KR102507311B1 - Use of siRNA specific for protein S in the treatment of hemophilia - Google Patents
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Abstract
본 발명은 혈우병 치료 방법에 사용하기 위한 단백질 S에 대한 siRNA를 제공한다. 본 발명에 따른 siRNA를 포함하는 분자, 및 본 발명에 따른 siRNA를 포함하는 분자를 포함하는 혈우병 예방 또는 치료를 위한 투약 형태를 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 필요로 하는 환자의 혈우병 치료방법 또한 본 발명의 범위에 속한다. The present invention provides siRNA against protein S for use in methods of treating hemophilia. A method of treating hemophilia in a patient in need thereof, comprising administering to the patient a molecule comprising the siRNA according to the present invention, and a dosage form for preventing or treating hemophilia comprising the molecule comprising the siRNA according to the present invention. within the scope of the present invention.
Description
본 발명은 단백질 S에 대하여 지시되는 siRNA를 사용한 혈우병 치료에 관한 것이다.The present invention relates to the treatment of hemophilia using siRNA directed against protein S.
발명의 배경background of invention
혈우병 A (HA) 및 B (HB)는 유전적 X-연관 장애이다. 이들은 각각 인자 VIII (FVIII) (F8) 또는 인자 IX (FIX) 유전자 (F9)의 돌연변이에 의해 유발되며, 이는 고유한 응고 경로의 필수 성분인 인코드된 단백질의 결핍을 초래한다 (도 1A). Hemophilia A (HA) and B (HB) are genetic X-linked disorders. These are caused by mutations in the factor VIII (FVIII) (F8) or factor IX (FIX) genes (F9), respectively, resulting in a deficiency of the encoded protein that is an essential component of the intrinsic coagulation pathway (FIG. 1A).
중증 혈우병 환자는 종종 근골격계 내부에서의 자연 출혈, 가령, 근육염을 겪는다. 이를 치료하지 않고 두게 되면 어린 나이에 장애가 생길 수 있다.Severe hemophilia patients often suffer from spontaneous bleeding within the musculoskeletal system, such as myositis. If left untreated, it can lead to disability at a young age.
현재 혈우병 치료에는 인자 대체 요법이 포함된다. 이 요법은 삶의 질 (QoL)을 향상시키지만 여전히 몇 가지 단점이 있다. 인자는 정맥내 투여되며, 반감기가 짧기 때문에 반복적으로 주입해야 하고, 환자에게 큰 불편함을 주고, 감염 및 정맥 손상의 위험이 있다. 더 중요하게는, 인자 대체 요법하의 환자는 억제성 동종항체를 발달시킬 수 있다. 억제제는 대체 요법을 비효율적이게 하고 환자의 안전하고 효과적인 치료 표준에 대한 접근을 제한하여 환자의 이환율과 사망률 위험을 증가시킨다.Current hemophilia treatment includes factor replacement therapy. Although this therapy improves quality of life (QoL), it still has some drawbacks. The factor is administered intravenously, and because of its short half-life, it must be injected repeatedly, causing great discomfort to the patient, and there is a risk of infection and venous damage. More importantly, patients under factor replacement therapy may develop inhibitory alloantibodies. Inhibitors render replacement therapies ineffective and limit patients' access to safe and effective standards of care, increasing patients' risk of morbidity and mortality.
새로운 요법은 예방 주입 빈도를 감소시켜 치료법과 QoL에 대한 순응도를 잠재적으로 개선 할 수 있는 산물의 개발에 중점을 둔다. 오래 지속되는 FVIII 및 FIX 이외에, 신규한 접근법은 혈우병 환자의 응고 균형을 재조정하는 전략으로서, 내인성 응고 인자의 생산에 필요한 유전자의 대체, 결손 인자의 응고 기능을 모방하는 이중특이적 항체 기술 및 조직 인자 경로 억제제 (TFPI) 또는 안티트롬빈과 같은 응고 억제제의 표적화를 포함한다. 최근에, 활성화된 단백질 C (APC)-특이적 세르핀이 시험관내 트롬빈 생성을 구제하고 혈우병 마우스 모델에서 지혈을 회복시키는 것으로 나타났다.New therapies focus on the development of products that can potentially improve adherence to therapy and QoL by reducing the frequency of prophylactic infusions. In addition to the long-acting FVIII and FIX, novel approaches are strategies to rebalance coagulation in patients with hemophilia, including replacement of genes required for the production of endogenous clotting factors, bispecific antibody technology that mimics the coagulation function of defective factors, and tissue factors including targeting of coagulation inhibitors such as pathway inhibitors (TFPI) or antithrombin. Recently, it has been shown that activated protein C (APC)-specific serpins rescue thrombin generation in vitro and restore hemostasis in a hemophilia mouse model.
상기 기술 상황에 기초하여, 본 발명의 목적은 새로운 혈우병 치료를 제공하는 수단 및 방법을 제공하는 것이다. 이 목적은 본 명세서의 청구범위에 의해 달성된다.Based on the above state of the art, an object of the present invention is to provide means and methods for providing a new hemophilia treatment. This object is achieved by the claims of this specification.
발명의 설명description of the invention
본 발명의 제 1 양상은 혈우병 치료 방법에 사용하기 위한 단백질 S에 대한 siRNA를 제공한다.A first aspect of the present invention provides siRNA against protein S for use in a method of treating hemophilia.
본 명세서의 내용에서 용어 혈우병은 응혈을 만드는 신체의 능력이 손상되는 병태와 관련이 있다. 혈우병의 유전적 형태에는 유전 질환 혈우병 A, 혈우병 B 및 혈우병 C가 포함된다.In the context of this specification, the term hemophilia relates to a condition in which the body's ability to form clots is impaired. Genetic forms of hemophilia include the genetic disorders hemophilia A, hemophilia B and hemophilia C.
본 명세서의 내용에서 단백질 S는 유전자 PROS1 (NCBI 유전자 ID: 5627)에 의해 인코드되는 인간 "비타민 K-의존성 단백질 S" (UniProt ID P07225)에 관한 것이다.Protein S in the context of this specification relates to human "vitamin K-dependent protein S" (UniProt ID P07225) encoded by gene PROS1 (NCBI Gene ID: 5627).
인간 단백질 S의 2개의 전사 변이체가 존재한다. 전사 변이체 2는 전사 변이체 1과 비교하여 5' 코딩 영역 내 교번 인-프레임 엑손이 없다. 인코드된 아이소형 2는 아이소형 1 보다 더 짧다. 전사 변이체 2는 서열 번호 001로 특징된다. 전사 변이체 1은 서열 번호 002로 특징된다.There are two transcript variants of human protein S. Transcript
본 명세서의 내용에서 용어 siRNA (작은/짧은 간섭 RNA)는 RNA 간섭이라 불리는 과정에서 siRNA의 서열에 상보적인 핵산 서열을 포함하는 유전자의 발현을 간섭 (다시 말하면: 발현을 저해) 할 수 있는 RNA 분자에 관한 것이다. 용어 siRNA는 단일 가닥 siRNA 및 이중 가닥 siRNA 모두를 포함하는 것을 의미한다. SiRNA는 일반적으로 17-24 bp의 길이를 특징으로 한다. 이중 가닥 siRNA는 보다 긴 이중 가닥 RNA 분자 (dsRNA)로부터 유래된다. 긴 dsRNA는 엔도-리보뉴클레아제 (다이서 (Dicer)라 함)에 의해 절단되어 이중 가닥 siRNA를 형성한다. 핵 단백질 복합체 (RISC라 함)에서, 이중 가닥 siRNA는 풀려서 단일 가닥 siRNA를 형성한다. RNA 간섭은 종종 상보적 서열을 갖는 mRNA 분자에 대한 siRNA 분자의 결합을 통해 작용하여 mRNA를 분해시킨다. RNA 간섭은 또한 세포의 핵 내 전구-mRNA (미성숙, 스플라이스되지 않은 mRNA)의 인트론 서열에 대한 siRNA 분자의 결합에 의해 가능하며, 전구-mRNA를 분해한다.In the context of this specification, the term siRNA (small/short interfering RNA) refers to an RNA molecule capable of interfering with (in other words: inhibiting) the expression of a gene containing a nucleic acid sequence complementary to the sequence of the siRNA in a process called RNA interference. It is about. The term siRNA is meant to include both single-stranded siRNA and double-stranded siRNA. SiRNAs are generally characterized by a length of 17-24 bp. Double-stranded siRNAs are derived from longer double-stranded RNA molecules (dsRNA). Long dsRNAs are cleaved by endo-ribonuclease (called Dicer) to form double-stranded siRNAs. In the nucleoprotein complex (referred to as RISC), double-stranded siRNAs are unwound to form single-stranded siRNAs. RNA interference often acts through the binding of a siRNA molecule to an mRNA molecule with a complementary sequence, resulting in mRNA degradation. RNA interference is also possible by binding of siRNA molecules to intronic sequences of pre-mRNA (immature, unspliced mRNA) in the nucleus of cells, degrading the pre-mRNA.
본 발명자들은 표적 단백질 S (PS)가 응고를 재조정함으로써 혈우병의 지혈을 촉진 할 수 있는지를 조사하였다 (도 1B). PROS1 유전자에 의해 인코드되는 PS는 인자 Va (FVa) 및 FVIIIa의 불활성화에서 APC에 대해 및 FXa의 억제에서 TFPI에 대해 보조인자로 작용한다. 이러한 이중 역할은 PS를 트롬빈 생성의 주요 조절인자가 되게 한다. We investigated whether the target protein S (PS) could promote hemostasis in hemophilia by reregulating coagulation (Fig. 1B). The PS encoded by the PROS1 gene acts as a cofactor for APC in the inactivation of factors Va (FVa) and FVIIIa and for TFPI in the inhibition of FXa. This dual role makes PS a major regulator of thrombin generation.
특정 구체예들에서, siRNA는 17-24개의 뉴클레오티드를 포함한다.In certain embodiments, siRNA comprises 17-24 nucleotides.
특정 구체예들에서, siRNA는 18-22개의 뉴클레오티드를 포함한다.In certain embodiments, siRNA comprises 18-22 nucleotides.
특정 구체예들에서, siRNA는 19개의 뉴클레오티드를 포함한다.In certain embodiments, siRNA comprises 19 nucleotides.
특정 구체예들에서, siRNA는 서열 번호 001에 역 상보적인 서열로 특징된다. In certain embodiments, the siRNA is characterized by a sequence reverse complementary to SEQ ID NO: 001.
특정 구체예들에서, siRNA는 서열 번호 002에 역 상보적인 서열로 특징된다.In certain embodiments, the siRNA is characterized by a sequence reverse complementary to SEQ ID NO: 002.
특정 구체예들에서, siRNA는 서열 번호 003, 서열 번호 004, 서열 번호 005, 서열 번호 006, 서열 번호 007, 서열 번호 008, 서열 번호 009, 서열 번호 010, 서열 번호 011, 서열 번호 012, 서열 번호 013, 서열 번호 014, 서열 번호 015, 서열 번호 016, 서열 번호 017 및 서열 번호 018을 포함하는 그룹에서 선택된 서열에 역 상보적인 서열로 특징된다.In certain embodiments, the siRNA is SEQ ID NO: 003, SEQ ID NO: 004, SEQ ID NO: 005, SEQ ID NO: 006, SEQ ID NO: 007, SEQ ID NO: 008, SEQ ID NO: 009, SEQ ID NO: 010, SEQ ID NO: 011, SEQ ID NO: 012, SEQ ID NO: 012 013, SEQ ID NO: 014, SEQ ID NO: 015, SEQ ID NO: 016, SEQ ID NO: 017, and SEQ ID NO: 018.
특정 구체예들에서, siRNA는 서열 번호 003에 역 상보적인 서열로 특징된다.In certain embodiments, the siRNA is characterized by a sequence reverse complementary to SEQ ID NO: 003.
특정 구체예들에서, siRNA는 서열 번호 004에 역 상보적인 서열로 특징된다.In certain embodiments, the siRNA is characterized by a sequence reverse complementary to SEQ ID NO: 004.
특정 구체예들에서, siRNA는 서열 번호 005에 역 상보적인 서열로 특징된다.In certain embodiments, the siRNA is characterized by a sequence reverse complementary to SEQ ID NO: 005.
특정 구체예들에서, siRNA는 서열 번호 006에 역 상보적인 서열로 특징된다.In certain embodiments, the siRNA is characterized by a sequence reverse complementary to SEQ ID NO: 006.
특정 구체예들에서, siRNA는 서열 번호 007에 역 상보적인 서열로 특징된다.In certain embodiments, the siRNA is characterized by a sequence reverse complementary to SEQ ID NO: 007.
특정 구체예들에서, siRNA는 서열 번호 008에 역 상보적인 서열로 특징된다.In certain embodiments, the siRNA is characterized by a sequence reverse complementary to SEQ ID NO: 008.
특정 구체예들에서, siRNA는 서열 번호 009에 역 상보적인 서열로 특징된다.In certain embodiments, the siRNA is characterized by a sequence reverse complementary to SEQ ID NO: 009.
특정 구체예들에서, siRNA는 서열 번호 010에 역 상보적인 서열로 특징된다.In certain embodiments, the siRNA is characterized by a sequence reverse complementary to SEQ ID NO: 010.
특정 구체예들에서, siRNA는 서열 번호 011에 역 상보적인 서열로 특징된다.In certain embodiments, the siRNA is characterized by a sequence reverse complementary to SEQ ID NO: 011.
특정 구체예들에서, siRNA는 서열 번호 012에 역 상보적인 서열로 특징된다.In certain embodiments, the siRNA is characterized by a sequence reverse complementary to SEQ ID NO: 012.
특정 구체예들에서, siRNA는 서열 번호 013에 역 상보적인 서열로 특징된다.In certain embodiments, the siRNA is characterized by a sequence reverse complementary to SEQ ID NO: 013.
특정 구체예들에서, siRNA는 서열 번호 014에 역 상보적인 서열로 특징된다.In certain embodiments, the siRNA is characterized by a sequence reverse complementary to SEQ ID NO: 014.
특정 구체예들에서, siRNA는 서열 번호 015에 역 상보적인 서열로 특징된다.In certain embodiments, the siRNA is characterized by a sequence reverse complementary to SEQ ID NO: 015.
특정 구체예들에서, siRNA는 서열 번호 016에 역 상보적인 서열로 특징된다.In certain embodiments, the siRNA is characterized by a sequence reverse complementary to SEQ ID NO: 016.
특정 구체예들에서, siRNA는 서열 번호 017에 역 상보적인 서열로 특징된다.In certain embodiments, the siRNA is characterized by a sequence reverse complementary to SEQ ID NO: 017.
특정 구체예들에서, siRNA는 서열 번호 018에 역 상보적인 서열로 특징된다.In certain embodiments, the siRNA is characterized by a sequence reverse complementary to SEQ ID NO: 018.
특정 실시 양태에서, siRNA는 상기 정의된 서열 중 임의의 2개의 연속 서열을 병치함으로써 형성된 서열에 역 상보적인 서열로 특징된다. 비 제한적인 예로서, siRNA는 서열 번호 014 및 서열 번호 015를 병치함으로써 형성된 서열에 역 상보적인 서열로 특징된다.In certain embodiments, siRNAs are characterized by sequences that are reverse complementary to sequences formed by juxtaposing any two contiguous sequences of the sequences defined above. As a non-limiting example, the siRNA is characterized by a sequence that is reverse complementary to a sequence formed by juxtaposing SEQ ID NO: 014 and SEQ ID NO: 015.
특정 구체예들에서, siRNA는 서열 번호 014 (엑손 12), 서열 번호 011 (엑손 9), 서열 번호 006 (엑손 4), 서열 번호 012 (엑손 10) 및 서열 번호 013 (엑손 11)으로 구성된 그룹에서 선택된 서열에 역 상보적인 서열로 특징된다.In certain embodiments, the siRNA is a group consisting of SEQ ID NO: 014 (exon 12), SEQ ID NO: 011 (exon 9), SEQ ID NO: 006 (exon 4), SEQ ID NO: 012 (exon 10), and SEQ ID NO: 013 (exon 11). It is characterized by a sequence that is reverse complementary to a sequence selected from .
특정 구체예들에서, siRNA는 서열 번호 001의 뉴클레오티드 1-100, 101-200, 201-300, 301-400, 301-400, 401-500, 501-600, 601-700, 701-800, 801-900, 901-1000, 1001-1100, 1101-1200, 1201-1300, 1301-1400, 1501-1600, 1701-1800, 1801-1900, 1901-2000, 2001-2100, 2101-2200, 2201-2300, 2301-2400, 2501-2600, 2701-2800, 2801-2900, 2901-3000, 3001-3100, 3101-3200, 3201-3300, 3301-3400, 3401-3500 또는 3501-3580으로 특징되는 서열에 역 상보적인 서열로 특징된다.In certain embodiments, the siRNA is nucleotides 1-100, 101-200, 201-300, 301-400, 301-400, 401-500, 501-600, 601-700, 701-800, 801 of SEQ ID NO: 001. -900, 901-1000, 1001-1100, 1101-1200, 1201-1300, 1301-1400, 1501-1600, 1701-1800, 1801-1900, 1901-2000, 2001-2100, 2101-20201, 2001-20201 , 2301-2400, 2501-2600, 2701-2800, 2801-2900, 2901-3000, 3001-3100, 3101-3200, 3201-3300, 3301-3400, 3401-3500 or 3501-3580. characterized by complementary sequences.
특정 구체예들에서, siRNA는 서열 번호 001의 뉴클레오티드 1-100으로 특징되는 서열에 역 상보적인 서열로 특징된다.In certain embodiments, the siRNA is characterized by a sequence reverse complementary to the sequence characterized by nucleotides 1-100 of SEQ ID NO: 001.
특정 구체예들에서, siRNA는 서열 번호 001의 뉴클레오티드 101-200으로 특징되는 서열에 역 상보적인 서열로 특징된다.In certain embodiments, the siRNA is characterized by a sequence reverse complementary to the sequence characterized by nucleotides 101-200 of SEQ ID NO: 001.
특정 구체예들에서, siRNA는 서열 번호 001의 뉴클레오티드 201-300으로 특징되는 서열에 역 상보적인 서열로 특징된다.In certain embodiments, the siRNA is characterized by a sequence reverse complementary to the sequence characterized by nucleotides 201-300 of SEQ ID NO: 001.
특정 구체예들에서, siRNA는 서열 번호 001의 뉴클레오티드 301-400으로 특징되는 서열에 역 상보적인 서열로 특징된다.In certain embodiments, the siRNA is characterized by a sequence reverse complementary to the sequence characterized by nucleotides 301-400 of SEQ ID NO: 001.
특정 구체예들에서, siRNA는 서열 번호 001의 뉴클레오티드 401-500으로 특징되는 서열에 역 상보적인 서열로 특징된다.In certain embodiments, the siRNA is characterized by a sequence reverse complementary to the sequence characterized by nucleotides 401-500 of SEQ ID NO: 001.
특정 구체예들에서, siRNA는 서열 번호 001의 뉴클레오티드 501-600으로 특징되는 서열에 역 상보적인 서열로 특징된다.In certain embodiments, the siRNA is characterized by a sequence reverse complementary to the sequence characterized by nucleotides 501-600 of SEQ ID NO: 001.
특정 구체예들에서, siRNA는 서열 번호 001의 뉴클레오티드 601-700으로 특징되는 서열에 역 상보적인 서열로 특징된다.In certain embodiments, the siRNA is characterized by a sequence reverse complementary to the sequence characterized by nucleotides 601-700 of SEQ ID NO: 001.
특정 구체예들에서, siRNA는 서열 번호 001의 뉴클레오티드 701-800으로 특징되는 서열에 역 상보적인 서열로 특징된다.In certain embodiments, the siRNA is characterized by a sequence reverse complementary to the sequence characterized by nucleotides 701-800 of SEQ ID NO: 001.
특정 구체예들에서, siRNA는 서열 번호 001의 뉴클레오티드 801-900으로 특징되는 서열에 역 상보적인 서열로 특징된다.In certain embodiments, the siRNA is characterized by a sequence reverse complementary to the sequence characterized by nucleotides 801-900 of SEQ ID NO: 001.
특정 구체예들에서, siRNA는 서열 번호 001의 뉴클레오티드 901-1000으로 특징되는 서열에 역 상보적인 서열로 특징된다.In certain embodiments, the siRNA is characterized by a sequence reverse complementary to the sequence characterized by nucleotides 901-1000 of SEQ ID NO: 001.
특정 구체예들에서, siRNA는 서열 번호 001의 뉴클레오티드 1001-1100으로 특징되는 서열에 역 상보적인 서열로 특징된다.In certain embodiments, the siRNA is characterized by a sequence reverse complementary to the sequence characterized by nucleotides 1001-1100 of SEQ ID NO: 001.
특정 구체예들에서, siRNA는 서열 번호 001의 뉴클레오티드 1100-1200으로 특징되는 서열에 역 상보적인 서열로 특징된다.In certain embodiments, the siRNA is characterized by a sequence reverse complementary to the sequence characterized by nucleotides 1100-1200 of SEQ ID NO: 001.
특정 구체예들에서, siRNA는 서열 번호 001의 뉴클레오티드 1201-1300으로 특징되는 서열에 역 상보적인 서열로 특징된다.In certain embodiments, the siRNA is characterized by a sequence reverse complementary to the sequence characterized by nucleotides 1201-1300 of SEQ ID NO: 001.
특정 구체예들에서, siRNA는 서열 번호 001의 뉴클레오티드 1301-1400으로 특징되는 서열에 역 상보적인 서열로 특징된다.In certain embodiments, the siRNA is characterized by a sequence reverse complementary to the sequence characterized by nucleotides 1301-1400 of SEQ ID NO: 001.
특정 구체예들에서, siRNA는 서열 번호 001의 뉴클레오티드 1401-1500으로 특징되는 서열에 역 상보적인 서열로 특징된다.In certain embodiments, the siRNA is characterized by a sequence reverse complementary to the sequence characterized by nucleotides 1401-1500 of SEQ ID NO: 001.
특정 구체예들에서, siRNA는 서열 번호 001의 뉴클레오티드 1501-1600으로 특징되는 서열에 역 상보적인 서열로 특징된다.In certain embodiments, the siRNA is characterized by a sequence reverse complementary to the sequence characterized by nucleotides 1501-1600 of SEQ ID NO: 001.
특정 구체예들에서, siRNA는 서열 번호 001의 뉴클레오티드 1601-1700으로 특징되는 서열에 역 상보적인 서열로 특징된다.In certain embodiments, the siRNA is characterized by a sequence reverse complementary to the sequence characterized by nucleotides 1601-1700 of SEQ ID NO: 001.
특정 구체예들에서, siRNA는 서열 번호 001의 뉴클레오티드 1701-1800으로 특징되는 서열에 역 상보적인 서열로 특징된다.In certain embodiments, the siRNA is characterized by a sequence reverse complementary to the sequence characterized by nucleotides 1701-1800 of SEQ ID NO: 001.
특정 구체예들에서, siRNA는 서열 번호 001의 뉴클레오티드 1801-1900으로 특징되는 서열에 역 상보적인 서열로 특징된다.In certain embodiments, the siRNA is characterized by a sequence reverse complementary to the sequence characterized by nucleotides 1801-1900 of SEQ ID NO: 001.
특정 구체예들에서, siRNA는 서열 번호 001의 뉴클레오티드 1901-2000으로 특징되는 서열에 역 상보적인 서열로 특징된다.In certain embodiments, the siRNA is characterized by a sequence reverse complementary to the sequence characterized by nucleotides 1901-2000 of SEQ ID NO: 001.
특정 구체예들에서, siRNA는 서열 번호 001의 뉴클레오티드 2001-2100으로 특징되는 서열에 역 상보적인 서열로 특징된다.In certain embodiments, the siRNA is characterized by a sequence reverse complementary to the sequence characterized by nucleotides 2001-2100 of SEQ ID NO: 001.
특정 구체예들에서, siRNA는 서열 번호 001의 뉴클레오티드 2100-2200으로 특징되는 서열에 역 상보적인 서열로 특징된다.In certain embodiments, the siRNA is characterized by a sequence reverse complementary to the sequence characterized by nucleotides 2100-2200 of SEQ ID NO: 001.
특정 구체예들에서, siRNA는 서열 번호 001의 뉴클레오티드 2201-2300으로 특징되는 서열에 역 상보적인 서열로 특징된다.In certain embodiments, the siRNA is characterized by a sequence reverse complementary to the sequence characterized by nucleotides 2201-2300 of SEQ ID NO: 001.
특정 구체예들에서, siRNA는 서열 번호 001의 뉴클레오티드 2301-2400으로 특징되는 서열에 역 상보적인 서열로 특징된다.In certain embodiments, the siRNA is characterized by a sequence reverse complementary to the sequence characterized by nucleotides 2301-2400 of SEQ ID NO: 001.
특정 구체예들에서, siRNA는 서열 번호 001의 뉴클레오티드 2401-2500으로 특징되는 서열에 역 상보적인 서열로 특징된다.In certain embodiments, the siRNA is characterized by a sequence reverse complementary to the sequence characterized by nucleotides 2401-2500 of SEQ ID NO: 001.
특정 구체예들에서, siRNA는 서열 번호 001의 뉴클레오티드 2501-2600으로 특징되는 서열에 역 상보적인 서열로 특징된다.In certain embodiments, the siRNA is characterized by a sequence reverse complementary to the sequence characterized by nucleotides 2501-2600 of SEQ ID NO: 001.
특정 구체예들에서, siRNA는 서열 번호 001의 뉴클레오티드 2601-2700으로 특징되는 서열에 역 상보적인 서열로 특징된다.In certain embodiments, the siRNA is characterized by a sequence reverse complementary to the sequence characterized by nucleotides 2601-2700 of SEQ ID NO: 001.
특정 구체예들에서, siRNA는 서열 번호 001의 뉴클레오티드 2701-2800으로 특징되는 서열에 역 상보적인 서열로 특징된다.In certain embodiments, the siRNA is characterized by a sequence reverse complementary to the sequence characterized by nucleotides 2701-2800 of SEQ ID NO: 001.
특정 구체예들에서, siRNA는 서열 번호 001의 뉴클레오티드 2801-2900으로 특징되는 서열에 역 상보적인 서열로 특징된다.In certain embodiments, the siRNA is characterized by a sequence reverse complementary to the sequence characterized by nucleotides 2801-2900 of SEQ ID NO: 001.
특정 구체예들에서, siRNA는 서열 번호 001의 뉴클레오티드 2901-3000으로 특징되는 서열에 역 상보적인 서열로 특징된다.In certain embodiments, the siRNA is characterized by a sequence reverse complementary to the sequence characterized by nucleotides 2901-3000 of SEQ ID NO: 001.
특정 구체예들에서, siRNA는 서열 번호 001의 뉴클레오티드 3001-3100으로 특징되는 서열에 역 상보적인 서열로 특징된다.In certain embodiments, the siRNA is characterized by a sequence reverse complementary to the sequence characterized by nucleotides 3001-3100 of SEQ ID NO: 001.
특정 구체예들에서, siRNA는 서열 번호 001의 뉴클레오티드 3100-3200으로 특징되는 서열에 역 상보적인 서열로 특징된다.In certain embodiments, the siRNA is characterized by a sequence reverse complementary to the sequence characterized by nucleotides 3100-3200 of SEQ ID NO: 001.
특정 구체예들에서, siRNA는 서열 번호 001의 뉴클레오티드 3201-3300으로 특징되는 서열에 역 상보적인 서열로 특징된다.In certain embodiments, the siRNA is characterized by a sequence reverse complementary to the sequence characterized by nucleotides 3201-3300 of SEQ ID NO: 001.
특정 구체예들에서, siRNA는 서열 번호 001의 뉴클레오티드 3301-3400으로 특징되는 서열에 역 상보적인 서열로 특징된다.In certain embodiments, the siRNA is characterized by a sequence reverse complementary to the sequence characterized by nucleotides 3301-3400 of SEQ ID NO: 001.
특정 구체예들에서, siRNA는 서열 번호 001의 뉴클레오티드 3401-3500으로 특징되는 서열에 역 상보적인 서열로 특징된다.In certain embodiments, the siRNA is characterized by a sequence reverse complementary to the sequence characterized by nucleotides 3401-3500 of SEQ ID NO: 001.
특정 구체예들에서, siRNA는 서열 번호 001의 뉴클레오티드 3501-3580으로 특징되는 서열에 역 상보적인 서열로 특징된다.In certain embodiments, the siRNA is characterized by a sequence reverse complementary to the sequence characterized by nucleotides 3501-3580 of SEQ ID NO: 001.
특정 실시 양태에서, siRNA는 상기 정의된 서열 중 임의의 2개의 연속 서열을 병치함으로써 형성된 서열에 역 상보적인 서열로 특징된다. 비 제한적인 예로서, siRNA는 서열 번호 001의 1501-1600 및 서열 번호 001의 1501-1600을 병치함으로써 형성된 서열에 역 상보적인 서열로 특징된다.In certain embodiments, siRNAs are characterized by sequences that are reverse complementary to sequences formed by juxtaposing any two contiguous sequences of the sequences defined above. As a non-limiting example, the siRNA is characterized by a sequence reverse complementary to a sequence formed by juxtaposing 1501-1600 of SEQ ID NO: 001 and 1501-1600 of SEQ ID NO: 001.
특정 구체예들에서, siRNA는 단백질 S의 인트론 서열에 대해 지시된다.In certain embodiments, the siRNA is directed against an intronic sequence of protein S.
특정 구체예들에서, siRNA는 서열 번호 014 (엑손 12), 서열 번호 011 (엑손 9), 서열 번호 006 (엑손 4), 서열 번호 012 (엑손 10) 및 서열 번호 013 (엑손 11)으로 구성된 그룹에서 선택된 서열에 역 상보적인 서열로 특징된다.In certain embodiments, the siRNA is a group consisting of SEQ ID NO: 014 (exon 12), SEQ ID NO: 011 (exon 9), SEQ ID NO: 006 (exon 4), SEQ ID NO: 012 (exon 10), and SEQ ID NO: 013 (exon 11). It is characterized by a sequence that is reverse complementary to a sequence selected from .
특정 구체예들에서, siRNA는 서열 번호 019 (siRNA_1), 서열 번호 020 (siRNA_2), 서열 번호 021 (siRNA_3), 서열 번호 022 (siRNA_4), 서열 번호 023 (siRNA_5), 서열 번호 024 (siRNA_6), 서열 번호 025 (siRNA_7), 서열 번호 026 (siRNA_8), 서열 번호 027 (siRNA_9), 서열 번호 028 (siRNA_10), 서열 번호 029 (siRNA_11), 서열 번호 030 (siRNA_12), 서열 번호 031 (siRNA_13), 서열 번호 032 (siRNA_14), 서열 번호 033 (siRNA_15), 서열 번호 034 (siRNA_16), 서열 번호 035 (siRNA_17), 서열 번호 036 (siRNA_18), 서열 번호 037 (siRNA_19), 서열 번호 038 (siRNA_20), 서열 번호 039 (siRNA_21), 서열 번호 040 (siRNA_22), 서열 번호 041 (siRNA_23), 서열 번호 042 (siRNA_24), 서열 번호 043 (siRNA_25), 서열 번호 044 (siRNA_26), 서열 번호 045 (siRNA_27), 서열 번호 046 (siRNA_28), 서열 번호 047 (siRNA_29), 서열 번호 048 (siRNA_30), 서열 번호 049 (siRNA_31), 서열 번호 050 (siRNA_32), 서열 번호 051(siRNA_33), 서열 번호 052 (siRNA_34), 서열 번호 053 (siRNA_35), 서열 번호 054 (siRNA_36), 서열 번호 055 (siRNA_37), 서열 번호 056 (siRNA_38), 서열 번호 057 (siRNA_39), 서열 번호 058 (siRNA_40), 서열 번호 059 (siRNA_41), 서열 번호 060 (siRNA_42), 서열 번호 061 (siRNA_43), 서열 번호 062 (siRNA_44), 서열 번호 063 (siRNA_45), 서열 번호 064 (siRNA_46), 서열 번호 065 (siRNA_47), 서열 번호 066(siRNA_48), 서열 번호 067 (siRNA_49), 및 서열 번호 068 (siRNA_50)을 포함하는 그룹에서 선택된 서열을 포함하는 또는 이러한 서열로 구성된 서열로 특징된다.In certain embodiments, the siRNA is SEQ ID NO: 019 (siRNA_1), SEQ ID NO: 020 (siRNA_2), SEQ ID NO: 021 (siRNA_3), SEQ ID NO: 022 (siRNA_4), SEQ ID NO: 023 (siRNA_5), SEQ ID NO: 024 (siRNA_6), SEQ ID NO: 025 (siRNA_7), SEQ ID NO: 026 (siRNA_8), SEQ ID NO: 027 (siRNA_9), SEQ ID NO: 028 (siRNA_10), SEQ ID NO: 029 (siRNA_11), SEQ ID NO: 030 (siRNA_12), SEQ ID NO: 031 (siRNA_13), sequence SEQ ID NO: 032 (siRNA_14), SEQ ID NO: 033 (siRNA_15), SEQ ID NO: 034 (siRNA_16), SEQ ID NO: 035 (siRNA_17), SEQ ID NO: 036 (siRNA_18), SEQ ID NO: 037 (siRNA_19), SEQ ID NO: 038 (siRNA_20), SEQ ID NO 039 (siRNA_21), SEQ ID NO: 040 (siRNA_22), SEQ ID NO: 041 (siRNA_23), SEQ ID NO: 042 (siRNA_24), SEQ ID NO: 043 (siRNA_25), SEQ ID NO: 044 (siRNA_26), SEQ ID NO: 045 (siRNA_27), SEQ ID NO: 046 (siRNA_28), SEQ ID NO: 047 (siRNA_29), SEQ ID NO: 048 (siRNA_30), SEQ ID NO: 049 (siRNA_31), SEQ ID NO: 050 (siRNA_32), SEQ ID NO: 051 (siRNA_33), SEQ ID NO: 052 (siRNA_34), SEQ ID NO: 053 ( siRNA_35), SEQ ID NO: 054 (siRNA_36), SEQ ID NO: 055 (siRNA_37), SEQ ID NO: 056 (siRNA_38), SEQ ID NO: 057 (siRNA_39), SEQ ID NO: 058 (siRNA_40), SEQ ID NO: 059 (siRNA_41), SEQ ID NO: 060 (siRNA_42 ), SEQ ID NO: 061 (siRNA_43), SEQ ID NO: 062 (siRNA_44), SEQ ID NO: 063 (siRNA_45), sequence A sequence comprising or consisting of a sequence selected from the group comprising SEQ ID NO: 064 (siRNA_46), SEQ ID NO: 065 (siRNA_47), SEQ ID NO: 066 (siRNA_48), SEQ ID NO: 067 (siRNA_49), and SEQ ID NO: 068 (siRNA_50) characterized by
특정 구체예들에서, siRNA는 혈우병 A의 치료 방법에 사용하기 위해 제공된다. In certain embodiments, siRNAs are provided for use in a method of treating hemophilia A.
특정 구체예들에서, siRNA는 혈우병 B의 치료 방법에 사용하기 위해 제공된다. In certain embodiments, siRNAs are provided for use in a method of treating hemophilia B.
유사하게, 본 발명의 범위에는 본 발명에 따른 siRNA를 포함하는 분자를 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 필요로 하는 환자에서 혈우병을 치료하는 방법이 속한다.Similarly, within the scope of the present invention is a method of treating hemophilia in a patient in need thereof comprising administering to the patient a molecule comprising a siRNA according to the present invention.
유사하게, 본 발명에 따른 siRNA를 포함하는 분자를 포함하는 혈우병의 예방 또는 치료를 위한 투여 형태가 제공된다. Similarly, a dosage form for preventing or treating hemophilia comprising a molecule comprising a siRNA according to the present invention is provided.
본 명세서의 내용에서, "본 발명에 따른 siRNA를 포함하는 분자"라는 표현은 이로부터 RNA 간섭 경로에 의해 포유 동물 세포 내에서 본 발명에 따른 siRNA가 생성 될 수 있는, 본 발명에 따른 siRNA 및 분자, 특히, dsRNA 분자를 포함한다.In the context of this specification, the expression “a molecule comprising the siRNA according to the present invention” refers to siRNA and molecules according to the present invention, from which the siRNA according to the present invention can be produced in mammalian cells by the RNA interference pathway. , in particular dsRNA molecules.
본 발명의 내용에서 "뉴클레오티드"는 핵산 또는 핵산 유사체 빌딩 블록이며, 이의 올리고머는 염기 쌍을 기초로 RNA 올리고머와의 선택적 하이브리드를 형성 할 수 있다. 이와 관련하여 용어 뉴클레오티드는 고전적인 리보뉴클레오티드 빌딩 블록 아데노신, 구아노신, 우리딘 (및 리보실티민), 시티딘, 고전적인 데옥시리보뉴클레오티드 데옥시아데노신, 데옥시구아노신, 티미딘, 데옥시우리딘 및 데옥시시티딘을 포함한다. 또한 이는 핵산의 유사체, 가령, 포스포티오에이트, 2'O-메틸포스포티오에이트, 펩티드 핵산 (PNA; 펩티드 링키지에 의해 연결된 N-(2-아미노에틸)-글리신 단위, 핵염기가 글리신의 알파-탄소에 부착됨) 또는 잠금 핵산 (LNA; 2'O, 4'C 메틸렌 가교된 RNA 빌딩 블록)을 포함한다. 혼성화 서열은 임의의 상기 뉴클레오티드, 또는 이들의 혼합물로 구성 될 수 있다.A "nucleotide" in the context of the present invention is a nucleic acid or nucleic acid analog building block, the oligomers of which are capable of forming selective hybrids with RNA oligomers on the basis of base pairing. In this context, the term nucleotide is derived from the classical ribonucleotide building blocks adenosine, guanosine, uridine (and ribosylthymine), cytidine, and the classical deoxyribonucleotides deoxyadenosine, deoxyguanosine, thymidine, deoxyuridine. Deine and deoxycytidine. It is also analogous to nucleic acids, such as phosphothioate, 2'O-methylphosphothioate, peptide nucleic acids (PNA; N-(2-aminoethyl)-glycine units linked by peptide linkages, nucleobases of glycine attached to the alpha-carbon) or locked nucleic acids (LNA; 2'O, 4'C methylene bridged RNA building blocks). The hybridization sequence may consist of any of the above nucleotides, or mixtures thereof.
특정 구체예들에서, 본 발명에 따른 siRNA의 혼성화 서열은 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 또는 27 개의 뉴클레오티드를 포함한다.In certain embodiments, a hybridization sequence of a siRNA according to the invention comprises 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 or 27 nucleotides.
특정 구체예들에서, 혼성화 서열은 서열 번호 001 또는 서열 번호 002의 역 상보적 서열과 95% 이상 동일하고, 보다 바람직하게는 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일하다. 특정 구체예들에서, 혼성화 서열은 데옥시뉴클레오티드, 포스포티오에이트 데옥시뉴클레오티드, LNA 및/또는 PNA 뉴클레오티드 또는 이들의 혼합물을 포함한다.In certain embodiments, the hybridization sequence is at least 95% identical, more preferably at least 96%, 97%, 98%, 99% or 100% identical to the reverse complementary sequence of SEQ ID NO: 001 or SEQ ID NO: 002. In certain embodiments, the hybridization sequence comprises deoxynucleotides, phosphothioate deoxynucleotides, LNA and/or PNA nucleotides or mixtures thereof.
본 명세서의 내용에서, 서열 동일성 및 서열 동일성 백분율이라는 용어는 2개의 정렬된 서열을 비교함으로써 결정된 값을 지칭한다. 비교를 위한 서열 정렬 방법은 해당 분야에 잘 공지되어 있다. 비교를 위한 서열의 정렬은 Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)의 국소 상동성 알고리즘, Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970)의 전역 정렬 알고리즘, Pearson and Lipman, Proc. Nat. Acad. Sci. 85:2444 (1988)의 유사성 방법을 위한 연구 또는 CLUSTAL, GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA 및 TFASTA를 비롯한 (그러나 이에 제한되는 것은 아님) 이들 알고리즘의 컴퓨터 수행에 의해 수행될 수 있다. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 공개적으로, 예를 들어, 국립 생명 공학 정보 센터 (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)를 통해 이용할 수 있다. In the context of this specification, the terms sequence identity and percent sequence identity refer to values determined by comparing two aligned sequences. Methods for aligning sequences for comparison are well known in the art. Alignment of sequences for comparison can be found in Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981) local homology algorithm, Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970) Global Sorting Algorithm, Pearson and Lipman, Proc. Nat. Acad. Sci. 85:2444 (1988) or computer implementation of these algorithms, including but not limited to CLUSTAL, GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA and TFASTA. Software for performing BLAST analyzes is publicly available, eg, through the National Center for Biotechnology Information (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/).
아미노산 서열을 비교하는 한 가지 예는 다음과 같은 기본 설정을 사용하는 BLASTP 알고리즘이다: 예상 임계값: 10; 워드 크기: 3; 쿼리 범위 내 최대 일치: 0; 매트릭스: BLOSUM62; 갭 코스트: 존재 11, 확장 1; 구성 조정: 조건부 구성 점수 매트릭스 조정. 핵산 서열의 비교를 위한 하나의 이러한 예는 기본 설정을 사용하는 BLASTN 알고리즘이다: 예상 임계값: 10; 워드 크기: 28; 쿼리 범위 내 최대 일치: 0; 일치/불일치 점수: 1.-2; 갭 코스트: 선형. 달리 언급되지 않는 한, 본원에 제공된 서열 동일성 값은 단백질 및 핵산 비교 각각에 대한 상기 확인된 기본 변수를 사용하는 BLAST 수이트 (suite) 프로그램 (Altschul 외, J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990))을 사용하여 수득된 값을 지칭한다.One example of comparing amino acid sequences is the BLASTP algorithm, which uses the following default settings: Expected Threshold: 10; word size: 3; max match in query range: 0; Matrix: BLOSUM62; Gap Coast: Existence 11,
일부 구체예에서, 혼성화 서열은 리보뉴클레오티드, 포스포티오에이트 및/또는 2'-O-메틸-변형 포스포티오에이트 리보뉴클레오티드를 포함한다.In some embodiments, the hybridization sequence comprises ribonucleotides, phosphothioates and/or 2'-O-methyl-modified phosphothioate ribonucleotides.
일부 구체예에서, 혼성화 서열은 데옥시뉴클레오티드, 포스포티오에이트 데옥시 뉴클레오티드, 포스포티오에이트 리보뉴클레오티드 및/또는 2'-O-메틸-변형 포스포티오에이트 리보뉴클레오티드를 포함한다.In some embodiments, the hybridization sequence comprises deoxynucleotides, phosphothioate deoxynucleotides, phosphothioate ribonucleotides and/or 2'-O-methyl-modified phosphothioate ribonucleotides.
단일의 분리가능한 특징들에 대한 대안이 본 명세서에서 "구체예"로 제시되는 경우, 이러한 대안은 자유롭게 조합되어 본 명세서에 개시된 본 발명의 개별 구체예를 형성할 수 있음을 이해해야 한다. Where alternatives to single separable features are presented herein as “embodiments,” it is to be understood that such alternatives may be freely combined to form individual embodiments of the invention disclosed herein.
본 발명은 하기 실시예 및 도면에 의해 추가로 예시되며, 이로부터 추가의 구체예 및 이점을 얻을 수 있다. 이들 실시예는 본 발명을 설명하기 위한 것이지 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.The invention is further illustrated by the following examples and figures, from which additional embodiments and advantages may be obtained. These examples are intended to illustrate the present invention and do not limit the scope of the present invention.
도면의 설명
도 1은 X-ase 활성의 소실이 Pros1-/-마우스를 구제한다는 것을 보여준다. A, 혈우병 상태에서 트롬빈 생성의 개략도. 주요 응고 복합체 중 하나는 고유 테나제 (X-ase) 복합체이다. X-ase는 프로테아제로서 활성화된 FIX (FIXa), 보조 인자로서 활성화된 FVIII (FVIIIa) 및 기질로서 인자 X (FX)를 포함한다. 손상 부위에서 조직 인자 (TF)의 생성 또는 노출이 외인성 경로를 통한 응고를 개시하는 주요 사건이지만, 내인성 경로 X-ase는 생체내에서 이용가능한 활성 TF의 제한된 양으로 인해 중요하며, 활성화 FX (FXa)과 복합체를 형성할 때 TFPI의 존재는 TF/활성화 인자 VII (FVIIa) 복합체를 억제한다 (도 1a). 따라서, 지속적인 트롬빈 생성은 FIX 및 FVIII의 활성화에 의존한다 (도 1a). FVIII는 FXa 및 트롬빈 모두에 의해 활성화되고, FIX는 FVIIa 및 활성화 인자 XI (FXIa) 모두에 의해 활성화되며, 이 때 후자는 트롬빈에 의해 사전에 활성화되기 때문에 이 과정이 증폭된다. 결과적으로, FVIII 및 FIX 활성화의 점진적인 증가는 FXa 및 트롬빈이 형성 될 때 발생하고, B는 Pros1을 표적화함으로써 심각한 혈우병 A 및 B에서 트롬빈 생성을 향상시키는 실험적 접근법이다. C-D, Pros1 결핍의 유무에 관계없이 혈액친화성 성체 마우스에서 DIC 혈액 변수의 평가: F8 -/- Pros1 +/+ , F8 -/- Pros1 +/- 및 F8 -/- Pros1 -/ - (C), 및 F9 -/- Pros1 +/+ , F9 -/- Pros1 +/- 및 F9 -/- Pros1 -/ - 성체 마우스 (D) (n=5/그룹)에서 PS (항원성), FVIII (응고 활성) 또는 FIX (응고 활성) 혈장 수준; 혈우병 A 그룹에서 혈소판 (n=7/그룹), 피브리노겐 (n=8/그룹), PT (n=6/그룹) 및 TAT (n=6/그룹) (c); 및 혈우병 B 그룹에서 혈소판 (n=5/그룹), 피브리노겐 (n=4/그룹), PT (n=4/그룹) 및 TAT (n=4/그룹) (D). EF, 2U/g 재조합 FVIII (Advate®주입의 단회 정맥 주사 후 24시간에 F8-/-Pros1-/- 마우스로부터의 폐의 육안 이미지 (E) 및 폐 구역에서 피브린 응혈에 대한 상응하는 현미경 평가 (F). G, F8 -/- Pros1 +/+ 및 F8 -/- Pros1 - /-에서 재조합 FVIII (Advate®투여: 0.3 U/g Advate®의 5회 iv 주사 (주사 시점: 카테터 삽입 1 시간 전 및 카테터 삽입 후 1시간, 4시간, 8시간 및 16시간) 후 24시간에 (n=3) (G, 흰색 및 검은색 컬럼) 그리고 F8 -/- Pros1 - /- 에서 단회 i.v. 주사 후 24시간에(n=3) (G, 점선 컬럼) 피브리노겐 및 TAT의 혈장 수준, 그리고 0.3 U/g의 Advate®의 반복 i.v. 주사 후 (H) 그리고 0.3 U/g Advate®i.v.의 단회 i.v. 주사 후 (i) 24시간에 F8 -/- Pros1 - /-에서 폐 및 간 구역 내 피브린 응혈을 검출할 수 있는 대표적인 면역조직화학. 모든 데이터는 평균 ± sem으로 표현됨; ns, 유의하지 않음; *, P<0.05 **; P<0.005.
도 2는 쥐과 혈전증 모델을 보여준다. A-C, F8 +/+ Pros1 +/+ , F8 -/- Pros1 +/+ , F8 -/- Pros1 + /- 및 F8 -/- Pros1 -/- 마우스에서 TF-유도 정맥 혈전색전증 (n=10/유전자형). 마취된 마우스에 다음과 같은 상이한 용량의 재조합 TF (Innovin): A에서 ½ 희석 (~4.3 nM TF) 그리고 B-C에서 ¼희석 (~2.1 nM TF)을 하대 정맥을 통해 정맥내 주사하였다. (A)에서, 한 그룹의 F8 +/+ Pros1 +/+ 마우스는 저 분자량 헤파린 (에녹사파린 60 μg/g s.c.) 주사를 제공받았다. 최소 2분 동안 지속되었던 호흡 정지 시작까지의 시간이 기록되었다. 실험은 20분에 종료되었다. 카플란-마이어 생존 곡선 (A-B). C, 호흡 정지 시작 2분 후 또는 20분 관찰 기간의 완료시, 폐를 절제하고 피브린 응혈 (불용성 피브린에 대한 면역염색, mAb 클론 102-10)을 조사하였다. D, F8 +/+ Pros1 +/+ , F8 -/- Pros1 +/+ 및 F8 -/- Pros1 -/- 마우스에서 생체 현미경에 의해 기록된 FeCl3-손상 장간막 동맥에서의 혈전 형성, 대표적 실험 (n=3/유전자형). D, F8 +/+ Pros1 +/+ , F8 -/- Pros1 +/+ 및 F8 -/- Pros1 -/- 마우스에서 생체 현미경에 의해 기록된 FeCl3-손상 장간막 동맥에서의 혈전 형성, 대표적 실험 (n=3/유전자형).
도 3은 꼬리 출혈 모델을 보여준다. 새로운 식염수 튜브에서 30분 (A) 및 10분 (B) 동안 2mm (A) 및 4mm (B) 꼬리 절개 후 혈액을 수집하였다; 이어서 총 혈액 손실 (μl)을 측정하였다. F8 +/- Pros1 +/+ 및 F8 +/+ Pros1 +/+ 마우스 (흰색 컬럼)가 대조군으로 사용되었다 (A의 모든 그룹에 대해 n=5, B의 모든 그룹에 대해 n=6). C, 항-인간 PS 항체는 4 mm 절개 후 꼬리 출혈을 변경시켰다.
도 4는 급성 간경변증 모델을 보여준다. A, F8 -/- Pros1 +/+ , F8 -/- Pros1 +/- , F8 -/- Pros1 -/- 및 F8 +/+ Pros1 +/+ 마우스에서 부상 72h 후 및 부상 전 사이의 무릎 직경 차이. B, F8 +/+ Pros1 +/+ , F8 -/- Pros1 +/+ 및 F8 -/- Pros1 -/- 마우스에서 72h 후 대표적인 부상입지 않은 및 부상입은 다리들의 무릎 관절내 공간에 대한 현미경 평가 (불용성 피브린에 대한 메이슨의 트라이크롬 염색 및 면역염색). C, 특이적 siRNA를 사용한 생체내 mPS 침묵: mPS siRNA 또는 대조 siRNA의 단일 ip 주입으로 처리된 F8 -/- Pros1 +/- 및 F8 -/- Pros1 +/+ 마우스에서 손상 72h 후의 관절 직경 평가. D, mPS siRNA 또는 대조 siRNA로 사전에 처리된 F8 -/- Pros1 +/+ 마우스에서 72h 후 대표적인 부상입은 다리의 무릎 관절내 공간의 현미경 평가 (Masson의 트라이크롬 염색법). 측정값들은 평균±s.e.m으로 제시된다. *, P<0.05; **, P<0.005; ***, P<0.0005; ****, P<0.0001.
도 5는 PS 및 TFPI 모두가 쥐과 활액에서 발현됨을 보여준다. A, 대조-siRNA 또는 mPS-siRNA로 사전에 처리된 F8 -/- Pros1 +/+ 마우스로부터의 부상 무릎의 무릎 관절내 공간에서 PS 및 TFPI에 대한 면역염색법. 화살표 머리는 활액 조직을, 화살은 혈관 구조를 가리키며, 이들 모두 PS 및 TFPI 모두에 대하여 양성이다. 상부 도면내 상자들 (스케일바: 200 μm)은 하부 패널에서 확대된 영역을 보여준다 (스케일바: 50 μm). B, F8 -/- Pros1 +/+ 및 F8 -/- Pros1 -/- 마우스의 부상없는 무릎의 무릎 관절내 공간에서 TFPI에 대한 면역염색법. C-E, 항-PS (c) 및 항-TFPI (d) 항체를 사용하여 일차 쥐과 섬유모세포-유사 활액 세포 (FLS) 배양물로부터의 조건화 배지의 웨스턴 블롯 분석. 무-혈소판 혈장 (PFP), 혈소판의 단백질 용해물 (PLT), 쥐과 PS (mPS)는 양성 대조(c)로 사용되었다. 탈당화된 TFPI 및 완전 당화된 TFPI의 분자량을 비교하여 결정된 TFPI 아이소형 발현. 쥐과 태반을 TFPIα에 대한 양성 대조로 사용하였다. E-F, 항-PS (f) 및 항-TFPI (e) 항체를 사용하여 트롬빈 (Thr, +) 또는 비히클 (-)의 존재하에 24시간 배양 후 FLS로부터 단리된 총 단백질 용해물의 웨스턴 블롯 분석. 인간 재조합 전장 TFPI를 TFPIα에 대한 양성 대조로 사용하였다 (hrTFPI). 블롯들은 3회 독립 실험들을 대표한다.
도 6은 인간 활액에서 PS 및 TFPI를 나타낸다. A, PS 및 TFPI는 HA (대증요법 및 예방요법), 대증요법 HB 또는 골관절염 (OA) 환자의 활액 조직에서 발현된다. 화살표머리는 활액 내막층을 및 화살은 내막하층의 혈관 구조를 가리키며, 이들 모두 PS 및 TFPI 모두에 대해 양성이다. 스케일바: 50 μm. B, 항-TFPI 항체를 사용한 탈당화 전후의 건강한 개체 및 OA 환자로부터의 일차 인간 FLS (hFLS) 배양물의 조건화 배지의 웨스턴 블롯 분석. 인간 혈소판 용해물 (hPLT)을 TFPIα에 대한 양성 대조로 사용하였다. 블롯들은 3회 독립 실험들을 대표한다.
도 7은 혈우병 A에서 트롬빈 생성 및 피브린 망을 보여주며, TF-(1 pM)는 TFPI-의존적 PS 활성을 나타내는 F8 -/- Pros1 +/+ 및 F8 -/- Pros1 -/- 마우스로부터의 PRP에서 트롬빈 생성을 유도하였다. B, F8 -/- Pros1 +/+ 및 F8 -/- Pros1 -/- 마우스로부터의 PRP 및 PFP에서 APC-의존적 PS 활성. C, F8 +/+ Pros1 +/+ , F8 -/- Pros1 +/+ 및 F8 -/- Pros1 -/- 로부터의, 그리고 F9 +/+ Pros1 +/+ , F9 -/- Pros1 +/+ 및 F9 -/- Pros1 -/- 피브린 구조로부터의 대표적인 주사 전자 현미경 이미지. D-G, 트롬빈 생성은 중증 HA 환자 (FVIII <1 %)의 PFP (D-E) 및 PRP (F-G)에서 높은 역가의 억제제 없이 (D, F) 그리고 억제제와 함께 (E, G) 낮은 TF 농도 (1 pM)에 의해 유발되었다. 측정값들은 평균±s.e.m으로 제시된다. **, P<0.005; ***, P<0.0005.
도 8은 유전자형 분석 접근법을 보여준다. F8 -/- Pros1 +/- (a-c) 및 F9 -/- Pros1 +/- (d-f) 마우스를 교배하여 얻은 유전자형. a, Pros1 대립유전자는 다중 PCR에 의해 증폭되었다. 이어서 PCR 생성물들을 전기영동하였으며; Saller, 2009에 따르면, wt 밴드는 널 (null) 밴드 (571 bp)에 비해 더 낮은 분자량 (234 bp)을 가졌다. b, 게놈 DNA로부터 F8 대립유전자의 wt 밴드 (620 bp) 및 널 밴드 (420 bp)를 증폭시키기 위한 다중 PCR의 셋업. c, (a)에서와 동일한 샘플에 대한 F8 대립유전자 증폭 (널 밴드: 420 bp)의 PCR 생성물. d, Pros1 대립유전자들은 다중 PCR에 의해 증폭되었다. 이어서 PCR 생성물들을 전기영동하였으며; Saller, 2009에 따르면, wt 밴드는 널 (null) 밴드 (571 bp)에 비해 더 낮은 분자량 (234 bp)을 가졌다. e, 게놈 DNA로부터 F9 대립유전자의 wt 밴드 (320 bp) 및 널 밴드 (550 bp)를 증폭시키기 위한 다중 PCR의 셋업. f, (d)에서와 동일한 샘플에 대한 F9 대립유전자 증폭 (널 밴드: 550 bp)의 PCR 생성물.
도 9는 생리학적 상태에서의 조직학을 보여준다. F8 -/- Pros1 -/- 및 F8 -/- Pros1 +/+ 마우스에서 그리고 F9 -/- Pros1 +/+ 및 F9 -/- Pros1 -/- 에서 간, 폐, 신장, 뇌 구역들에 대한 불용성 피브린에 대한 면역염색법. 스케일바: 100 μm.
도 10은 Pros1의 유전자 손실이 혈우병 B 마우스에서 혈종을 예방함을 보여준다. A, F9 -/- Pros1 +/+ , F9 -/- Pros1 +/- , F9 -/- Pros1 -/- 및 F9 +/+ Pros1 +/+ 마우스에서 부상 72h 후 및 부상 전 무릎 직경간의 차이. B, F9 +/+ Pros1 +/+ , F9 -/- Pros1 +/+ 및 F9 -/- Pros1 -/- 마우스에서 72h 후 대표적인 부상없는 및 부상입은 다리들의 무릎 관절내 공간에 대한 현미경 평가 (불용성 피브린, mAb 클론 102-10에 대한 메이슨의 트라이크롬 염색 및 염색법). 스케일바: 500 μm. 측정값들은 평균±s.e.m으로 제시된다. ***, P<0.0005.
도 11은 피브린 망 밀도 및 섬유 분지형성의 정량을 보여준다. a-b, F8 +/+ Pros1 +/+ , F8 -/- Pros1 +/+ 및 F8 -/- Pros1 -/- 마우스의 피브린 망. c-d, F9 +/+ Pros1 +/+ , F9 -/- Pros1 +/+ 및 F9 -/- Pros1 -/- 의 피브린 망. 피브린 망 밀도의 정량 (a 및 c). 섬유 분지형성의 정량 (b 및 d). 측정값들은 평균±s.e.m으로 제시된다. ***, P<0.0005. Description of the drawing
1 shows that loss of X-ase activity rescues Pros1−/− mice. A, Schematic diagram of thrombin generation in hemophilic condition. One of the major coagulation complexes is the intrinsic tenase (X-ase) complex. X-ases include activated FIX (FIXa) as a protease, activated FVIII (FVIIIa) as a cofactor and factor X (FX) as a substrate. Although the production or exposure of tissue factor (TF) at the site of injury is the key event initiating coagulation via the extrinsic pathway, the endogenous pathway X-ase is important due to the limited amount of active TF available in vivo and activates FX (FXa). ), the presence of TFPI inhibits the TF/activator VII (FVIIa) complex (Fig. 1a). Thus, sustained thrombin generation is dependent on the activation of FIX and FVIII (Figure 1a). FVIII is activated by both FXa and thrombin, and FIX is activated by both FVIIa and activator XI (FXIa), a process amplified since the latter was previously activated by thrombin. Consequently, progressive increases in FVIII and FIX activation occur when FXa and thrombin are formed, and targeting Pros1 is an experimental approach to enhance thrombin generation in severe hemophilia A and B. Assessment of DIC blood parameters in hemophilic adult mice with or without CD, Pros1 deficiency: F8 -/- Pros1 +/+ , F8 -/- Pros1 +/- and F8 -/- Pros1 -/ - (C) , and F9 -/- Pros1 +/+ , F9 -/- Pros1 +/- and F9 -/- Pros1 -/ - PS (antigenicity), FVIII (coagulability) in adult mice (D) ( n =5/group) activity) or FIX (coagulation activity) plasma levels; Platelet ( n =7/group), fibrinogen ( n =8/group), PT ( n =6/group) and TAT ( n =6/group) in hemophilia A group (c); and platelets ( n =5/group), fibrinogen ( n =4/group), PT ( n =4/group) and TAT ( n =4/group) in hemophilia B group (D). EF, macroscopic images of lungs from F8-/-Pros1-/- mice 24 hours after a single intravenous injection of 2U/g recombinant FVIII (Advate® infusion (E) and corresponding microscopic evaluation for fibrin clots in lung areas ( F).G, F8 -/- Pros1 +/+ and F8 -/- Pros1 - /- recombinant FVIII (Advate® Administration: 5 iv injections of 0.3 U/g Advate® (Time of injection: 1 hour before catheterization and 1 hour, 4 hours, 8 hours and 1 hour after catheterization) 16 hours) (n=3) (G, white and black columns) and 24 hours ( n =3) after a single iv injection at F8 -/- Pros1 - /- (G, dotted column) fibrinogen and plasma levels of TAT, and after repeated iv injections of 0.3 U/g Advate® (H) and after single iv injections of 0.3 U/g Advate®iv (i) in F8 -/- Pros1 - /- at 24 hours Representative immunohistochemistry capable of detecting fibrin clots in lung and liver areas.All data are expressed as mean ± sem; ns, not significant; *, P <0.05 **; P <0.005.
Figure 2 shows a murine thrombosis model. TF-induced venous thromboembolism in AC, F8 +/+ Pros1 +/+ , F8 -/- Pros1 +/+ , F8 -/ - Pros1 +/- and F8 -/- Pros1 -/- mice ( n = 10/ genotype). Anesthetized mice were intravenously injected via the inferior vena cava with different doses of recombinant TF (Innovin): ½ dilution in A (˜4.3 nM TF) and ¼ dilution in BC (˜2.1 nM TF). In (A), a group of F8 +/+ Pros1 +/+ mice received an injection of low molecular weight heparin (
Figure 3 shows a tail bleeding model. Blood was collected after 2 mm (A) and 4 mm (B) tail incisions for 30 min (A) and 10 min (B) in fresh saline tubes; Total blood loss (μl) was then determined. F8 +/- Pros1 +/+ and F8 +/+ Pros1 +/+ mice (white columns) served as controls (n=5 for all groups in A, n=6 for all groups in B). C, Anti-human PS antibody altered tail hemorrhage after 4 mm incision.
4 shows an acute cirrhosis model. A, Knee diameter difference between 72 h post-injury and pre-injury in F8 -/- Pros1 +/+ , F8 -/ - Pros1 +/- , F8 -/- Pros1 -/- and F8 +/+ Pros1 +/+ mice . B, Microscopic evaluation of the intra-articular space of the knee of representative uninjured and injured limbs after 72 h in F8 +/+ Pros1 +/ + , F8 - / - Pros1 +/+ and F8 -/- Pros1 -/- mice ( Mason's trichrome staining and immunostaining for insoluble fibrin). C, mPS silencing in vivo using specific siRNA: evaluation of joint diameter 72 h post injury in F8 -/- Pros1 +/- and F8 -/- Pros1 +/+ mice treated with a single ip injection of mPS siRNA or control siRNA. D, Microscopic evaluation of the intra-articular space of the knee of a representative injured leg after 72 h in F8 −/− Pros1 +/+ mice pre-treated with mPS siRNA or control siRNA (Masson's trichrome staining). Measurements are presented as mean±sem. *, P <0.05; **, P <0.005; ***, P <0.0005; ****, P <0.0001.
5 shows that both PS and TFPI are expressed in murine synovial fluid. A, Immunostaining for PS and TFPI in the intra-articular space of injured knees from F8 −/− Pros1 +/+ mice pretreated with control-siRNA or mPS-siRNA. Arrow heads point to synovial tissue and arrows to vasculature, all of which are positive for both PS and TFPI. Boxes in the upper figure (scale bar: 200 μm) show enlarged regions in the lower panel (scale bar: 50 μm). B, Immunostaining for TFPI in the intra-articular space of the uninjured knee of F8 -/- Pros1 +/+ and F8 - /- Pros1 -/- mice. Western blot analysis of conditioned media from primary murine fibroblast-like synovial cell (FLS) cultures using CE, anti-PS (c) and anti-TFPI (d) antibodies. Platelet-free plasma (PFP), protein lysate of platelets (PLT), and murine PS (mPS) were used as positive controls (c). TFPI isoform expression determined by comparing the molecular weight of deglycosylated and fully glycosylated TFPI. Murine placenta was used as a positive control for TFPIα. Western blot analysis of total protein lysates isolated from FLS after 24 hour incubation in the presence of thrombin (Thr, +) or vehicle (-) using EF, anti-PS (f) and anti-TFPI (e) antibodies. Human recombinant full-length TFPI was used as a positive control for TFPIα (hrTFPI). Blots are representative of 3 independent experiments.
6 shows PS and TFPI in human synovial fluid. A, PS and TFPI are expressed in synovial tissues of patients with HA (symptomatic and prophylactic), symptomatic HB or osteoarthritis (OA). Arrowheads point to synovial intimal layer and arrows to subintimal vascular structures, both of which are positive for both PS and TFPI. Scale bar: 50 μm. B, Western blot analysis of conditioned media of primary human FLS (hFLS) cultures from healthy individuals and OA patients before and after deglycosylation with anti-TFPI antibody. Human platelet lysate (hPLT) was used as a positive control for TFPIα. Blots are representative of 3 independent experiments.
Figure 7 shows thrombin generation and fibrin network in hemophilia A, TF-(1 pM) PRP from F8 -/- Pros1 +/+ and F8 -/- Pros1 -/- mice showing TFPI-dependent PS activity. induced thrombin generation. B, APC-dependent PS activity in PRP and PFP from F8 -/ - Pros1 +/+ and F8 -/- Pros1 -/- mice. From C, F8 +/+ Pros1 +/+ , F8 -/- Pros1 +/+ and F8 -/- Pros1 -/- , and from F9 +/+ Pros1 +/+ , F9 -/- Pros1 +/+ and F9 -/- Pros1 -/- Representative scanning electron microscopy images from fibrin structures. DG, thrombin generation in patients with severe HA (FVIII <1%) in PFP (DE) and PRP (FG) without (D, F) and with (E, G) high titer inhibitors at low TF concentrations (1 pM). ) was triggered by Measurements are presented as mean±sem. **, P <0.005; ***, P <0.0005.
8 shows the genotyping approach. Genotypes obtained by mating F8 -/- Pros1 +/- (ac) and F9 -/- Pros1 +/- (df) mice. a, The Pros1 allele was amplified by multiplex PCR. PCR products were then subjected to electrophoresis; According to Saller, 2009, the wt band had a lower molecular weight (234 bp) compared to the null band (571 bp). b, Setup of multiplex PCR to amplify the wt band (620 bp) and null band (420 bp) of the F8 allele from genomic DNA. c, PCR product of F8 allele amplification ( null band: 420 bp) for the same sample as in (a). d, Pros1 alleles were amplified by multiplex PCR. PCR products were then subjected to electrophoresis; According to Saller, 2009, the wt band had a lower molecular weight (234 bp) compared to the null band (571 bp). e, Setup of multiplex PCR to amplify the wt band (320 bp) and null band (550 bp) of the F9 allele from genomic DNA. f, PCR product of F9 allele amplification ( null band: 550 bp) for the same sample as in (d).
9 shows histology in physiological condition. Insoluble in liver, lung, kidney, brain regions in F8 -/- Pros1 -/- and F8 - /- Pros1 +/ + mice and in F9 -/- Pros1 +/+ and F9 -/- Pros1 -/- Immunostaining method for fibrin. Scale bar: 100 μm.
10 shows that genetic loss of Pros1 prevents hematomas in hemophilia B mice. A, Difference between knee diameters 72 h post and pre-injury in F9 -/- Pros1 +/+ , F9 - /- Pros1 +/- , F9 -/- Pros1 -/- and F9 +/+ Pros1 +/+ mice. B, Microscopic evaluation of the intra-articular space of the knee of representative uninjured and injured limbs after 72 h in F9 +/+ Pros1 + / + , F9 -/ - Pros1 +/+ and F9 -/- Pros1 -/- mice (insoluble Mason's trichrome staining and staining for fibrin, mAb clone 102-10). Scale bar: 500 μm. Measurements are presented as mean±sem. ***, P <0.0005.
11 shows the quantification of fibrin network density and fiber branching. ab, Fibrin networks of F8 +/+ Pros1 +/+ , F8 -/- Pros1 +/+ and F8 -/- Pros1 -/- mice. cd, Fibrin networks of F9 +/+ Pros1 +/+ , F9 -/- Pros1 +/+ and F9 -/- Pros1 -/- . Quantification of fibrin net density (a and c). Quantification of fiber branching (b and d). Measurements are presented as mean±sem. ***, P <0.0005.
실시예Example
실시예 1: X-ase 활성의 소실은 Example 1: Loss of X-ase activity Pros1Pros1 -/--/- 마우스를 구제한다save the mouse
F8 -/- 수컷과 교배한 Pros1 +/- 암컷은 25% F8 +/- Pros1 +/- 자손을 생산하였다. F8 -/- 수컷과 함께 번식한 F8 +/- Pros1 +/- 암컷은 25% F8 -/- Pros1 +/- 자손을 가져왔다 (도 8A-C). F9 -/- Pros1 +/- 마우스에서도 유사한 관찰이 이루어졌다 (도 8D-F). 예상한 바와 같이, F8 -/- Pros1 -/- 및 F9 -/- Pros1 -/- 마우스는 각각 FVIII 및 FIX 혈장 활성을 나타내지 않았으며, PS는 F8 -/- Pros1 -/- 및 F9 -/- Pros1 -/- 마우스 혈장에서 검출되지 않았다 (도 1C-D). 보고된 바와 같이, F8 -/- Pros1 +/- 및 F9 -/- Pros1 +/- 에서의 PS 수준은 F8 -/- Pros1 +/+ 및 F9 -/- Pros1 +/+ 마우스에서보다 ~ 50-60 % 낮았다 (그림 1C-D). Pros1 +/- females mated with F8 -/- males produced 25% F8 +/- Pros1 +/- offspring. F8 +/- Pros1 +/- females bred with F8 - /- males produced 25% F8 -/- Pros1 +/- offspring (FIGS. 8A-C). Similar observations were made in F9 -/- Pros1 +/- mice (Fig. 8D-F). As expected, F8 -/- Pros1 -/- and F9 -/- Pros1 -/- mice did not show FVIII and FIX plasma activity, respectively, and PS did not show F8 -/- Pros1 -/- and F9 -/- It was not detected in the plasma of Pros1 -/- mice (Fig. 1C-D). As reported , PS levels in F8 - /- Pros1 +/- and F9 - /- Pros1 +/- were ~ 50- 60% lower (Fig. 1C–D).
F8 -/- Pros1 +/- 번식 쌍으로부터의 295마리 새끼들 중, 72마리 (24%)는 F8 -/- Pros1 +/+ 이었고, 164마리 (56%)는 F8 -/- Pros1 +/- 이었으며 59마리 (20%)는 F8 -/- Pros1 -/- 이었다 (χ2=4.8, P=0.09). 그러므로, F8 -/- Pros1 -/- 마우스들은 예상된 멘델 비율로 존재하였다. 대조적으로, F9 -/- Pros1 +/- 번식 쌍으로부터의 219마리 새끼들 중, 56마리 (26%)는 F9 -/- Pros1 +/+ 이었고, 132마리 (60%)는 F9 -/- Pros1 +/- 이었으며 31마리 (14%)는 F9 -/- Pros1 -/- 이었다 (χ2=14.95, P=0.001). 이는 F9 -/- Pros1 -/- 마우스에 대한 전달 비율 변형 (transmission ratio distortion)과 양립가능하며 F9 +/+ Pros1 +/+ 마우스로부터의 교배와 비교시 감소된 한배새끼 크기와 합치한다 (5.2±0.7 대 9.8±1.8, n=4 교배/3t 세대에 걸침, P=0.046). Of the 295 pups from the F8 -/- Pros1 +/- breeding pair, 72 (24%) were F8 -/- Pros1 +/+ and 164 (56%) were F8 -/- Pros1 +/- and 59 animals (20%) were F8 -/- Pros1 -/- (χ 2 =4.8, P =0.09). Therefore, F8 -/- Pros1 -/- mice were present at the expected Mendelian ratio. In contrast, of 219 pups from the F9 -/- Pros1 +/- breeding pair, 56 (26%) were F9 -/- Pros1 +/+ and 132 (60%) were F9 -/- Pros1 +/- and 31 (14%) were F9 -/- Pros1 -/- (χ 2 =14.95, P =0.001). This is compatible with transmission ratio distortion for F9 -/- Pros1 -/- mice and consistent with reduced litter size compared to crosses from F9 +/+ Pros1 +/+ mice (5.2± 0.7 vs. 9.8±1.8, n = 4 matings/over 3 t generations, P = 0.046).
F8 -/- Pros1 -/- 및 F9 -/- Pros1 -/- 마우스는 완전히 정상인 것으로 나타났다. 이들의 생존력은 각각 최대 20 (n=4) 및 16 개월 (n=2)로 모니터되었으며, F8 -/- Pros1 +/+ 및 F9 -/- Pros1 +/+ 마우스 각각과 비교하여 차이를 나타내지 않았다. F8 -/- Pros1 -/- and F9 -/- Pros1 -/- mice appeared completely normal. Their viability was monitored up to 20 (n=4) and 16 months (n=2), respectively, and showed no difference compared to F8 -/- Pros1 +/+ and F9 -/- Pros1 +/+ mice, respectively. .
마우스에서 완전한 Pros1 결핍은 소모성 응고병증15으로 이어지므로, 우리는 F8 -/- Pros1 -/- 및 F9 -/- Pros1 -/- 마우스가 DIC를 발병하였는지 여부를 평가하였다. DIC 변수들은 F8 -/- Pros1 +/+ , F8 -/- Pros1 +/- 및 F8 -/- Pros1 -/- 마우스에서 (도 1C), 그리고 F9 -/- Pros1 +/+ , F9 -/- Pros1 +/- 및 F9 -/- Pros1 -/- 마우스에서 (도 1D) 비등하였다. 활성화된 부분 트롬보플라스틴 시간은 FVIII의 부재로 인해 F8 -/- Pros1 +/+ (69±2 초), F8 -/- Pros1 +/- (68±3 초) 및 F8 -/- Pros1 -/- (63±3 초) 마우스에서 동일하게 연장되었다 (평균±s.e.m., 그룹 당 n=6, P=0.3). F9 -/- Pros1 +/+ , F9 -/- Pros1 +/- 및 F9 -/- Pros1 -/- 마우스를 이용하여 비등한 데이터를 수득하였다. 더욱이, F8 -/- Pros1 -/- 및 F9 -/- Pros1 -/- 마우스의 뇌, 폐, 간 및 신장에서 혈전증 또는 피브린 침착이 발견되지 않았다 (도 9). Since complete Pros1 deficiency in mice leads to coagulopathy of wasting 15 , we evaluated whether F8 -/- Pros1 -/- and F9 -/- Pros1 -/- mice developed DIC. DIC variables were found in F8 -/- Pros1 +/+ , F8 -/- Pros1 +/- and F8 -/- Pros1 -/- mice (Fig. 1C), and in F9 -/- Pros1 +/+ , F9 -/- Boiled in Pros1 +/- and F9 -/- Pros1 -/- mice (FIG. 1D). The activated fractional thromboplastin times are F8 -/- Pros1 +/+ (69±2 sec), F8 -/- Pros1 +/- (68±3 sec) and F8 -/- Pros1 - due to the absence of FVIII. /− (63±3 s) were equally prolonged in mice (mean±sem, n =6 per group, P =0.3). Boiling data were obtained using F9 -/- Pros1 +/+ , F9 -/- Pros1 +/- and F9 -/- Pros1 -/- mice. Moreover, no thrombosis or fibrin deposition was found in the brain, lung, liver and kidney of F8 -/- Pros1 -/- and F9 - /- Pros1 -/- mice (FIG. 9).
따라서, X-ase 활성의 손실은 완전한 Pros1 결핍의 배아 치사를 구제한다. 그러나 구제는 FIX 활성 손실로 인해 부분적이었다. 가능한 설명은 중증 HB가 중증 HA에 비해 덜 심각한 병태인 것으로 보인다는 것이다. 결과적으로, Pros1 -/- 마우스에서 F9 붕괴는 F8 붕괴보다 응고 재조정면에서 덜 효율적이었다.Thus, loss of X-ase activity rescues embryonic lethality of complete Pros1 deficiency. However, rescue was partial due to loss of FIX activity. A possible explanation is that severe HB appears to be a less severe condition than severe HA. Consequently, F9 disruption in Pros1 −/− mice was less efficient in coagulation readjustment than F8 disruption.
FVIII 주입에 의한 고유의 X-ase 활성을 회복시키는 것이 F8 -/- Pros1 -/- 마우스에서 DIC, 혈전증 및 전격자색반병을 유도하는지 여부를 조사하기 위하여, 재조합 FVIII (rFVIII)을 정맥내 투여하였다. rFVIII 주사 후 마우스가 사망하지 않았다. 과량의 rFVIII의 단회 주사 24h 후 F8 -/- Pros1 -/- 마우스에서 수많은 혈관내 혈전 및 폐에서의 출혈이 발견되었다 (도 1E-F). 정상 용량의 rFVIII 반복 투여 후 24시간에, 응고 분석은 응고불가능한 프로트롬빈 시간 (PT) (도시되지 않음), 낮은 피브리노겐 및 높은 트롬빈-안티 트롬빈 (TAT) 수준을 나타내었고, 이는 명백한 DIC와 합치한다 (도 1G). 대조적으로, F8 -/- Pros1 -/- 마우스에서 정상 용량의 rFVIII의 단회 주사 후, 피브리노겐 및 TAT 수준은 비처리 F8 -/- Pros1 -/- 마우스과 비등하였다 (도 1G). 폐와 간에서 수많은 혈전이 보였지만 (도 1H-I), 이들 마우스 중 어느 것도 전격자색반병이 발병하지 않았다.To investigate whether restoring native X-ase activity by FVIII infusion induces DIC, thrombosis and fulminant purpura in F8 -/- Pros1 -/- mice, recombinant FVIII (rFVIII) was administered intravenously. . No mice died after rFVIII injection. Numerous intravascular clots and hemorrhages in the lungs were found in F8 -/- Pros1 -/- mice 24 h after a single injection of excess rFVIII (FIG. 1E-F). Twenty-four hours after repeated administration of normal doses of rFVIII, coagulation assays showed non-coagulable prothrombin time (PT) (not shown), low fibrinogen, and high thrombin-antithrombin (TAT) levels, consistent with apparent DIC ( Figure 1G). In contrast, F8 -/- Pros1 -/- After a single injection of normal doses of rFVIII in mice, fibrinogen and TAT levels decreased in untreated F8 -/- Pros1 -/- Boiled with mice (Fig. 1G). Although numerous blood clots were seen in the lungs and liver (Fig. 1H-I), none of these mice developed purpura fulminosis.
실시예 2: X-ase 활성의 손실은 Example 2: Loss of X-ase activity Pros1Pros1 -/--/- 마우스에서 TF-유도된 혈전색전증에 의한 치사를 예방하지 못한다 Does not prevent death by TF-induced thromboembolism in mice
우리는 이전에, Pros1 +/+ 마우스의 88%가 TF-유도된 혈전색전증 모델에 대해 생존하였지만, 낮은 TF 용량 주사 (~ 1.1 nM) 20분 후에 Pros1 +/- 마우스의 25%만이 여전히 살아있었음을 입증하였다. 더 높은 TF 용량 (~ 4.3 nM)을 사용하는 경우, Pros1 +/+ 및 Pros1 +/- 마우스 모두 20분 이내에 사망하였다. 그러나 Pros1 +/- 는 Pros1 +/+ 보다 일찍 사망했다. HA 및 WT 마우스는 이러한 높은 TF-용량에 동일하게 민감하였으며, 이들 중 85% 이상이 15분 이내에 사망하였다 (도 2A). 대조적으로, 저 분자량 헤파린 (LMWH)을 갖는 혈전예방전략하에서 >75% WT 마우스가 생존하였다 (도 2A). 따라서, LMWH와 달리, HA는 TF-유도된 혈전색전증으로부터 마우스를 보호하지 못한다. 이어서 동일한 모델에서 F8 -/- Pros1 +/+ , F8 -/- Pros1 +/- 및 F8 -/- Pros1 -/- 마우스를 조사하였다. TF (~2.1 nM)의 주입 후, 마우스의 40-60%가 그들의 Pros1 유전자형과 무관하게 사망 하였다 (P> 0.05) (도 2B). 그러나, F8 -/- Pros1 -/- 및 F8 -/- Pros1 +/- 가 F8 -/- Pros1 +/+ 마우스보다 일찍 사망하였고, 그리고 F8 -/- Pros1 +/- 가 F8 -/- Pros1 +/+ 마우스보다 일찍 사망하는 경향이 존재하였다 (평균 사망 시간: F8 -/- Pros1 +/+ 는 12±4 분, F8 -/- Pros1 +/- 는 7±2 분, F8 -/- Pros1 -/- 마우스는 8±3 분, n=4-6/그룹, P=0.43). F9 -/- Pros1 +/+ , F9 -/- Pros1 +/- 및 F9 -/- Pros1 -/- 마우스에 대해 유사한 데이터를 수득하였다 (데이터 제시되지 않음).We previously found that 88% of Pros1 +/+ mice survived a TF-induced thromboembolism model, but only 25% of Pros1 +/- mice were still alive 20 min after injection of a low TF dose (~1.1 nM) proved. When using higher TF doses (~4.3 nM), both Pros1 +/+ and Pros1 +/- mice died within 20 minutes. However, Pros1 +/− died earlier than Pros1 +/+ . HA and WT mice were equally sensitive to this high TF-dose, and more than 85% of them died within 15 minutes (FIG. 2A). In contrast, >75% WT mice survived under the prothrombotic strategy with low molecular weight heparin (LMWH) (Fig. 2A). Thus, unlike LMWH, HA does not protect mice from TF-induced thromboembolism. Then on the same model F8 -/- Pros1 +/+ , F8 -/- Pros1 +/- and F8 -/- Pros1 -/- mice were investigated. After injection of TF (~2.1 nM), 40–60% of mice died (P > 0.05) regardless of their Pros1 genotype (Fig. 2B). However, F8 -/- Pros1 -/- and F8 -/- Pros1 +/- died earlier than F8 -/- Pros1 +/+ mice, and F8 -/- Pros1 +/- mice died earlier than F8 -/- Pros1 + There was a tendency to die earlier than /+ mice (average time to death: F8 -/- Pros1 +/+ 12±4 min , 7±2 min for F8 -/- Pros1 +/- and 8±3 min for F8 -/- Pros1 -/- mice, n= 4-6/group, P = 0.43). F9 -/- Pros1 +/+ , F9 -/- Pros1 +/- and F9 -/- Pros1 -/- mice (data not shown).
TF-유도 혈전색전증 시험감염동안 사망한 F8 -/- Pros1 +/+ 및 F8 -/- Pros1 -/- 마우스의 폐 동맥에서 피브린 응혈이 검출되었다 (도 2C). 중요하게도, F8 -/- Pros1 +/+ 마우스보다 F8 -/- Pros1 -/- 의 폐에 더 많은 혈전이 있었다 (각각 n = 48 대 26). 또한, F8 -/- Pros1 -/- 폐의 대부분의 동맥은 완전히 폐색된 반면, F8 -/- Pros1 +/+ 폐에서는 부분적으로만 폐색되었다.Fibrin clots were detected in the pulmonary arteries of F8 -/- Pros1 +/+ and F8 -/- Pros1 -/- mice that died during TF-induced thromboembolism challenge (FIG. 2C). Importantly, there were more blood clots in the lungs of F8 −/− Pros1 − /− than F8 −/− Pros1 +/+ mice (n = 48 versus 26, respectively). In addition, most arteries in the F8 −/− Pros1 −/− lung were completely occluded, whereas in the F8 −/− Pros1 +/+ lung only partially occluded.
TF-유도된 혈전색전증-시험감염 중에 사망한 F8 -/- Pros1 -/- 마우스 어느 것도 전격자색반병이 발병하지 않았다. F9 -/- Pros1 +/+ , F9 -/- Pros1 +/- 및 F9 -/- Pros1 -/- 마우스에 대해 유사한 데이터를 수득하였다 (제시되지 않음).None of the F8 -/- Pros1 -/- mice that died during TF-induced thromboembolism-challenge developed fulminant purpura. F9 -/- Pros1 +/+ , F9 -/- Pros1 +/- and F9 -/- Pros1 -/- mice (not shown).
실시예 3: FVIII의 손실은 장간막 세동맥에서 혈전증으로부터 Example 3: Loss of FVIII from thrombosis in mesenteric arterioles Pros1Pros1 -/- -/- 마우스를 부분적으로 보호한다partially protects the mouse
이어서 고유 응고 경로에서의 결합에 민감한 모델인 장간막 세동맥에서의 혈전 형성을 기록하였다. F8 +/+ Pros1 +/+ 마우스에서, 혈전은 20분 안에 폐색 크기로 성장하였고, 모든 손상된 동맥은 폐색되었다 (도 2D). 예상한 바와 같이, F8 -/- Pros1 +/+ 의 세동맥은 혈전증을 보이지 않았던 반면, F8 -/- Pros1 -/- 마우스는 부분 혈전을 보였다 (도 2D).Thrombus formation in mesenteric arterioles, a model sensitive to binding in the intrinsic coagulation pathway, was then recorded. In F8 +/+ Pros1 +/+ mice, thrombi grew to occluded size within 20 minutes, and all injured arteries were occluded (Fig. 2D). As expected, arterioles of F8 −/− Pros1 +/+ did not show thrombosis, whereas F8 −/− Pros1 −/− mice showed partial thrombosis ( FIG. 2D ).
F8 +/+ Pros1 +/+ 마우스에서는 혈전 형성 동안 색전이 생성되었지만 F8 -/- Pros1 +/+ 마우스에서는 생성되지 않았다. F8 -/- Pros1 -/- 마우스에서, 부분 혈전 성장 동안 다수의 마이크로-색전이 분리되어 폐색성 혈전 형성을 방지하였다.Emboluses were formed during clot formation in F8 +/+ Pros1 +/+ mice but not in F8 -/- Pros1 +/+ mice. In F8 -/- Pros1 -/- mice, multiple micro-emboli were isolated during partial thrombus growth to prevent occlusive thrombus formation.
실시예 4: HA가 있는 마우스에서 Example 4: in mice with HA Pros1 Pros1 표적화는 한정되지만 꼬리 출혈은 없어지지 않는다 Targeting is limited, but tail hemorrhage is not eliminated
출혈 표현형은 경증 또는 중증 출혈 모델을 사용하여 꼬리 절개에 의해 평가되었다. Bleeding phenotype was assessed by tail incision using mild or severe bleeding models.
두 모델 모두에서, F8 -/- Pros1 +/+ 마우스와 비교하여 F8 -/- Pros1 -/- 에서 혈액 손실이 감소되었다 (도 3A-B). 경증 모델에 의해 시험감염 되었을 때, F8 -/- Pros1 +/- 마우스는 F8 -/- Pros1 +/+ 마우스 보다 출혈이 더 적었다 (도 3A). 대조적으로, 중증 모델에 노출되었을 때, F8 -/- Pros1 -/- 및 F8 -/- Pros1 +/- 마우스는 비등한 혈액 손실을 나타내었다 (도 3B). 그러나, F8 -/- Pros1 -/- 마우스는 두 모델 모두에서F8 +/- Pros1 +/+ 및 F8 +/+ Pros1 +/+ 마우스보다 출혈이 더 많았으며 (도 3A-B), 이는 F8 -/- 마우스에서 Pros1의 손실이 F8 -/- 마우스의 출혈 표현형을 부분적으로만 교정하였음을 나타낸다.In both models, blood loss was reduced in F8 −/− Pros1 −/− compared to F8 −/− Pros1 +/+ mice ( FIGS. 3A-B ). When challenged with the mild model, F8 −/− Pros1 +/− mice bleed less than F8 −/− Pros1 +/+ mice ( FIG. 3A ). In contrast, when exposed to the severe model, F8 -/- Pros1 -/- and F8 -/- Pros1 +/- mice exhibited comparable blood loss (Fig. 3B). However, F8 −/− Pros1 −/− mice bled more than F8 +/− Pros1 +/+ and F8 +/+ Pros1 +/+ mice in both models (Fig. 3A-B), indicating that F8 − Indicates that loss of Pros1 in /- mice only partially corrected the bleeding phenotype of F8 -/- mice.
이어서, PS-중화 항체를 사용하여 PS 활성의 억제가 F8 -/- Pros1 +/- 마우스에서 꼬리 출혈을 어떻게 변화시키는 지 조사하였다. 이 항체는 F8 -/- Pros1 +/- 마우스 (도 3C)에서의 혈액 손실을 Pros1의 완전한 유전자 손실 (도 3B)과 동일한 정도로 제한하였다.We then investigated how inhibition of PS activity alters tail hemorrhage in F8 -/- Pros1 +/- mice using a PS-neutralizing antibody. This antibody limited blood loss in F8 −/− Pros1 +/− mice ( FIG. 3C ) to the same extent as complete genetic loss of Pros1 ( FIG. 3B ).
실시예 5: Example 5: Pros1Pros1 표적화 또는 PS 억제는 HA 또는 HB 마우스를 급성 출혈관절증 (AH)으로부터 완전히 보호한다 Targeting or PS inhibition completely protects HA or HB mice from acute hemorrhagic arthrosis (AH)
출혈은 혈우병 환자의 어디에서나 나타날 수 있지만 대부분의 출혈은 관절에서 발생한다.. Pros1 손실이 혈우병 마우스에서 출혈관절증을 예방하는지 여부를 결정하기 위해, F8 -/- Pros1 +/+ , F8 -/- Pros1 +/- , F8 -/- Pros1 -/- 및 F8 +/+ Pros1 +/+ 마우스에 AH 모델을 적용하였다. F8 -/- Pros1 +/+ 및 F8 -/- Pros1 +/- 마우스와 비교하여 F8 -/- Pros1 -/- 및 F8 +/+ Pros1 +/+ 마우스에서 손상 후 무릎 부종이 감소되었다 (도 4A). F8 -/- Pros1 -/- 및 F8 +/+ Pros1 +/+ 마우스 간에 무릎 부종의 차이는 없었다 (도 4A). F8 -/- Pros1 +/+ 의 관절 공간과 활액에서 출혈이 관찰되었으나 (IBS=2, n=5) F8 -/- Pros1 -/- (IBS=0, n=5) 및 F8 +/+ Pros1 +/+ 마우스에서는 관찰되지 않았다 (IBS=0, n=5) (도 4B). F8 -/- Pros1 -/- 및 F8 +/+ Pros1 +/+ 마우스보다 F8 -/- Pros1 +/+ 의 관절 공간 및 활액에 피브린이 더 많았다 (도 4B). F9 -/- Pros1 +/+ 및 F9 -/- Pros1 -/- 마우스에 대해 유사한 데이터를 수득하였다 (각각 IBS=0, n=3 및 IBS=2, n=3) (도 9A-B).Bleeding can occur anywhere in hemophiliacs, but most bleeding occurs in the joints. To determine whether Pros1 loss prevents hemorrhagic arthrosis in hemophiliac mice, F8 -/- Pros1 +/+ , F8 -/- The AH model was applied to Pros1 +/- , F8 -/- Pros1 -/- and F8 +/+ Pros1 +/+ mice. Knee swelling after injury was reduced in F8 -/- Pros1 -/- and F8 +/+ Pros1 + /+ mice compared to F8 -/- Pros1 +/+ and F8 -/- Pros1 +/- mice (Fig. 4A ). There was no difference in knee swelling between F8 -/- Pros1 -/- and F8 +/+ Pros1 +/+ mice (FIG. 4A). Bleeding was observed in the joint space and synovial fluid of F8 -/- Pros1 +/+ (IBS=2, n = 5), but F8 -/- Pros1 -/- (IBS=0, n = 5) and F8 +/+ Pros1 It was not observed in +/+ mice (IBS=0, n =5) (Fig. 4B). There was more fibrin in the joint space and synovial fluid of F8 −/− Pros1 +/ + than F8 − /− Pros1 −/− and F8 +/+ Pros1 +/ + mice (Fig. 4B). F9 -/- Pros1 +/+ and F9 -/- Pros1 -/- Similar data were obtained for mice (IBS=0, n =3 and IBS=2, n =3, respectively) (FIGS. 9A-B).
이러한 결과는 F8 -/- Pros1 +/- 마우스에서 PS 중화 항체 또는 대조 항체를 4일 동안 연속 피하 주입하여 (AH 유도 1일 전 시작) 확인되었다 (무릎 부종은 PS-중화 항체 그룹에서 0.43±0.07 대 대조 그룹에서 0.69±0.09 mm 였다, n=9, P=0.04). PS 혈장 수준은 PS-중화 항체 그룹에서 26±6% 대 대조에서 45±3% 였다 (n=5, P=0.017). 또한, PS 억제는 대안적으로 F8 -/- Pros1 +/- 및 F8 -/- Pros1 +/+ 마우스에서 AH 시험감염 이전에 쥐과 PS (mPS) siRNA를 정맥 주사하여 구현되었다 (도 4C-D). IBS 평가로 대조 siRNA (IBS=2, n=3)로 처리시와 비교할 때 mPS siRNA (IBS= 0.5, n=3)로 처리된 F8 -/- Pros1 +/+ 마우스에서 관절내 출혈이 없음을 확인하였다, (도 4C). 중요하게도, PS 발현은 혈장 (26±3% 대 대조에서 84±11%, n=3, P=0.006) 및 활액 모두에서 mPS siRNA에 의해 감소되었다 (도 5A).These results were confirmed by continuous subcutaneous injection (starting 1 day before AH induction) of PS neutralizing antibody or control antibody in F8 -/- Pros1 +/- mice for 4 days (knee edema was 0.43±0.07 in PS-neutralizing antibody group). It was 0.69 ± 0.09 mm in the control group versus the control group, n = 9, P = 0.04). PS plasma levels were 26±6% in the PS-neutralizing antibody group versus 45±3% in the control ( n =5, P =0.017). In addition, PS inhibition was alternatively achieved by intravenous injection of murine PS (mPS) siRNA prior to AH challenge in F8 -/- Pros1 +/- and F8 -/- Pros1 +/+ mice (Fig. 4C-D) . IBS assessment showed no intra-articular hemorrhage in F8 -/- Pros1 +/+ mice treated with mPS siRNA (IBS = 0.5, n = 3) when compared to those treated with control siRNA (IBS = 2, n = 3) confirmed, (FIG. 4C). Importantly, PS expression was significantly reduced in plasma (26±3% vs control 84±11%, n =3, P =0.006) and synovial fluid were all reduced by mPS siRNA (Fig. 5A).
실시예 6: PS 및 TFPI 모두 마우스의 활액에서 발현된다 Example 6: Both PS and TFPI are expressed in the synovial fluid of mice
혈우병 마우스에서 Pros1 및 PS 억제의 유전적 손실의 현저한 관절내 지혈 효과를 이해하기 위해, 무릎 부분을 PS 및 TFPI에 대해 면역염색하였다. PS는 대조 siRNA로 처리된 AH를 가지는 F8 -/- Pros1 +/+ 마우스 활액 조직의 내막층에 주로 존재하는 반면, PS에 대한 활액 염색은 mPS siRNA를 받은 AH를 가지는 F8 -/- Pros1 +/+ 마우스에서 현저하게 감소되었다 (도 5A). 대조적으로, TFPI 염색은 대조 siRNA에 의해 처리시 보다 mPS siRNA를 받은 혈우병 마우스로부터의 활액 조직에서 더욱 두드러졌다 (도 5a). 그러나, TFPI 발현은 F8 -/- Pros1 +/+ 및 F8 -/- Pros1 -/- 마우스 모두의 활액 내막층에서 비등하였다 (도 5B).To understand the significant intra-articular hemostatic effect of genetic loss of Pros1 and PS suppression in hemophilia mice, knee sections were immunostained for PS and TFPI. PS was mainly present in the intimal layer of synovial tissues of F8 -/- Pros1 +/+ mice with AH treated with control siRNA, whereas synovial staining for PS was found in F8 -/- Pros1 +/+ mice with AH treated with mPS siRNA. + significantly reduced in mice (Fig. 5A). In contrast, TFPI staining was more pronounced in synovial tissue from hemophiliac mice receiving mPS siRNA than when treated with control siRNA (FIG. 5A). However, TFPI expression was reduced in F8 -/- Pros1 +/+ and F8 -/- Pros1 -/- Boiled in the synovial lining layer of all mice (Fig. 5B).
PS가 섬유모세포-유사 활액 세포 (FLS)에 의해 발현됨을 추가로 입증하기 위해, F8 +/+ Pros1 +/+ , F8 -/- Pros1 +/+ 및 F8 -/- Pros1 -/- FLS로부터 수집된 조건화 배지에서 웨스턴 블롯을 수행하였다. 도 5C에 도시된 바와 같이, F8 +/+ Pros1 +/+ 및 F8 -/- Pros1 +/+ FLS의 배지는 ~ 75 kDa의 분자량에서 밴드를 나타냈으며, 이는 PS와 비등하고 혈장 및 혈소판에서 관찰된 것과 유사하다. 예상한 바와 같이, F8 +/+ Pros1 -/- FLS로부터 얻은 배지에서 염색이 검출되지 않았다 (도 5C). To further demonstrate that PS is expressed by fibroblast-like synovial cells (FLS), collections from F8 +/+ Pros1 +/+ , F8 -/- Pros1 +/+ and F8 -/- Pros1 -/- FLS Western blot was performed in conditioned medium. As shown in Figure 5C, the medium of F8 +/+ Pros1 +/+ and F8 -/- Pros1 +/+ FLS showed a band at a molecular weight of ~ 75 kDa, which was comparable to PS and observed in plasma and platelets. similar to what has been As expected, no staining was detected in media obtained from F8 +/+ Pros1 -/- FLS (FIG. 5C).
또한 F8 -/- Pros1 +/+ 및 F8 -/- Pros1 -/- FLS 조건화 배지에서 TFPI 발현을 연구하였다 (도 5D). 모든 배지는 ~50 kDa에서 밴드를 나타냈으며, 이는 태반 용해물에서 관찰된 것과 유사하다. 완전히 당화된 TFPIα 및 TFPIβ가 동일한 분자량30에서 이동하기 때문에 TFPI 아이소형 발현은 단백질 탈당화 이후 조사되었다. FLS 배지로부터 탈당화된 TFPI는 태반 TFPI (TFPIα에 대한 양성 대조)와 유사한 TFPIα의 분자량에서 단일 밴드로서 이동하였다 (도 5D). 이는 FLS가 TFPIα를 발현하지만 TFPIβ는 발현하지 않음을 나타낸다. 또한, 트롬빈 자극 후 F8 -/- Pros1 +/+ FLS에서 PS 및 TFPI 발현이 증가 하였다 (도 5E-F). TFPI expression was also studied in F8 -/- Pros1 +/+ and F8 -/- Pros1 -/- FLS conditioned media (FIG. 5D). All media showed a band at ~50 kDa, similar to that observed in placental lysates. TFPI isoform expression was investigated after protein deglycosylation, since fully glycosylated TFPIα and TFPIβ migrate at the same molecular weight 30 . TFPI deglycosylated from the FLS medium migrated as a single band at a molecular weight of TFPIα similar to that of placental TFPI (positive control for TFPIα) (FIG. 5D). This indicates that FLS expresses TFPIα but not TFPIβ. Moreover, PS and TFPI expression increased in F8 −/− Pros1 +/+ FLSs after thrombin stimulation (Fig. 5E–F).
실시예 7: PS 및 TFPI 모두 HA 또는 HB 환자의 활액에서 발현된다Example 7: Both PS and TFPI are expressed in the synovial fluid of HA or HB patients
이어서 인간 HA, HB 및 골관절염 무릎 활액 조직을 PS 및 TFPI 모두에 대해 분석하였다 (도 6A). 대증요법 HA 환자의 활액 내막층 및 내막하층에서 TFPI 및 PS에 대한 강한 신호가 발견되었다 (n = 7). 대조적으로, PS 및 TFPI 모두에 대해 면역염색은 예방요법 중인 HA 환자에서 감소되었다 (n=5). 대증요법 HB 환자는 대증요법 HA 환자보다 활액 내막층 및 내막하층에서 (n=4) PS 및 TFPI 모두에 대해 더 적은 신호를 나타냈다. 골관절염 환자 (n = 7)로부터 얻은 구역들은 예방요법 중인 혈우병 환자와 유사하게 TFPI 및 PS에 대해 강한 염색을 나타내지 않았다. 어떠한 TFPI 아이소형이 인간 FLS에 의해 발현되는지를 평가하기 위해, 건강한 대상체 및 골관절염 환자로부터 단리된 인간 FLS의 조건화 배지에 대한 웨스턴 블롯을 수행하였다. 쥐과 FLS와 유사하게, 인간 FLS는 TFPIα를 발현하지만 TFPIβ는 발현하지 않는다 (도 6B).Human HA, HB and osteoarthritic knee synovial tissues were then analyzed for both PS and TFPI (FIG. 6A). Strong signals for TFPI and PS were found in the synovial intimal and subintimal layers of allopathic HA patients (n = 7). In contrast, immunostaining for both PS and TFPI was reduced in HA patients on prophylaxis (n=5). Patients with symptomatic HB showed fewer signals for both PS and TFPI in the synovial intimal and subintimal layers ( n =4) than patients with symptomatic HA. Sections from osteoarthritis patients (n = 7) did not show strong staining for TFPI and PS, similar to hemophilia patients on prophylaxis. To assess which TFPI isoforms are expressed by human FLS, Western blots were performed on conditioned media of human FLS isolated from healthy subjects and osteoarthritis patients. Similar to murine FLS, human FLS express TFPIα but not TFPIβ (Fig. 6B).
실시예 8: Example 8: Pros1Pros1 의 손실은 HA 마우스에서 TFPI-의존적 PS 활성 없음 및 APC에 대한 내성의 원인이다Loss of is responsible for TFPI-dependent PS inactivation and resistance to APC in HA mice
Pros1이 없거나 PS가 억제된 HA 또는 HB 마우스에서 AH에 대한 완전한 보호는 적어도 부분적으로 관절에서 APC 및 TFPI에 대한 PS 보조인자 활성이 없음에 의해 설명 될 수 있다. 그러나, 꼬리 출혈 모델에서 시험감염된 HA 마우스에서 Pros1 또는 PS 억제 없음의 부분 지혈 효과에 대한 이유를 추가로 조사할 필요가 있다.Complete protection against AH in HA or HB mice lacking Pros1 or suppressed PS can be explained, at least in part, by the absence of PS cofactor activity for APC and TFPI in the joint. However, the reason for the partial hemostatic effect of no Pros1 or PS inhibition in HA mice challenged in the tail bleeding model needs to be further investigated.
생체외 TF-개시된 트롬빈 생성 테스트는 트롬빈을 생성하는 혈장의 용량과 혈우병의 임상적 중증도 사이의 상관관계를 보여주었다. 따라서, HA 마우스의 혈장에서 트롬빈 생성에 대한 Pros1 손실의 영향을 조사하였다. TFPI-의존적 PS 활성은 무-혈소판 혈장 (PFP)에서가 아닌 혈소판-풍부 혈장 (PRP)에서 평가되었는데, 왜냐하면 PS의 TFPI-보조인자 활성은 트롬빈 생성 테스트를 사용하여 마우스 혈장에서 입증될 수 없기 때문이다. 이는 마우스 혈장에서의 TFPIα 부재 및 마우스 혈소판에서의 이의 존재에 의해 설명된다. An ex vivo TF-initiated thrombin generation test showed a correlation between the dose of thrombin-generating plasma and the clinical severity of hemophilia. Therefore, the effect of Pros1 loss on thrombin generation in the plasma of HA mice was investigated. TFPI-dependent PS activity was evaluated in platelet-rich plasma (PRP) but not in platelet-free plasma (PFP) because the TFPI-cofactor activity of PS could not be demonstrated in mouse plasma using the thrombin generation test. am. This is explained by the absence of TFPIα in mouse plasma and its presence in mouse platelets.
트롬빈 피크 및 내인성 트롬빈 전위 (ETP)는 1 pM TF에 대한 반응으로 F8 -/- Pros1 +/+ PRP에서보다 F8 -/- Pros1 -/- 에서 유의하게 더 높았으며 (1072±160 대 590±10 nmol/L.분, n=3/그룹, P=0.04), 이는 F8 -/- Pros1 -/- PRP에서 PS TFPI-보조인자 활성이 없음을 제시하는 것이다 (도 7A). 이전 연구와 일관되게, 트롬빈 피크 및 ETP는 1, 2.5 또는 5pM TF의 존재하에 F8 -/- Pros1 +/+ 및 F8 -/- Pros1 -/- 마우스의 PFP에서 비등하였다 (데이터 제시되지 않음).Thrombin peak and endogenous thrombin potential (ETP) were significantly higher in F8 -/- Pros1 -/- than in F8 -/- Pros1 +/+ PRP in response to 1 pM TF (1072±160 vs. 590±10 nmol/L.min, n =3/group, P =0.04), suggesting no PS TFPI-cofactor activity in F8 -/- Pros1 -/- PRP (Fig. 7A). Consistent with previous studies, thrombin peaks and ETP were increased by F8 −/− Pros1 +/+ in the presence of 1, 2.5 or 5 pM TF. and F8 -/- Pros1 -/- mice in PFP (data not shown).
F8 -/- Pros1 -/- 마우스가 결함성의 기능적 APC-의존성 PS 활성을 나타내었는지를 평가하기 위해, APC의 부재하에, 야생형 (WT) 재조합 APC의 존재하에, 또는 돌연변이된 (L38D) 재조합 마우스 APC (L38D APC, 제거된 PS 보조인자 활성을 갖는 변이체)의 존재하에 Ca2+ 이오노포어-활성화된 PRP에서의 트롬빈 생성 테스트를 사용하였다. 이 분석에서, APC 적정은 8 nM WT APC의 첨가가 WT 마우스의 활성화된 PRP에서 ETP를 90% 감소시킬 수있는 반면, 동일한 농도의 L38D APC는 ETP를 단지 30% 감소시켰음 (데이터는 제시되지 않음)을 보여주었다. 이들 데이터에 기초하여, 트롬빈 생성 곡선이 활성화된 PRP (3마리 마우스/검정)에 대해 기록되었다. 계산된 APC 비 (ETP + APC WT / ETP +APC L38D )는 F8 -/- Pros1 -/- p혈장에서는 APC 내성을 나타내었으나 F8 -/- Pros1 +/+ 혈장에서는 그러하지 않았다 (각각 0.87±0.13 대 0.23±0.08, P=0.01) (도 7B). To assess whether F8 -/- Pros1 -/- mice displayed defective functional APC-dependent PS activity, in the absence of APC, in the presence of wild-type (WT) recombinant APC, or mutated (L38D) recombinant mouse APC (L38D APC, a variant with deleted PS cofactor activity) was used to test for thrombin generation in Ca 2+ ionophore-activated PRP. In this assay, APC titration showed that the addition of 8 nM WT APC could reduce ETP by 90% in activated PRP of WT mice, whereas the same concentration of L38D APC reduced ETP by only 30% (data not shown). ) was shown. Based on these data, thrombin generation curves were recorded for activated PRP (3 mice/assay). The calculated APC ratio (ETP + APC WT / ETP +APC L38D ) showed APC resistance in F8 -/- Pros1 -/- p plasma but not in F8 -/- Pros1 +/+ plasma (0.87±0.13 versus 0.87±0.13, respectively). 0.23±0.08, P =0.01) (Fig. 7B).
APC-의존적 PS 활성 또한 2 nM WT APC 및 L38D APC의 존재하에 F8 -/- Pros1 +/+ 및 F8 -/- Pros1 -/- 마우스 (2마리 마우스/검정)의 PFP에서 테스트되었다. 계산된 APC 비율은 F8 -/- Pros1 -/- 에서 APC 저항성을 나타내었지만 F8 -/- Pros1 +/+ 마우스에서는 그렇지 않았다 (각각 1.08±0.04 대 0.25±0.09, P=0.0003) (도 7B).APC-dependent PS activity was also tested in PFP of F8 -/- Pros1 +/+ and F8 -/- Pros1 -/- mice (2 mice/assay) in the presence of 2 nM WT APC and L38D APC. The calculated APC ratios showed APC resistance in F8 −/− Pros1 −/− but not F8 −/− Pros1 +/+ mice (1.08±0.04 versus 0.25±0.09, respectively, P=0.0003) ( FIG. 7B ).
실시예 9: Example 9: Pros1Pros1 이 없는 HA 마우스에서 개선된 피브린 망Improved fibrin network in HA mice without
꼬리 출혈 마우스 모델은 혈소판 기능장애 뿐만 아니라 응고 및 피브린용해 변화에도 민감하다. 꼬리 출혈과 관련하여 연구된 유전자형 간의 차이를 이해하기 위해, 주사 전자 현미경 이미지를 사용하여 피브린 구조를 조사했다 (도 7C). F8 +/+ Pros1 +/+ 및 F8 -/- Pros1 -/- 혈장으로부터의 응혈들은 F8 -/- Pros1 +/+ 혈장 응혈들에 비해 보다 밀도있는 고도로 분지형성된 피브린 섬유들의 망을 보여주었다 (도11a-b). 대조적으로, F9 +/+ Pros1 +/+ 및 F9 -/- Pros1 -/- 혈장으로부터의 응혈은 F9 -/- Pros1 +/+ 혈장 응혈보다 밀도있는 망을 보여주지 않았으나, 섬유 분지형성 증가 경향을 보여주었다 (도 11c-d).The tail-bleeding mouse model is sensitive to changes in coagulation and fibrinolysis as well as platelet dysfunction. To understand the differences between the genotypes studied with respect to tail hemorrhage, scanning electron microscopy images were used to examine the fibrin structure (Fig. 7C). Clots from F8 +/+ Pros1 +/+ and F8 -/- Pros1 -/- plasma showed a denser network of highly branched fibrin fibers compared to F8 -/- Pros1 +/+ plasma clots. (Fig. 11a-b). In contrast, clots from F9 +/+ Pros1 +/+ and F9 -/- Pros1 -/- plasma did not show a denser network than F9 -/- Pros1 +/+ plasma clots, but showed a tendency towards increased fiber branching. showed (Fig. 11c-d).
F8 -/- Pros1 -/- 및 F8 -/- Pros1 +/+ 마우스, 및 F9 -/- Pros1 -/- 및 F9 -/- Pros1 +/+ 마우스로부터의 피브린 섬유는, F8 +/+ Pros1 +/+ 마우스 또는 F9 +/+ Pros1 +/+ 마우스 각각으로부터의 섬유들에 비해 더 큰 직경을 나타내었다. 그럼에도 불구하고, F8 -/- Pros1 -/- 및 F9 -/- Pros1 -/- 마우스의 섬유 표면은 F8 -/- Pros1 +/+ 또는 F9 -/- Pros1 +/+ 마우스 각각에 비해 더 작은 다공성을 보였으며, 이는 F8 -/- Pros1 -/- 및 F9 -/- Pros1 -/- -유래 섬유들이 F8 -/- Pros1 +/+ 또는 F9 -/- Pros1 +/+ -유래 섬유들보다 투과성이 더 작아서 피브린분해에 보다 내성일 수 있음을 제시하는 것이다38. 이들 데이터는, TFPI 및 APC 보조인자 활성 결과들 (도 7A-B) 모두를 보완하여, F8 -/- Pros1 -/- 에서의 꼬리 출혈이 F8 -/- Pros1 +/+ 마우스에 비해 개선되었으나 F8 +/+ Pros1 +/+ 마우스에서와 같이 완전히 교정되지 않은 이유를 설명함에 도움을 준다.Fibrin fibers from F8 -/- Pros1 - / - and F8 -/- Pros1 +/+ mice , and F9 -/- Pros1 -/- and F9 -/- Pros1 +/+ mice were showed a larger diameter compared to fibers from either /+ mice or F9 +/+ Pros1 +/+ mice, respectively. Nevertheless, the fiber surfaces of F8 -/- Pros1 -/- and F9 -/- Pros1 -/- mice were less porous compared to F8 -/- Pros1 +/+ or F9 -/- Pros1 +/+ mice, respectively. , which indicates that F8 -/- Pros1 -/- and F9 -/- Pros1 -/- -derived fibers are more permeable than F8 -/- Pros1 +/+ or F9 -/- Pros1 +/+ -derived fibers. It is smaller, suggesting that it may be more resistant to fibrinolysis 38 . These data complement both the TFPI and APC cofactor activity results ( FIGS. 7A-B ), suggesting that tail hemorrhage in F8 −/− Pros1 −/− was improved compared to F8 −/− Pros1 +/+ mice, but not F8 −/− Pros1 +/+ mice. +/+ Pros1 +/+ helps explain why it is not completely corrected as in the mouse.
실시예 10: 혈장에서의 PS 억제는 HA 환자에서 트롬빈 생성을 회복시킨다Example 10: PS Inhibition in Plasma Restores Thrombin Generation in HA Patients
이어서 인간 HA 혈장에서 트롬빈 생성에 대한 PS 억제의 효과를 조사했다. PFP의 ETP는 PS-중화 항체의 존재하에서 2-4배 증가하였다. FVIII 억제제의 존재하에서조차 C-말단 도메인에 대한 항-인간 TFPI 항체를 사용하여 효율적인 FXa 억제에 대한 유사한 결과를 얻었다 (도 7D-E). PS 억제는 PRP 샘플에서 ETP가 10배 이상 증가한 경우 현저한 영향을 미쳤다 (1912±37 및 1872±64 nM*분) (각각 도 7F 및 G). 따라서, PS 억제는 혈우병 혈장에서 ETP를 완전히 회복시켰다 (비교를 위해, 정상 혈장에서 ETP:1495±2nM*분). 항-TFPI 항체를 사용하여 유사한 결과를 얻었다 (도 7D-G). 이러한 데이터는, 마우스에서 관찰되었던 PS 억제에 의해 유도된 HA PFP 및 PRP에서의 트롬빈 생성 개선을 인간에서 확인시켜 주었다. We then investigated the effect of PS inhibition on thrombin generation in human HA plasma. The ETP of PFP increased 2-4 fold in the presence of PS-neutralizing antibodies. Similar results for efficient FXa inhibition were obtained using an anti-human TFPI antibody directed against the C-terminal domain even in the presence of a FVIII inhibitor (FIGS. 7D-E). PS inhibition had a significant effect when ETP increased more than 10-fold in PRP samples (1912±37 and 1872±64 nM*min) (Fig. 7F and G, respectively). Thus, PS inhibition completely restored ETP in hemophiliac plasma (for comparison, ETP in normal plasma: 1495±2 nM*min). Similar results were obtained using an anti-TFPI antibody (Fig. 7D-G). These data confirm in humans the improvement in thrombin generation in HA PFP and PRP induced by PS inhibition observed in mice.
실시예 11: 재료와 방법Example 11: Materials and Methods
마우스mouse
C57BL/6J 바탕의 F8 -/- 마우스 (B6;129S4-F8 tm1Kaz /J) 및 F9 -/- 마우스 (B6.129P2-F9 tm1Dws /J) 를 The Jackson Laboratory로부터 얻었다. Pros1 +/- 마우스는 최초 콜로니의 자손이었다15. 스위스 연방 수의사 협회가 실험을 승인하였다. 마우스들을 문헌에 설명된 바와 같이 유전자형화하였다15-17. F8 -/- mice ( B6;129S4- F8 tm1Kaz / J ) and F9 -/- mice ( B6.129P2- F9 tm1Dws / J ) from a C57BL/6J background were obtained from The Jackson Laboratory . Pros1 +/- Mice were progeny of the original colony 15 . The Swiss Federal Association of Veterinarians approved the experiment. Mice were genotyped as described in the literature 15-17 .
TF-유도된 폐색 전증TF-induced pulmonary embolism
정맥 혈전색전증 모델은 Weiss 등의 문헌18으로부터 약간 변형되어 조정되었다15. 6-9주령의 마취된 마우스는, 4.25 nM (1:2 희석) 또는 2.1 nM (1:4 희석)의 인간 재조합 TF (hrTF, Dade Innovin, Siemens)를 정맥내 (2 μL/g) 투여받았다. 호흡 정지가 시작되고 2분 후 또는 20분 관찰 기간이 종료시 폐를 수확하여 4% PFA에서 고정시켰다. 폐 구역을 헤마톡실린 및 에오신으로 그리고 피브린에 대해 염색하였다. 폐에서 피브린 응혈 정도는 10개의 무작위로 선택된 비 중첩 영역에서 혈관내 혈전(thrombi)의 수로 평가되었다 (×10 배율). The venous thromboembolic model was adapted from Weiss et al. 18 with minor modifications 15 . Anesthetized mice aged 6-9 weeks received intravenous (2 μL/g) administration of 4.25 nM (1:2 dilution) or 2.1 nM (1:4 dilution) of human recombinant TF (hrTF, Dade Innovin, Siemens) . Lungs were harvested 2 min after the onset of respiratory arrest or at the end of the 20 min observation period and fixed in 4% PFA. Lung sections were stained with hematoxylin and eosin and for fibrin. The extent of fibrin clots in the lungs was evaluated as the number of intravascular thrombi in 10 randomly selected non-overlapping areas (×10 magnification).
HA 마우스의 꼬리 클리핑 모델Tail clipping model in HA mice
출혈 표현형을 평가하기 위한 2개의 상이한 꼬리 클리핑 모델을 설명된 바와 같이 평가하였다14. 간단히 말하면, 8-10주령 마우스의 원위 꼬리는 2 mm (경증 손상)에서 절개되었고, 출혈은 정맥 또는 4 mm (중증 손상)였으며, 출혈은 동맥 및 정맥이었다19. 출혈은 각각 30분 또는 10분 후 손실된 혈액으로 정량화되었다. 중증 손상 모델에서, 일부 F8 -/- Pros1 +/- 마우스는 꼬리 절개 2분 전에 2.1 mg/kg의 용량의 토끼 항-인간 PS-IgG (Dako) 또는 토끼 아이소형 IgG (R&D Systems)를 정맥내 투여받았다. Two different tail clipping models for assessing the bleeding phenotype were evaluated as described 14 . Briefly, the distal tail of 8–10 week old mice was transected at 2 mm (mild injury), bleeding was venous or 4 mm (severe injury), and bleeding was arterial and venous 19 . Bleeding was quantified as blood lost after 30 or 10 minutes, respectively. In severe injury models, some F8 -/- Pros1 +/- Mice received an intravenous dose of rabbit anti-human PS-IgG (Dako) or rabbit isotype IgG (R&D Systems) at a dose of 2.1 mg/
급성 출혈관절증 모델Acute hemorrhagic arthrosis model
Øvlisen 등20의 문헌에 따라, 마취된 9-12주령 마우스에서 관절 출혈의 유도, 무릎 직경 측정 및 진통 커버리지를 수행하였다. 관절 직경은 0 및 72h에 디지털 캘리퍼 (Mitutoyo 547-301, Kanagawa)로 측정하였다. 72h에, 마우스를 희생시키고 무릎을 단리하고, 4% PFA에서 고정시키고, 석회제거하여 파라핀에 침지시켰다. 관절내 출혈 점수 (IBS)를 문헌에 기재된 바와 같이 평가하였다21.According to the literature of Øvlisen et al . 20 , induction of joint hemorrhage, measurement of knee diameter, and analgesia coverage were performed in anesthetized 9-12 week old mice. Joint diameter was measured with a digital caliper (Mitutoyo 547-301, Kanagawa) at 0 and 72 h. At 72h, mice were sacrificed and knees were isolated, fixed in 4% PFA, decalcified and immersed in paraffin. Intra-articular bleeding score (IBS) was assessed as described in the literature 21 .
생체내 PS 억제 PS inhibition in vivo
10주령 마우스에게 피하 삼투압 미니 펌프 (model2001, Alzet)를 통해 토끼 항-인간 PS-IgG (Dako Basel, Switzerland) 또는 토끼 아이소형 IgG (R&D Systems)를 1mg/kg/일로 연속 주입하였다.10-week-old mice were continuously infused with rabbit anti-human PS-IgG (Dako Basel, Switzerland) or rabbit isotype IgG (R&D Systems) at 1 mg/kg/day via subcutaneous osmotic minipump (model2001, Alzet).
대안적으로, 10주령 마우스를 제조업체의 지침에 따라 형질감염 물질 (Invivofectamine 3.0, Invitrogen, Life Technologies)를 사용하여 1 mg/kg 단회 용량의 마우스 특이적 siRNA (s72206, Life Technologies) 또는 대조 siRNA (4459405, 생체내 음성 대조 #1 Ambion, Life Technologies)로 처리하였다. PS 억제 후 2.5일에 급성 출혈관절증 모델을 적용하였다.Alternatively, 10-week-old mice were transfected with a single dose of 1 mg/kg mouse-specific siRNA (s72206, Life Technologies) or control siRNA (4459405) using transfection material (Invivofectamine 3.0, Invitrogen, Life Technologies) according to the manufacturer's instructions. , In vivo
통계 방법statistical method
값은 평균 ± sem으로 표현되었다. 비-연관 유전자 좌위에 대한 카이-제곱을 사용하여 멘델 대립유전자 분리를 평가하였다. TF-유도된 정맥 혈전색전증 모델에서의 생존 데이터를 카플란-마이어법을 사용하여 플롯하였다. 로그-랭크 테스트를 이용하여 곡선을 통계적으로 비교하였다 (Prism 6.0d; GraphPad). 다른 데이터는 GraphPad Prism 6.0d를 사용한 t-검정, 일원 및 이원 ANOVA 테스트에 의해 분석되었다. 0.05 미만의 P-값은 통계학적으로 유의한 것으로 간주되었다.Values were expressed as mean ± sem. Mendelian allelic segregation was assessed using chi-square for non-linked genetic loci. Survival data in the TF-induced venous thromboembolic model were plotted using the Kaplan-Meier method. Curves were statistically compared using the log-rank test (Prism 6.0d; GraphPad). Other data were analyzed by t-test, one-way and two-way ANOVA tests using GraphPad Prism 6.0d. A P -value of less than 0.05 was considered statistically significant.
쥐과 혈장의 준비Preparation of murine plasma
6-9주령 마우스를 펜토바르비탈 (40 mg/kg)로 마취시키고, 전혈을 하대정맥으로부터 into 3.13% 시트레이트로 채혈하였다 (1 vol 항응고제/9 vol 혈액). 혈소판 풍부 혈장 (PRP)을 얻기 위해 26°C로 예열된 원심분리기로 혈액을 1031 g에서 10분 동안 원심분리하였다. 대안적으로 혈액을 실온 (RT)에서 2400g에서 10분 동안 원심분리하여 혈소판 부족 혈장 (PPP)을 수득하였다. 무-혈소판 혈장 (PFP)을 얻기 위해, 10분 동안 10000g에서 추가 원심분리를 수행하였다.6-9 week old mice were anesthetized with pentobarbital (40 mg/kg), and whole blood was drawn into 3.13% citrate from the inferior vena cava (1 vol anticoagulant/9 vol blood). Blood was centrifuged at 1031 g for 10 min in a centrifuge preheated to 26 °C to obtain platelet-rich plasma (PRP). Alternatively, blood was centrifuged at room temperature (RT) at 2400g for 10 minutes to obtain platelet-poor plasma (PPP). To obtain platelet-free plasma (PFP), additional centrifugation was performed at 10000g for 10 minutes.
혈소판 수 및 응고 변수 측정Measurement of platelet count and coagulation parameters
혈소판 수는 자동 세포 계수기 (Procyte Dx Hematology Analyzer, IDEXX)로 수행하였다. 피브리노겐, FVIII 및 FIX 활성은 자동화된 Sysmex CA-7000 응고 분석기 (Sysmex Digitana)에서 측정되었다. 프로트롬빈 시간 (PT) 및 활성화된 부분 트롬보플라스틴 시간 (APTT)을 응고측정기 (MC4plus, Merlin Medical)에서 측정하였다.Platelet counts were performed with an automatic cell counter (Procyte Dx Hematology Analyzer, IDEXX). Fibrinogen, FVIII and FIX activities were measured on an automated Sysmex CA-7000 coagulation analyzer (Sysmex Digitana). Prothrombin time (PT) and activated partial thromboplastin time (APTT) were measured in a coagulometer (MC4plus, Merlin Medical).
ELISA에 의한 쥐과 PS 항원 및 TAT 복합체의 측정Measurement of murine PS antigen and TAT complexes by ELISA
96-웰 플레이트 (Maxisorb, Thermo)의 웰들을 웰 당 50 μL의 10 μg/mL의 토끼 폴리클로날 항-인간 PS (DAKO Cytomation)로 코팅하고 4°C에서 밤새 배양하였다. TBS 완충액 (0.05 M 트리스(하이드록시메틸)아미노메테인, 0.15 M NaCl, pH 7.5, 0.05% Tween 20)으로 3회 세척 후, 플레이트를 TBS-BSA 2%로 차단시켰다. 희석된 혈장 샘플들 (희석 범위: 1:300-1:600)을 웰에 첨가하고 RT에서 2h 동안 배양하였다. 3회 세척 후, 50 μL의 1μg/mL 비오티닐화 닭 다클론 항-쥐과 단백질 S를 첨가하고 실온에서 2시간 동안 배양하였다. 스트렙타비딘-HRP 접합된 홀스래디쉬 퍼옥시다제 (Thermo)를 첨가하여 신호를 증폭시키고, 플레이트를 1시간 동안 배양하였다. 플레이트를 3회 세척하고 100 μLTMB 기질 (KPL)을 첨가하였다. 100 μL HCl (1M)을 첨가하여 반응을 중지시켰다. 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 14마리의 건강한 마우스 (수컷 8마리 및 암컷 6마리, 7-12주령)로부터 얻은 풀링된 정상 혈장의 연속 희석액을 사용하여 표준 곡선을 설정하였다. 풀링된 정상 혈장에 대한 결과를 백분율로 표시하였다. Wells of a 96-well plate (Maxisorb, Thermo) were coated with 50 μL per well of 10 μg/mL rabbit polyclonal anti-human PS (DAKO Cytomation) and incubated overnight at 4°C. After washing three times with TBS buffer (0.05 M tris(hydroxymethyl)aminomethane, 0.15 M NaCl, pH 7.5, 0.05% Tween 20), the plate was blocked with 2% TBS-BSA. Diluted plasma samples (dilution range: 1:300-1:600) were added to the wells and incubated for 2h at RT. After washing three times, 50 μL of 1 μg/mL biotinylated chicken polyclonal anti-murine protein S was added and incubated for 2 hours at room temperature. Streptavidin-HRP conjugated horseradish peroxidase (Thermo) was added to amplify the signal and the plate was incubated for 1 hour. The plate was washed 3 times and 100 μLTMB substrate (KPL) was added. The reaction was stopped by adding 100 μL HCl (1M). Absorbance was measured at 450 nm. A standard curve was established using serial dilutions of pooled normal plasma from 14 healthy mice (8 males and 6 females, 7-12 weeks old). Results for pooled normal plasma are expressed as percentages.
제조업체의 지침에 따라 시판 ELISA (Enzygnost TAT micro, Siemens)를 사용하여 각 혈장 샘플에 대해 TAT 수준을 2회 측정하였다.TAT levels were measured in duplicate for each plasma sample using a commercial ELISA (Enzygnost TAT micro, Siemens) according to the manufacturer's instructions.
마우스 조직 가공 및 절편화, 면역화학 및 현미경Mouse tissue processing and sectioning, immunochemistry and microscopy
전처리 하지 않은 조직 절편 (4 μm)을 헤마톡실린/에오신 또는 메이슨 트라이크롬으로 염색하거나 불용성 피브린, PS 또는 TFPI에 대해 면역염색하였다. 다음 항체들이 사용되었다: 피브린 (mAb 클론 102-10)1 최종 농도 15.6 μg/mL, 30분 동안 RT에서 배양, 이차 항체 토끼 항-인간, (ab7155 Abcam, Cambridge, UK) 1:200 희석, 30분 동안 RT에서 배양; PS (MAB 4976, R&D, 희석 1:50) 30분 동안 RT에서 배양, 이차 항체 토끼 항-랫트, (ab7155 Abcam)-1:200 희석, 30분 동안 RT에서 배양; TFPI (PAHTFPI-S, Hematological Technologies) 최종 농도 18.6 μg/mL, 30분 동안 RT에서 배양, 이차 항체 토끼 항-양 IgG (ab7106, Abcam) 1:200 희석, 30분 동안 RT에서 배양. 모든 염색은 제조업체의 지시에 따라 면역염색제 BOND RX (Leica Biosystems, Muttenz, Switzerland)로 수행하였다. 20x (NA 0.8), 40x (NA 0.95) 공기 대물렌즈가 있는 3D HISTECH Panoramic 250 Flash II를 사용하여 전체 슬라이드들을 스캔하였다. 이미지 처리는 파노라마 뷰어 소프트웨어를 사용하여 수행되었다.Untreated tissue sections (4 μm) were stained with hematoxylin/eosin or Mason's trichrome or immunostained for insoluble fibrin, PS or TFPI. The following antibodies were used: fibrin (mAb clone 102-10) 1 final concentration 15.6 μg/mL, incubated for 30 min at RT, secondary antibody rabbit anti-human, (ab7155 Abcam, Cambridge, UK) 1:200 dilution, 30 Incubate at RT for min; PS (MAB 4976, R&D, dilution 1:50) incubate at RT for 30 min, secondary antibody rabbit anti-rat, (ab7155 Abcam) - 1:200 dilution, incubate at RT for 30 min; TFPI (PAHTFPI-S, Hematological Technologies) final concentration 18.6 μg/mL, incubated at RT for 30 min, secondary antibody rabbit anti-sheep IgG (ab7106, Abcam) 1:200 dilution, incubated at RT for 30 min. All staining was performed with the immunostaining agent BOND RX (Leica Biosystems, Muttenz, Switzerland) according to the manufacturer's instructions. Entire slides were scanned using a
F8이 완전히 손실된 마우스에 FVIII의 생체내 투여In vivo administration of FVIII to mice with complete loss of F8
6-9 주령 마우스를 케타민 (80mg/kg) 및 자일라진 (16mg/kg)으로 마취시켰다. 1h에 100% FVIII 수준에 도달할때까지 0.3 U/kg의 재조합 FVIII (Advate®Baxalta)를 (정상 용량) 또는 1h에 >200%에 도달할때까지 과량의 재조합 FVIII (2 U/kg)를 정맥내 투여하였다. 경정맥 카테터 (마우스 JVC 2Fr PU 10 cm, Instech)의 도입 1 시간 전과 1 시간 후, 중앙선 배치 후 4 시간, 8 시간 및 16 시간에 정상 용량 또는 과량을 주사 하였다. 첫 주사 24 시간 후에 마우스를 희생시켰다. 혈액을 채취하고 장기를 수확했다. FVIII, 피브리노겐 및 트롬빈-안티트롬빈 복합체 (TAT)를 실시예에 기재된 바와 같이 측정하였다. 폐를 단리하고, 4% 파라포름알데히드 (PFA)에 고정시키고 파라핀에 포매시켰다. 6-9 week old mice were anesthetized with ketamine (80mg/kg) and xylazine (16mg/kg). 0.3 U/kg of recombinant FVIII (Advate® Baxalta) at 1 h until 100% FVIII level is reached (normal dose) or excess recombinant FVIII (2 U/kg) at 1 h until >200% FVIII level is reached administered intravenously. Normal dose or overdose was injected 1 h before and 1 h after the introduction of the jugular catheter (mouse
장간막 동맥에서의 FeClFeCl in the mesenteric artery 33 손상 혈전증 모델 Injury thrombosis model
장간막 동맥의 혈전증 모델은 생체 현미경을 사용하여 참고문헌2에 따르되 약간 수정을 가하여 수행되었다. 케타민 (80 mg/kg) 및 자일라진 (16 mg/kg) 혼합물을 복강내 주사하여 마우스를 마취시켰다. 혈소판은 100 μL 로다민 6G (1.0 mM)를 주사하여 직접 생체내 표지되었다. 연구 분야의 선택 후, 용기 벽 손상은 10% FeCl3로 포화된 여과지 (1mm 직경의 1M Whatmann 종이 패치)에 의해 1분 동안 국소 처리하여 생성되었다. 혈전 형성은 친화력 보정된 침수형 광학장치(Zeiss, Germany)가 장착된, FITC 필터 세트를 구비한 형광 현미경 (IV-500, Micron instrument, San Diego, CA) 하에서 실시간으로 모니터 되었다. 밝은 형광 표지된 혈소판 및 백혈구는 비디오 촉발된 스트로보스코프 에피-조명 (Chadwick Helmuth, El Monte, CA)을 통해 1355μm X 965μm의 시야를 관찰 할 수 있게 하였다. NA0.3.의 10X 대물렌즈 Zeiss Plan-Neofluar를 사용하였다. 모든 장면은 맞춤형 저-지연 실리콘 강화 타겟 카메라 (Dage MTI, IN, Michigan city), 타임베이스 생성기 및 Hi-8 VCR (EV, C-100, Sony, Japan)을 사용하여 비디오 테이프에 기록되었다. 혈액 세포 흐름의 중단에 의해 결정된, 혈관벽 폐색 시간을 측정하였다.A mesenteric artery thrombosis model was performed using biomicroscopy according to Ref. 2 but with minor modifications. Mice were anesthetized by intraperitoneal injection of a mixture of ketamine (80 mg/kg) and xylazine (16 mg/kg). Platelets were directly labeled in vivo by injection of 100 μL Rhodamine 6G (1.0 mM). After selection of study area, vessel wall damage was created by topical treatment for 1 min with a filter paper (1 mm diameter 1M Whatmann paper patch) saturated with 10% FeCl 3 . Thrombus formation was monitored in real time under a fluorescence microscope (IV-500, Micron instrument, San Diego, Calif.) equipped with a FITC filter set equipped with affinity-corrected immersion optics (Zeiss, Germany). Brightly fluorescently labeled platelets and leukocytes were observed in a 1355 μm X 965 μm field of view via video-triggered stroboscopic epi-illumination (Chadwick Helmuth, El Monte, CA). A 10X objective lens of NA0.3. Zeiss Plan-Neofluar was used. All scenes were recorded to videotape using a custom low-latency silicon-enhanced target camera (Dage MTI, Michigan city, IN), a timebase generator, and a Hi-8 VCR (EV, C-100, Sony, Japan). The vessel wall occlusion time, determined by cessation of blood cell flow, was measured.
섬유모세포-유사 활액 세포 (FLS) 분리, 배양 및 유세포 분석Fibroblast-Like Synovial Cell (FLS) Isolation, Culture and Flow Cytometry
문헌3에 따라 8-10 주령의 마우스로부터 쥐과 FLS를 단리하고 배양하였다. 3계대 후, 세포의 위상차 이미지를 취하고, 세포를 FITC-접합된 랫트 항-마우스 CD11b 항체 (M1/70, Pharmingen, BD Biosciences), PE-접합된 랫트 항-마우스 CD90.2 항체 (30-H12, Pharmingen, BD Biosciences), FITC-접합된 랫트 항-마우스 CD106 항체 (429 MVCAM.A, Pharmingen, BD Biosciences), PE-접합된 햄스터 항-마우스 CD54 항체 (3E2, Pharmingen, BD Biosciences) 및 플루오로크롬-접합된 이이소형 대조군 항체와 함께 4℃ 암실에서 30분 동안 배양하였다. 최종 세척 및 원심분리 단계 후, 모든 배양된 세포를 LSR II 유세포 분석기 (BD Biosciences) 및 FACS Diva 7.0 소프트웨어 (BD Biosciences)에서 분석하였다. 건강한 개인 및 OA 환자로부터의 인간 FLS를 Asterand, Bioscience로부터 구입하여 제조업체의 지침에 따라 배양하였다.Murine FLS were isolated and cultured from 8-10 week old mice according to literature 3 . After 3 passages, phase-contrast images of cells were taken, and cells were incubated with FITC-conjugated rat anti-mouse CD11b antibody (M1/70, Pharmingen, BD Biosciences), PE-conjugated rat anti-mouse CD90.2 antibody (30-H12 , Pharmingen, BD Biosciences), FITC-conjugated rat anti-mouse CD106 antibody (429 MVCAM.A, Pharmingen, BD Biosciences), PE-conjugated hamster anti-mouse CD54 antibody (3E2, Pharmingen, BD Biosciences) and fluoro Incubation with chromium-conjugated isotype control antibody for 30 minutes at 4°C in the dark. After final washing and centrifugation steps, all cultured cells were analyzed on an LSR II flow cytometer (BD Biosciences) and FACS Diva 7.0 software (BD Biosciences). Human FLS from healthy individuals and OA patients were purchased from Asterand, Bioscience and cultured according to the manufacturer's instructions.
웨스턴 블롯팅western blotting
PS 및 TFPI는 환원 조건하에서 소듐 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (12% 구배 SDS-PAGE, Bio-Rad)에 의해 인간 및 마우스 샘플에서 검출되었다. 단백질을 니트로셀룰로스 막 (Bio-Rad)으로 옮긴 후, 쥐과 PS는 2ug/mL 단일 클론 MAB-4976 (R&D 시스템), 쥐과 TFPI의 경우 1μg/mL 다클론 AF2975 (R&D 시스템)를 사용하여 시각화하였다. 재조합 쥐과 PS4 (30 ng), 재조합 인간 TFPI 전장 (T. Hamuro, Kaketsuken, Japan 제공), 세척된 혈소판의 용해물, F8 -/- Pros1 +/+ 마우스의 PFP 및 F8 +/+ Pros1 +/+ 마우스의 태반 용해물을 PS, TFPIα 대조로 사용하였다. 합류된 쥐과 및 인간 FLS 조건화 배지로부터의 샘플을 무-혈청 배지 (OptiMem)에서 24h-배양 후 수집하고 Amicon 필터 장치 (Millipore, 10 kDa 컷오프)를 사용하여 40배 농축하였다. TFPI 웨스턴 블롯팅을 위해, 샘플들을 겔에 적재하기 전에 37 ℃에서 12시간 동안 5개의 단백질 탈당화효소 (PNGase F, O-글리코시다제, 뉴라미다제, β갈락토시다제, β아세틸글루코사미니다제, 탈당화 키트, V4931, Promega)의 혼합물로 처리하였다. 최종 검출은 홀스래디쉬 퍼옥시다제-접합된 이차 항체 (Dako) 및 Supersignal West Dura 장기 화학발광 기질 (Pierce)를 사용하여 완료하였으며, Fuji LAS 3000IR CCD 카메라를 사용하여 모니터하였다.PS and TFPI were detected in human and mouse samples by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (12% gradient SDS-PAGE, Bio-Rad) under reducing conditions. After protein transfer to a nitrocellulose membrane (Bio-Rad), murine PS was visualized using 2 μg/mL monoclonal MAB-4976 (R&D Systems) and 1 μg/mL polyclonal AF2975 (R&D Systems) for murine TFPI. Recombinant murine PS 4 (30 ng), recombinant human TFPI full length (provided by T. Hamuro, Kaketsuken, Japan), lysate of washed platelets, PFP from F8 -/- Pros1 +/+ mice and F8 +/+ Pros1 +/ + Placental lysates from mice were used as PS and TFPIα controls. Samples from confluent murine and human FLS conditioned medium were collected after 24h-incubation in serum-free medium (OptiMem) and concentrated 40-fold using an Amicon filter device (Millipore, 10 kDa cutoff). For TFPI Western blotting, samples were incubated with five protein deglycosylase (PNGase F, O-glycosidase, neuramidase, β-galactosidase, β-acetylglucosaminases) for 12 h at 37 °C before loading on the gel. Nidase, Deglycosylation Kit, V4931, Promega). Final detection was completed using horseradish peroxidase-conjugated secondary antibody (Dako) and Supersignal West Dura long term chemiluminescent substrate (Pierce) and monitored using a Fuji LAS 3000IR CCD camera.
인간의 무릎 활액에 대한 면역조직화학Immunohistochemistry of human knee synovial fluid
12명의 HA 환자 및 중증 무릎 관절증으로 관절성형술을 시행한 4명의 HB 환자의 활액 조직의 파라핀-포매 표본들을 다른 분헌들5,6에 기재된 바와 같이 피렌체 대학교 실험 및 임상 의학 학과, 해부학 및 조직학 분야의 기록보관소에서 수집하였다. 7명의 HA 환자를 필요에 따라 치료하고 5명을 이차 예방요법 치료하였다. 모든 4명의 HB 환자를 필요에 따라 치료하였다. 7명의 골관절염 (OA) 환자의 활액 샘플을 대조로 사용하였다5,6. 면역조직화학 분석을 위해, 활액 조직 절편 (두께 5 μm)을 탈파라핀화하고, 재수화시키고, 항원 회수를 위해 시트르산 나트륨 완충액 (10 mM, pH 6.0)에서 10 분 동안 끓인 후 메탄올에서의 3% H2O2로 실온에서 15분 동안 처리하여, 내인성 퍼옥시다제 활성을 차단하였다. 이어서, 졀편들을 PBS에서 세척하고 제조업체의 프로토콜에 따라 실온에서 10 분 동안 Ultra V 블록 (UltraVision 대용량 검출 시스템 항-다가, HRP, 카탈로그 번호 TP-125-HL, LabVision)과 함께 배양하였다. 비특이적 부위 결합을 차단한 후, 슬라이드를 PBS에 희석된 토끼 다클론 항-인간 단백질 S/PROS1 항체 (1:50 희석, 카탈로그 번호 NBP1-87218, Novus Biologicals) 또는 양 다클론 항-인간 조직 인자 경로 억제제 (TFPI) 항체 (1:500 희석, 카탈로그 번호 PAHTFPI-S, Haematologic Technologies)와 함께 4 ℃에서 밤새 배양하였다. PS 면역염색의 경우, 조직 절편들을 제조업체의 프로토콜에 따라 비오티닐화된 이차 항체, 이어서 스트렙타비딘 퍼옥시다제 (UltraVision Large Volume Detection System Anti-Polyvalent, HRP; LabVision)와 함께 배양하였다. TFPI 면역염색의 경우, 조직 절편들을 대신 30분 동안 HRP-접합된 당나귀 항-양 IgG (1:1000 희석; 카탈로그 번호 ab97125; Abcam)와 함께 배양하였다. 면역반응성은 염색체로서 3-아미노-9-에틸카르바졸 (AEC 키트, 카탈로그 번호 TA-125-SA; LabVision)을 사용하여 전개되었다. 활액 절편들을 최종적으로 메이어 헤마톡실린 (Bio-Optica)으로 염색하고, 세척하고, 수성 봉입제에 봉입시키고, Leica DM4000 B 현미경 (Leica Microsystems)으로 관찰하였다. 일차 항체에 노출되지 않거나 아이소형입-매칭 및 농도-매칭 비-면역 IgG (Sigma-Aldrich)와 함께 배양된 절편들은 항체 특이성에 대한 음성 대조로 포함되었다. Leica 소프트웨어 애플리케이션 스위트 LAS V3.8 (Leica Microsystems)가 장착된 Leica DFC310 FX 1.4-메가픽셀 디지털 컬러 카메라로 광학 현미경 이미지들을 캡쳐하였다. Paraffin-embedded specimens of synovial tissue from 12 HA patients and 4 HB patients who underwent arthroplasty for severe knee arthrosis were collected from the Department of Laboratory and Clinical Medicine, Department of Anatomy and Histology, University of Florence, as described elsewhere 5,6 . Collected from the archives. Seven HA patients were treated as needed and five were treated with secondary prophylaxis. All 4 HB patients were treated as needed. Synovial fluid samples from 7 osteoarthritis (OA) patients were used as controls 5,6 . For immunohistochemical analysis, synovial tissue sections (5 μm thick) were deparaffinized, rehydrated, and boiled for 10 min in sodium citrate buffer (10 mM, pH 6.0) for antigen retrieval followed by 3% in methanol. Endogenous peroxidase activity was blocked by treatment with H 2 O 2 at room temperature for 15 minutes. The slices were then washed in PBS and incubated with Ultra V block (UltraVision High Volume Detection System Anti-Polyvalent, HRP, catalog number TP-125-HL, LabVision) for 10 minutes at room temperature according to the manufacturer's protocol. After blocking non-specific site binding, slides were inoculated with rabbit polyclonal anti-human protein S/PROS1 antibody diluted in PBS (1:50 dilution, catalog number NBP1-87218, Novus Biologicals) or sheep polyclonal anti-human tissue factor pathway. inhibitor (TFPI) antibody (1:500 dilution, catalog number PAHTFPI-S, Haematologic Technologies) and incubated overnight at 4°C. For PS immunostaining, tissue sections were incubated with a biotinylated secondary antibody followed by streptavidin peroxidase (UltraVision Large Volume Detection System Anti-Polyvalent, HRP; LabVision) according to the manufacturer's protocol. For TFPI immunostaining, tissue sections were instead incubated with HRP-conjugated donkey anti-sheep IgG (1:1000 dilution; catalog number ab97125; Abcam) for 30 minutes. Immunoreactivity was developed using 3-amino-9-ethylcarbazole (AEC kit, catalog number TA-125-SA; LabVision) as a chromosome. Synovial sections were finally stained with Mayer's hematoxylin (Bio-Optica), washed, embedded in an aqueous loading medium, and observed under a Leica DM4000 B microscope (Leica Microsystems). Sections not exposed to primary antibodies or incubated with isotype-matched and concentration-matched non-immune IgG (Sigma-Aldrich) were included as negative controls for antibody specificity. Optical microscope images were captured with a Leica DFC310 FX 1.4-megapixel digital color camera equipped with the Leica software application suite LAS V3.8 (Leica Microsystems).
피브린 응혈 초미세구조 조사Investigation of fibrin clot ultrastructure
~ 5 nM TF (Dade Innovin, Siemens)를 첨가하여 PFP로부터 37℃에서 피브린 응혈을 제조하였다. 이어서 Zubairova 등의 문헌7에 따라 주사 전자 현미경을 사용하여 시각화 하기 위해 이들을 2% 글루타르알데히드에 고정시키고, 탈수시키고, 건조시키고, 금 팔라듐으로 스퍼터-코팅하였다. 망 밀도 및 섬유 분지형성의 반 정량 평가를 STEPanizer 소프트웨어 (www.stepanizer.com)를 사용하여 수행하였다.Fibrin clots were prepared at 37°C from PFP by adding ~5 nM TF (Dade Innovin, Siemens). They were then fixed in 2% glutaraldehyde, dehydrated, dried and sputter-coated with gold palladium for visualization using scanning electron microscopy according to Zubairova et al. 7 . Semi-quantitative evaluation of network density and fiber branching was performed using STEPanizer software (www.stepanizer.com).
쥐과 샘플에서 보정된 자동화 혈전 분석Automated clot assay calibrated in murine samples
PFP 및 PRP에서의 트롬빈 생성은 보정된 자동화 트롬보그램 (CAT) 방법을 사용하여 결정되었다. Thrombin generation in PFP and PRP was determined using a calibrated automated thrombogram (CAT) method.
TFPI 의존적 PS 활성을 다음과 같이 PRP (150 G/L)에서 평가하였다. 간략히 말하면, 10 μL 마우스 PRP (150 G/L)를 10 μL PRP 시약 (Diagnostica Stago) 및 30 μL의 완충액 A (25 mm Hepes, 175 mm NaCl, pH 7.4, 5 mg/mL BSA)와 혼합하였다. 트롬빈 생성은 10 μL의 형광원성 기질/CaCl2 혼합물을 사용하여 37℃에서 시작되었다. 최종 농도는 다음과 같았다: 16.6% 마우스 혈장, 1 pM hrTF, 4 μM 인지질, 16 mM CaCl2, 및 0.42 mM 형광원성 기질.TFPI-dependent PS activity was evaluated in PRP (150 G/L) as follows. Briefly, 10 μL mouse PRP (150 G/L) was mixed with 10 μL PRP reagent (Diagnostica Stago) and 30 μL of Buffer A (25 mm Hepes, 175 mm NaCl, pH 7.4, 5 mg/mL BSA). Thrombin generation was initiated at 37° C. using 10 μL of a fluorogenic substrate/CaCl 2 mixture. The final concentrations were: 16.6% mouse plasma, 1 pM hrTF, 4 μM phospholipids, 16 mM CaCl 2 , and 0.42 mM fluorogenic substrate.
APC 의존성 PS 활성은 Dargaud Y 등8에 따라 마우스 PFP 및 PRP의 CAT-기반 APC 내성 테스트에서 평가되었다. PRP (150 G/L)는 37℃에서 5분 동안 40 μM Ca2+ 이오노포어 (A23187)를 사용하여 미리 활성화되었다. 최종 농도는 다음과 같았다: 16.6% 마우스 혈장, 22 μM A23187, 1 pM hrTF, 4 μM 인지질, 2nM (PFP의 경우) 또는 8 nM (PRP의 경우) 야생형 재조합 마우스 APC (wt-rmAPC)5 또는 돌연변이된 재조합 마우스 APC (rmAPC L38D), 16 mM CaCl2, 및 0.42 mM 형광원성 기질. rmAPC L38D의 생성 및 특성화는 참고문헌 9,10 에 따라, 그리고 정제는 참고문헌11,12에 따라 수행되었다.APC-dependent PS activity was evaluated in a CAT-based APC resistance test of mouse PFP and PRP according to Dargaud Y et al. 8 . PRP (150 G/L) was pre-activated using 40 μM Ca 2+ ionophore (A23187) for 5 min at 37°C. Final concentrations were: 16.6% mouse plasma, 22 μM A23187, 1 pM hrTF, 4 μM phospholipids, 2 nM (for PFP) or 8 nM (for PRP) wild-type recombinant mouse APC (wt-rmAPC) 5 or mutant recombinant mouse APC (rmAPC L38D), 16 mM CaCl 2 , and 0.42 mM fluorogenic substrate. Generation and characterization of rmAPC L38D was performed according to Refs 9,10 and purification according to Refs 11,12 .
PFP에 대한 TF 적정을 위해, 다음 시약들이 사용되었다: PPP 시약 및 MP 시약 (Diagnostica Stago).For titration of TF to PFP, the following reagents were used: PPP reagent and MP reagent (Diagnostica Stago).
디스펜서가 장착된 Fluoroscan Ascent®형광계를 사용하여 형광을 측정하였다. 390nm (여기 필터) 및 460nm (방출 필터)의 파장에서 형광 강도가 검출되었다. 전용 소프트웨어 프로그램 Thrombinoscope®버전 3.0.0.29 (Thrombinoscope bv)를 통해 교정기 (Thrombinoscope bv)에 대한 트롬빈 활성을 계산할 수 있었으며 시간에 따라 트롬빈 활성을 표시하였다. 모든 실험들은 37° C에서 2회 실시되었으며 측정은 통상적으로 60분 지속되었다.Fluorescence was measured using a Fluoroscan Ascent® fluorometer equipped with a dispenser. Fluorescence intensities were detected at wavelengths of 390 nm (excitation filter) and 460 nm (emission filter). The dedicated software program Thrombinoscope® version 3.0.0.29 (Thrombinoscope bv) was able to calculate the thrombin activity for the calibrator (Thrombinoscope bv) and displayed the thrombin activity over time. All experiments were performed twice at 37°C and measurements typically lasted 60 minutes.
인간 샘플에서 CAT 분석CAT analysis in human samples
환자로부터 서면 동의를 얻었다. 정맥혈을 3.2% 시트르산 나트륨 (부피/부피)에서 정맥천자에 의해 채취하고 2000g에서 5분 동안 원심분리하였다. 이어서 혈소판 부족 혈장 (PPP)을 10000g에서 10분 동안 원심분리하여 PFP를 수득하였다. PFP를 분취하고, 급속 냉동하고, 사용하기 전까지 -80 ℃에서 보관하였다. PRP의 경우, 혈액을 180 gx 10 분에서 원심분리하였다. 모든 대상체들은 참여에 대해 사전 동의하였다. 참고문헌13 기재내용을 약간 변형하여 트롬빈 생성을 인간 PFP 및 PRP에서 평가하였다. 간단히 말하면, 68 μL PFP 또는 PRP (150 G/L)를 12 μL의 다클론 토끼 항-인간 PS-IgG 항체 (0.42 mg/mL, Dako) 또는 TFPI에 대한 단클론 항체 (0.66 μm, MW1848, Sanquin) 또는 완충액 A와 함께 37°C에서 15분 동안 배양 하였다. PFP 샘플은 PPP 저 및 PPP 5 pm 시약 (Diagnostica Stago)의 7:1 혼합물 또는 PRP 샘플은 PRP 시약 (Diagnostica stago) 20 μL로 응고가 시작되었다. 20 μL의 CaCl2 및 형광원성 기질 (I-1140; Bachem) 첨가 후, Fluoroskan Ascent 판독기 (Thermo Labsystems)에서 트롬빈 생성이 이어졌다. Written informed consent was obtained from the patients. Venous blood was collected by venipuncture in 3.2% sodium citrate (vol/vol) and centrifuged at 2000 g for 5 min. The platelet poor plasma (PPP) was then centrifuged at 10000 g for 10 minutes to obtain PFP. PFP was aliquoted, flash frozen and stored at -80 °C until use. For PRP, blood was centrifuged at 180 g×10 min. All subjects gave informed consent for participation. With minor modifications from reference 13 , thrombin generation was evaluated in human PFP and PRP. Briefly, 68 μL PFP or PRP (150 G/L) was added with 12 μL of polyclonal rabbit anti-human PS-IgG antibody (0.42 mg/mL, Dako) or monoclonal antibody to TFPI (0.66 μm, MW1848, Sanquin). or incubated with buffer A at 37 °C for 15 min. PFP samples were initiated with a 7:1 mixture of PPP low and
논의Argument
PS는 트롬빈 생성의 주요 조절인자여서, 우리는 PS를 표적으로 하는 것이 잠재적인 혈우병 치료법을 구성할 수 있다고 생각했다. As PS is a key regulator of thrombin generation, we envisioned that targeting PS could constitute a potential hemophilia therapy.
마우스에서의 광범위한 연구는 혈우병 마우스에서 출혈 및 심각한 관절 손상에 대한 원인으로서의 PS 및 TFPI에 대한 중추적 역할을 뒷받침하는 개념 증명 데이터를 제공한다. Pros1을 표적화하거나 PS를 억제하는 것은 꼬리 출혈 분석에서 출혈 표현형의 생체내 개선 및 출혈관절증에 대한 완전한 보호에 의해 판단되는 바와 같이 마우스에서 혈우병을 개선하는 능력을 갖는다 (도 3A-C 및 4). 관절은 TF의 매우 약한 발현을 나타내고 활액 세포는 많은 양의 TFPIα 및 PS를 생성하기 때문에 (도 5), 외인성 경로의 활성은 관절내에서 크게 감소하여 혈우병성 관절이 출혈되기 쉽다. 더욱이, 트롬보모듈린 (TM) 및 내피 단백질 C 수용체 (EPCR)는 FLS에 의해 발현되며, 이는 TM-트롬빈 복합체가 EPCR 결합된-PC를 활성화시켜 AH와 관련하여 매우 강력한 항응고제인 APC를 생성함을 시사한다. 중요하게도, TFPIα의 발현은 트롬빈에 의해 상향조절된다 (도 5F). 그러므로 수 일 내지 수 주간 지속될 수 있는 현저한 국소 염증 및 관절 증상들을 통상적으로 유발하는 AH 는 또한 다수의 항응고제들, 즉, APC, TFPIα, 및 이들의 상호 보조인자 PS의 국소 생성 및 분비를 촉진시키며, 이는 혈우병에서 관절 손상의 병태생리학을 설명함에 도움을 줄 수 있다. Extensive studies in mice provide proof-of-concept data supporting a pivotal role for PS and TFPI as a cause for hemorrhage and severe joint damage in hemophilic mice. Targeting Pros1 or inhibiting PS has the ability to ameliorate hemophilia in mice as judged by in vivo improvement of the bleeding phenotype and complete protection against hemorrhagic arthrosis in the tail bleeding assay (Figures 3A-C and 4). Because joints show very weak expression of TF and synovial cells produce large amounts of TFPIα and PS (FIG. 5), the activity of the extrinsic pathway is greatly reduced within the joint, making hemophilic joints prone to hemorrhage. Moreover, thrombomodulin (TM) and endothelial protein C receptor (EPCR) are expressed by FLS, which TM-thrombin complex activates EPCR bound-PC to produce APC, a very potent anticoagulant with respect to AH suggests Importantly, expression of TFPIα is upregulated by thrombin (FIG. 5F). Therefore, AH, which usually causes marked local inflammatory and joint symptoms that can last for days to weeks, also promotes the local production and secretion of a number of anticoagulants, namely APC, TFPIα, and their cofactor PS; This may help explain the pathophysiology of joint damage in hemophilia.
혈우병 환자의 임상 샘플을 사용한 관찰결과는 쥐과 연구로부터 얻은 결과와 일관된다. 인간에서, 억제제를 사용한 또는 억제제를 사용하지 않은 HA 환자의 혈장에서 PS를 차단하는 것은 ETP를 정상화시킨다 (도 7D-G). HB 환자는 HA 환자보다 TFPI 및 PS의 관절내 발현이 적으며, HB 환자는 HA 환자보다 출혈이 더 적다는 현재의 지식과 일치한다 (도 6). 더욱이, 예방요법을 받는 HA 환자들은 출혈 상황, 즉, 소위 "대증 요법"에서만 FVIII 농축액을 투여받는 환자보다 적은 TFPI 및 PS 활액 발현을 나타낸다 (도 6A). 마지막으로, 인간 FLS는 마우스에서 관찰된 바와 같이 TFPIα 및 PS를 모두 분비하므로, 쥐과 혈우병 데이터의 인간에 대한 외삽을 강력하게 한다.Observations using clinical samples from patients with hemophilia are consistent with those obtained from murine studies. In humans, blocking PS in the plasma of HA patients with or without inhibitors normalizes ETP (Fig. 7D-G). HB patients have less intraarticular expression of TFPI and PS than HA patients, consistent with current knowledge that HB patients have less bleeding than HA patients ( FIG. 6 ). Moreover, HA patients receiving prophylaxis showed less TFPI and PS synovial fluid expression than patients receiving FVIII concentrate only in a hemorrhagic situation, ie, so-called “symptomatic therapy” ( FIG. 6A ). Finally, human FLSs secrete both TFPIα and PS as observed in mice, making the extrapolation of murine hemophilia data to humans robust.
이 보고서에서의 중요한 발견에 근거하여 우리는 PS의 표적화가 잠재적으로 혈우병에 유용한 치료법으로 번역될 수 있음을 제안한다. 인간 및 쥐과 관절에서의 PS는 출혈관절증에 대한 새로운 병태생리학적 원인인자이며 특히 관절내 APC 및 TFPIα 모두에 대한 이중 보조인자 활성으로 인해 매력적인 잠재적 치료 표적을 구성한다. PS의 존재하에서, 출혈관절증은 활액에서 TFPIα 발현을 증가시킨다. 마우스에서 PS를 표적으로 하는 것은 출혈관절증으로부터 마우스들을 보호한다. 따라서, 우리는 FLS에 의해 생성되는 TFPIα 및 그의 보조인자 PS 모두가 TM-EPCR-PC 경로와 함께, 출혈관절증에 대한 중요한 병리학적 영향을 미치는 강력한 관절내 항응고제 시스템을 포함함을 제안한다. 우리가 성공적으로 혈우병 생쥐에서 사용했던 쥐과 PS 침묵 RNA (도 4H-I 및 도 5A)는 우리가 혈우병 환자를 위해 개발하게 될 치료적 접근법이다. 현재 인자 대체 요법에 비해 RNA를 침묵시키는 것의 이점은 주사 빈도 및 가능한 피하 투여 경로를 감소시키는 보다 긴 반감기이다. Based on the important findings in this report, we suggest that targeting PS could potentially translate into useful therapies for hemophilia. PS in the human and murine joints is a novel pathophysiological causative factor for hemorrhagic arthrosis and constitutes an attractive potential therapeutic target, particularly due to its dual cofactor activity on both APC and TFPIα in the joint. In the presence of PS, hemorrhagic arthritis increases TFPIα expression in synovial fluid. Targeting PS in mice protects mice from hemorrhagic arthrosis. Thus, we propose that both TFPIα and its cofactor PS produced by FLS, together with the TM-EPCR-PC pathway, comprise a potent intra-articular anticoagulant system with important pathological implications for hemorrhagic arthrosis. Murine PS silencing RNA (Fig. 4H-I and Fig. 5A), which we successfully used in hemophiliac mice, is a therapeutic approach that we will develop for hemophiliac patients. The advantage of silencing RNA over current factor replacement therapy is a longer half-life that reduces injection frequency and possible subcutaneous route of administration.
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SEQUENCE LISTING <110> Universit? 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ata 1560 taaataaacc tggacccctt tttaagccgg aaaatggatt gctggaaacc aaagtatact 1620 ttgcaggatt ccctcggaaa gtggaaagtg aactcattaa accgattaac cctcgtctag 1680 atggatgtat acgaagctgg aatttgatga agcaaggagc ttctggaata aaggaaatta 1740 ttcaagaaaa acaaaataag cattgcctgg ttactgtgga gaagggctcc tactatcctg 1800 gttctggaat tgctcaattt cacatagatt ataataatgt atccagtgct gagggttggc 1860 atgtaaatgt gaccttgaat attcgtccat ccacgggcac tggtgttatg cttgccttgg 1920 tttctggtaa caacacagtg ccctttgctg tgtccttggt ggactccacc tctgaaaaat 1980 cacaggatat tctgttatct gttgaaaata ctgtaatata tcggatacag gccctaagtc 2040 tatgttccga tcaacaatct catctggaat ttagagtcaa cagaaacaat ctggagttgt 2100 cgacaccact taaaatagaa accatctccc atgaagacct tcaaagacaa cttgccgtct 2160 tggacaaagc aatgaaagca aaagtggcca catacctggg tggccttcca gatgttccat 2220 tcagtgccac accagtgaat gccttttata atggctgcat ggaagtgaat attaatggtg 2280 tacagttgga tctggatgaa gccatttcta aacataatga tattagagct cactcatgtc 2340 catcagtttg gaaaaagaca aagaattctt aaggcatctt ttctctgctt ataatacctt 24 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ctatgaa aaccagaaca aattttaaca aaaggacaac cacagaggga tatagtgaat 3300 atcgtatcat tgtaatcaaa gaagtaagga ggtaagattg ccacgtgcct gctggtactg 3360 tgatgcattt caagtggcag ttttatcacg tttgaatcta ccattcatag ccagatgtgt 3420 atcagatgtt tcactgacag tttttaacaa taaattcttt tcactgtatt ttatatcact 3480 tataataaat cggtgtataa ttttaaaatg catgtgaata tctttattat atcaactgtt 3540 tgaataaaac aaaattacat aatagacatt taactcttca aaaaaaaaaa aaaaa 3595 <210> 2 <211> 3682 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 gtcacactgt ggaggaaaag cagcaactag ggagctggtg aagaaggatg tctcagcagt 60 gtttactagg cctccaacac tagagcccat cccccagctc cgaaaagctt cctggaaatg 120 tccttgttat cacttcccct ctcgggctgg gcgctgggag cgggcggtct cctccgcccc 180 cggctgttcc gccgaggctc gctgggtcgc tggcgccgcc gcgcagcacg gctcagaccg 240 aggcgcacag gctcgcagct ccgcggcgcc tagcgctccg gtccccgccg cgacgcgcca 300 ccgtccctgc cggcgcctcc gcgcgcttcg aaatgagggt cctgggtggg cgctgcgggg 360 cgctgctggc gtgtctcctc ctagtgcttc ccgtctcaga ggcaaacttt tgtttatatt 420 ttagaaatga ttttatatac aaccgtgcat gcat 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를 포함하는, 혈우병의 치료 방법.Administering a molecule comprising the siRNA according to claim 1 or 2 to a non-human subject
Including, a method for treating hemophilia.
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