TM was removed one week later and the affected area was photographed, and the results are shown in FIG. 1. From the results of FIG. 1, melanocytes were effectively engrafted to the skin, and were uniformly distributed without being biased to the applied tissue, of which the concentration of fibrinogen in the first compartment was 10 mg/ml, and the second compartment It can be seen that the concentration of thrombin in the solution of 10 IU/ml exhibited the most excellent melanin production effect.
실시예Example 4: 히알루론산 4: hyaluronic acid 담체를carrier 사용한 제제와의 비교 Comparison with the formulation used
실시예 3과 동일한 방법으로, Balb C 누드 마우스(7주령)의 등 피부에 피부찰상법을 실시하여 피부의 기저막을 노출시킨 후, 환부에 제1 컴파트먼트(20 ㎕/cm2) 및 제2 컴파트먼트 A(20 ㎕/cm2)를 사용하여 세포 전달체를 형성시킨 다음, 테가덤TM(TegadermTM)을 부착하였다. In the same manner as in Example 3, skin scratching was performed on the back skin of Balb C nude mice (7 weeks old) to expose the basement membrane of the skin, and then the first compartment (20 μl/cm 2 ) and the second compartment were applied to the affected area. A cell delivery system was formed using 2 compartment A (20 µl/cm 2 ), and then Tegaderm ™ was attached.
생분해성 물질로 알려져 있는 히알루론산을 담체로 사용하여 세포전달체를 제조하였다. 즉, 생리식염수 1.8 ml에 멜라닌세포와 지방유래 간엽줄기세포의 혼합 세포 3 X 106 cells를 분산시킨 후, 1% 히알루론산 용액 0.2 ml을 첨가하여 세포 전달체(비교예)를 제조하였다. Balb C 누드 마우스(7주령)의 등 피부에 피부찰상법을 실시하여 피부의 기저막을 노출시킨 후, 비교예의 세포 전달체(20 ㎕/cm2)를 도포한 다음, 환부에 테가덤TM(TegadermTM)을 부착하였다.A cell delivery system was prepared using hyaluronic acid known as a biodegradable material as a carrier. That is, after dispersing 3 X 10 6 cells of mixed cells of melanocytes and adipose-derived mesenchymal stem cells in 1.8 ml of physiological saline, 0.2 ml of a 1% hyaluronic acid solution was added to prepare a cell carrier (Comparative Example). After exposing the basement membrane of the skin by performing a skin scratch method on the back skin of Balb C nude mice (7 weeks old), the cell carrier of the comparative example (20 μl/cm 2 ) was applied, and then Tegaderm TM (Tegaderm TM ) was attached.
테가덤TM(TegadermTM) 부착 후 1주 후에 각각의 마우스의 환부를 촬영하고, 피부조직을 채취하여 조직절편을 만들어 헤마톡실린-에오신 염색(Hematoxylin and eosin staining, H&E 염색)을 통하여 멜라닌세포의 존재부위 및 세포의 분포 정도를 확인한 결과는 도 2와 같다. 도 2의 결과로부터, 본 발명에 따라 피브린 가교화를 통한 세포 전달체를 형성한 경우가 히알루론산을 통한 세포 전달체 형성한 경우에 비하여 적용된 혼합 세포가 균일하게 분산되었으며, 적용 부위에 효과적으로 생착된 형태를 이루고 있음을 알 수 있다.Tegaderm TM (Tegaderm TM ) 1 week after attachment, the affected area of each mouse was photographed, skin tissue was collected, tissue sections were made, and melanocytes were stained through Hematoxylin and eosin staining (H&E staining). The results of confirming the presence of and the distribution of cells are shown in FIG. 2. From the results of FIG. 2 , in the case of forming the cell carrier through fibrin crosslinking according to the present invention, compared to the case of forming the cell carrier through hyaluronic acid, the applied mixed cells were uniformly dispersed and effectively engrafted to the application site. it can be seen that the
실시예Example 5: 5: 피부찰상법skin scraping method 및 피부이식법의 비교 and comparison of skin grafting methods
실시예 3과 동일한 방법으로, 누드 마우스의 환부에 제1 컴파트먼트(20 ㎕/cm2) 및 제2 컴파트먼트(20 ㎕/cm2)를 사용하여 세포 전달체를 형성시킨 다음, 테가덤TM(TegadermTM)을 부착하였다. 테가덤TM(TegadermTM) 부착 후 2주후에 실험동물을 희생시켜 피부조직을 채취하여 절편을 만들어 H&E 염색을 통하여 적용부위의 멜라닌세포 생착 정도와 분포 위치를 확인한 결과는 도 3과 같다. 도 3에서 A, B, C, 및 D는 각각 피브리노겐 10 mg/ml + 혼합 세포 + 트롬빈 10 IU/ml(A), 피브리노겐 10 mg/ml + 혼합 세포 + 트롬빈 50 IU/ml(B), 피브리노겐 10 mg/ml + 혼합 세포 + 트롬빈 250IU/ml(C), 및 피브리노겐 10 mg/ml + 혼합 세포 + 트롬빈 500 IU/ml(D)를 처리한 결과를 나타낸다.In the same manner as in Example 3, a cell delivery system was formed using the first compartment (20 μl/cm 2 ) and the second compartment (20 μl/cm 2 ) on the affected part of the nude mouse, and then the Derm ™ (Tegaderm ™ ) was attached. Tegaderm TM (Tegaderm TM ) After 2 weeks after attachment, the test animal was sacrificed, skin tissue was collected to make a section, and the result of confirming the degree of melanocyte engraftment and distribution location of the application site through H & E staining was shown in FIG. 3 . In FIG. 3, A, B, C, and D are 10 mg/ml of fibrinogen + mixed cells + 10 IU/ml of thrombin (A), 10 mg/ml of fibrinogen + mixed cells + 50 IU/ml of thrombin (B), and fibrinogen, respectively. The results of treatment with 10 mg/ml + mixed cells + thrombin 250 IU/ml (C) and fibrinogen 10 mg/ml + mixed cells + thrombin 500 IU/ml (D) are shown.
또한, 6주령 누드 마우스의 표피를 절개하여 피하에 제1 컴파트먼트(20 ㎕/cm2) 및 제2 컴파트먼트 A(20 ㎕/cm2)를 사용하여 세포 전달체를 형성시킨 후, 표피를 봉합한 후 테가덤TM(TegadermTM)을 부착하였다. 테가덤TM 부착 후, 2주(도 4의 A) 및 3주 후(도 4의 B) 각각의 실험동물을 희생시켜 피부조직을 채취하여 절편을 만들어 H&E 염색을 통하여 이식부위의 멜라닌세포 생착 정도와 분포위치를 확인하여 얻어진 결과는 도 4와 같다. In addition, the epidermis of 6-week-old nude mice was incised to form a cell carrier using the first compartment (20 μl/cm 2 ) and the second compartment A (20 μl/cm 2 ) subcutaneously, and then the epidermis After suturing, Tegaderm TM (Tegaderm TM ) was attached. After attaching Tegaderm TM , after 2 weeks (Fig. 4A) and 3 weeks (Fig. 4B), each experimental animal was sacrificed, skin tissue was collected, and sections were made to engraft melanocytes at the transplant site through H&E staining. The results obtained by confirming the degree and distribution position are shown in FIG.
도 3 및 도 4의 결과로부터, 피하이식을 통해 세포 전달체를 형성시킨 경우 지방세포층 사이 즉 피하에서 이식된 멜라닌세포(검은 세포)들이 관찰된 반면, 피부찰상법을 통해 세포 전달체를 형성시킨 경우에는 기저막 부위에서 멜라닌세포들이 관찰됨을 알 수 있다. 따라서, 본 발명의 약학 제제는 피부찰상법을 통해 혼합 세포를 피부 기저막 부위에 효과적으로 생착시켜 이탈되지 않도록 함으로써, 우수한 치료 효과를 얻을 수 있다.From the results of FIGS. 3 and 4, when the cell delivery system was formed through subcutaneous transplantation, melanocytes (black cells) transplanted between the fat cell layers, that is, subcutaneously, were observed, whereas when the cell delivery system was formed through the skin scratch method It can be seen that melanocytes are observed in the basement membrane area. Therefore, the pharmaceutical preparation of the present invention can effectively engraft mixed cells in the basement membrane of the skin through the skin scratching method and prevent them from escaping, thereby obtaining excellent therapeutic effects.
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