KR102507204B1 - 약제 내성을 가지고 내부에 표면 개질된 금속 나노입자를 포함하는 마이셀, 이의 용도 및 제조 방법 - Google Patents

약제 내성을 가지고 내부에 표면 개질된 금속 나노입자를 포함하는 마이셀, 이의 용도 및 제조 방법 Download PDF

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Abstract

약제 내성을 가지고 내부에 표면 개질된 금속 나노입자를 포함하는 마이셀, 이의 용도 및 제조 방법에 관한 것으로, 일 양상에 따른 마이셀, 이를 포함하는 세포 내 나노입자 전달용 조성물, 세포 내 나노입자 전달용 조성물의 제조방법, 및 일 양상에 따른 마이셀을 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 의하면, 약제내성(drug-resistance)를 갖지 않고 효과적으로 암의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있는 효과가 있다.

Description

약제 내성을 가지고 내부에 표면 개질된 금속 나노입자를 포함하는 마이셀, 이의 용도 및 제조 방법 {Micelles that are drug resistant and comprise surface-modified metal nanoparticles therein, uses and preparation methods thereof}
약제 내성을 가지고 내부에 표면 개질된 금속 나노입자를 포함하는 마이셀, 이의 용도 및 제조 방법에 관한 것이다.
1940년대 후반기부터 사용된 화학항암제는 보통 DNA damage를 일으켜 세포를 죽이는 방식으로 암세포만이 아닌 건강한 정상 세포를 함께 공격함으로써 치료의 한계점(toxicity)이 있다. 2000년대 들어 사용된 표적항암제는 암세포에만 존재하는 특정 표적 단백질을 공격한다는 이점이 있지만 같은 암종이라도 환자에게 특정 표적 인자가 없으면 복용할 수 없다는 단점이 있다. 공통으로 두 세대의 항암제에 대한 내성의 발생으로 약물의 사용이 여전히 제한적이다.
　내성의 발생은 크게 두 가지로 분류되는데 초기부터 약물에 대한 내성을 가진 요인이 암세포에 존재하여 약물이 반응하지 않는 선천적인 내성(intrinsic resistance)과 약물 처리가 암의 치료에 효과를 보이다 약물의 지속적 치료 과정에서 변성(mutations)이 발생하거나 다른 신호 전달 체계와의 상호작용으로 단순한 단백질이나 효소의 작용 억제만으로는 약물이 더는 반응을 하지 않게 되는 후천적인 내성(acquired resistance)이 있다.
　화학항암제와 표적항암제의 내성은 약물의 표적 단백질의 발현 변화 및 변성, prosurvival 신호 경로의 활성, 유전자 손상 회복 시스템(DNA repair system)의 증가, 세포 사멸(apoptosis) 신호 전달 유도의 실패 등 다양한 방식으로 진행된다. 화학항암제의 경우 약물 및 암의 종류에 따라 DNA, topoisomeras나 tublin을 타겟으로 하여 약물의 저항 기전이 표적 단백질의 발현 변화나 변성, anti-apoptosis 단백질의 증가가 내성 기전에 영향을 미친다고 알려져 있고, 특정 단백질을 타겟으로 하는 표적항암제의 내성 기전 역시 단백질의 변성 및 발현 변화, anti-apoptosis 기전의 영향 등이 보고된다.
이에 따라 본 발명자들은 약제내성을 발생시키지 않는, 내부에 표면 개질된 금속 나노입자를 포함하는 마이셀을 제공한다.
일 양상은 내부에 하나 이상의 표면개질된 금속 나노입자를 포함하며, 양친매성 블록 공중합체를 주요성분으로 하는 마이셀(micelle)을 제공하는 것이다.
다른 양상은 상기 마이셀을 포함하는 세포 내 나노입자 전달용 조성물을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 금속 나노입자 표면에 치환 또는 비치환된 C1-30알킬이 결합된 전구체를 제조하는 단계; 및 상기 전구체 주변에 마이셀 구조를 이루도록 양친매성 블록 공중합체를 도입하는 단계를 포함하는, 세포 내 나노입자 전달용 조성물의 제조 방법을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 상기 마이셀을 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
일 양상은 내부에 하나 이상의 표면개질된 금속 나노입자를 포함하며, 양친매성 블록 공중합체를 주요성분으로 하는 마이셀(micelle)을 제공한다.
본 명세서에서 용어 "마이셀"은 양친성 고분자의 자기 조립특성에 의해 코어/쉘 구조를 가지는 수 나노 내지 수만 나노 크기의 입자를 의미할 수 있다. 양친성 고분자를 포함하는 마이셀은 유중 또는 수중에서 우수한 분산 특성을 가질 수 있고, 또한 뛰어난 안정성을 가질 수 있다. 이러한 마이셀은 내부에 다른 나노 입자를 포함할 수 있다.
상기 양친매성 블록 공중합체는 수용액상에서 마이셀을 형성할 수 있는 양친매성 블록 공중합체로서 소수성의 중심부가 친수성의 블록으로 표면이 둘러싸인 코어-쉘 (core-shell) 구조를 형성할 수 있다. 따라서 내부에 표면이 소수성인 입자을 포함하는 코어-쉘 구조를 형성할 수 있다. 본 발명에서 양친매성 블록 공중합체가 마이셀을 이루는 주된 성분일 수 있으나, 이에 한하지 않고 다른 성분을 더 포함하여 마이셀을 이룰 수 있다.
상기 금속 나노입자는 마이셀 내부에 있고, 금속 나노입자와 마이셀 사이에 내부 공극을 포함하는 것일 수 있다.
상기 금속 나노입자는 금(Au), 은(Ag), 백금(Pt), 구리(Cu), 주석(Sn), 알루미늄(Al), 니켈(Ni), 철(Fe), 팔라듐(Pd), 아연(Zn) 또는 티타늄(Ti) 을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 용어 "표면개질"은 재료의 표면으로부터 수십 ㎚ ~ 수 ㎛ 이내의 범위에 있는 표면만을 적당한 공정을 통해 특성을 변화시키는 것을 포함하며 다양한 물리·화학적 반응이 사용될 수 있고, 화학적 처리, 프라이머 처리, 연마 등을 포함할 수 있다. 구체적으로, 화학적 처리는 산, 알칼리 및 산화제 등으로 표면의 이물질을 제거하는 동시에 표면을 화학적으로 변화시켜 물리·화학적 특성을 개질시키는 방법일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 금속 나노입자는 치환 또는 비치환된 C1-30알킬로 표면개질된 것일 수 있다. 상기 금속 나노입자는 비치환된 탄소수 15 내지 30인 알킬, 예를 들면, 15 내지 30, 15 내지 20, 18 내지 30, 18 내지 25, 20 내지 30, 20 내지 25인 알킬로 표면개질된 것일 수 있다. 상기 C1-30알킬은 분지 또는 비분지된 알킬을 포함하는 것이고, 본 발명에서 금속 나노입자는 비치환된 비분지 알킬로 표면개질된 것일 수 있다.
상기 치환된 치환기는 아실, 방향족, 알콜, 알콕시, 아미노, 아미도, 니트로, 에테르, 에스테르, 할로겐, 케톤, 시아노, 카르복시, 히드록시, 티올, 알데하이드, 카보닐, 인, 황, 염소, 포스페이트, 포스파트, 포스피트, 술페이트, 디술피드, 옥시, 머캅토 및 히드로카르빌로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
일 구체예에 있어서, 상기 금속 나노입자와 치환 또는 비치환된 C1-30알킬의 결합부분은 싸이올기(-SH), 다이싸이올기(-CS2, -PS2, -CH(SH)(CH2CH2SH)), 아민기(-NH2, -NH), 포스포네이트기(-PO3H), 포스파이드기(-P), 포스핀옥사이드기 (-P=O), 카르복시기 (-COOH), 하이드록시기 (-OH), 이미다졸기 (-imidazole), 다이올기 (-diole)로 이루어진 그룹에서 하나 이상 선택된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 금속 나노입자에 결합된 알킬의 말단 사이의 간격은 1 내지 5nm인 것일 수 있으며, 상기 마이셀의 크기는 25 내지 100nm인 것일 수 있다. 상기 알킬의 말단은 금속입자와 결합된 부분이 아닌 다른 쪽 말단을 의미하는 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 양친매성 블록 공중합체는 폴록사머, 폴리(옥시에틸렌)-폴리(락틱산) 및 폴리(옥시에틸렌)-폴리카프로락톤 중 적어도 어느 하나를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 폴록사머는 Pluronic® F 127일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 마이셀은 세포 내 활성산소를 발생시켜 세포 자연사(apoptosis)를 유발시키는 것일 수 있다.
본 명세서에서 용어 "활성산소"는 산소 원자를 포함한 화학적으로 반응성 있는 분자로서, 생체 조직을 공격하고 세포를 손상시키는 산화력이 강한 산소를 의미할 수 있다. 이러한 산화적 스트레스에 의해 세포가 사멸될 수 있다.
본 명세서에서 용어 "세포 자연사"는 아폽토시스 또는 세포 사멸이라고도 하며, 세포 내 스트레스를 감지하면 자체적으로 사멸되는 것을 의미할 수 있다.
본 명세서에서 Cx-AuNPs@F-127는 알킬의 갯수가 임의인 것인 본 발명에 따른 마이셀 구조를 이루는 입자를 의미한다. 본 발명의 실시예에서는 x 가 독립적으로 5, 12 및 18을 나타내는 것일 수 있다.
다른 양상은 상기 마이셀을 포함하는 세포 내 나노입자 전달용 조성물을 제공한다.
일 구체예에 있어서, 상기 세포는 암세포인 것일 수 있다.
또 다른 양상은 금속 나노입자 표면에 치환 또는 비치환된 C1-30알킬이 결합된 전구체를 제조하는 단계; 및 상기 전구체 주변에 마이셀 구조를 이루도록 양친매성 블록 공중합체를 도입하는 단계를 포함하는, 세포 내 나노입자 전달용 조성물의 제조 방법을 제공한다.
또 다른 양상은 상기 마이셀을 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
용어 "약학적 조성물"은, 대상체로의 투여 시에 몇몇 유리한 효과를 부여하는 분자 또는 화합물을 지칭할 수 있다. 유리한 효과는 진단적 결정을 가능하게 하는 것; 질병, 증상, 장애 또는 병태의 개선; 질병, 증상, 장애 또는 질환의 발병의 감소 또는 예방; 및 일반적으로 질병, 증상, 장애 또는 병태의 대응을 포함할 수 있다.
상기 암은 폐암(예를 들면, 비소세포성 폐암), 췌장암, 위암, 간암, 대장암, 뇌암, 유방암, 갑상선암, 방광암, 식도암, 또는 자궁암일 수 있다. 또한, 상기 암은 항암제에 대한 내성(예를 들면, 다제 내성)을 갖는 위암, 유방암, 폐암, 간암, 식도암 및 전립선암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있다.
상기 약학적 조성물은 임상투여시 비경구로 투여가 가능하며 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다. 비경구 투여는 직장, 정맥, 복막, 근육, 동맥, 경피, 비강(Nasal), 흡입, 안구 및 피하와 같은 경구 이외의 투여경로를 통한 투여를 의미할 수 있다. 본 발명의 상기 약학적 조성물을 의약품으로 사용하는 경우, 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다.
상기 활성 성분을 개체 내로 전달할 수 있는 약학적 활성 성분의 종류는 항암제, 조영제(염료), 호르몬제, 항호르몬제, 비타민제, 칼슘제, 무기질 제제, 당류제, 유기산 제제, 단백질 아미노산 제제, 해독제, 효소 제제, 대사성 제제, 당뇨 병용제, 조직 부활 용약, 클로로필 제제, 색소제제, 종양 용약, 종양 치료제, 방사성 의약품, 조직 세포 진단제, 조직 세포 치료제, 항생 물질 제제, 항바이러스제, 복합항생물질제제, 화학요법제, 백신, 독소, 톡소이드, 항독소, 렙토스피라혈청, 혈액 제제, 생물학적 제제, 진통제, 면역원성 분자, 항히스타민제, 알레르기 용약, 비특이성 면역원 제제, 마취제, 각성제, 정신 신경 용제, 저분자 화합물, 핵산, 앱타머, 안티센스 핵산, 올리고뉴클레오타이드, 펩타이드, siRNA 및 마이크로 RNA 등을 포함할 수 있다.
상기 약학적 조성물을 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(Witepsol), 마크로골, 트윈(Tween) 61, 카카오지, 리우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
또한, 상기 약학적 조성물은 생리식염수 또는 유기용매와 같이 약제로 허용된 여러 전달체(Carrier)와 혼합하여 사용될 수 있고, 안정성이나 흡수성을 증가시키기 위하여 글루코스, 수크로스 또는 덱스트란과 같은 탄수화물, 아스코르브산(Ascorbic acid) 또는 글루타치온(Glutathione)과 같은 항산화제(Antioxidants), 킬레이트화제(Chelating agents), 저분자 단백질 또는 다른 안정화제(Stabilizers)들이 약제로 사용될 수 있다.
상기 약학적 조성물을 암을 예방 또는 치료하기에 유효한 양으로 개체에 투여하는 단계를 포함하여 개체에서 암을 치료할 수 있다.
상기 개체는 포유동물일 수 있다. 상기 포유동물은 사람, 개, 고양이, 소, 염소, 또는 돼지일 수 있다.
상기 투여는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여도 투여될 수 있다. 예를 들어 점안 투여, 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경피 패치투여, 경구 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여 등의 경로를 통해 투여될 수 있고, 구체적으로 점안 투여의 경로 등을 통해 목적하는 바에 따라 투여될 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, "치료" 또는 "치료하는" 또는 "완화하는" 또는 "개선하는"은 상호교환 가능하게 사용된다. 이들 용어는 치료 이익 및/또는 예방 이익을 포함하나 이들에 한정되지 않는 유리한 또는 요망되는 결과를 수득하는 방법을 지칭한다. 치료 이익은 치료 하의 하나 이상의 질병, 질환 또는 증상의 임의의 치료적으로 유의미한 개선 또는 그에 대한 효과를 의미한다. 예방 이익에 있어서, 조성물은 특정 질병, 질환 또는 증상이 발생할 위험이 있는 대상체에게 또는 질병, 질환 또는 증상이 아직 나타나지 않을지라도, 질병의 하나 이상의 생리학적 증상을 보고하는 대상체에게 투여될 수 있다.
용어 "유효량" 또는 "치료적 유효량"은 유리한 또는 요망되는 결과를 야기하기에 충분한 작용제의 양을 지칭한다. 치료적 유효량은 치료되는 대상체 및 병태, 대상체의 체중 및 연령, 병태의 중증도, 투여 방식 등 중 하나 이상에 따라 달라질 수 있으며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 또한, 상기 용어는 본원에 기술된 영상화 방법 중 임의의 것에 의한 검출을 위한 이미지를 제공할 용량에 적용된다. 특정 용량은 선택된 특정 작용제, 뒤따르는 투여 요법, 그것이 다른 화합물과 병용하여 투여되는지 여부, 투여 시기, 영상화되는 조직 및 그것을 운반하는 신체 전달 시스템 중 하나 이상에 따라 달라질 수 있다.
상기 세포 내 나노입자 전달용 조성물, 제포 내 나노입자 전달용 조성물의 제조 방법, 및 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물에서 언급된 용어 또는 요소 중 청구된 마이셀에 대한 설명에서 언급된 것과 같은 것은, 앞에서 청구된 마이셀에 대한 설명에서 언급된 바와 같은 것으로 이해된다.
일 양상에 따른 마이셀, 이를 포함하는 세포 내 나노입자 전달용 조성물, 세포 내 나노입자 전달용 조성물의 제조방법, 및 일 양상에 따른 마이셀을 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 의하면, 약제내성(drug-resistance)를 갖지 않고 효과적으로 암의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있는 효과가 있다.
도 1은 Cx-AuNPs@F-127가 세포 내에서 세포 자연사를 유발하는 과정을 도식화한 것이다.
도 2는 Cx-AuNP로부터 Cx-AuNPs@F-127가 만들어지는 것을 도식화한 것이다:
도 2a는 Cx-AuNP을 나타낸 그림이고; 도2b는 Cx-AuNPs@F-127를 나타낸 그림이다.
도 3은 Cx-AuNP 및 Cx-AuNPs@F-127의 투과 전자 현미경(TEM) 이미지 및 DLS 결과를 나타낸 그래프이다:
도 3a는 C5-AuNP의 TEM 이미지이고; 도 3b는 C12-AuNP의 TEM 이미지이며; 도 3c는 C18-AuNP의 TEM 이미지이고; 도 3d는 C5-AuNPs@F-127의 TEM 이미지이며; 도 3e는 C12-AuNPs@F-127의 TEM 이미지이고; 도 3f는 C18-AuNPs@F-127의 TEM 이미지이며; 도 3g는 C5-AuNP, C12-AuNP 및 C18-AuNP의 DLS 결과를 나타낸 그래프이고; 도 3h는 C5-AuNPs@F-127, C12-AuNPs@F-127 및 C18-AuNPs@F-127의 DLS 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 HeLa 세포에서의 Cx-AuNPs@F-127의 세포독성 실험 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 SS7 세포에서의 Cx-AuNPs@F-127의 세포독성 실험 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 SKBR3 세포에서의 Cx-AuNPs@F-127의 세포독성 실험 결과를 나타낸 그래프이다.
도 7은 MCF7/MDR 세포에서의 Cx-AuNPs@F-127의 세포독성 실험 결과를 나타낸 그래프이다.
도 8은 MCF7 세포에서의 Cx-AuNPs@F-127의 세포독성 실험 결과를 나타낸 그래프이다.
도 9는 HeLa, SS7, SKBR3, MCF7/MDR, MCF7 세포에서의 Cx-AuNPs@F-127의 세포독성 결과를 IC50 값으로 나타낸 표이다.
도 10은 C18-AuNPs@F-127 가 암세포에 대하여 내성을 보이는 확인하기 위하여 음성대조군으로는 독소루비신을 처리하여 MCF7/MDR과 MCF7 세포에서의 세포독성 실험 결과를 나타낸 그래프이다.
도 11은 알킬체인만 있는 경우의 세포독성 실험 결과를 나타낸 그래프이다.
도 12a는 Cx-AuNPs@F-127가 세포 내에 없는 경우를 도식화한 것이고; 도 12b는 C18-AuNPs@F-127가 세포 내에 있는 경우를 도식화한 것이며; 도 12c는 C18-AuNPs@F-127가 세포 내에 있는 경우의 TEM 이미지이고; 도 12d는 C5-AuNPs@F-127가 세포 내에 있는 경우를 도식화한 것이며; 도 12e는 C5-AuNPs@F-127가 세포 내에 있는 경우의 TEM 이미지이고; 도 12f는 GSH와 C5-AuNPs@F-127 또는 C18-AuNPs@F-127 를 섞어주고 DLS 결과를 나타낸 그래프 및 사진이다.
도 13은 세포 자연사를 관찰하기 위해 대조군, C5-AuNPs@F-127, C12-AuNPs@F-127 및 C18-AuNPs@F-127을 처리한 세포에서 형광 현미경으로 관찰한 이미지이다.
도 14는 세포 자연사를 관찰하기 위해 대조군, C5-AuNPs@F-127, C12-AuNPs@F-127 및 C18-AuNPs@F-127을 처리한 세포에서 유세포 분석을 통해 정량적으로 나타낸 것이다.
도 15는 Cx-AuNPs@F-127가 세포 자연사를 유발하여 세포 사멸을 일으키는 것인지 확인하기 위해 ELISA 실험한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 16은 상기 Cx-AuNPs@F-127의 세포 자연사 유발이 ROS 발생에 의한 것임을 확인하기 위해, 위해 대조군, C5-AuNPs@F-127, C12-AuNPs@F-127 및 C18-AuNPs@F-127을 처리한 세포에서 DHE (dihydroethidium dye) 염색을 수행하여 관찰한 결과를 나타낸 이미지이다.
도 17은 Cx-AuNPs@F-127rk 세포에서 스트레스를 유발하여 세포 자연사를 유발하게 되는지, TMRM(Tetramethylrhodamine, methyl ester) 분석을 수행한 결과를 나타낸 이미지이다.
도 18a는 Cx-AuNPs@F-127를 마우스에 처리한 경우 종양 크기가 작아진 결과를 나타낸 사진이고; 도 18b는 Cx-AuNPs@F-127를 마우스에 처리한 경우의 종양 부피를 측정한 그래프이며; 도 18c는 Cx-AuNPs@F-127를 마우스에 처리한 경우 마우스의 체중변화를 측정한 그래프이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실험재료
사염화수소 (III) 삼수화물 (Hydrogen tetrachloroaurate (III) trihydrate) 및 테트라-n-옥틸암모늄 브로마이드는 (Tetra-n-octylammonium bromide) Alfa Aesar에서 구입하였다. 1-옥타데칸에티올 (1-Octadecanethiol) 및 1-펜탄티올 (1-Pentanethiol)은 TCI에서 구입하였다. 소듐 보로하이드리드 (Sodium borohydride)는 Acros organics에서 구입하였다. 1-도데칸티올 (1-Dodecanethiol), 플루로닉® F 127 (Pluronic® F 127), 디하이드로에티디움 (Dihydroethidium, DHE), Hoechst 33258 및 티아졸릴 블루 테트라졸륨 브로마이드 (Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide)는 Sigma Aldrich에서 구입하였다. Annexin V Alexa Fluor?? 488 및 Propidium Iodide (PI)가 포함된 Dead Cell Apoptosis Kit는 Thermo Fisher Scientific에서 구입했다. 모든 화학 물질은 추가 정제 없이 사용하였다.
실시예 1. 알킬 체인이 결합된 금나노입자를 양친매성 블록 공중합체가 둘러싼 나노 약물 Cx-AuNPs@F-127의 제조
알킬체인이 결합된 금나노입자(AuNP)인 C5-AuNP, C12-AuNP 및 C18-AuNP는 공지된 브러스트-슈프린 제법 (Brust-Schiffrin method)에 따라 합성하였다. 알킬화된 AuNP를 친수성으로 만들기 위해, 고분자 화합물인 Pluronic® F 127로 알킬화된 AuNP을 둘러싸아 마이셀(micelle) 구조를 형성하였다. 10 mg의 알킬화된 AuNP를 1 mL 헥산(Hexane)에 용해시키고 500 mg의 Pluronic® F 127을 5 mL의 탈이온수에 용해시켰다. 용액을 함께 혼합하고 5 내지 10 분 동안 초음파 처리하여 용액을 균질하게 혼합하였다. 그 다음, 혼합물로부터 헥산을 증발시키고, 물에서 고분자로 코팅된 알킬화된 AuNP(Cx-AuNPs@F-127)를 수득하였다. AuNP의 농도는 UV 분광법에 의해 측정되었다.
도 2는 Cx-AuNP로부터 Cx-AuNPs@F-127가 만들어지는 것을 도식화한 것이다: 도 2a는 Cx-AuNP을 나타낸 그림이고; 도2b는 Cx-AuNPs@F-127를 나타낸 그림이다.
실험예 1. Cx-AuNPs@F-127의 특성 분석
상기 실시예 1에서 제조된 Cx-AuNPs@F-127의 특성을 분석하였다.
먼저, 투과전자현미경(Transmission Electron Microscopy, TEM) 및 동적 광 산란 (Dynamic Light Scattering, DLS)으로 Cx-AuNPs@F-127의 모양 및 크기를 관찰하였다. 그 결과, C5-AuNPs, C12-AuNPs 및 C18-AuNPs의 평균 입자 크기는 TEM으로 관찰하였을 때 2.6 ± 0.5 nm 를 보였고, DLS 측정 결과 C5-AuNPs는 4.5 ± 2.4 nm (PDI = 0.22), C12-AuNP는 3.7 ± 0.4 nm (PDI = 0.68), C18-AuNP는 5.4 ± 1.7 nm (PDI = 0.37)로 측정되었다(도 3a, b, c g). 또한, 수용액상 용해를 위해, 상기 소수성인 고분자 물질(Cx-AuNP)을 양친매성 블록 공중합체인 Pluronic® F-127와 자가 조립시켜, TEM 으로 관찰한 결과, 다수의 CX-AuNP가 하나의 미셀에 포함된 CX-AuNPs@F-127 구조를 확인하였다. 미셀의 평균 크기는 30 ± 15 nm 인 것으로 관찰되었으며(도 3c, 2d 및 2e), DLS로 추가로 확인하였다(도 3h).
도 3은 Cx-AuNP 및 Cx-AuNPs@F-127의 투과 전자 현미경(TEM) 이미지 및 DLS 결과를 나타낸 그래프이다:
도 3a는 C5-AuNP의 TEM 이미지이고; 도 3b는 C12-AuNP의 TEM 이미지이며; 도 3c는 C18-AuNP의 TEM 이미지이고; 도 3d는 C5-AuNPs@F-127의 TEM 이미지이며; 도 3e는 C12-AuNPs@F-127의 TEM 이미지이고; 도 3f는 C18-AuNPs@F-127의 TEM 이미지이며; 도 3g는 C5-AuNP, C12-AuNP 및 C18-AuNP의 DLS 결과를 나타낸 그래프이고; 도 3h는 C5-AuNPs@F-127, C12-AuNPs@F-127 및 C18-AuNPs@F-127의 DLS 결과를 나타낸 그래프이다.
실험예 2. 세포 생존율 분석
Cx-AuNPs@F-127의 항암 효과를 관찰하기 위해 세포 독성을 분석하였다.
구체적으로, 자궁 경부암 세포(human cervical cancer cell)인 HeLa 세포, 편평 암 세포(squamous cancer cell)인 SCC7 세포, 인간 유방암 세포(human breast cancer cell)인 SKBR3 세포, 인간 유방암 세포인 MCF7 및 다제 내성을 가지는 인간 유방암 세포인 MCF7/MDR 세포에 대한 C5-AuNPs@F-127, C12-AuNPs@F-127 및 C18-AuNPs@F-127의 세포 생존력은 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) (MTT)의 불용성 포르마잔(formazan)으로의 환원을 관찰하여 평가하였다. 10% FBS가 첨가된 DMEM에서 세포를 96-웰 플레이트에 웰당 5X103 세포의 밀도로 파종하고 밤새 배양한 후, 100 nM ~ 1 μM 농도 범위의 C5-AuNPs@F-127, C12-AuNPs@F-127 및 C18-AuNPs@F-127를 각각 세포에 처리하여 24 시간 동안 배양하였다. 대조군 실험은 HeLa 세포에서 Pluronic® F-127, 1-헥산티올(1-hexanethiol), 1-도데칸티올(1-dodecanethiol) 및 1-옥타데칸티올(1-octadecanetiol)로 수행하였다. 그 다음, 세포를 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) (MTT)와 배양한 뒤, 결정화된 포르마잔을 ELISA 플레이트 판독기로 595 nm에서 흡광도를 측정하여 정량화하였다. 결과는 생존력 백분율 = [(A550 (처리 된 세포)-배경값) / (A550 (처리되지 않은 세포)-배경값)] x 100으로 표현되었다.
그 결과, 모든 암 세포주에서 CX-AuNPs@F127 가 세포 독성을 보였고(도 4 내지 8), IC50 값은 C5-AuNPs@F-127 및 C12-AuNPs@F-127의 경우 ~ 5 μM이고, C18-AuNPs@F-127은 ~ 0.3 μM의 IC50 값을 나타냈다(도 9). 이는 CX-AuNPs@F127가 효과적으로 암세포를 사멸시킬 수 있음을 의미하며, C18-AuNPs@F-127가 C5-AuNPs@F-127 및 C12-AuNPs@F-127보다 약 16배 더 높은 독성을 가져 더 효과적으로 암세포를 사멸시킬 수 있음을 의미한다. 또한, C18-AuNPs@F-127가 내성 암세포에 대해서도 세포사멸을 효과적으로 유도하는지 확인하기 위하여, 암 세포 MCF7 과 내성암세포 MCF7/ADR 에 대해 독성 평가를 수행한 결과, 유사한 IC50 가 관찰되어, C18-AuNPs@F-127가 내성 암세포를 효과적으로 사멸시키는 것을 나타냈다(도 10). 반면, 음성 대조군으로 독소루비신(Doxorubicin)을 MCF7/ADR에 처리한 경우에는 내성을 보였다. 이는 C18-AuNPs@F-127가 다른 항암제와 달리 약제 내성을 갖지 않는다는 것을 의미한다.
CX-AuNPs@F127의 독성 원인을 조사하기 위해, 다양한 농도의 알킬 티올(alkyl thiol) 리간드 및 Pluronic® F-127 중합체를 24 시간 동안 처리한 후의 세포 생존율을 분석했다. 그 결과, 독성을 보이지 않았다(도 11).
상기와 같은 결과는, 치료제 AuNP는 명백한 독성을 나타내지만, CX-AuNPs @F-127에 포함된 것보다 훨씬 많은 양의 리간드 또는 Pluronic® F127 중합체는 세포 생존력에 영향을 줄 수 없음을 의미한다.
상기 결과를 바탕으로, 소수성인 AuNP와 세포질 사이의 다가 상호 작용이 독성과 관련이 있음을 확인하기 위해, 투과전자현미경(TEM)으로 관찰하였다. 그 결과, 도 12c 및 e에서 세포 TEM 이미지에 나타낸 바와 같이, C18-AuNP는 세포질에 잘 분산되어 있지만 C5-AuNP는 응집된 형태로 위치하였다.
이는 고농도의 글루타티온(Glutathione, GSH)과 C5-AuNPs@F-127 및 C18-AuNPs@F-127을 섞어주고 DLS 측정을 하였을 때, 글루타티온이 C5-AuNPs@F-127의 금 입자에 치환되어 물에서 침전되었으나 C18-AuNPs@F-127의 금 입자에는 치환이 되지 않음을 보여, 글루타티온 분자가 C5-AuNPs를 불안정하게하여 응집을 유도함을 나타낸 것과 일치했다(도 12f).
도 4는 HeLa 세포에서의 Cx-AuNPs@F-127의 세포독성 실험 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 SS7 세포에서의 Cx-AuNPs@F-127의 세포독성 실험 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 SKBR3 세포에서의 Cx-AuNPs@F-127의 세포독성 실험 결과를 나타낸 그래프이다.
도 7은 MCF7/MDR 세포에서의 Cx-AuNPs@F-127의 세포독성 실험 결과를 나타낸 그래프이다.
도 8은 MCF7 세포에서의 Cx-AuNPs@F-127의 세포독성 실험 결과를 나타낸 그래프이다.
도 9는 HeLa, SS7, SKBR3, MCF7/MDR, MCF7 세포에서의 Cx-AuNPs@F-127의 세포독성 결과를 IC50 값으로 나타낸 표이다.
도 10은 C18-AuNPs@F-127 가 암세포에 대하여 내성을 보이는 확인하기 위하여 음성대조군으로는 독소루비신을 처리하여 MCF7/MDR과 MCF7 세포에서의 세포독성 실험 결과를 나타낸 그래프이다.
도 11은 알킬체인만 있는 경우의 세포독성 실험 결과를 나타낸 그래프이다.
도 12a는 Cx-AuNPs@F-127가 세포 내에 없는 경우를 도식화한 것이고; 도 12b는 C18-AuNPs@F-127가 세포 내에 있는 경우를 도식화한 것이며; 도 12c는 C18-AuNPs@F-127가 세포 내에 있는 경우의 TEM 이미지이고; 도 12d는 C5-AuNPs@F-127가 세포 내에 있는 경우를 도식화한 것이며; 도 12e는 C5-AuNPs@F-127가 세포 내에 있는 경우의 TEM 이미지이고; 도 12f는 GSH와 C5-AuNPs@F-127 또는 C18-AuNPs@F-127 를 섞어주고 DLS 결과를 나타낸 그래프 및 사진이다.
실험예 3. 세포 자연사(apoptosis) 유발 분석
C5-AuNPs@F-127, C12-AuNPs@F-127 및 C18-AuNPs@F-127이 암 세포에서 세포 자연사(apoptosis)를 유도하는지를 관찰하기 위해, 프로피디움 아이오다이드 (Propidium Iodide, PI) 및 FITC-아넥신 V 염색 분석(FITC-annexin V staining assays)을 수행하였다.
구체적으로, HeLa 세포를 5 % CO2, 37 ℃조건에서 10 % FBS 및 1 % 페니실린 / 스트렙토마이신이 첨가된 DMEM (Life Technologies)에 10X103 세포 / 웰의 밀도로 Lab Tek II 슬라이드 챔버 상에 파종하여 밤새 배양하였다. 이어서, 세포를 5 μM의 C5-AuNPsF@127, C12-AuNPsF@127 및 C18-AuNPsF@127로 각각 처리하여 24시간 동안 배양하고, 대조군 세포에는 처리하지 않았다. 세포를 세척하고 37 ℃에서 15 분 동안 1X 아넥신 결합 완충액 중의 Alexa Fluor 488-접합된 아넥신 V(Alexa Fluor 488-conjugated annexin V) 및 프로피디움 아이오다이드 (PI)와 함께 배양하였다. 그 다음, 세포를 세척하고 DMEM 배지로 교체한 후, FITC 및 TRITC를 40X 대물렌즈의 다광자 LSM780 공 초점 현미경으로 관찰하였다. 녹색 형광은 FITC 컨쥬게이션된 아넥신 V의 포스파티딜 세린 (phosphatidyl serine, PS) 잔기에의 결합을 나타내며, 이는 세포 자연사의 초기 단계 동안 원형질 막의 내부에서 외부로 표면화된다. 한편, PI의 적색 형광은 원형질막이 손상된 자연사 또는 괴사 세포의 후기 단계를 나타낸다.
그 결과, HeLa 세포 내부의 녹색 및 적색 형광은 형광 현미경 이미지에서 관찰되었으며, 이는 C5-AuNPs@F-127, C12-AuNPs@F-127 및 C18-AuNPs@F-127이 HeLa 세포에서 조기 및 후기 세포 자연사를 유발함을 나타낸다(도 13).
HeLa 세포에서 유발된 세포 자연사는 추가로 FITC-아넥신 V / PI 염색 분석에 의한 유세포 분석을 통해 정량적으로 확인하였다.
구체적으로, 10 % FBS 및 1 % 페니실린 / 스트렙토마이신이 첨가된 DMEM (Life Technologies)에서 HeLa 세포를 6-웰 플레이트에 4 x 105 세포 / 웰의 밀도로 파종하여 5 % CO2, 37 ℃ 조건에서 밤새 배양하였다. 이어서, 세포에 5 μM의 C5-AuNPs@F-127, C12-AuNPs@F-127 및 C18-AuNPs@F-127를 각각 처리하여 24 시간 동안 배양하고 대조군 세포에는 아무런 처리를 하지 않았다. 세포를 세척한 후, 트립신 처리하고 원심 분리하여 수집하였다. 1X 아넥신-결합 완충액으로 세척한 후, 세포를 스탁 농도가 50 μg / mL 5 μL인 PI 및 스탁 농도가 200 μg / mL인 5 μL의 아넥신 V 를 함유하는 100 μL의 1X 아넥신-결합 완충액으로 37 ℃에서 15 분 동안 배양하였다. 그 후, 추가로 400 μL의 1X 아넥신-결합 완충액을 세포에 첨가하고, 530 및 610 nm의 방출 필터를 이용한 BD FACSVerse 유세포 분석기로 분석하였다. Cx-AuNPs@F-127를 처리 또는 비처리한 세포에서, 괴사성(necrotic) (FITC- / PI +) 및 세포 자연사(apoptotic) 세포 ((조기 세포 자연사 (FITC + / PI-) 또는 후기 세포 자연사 (FITC + / PI +)) 집단을 온전한 세포 (FITC- / PI-)와 비교한 백분율을 계산하였다.
그 결과, 세포 자연사 세포의 백분율은 Cx-AuNPs@F-127가 처리되지 않은 세포에 대해 동일하게 12 % 인 반면, HeLa 세포에 처리된 C5-AuNPs@F-127의 경우 27 %, C12-AuNPs@F-127의 경우 34 %였고, C18-AuNPs@F-127는 61 %였다(도 14). 이러한 결과는 3 개의 Cx-AuNPs@F-127가 모두 HeLa 세포의 세포 자연사를 유도함을 나타내고, 특히 이 중에서 C18-AuNPs@F-127가 세포 자연사를 가장 많이 유발하는 것에서 알 수 있듯이, AuNP에 부착된 알킬기의 사슬 길이의 증가할수록 세포 자연사가 잘 유발됨을 알 수 있다.
Cx-AuNPs@F-127가 세포 괴사(necrosis)가 아니라 세포 자연사(apoptosis)를 유발하는지 확인하기 위해, HeLa 세포에 C18-AuNPs@F-127와 양성대조군인 H2O2를 처리하여 ELISA로 TNF-alpha 발현을 비교하였다. 구체적으로, HeLa 세포를 10 % FBS 및 1 % 페니실린 / 스트렙토마이신이 첨가된 DMEM (Life Technologies)에서 96-well plate 에 1 X105 세포 / 웰의 밀도로 파종하여 5 % CO2, 37 ℃ 조건에서 밤새 배양하였다. 이어서, 세포에 5 μM의 C18-AuNPs@F-127와 양성대조군 4 mM 의 H2O2 를 24 시간 처리하였다. 세포를 세척한 후 TNF alpha Human ELISA Kit (Invitrogen) 을 이용하여 TNF-α 발현을 측정하였다. 그 결과, C18-AuNPs@F-127를 처리한 세포에서 세포 괴사 시 발생하는 TNF-alpha의 발현이 낮게 나타났다(도 15). 이러한 결과는 Cx-AuNPs@F-127가 세포 괴사가 아닌 세포 자연사에 의해 암세포 사멸을 유발함을 나타낸다.
도 13은 세포 자연사를 관찰하기 위해 대조군, C5-AuNPs@F-127, C12-AuNPs@F-127 및 C18-AuNPs@F-127을 처리한 세포에서 형광 현미경으로 관찰한 이미지이다.
도 14는 세포 자연사를 관찰하기 위해 대조군, C5-AuNPs@F-127, C12-AuNPs@F-127 및 C18-AuNPs@F-127을 처리한 세포에서 유세포 분석을 통해 정량적으로 나타낸 것이다.
도 15는 Cx-AuNPs@F-127가 세포 자연사를 유발하여 세포 사멸을 일으키는 것인지 확인하기 위해 ELISA 실험한 결과를 나타낸 그래프이다.
실험예 4. 활성산소(ROS) 발생 분석
상기 Cx-AuNPs@F-127의 세포 자연사 유발이 ROS 발생에 의한 것임을 확인하기 위해, DHE (dihydroethidium dye) 염색을 수행하여 세포 내 ROS를 측정하였다.
구체적으로, HeLa 세포를 10 % FBS 및 1 % 페니실린 / 스트렙토마이신이 첨가된 DMEM (Life Technologies)에서 Lab Tek II 슬라이드 챔버 상에 10X103 세포 / 웰의 밀도로 파종하여 5 % CO2, 37 ℃ 조건에서 밤새 배양하였다. 이어서, 세포에 5 μM의 C5-AuNPs@F-127, C12-AuNPs@F-127 및 C18-AuNPs@F-127를 각각 처리하여 24 시간 동안 배양하였고, 대조군 세포에는 아무런 처리도 하지 않았다. 그 후, 세포를 세척하고 나서 5 μM의 Dihydroethidium (DHE) 로 37 ℃에서 30 분 동안 처리하였다. 이어서, 세포를 세척한 후 핵 염색을 위해 30 분 동안 hoechst dye로 처리하였다. 그리고 나서, 세포를 세척하고 DMEM 배지로 교체한 후, FITC 및 TRITC를 40X 대물렌즈의 다광자 LSM780 공 초점 현미경으로 관찰하였다. DHE는 미토콘드리아 과산화물 검출에 자주 사용되고, 핵 DNA에 삽입되어, 과산화수소 존재시 에티디움 (ethidium) 이온으로 산화되어 적색 형광을 방출한다.
상기 실험결과, 대조군에 비해 Cx-AuNPs@F-127로 처리한 Hela 세포 내에서 강한 적색 형광이 관찰되었다(도 16). 이러한 결과는, Cx-AuNPs@F-127가 HeLa 세포에서 ROS 생성을 유도하여 세포 자연사를 유발한다는 것을 나타낸다.
추가적으로 Cx-AuNPs@F-127이 세포에서 스트레스를 유발하여 세포 자연사를 유발하게 되는지, TMRM(Tetramethylrhodamine, methyl ester) 분석을 수행하였다. HeLa 세포를 10 % FBS 및 1 % 페니실린 / 스트렙토마이신이 첨가된 DMEM (Life Technologies)에서 24-well plate 에 1 X105 세포 / 웰의 밀도로 파종하여 5 % CO2, 37 ℃ 조건에서 밤새 배양하였다. 이어서, 세포에 5 μM의 C5-AuNPs@F-127, C12-AuNPs@F-127 및 C18-AuNPs@F-127를 각각 6 시간 처리한 후 5 μM의 TMRM(Tetramethylrhodamine, methyl ester)으로 37 ℃에서 30 분 동안 처리하였다. 이어서, 세포를 세척한 후 핵 염색을 위해 30 분 동안 hoechst dye로 처리하였다. 그리고 나서, 세포를 세척하고 DMEM 배지로 교체한 후, 다광자 LSM780 공 초점 현미경으로 관찰하였다. TMRM 분석은 음전하의 미토콘드리아 막과 반응해 붉은색 형광을 띠는 성질을 이용한 것으로, TMRM의 붉은색 형광이 옅어진 경우 미토콘드리아가 손상된 상태를 의미한다. 따라서, 세포내 미토콘드리아가 손상되어 세포의 스트레스를 유발하는지 관찰하였다. 그 결과, C18-AuNPs@F-127이 대조군에 비해 형광이 줄어드는 것이 관찰되었다(도 17). 이는 Cx-AuNPs@F-127가 세포에서 스트레스를 유발하고 있음을 나타낸다.
도 16은 상기 Cx-AuNPs@F-127의 세포 자연사 유발이 ROS 발생에 의한 것임을 확인하기 위해, 위해 대조군, C5-AuNPs@F-127, C12-AuNPs@F-127 및 C18-AuNPs@F-127을 처리한 세포에서 DHE (dihydroethidium dye) 염색을 수행하여 관찰한 결과를 나타낸 이미지이다.
도 17은 Cx-AuNPs@F-127rk 세포에서 스트레스를 유발하여 세포 자연사를 유발하게 되는지, TMRM(Tetramethylrhodamine, methyl ester) 분석을 수행한 결과를 나타낸 이미지이다.
실험예 5. 생체 내( in vivo ) 항암 효과 분석
Cx-AuNPs@F-127의 생체 내 항종양 효능을 분석하기 위한 실험을 수행하였다.
구체적으로, Balb / c 누드 암컷 마우스는 한국의 Orient bio에서 구입했으며 모든 동물 실험은 울산과학기술원 (UNIST)의 기관 동물 관리 및 사용위원회가 승인한 프로토콜에 따라 수행하였다. SKBR3 세포를 1X PBS 에 3X106 세포 / 100 μL로 하여 0.1 mL 를 각각의 누드 마우스의 우측 측면 영역에 피하 주사하여 종양 이종 이식편 모델을 생성하였다. 디지털 캘리퍼(caliper)를 사용하여 주기적으로 종양의 성장을 모니터링 하였다. 종양 부피는 부피 = (종양 길이) x (종양 폭)2/2의 공식에 의해 계산되었다. 종양 크기가 200 mm3에 도달할 때, C18-AuNPs@F-127, Pluronic® F-127 및 PBS 를 각각 주사할 3 마리씩의 마우스를 선택하였고, 그보다 크거나 작은 종양을 가진 마우스는 선택하지 않았다. 이어서, 각 마우스에 C18-AuNPs@F-127를 100 μL, 10 mg / kg, Pluronic® F-127를 100 μL, 50 mg / kg, 1X PBS를 100 μL로 하여 매일 3주간 정맥 내 주사하였다. 그 후, 모든 그룹의 종양 크기 및 체중을 측정하고 비교하였다.
그 결과, F-127 처리군 및 대조군과 비교하여 C18-AuNPs@F-127이 처리된 누드 마우스의 경우 종양 성장이 현저히 감소하였다(도 18a, b). 이러한 결과는, C18-AuNPs@F-127이 유의한 항 종양 효과를 갖는다는 것을 나타낸다. 또한, F-127 처리군 및 대조군과 비교하여 체중의 유의한 변화가 관찰되지 않았으며(도 18c), 이는 C18-AuNPs@F-127의 부작용이 없음을 의미한다.
도 18a는 Cx-AuNPs@F-127를 마우스에 처리한 경우 종양 크기가 작아진 결과를 나타낸 사진이고; 도 18b는 Cx-AuNPs@F-127를 마우스에 처리한 경우의 종양 부피를 측정한 그래프이며; 도 18c는 Cx-AuNPs@F-127를 마우스에 처리한 경우 마우스의 체중변화를 측정한 그래프이다.

Claims (14)

  1. 내부에 하나 이상의 표면개질된 금속 나노입자를 포함하는, 코어-쉘 구조를 형성하는 양친매성 블록 공중합체를 포함하는 마이셀로서,
    상기 금속 나노입자는 금(Au), 은(Ag) 또는 백금(Pt)이고,
    상기 금속 나노입자는 비치환된 C15-30알킬로 표면개질된 것이며,
    상기 양친매성 블록 공중합체는 폴록사머, 폴리(옥시에틸렌)-폴리(락틱산) 및 폴리(옥시에틸렌)-폴리카프로락톤으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것인, 마이셀(micelle).
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 금속 나노입자와 마이셀 사이에 내부 공극을 포함하는, 마이셀.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 금속 나노입자와 비치환된 C15-30알킬의 결합부분은 싸이올기(-SH), 다이싸이올기(-CS2, -PS2, -CH(SH)(CH2CH2SH)), 아민기(-NH2, -NH), 포스포네이트기(-PO3H), 포스파이드기(-P), 포스핀옥사이드기 (-P=O), 카르복시기 (-COOH), 하이드록시기 (-OH), 이미다졸기 (-imidazole), 다이올기 (-diole)로 이루어진 그룹에서 하나 이상 선택되는 것인, 마이셀.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 금속 나노입자에 결합된 알킬의 말단 사이의 간격은 1 내지 5nm인, 마이셀.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 마이셀의 크기는 25 내지 100nm인, 마이셀.
  6. 청구항 1에 있어서, 상기 마이셀은 세포 내 활성산소를 발생시켜 세포 자연사(apoptosis)를 유발시키는, 마이셀.
  7. 청구항 1의 마이셀을 포함하는, 세포 내 나노입자 전달용 조성물.
  8. 청구항 7에 있어서, 상기 세포는 암세포인 것인, 세포 내 나노입자 전달용 조성물.
  9. 금속 나노입자 표면에 비치환된 C15-30알킬이 결합된 전구체를 제조하는 단계; 및
    상기 전구체 주변에 마이셀 구조를 이루도록 양친매성 블록 공중합체를 도입하는 단계를 포함하고,
    상기 금속 나노입자는 금(Au), 은(Ag) 또는 백금(Pt)이며,
    상기 양친매성 블록 공중합체는 폴록사머, 폴리(옥시에틸렌)-폴리(락틱산) 및 폴리(옥시에틸렌)-폴리카프로락톤으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것인, 세포 내 나노입자 전달용 조성물의 제조 방법.
  10. 청구항 1의 마이셀을 유효성분으로 포함하는, 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
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