KR102515464B1 - Cytotoxic mitigating membrane permeable peptides for improving nucleic acid or genetransfection efficiency and use thereof - Google Patents

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Abstract

본 발명은 핵산 또는 유전자 형질감염 효율을 개선하는 세포독성 완화 막 투과 펩타이드 및 이의 용도에 관한 것으로, 구체적으로 본 발명의 세포독성 완화 막 투과 펩타이드(cytotoxic mitigating cell-penetrating peptides, CMCP)를 함께 이용하여 성체줄기세포에 유전자 형질감염 시 낮은 세포독성, 높은 형질감염 효율 및 이에 따른 증가된 단백질 발현을 나타내는바 기존의 유전자 형질감염 기술과 비교해 보았을 때 유전자 형질감염이 어려운 세포로의 유전자 형질감염 효율 향상을 위한 제제로 유용하게 이용하는 것이 가능하다.The present invention relates to a cytotoxic mitigating membrane-penetrating peptide that improves nucleic acid or gene transfection efficiency and uses thereof, and specifically, by using the cytotoxic mitigating cell-penetrating peptides (CMCP) of the present invention together When gene transfection into adult stem cells shows low cytotoxicity, high transfection efficiency, and consequently increased protein expression, compared to conventional gene transfection technology, gene transfection efficiency is improved in cells where gene transfection is difficult. It is possible to use it usefully as a preparation for

Description

핵산 또는 유전자 형질감염 효율을 개선하는 세포독성 완화 막 투과 펩타이드 및 이의 용도{CYTOTOXIC MITIGATING MEMBRANE PERMEABLE PEPTIDES FOR IMPROVING NUCLEIC ACID OR GENETRANSFECTION EFFICIENCY AND USE THEREOF}Cytotoxicity alleviating membrane penetrating peptides that improve nucleic acid or gene transfection efficiency and uses thereof

본 발명은 핵산 또는 유전자 형질감염(transfection) 효율을 개선하는 세포독성 완화 막 투과 펩타이드 및 이의 용도에 관한 것이다.The present invention relates to cytotoxicity mitigating membrane penetrating peptides that improve nucleic acid or gene transfection efficiency and uses thereof.

중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cells, MSCs)는 골수, 지방 및 제대를 포함하는 많은 조직으로부터 쉽게 분리되고 확장될 수 있는 다분화성(multipotent) 성체 줄기세포(adult stem cells)이며, 세포 치료(cell therapy)에 사용하기 위해 활발하게 연구되어 왔다. 그동안 중간엽 줄기세포 치료요법(MSC therapy)은 약간의 성공을 거두었지만, 아직 임상 용도로 미국 식품의약국(food and drug administration, FDA) 승인을 받은 것은 없다. 중간엽 줄기세포는 생체 밖(ex vivo)에서는 줄기세포능(stemness)을 잃어 치료 가능성(therapeutic potential)이 감소하고, 생체 내(in vivo)에서는 추가적인 장벽 때문에 치료 효능(therapeutic efficacy)이 감소하지만, 중간엽 줄기세포의 배양 최적화 및 유전자 변형(genetic modification)으로 이러한 장벽을 극복할 수 있을 것으로 기대하고 있다. 유전자 변형 중 바이러스성 형질도입(transduction)은 효율적이지만, 통합 바이러스 벡터의 변이 유발성 및 바이러스 항원의 잠재적 면역원성(immunogenicity)과 관련된 안전성 문제로 제한되며, 비 바이러스성 전달 방법은 비효율성(inefficiency) 및 독성(toxicity)에 의해 제한되지만, 보다 더 안전하고 유연하며 확장 가능하여 중간엽 줄기세포 치료요법 엔지니어링에 매력적인 분야로 주목받고 있다.Mesenchymal stem cells (MSCs) are multipotent adult stem cells that can be readily isolated and expanded from many tissues, including bone marrow, adipose tissue, and umbilical cord. ) has been actively studied for use in Mesenchymal stem cell therapy (MSC) has had some success, but none has yet been approved by the US Food and Drug Administration (FDA) for clinical use. Mesenchymal stem cells lose their stemness in ex vivo , reducing their therapeutic potential, and in vivo , their therapeutic efficacy decreases due to additional barriers. It is expected that these barriers can be overcome through optimization of mesenchymal stem cell culture and genetic modification. Viral transduction during genetic modification is efficient, but is limited by safety issues related to the mutagenicity of integrating viral vectors and the potential immunogenicity of viral antigens, and non-viral delivery methods are inefficient and toxicity, but is attracting attention as an attractive field for engineering mesenchymal stem cell therapies because it is safer, more flexible and scalable.

또한, 유전자 변형 중 비-바이러스성 벡터를 이용한 형질감염(transfection) 방법에는 미량주입(microinjection), 전기천공법(electroporation) 및 나노 담체 전달(nanocarrier delivery) 등이 있는데, 이 중 미량주입 및 전기천공법은 효율적이지만 처리량 및 세포독성으로 인해 제한되는 것으로 알려져 있고, 다양한 나노 담체들은 핵산을 세포로 전달한다는 것이 입증되었지만 중간엽 줄기세포에서의 나노 담체 전달 효율이 비효율적인 것으로 알려져 있다. 이처럼 중간엽 줄기세포는 재생의학 분야에서 널리 활용되고 있는 것에 비하여 치료효능은 충분하지 못한 것으로 보고되고 있다. 따라서 이를 극복하기 위하여 유전자 발현을 강화하고자 하는 연구가 집중되고 있다.In addition, transfection methods using non-viral vectors among genetic modification include microinjection, electroporation, and nanocarrier delivery, among which microinjection and electroporation Although the method is efficient, it is known to be limited due to throughput and cytotoxicity, and various nanocarriers have been demonstrated to deliver nucleic acids into cells, but nanocarrier delivery efficiency in mesenchymal stem cells is known to be inefficient. As such, mesenchymal stem cells are reported to have insufficient therapeutic efficacy compared to those widely used in the field of regenerative medicine. Therefore, in order to overcome this, research to enhance gene expression is being concentrated.

이에 본 발명자들은 유전자 형질감염이 어려운 세포로의 효과적인 유전자 형질감염 방법을 개발하기 위하여 노력한 결과, 성체줄기세포에 유전자 형질감염 시 세포독성 완화 막 투과 펩타이드(cytotoxic mitigating cell-penetrating peptides, CMCP)를 함께 이용하는 경우 낮은 세포독성, 높은 형질감염 효율 및 이에 따른 증가된 단백질 발현을 나타내는 것을 확인하였다. 따라서, 상기 세포독성 완화 막 투과 펩타이드를 유전자 형질감염이 어려운 세포로의 유전자 형질감염 효율 향상을 위한 제제로 유용하게 이용할 수 있음을 밝힘으로써, 본 발명을 완성하였다.Accordingly, the present inventors have made efforts to develop an effective gene transfection method for cells that are difficult to transfect genes. When used, it was confirmed that low cytotoxicity, high transfection efficiency and thus increased protein expression were exhibited. Accordingly, the present invention was completed by revealing that the cytotoxicity-mitigating membrane-penetrating peptide can be usefully used as an agent for improving the efficiency of gene transfection into cells difficult for gene transfection.

본 발명은 핵산 또는 유전자 형질감염 효율을 개선하는 세포독성 완화 막 투과 펩타이드 및 이의 용도를 제공하기 위한 것이다.The present invention is to provide cytotoxicity mitigating membrane penetrating peptides that improve nucleic acid or gene transfection efficiency and uses thereof.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 세포독성 완화 막 투과 펩타이드를 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention provides a cytotoxicity alleviating membrane penetrating peptide represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.

또한, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 세포독성 완화 막 투과 펩타이드를 포함하는 핵산 또는 유전자 형질감염용 키트를 제공한다.In addition, the present invention provides a nucleic acid or gene transfection kit comprising the cytotoxicity reducing membrane penetrating peptide represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.

아울러, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 펩타이드를 처리하고 핵산 또는 유전자 형질감염하는 단계를 포함하는, 세포독성 완화 막 투과 펩타이드를 이용한 핵산 또는 유전자 형질감염 방법을 제공한다.In addition, the present invention provides a nucleic acid or gene transfection method using a membrane-penetrating peptide that reduces cytotoxicity, comprising the steps of processing the peptide represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and transfecting the nucleic acid or gene.

본 발명에서는 성체줄기세포로 유전자 형질감염 시 본 발명에 따른 세포독성 완화 막 투과 펩타이드(cytotoxic mitigating cell-penetrating peptides, CMCP)를 함께 이용하는 경우 낮은 세포독성, 높은 형질감염 효율 및 이에 따른 증가된 단백질 발현을 나타내는 것을 확인하였으므로, 상기 세포독성 완화 막 투과 펩타이드를 유전자 형질감염이 어려운 세포로의 유전자 형질감염 효율 향상을 위한 제제로 유용하게 이용할 수 있다.In the present invention, when the cytotoxic mitigating cell-penetrating peptides (CMCP) according to the present invention are used together during gene transfection into adult stem cells, low cytotoxicity, high transfection efficiency and consequently increased protein expression Since it was confirmed that the cytotoxicity mitigating membrane penetrating peptide can be usefully used as an agent for improving gene transfection efficiency into cells difficult to transfect genes.

도 1은 본 발명에 따른 세포독성 완화 막 투과 펩타이드(cytotoxic mitigating cell-penetrating peptides, CMCP)의 세포독성 완화 효과를 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명에 따른 CMCP의 세포막 투과 효율을 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명에 따른 CMCP의 유전자 형질감염 효율을 나타낸 도이다.
도 4는 본 발명에 따른 CMCP에 의한 유전자 형질감염으로 발현된 단백질을 나타낸 도이다.
도 5는 본 발명에 따른 CMCP의 형질감염 방법 및 용량에 의한 유전자 형질감염 효율을 나타낸 도이다.1 is a diagram showing the cytotoxicity mitigating effect of cytotoxic mitigating cell-penetrating peptides (CMCP) according to the present invention.
2 is a diagram showing the cell membrane penetration efficiency of CMCP according to the present invention.
Figure 3 is a diagram showing the gene transfection efficiency of CMCP according to the present invention.
Figure 4 is a diagram showing the protein expressed by gene transfection by CMCP according to the present invention.
5 is a diagram showing gene transfection efficiency according to the transfection method and dose of CMCP according to the present invention.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.

본 발명은 세포의 핵산 또는 유전자 형질감염 효율을 개선하는 세포독성 완화 막 투과 펩타이드로, 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 세포독성 완화 막 투과 펩타이드를 제공한다.The present invention provides a cytotoxicity mitigating membrane-penetrating peptide represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 as a cytotoxicity mitigating membrane-penetrating peptide that improves cell nucleic acid or gene transfection efficiency.

본 발명에서, 상기 세포독성 완화 막 투과 펩타이드는 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 TAT 부위, 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 힌지(hinge) 부위 및 서열번호 4의 아미노산 서열로 표시되는 DNA 결합 부위를 포함한다.In the present invention, the cytotoxicity alleviating membrane penetrating peptide is a TAT region represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, a hinge region represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, and a DNA binding represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 include the part

본 발명에서, 상기 용어 “형질감염”은 세포, 구체적으로 진핵세포로의 핵산 또는 유전자를 도입하는 것을 말한다.In the present invention, the term "transfection" refers to introducing a nucleic acid or gene into a cell, specifically a eukaryotic cell.

본 발명에서, 상기 핵산은 공유결합으로 연결된 2개 이상의 뉴클레오티드로 이루어진 임의의 중합체로, 예컨대 DNA 분자, RNA 분자, PNA 분자, 앱타머 또는 이들의 혼합물일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 핵산은 L-뉴클레오티드, D-뉴클레오티드 또는 혼합물로 이루어진 경우 또한 본 발명의 범위 내에 있다. 또한, 개별 뉴클레오티드의 염기 부분, 당 부분 및/또는 포스페이트 부분은 핵산 또는 각각의 유사체를 형성하는 각각 임의의 뉴클레오티드에 대해 개별적 및 독립적으로 수식될 수 있다. 상기 수식된 당 부분은 당 부분의 2’ 원자에 메틸, 메톡시, 에틸 또는 에톡시기를 갖는 것일 수 있고, 상기 수식된 포스페이트 부분은 포스포티오에이트일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 DNA 분자는 선형 DNA 또는 환형 DNA, 예를 들면, 원형 플라스미드, 에피솜 또는 발현 벡터 형태의 DNA일 수 있고, 상기 RNA 분자는 세포 내부로 전달되는 것이 추구되는 mRNA, siRNA, miRNA, 안티센스 RNA 또는 리보자임일 수 있으나 이에 한정되지 않으며 임의의 유형의 RNA를 포함한다.In the present invention, the nucleic acid may be any polymer composed of two or more nucleotides linked by covalent bonds, such as DNA molecules, RNA molecules, PNA molecules, aptamers, or mixtures thereof, but is not limited thereto. Such nucleic acids are also within the scope of the present invention if they consist of L-nucleotides, D-nucleotides or mixtures. In addition, the base portion, sugar portion and/or phosphate portion of individual nucleotides may be individually and independently modified for each of the nucleotides forming the nucleic acid or the respective analog. The modified sugar moiety may have a methyl, methoxy, ethyl or ethoxy group at the 2' atom of the sugar moiety, and the modified phosphate moiety may be phosphothioate, but is not limited thereto. The DNA molecule may be linear DNA or circular DNA, eg DNA in the form of a circular plasmid, episome or expression vector, and the RNA molecule may be mRNA, siRNA, miRNA, antisense RNA or It can be, but is not limited to, a ribozyme, including any type of RNA.

본 발명에서, 상기 유전자는 벡터에 의해 형질감염이 이루어질 수 있다. 상기 벡터는 숙주 세포에서 목적 유전자를 발현시키기 위한 수단을 의미한다. 상기 벡터는 상기 유전자 발현을 위한 요소(elements)를 포함하는 것으로, 복제원점(replication origin), 프로모터, 작동 유전자(operator), 전사 종결 서열(terminator) 등을 포함할 수 있고, 숙주 세포의 게놈 내로의 도입을 위한 적절한 효소 부위(예컨대, 제한 효소 부위) 및/또는 숙주 세포 내로의 성공적인 도입을 확인하기 위한 선별 마커 및/또는 단백질로의 번역을 위한 리보좀 결합 부위(ribosome binding site; RBS), IRES(Internal Ribosome Entry Site) 등을 추가로 포함할 수 있다. 상기 벡터는 상기 프로모터 이외의 전사 조절 서열(예를 들어, 인핸서 등)을 추가로 포함할 수 있다.In the present invention, the gene may be transfected with a vector. The vector refers to a means for expressing a target gene in a host cell. The vector includes elements for expressing the gene, may include a replication origin, a promoter, an operator, a transcription terminator, and the like, and is incorporated into the genome of a host cell. A ribosome binding site (RBS) for translation into a protein and/or an appropriate enzyme site (e.g., restriction enzyme site) for incorporation and/or selectable markers to confirm successful incorporation into the host cell, IRES (Internal Ribosome Entry Site) and the like may be additionally included. The vector may further include transcription control sequences (eg, enhancers, etc.) other than the promoter.

또한, 상기 벡터는 당업계에 공지된 플라스미드 DNA, 재조합 벡터 또는 기타 매개체일 수 있고, 구체적으로 선형 DNA 플라스미드 DNA, 재조합 비바이러스성 벡터, 재조합 바이러스성 벡터 또는 유전자 발현 유도 벡터 시스템(inducible gene expression vector system)일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.In addition, the vector may be a plasmid DNA, a recombinant vector or other medium known in the art, specifically, a linear DNA plasmid DNA, a recombinant non-viral vector, a recombinant viral vector or an inducible gene expression vector system. system), but is not limited thereto.

본 발명에서, 상기 세포는 연구 및 임상 현장에서 일상적으로 사용되는 임의의 세포 및 세포주, 구체적으로 진핵 세포, 특히 배양으로 성장한 세포, 동물 또는 인간의 조직에서 발견된 세포일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.In the present invention, the cells may be any cells and cell lines routinely used in research and clinical settings, specifically eukaryotic cells, especially cells grown in culture, cells found in animal or human tissues, but are not limited thereto. .

또한, 상기 세포는 핵산 또는 유전자 형질감염이 어려운 세포일 수 있다. 여기서 “형질감염이 어려운”이란 표준 상업적으로 입수 가능한 형질감염 시약, 예를 들면, 양이온성 지질(이의 예는 리포펙타민(등록상표) 2000, 리포펙타민(등록상표) LTX, 리포펙타민(등록상표), 리포펙틴(등록상표), 퓨진(등록상표) HD, X-트림진(상표명) HP 등을 포함하지만 이에 한정되지 않음)을 사용하여 형질감염되는 경우, 전형적으로 60 ％ 미만의 형질감염 효율을 나타내는 임의의 세포 또는 세포주를 일반적으로 나타내는 상대적인 용어이다.In addition, the cell may be a cell in which nucleic acid or gene transfection is difficult. Here, “difficult to transfect” means standard commercially available transfection reagents, such as cationic lipids (examples of which are Lipofectamine® 2000, Lipofectamine® LTX, Lipofectamine ( (including but not limited to), Lipofectin®, Fugene® HD, X-Trimgene® HP, etc.), typically less than 60% of the transfection It is a relative term that generally refers to any cell or cell line that exhibits infection efficiency.

상기 세포는 예컨대, 줄기세포, 전구세포 또는 동물세포일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 또한, 상기 줄기세포는 구체적으로 배아줄기세포, 성체줄기세포 또는 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cell, iPS)일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.The cells may be, for example, stem cells, progenitor cells or animal cells, but are not limited thereto. In addition, the stem cells may specifically be embryonic stem cells, adult stem cells, or induced pluripotent stem cells (iPS), but are not limited thereto.

또한, 상기 성체줄기세포는 배아 발달 단계 이후에도 성체 전반에서 발견되는 미분화된 줄기세포로 이러한 성체줄기세포는 주변 조직의 특성에 세포 자신을 맞추어 분화하는 조직특이적 분화능력(site-specific differentiation)을 가지고 있다. 성체줄기세포는 골수, 혈액, 뇌, 피부, 지방, 골격근, 탯줄, 제대혈 등의 다양한 성체 세포로부터 유래할 수 있다. 구체예로, 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell, MSC), 골격근 줄기세포(skeletal muscle stem cell), 조혈 줄기세포(hematopoietic stem cell), 신경 줄기세포(neural stem cell, NSC), 지방유래 줄기세포(adipose-derived stem cell), 지방유래 전구세포(adipose-derived progenitor cell), 혈관내피 전구세포(vascular endothelial progenitor cell) 등을 들 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.In addition, the adult stem cells are undifferentiated stem cells found throughout the adult body even after the embryonic development stage, and these adult stem cells have site-specific differentiation ability to differentiate themselves according to the characteristics of the surrounding tissues. there is. Adult stem cells may be derived from various adult cells such as bone marrow, blood, brain, skin, fat, skeletal muscle, umbilical cord, and umbilical cord blood. Specifically, mesenchymal stem cells (MSC), skeletal muscle stem cells, hematopoietic stem cells, neural stem cells (NSC), adipose-derived stem cells (adipose-derived stem cells), adipose-derived progenitor cells, vascular endothelial progenitor cells, and the like, but are not limited thereto.

또한, 상기 중간엽 줄기세포는 이미 성인이 된 몸의 각 부위에서 얻어지는 성체조직으로부터 유래된 줄기세포로, 제대, 제대혈, 골수, 혈액, 지방, 근육, 골격, 신경, 피부, 골막, 양막 또는 태반에서 분리될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.In addition, the mesenchymal stem cells are stem cells derived from adult tissues obtained from each part of the body that has already become an adult, such as umbilical cord, umbilical cord blood, bone marrow, blood, fat, muscle, skeletal, nerve, skin, periosteum, amnion, or placenta. It can be separated from, but is not limited thereto.

본 발명에서, 상기 핵산 또는 유전자 형질감염은 당 분야의 통상의 지식을 가진 기술자들에게 잘 알려진 방법을 이용할 수 있다. 상기 핵산 또는 유전자 형질감염 방법은 예를 들면, 칼슘 포스페이트-매개된 형질감염, 양이온 폴리머 형질감염(예로써, DEAE-덱스트란(dextran) 또는 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol, PEG)), 비로좀(virosome) 형질감염, 양이온성 지질을 이용한 형질감염, 리포펙션(lipofection)(예로써, 리포좀 형질감염, 양이온 리포좀 형질감염, 면역리포좀 형질감염), 비리포좀 지질 형질감염, 덴드리머(dendrimer) 형질감염, 열 쇼크 형질감염, 마그네토펙션(magnetofection), 임팔레펙션(impalefection), 소노포레이션(sonoporation) 또는 이들의 조합에 의하여 수행될 수 있지만, 이에 한정되지 않는다. 상기 형질감염 방법은 당 분야에 공지되어 있다(예로써, “Current Protocols in Molecular Biology” Ausubel et al., John Wiley & Sons, New York, 2003 or “Molecular Cloning: A Laboratory Manual” Sambrook & Russell, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 3rd edition, 2001).In the present invention, the nucleic acid or gene transfection may use methods well known to those skilled in the art. The nucleic acid or gene transfection methods include, for example, calcium phosphate-mediated transfection, cationic polymer transfection (eg, DEAE-dextran or polyethylene glycol (PEG)), virosome ) transfection, transfection with cationic lipids, lipofection (e.g., liposomal transfection, cationic liposome transfection, immunoliposomal transfection), non-liposomal lipid transfection, dendrimer transfection, heat Shock transfection, magnetofection, impalefection, sonoporation, or a combination thereof may be performed, but is not limited thereto. Such transfection methods are known in the art (e.g., “Current Protocols in Molecular Biology” Ausubel et al., John Wiley & Sons, New York, 2003 or “Molecular Cloning: A Laboratory Manual” Sambrook & Russell, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 3rd edition, 2001).

이에, 상기 세포독성 완화 막 투과 펩타이드는 상기 핵산 또는 유전자 형질감염 방법에 사용되는 형질감염 시약과 조합으로서 사용될 수 있고, 상기 형질감염 시약과 조합으로 사용하여 핵산 또는 유전자 형질감염 효율을 개선할 수 있다.Thus, the cytotoxicity reducing membrane penetrating peptide may be used in combination with the transfection reagent used in the nucleic acid or gene transfection method, and the nucleic acid or gene transfection efficiency can be improved by using in combination with the transfection reagent .

또한, 상기 세포독성 완화 막 투과 펩타이드는 상기 핵산 또는 유전자 형질감염 시 유발되는 세포독성을 감소시킬 수 있다.In addition, the cytotoxicity alleviating membrane penetrating peptide can reduce cytotoxicity induced during transfection of the nucleic acid or gene.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 핵산 또는 유전자 형질감염 방법을 이용한 유전자 형질감염 시, 구체적으로 리포펙션 및/또는 마그네토펙션을 이용한 유전자 형질감염 시 본 발명에 따른 세포독성 완화 막 투과 펩타이드를 조합할 경우 유전자 형질감염 효율을 3 내지 15배 개선할 수 있고, 구체적으로 4 내지 12배 개선할 수 있으며, 더 구체적으로 5 내지 9배 개선할 수 있음을 확인하였다.In one embodiment of the present invention, when gene transfection using the nucleic acid or gene transfection method, specifically, when gene transfection using lipofection and / or magnetofection, the cytotoxicity alleviating membrane-penetrating peptide according to the present invention is combined. In this case, it was confirmed that the gene transfection efficiency could be improved by 3 to 15 times, specifically by 4 to 12 times, and more specifically by 5 to 9 times.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 세포독성 완화 막 투과 펩타이드(cytotoxic mitigating cell-penetrating peptides, CMCP)를 합성하였다.In a specific embodiment of the present invention, the present inventors synthesized cytotoxic mitigating cell-penetrating peptides (CMCP) represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.

또한, 본 발명자들은 성체줄기세포에 유전자 형질감염 시 기존의 유전자 형질감염 방법으로 리포펙션 및/또는 마그네토펙션과 상기 펩타이드를 함께 사용할 경우 리포펙션 또는 마그네토펙션 단독으로 사용하는 경우와 비교하여In addition, when the present inventors use lipofection and / or magnetofection together with the peptide as a conventional gene transfection method when transfecting genes into adult stem cells, compared to the case of using lipofection or magnetofection alone

세포독성이 완화되고, 세포막 투과성, 유전자 형질감염 효율 및 형질감염된 유전자로부터 단백질의 발현이 증가하는 것을 확인하였다.It was confirmed that cytotoxicity was alleviated, cell membrane permeability, gene transfection efficiency, and protein expression from the transfected gene increased.

따라서, 본 발명에 따른 세포독성 완화 막 투과 펩타이드를 성체 줄기세포를 포함한 유전자 형질감염이 어려운 세포로의 핵산 또는 유전자 형질감염 효율 개선을 위한 제제로 유용하게 이용할 수 있다.Therefore, the cytotoxicity-mitigating membrane-penetrating peptide according to the present invention can be usefully used as an agent for improving the efficiency of nucleic acid or gene transfection into cells that are difficult to transfect genes, including adult stem cells.

또한, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 세포독성 완화 막 투과 펩타이드를 포함하는 핵산 또는 유전자 형질감염용 키트를 제공한다.In addition, the present invention provides a nucleic acid or gene transfection kit comprising the cytotoxicity reducing membrane penetrating peptide represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.

본 발명에서, 상기 핵산 또는 유전자 형질감염용 키트는 상기 세포독성 완화 막 투과 펩타이드를 0.00001 내지 100 ㎍ 포함할 수 있고, 보다 구체적으로 0.0001 내지 60 ㎍ 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.In the present invention, the nucleic acid or gene transfection kit may include 0.00001 to 100 μg of the cytotoxicity mitigating membrane-penetrating peptide, and more specifically, 0.0001 to 60 μg, but is not limited thereto.

본 발명에서, 상기 핵산 또는 유전자 형질감염 방법은 예를 들면, 칼슘 포스페이트-매개된 형질감염, 양이온 폴리머 형질감염(예로써, DEAE-덱스트란(dextran) 또는 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol, PEG)), 비로좀(virosome) 형질감염, 양이온성 지질을 이용한 형질감염, 리포펙션(lipofection)(예로써, 리포좀 형질감염, 양이온 리포좀 형질감염, 면역리포좀 형질감염), 비리포좀 지질 형질감염, 덴드리머(dendrimer) 형질감염, 열 쇼크 형질감염, 마그네토펙션(magnetofection), 임팔레펙션(impalefection), 소노포레이션(sonoporation) 또는 이들의 조합을 들 수 있지만, 이에 한정되지 않는다.In the present invention, the nucleic acid or gene transfection methods include, for example, calcium phosphate-mediated transfection, cationic polymer transfection (eg, DEAE-dextran or polyethylene glycol (PEG)), virosome transfection, transfection with cationic lipids, lipofection (eg, liposome transfection, cationic liposome transfection, immunoliposome transfection), non-liposomal lipid transfection, dendrimer transfection, heat shock transfection, magnetofection, impalefection, sonoporation, or combinations thereof, but is not limited thereto.

이에, 상기 핵산 또는 유전자 형질감염용 키트는 상기 핵산 또는 유전자 형질감염 방법에 이용되는 형질감염 시약을 포함할 수 있다. 상기 형질감염 시약은 당 분야의 통상의 지식을 가진 기술자들에게 잘 알려져 있다.Thus, the nucleic acid or gene transfection kit may include a transfection reagent used in the nucleic acid or gene transfection method. Such transfection reagents are well known to those skilled in the art.

일예로, 상기 형질감염 시약은 양이온성 중합체, 예를 들면, 폴리에틸렌이민(PEI), 양으로 하전된 아미노산의 중합체, 예를 들면, 폴리리신 및 폴리아르기닌, 양으로 하전된 덴드리머 및 분절된 덴드리머, 양이온성 β-사이클로덱스트린 함유 중합체(CD-중합체), DEAE-덱스트란 등을 포함하는 하나 이상의 화합물 및/또는 조성물을 포함할 수 있지만, 이에 한정되지 않는다. 또한, 상기 형질감염 시약은 양이온성 지질 및/또는 중성 지질을 포함할 수 있다. 상기 지질의 예로는 N-[1-(2,3-다이올레일옥시)프로필]-N,N,N-트라이메틸암모늄 클로라이드(DOTMA), 다이올레오일포스파티딜콜린(DOPE), 1,2-비스(올레오일옥시)-3-(4’-트라이메틸암모니오)프로판(DOTAP), 1,2-다이올레오일-3-(4’-트라이메틸암모니오)부타노일-sn-글리세롤(DOTB), 1,2-다이올레오일-3-석시닐-sn-글리세롤 콜린 에스터(DOSC), 콜레스테릴(4’-트라이메틸암모니오)부타노에이트(ChoTB), 세틸트라이메틸암모늄 브로마이드(CTAB), 1,2-다이올레오일-3-다이메틸-하이드록시에틸 암모늄 브로마이드(DORI), 1,2-다이올레일옥시프로필-3-다이메틸-하이드록시에틸 암모늄 브로마이드(DORIE), 1,2-다이미리스틸옥시프로필-3-다이메틸-하이드록시에틸 암모늄 브로마이드(DMRIE), O,O'-다이도데실-N-[p(2-트라이메틸암모니오에틸옥시)벤조일]-N,N,N-트라이메틸암모늄 클로라이드, 하나 이상의 지질에 컨쥬게이트된 스퍼민(예를 들면, 5-카복시스퍼밀글리신 다이옥타데실아마이드(DOGS), N,NI ,NII ,NIII-테트라메틸-N,NI,NII,NIII-테트라팔미틸스퍼민(TM-TPS) 및 다이팔미토일파스페이티딜에탄올아민 5-카복시스퍼밀아민(DPPES)), 리포폴리리신(DOPE에 컨쥬게이트된 폴리리신), TRIS(트리스(하이드록시메틸)아미노메탄, 트로메타민) 컨쥬게이트된 지방산(TFA) 및/또는 펩타이드, 예를 들면, 트릴리실-알라닐-TRIS 모노-, 다이- 및 트라이-팔미테이트, (3β-[N--(N',N'-다이메틸아미노에탄)-카바모일]콜레스테롤(DCChol), N-(α-트라이메틸암모니오아세틸)-다이도데실-D-글루타메이트 클로라이드(TMAG), 다이메틸 다이옥타데실 암모늄 브로마이드(DDAB), 2,3-다이올레일옥시-N-[2(스퍼민-카복스아미도)에틸]-N,N-다이메틸-1-프로판아미니늄 트라이플루오로아세테이트(DOSPA) 및 이의 조합을 들 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.In one embodiment, the transfection reagent is a cationic polymer such as polyethyleneimine (PEI), a polymer of positively charged amino acids such as polylysine and polyarginine, positively charged dendrimers and segmented dendrimers, one or more compounds and/or compositions including, but not limited to, cationic β-cyclodextrin containing polymers (CD-polymers), DEAE-dextran, and the like. In addition, the transfection reagent may include cationic lipids and/or neutral lipids. Examples of such lipids include N-[1-(2,3-dioleyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammonium chloride (DOTMA), dioleoylphosphatidylcholine (DOPE), 1,2-bis (Oleoyloxy)-3-(4'-trimethylammonio)propane (DOTAP), 1,2-dioleoyl-3-(4'-trimethylammonio)butanoyl-sn-glycerol (DOTB) , 1,2-dioleoyl-3-succinyl-sn-glycerol choline ester (DOSC), cholesteryl (4'-trimethylammonio) butanoate (ChoTB), cetyltrimethylammonium bromide (CTAB ), 1,2-dioleoyl-3-dimethyl-hydroxyethyl ammonium bromide (DORI), 1,2-dioleyloxypropyl-3-dimethyl-hydroxyethyl ammonium bromide (DORIE), 1, 2-Dimyristyloxypropyl-3-dimethyl-hydroxyethyl ammonium bromide (DMRIE), O,O'-didodecyl-N-[p(2-trimethylammonioethyloxy)benzoyl]-N, N,N-trimethylammonium chloride, spermine conjugated to one or more lipids (e.g., 5-carboxypermylglycine dioctadecylamide (DOGS), N,NI,NII,NIII-tetramethyl-N,N I ,N II ,N III -tetrapalmitylspermine (TM-TPS) and dipalmitoylphasphatidylethanolamine 5-carboxypermylamine (DPPES)), lipopolylysine (polylysine conjugated to DOPE) , TRIS (tris(hydroxymethyl)aminomethane, tromethamine) conjugated fatty acids (TFA) and/or peptides such as trilisyl-alanyl-TRIS mono-, di- and tri-palmitate; (3β-[N--(N',N'-dimethylaminoethane)-carbamoyl]cholesterol (DCChol), N-(α-trimethylammonioacetyl)-didodecyl-D-glutamate chloride (TMAG ), dimethyl dioctadecyl ammonium bromide (DDAB), 2,3-dioleyloxy-N-[2(spermine-carboxamido)ethyl]-N,N-dimethyl-1-propanamininium trifluoroacetate (DOSPA) and combinations thereof, but is not limited thereto.

당 분야의 통상의 지식을 가진 기술자들은 상기 언급된 지질의 특정한 조합이 세포 내로 핵산의 도입에 특히 적합하다는 것을 인식할 것이고, 예를 들면, DOSPA 및 DOPE의 3:1(w/w) 조합이 라이프 테크놀로지스 코포레이션(Life Technologies Corporation, 캘리포니아주의 칼스배드시에 소재)으로부터 상표명 리포펙타민(상표명)하에 이용 가능하고, DOTMA 및 DOPE의 1:1(w/w) 조합이 라이프 테크놀로지스 코포레이션(캘리포니아주의 칼스배드시에 소재)으로부터 상표명 리포펙틴(등록상표)하에 입수 가능하고, DMRIE 및 콜레스테롤의 1:1(M/M) 조합이 라이프 테크놀로지스 코포레이션(캘리포니아주의 칼스배드시에 소재)으로부터 상표명 DMRIE-C 시약하에 입수 가능하고, TM-TPS 및 DOPE의 1:1.5(M/M) 조합이 라이프 테크놀로지스 코포레이션(캘리포니아주의 칼스배드시에 소재)으로부터 상표명 셀펙틴(CELLFECTIN)(등록상표)하에 입수 가능하고, DDAB 및 DOPE의 1:2.5(w/w) 조합이 라이프 테크놀로지스 코포레이션(캘리포니아주의 칼스배드시에 소재)으로부터 상표명 리포펙테이스(LIPOFECTACE)(등록상표)하에 입수 가능하다. Those skilled in the art will recognize that certain combinations of the aforementioned lipids are particularly suitable for the introduction of nucleic acids into cells, for example a 3:1 (w/w) combination of DOSPA and DOPE is Available under the trademark Lipofectamine™ from Life Technologies Corporation, Carlsbad, Calif., a 1:1 (w/w) combination of DOTMA and DOPE is available from Life Technologies Corporation, Carlsbad, Calif. Badsee) under the trademark Lipofectin®, a 1:1 (M/M) combination of DMRIE and cholesterol is available from Life Technologies Corporation (Carlsbad, Calif.) under the trademark DMRIE-C reagent. A 1:1.5 (M/M) combination of TM-TPS and DOPE is available under the tradename CELLFECTIN® from Life Technologies Corporation (Carlsbad, Calif.), DDAB and DOPE in a 1:2.5 (w/w) combination is available from Life Technologies Corporation (Carlsbad, Calif.) under the trademark LIPOFECTACE®.

또한, 상기 형질감염 시약의 일 예로 지질 응집체, 예를 들면 리포좀을 포함할 수 있다. 특히, 하나 이상의 양이온성 지질을 포함하는 지질 응집체를 들 수 있고, 여기서 하나의 일반적으로 사용되는 양이온성 지질은 N-[1-(2,3-다이올레오일옥시)프로필]-N,N,N-트라이메틸암모늄 클로라이드(DOTMA)를 들 수 있다. 또한, 상기 리포좀으로 단독 또는 다이올레오일포스파티딜에탄올아민(DOPE)과의 1:1 혼합물로서 DOTMA를 포함하는 리포좀을 들 수 있다. DOTMA:DOPE의 1:1 혼합물은 라이프 테크놀로지스 코포레이션(캘리포니아주의 칼스배드시에 소재)으로부터 상표명 리포펙틴(상표명)하에 입수 가능하다.In addition, an example of the transfection reagent may include a lipid aggregate, for example, a liposome. In particular, lipid aggregates comprising one or more cationic lipids, wherein one commonly used cationic lipid is N-[1-(2,3-dioleoyloxy)propyl]-N,N, N-trimethylammonium chloride (DOTMA). Also, as the liposome, a liposome containing DOTMA alone or as a 1:1 mixture with dioleoylphosphatidylethanolamine (DOPE) may be mentioned. A 1:1 mixture of DOTMA:DOPE is available under the trade name Lipofectin™ from Life Technologies Corporation (Carlsbad, Calif.).

또한, 상기 형질감염 시약의 일 예로 라이프 테크놀로지스(Life technologies)로부터 입수가능한 리포펙타민 2000(상표명)(참조: 제WO 00/27795호로서 공개된 미국 국제 특허 제PCT/US99/26825호), 엑스피펙타민(EXPIFECTAMINE)(상표명), 리오펙타민(LIOFECTAMINE)(상표명) RNAiMAX, 리포펙타민(상표명) LTX, 올리고펙타민(OLIGOFECTAMINE)(상표명), 셀펙틴(상표명), 인비보펙타민(INVIVOFECTAMINE)(상표명), 인비보펙타민(상표명) 2.0을 포함할 수 있다.In addition, as an example of the transfection reagent, Lipofectamine 2000 (trade name) available from Life technologies (see: US International Patent No. PCT/US99/26825 published as WO 00/27795), XP EXPIFECTAMINE (trade name), LIOFECTAMINE (trade name) RNAiMAX, Lipofectamine (trade name) LTX, OLIGOFECTAMINE (trade name), Cellpectin (trade name), INVIVOFECTAMINE (trade name), Invivofectamine (trade name) 2.0.

또한, 상기 형질감염 시약의 일 예로 자성 나노입자, 예를 들어, 산화철(Fe2O3, Fe3O4) 나노입자를 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.In addition, an example of the transfection reagent may include magnetic nanoparticles, for example, iron oxide (Fe 2 O 3 , Fe 3 O 4 ) nanoparticles, but is not limited thereto.

또한, 상기 형질감염 시약의 일 예로 카본 나노섬유, 카본 나노튜브 또는 나노와이어를 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.In addition, examples of the transfection reagent may include carbon nanofibers, carbon nanotubes, or nanowires, but are not limited thereto.

또한, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 세포독성 완화 막 투과 펩타이드를 처리하고 핵산 또는 유전자 형질감염하는 단계;를 포함하는, 세포독성 완화 막 투과 펩타이드를 이용한 핵산 또는 유전자 형질감염 방법을 제공한다.In addition, the present invention treats the cytotoxicity alleviating membrane penetrating peptide represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and transfects the nucleic acid or gene; a nucleic acid or gene transfection method using a cytotoxicity alleviating membrane penetrating peptide comprising to provide.

본 발명에서, 상기 세포독성 완화 막 투과 펩타이드는 0.00001 내지 50 ㎍으로 처리될 수 있고, 보다 구체적으로 0.0001 내지 10 ㎍으로 처리될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.In the present invention, the cytotoxicity alleviating membrane penetrating peptide may be treated with 0.00001 to 50 μg, more specifically 0.0001 to 10 μg, but is not limited thereto.

본 발명에서, 상기 핵산 또는 유전자 형질감염 방법은 칼슘 포스페이트-매개된 형질감염, 양이온 폴리머 형질감염, 비로좀(virosome) 형질감염, 리포펙션(lipofection), 비리포좀 지질 형질감염, 덴드리머(dendrimer) 형질감염, 열 쇼크 형질감염, 마그네토펙션(magnetofection), 임팔레펙션(impalefection) 및 소노포레이션(sonoporation) 또는 이들의 조합에 의하여 수행될 수 있지만, 이에 한정되지 않는다.In the present invention, the nucleic acid or gene transfection method includes calcium phosphate-mediated transfection, cationic polymer transfection, virosome transfection, lipofection, non-liposomal lipid transfection, dendrimer transfection It may be performed by infection, heat shock transfection, magnetofection, impalefection, and sonoporation, or a combination thereof, but is not limited thereto.

이에 본 발명의 일 예에서는 하기의 단계를 거쳐 핵산 또는 유전자를 형질감염할 수 있다:Accordingly, in one example of the present invention, nucleic acids or genes can be transfected through the following steps:

1) 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 세포독성 완화 막 투과 펩타이드, 형질감염 시약, 및 핵산 또는 유전자를 혼합하는 단계; 및1) mixing the cytotoxicity reducing membrane penetrating peptide represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, a transfection reagent, and a nucleic acid or gene; and

2) 상기 단계 1)의 혼합물을 세포에 처리하는 단계.2) treating cells with the mixture of step 1).

상기 단계 1)에서 형질감염 시약은 수행되는 핵산 또는 유전자 형질감염 방법에 따라 선택적으로 포함될 수 있다.In step 1), the transfection reagent may be optionally included depending on the nucleic acid or gene transfection method to be performed.

상기 단계 2)에서 물리적 힘, 예컨대, 전기 펄스, 자성, 열 또는 초음파가 가해질 수 있다.In step 2), a physical force such as an electric pulse, magnetism, heat or ultrasonic waves may be applied.

한편, 상기 세포독성 완화 막 투과 펩타이드, 핵산 또는 유전자 형질감염 방법, 형질감염 시약, 및 핵산 또는 유전자에 대해서는 상기 펩타이드 및 이를 포함하는 핵산 또는 유전자 형질감염용 키트에 대한 설명과 동일한 바, 구체적인 설명은 상기 내용을 원용한다.On the other hand, the cytotoxicity alleviating membrane penetrating peptide, the nucleic acid or gene transfection method, the transfection reagent, and the nucleic acid or gene are the same as the description of the peptide and the nucleic acid or gene transfection kit containing the same, the specific description Use the above content.

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail by examples.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.However, the following examples are only to illustrate the present invention, and the content of the present invention is not limited by the following examples.

<실시예 1> 세포독성 완화 막 투과 펩타이드(cytotoxic mitigating cell-penetrating peptides, CMCP)의 합성<Example 1> Synthesis of cytotoxic mitigating cell-penetrating peptides (CMCP)

서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 CMCP 펩타이드를 합성하였다. 펩타이드의 순도는 95 ％ 이상이 되도록 제작하였으며, 펩타이드 합성은 펩타이드 합성 전문 회사인 (주)펩트론에 의뢰하여 진행하였다. 서열번호 1의 아미노산 서열은 하기 표 1과 같다. 또한, CMCP 펩타이드는 TAT 부위(서열번호 2), 힌지(hinge) 부위(서열번호 3) 및 DNA 결합 부위(서열번호 4)로 구성된다.A CMCP peptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 was synthesized. The purity of the peptide was prepared to be 95% or more, and the synthesis of the peptide was commissioned by Peptron Co., Ltd., a company specializing in peptide synthesis. The amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is shown in Table 1 below. In addition, the CMCP peptide consists of a TAT site (SEQ ID NO: 2), a hinge site (SEQ ID NO: 3), and a DNA binding site (SEQ ID NO: 4).

명칭designation 아미노산 서열amino acid sequence 서열번호sequence number CMCPCMCP YGRKKRRQRRRGGGGRRRRRRRRRYGRKKRRQRRRGGGGRRRRRRRRR 1One TAT 부위TAT site YGRKKRRQRRRYGRKKRRQRRR 22 힌지(hinge) 부위hinge area GGGGGGGG 33 DNA 결합 부위DNA binding site RRRRRRRRRRRRRRRRRR 44

<실시예 2> CMCP의 세포독성 완화 효과 확인<Example 2> Confirmation of cytotoxicity mitigation effect of CMCP

상기 <실시예 1>에서 합성된 CMCP의 세포독성 완화 효과를 확인하기 위하여 본 실험을 진행하였다. 구체적으로, 6-웰 플레이트(well plate)에 인간 지방유래 중간엽 줄기세포(adipose tissue-derived mesenchymal stem cell, ASC)를 0.5 내지 1 × 105 세포 수로 분주하고 24시간 동안 배양배지(DMEM(Dulbeco’s Modified Eagle’s Media), 10 ％ 소태아혈청(fetal bovine serum, FBS), 1 × 항생제(antibiotics))에서 배양하였다. 또한, 5 ㎕의 리포펙타민 2000(리포펙션(lipofection) 시약, Invitrogen) 및 6 ㎍의 pCMV3-GFP(GFP를 인코딩하는 발현벡터)를 혼합한 뒤 상온에서 15분간 반응시켜 GFP 형질감염 혼합물(transfection 혼합물)을 제조하고, 5 ㎕의 리포펙타민 2000, 6 ㎍의 pCMV3-GFP 및 60 ㎍의 <실시예 1>에서 합성된 CMCP를 혼합한 다음 상온에서 15분간 반응시켜 GFP 형질감염 혼합물(transfection ＋ CMCP 혼합물)을 제조하였다. 그다음, 상기 배양한 중간엽 줄기세포에 상기 제조한 transfection 혼합물 또는 transfection ＋ CMCP 혼합물을 48시간 동안 처리하여 pCMV3-GFP를 형질감염하였다. 상기 형질감염한 세포를 혼합물 존재 하에 48시간 동안 배양한 후, MTT(Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide, Sigma-Aldrich) 용액을 처리하고 2시간 후 570 ㎚에서 세포의 생존율을 측정하였다. 대조군으로 인산완충식염수(phosphate buffered saline, PBS)만 처리한 중간엽 줄기세포를 사용하였다.This experiment was conducted to confirm the effect of mitigating cytotoxicity of CMCP synthesized in <Example 1>. Specifically, human adipose tissue-derived mesenchymal stem cells (ASC) were dispensed in a cell number of 0.5 to 1 × 10 5 in a 6-well plate, and the culture medium (DMEM (Dulbeco's) was cultured for 24 hours. Modified Eagle's Media), 10% fetal bovine serum (FBS), 1 × antibiotics). In addition, GFP transfection mixture (transfection mixture) was prepared, and 5 μl of Lipofectamine 2000, 6 μg of pCMV3-GFP, and 60 μg of CMCP synthesized in <Example 1> were mixed and reacted at room temperature for 15 minutes to obtain a GFP transfection mixture (transfection + CMCP mixture) was prepared. Then, the cultured mesenchymal stem cells were transfected with pCMV3-GFP by treating the above-prepared transfection mixture or transfection + CMCP mixture for 48 hours. The transfected cells were cultured in the presence of the mixture for 48 hours, treated with MTT (Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide, Sigma-Aldrich) solution, and cell viability was measured at 570 nm after 2 hours. As a control, mesenchymal stem cells treated with only phosphate buffered saline (PBS) were used.

그 결과, 도 1에서 나타낸 바와 같이, 리포펙션 시 CMCP를 함께 사용한 경우 중간엽 줄기세포의 세포 생존율이 대조군과 유사한 것을 확인하였다. 상기 결과를 통해 본 발명의 CMCP가 기존의 핵산 또는 유전자 형질감염 방법에 의해 유발되는 세포 독성을 완화하는 것을 알 수 있다.As a result, as shown in FIG. 1, it was confirmed that the cell viability of mesenchymal stem cells was similar to that of the control group when CMCP was used together during lipofection. Through the above results, it can be seen that the CMCP of the present invention alleviates the cytotoxicity caused by the conventional nucleic acid or gene transfection method.

<실시예 3> CMCP의 세포막 투과 활성 개선 확인<Example 3> Confirmation of improvement in cell membrane permeation activity of CMCP

상기 <실시예 1>에서 합성된 CMCP의 세포막 투과 활성을 확인하기 위하여 본 실험을 진행하였다. 구체적으로, 상기 <실시예 1>에서 합성된 CMCP가 결합된 GFP 유전자(CMCP-GFP gene) 및 CMCP가 결합되지 않은 GFP 유전자를 합성 전문 회사인 바이오니아에 의뢰하여 제조하였고, 상기 CMCP-GFP 및 GFP를 각각 pQE30 Xa 벡터에 재조합 후, CMCP-GFP 또는 GFP 단백질을 발현하는 대장균으로부터 Ni-NTA 스핀 키트(Ni-NTA spin kit, Qiagen)를 이용하여 CMCP-GFP 및 GFP 단백질을 분리 및 정제하였다. 그다음, 상기 <실시예 2>에서 배양한 중간엽 줄기세포에 분리정제된 CMCP-GFP 단백질 또는 GFP 단백질을 처리하고 1시간 후 형광 현미경(fluorescene microscope)을 이용하여 세포의 형광 정도를 확인하였다.This experiment was conducted to confirm the cell membrane penetration activity of CMCP synthesized in <Example 1>. Specifically, the CMCP-coupled GFP gene (CMCP-GFP gene) and the CMCP-uncoupled GFP gene synthesized in <Example 1> were commissioned by Bioneer, a company specializing in synthesis, and the CMCP-GFP and GFP were recombined into the pQE30 Xa vector, and CMCP-GFP and GFP proteins were isolated and purified from Escherichia coli expressing CMCP-GFP or GFP protein using a Ni-NTA spin kit (Qiagen). Next, the mesenchymal stem cells cultured in <Example 2> were treated with the separated and purified CMCP-GFP protein or GFP protein, and after 1 hour, the degree of fluorescence of the cells was confirmed using a fluorescence microscope.

그 결과, 도 2에서 나타낸 바와 같이, CMCP-GFP 단백질을 처리한 중간엽 줄기세포에서 GFP 단백질을 처리한 경우와는 다르게 높은 형광 강도를 나타내는 것을 확인하였다. 상기 결과를 통해 핵산 또는 유전자 형질감염 시 본 발명의 CMCP가 핵산 또는 유전자와 결합하여 이들의 세포막 투과 활성을 높이는 것을 알 수 있다.As a result, as shown in FIG. 2, it was confirmed that the mesenchymal stem cells treated with CMCP-GFP protein exhibited high fluorescence intensity, unlike the case where GFP protein was treated. From the above results, it can be seen that the CMCP of the present invention binds to nucleic acids or genes and enhances their cell membrane penetration activity during nucleic acid or gene transfection.

<실시예 4> CMCP의 유전자 형질감염 효율 개선 확인<Example 4> Confirmation of improvement in gene transfection efficiency of CMCP

<4-1> GFP 발광 증가 확인<4-1> Confirmation of increase in GFP emission

상기 <실시예 1>에서 합성된 CMCP의 유전자 형질감염 효율을 확인하기 위하여 본 실험을 진행하였다. 구체적으로, 상기 <실시예 2>에서 transfection 혼합물 또는 transfection ＋ CMCP 혼합물을 처리하고 형질감염한 중간엽 줄기세포에서 명시야 현미경(bright-field microscope) 또는 형광 현미경(fluorescence microscope)을 이용하여 세포의 형광 정도를 확인하고, 유동 세포 계측법으로 GFP의 형광을 정량화하여 측정하였다. 대조군으로 인산완충식염수(phosphate buffered saline, PBS)만 처리한 중간엽 줄기세포를 사용하였다.This experiment was conducted to confirm the gene transfection efficiency of the CMCP synthesized in <Example 1>. Specifically, fluorescence of cells using a bright-field microscope or a fluorescence microscope in mesenchymal stem cells treated and transfected with the transfection mixture or the transfection + CMCP mixture in <Example 2> The degree was confirmed, and the fluorescence of GFP was quantified and measured by flow cytometry. As a control, mesenchymal stem cells treated with only phosphate buffered saline (PBS) were used.

그 결과, 도 3에서 나타낸 바와 같이, 리포펙션 시 CMCP를 함께 사용한 경우 중간엽 줄기세포의 형질감염 비율이 증가한 것을 형광 강도의 차이로 확인하였고(도 3A), 기존 5 ％ 정도이던 형질감염 효율이 CMCP를 함께 사용함으로써 약 35 ％까지 약 7배 증가하는 것을 확인하였다(도 3B). 상기 결과를 통해 본 발명의 CMCP가 기존의 핵산 또는 유전자 형질감염 방법에 따른 형질감염 효율을 개선하는 것을 알 수 있다.As a result, as shown in FIG. 3, when CMCP was used together during lipofection, it was confirmed that the transfection rate of mesenchymal stem cells increased by the difference in fluorescence intensity (FIG. 3A), and the transfection efficiency, which was about 5% before, was confirmed. It was confirmed that about 7-fold increase up to about 35% was achieved by using CMCP together (FIG. 3B). Through the above results, it can be seen that the CMCP of the present invention improves the transfection efficiency according to the existing nucleic acid or gene transfection method.

<4-2> GFP 단백질 발현 증가 확인<4-2> Confirmation of increase in GFP protein expression

상기 <실시예 1>에서 합성된 CMCP의 유전자 형질감염 효율을 확인하기 위하여 본 실험을 진행하였다. 구체적으로, 상기 <실시예 2>에서 transfection 혼합물 또는 transfection ＋ CMCP 혼합물을 처리하고 형질감염한 중간엽 줄기세포를 회수한 후, 웨스턴 블럿(western blot)을 이용하여 형질감염된 GFP의 단백질 발현을 분석하였다. This experiment was conducted to confirm the gene transfection efficiency of the CMCP synthesized in <Example 1>. Specifically, after treating the transfection mixture or the transfection + CMCP mixture in <Example 2> and recovering the transfected mesenchymal stem cells, the protein expression of the transfected GFP was analyzed using Western blot. .

그 결과, 도 4에서 나타낸 바와 같이, 리포펙션 시 CMCP를 함께 사용한 경우 GFP의 단백질 발현이 기존의 핵산 또는 유전자 형질감염 방법과 비교하여 약 15배 증가하는 것을 확인하였다. 상기 결과를 통해 본 발명의 CMCP가 기존의 핵산 또는 유전자 형질감염 방법에 따른 형질감염 효율을 개선하는 것을 알 수 있다.As a result, as shown in FIG. 4, it was confirmed that the protein expression of GFP increased about 15-fold compared to conventional nucleic acid or gene transfection methods when CMCP was used together during lipofection. Through the above results, it can be seen that the CMCP of the present invention improves the transfection efficiency according to the existing nucleic acid or gene transfection method.

<실시예 5> 형질감염 방법 및 CMCP 용량에 의한 유전자 형질감염 효율 확인<Example 5> Confirmation of gene transfection efficiency by transfection method and CMCP dose

상기 <실시예 1>에서 합성된 CMCP의 형질감염 방법 및 CMCP 용량에 의한 유전자 형질감염 효율을 확인하기 위하여 본 실험을 진행하였다. 구체적으로, 상기 <실시예 2>에 기재된 방법과 동일한 방법으로 60 ㎍의 CMCP 대신 CMCP 0, 1 및 10 ㎍을 포함하는 GFP 형질감염 혼합물(lipofection ＋ CMCP 혼합물)을 제조하고, 중간엽 줄기세포에 처리하여 리포펙션에 의한 pCMV3-GFP 형질감염을 하였다. 또한, 200 ㎕의 무혈청 무항생제 DMEM(serum/antibiotics free DMEM) 배지에 6 ㎕의 폴리매그 네오(PolyMag Neo)(매그네토펙션(megnetofection) 시약, OZ Biosciences), 6 ㎍의 pCMV3-GFP 및 0, 1 및 10 ㎍의 <실시예 1>에서 합성된 CMCP를 혼합하여 5회 피펫으로 잘 섞고 20분간 반응시켜 GFP 형질감염 혼합물(magnetofection ＋ CMCP 혼합물)을 제조하였다. 그다음, 상기 배양한 중간엽 줄기세포에 상기 제조한 magnetofection + CMCP 혼합물을 30분간 마그네틱 플레이트(magnetic plate) 위에서 처리하여 매그네토펙션에 의한 pCMV3-GFP 형질감염을 하였다. 또한, 0, 1 및 10 ㎍의 <실시예 1>에서 합성된 CMCP를 포함하고 상기 리포펙션 및 매그네토펙션을 병용하여 형질감염을 하였다. 상기 형질감염한 세포들을 혼합물 존재 하에 각각 48시간 동안 배양한 후, 명시야 현미경(bright-field microscope) 또는 형광 현미경(fluorescence microscope)을 이용하여 세포의 형광 정도를 확인하고, 유동 세포 계측법으로 GFP의 형광을 정량화하여 측정하였다. 대조군으로 pCMV3-GFP만을 이용하여 형질감염한 중간엽 줄기세포를 사용하였다.In order to confirm the transfection method of the CMCP synthesized in <Example 1> and the gene transfection efficiency by the CMCP dose, this experiment was conducted. Specifically, a GFP transfection mixture (lipofection + CMCP mixture) containing 0, 1 and 10 μg of CMCP instead of 60 μg of CMCP was prepared in the same manner as in <Example 2>, and After treatment, pCMV3-GFP was transfected by lipofection. In addition, 6 μl of PolyMag Neo (magnetofection reagent, OZ Biosciences), 6 μg of pCMV3-GFP and 0, 1, and 10 μg of CMCP synthesized in <Example 1> were mixed, mixed well with a pipette 5 times, and reacted for 20 minutes to prepare a GFP transfection mixture (magnetofection + CMCP mixture). Next, the cultured mesenchymal stem cells were transfected with pCMV3-GFP by magnetofection by treating the prepared magnetofection + CMCP mixture on a magnetic plate for 30 minutes. In addition, 0, 1, and 10 μg of CMCP synthesized in <Example 1> were included, and transfection was performed by combining the above lipofection and magnetofection. After culturing the transfected cells in the presence of the mixture for 48 hours, the degree of fluorescence of the cells was checked using a bright-field microscope or a fluorescence microscope, and the amount of GFP was measured by flow cytometry. Fluorescence was measured by quantification. As a control, mesenchymal stem cells transfected with only pCMV3-GFP were used.

그 결과, 도 5에서 나타낸 바와 같이, 대조군과 비교하여 CMCP 10 ㎍을 함께 사용한 경우 모든 실험군의 형광 신호가 증가하는 것을 확인하였고, 특히 매그네토펙션 시 CMCP 10 ㎍을 함께 사용한 경우 중간엽 줄기세포의 GFP 양성세포(GFP positive cells) 비율이 가장 높은 것을 확인하였으며, 이어 리포펙션 및 매그네토펙션 병용 시 CMCP 10 ㎍을 함께 사용한 경우가 높은 것을 확인하였다.As a result, as shown in FIG. 5, it was confirmed that the fluorescence signal of all experimental groups increased when 10 μg of CMCP was used together compared to the control group, and in particular, when 10 μg of CMCP was used together during magnetofection, mesenchymal stem cells It was confirmed that the ratio of GFP positive cells was the highest, and then it was confirmed that the case of using 10 μg of CMCP together was high when lipofection and magnetofection were used together.

<110> EOM, YOUNG WOO <120> CYTOTOXIC MITIGATING MEMBRANE PERMEABLE PEPTIDES FOR IMPROVING NUCLEIC ACID OR GENETRANSFECTION EFFICIENCY AND USE THEREOF <130> PB2020-026 <160> 4 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 24 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Gly Gly Gly Gly Arg 1 5 10 15 Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg 20 <210> 2 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg 1 5 10 <210> 3 <211> 4 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Gly Gly Gly Gly 1 <210> 4 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg 1 5 <110> EOM, YOUNG WOO <120> CYTOTOXIC MITIGATING MEMBRANE PERMEABLE PEPTIDES FOR IMPROVING NUCLEIC ACID OR GENETRANSFECTION EFFICIENCY AND USE THEREOF <130> PB2020-026 <160> 4 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 24 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Gly Gly Gly Gly Arg 1 5 10 15 Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg 20 <210> 2 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg 1 5 10 <210> 3 <211> 4 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Gly Gly Gly Gly One <210> 4 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg 1 5

Claims (13)

서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는, 세포독성 완화 막 투과 펩타이드.
Represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, cytotoxicity alleviating membrane penetrating peptide.
 제1항에 있어서, 상기 세포독성 완화 막 투과 펩타이드는 세포의 핵산 또는 유전자 형질감염 효율을 개선하는 것을 특징으로 하는, 세포독성 완화 막 투과 펩타이드.
The cytotoxicity mitigating membrane-penetrating peptide according to claim 1, characterized in that the cytotoxicity mitigating membrane-penetrating peptide improves cell nucleic acid or gene transfection efficiency.
 제2항에 있어서, 상기 핵산은 DNA 분자, RNA 분자, PNA 분자, siRNA 분자, 안티센스 분자, 리보자임 및 앱타머로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 세포독성 완화 막 투과 펩타이드.
According to claim 2, wherein the nucleic acid is DNA molecules, RNA molecules, PNA molecules, siRNA molecules, antisense molecules, characterized in that at least one selected from the group consisting of ribozymes and aptamers, cytotoxicity alleviating membrane penetrating peptide.
 제2항에 있어서, 상기 유전자 형질감염은 벡터에 의해 이루어지는 것을 특징으로 하는, 세포독성 완화 막 투과 펩타이드.
The cytotoxicity alleviating membrane penetrating peptide according to claim 2, wherein the gene transfection is performed by a vector.
 제2항에 있어서, 상기 세포는 줄기세포, 전구세포 및 동물세포로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 세포독성 완화 막 투과 펩타이드.
According to claim 2, wherein the cell is characterized in that selected from the group consisting of stem cells, progenitor cells and animal cells, cytotoxicity alleviating membrane penetrating peptide.
 제5항에 있어서, 상기 줄기세포는 배아줄기세포, 성체줄기세포 및 유도만능줄기세포로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 세포독성 완화 막 투과 펩타이드.
According to claim 5, wherein the stem cells are characterized in that selected from the group consisting of embryonic stem cells, adult stem cells and induced pluripotent stem cells, cytotoxicity alleviating membrane penetrating peptide.
 제6항에 있어서, 상기 성체줄기세포는 조혈 줄기세포(hematopoietic stem cell) 또는 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell)인 것을 특징으로 하는, 세포독성 완화 막 투과 펩타이드.
According to claim 6, wherein the adult stem cells are hematopoietic stem cells (hematopoietic stem cells) or mesenchymal stem cells (mesenchymal stem cells) characterized in that, cytotoxicity alleviating membrane penetrating peptide.
 제7항에 있어서, 상기 중간엽 줄기세포는 제대, 제대혈, 골수, 혈액, 지방, 근육, 골격, 신경, 피부, 골막, 양막 및 태반으로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상의 조직으로부터 유래된 중간엽 줄기세포인 것을 특징으로 하는, 세포독성 완화 막 투과 펩타이드.
The method of claim 7, wherein the mesenchymal stem cells are mesenchymal derived from one or more tissues selected from the group consisting of umbilical cord, umbilical cord blood, bone marrow, blood, fat, muscle, skeleton, nerve, skin, periosteum, amniotic membrane, and placenta. Characterized in that it is a stem cell, cytotoxicity alleviating membrane penetrating peptide.
 제2항에 있어서, 상기 핵산 또는 유전자 형질감염은 칼슘 포스페이트-매개된 형질감염, 양이온 폴리머 형질감염, 비로좀(virosome) 형질감염, 리포펙션(lipofection), 비리포좀 지질 형질감염, 덴드리머(dendrimer) 형질감염, 열 쇼크 형질감염, 마그네토펙션(magnetofection), 임팔레펙션(impalefection) 및 소노포레이션(sonoporation)으로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상의 형질감염 방법을 이용하여 수행되는 것을 특징으로 하는, 세포독성 완화 막 투과 펩타이드.
The method of claim 2, wherein the nucleic acid or gene transfection is calcium phosphate-mediated transfection, cationic polymer transfection, virosome transfection, lipofection (lipofection), non-liposomal lipid transfection, dendrimer (dendrimer) Transfection, heat shock transfection, magnetofection, impalefection and sonoporation characterized in that carried out using one or more transfection methods selected from the group consisting of cells, Toxicity mitigating membrane penetrating peptide.
 제9항에 있어서, 상기 세포독성 완화 막 투과 펩타이드는 상기 핵산 또는 유전자 형질감염 방법 수행 시 유발되는 세포독성을 감소시키는 것을 특징으로 하는, 세포독성 완화 막 투과 펩타이드.
The cytotoxicity mitigating membrane-penetrating peptide according to claim 9, wherein the cytotoxicity mitigating membrane-penetrating peptide reduces cytotoxicity induced during the nucleic acid or gene transfection method.
 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 세포독성 완화 막 투과 펩타이드를 포함하는 핵산 또는 유전자 형질감염용 키트.
A kit for nucleic acid or gene transfection comprising the cytotoxicity reducing membrane penetrating peptide represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
 시험관내(in vitro) 또는 인체를 제외한 생체내(in vivo)에서 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 세포독성 완화 막 투과 펩타이드를 처리하고 핵산 또는 유전자 형질감염하는 단계;를 포함하는, 세포독성 완화 막 투과 펩타이드를 이용한 핵산 또는 유전자 형질감염 방법.
In vitro ( in vitro ) or in vivo (excluding the human body), cytotoxicity alleviation step of treating the membrane penetrating peptide represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and transfecting the nucleic acid or gene; including, cytotoxicity alleviation Nucleic acid or gene transfection method using a membrane penetrating peptide.
 제12항에 있어서, 상기 핵산 또는 유전자 형질감염은 칼슘 포스페이트-매개된 형질감염, 양이온 폴리머 형질감염, 비로좀(virosome) 형질감염, 리포펙션(lipofection), 비리포좀 지질 형질감염, 덴드리머(dendrimer) 형질감염, 열 쇼크 형질감염, 마그네토펙션(magnetofection), 임팔레펙션(impalefection) 및 소노포레이션(sonoporation)으로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상의 형질감염 방법을 이용하여 수행되는 것을 특징으로 하는, 세포독성 완화 막 투과 펩타이드를 이용한 핵산 또는 유전자 형질감염 방법.
The method of claim 12, wherein the nucleic acid or gene transfection is calcium phosphate-mediated transfection, cationic polymer transfection, virosome transfection, lipofection (lipofection), non-liposomal lipid transfection, dendrimer (dendrimer) Transfection, heat shock transfection, magnetofection, impalefection and sonoporation characterized in that carried out using one or more transfection methods selected from the group consisting of cells, Nucleic acid or gene transfection method using a toxicity-mitigating membrane penetrating peptide.
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