KR102514126B1 - 히알루론산 나노입자를 유효성분으로 함유하는 전이성 골종양 광역학 치료용 조성물 - Google Patents

히알루론산 나노입자를 유효성분으로 함유하는 전이성 골종양 광역학 치료용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 전이성 골종양 세포를 다중 표적하는 히알루론산 나노입자 조성물 및 이의 의학적 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 풀러렌과 히알루론산을 결합시켜 생성된 나노입자에 알렌드로네이트(ALN), cRGD 및 클로린 e6(Ce6)를 화학적 결합을 통해 제조한 (ALN/cRGD)@dHA-Ce6은 우수한 세포 흡수력을 나타내며, 전이성 종양에서 과발현되는 CD44 수용체와 인테그린 αvβ3과 상호작용 및 뼈의 수산화인회석과 정전기적 상호작용을 통하여 전이성 골종양 세포를 다중 표적함으로써 전이성 골종양과의 결합력을 증가시켜 향상된 광역학 치료 효과를 나타내는 것이 확인됨에 따라, 상기 (ALN/cRGD)@dHA-Ce6은 전이성 골종양 치료를 위한 약물전달체 또는 광역학 치료제로 제공될 수 있다.

Description

히알루론산 나노입자를 유효성분으로 함유하는 전이성 골종양 광역학 치료용 조성물{Composition for photodynamic therapy of bone metastasis comprising hyaluronate nanoparticles}
본 발명은 전이성 골종양 세포를 다중 표적하는 히알루론산 나노입자 조성물 및 이의 의학적 용도에 관한 것이다.
현대인의 암 발생률은 기하급수적으로 증가하고 있으며 사망 원인 중 많은 비중을 차지하고 있으나 암을 치료하기 위한 치료법 중 가장 많이 사용되는 항암제치료는 암세포를 직접적으로 공격하여 제거할 수 있다는 장점이 있지만 항암제에 대한 내성이 생길 수 있으며 암세포 뿐 아니라 주변의 정상조직에도 작용하여 부작용이 나타나는 등 여러 문제점이 있어 질병을 효과적으로 치료하기에는 어려움이 있다.
전이성 골종양은 뼈 외의 다른 곳에서 생긴 원발암 세포들이 혈관이나 림프관을 통하여 골 조직으로 침범하여 발생되며, 일반적으로 병원성 침윤과 골 다중 분획을 유발하여 복잡한 생체 조건을 형성하여 파골세포의 분화를 촉진시키고 치료제의 흡수를 제한시킨다.
전이성 골종양의 가장 흔한 증상은 국소부위 통증이나 상당수 전이성 골종양환자의 초기에는 통증을 유발하지 않아 간과되는 경우가 많다. 악성종양에 의한 고칼슘혈증의 경우 소세포암 및 유방암, 신세포암, 난소암, 다발성골수종에 의해 발생될 수 있다. 고칼슘혈증의 치료로는 이뇨제, 스테로이드, 칼시토닌 및 비스포스네이트 등의 제제를 사용할 수 있다. 그러나 전이성 골종양을 직접적으로 표적하여 항암치료 효과를 나타내는 약물은 보고되어 있지 않다.
수 나노미터의 미세입자는 생물학 분야에서 생물학적 기능을 제어하거나 시각화할 뿐만 아니라 제약 분야에서 질병 표적화 능력을 향상시키기 위한 방법으로 활용되고 있다. 퀀텀 닷 (Quantum dot), 카본 닷 (carbon dot) 및 폴리머 닷 (polymeric dot) 입자는 표면 개질 및 매우 작은 크기로 인해 세포 수용체, 단백질, 유전자 및 사이토카인과 효율적으로 상호작용이 가능하지만, 제형이 지닌 독성으로 인하여 생의학 분야에 적용은 한계가 존재하며, 이러한 문제점을 해결하기 위한 생체 기능성 닷(dot) 개발이 필요한 실정이다.
대한민국 공개특허 제10-2010-0051163호 (2010.05.17. 공개)
본 발명은 풀러렌과 히알루론산의 π-π 결합을 통하여 생성된 히알루론산 나노입자를 제공하며, 상기 나노입자는 히알루론산과 광감작제, 비스포스네이트 약물 및 cRGD가 화학 결합되어 전이성 골종양 세포를 다중 표적화하여 전이성 골종양 세포의 사멸을 증가시키는 효과를 나타내는 광역학 치료용 조성물로 제공하고자 한다.
본 발명은 풀러렌; 및 상기 풀러렌 표면에 π-π 결합한 히알루론산을 포함하며, 상기 히알루론산에 광감작제, 비스포스네이트 약물 및 cRGD (cyclic arginine-glycine-aspartic acid)가 결합된 히알루론산 나노입자 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 풀러렌; 및 상기 풀러렌 표면에 π-π 결합한 히알루론산을 포함하며, 상기 히알루론산에 광감작제, 비스포스네이트 약물 및 cRGD (cyclic arginine-glycine-aspartic acid)가 결합된 히알루론산 나노입자를 유효성분으로 함유하는 전이성 골종양 광역학 치료용 약학조성물을 제공한다.
본 발명에 따르면, 풀러렌과 히알루론산을 결합시켜 생성된 나노입자에 알렌드로네이트(ALN), cRGD 및 클로린 e6(Ce6)를 화학적 결합을 통해 제조한 (ALN/cRGD)@dHA-Ce6은 우수한 세포 흡수력을 나타내며, 전이성 종양에서 과발현되는 CD44 수용체와 인테그린 αvβ3과 상호작용 및 뼈의 수산화인회석과 정전기적 상호작용을 통하여 전이성 골종양 세포를 다중 표적함으로써 전이성 골종양과의 결합력을 증가시켜 향상된 광역학 치료 효과를 나타내는 것이 확인됨에 따라, 상기 (ALN/cRGD)@dHA-Ce6은 전이성 골종양 치료를 위한 약물전달체 또는 광역학 치료제로 제공될 수 있다.
도 1a는 (ALN/cRGD)@dHA-Ce6의 모식도이며, 도 1b는 (ALN/cRGD)@dHA-Ce6 합성 과정을 나타내는 모식도이다.
도 2는 (ALN/cRGD)@dHA-Ce6 및 (ALN/cRGD)@HDOC-Ce6의 1H-NMR 분석 결과이다.
도 3a는 (ALN/cRGD)@dHA-Ce6 (왼쪽) 및 (ALN/cRGD)@HDOC-Ce6 NP (오른쪽)의 TEM 이미지 결과이며, 도 3b는 PBS(pH 7.4, 150 mM) 상에서 dHA-Ce6, (ALN)@dHA-Ce6, (cRGD)@dHA-Ce6, (ALN/cRGD)@HDOC-Ce6 NP 및 (ALN/cRGD)@dHA-Ce6의 입자 크기를 확인한 결과이며, 도 3c는 PBS(pH 7.4, 150 mM) 상에서 dHA-Ce6, (ALN)@dHA-Ce6, (cRGD)@dHA-Ce6, (ALN/cRGD)@HDOC-Ce6 NP 및 (ALN/cRGD)@dHA-Ce6의 제타 전위를 확인한 결과이며 (n = 3, as multiple experiments, ** p < 0.01 compared to dHA-Ce6), 도 3d는 PBS (pH 7.4, 150 mM) 상에서 유리 Ce6 (10 μg/mL) 및 각 샘플 (equivalent Ce6 10 μg/mL)의 방출 스펙트럼 (λex = 400 nm 및 λem = 600-750 nm)을 확인한 결과이며, 도 3e는 PBS (pH 7.4, 150 mM) 상에서 유리 Ce6 (10 μg/mL) 및 각 샘플 (equivalent Ce6 10 μg/mL)의 DMAT (9,10-dimethylanthracene) 형광 변화 (λex = 360 nm 및 λem = 380-550 nm) 확인한 결과로, 일항산소 발생을 DMAT 형광 세기의 변화로 나타낸 결과이다 (Ff-Fs, Ff는 DMA 자체의 형광 세기, Fs는 샘플과 혼합된 DMAT의 형광 세기를 나타냄).
도 4는 PBS (pH 7.4, 150 mM) (n = 3, as multiple experiments) 상에서 dHA-Ce6, (ALN)@dHA-Ce6, (cRGD)@dHA-Ce6, (ALN/cRGD)@HDOC-Ce6 NP 및 ALN/cRGD@dHA-Ce6의 수산화인회석 입자 (in vitro 뼈 모델, 직경 ~2.5 μm)에 대한 정전기적 결합 친화도를 확인한 결과이다.
도 5는 광독성을 확인한 결과로, 수산화인회석 입자가 존재하거나 존재하지 않는 조건에서 콜라겐 겔이 함유된 세포 배지에서 배양된 MDA-MB-231, A549, BT-474 및 NIH3T3 세포의 광독성을 확인한 CCK-8 분석 결과로, 도 4a는 수산화인회석 입자가 존재하는 조건의 결과이며, 도 4b는 수산화인회석 입자가 존재하지 않는 조건의 결과로, 모든 세포에 유리 Ce6 (10 μg/mL) 또는 각 샘플 (equivalent Ce6 10 μg/mL)을 4시간 동안 처리한 후 670 nm 광원을 이용하여 5.2 mW/cm2의 광도로 10분간 광 조사하여 확인한 결과이다 (n = 7) (** p < 0.01 free Ce6에 비교).
도 6a는 37 ℃에서 4시간 동안 유리 Ce6 (10 μg/mL) 또는 각 샘플 (equivalent Ce6 10 μg/mL)을 MDA-MB-231 세포에 처리하고 유세포 분석 및 공초점이미지 결과이며, 도 5b는 유리 Ce6 (10 μg/mL) 또는 각 샘플 (equivalent Ce6 10 μg/mL)이 처리된 MDA-MB-231 세포의 SEM 이미지 결과로, 적색 화살표는 종양 세포를 나타낸다.
도 7은 (a) MDA-MB-231 및 (b) A549, (c) BT-474, (d) NIH3T3 세포에 각 샘플을 24시간 동안 처리하고 광조사하지 않은 조건에서 세포 생존율을 확인한 CCK-8 분석 결과이다.
도 8a는 MDA-MB-231 종양 세포가 이식된 누드 마우스에 유리 Ce6 (2.5 mg/kg) 또는 각 샘플 (equivalent Ce6 2.5 mg/kg)을 정맥 주사한 후 비침습적 형광 종양 이미지를 확인한 결과로, 주사 1, 4, 및 8시간 후 얻은 형광 종양 이미지이며, 도 8b는 MDA-MB-231 종양 세포가 이식된 누드 마우스에 주사 24시간 후 얻은 주요 기관 및 종양의 Ex vivo 형광이미지이다.
도 9a는 MDA-MB-231 종양 세포가 이식된 누드 마우스에 식염수, 유리 Ce6 (2.5 mg/kg) 또는 각 샘플 (equivalent Ce6 2.5 mg/kg)을 주사하고 14일 후 종양을 추출하여 확인한 ex vivo 광학 이미지 결과이며, 도 9b는 MDA-MB-231 종양 세포가 이식된 누드 마우스에 식염수, 유리 Ce6 (2.5 mg/kg) 또는 각 샘플 (equivalent Ce6 2.5 mg/kg) 처리 후 상대적인 종양 크리 변화를 확인한 결과이며 (Vt/V0, Vt는 시간에 따른 크기 변화, V0는 초기 종양 크기), 도 9c는 MDA-MB-231 종양 세포가 이식된 누드 마우스에 대조군 (식염수), 유리 Ce6 (2.5 mg/kg) 또는 각 샘플 (equivalent Ce6 2.5 mg/kg)을 정맥 주사하고 14일 후 컴퓨터 단층 촬영한 결과로, 붉은 점선 원과 화살표로 종양 부위를 나타낸 결과이다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
본 발명자들은 전이성 골종양의 효과적인 광역학 치료가 가능한 히알루론산 닷 (hyaluronate dot)을 연구하던 중 (ALN/cRGD)@dHA-Ce6의 다중 종양 표적화 능력이 전이성 골종양 세포와의 결합 친화성을 향상시키고 우수한 종양 사멸 효과를 나타내는 것을 확인함에 따라, 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 풀러렌; 및 상기 풀러렌 표면에 π-π 결합한 히알루론산을 포함하며, 상기 히알루론산에 광감작제, 비스포스네이트 약물 및 cRGD [cyclic arginine-glycine-aspartic acid; cyclo(Cys-Lys-Arg-Gly-Asp-D-Phe)]가 결합된 히알루론산 나노입자 조성물을 제공할 수 있다.
상기 나노입자는 전이성 골종양 세포를 다중 표적하는 것일 수 있다.
보다 상세하게는 상기 히알루론산은 전이성 종양 세포에서 과발현되는 CD44 수용체와 결합하여 종양 세포를 표적하는 것일 수 있으며, 상기 cRGD는 전이성 종양 세포에서 과발현되는 인테그린 (integrin) αvβ3와 결합하여 종양 세포를 표적하는 것일 수 있으며, 상기 비스포스네이트 약물은 뼈에 존재하는 수산화인회석 (hydroxyapatite)과 정전기적 결합하여 종양 세포를 표적하는 것일 수 있다.
상기 히알루론산 나노입자는 히알루론산 1 몰에 대하여, 광감작제 0.1 내지 0.5 몰, 비스포스네이트 약물 0.5 내지 1.2 몰 및 cRGD 0.8 내지 1.5 몰로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한 상기 히알루론산 나노입자는 5 내지 10 nm의 평균 직경을 나타내는 것일 수 있다.
상기 광감작제는 클로린류(chlorins), 포피린류(phophyrins) 및 프탈로시아닌류(phthalocyanine)로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.
상기 비스포스네이트 약물은 알렌드로네이트 (alendronate), 리세드로네이트 (risedronate), 이반드로네이트 (ibandronate), 파미드로네이트 (pamidronate) 및 졸레드로네이트 (zoledronate)로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.
본 발명은 풀러렌; 및 상기 풀러렌 표면에 π-π 결합한 히알루론산을 포함하며, 상기 히알루론산에 광감작제, 비스포스네이트 약물 및 cRGD [cyclo(Cys-Lys-Arg-Gly-Asp-D-Phe)]가 결합된 히알루론산 나노입자를 유효성분으로 함유하는 전이성 골종양 광역학 치료용 약학조성물을 제공할 수 있다.
상기 히알루론산 나노입자는 전이성 골종양 세포를 다중 표적하여 광역학 항암 치료 효과를 증가시키는 것일 수 있다.
본 발명의 한 구체예에서, 상기 히알루론산 나노입자를 유효성분으로 함유하는 전이성 골종양 광역학 치료용 약학조성물은 통상적인 방법에 따라 주사제, 과립제, 산제, 정제, 환제, 캡슐제, 좌제, 겔, 현탁제, 유제, 점적제 또는 액제로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 제형을 사용할 수 있다.
본 발명의 다른 구체예에서, 약학조성물은 약학조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제, 붕해제, 감미제, 피복제, 팽창제, 활택제, 향미제, 항산화제, 완충액, 정균제, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 첨가제를 추가로 포함할 수 있다.
구체적으로 담체, 부형제 및 희석제는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 사용할 수 있으며, 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제할 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용할 수 있다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 있으며 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제 등이 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기재로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면 상기 약학 조성물은 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 흉골내, 경피, 비측내, 흡입, 국소, 직장, 경구, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 대상체로 투여할 수 있다.
상기 히알루론산 나노입자의 바람직한 투여량은 대상체의 상태 및 체중, 질환의 종류 및 정도, 약물 형태, 투여경로 및 기간에 따라 달라질 수 있으며 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 본 발명의 일실시예에 따르면 이에 제한되는 것은 아니지만 1일 투여량이 0.01 내지 200 mg/kg, 구체적으로는 0.1 내지 200 mg/kg, 보다 구체적으로는 0.1 내지 100 mg/kg 일 수 있다. 투여는 하루에 한 번 투여할 수도 있고 수회로 나누어 투여할 수도 있으며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 '대상체'는 인간을 포함하는 포유동물일 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 ‘풀러렌(Fullerene)’은 탄소원자가 오각형과 육각형으로 교대로 배열된 분자를 통칭하는 말이다. 본 발명에서 풀러렌은 예를 들어 C60, C70, C74, C76, C78, C80, C82, C88, C90, C96 등의 임의의 탄소수의 것을 단독 또는 혼합물을 이용할 수 있다. 또한 순탄소 물질인 나노 튜브 풀러렌, 각종 고차원 플라렌 등을 이용할 수 있고 금속 내포 풀러렌도 가능하다.
본 발명의 ‘광감작제(photosensitizer)’는 빛에 노출되지 않을 경우 세포독성이 거의 없다가, 특정 파장의 빛을 조사하면 광감작제가 빛을 받아 여기되면서 광 에너지가 종양 조직 내의 산소로 전달되고, 기저상 태에 있던 산소는 화학 반응성이 뛰어난 반응성 산소종 예를들어, 일항산소(singlet oxygen), 산소라디칼, 초과산화물(superoxide) 및 과산화물(peroxide)을 발생시키게 된다. 이러한 반응성 산소종은 주변 세포성분과 혈관조직을 화학적으로 파괴하기 시작하여 세포자멸괴사(apoptosis)와 세포괴사(necrosis)로 진행하게 된다.
또한, 이러한 광감작제는 정맥 내 투여 후 암 조직에 특이적으로 축적되는 성질을 가지고 있어, 일정시간이 지난 뒤에 특정 파장의 빛을 조사하게 되면 암 조직만 괴사하고 정상조직은 보존될 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
<실험예>
하기의 실험예들은 본 발명에 따른 각각의 실시예에 공통적으로 적용되는 실험예를 제공하기 위한 것이다.
1. 물질
히알루론산 (Hyaluronic acid, HA, Mn=3.7kDa), 수산화리튬 (lithiumhydroxide, LiOH), 디메틸설폭시드 (dimethylsulfoxide, DMSO), 톨루엔 (toluene), N,N′-디사이클로헥실카보디이미드 (N,N′-dicyclohexylcarbodiimide, DCC), N-하이드록시석신이미드 (N-hydroxysuccinimide, NHS), N-(2-아미노에틸말레이미드 [N-(2-aminoethylmaleimide), AEM], 트리에틸아민 (triethylamine, TEA), adipic acid dihydrazide (ADH), 알렌드로네이트 소디움 염 (alendronate sodium salt, ALN), N-(3-디메틸아미노프로필)-N′-에틸카르보디이미드 하이드로클로라이드 [N-(3-dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride, EDC], 데옥시클로릭 산 (deoxychlolic acid, DOCA), 4-디메틸아미노피리딘 (4-dimethylaminopyridine, DMAP), 피리딘 (pyridine), 9,10-디메틸안트라센 (9,10-dimethylanthracene, DMAT), 수산화인회석 (hydroxyapatite), 소디움 하이드록시드 (sodium hydroxide, NaOH), 4′,6-디아미디노-2-페닐인돌 디하이드로클로라이드 (4′,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride, DAPI) 및 파라포름알데하이드 (paraformaldehyde)는 Sigma-Aldrich(USA)에서 구입하였으며, 풀러렌 (Fullerene, C60)은 NanoLab Inc.(USA)에서 구입하였다. 클로린 e6 (Chlorin e6, Ce6)는 Frontier Scientific Inc.(USA)에서 구입하였으며, cRGD [cyclo(Cys-Lys-Arg-Gly-Asp-D-Phe)]는 Peptron Inc.(Korea)에서 구입하였다.
또한, 페니실린 (Penicillin), 스트렙토마이신 (streptomycin), 태아소혈청 (FBS), RPMI-1640, 송아지혈청 (bovine calf serum, BCS), Dulbecco’s modified eagle’s medium (DMEM), 트립신 (trypsin) 및 에틸렌 디아민 테트라-아세틱산 (ethylene diamine tetra-acetic acid, EDTA)는 Welgene Inc.(Korea)에서 구입하였다. 콜라겐 타입 I 용액 (3 mg/mL, Bovine)은 Advanced BioMatrix(USA)에서 구입하였으며, Cell Counting Kit-8 (CCK-8)은 Dojindo Molecular Technologies Inc.(Japan)에서 구입였고, Wheat Germ Agglutinin Alexa Fluor®488conjugate(WGA-AlexaFluor®488)는 Life Technologies(USA)에서 구입하였다.
2. ALN 및 cRGD, Ce6을 사용한 hyaluronate dot(dHA)의 합성
히알루론산 닷 (hyaluronate dot, dHA)를 다음과 같은 4가지 유형으로 준비하였다: (1) dHA-Ce6, (2) [(ALN)@dHA-Ce6], (3) [(cRGD)@dHA-Ce6], 및 (4) [(ALN/cRGD)@dHA-Ce6].
먼저, dHA(400 mg, HA를 C60의 모든 π-π 탄소 결합에 접합한 후 제조)를 DCC(20 mg), NHS(25 mg), AEM(8 mg) 및 TEA(1 mL)가 포함된 DMSO(15 mL) 상에서 1일간 전처리 한 후, Ce6[150 mg, ADH(35 mg), DCC(20 mg), NHS(25 mg) 및 TEAA(0.5 mL)가 포함된 DMSO(15 mL) 상에서 4시간 전처리 함]를 넣고 25℃에서 3일간 반응시켰다.
생성된 용액을 투석막(Spectra/Por® MWCO 10 kDa; Spectrum Lab., Rancho Dominguez, CA, USA)을 이용하여 2일간 신선한 DMSO로 투석한 후 증류수를 이용하여 2일간 투석하여 반응하지 않은 화합물을 제거하였다. 투석된 용액을 동결건조하여 dHA-Ce6를 얻었다.
생성된 dHA-Ce6(200 mg)를 EDC(40 mg), NHS(45 mg) 및 TEA(1 mL)가 포함된 증류수(20 mL) 상에서 ALN(60 mg)과 3일간 반응시켰다. 이후, 투석막(Spectra/Por® MWCO 10 kDa)을 이용해 증류수에서 3일간 25℃에서 투석 후 동결건조하여 (ALN)@dHA-Ce6를 얻었다.
다음으로, 증류수(20 mL) 상에서 생성된 dHA-Ce6(200 mg)와 cRGD(4 mg)를 3일간 반응시켰다. 이후, 투석막(Spectra/Por® MWCO 10 kDa)을 이용하여 25℃에서 증류수로 3일간 투석한 후 동결건조하여 (cRGD)@dHA-Ce6를 얻었다.
마지막으로, EDC(40 mg), NHS(45 mg) 및 TEA(1 mL)가 포함된 증류수(20 mL) 상에서 생성된 dHA-Ce6(200 mg)를 ALN(60 mg) 및 cRGD(4 mg)와 3일간 반응시켰다. 이후, 투석막(Spectra/Por® MWCO 10 kDa)을 이용해 25℃에서 증류수로 3일간 투석 후 동결건조하여 (ALN/cRGD)@dHA-Ce6를 얻었다.
또한, 크기 대조군으로 (ALN/cRGD)@HDOC-Ce6 NP를 제조하였다.
HA(200 mg)와 DOCA(655 mg)을 DCC(345 mg), DMAP(205 mg) 및 피리딘 (0.5 mL)이 포함된 DMSO(10 mL) 상에서 2일간 반응시켰다. 반응 후 용액을 정제하기 위해 투석막(Spectra/Por® MWCO 1 kDa)을 이용하여 신선한 DMSO 용매 상에서 25℃로 2일간 투석 후 증류수에서 2일간 투석하고 동결건조하여 HA-DOCA(HDOC)를 얻었다.
생성된 HDOC (1.2 g)를 DCC (60 mg), NHS (75 mg), AEM (10 mg) 및 TEA (1 mL)이 포함된 DMSO (15 mL)에서 1일간 전처리하고, 전처리된 Ce6[225 mg, ADH(35 mg), DCC(20 mg), NHS(25 mg), TEA(0.5 mL)를 DMSO(15 mL) 상에서 4시간 전처리함]를 첨가하여 25℃에서 3일간 반응시켰다. 반응이 완료된 용액은 투석막(Spectra/Por® MWCO 1 kDa)을 이용해 DMSO 상에서 2일간 투석 후 증류수에서 2일간 투석하고 동결건조하여 HDOC-Ce6를 얻었다.
생성된 HDOC-Ce6를 DCC (60 mg), NHS (75 mg) 및 TEA (1 mL)이 포함된 증류수 (30 mL) 상에서 ALN (80 mg) 및 cRGD (4 mg)와 3일간 반응시켰다. 이후 투석막(Spectra/Por® MWCO 1 kDa)을 이용해 증류수에서 3일간 투석한 후 동결건조하여 최종생성물 (ALN/cRGD)@HDOC-Ce6를 얻었다.
생성된 (ALN/cRGD)@HDOC-Ce6를 DMSO에 용해시키고, 투석막(Spectra/Por® MWCO 1 kDa)을 이용해 PBS(pH 7.4, 150 mM)에서 24시간 동안 투석한 후, 동결건조하여 (ALN/cRGD)@HDOC-Ce6 NP를 얻었다.
3. dHA 샘플의 특징 확인
각 dHA 샘플 및 (ALN/cRGD)@HDOC-Ce6(크기 대조군)의 화학 구조를 500MHz NMR Spectrometer(Bruker, Billerica, MA, USA)를 이용하여 분석하였다.
각 dHA 샘플과 (ALN/cRGD)@HDOC-Ce6 NP의 입자 크기 및 형태는 투과 전자 현미경(TEM, Carl zeiss, Oberkochen, Germany)으로 확인하였으며, 각 샘플의 입자 크기와 제타전위(0.1 mg/mL)는 PBS(pH 7.4, 150 mM) 상에서 Zetasizer 3000(Malvern Instruments, Malvern , UK)로 확인하였다.
각 dHA 샘플에서 유리 Ce6 (equivalent Ce6 10 μg/mL) 또는 (ALN/cRGD)@HDOC-Ce6 NP(equivalent Ce6 10 μg/mL)의 빛 방출 스펙트럼(λex 400 nm 및 λem 600-750 nm)을 PBS(pH 7.4, 150mM)를 용매로 하여 RF-5301PC spectrofluorophotometer(Shimadzu, Kyoto, Japan)를 이용하여 측정하였다.
유리 Ce6(10 μg/mL) 및 각 dHA 샘플(equivalent Ce6 10 μg/mL), (ALN/cRGD)@HDOC-Ce6 NP (equivalent Ce6 10 μg/mL)의 일항 산소 발생을 RF-5301PC spectrofluorophotometer를 이용하여 PBS(pH 7.4, 150 mM) 상에서 9,10-dimethylathracene (DMAT, λex 360 nm 및 λem 380-550 nm)의 형광을 분석하여 확인하였다.
간략하게, 각 샘플 (pH 7.4, 150 mM PBS)을 DMAT (20 mmol)과 혼합 후 670 nm의 광원을 이용하여 5.2 mW/cm2의 광도로 10분간 광 조사하였다. 1시간 후 DMAT (RF-5301PC spectrofluorometer로 λex 360 nm, λem 380-550 nm에서 측정)가 정체기에 도달하면 DMAT의 형광 변화 (Ff - Fs, Ff는 순수한 DMAT의 형광 강도이고 Fs는 샘플과 혼합된 DMAT의 형광 강도)를 확인하였다.
4. 수산화인회석 (Hydroxyapatite) 결합 분석
뼈와 유사한 수산화인회석 입자 (10 mg)와 각 dHA 샘플 (1 mg/mL) 및 (ALN/cRGD)@HDOC-Ce6 NP (1 mg/mL)의 결합 친화도를 Cary 1E UV/visible spectrophotometer (Varian Inc., Palo Alto, CA, USA)를 이용하여 용액의 흡광도를 측정하여 확인하였다.
각 샘플(pH 7.4, 150 mM PBS)을 수산화인회석 입자(직경 ~ 2.5 μm)와 혼합 하고 mechanical shaker(100 rpm, 37 ℃) 조건에서 인큐베이션하였다.
각 시간 별로 shaker에 존재하는 샘플을 5000 rpm에서 5분 동안 원심분리 후, 상층액을 수집하였다. 수집한 상층액의 흡광도는 670 nm 파장에서 측정하고, 결합 친화도를 하기 계산식을 이용하여 확인하였다.
결합 친화도(%) = (A0 - A) / A0 × 100 (%)
A0는 초기 흡광도이며, A는 각 시간에서의 흡광도이다.
5. 세포 배양
인간 유방암종 MDA-MB-231 및 인간 폐암종 A549, 인간 유방암종 BT-474 세포를 한국 세포주 은행으로부터 위탁받았으며, 1% 페니실린-스트렙토마이신 및 10% 태아소혈청 (FBS)를 첨가한 RPMI-1640 배지에서 5% CO2 농도, 37℃의 조건으로 배양하였다. 마우스 배아 섬유아세포종 NIH3T3 세포는 1% 페니실린-스트렙토마이신 및 10% 송아지혈청(BCS)를 첨가한 DMEM 배지에서 5% CO2농도, 37℃의 조건으로 배양하였다. 실험에 앞서, 세포(1×106 cells/mL)를 단층 상태로 배양하고 0.25%(w/v) 트립신 (trypsin)과 0.03%(w/v) EDTA 수용액을 처리한 후 RPMI-1640 또는 DMEM 배지를 이용해 24시간 동안 배양한 후 세포 배양 플레이트에 분주하였다.
6. In vitro 세포 광 독성 실험
MDA-MB-231, A549, BT-474 및 NIH3T3 세포에서 각 dHA 샘플 및 (ALN/cRGD)@HDOC-Ce6 NP의 광독성 실험을 수행하였다. 수산화인회석의 유무 조건에서 콜라겐 타입 I 용액을 37℃에서 2시간 동안 겔 상으로 만든 후, 세포를 배양하였다. 세포 배양 후, 콜라겐 겔을 뒤집어서 표면에 세포를 노출시키고, 유리 Ce6(10 μg/mL), 각 dHA 샘플(equivalent Ce6 10 μg/mL) 또는 (ALN/cRGD)@HDOC-Ce6 NP(equivalent Ce6 10 μg/mL)와 37℃에서 4시간 동안 배양한 후 PBS(pH 7.4)로 세 번 세척하였다.
이후 세포에 670 nm의 광원을 이용하여 5.2 mW/cm2의 광도로 10분간 광 조사하고 37℃에서 12시간 동안 배양하였다. 세포 생존율은 Cell Counting Kit-8(CCK-8 assay)을 이용해 측정하였음, 광 조사를 하지 않은 각 dHA 샘플 또는 (ALN/cRGD)@HDOC-Ce6 NP의 세포 독성은 샘플 처리 24시간 후에 확인하였다.
7. In vitro 세포 흡수 확인
MDA-MB-231 세포와 각각의 dHA 샘플 (equivalent Ce6 10 μg/mL), (ALN/cRGD)@HDOC-Ce6 NP (equivalent Ce6 10 μg/mL) 또는 유리 Ce6 (10 μg/mL)를 37℃에서 4시간 동안 배양하고 PBS (pH 7.4, 150 mM)로 세포를 세척하였다.
이후 세포의 형광 강도를 FACSCaliburTM flow cytometer (FACSCanto II, Becton Dickinson, Franklin lakes, NJ, USA)를 이용하여 확인하였다.
또한, 세포 내에서 각 샘플의 분포를 확인하기 위해, MDA-MB-231 세포에 유리 Ce6(10 μg/mL), 각 dHA 샘플(equivalent Ce6 10 μg/mL) 또는 (ALN/cRGD)@HDOC-Ce6 NP(equivalent Ce6 10 μg/mL)를 처리하여 배양한 후, DAPI와 WGA-Alexa Fluor®488로 염색하였다. 염색된 세포는 공초점 레이저 주사 현미경(LSM710, Carl Zeiss, Oberkochen, Germany)으로 확인하였다.
8. 동물 관리
모든 동물 실험은 6-8 주령 암컷 BALB/c 누드 마우스 (Orient Bio Inc., Seongnam, Korea)를 이용하여 수행되었으며, 가톨릭대학교 동물실험윤리위원회로부터 승인된 가이드라인에서 따라 수행되었다.
9. 뼈 전이 모델을 이용한 ex vivo 광역학 종양 치료 효과 확인
뼈 전이 모델을 이용하여 각 샘플의 광역학적 항종양 효과를 확인하기 위해, 이산화탄소 (CO2)를 이용하여 BALB/c 누드마우스를 안락사시키고, 무균 상태에서 경골을 추출하였다. 추출한 경골을 6-웰 플레이트에 넣고 RPMI-1640 배지에서 MDA-MD-231 종양 세포(1×106 cells/mL)와 함께 37℃에서 48시간 동안 배양하였다. 이후 종양 세포가 존재하는 웰에 유리 Ce6(10 μg/mL), 각 샘플 (equivalent Ce6 10 μg/mL) 또는 (ALN/cRGD)@HDOC-Ce6 NP (equivalent Ce6 10 μg/mL)을 넣고 37℃에서 4시간 동안 배양하고, PBS (pH 7.4, 150 mM)로 3회 세척한 후, 670 nm 광원을 이용하여 5.2 mW/cm2의 광도로 10분간 광 조사하고 37℃에서 12시간 동안 배양하였다.
배양 후 글루타알데하이드, 에탄올 및 HMDS를 이용하여 고정한 후 주사전자현미경 (SEM, S-4800, Hitachi, Tokyo, Japan)을 이용하여 확인하였다.
10. In vivo 흡수 확인
MDA-MB-231 종양세포 (1 × 107 cells in pH 7.4, 150 mM PBS)를 BALB/c 누드 마우스의 골내에 주사하여 전이성 골종양 모델을 준비하였다. 21일 후 micro CT imaging scanner(CLS140083, PerkinElmer INC., Waltham, MA, USA)로 촬영하여 종양의 유무을 확인하였다.
다음으로, 생체 내 입자분포를 확인하기 위해, 각 dHA 샘플 (equivalent Ce6 2.5 mg/kg) 및 유리 Ce6 (2.5 mg/kg)를 MDA-MB-231 종양 세포가 이식된 BALB/c 누드 마우스의 꼬리 정맥에 주사하였다. 이후 Fluorescence-labeled Organism Bioimaging Instrument(FOBI, Neo-Science, Seoul, Korea)를 사용하여 주사 후 24시간 동안 관찰하였으며, 추가적으로, 주사 24시간 후 CO2 가스를 이용해 누드 마우스를 안락사 시킨 후 종양(오른쪽 다리) 및 주요기관(심장 및 폐, 간, 신장, 비장)을 적출하여 FOBI를 이용해 분석하였다.
11. In vivo 광역학 종양 치료 효과 확인
각 dHA 샘플 (equivalent Ce6 2.5 mg/kg), 유리 Ce6 (2.5 mg/kg) 또는 대조군 (식염수)를 MDA-MB-231 종양 세포가 이식된 누드 마우스 꼬리에 정맥 주사하였다. 주사 12시간 후 누드 마우스의 종양 위치에 670 nm의 광원을 이용하여 5.2mW/cm2의 광도로 40분간 국소적으로 광 조사하였다. 종양 크기는 하기 계산식을 이용하여 확인하였다.
종양 크기 (tumor volume) = length × (width)2/2.
상대적인 종양 크기 변화 (Vt/V0)에서 Vt는 해당 시간에서의 종양 크기이며, VO는 초기 종양 크기이며, 이를 통하여 (ALN/cRGD)@dHA-Ce6의 광역학적 항암치료 효과를 확인하였다. 추가적으로 각 샘플을 주입하고 14일 후 종양 부위의 micro CT 이미지를 촬영하여 분석하였다.
<실시예 1> dHA 샘플 합성
효과적인 전이성 골종양 치료를 위해 다중 표적능을 가진 히알루론산 닷 (hyaluronate dot, dHA)를 도 1a와 같이 합성하였다.
먼저, HA의 하이드록시기 (hydroxyl group)를 C60의 모든 π-π 탄소 결합들과 연결하여 dHA를 제조하였다. DCC, NHS, AEM 및 TEA이 포함된 DMSO에서 제조된 dHA(Mw = 13.0 kDa)를 광역학 종양 치료제 Ce6와 반응시켜 도 1b와 같이 ALN (뼈의 Ca2+ 타겟팅) 및 cRGD (integrin αvβ3을 타겟팅)를 화학적으로 연결하였다.
상기 과정으로 (ALN/cRGD)@dHA-Ce6가 합성되었으며, 1H-NMR 분석을 통하여 각 물질의 화학적 구조를 확인하였다. dHA에 결합한 Ce6 및 ALN, cRGD의 몰 비율은 1H-NMR 상의 δ 1.21 ppm(-CH, dHA)과 δ 6.42 ppm(-CH2-, Ce6), δ 2.98 ppm(-CH2-, ALN), δ 7.81 ppm(-CH, cRGD)의 피크를 적분 비로 계산하였다.
그 결과, 도 2와 같이 (ALN/cRGD)@dHA-Ce6는 HA의 반복 단위당 Ce6, ALN 및 cRGD의 결합 몰비는 각각 0.3, 0.9 및 1.1인 것을 확인할 수 있었으며, (ALN/cRGD)@HDOC-Ce6는 HA, DOCA, Ce6, ALN 및 cRGD가 화학적으로 연결된 것을 확인할 수 있었다.
이후 PBS(pH 7.4, 150 mM) 상에서 (ALN/cRGD)@HDOC-Ce6의 자가 조립 공정을 통해 (ALN/cRGD)@HDOC-Ce6 NP를 제조하였다.
<실시예 2> dHA 샘플 특징 확인
TEM을 이용하여 도 3a와 같이 (ALN/cRGD)@dHA-Ce6 및 (ALN/cRGD)@HDOC-Ce6 NP의 이미지를 확인하였다. TEM 이미지에서 모든 dHA 샘플은 평균 직경 5-10 nm의 매우 작은 크기의 닷 (dot) 형태를 나타내었다. 또한, (ALN/cRGD)@HDOC-Ce6 NP의 평균 직경은 100 nm의 구형태를 나타내었다.
또한, 도 3b를 참고하면, 각 dHA 샘플 및 (ALN/cRGD)@HDOC-Ce6 NP (measured using a Zetasizer 3000)의 평균 입자 크기가 각각 10 및 100 nm인 것이 확인되었다.
도 3c와 같이 pH 7.4에서 모든 샘플의 제타 전위가 HA 및 Ce6로 인해 음의 값을 나타내었으며, 특히, (ALN)@dHA-Ce6 및 (ALN/cRGD)@HDOC-Ce6 NP, (ALN/cRGD)@dHA-Ce6는 ALN의 포스포릴 기 (phosphoryl group)으로 인해 더 감소된 제타 전위 값을 나타내었다.
각 dHA 샘플 및 (ALN/cRGD)@HDOC-Ce6 NP의 형광 Ce6 강도를 확인하기 위해 방출 스펙트럼(λex 400 nm)을 분석 결과, 도 3d와 같이, 670 nm에서 각 dHA 샘플(수용성 dHA-Ce6, (ALN)@dHA-Ce6, (cRGD)@dHA-Ce6 및 (ALN/cRGD)@dHA-Ce6)에서 형광 세기가 증가한 것이 확인되었다.
상기 결과로부터 유리 Ce6 또는 (ALN/cRGD)@HDOC-Ce6 NP의 수용액 상에서 auto-quenching이 일어난 것과 다르게 각 dHA 샘플은 HA 골격에 고르게 분포된 Ce6의 dequenching 상태인 것이 확인되었다.
다음으로, 형광 9,10-dimethylanthracene (DMAT)를 이용하여 (ALN/cRGD)@dHA-Ce6의 일항 산소 발생을 확인하였다.
그 결과, 도 3e와 같이 모든 dHA 샘플에서 빛 조사시 다량의 일항산소 생성이 확인되었으나, 유리 Ce6 또는 (ALN/cRGD)@HDOC-Ce6 NP에서는 Ce6 분자의 auto-quenching으로 인하여 일항산소 생성이 감소하였다.
상기 결과로부터 (ALN/cRGD)@HDOC-Ce6 NP와 다르게 dHA 샘플은 종양 치료 시 일항 산소 매개 광 독성을 향상시킬 수 있음이 확인되었다.
<실시예 3> dHA 샘플의 수산화인회석 (hydroxyapatite) 결합 친화도 확인
각 dHA 샘플과 (ALN/cRGD)@HDOC-Ce6 NP의 수산화인회석 결합 친화도를 확인하였다.
그 결과, 도 4와 같이 ALN이 없는 dHA-Ce6 및 (cRGD)@dHA-Ce6는 180분 후 35-40 wt.%의 낮은 결합 친화도를 나타낸 반면, (ALN)@dHA-Ce6, (ALN/cRGD)@HDOC-Ce6 NP 및 (ALN/cRGD)@dHA-Ce6는 ALN와 Ca2+ 사이의 뼈-매개 정전기적 상호작용으로 인해 약 80 wt.%의 결합 친화도를 나타내었다.
상기 결과로부터 ALN가 존재하는 dHA 샘플은 뼈 표적화능이 향상된 것이 확인되었다.
<실시예 4> In vitro dHA 샘플의 광독성 확인
dHA 샘플의 in vitro 광 독성을 확인하기 위해, CD44 수용체 또는 인테그린 (integrin) αvβ3의 존재 여부에 따라 4종류의 세포[MDA-MB-231 세포(CD44 +, integrin αvβ3 +), A549 세포(CD44 +, integrin αvβ3-), BT-474 세포(CD44-, integrin αvβ3 +) 및 NIH3T3 세포 (CD44-, integrin αvβ3-)]를 준비하였다.
수산화인회석 입자의 유무 조건에서 타입 I 콜라겐 용액을 겔상으로 제조하여 세포를 배양한 후, 겔을 뒤집어 표면에 세포를 노출시키고(in vivo 뼈 환경 모방), 겔 상에서 유리 Ce6(10 μg/mL), 각 dHA 샘플(equivalent Ce6 10 μg/mL) 또는 (ALN/cRGD)@HDOC-Ce6 NP(equivalent Ce6 10 μg/mL)와 4 시간 동안 배양한 후, 670 nm의 광원을 이용하여 5.2 mW/cm2의 광도로 광 조사하고 12시간 동안 안정화시켰다. 이후, CCK-8 분석을 이용하여 세포 생존율을 확인하였다.
그 결과, 도 5a와 같이 (ALN/cRGD)@dHA-Ce6는 HA, cRGD 및 ALN 각각 CD44 수용체, 인테그린 αvβ3 및 수산화인회석 입자에 대한 표적 능력으로 인하여 매우 증가된 MDA-MB-231 세포사멸 효과를 나타내었다. 반면, 도 6a와 같이 (ALN/cRGD)@HDOC-Ce6 NP는 상대적으로 큰 입자 크기에 따른 세포 흡수율 감소로 인하여 낮은 광독성을 나타내었다.
또한, ALN 또는 cRGD가 없거나, ALN 및 cRGD가 둘 다 없는 dHA-Ce6, (ALN)@dHA-Ce6 및 (cRGD)@dHA-Ce6는 MDA-MB-231 세포 사멸에 매우 낮은 효과를 나타내는 것이 확인되었다. 이와 유사하게 도 5a를 참고하면, (ALN/cRGD)@dHA-Ce6는 인테그린 αvβ3이 없는 A549 세포, CD44 수용체가 없는 BT-474 세포, CD44 수용체 및 인테그린 αvβ3이 없는 NIH3T3 세포에 대해 상대적으로 낮은 광 독성을 나타내었다.
한편, 도 5b를 참고하면 수산화인회석 입자가 없는 조건에서 (ALN)@dHA, (ALN/cRGD)@HDOC-Ce6 NP 및 (ALN/cRGD)@dHA-Ce6는 상대적으로 감소된 세포 광독성을 나타내었다.
상기 결과로부터 HA, cRGD 및 ALN이 존재하는 (ALN/cRGD)@dHA-Ce6의 다중 표적화 능력은 골 전이성 MDA-MB-231 종양 세포의 세포사멸 능력을 향상시킬 수 있음이 확인되었다.
또한, 도 7과 같이 MDA-MB-231, A549, BT-474 및 NIH3T3 세포에서 광조사되지 않은 각 dHA 샘플 및 (ALN/cRGD)@HDOC-Ce6 NP의 자체 독성을 확인한 결과, 모든 샘플은 자체 독성이 거의 나타나지 않는 것을 확인할 수 있었다.
<실시예 5> In vitro/in vivo dHA 샘플 확인
각 샘플의 MDA-MB-231 종양 세포 내 흡수를 확인하기 위해, 유세포 분석과 공초점 이미지 분석을 수행하였다.
그 결과, 도 6a와 같이 MDA-MB-231 세포에서 매우 작은 크기의 (ALN/cRGD)@dHA-Ce6 및 (cRGD)@dHA-Ce6는 HA(CD44 표적) 및 cRGD(인테그린 αvβ3 표적)의 존재로 인한 종양 표적능력으로 높은 세포 흡수율이 확인되었으나, (ALN/cRGD)@HDOC-Ce6 NP (~100 nm in diameter)은 상대적은 낮은 세포 흡수율이 확인되었다. 또한, dHA-Ce6 및 (ALN)@dHA-Ce6는 MDA-MB-231 종양 세포의 인테그린 αvβ3와 결합할 수 있는 cRGD가 존재하지 않으므로, 상대적으로 낮은 세포 흡수가 확인되었다.
다음으로, ex vivo 상에서 각 샘플의 광 독성을 확인하기 위해, 추출한 경골 표면에 MDA-MB-231 종양 세포를 48시간 동안 배양하여 ex vivo 전이성 골종양 모델을 제작하였다.
종양 세포가 배양된 경골에 유리 Ce6(10 μg/mL), (ALN/cRGD)@HDOC-Ce6 NP (equivalent Ce6 10 μg/mL) 또는 각 샘플(equivalent Ce6 10 μg/mL)을 4시간 동안 처리한 후, 670 nm의 광원을 이용하여 5.2 mW/cm2의 광도로 10분간 광 조사하고 37℃에서 12시간 동안 배양하였다.
그 결과, 도 6b와 같이 각 샘플로 처리된 경골의 SEM 이미지에서 (ALN/cRGD)@dHA-Ce6로 처리된 경골은 종양 세포의 사멸이 확인된 반면, 다른 샘플이 처리된 경골 표면에서 종양 세포가 부분적으로 분포되어 제한된 치료 효과가 나타나는 것을 확인할 수 있었다.
또한, 오른쪽 경골에 MDA-MB-231 종양 세포가 이식된 마우스 모델을 사용하여 각 샘플의 생체 내 종양 표적화 능력을 확인하였다.
먼저, 마우스의 꼬리 정맥에 유리 Ce6(2.5 mg/kg) 또는 각 샘플(equivalent Ce6 2.5 mg/kg)을 주사하고, FOBI를 이용해 형광 이미지를 얻었다.
그 결과, 그림 8a와 같이 (ALN/cRGD)@dHA-Ce6는 주사 후 8 시간 후에 종양 부위에서 강한 Ce6 형광 신호를 보인 반면, 유리 Ce6, (cRGD)@dHA-Ce6 및 (ALN)@dHA-Ce6는 상대적으로 약한 Ce6 형광을 나타내었다.
추가적으로, 각 샘플의 종양 선택적인 축적을 확인하기 위해, 주사 후 24 시간 뒤 모델 마우스로부터 얻은 기관(심장, 폐, 간, 신장, 비장 및 종양)에서 Ce6 형광 강도를 확인하였다.
그 결과, 도 8b와 같이 (ALN)@dHA-Ce6 및 (ALN/cRGD)@dHA-Ce6는 종양 부위에서 강한 Ce6 형광을 나타낸 반면, ALN가 없는 유리 Ce6 및 (cRGD)@dHA-Ce6는 종양 부위에서 상대적으로 약한 Ce6 형광을 나타내었다. 또한, 정상 기관(심장 및 폐, 간, 신장, 비장)에서 (ALN/cRGD)@dHA-Ce6의 형광 강도가 상대적으로 약한 것으로 확인됨에 따라, (ALN/cRGD)@dHA-Ce6은 정상 기관에 낮은 축적율을 나타내는 것이 확인되었다.
dHA 샘플의 생체 내 광역학적 종양 억제 효과를 확인하기 위해, 도 9a와 같이 MDA-MB-231 종양이 이식된 모델 마우스에 대조군(식염수), 유리 Ce6(2.5 mg/kg) 또는 dHA 샘플(equivalent Ce6 2.5 mg/kg)을 정맥주사하고 670 nm의 광원을 이용하여 5.2 mW/cm2의 광도로 종양 부위에 10분간 조사하였다.
그 결과, 도 9b와 같이 (ALN/cRGD)@dHA-Ce6가 처리된 마우스에서 14일 경과 후 종양의 성장이 효과적으로 억제되는 것을 확인할 수 있었다. 특히 (ALN/cRGD)@dHA-Ce6를 처리 한 마우스에서 상대적인 종양 크기는 대조군(식염수), 유리 Ce6, (cRGD)@dHA-Ce6 및 (ALN)@dHA-Ce6이 처리된 마우스보다 13.4배, 9.5배, 2.9배 및 1.9배 감소하였다. 또한, 도 9c와 같은 컴퓨터 단층 촬영 이미지에서도 (ALN/cRGD)@dHA-Ce6가 MDA-MB-231 종양 세포를 억제하는데 매우 효과적인 것을 확인할 수 있었으며, 정상군의 오른쪽 다리의 컴퓨터 단층 촬영 이미지와 차이가 없는 것을 확인할 수 있었다.
상기 결과들로부터 전이성 골종양에 대한 (ALN/cRGD)@dHA-Ce6의 우수한 다중 표적능력 및 현저한 치료효과가 확인됨에 따라, 다중 표적 능력을 나타내는 (ALN/cRGD)@dHA-Ce6 초미세 닷은 전이성 골종양 치료를 위한 약물전달체 및 광역학 치료제로 제공될 수 있다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (10)

  1. 풀러렌; 및 상기 풀러렌 표면에 π-π 결합한 히알루론산을 포함하며,
    상기 히알루론산에 광감작제, 비스포스네이트 약물 및 cRGD (cyclic arginine-glycine-aspartic acid)가 결합된 히알루론산 나노입자 조성물.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 나노입자는 전이성 골종양 세포를 다중 표적하는 것을 특징으로 하는 히알루론산 나노입자 조성물.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 히알루론산은 종양 세포의 CD44 수용체와 결합하여 종양 세포를 표적하는 것을 특징으로 하는 히알루론산 나노입자 조성물.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 cRGD는 종양 세포의 인테그린 (integrin) αvβ3와 결합하여 종양 세포를 표적하는 것을 특징으로 하는 히알루론산 나노입자 조성물.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 비스포스네이트 약물은 뼈에 존재하는 수산화인회석 (hydroxyapatite)과 정전기적 결합하여 종양 세포를 표적하는 것을 특징으로 하는 히알루론산 나노입자 조성물.
  6. 청구항 1에 있어서, 상기 히알루론산 나노입자는 히알루론산 1 몰에 대하여, 광감작제 0.1 내지 0.5 몰, 비스포스네이트 약물 0.5 내지 1.2 몰 및 cRGD 0.8 내지 1.5 몰로 이루어진 것을 특징으로 하는 히알루론산 나노입자 조성물.
  7. 청구항 1에 있어서, 상기 광감작제는 클로린류(chlorins), 포피린류(phophyrins) 및 프탈로시아닌류(phthalocyanine)로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 히알루론산 나노입자 조성물.
  8. 청구항 1에 있어서, 상기 비스포스네이트 약물은 알렌드로네이트 (alendronate), 리세드로네이트 (risedronate), 이반드로네이트 (ibandronate), 파미드로네이트 (pamidronate) 및 졸레드로네이트 (zoledronate)로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 히알루론산 나노입자 조성물.
  9. 풀러렌; 및 상기 풀러렌 표면에 π-π 결합한 히알루론산을 포함하며,
    상기 히알루론산에 광감작제, 비스포스네이트 약물 및 cRGD (cyclic arginine-glycine-aspartic acid)가 결합된 히알루론산 나노입자를 유효성분으로 함유하는 전이성 골종양 광역학 치료용 약학조성물.
  10. 청구항 9에 있어서, 상기 히알루론산 나노입자는 전이성 골종양 세포를 다중 표적하여 광역학 항암 치료 효과를 증가시키는 것을 특징으로 하는 광역학 치료용 약학조성물.
KR1020200182982A 2020-12-24 2020-12-24 히알루론산 나노입자를 유효성분으로 함유하는 전이성 골종양 광역학 치료용 조성물 KR102514126B1 (ko)

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