KR102504114B1 - 칸나비노이드를 유효성분으로 함유하는 중증 급성 호흡기 증후군 코로나 바이러스 2에 대한 항바이러스 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 2019년 중국 우한에서 발생한 중증 급성 호흡기 증후군 코로나 바이러스 2(SARS-CoV-2)에 대한 항바이러스 조성물 및 이의 스크리닝 방법에 관한 것으로, 대마(Cannabis sativa L.) 잎 또는 미수정 암꽃의 추출물 또는 분획물, 및 이로부터 분리된 칸나비노이드(CBDs) 분자들은 SARS-CoV-2 Mpro에 대한 높은 결합력과 안정성을 갖는바 메인 프로테아제로서의 작용을 저해함으로써 중증 급성 호흡기 증후군 코로나 바이러스 2(SARS-CoV-2)를 치료하기 위해 단일 또는 다른 약물과 함께 공동 치료로 사용될 수 있는 유용한 선도 분자를 제공될 수 있다.

Description

칸나비노이드를 유효성분으로 함유하는 중증 급성 호흡기 증후군 코로나 바이러스 2에 대한 항바이러스 조성물{Antiviral Composition for SARS-CoV-2 containing cannabinoids}
본 발명은 2019년 중국 우한에서 발생한 중증 급성 호흡기 증후군 코로나 바이러스 2(SARS-CoV-2)에 대한 항바이러스 조성물 및 이의 스크리닝 방법에 관한 것으로, 대마(Cannabis sativa L.) 잎 또는 미수정 암꽃의 추출물 또는 이의 분획물; 및 이로부터 분리된 칸나비노이드(CBDs) 분자들은 SARS-CoV-2 Mpro에 대한 높은 결합력과 안정성을 갖는바 메인 프로테아제로서의 작용을 저해함으로써 중증 급성 호흡기 증후군 코로나 바이러스 2(SARS-CoV-2)를 치료하기 위해 단일 또는 다른 약물과 함께 공동 치료로 사용될 수 있는 유용한 선도 분자를 제공될 수 있다.
코로나 19(corona virus disease 19, COVID-19, 코로나바이러스감염증-19)는 2019년 12월 중국 우한에서 처음 발생한 뒤 전 세계로 확산된 호흡기 감염질환으로, 세계보건기구(WHO)가 2020년 1월 9일 해당 폐렴의 원인이 새로운 유형의 중증 급성 호흡기 증후군 코로나 바이러스 2(SARS-CoV-2, 국제바이러스분류위원회 2월 11일 명명)라고 밝히면서 병원체가 확인되었다.
중증 급성 호흡기 증후군 코로나 바이러스 2(SARS-CoV-2)는 사스 코로나바이러스(SARS-CoV)와 79%의 유전적 유사성을 공유하며, 흥미롭게도 알려진 코로나 바이러스 서열은 박쥐 코로나 바이러스 RaTG13과 98% 이상의 유사성을 공유합니다. 알파(α), 베타(β), 감마(γ) 및 델타(δ)는 코로나 바이러스 계열의 하위 범주를 나타내는데 사용된다.
SARS-CoV-2, MERS-CoV 및 SARS-CoV는 하부기도(lower respiratory tract)만 감염시켜 폐렴을 유발하는 반면에, 인간 코로나 바이러스 229E, NL63, OC43 및 HKU1은 일반적으로 감염 상부기도와 관련된 경미한 증상과 관련이 있다.
SARS-CoV-2 게놈은 바이러스가 인간을 감염시키고 복제하는 데 필요한 약 25 개의 단백질을 암호화하며, 그중 하나인 스파이크(S) 단백질은 안지오텐신 전환효소(Angiotensin-converting enzyme 2)를 인식하고 결합하여 바이러스 감염을 시작한다. 두 개의 프로테아제는 바이러스 및 인간 단백질을 절단하며, RNA 중합 효소는 바이러스 RNA 및 바이러스 RNA 절단 엔도리보뉴클레아제(viral RNA-cleaving endoribonuclease)를 합성한다. 특히, 바이러스 메인 프로테아제(Main Protease)라고 불리우는 ‘SARS-CoV-2 Mpro ’ 또는 ‘Mpro’ 는 코로나 바이러스 복제를 차단하는 최고의 분자 표적으로 간주되고 있으며, 이는 SARS-CoV-2 바이러스가 세포 내에서 증식하기 위해서는 생산한 단백질을 적절히 잘라주는 효소이다.
구체적으로, SARS-CoV-2 주요 프로테아제 MPro (3CLPro 라고도 함)는 바이러스 수명 주기에 주요 역할을 하는 것으로 알려져 있다. SARS-CoV-2 Mpro 프로테아제 및 파파인-유사 프로테아제(papain-like protease) 과정은 바이러스 RNA 폴리프로테인을 번역하며, SARS-CoV-2 Mpro는 폴리프로테인 리프리카아제 1ab(polyprotein replicase 1ab)의 Leu-Gln ↓ (Ser, Ala, Gly)의 11개 미만의 절단 부위를 인식하고 작용한다.
이에 SARS-CoV-2 Mpro 프로테아제에 효과적으로 달라붙어 작용을 방해할 수 있는 약물 후보군의 발굴이 필요한 실정이다. 아울러, SARS-CoV-2 Mpro 프로테아제의 억제는 인간 프로테아제에 대해 유사한 절단 특이성이 보고되지 않았기 때문에 인간에게 독성이 없을 가능성이 높다.
중증 급성 호흡기 증후군 코로나 바이러스 2(SARS-CoV-2)는 감염자의 비말(침방울)이 호흡기나 눈·코·입의 점막으로 침투될 때 전염된다고 알려져 있으며, 감염되면 약 2 ~ 14 일(추정)의 잠복기를 거친 뒤 발열(37.5℃) 및 기침이나 호흡곤란 등 호흡기 증상, 폐렴이 주증상으로 나타나지만 무증상 감염 사례도 드물게 나오고 있다.
구체적으로, 최근에 염증 분자(예: C reactive protein and pro-inflammatory cytokines, IL-1β, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, fibroblast growth factor, IFN, granulocyte-colony-stimulating factor, granulocyte-macrophage colony-stimulating factor, macrophage inflammatory protein 1 α, tumor necrosis factor and vascular endothelial growth factor)가 중증 급성 호흡기 증후군 코로나 바이러스 2 감염 환자의 폐 세포에서 상승함이 보고되었고, 폐에서 이러한 전염증성 사이토카인의 존재는 급성 호흡 곤란, 심각한 부상 및 사망과 관련이 있다고 보고되고 있다.
바이러스 복제는 숙주의 염증 및 면역 활성화와 관련이 있으며, 면역세포 (예 : B 세포, 자연살해세포, CD8 림프구, 단핵구, CD4 림프구 및 호중구)가 폐, 간, 비강 상피, 비장, 흉선, 신장 및 뇌에서 칸나비노이드 수용체 타입 2(cannabinoid receptor type 2, CB-2)가 높은 수준으로 발현된다는 것이 입증된 바 있다.
칸나비노이드수용체-2(cannabinoid’s receptor-2, CB-2)는 면역억제 및 세포자연사(apoptosis) 효과, 항염증 사이토카인 수준 증가, 전염증 사이토카인 생산 감소, 조절 T 세포 발현 유도로 가장 잘 알려져 있다. 또한 칸나비노이드수용체-2(CB-2)는 염증 과정과 대식세포 이동을 억제하고 바이러스 관련 감염에서 면역 관련 병리학적 과정을 줄이기 위한 치료 표적을 제공되고 있다. 칸나비노이드수용체-2(CB-2)는 면역 조절 진행에 영향을 미치며, 중증 급성 호흡기 증후군 코로나 바이러스 2(SARS-CoV-2) 감염 환자에서 전염증성 사이토카인(pro-inflammatory cytokine)이 증가하는바, 칸나비노이드수용체-2(CB-2) 및 SARS-CoV-2 Mpro가 치료 대상으로 간주될 수 있다고 보고되고 있다.
SARS-CoV-2 Mpro는 중증 급성 호흡기 증후군 코로나 바이러스 2(SARS-CoV-2)의 바이러스 복제에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있지만, 아직 중증 급성 호흡기 증후군 코로나 바이러스 2(SARS-CoV-2)에 대한 효과적인 표적 약물이나 백신은 개발되지 않은 상태로, 중증 급성 호흡기 증후군 코로나 바이러스 2(SARS-CoV-2) 치료 및 예방이 시급한 실정이다.
한편, 칸나비노이드(Cannabinoids, CBDs)는 칸나비노이드수용체-2 (cannabinoid’s receptor-2, CB-2)에 결합하여 작용제(agonist)로 작용하여 환자에게 높은 수준으로 존재하는 염증성 사이토카인을 억제한다.
이러한 배경 하에서, 본 발명자들은 종래에 칸나비노이드수용체-2 (CB-2)와 결합하여 염증을 감소시킨다고 알려진 칸나비노이드(Cannabinoids, CBDs)에 속하는 화합물 또는 분자를 대상으로 AUTODOCK 및 VINA를 사용하여 SARS-CoV-2 Mpro와의 결합 친화도를 평가하고, SARS-CoV-2 Mpro에 대한 형태적 안정성, 리간드 반응성 및 안정성에 대해 평가하여, SARS-CoV-2 Mpro에 대해 우수한 결합 찬화성을 갖는 선도 화합물 또는 분자를 선별하고, 이의 항바이러스 효과를 확인함으로써 중증 급성 호흡기 증후군 코로나 바이러스 2(SARS-CoV-2) 치료제로서의 가능성을 확인하고자 하였다.
1. Fasinu, P.S., Phillips, S., Elsohly, M.A., and Walker, L.A. (2016). Current status and prospects for cannabidiol preparations as new therapeutic agents. Pharmacotherapy: The Journal of Human Pharmacology and Drug Therapy 36, 781-796. 2. Gurung, A.B., Ali, M.A., Lee, J., Farah, M.A., and Al-Anazi, K.M. (2020). Unravelling lead antiviral phytochemicals for the inhibition of SARS-CoV-2 Mpro enzyme through in silico approach. Life Sciences, 117831.
본 발명자들은 SARS-CoV-2 RNA 복제 및 전사에서 관여하는 메인 프로테아제인 SARS-CoV-2 Mpro가 약물 표적에 있어 중추적인 역할을 함을 바탕으로, 밀도 기능적 접근법(density functional theory, DFT)과 분자 역학 시뮬레이션(molecular dynamic simulation)을 사용하여 대마 잎 또는 미수정 암꽃에서 추출한 32 개의 칸나비노이드(CBDs)와 SARS-CoV-2 Mpro 효소 간의 상호 작용에 대한 가상 스크리닝(virtual screening)을 수행하였고, 32 개의 칸나비노이드(CBDs) 분자들 중 대마(Cannabis sativa L.) 잎 또는 미수정 암꽃 추출물에서 분리된 Δ9-테트라하이드로칸나비놀(Δ9-tetrahydrocannabinol, IC50 = 10.25 μM) 및 칸나비디올(cannabidiol, IC50 = 7.91 μM)이 참조약물인 로피나비르(lopinavir), 클로로퀸(chloroquine) 및 렘데시비르(remdesivir)(8.16 - 13.15 μM의 IC50 범위) 보다 SARS-CoV-2에 대해 더 강력한 항바이러스 효과가 있다는 것을 확인하였다. 이외에도 △9-테트라하이드로칸나비놀산(△9-Tetrahydrocannabinolic acid), 칸나비놀(Cannabinol), 및 칸나비디올산(Cannabidiolic acid)이 있었다. 또한, 본 발명자들은 시험관 내(in vitro) 실험을 통해 Δ9-테트라하이드로칸나비놀 또는 칸나비디올의 항바이러스 효과를 확인하였는바, 이들은 중증 급성 호흡기 증후군 코로나 바이러스 2(SARS-CoV-2) 감염 환자를 치료를 위한 잠재적 약물 후보군이 될 수 있다는 것을 확인하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 대마(Cannabis sativa L.) 잎 또는 미수정 암꽃의 추출물 또는 이의 분획물을 포함하는 중증 급성 호흡기 증후군 코로나 바이러스 2(SARS-CoV-2)에 대한 항바이러스 조성물을 제공하는데 그 목적이 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 칸나비노이드를 유효성분으로 함유하는 중증 급성 호흡기 증후군 코로나 바이러스 2(SARS-CoV-2)에 대한 항바이러스 조성물을 제공하는데 그 목적이 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 칸나비노이드를 유효성분으로 함유하는 중증 급성 호흡기 증후군 코로나 바이러스 2(SARS-CoV-2) 감염증 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는데 그 목적이 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 칸나비노이드를 유효성분으로 함유하는 항바이러스 조성물을 세포에 처리하는 단계를 포함하는, 중증 급성 호흡기 증후군 코로나 바이러스 2(SARS-CoV-2)의 사멸 증진 방법을 제공하는 데에 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 중증 급성 호흡기 증후군 코로나 바이러스 2(SARS-CoV-2)에 대한 항바이러스 약물의 스크리닝 방법을 제공하는 데에 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 항바이러스 조성물 및 로피나비르(lopinavir), 클로로퀸(chloroquine) 및 렘데시비르(remdesivir)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 약물과 병용투여하여 중증 급성 호흡기 증후군 코로나 바이러스 2(SARS-CoV-2))의 사멸 증진 방법을 제공하는 데에 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 항바이러스 조성물 및 로피나비르(lopinavir), 클로로퀸(chloroquine) 및 렘데시비르(remdesivir)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 약물을 포함하는, 중증 급성 호흡기 증후군 코로나 바이러스 2(SARS-CoV-2) 감염증 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 데에 있다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 대마(Cannabis sativa L.) 잎 또는 미수정 암꽃의 추출물 또는 이의 분획물을 포함하는 중증 급성 호흡기 증후군 코로나 바이러스 2(SARS-CoV-2)에 대한 항바이러스 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 칸나비노이드를 유효성분으로 함유하는 중증 급성 호흡기 증후군 코로나 바이러스 2(SARS-CoV-2)에 대한 항바이러스 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 칸나비노이드를 유효성분으로 함유하는 중증 급성 호흡기 증후군 코로나 바이러스 2(SARS-CoV-2) 감염증 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 칸나비노이드를 유효성분으로 함유하는 항바이러스 조성물을 세포에 처리하는 단계를 포함하는, 중증 급성 호흡기 증후군 코로나 바이러스 2(SARS-CoV-2)의 사멸 증진 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 중증 급성 호흡기 증후군 코로나 바이러스 2(SARS-CoV-2)에 대한 항바이러스 약물의 스크리닝 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 항바이러스 조성물 및 로피나비르(lopinavir), 클로로퀸(chloroquine) 및 렘데시비르(remdesivir)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 약물과 병용투여하여 중증 급성 호흡기 증후군 코로나 바이러스 2(SARS-CoV-2))의 사멸 증진 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 항바이러스 조성물 및 로피나비르(lopinavir), 클로로퀸(chloroquine) 및 렘데시비르(remdesivir)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 약물을 포함하는, 중증 급성 호흡기 증후군 코로나 바이러스 2(SARS-CoV-2) 감염증 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 항바이러스 조성물은 중증 급성 호흡기 증후군 코로나 바이러스 2(SARS-CoV-2)에 대한 증식 억제 효과가 뚜렷하고 칸나비노이드수용체-2(CB-2)에 붙어 염증반응과 섬유증을 완화할 수 있어 치료제로서의 효과가 탁월하다.
또한, 본 발명에 따른 항바이러스 조성물을 이용함으로써, 중증 급성 호흡기 증후군 코로나 바이러스 2(SARS-CoV-2) 감염증의 조기 치료를 통해 2차 감염을 예방할 수 있고 환자의 사회복귀 시기를 앞당길 수 있으며, 감염병 확진자에 대한 이동경로 파악을 통한 접촉자의 2주간의 격리조치, 음식점, 영업점, 회사 등의 일시 폐쇄 등의 피해를 막아 경제 산업적인 손실을 최소화할 수 있다.
도 1은 SARS-CoV-2 Mpro의 리본(Ribbon) 구조로서, (A) CASTp 서버 (http://sts.bioe.uic.edu/castp/index.html)에 의해 예측된 리간드 결합 구조, (B) SARS-CoV-2 Mpro의 단단한 표면에 결합 공동, (C) Δ9-THC의 25 가지 도킹 실행 위치, (D) CASTp 서버에 의해 예측되는 포켓과 유사한 SARS-CoV-2 Mpro와 복합된 CBD모습을 나타낸 것이다.
도 2는 대마 잎 또는 미수정 암꽃의 추출물 및 5 개의 분리된 칸나비노이드(CBDs) 분자의 UHPLC 크로마토그램 결과이다.
도 3은 SARS-CoV-2 Mpro와 Δ9-THCA, Δ9-THC, CBN, CBD, CBDA 및 α-케토아미드 13b(양성대조군)의 리간드-단백질 상호 작용을 3D 형태로 나타낸 것으로. 녹색 점선은 SARS-CoV-2 Mpro와 리간드 사이의 잔기 간의 수소 결합을 나타낸 것이다.
도 4는 Δ9-THCA, Δ9-THC, CBN, CBD, CBDA 및 α-케토아미드 13b(양성대조군)와 SARS-CoV-2 Mpro의 리간드-단백질 상호 작용을 나타낸 것이다.
도 5는 프론티어 분자 궤도로서, A. △9-THCA, C. △9-THC, E. CBN, G. CBD 및 I. CBD에 대한 전하 및 원자 번호를 갖는 최적화된 분자 형상을 나타낸 것이고, B. △9-THCA, D. △9-THC, F. CBN, H. CBD 및 J. CBDA는 HOMO-LUMO를 탐색하는데 사용되는 프론티어 분자 궤도를 나타낸 것이다.
도 6은 대조군 약물인 로피나비르(lopinavir), 클로로퀸(chloroquine) 및 렘데시비르(ramdesivir)와 Δ9-THCA, Δ9-THC, CBN, CBD 및 CBDA의 용량-반응곡선 분석한 결과로서, 파란색 선은 SARS-CoV-2 감염 억제율(%)을 나타내고, 빨간색 선은 Vero 세포 생존율(%)을 나타낸 것이다(평균 ± SD는 중복 실험의 결과에서 계산됨).
도 7은 시간 경과에 따른 분자도킹(MD) 시뮬레이션에서 칸나비노이드(CBDs)와 SARS-CoV-2 Mpro 복합체 간의 상호 작용 안정성을 나타내는 플롯이다. 상세하게, (A-C) △9-THCA-SARS-CoV-2 Mpro 복합체의 결합에너지 프로파일, RMSD 및 위치에너지를, (D-F) CBN-SARS-CoV-2 Mpro 복합체의 결합에너지 프로파일, RMSD 및 위치에너지를, (G-I) CBDA-SARS-CoV-2 Mpro 복합체의 결합에너지 프로파일, RMSD 및 위치 에너지를, (J-L) △9-THC-SARS-CoV-2 Mpro 복합체의 결합에너지 프로파일, RMSD 및 위치에너지를, (M-O) CBD-SARS-CoV-2 Mpro 복합체의 결합에너지 프로파일, RMSD 및 위치 에너지를 나타낸 것이다.
도 8은 (A) △9-THC 및 (B) CBD에 대한 분자도킹(MD) 시뮬레이션의 실행 전후의 CBDs-SARS-CoV-2 Mpro 복합체의 결합 위치를 비교한 것이다.
도 9는 (A) SARS-CoV-2 및 주요 SARS-CoV-2 Mpro 바인딩 포켓의 구조적 특징을 나타낸 것이고, (B) 숙주의 폐 세포에서 SARS-CoV-2의 수명주기를 나타낸 것이며, SARS-CoV-2의 감염은 바이러스 스파이크 당 단백질과 세포 수용체 ACE2 사이의 결합에 의해 시작됨을 나타낸 모식도이다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명하기로 한다.
본 발명자들은 종래에 칸나비노이드수용체-2(CB-2)와 결합하여 염증을 감소시킨다고 알려진 칸나비노이드(Cannabinoids, CBDs)에 속하는 화합물 또는 분자를 대상으로 AUTODOCK 및 VINA를 사용하여 SARS-CoV-2 Mpro와의 결합 친화도를 평가하고, SARS-CoV-2 Mpro에 대한 형태적 안정성, 리간드 반응성 및 안정성에 대해 평가하여, SARS-CoV-2 Mpro에 대해 우수한 결합 친화성을 갖는 선도 화합물 또는 분자를 선별하였다. 다음으로 선별한 화합물 또는 분자에 대해 시험관 내(in vitro) 항바이러스 효과를 확인함으로써 SARS-CoV-2 억제제로서의 가능성을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다. 시험관 내(in vitro) 항바이러스 실험 결과, 대마(Cannabis sativa L.) 잎 또는 미수정 암꽃의 추출물에서 분리된 칸나비노이드에 속하는 5개의 분자 중 Δ9-테트라하이드로칸나비놀(T4)(IC50 = 10.25μM) 및 칸나비디올 (T22)(IC50 = 7.91μM) 분자는 로피나비르(lopinavir), 클로로퀸(chloroquine) 및 렘데시비르(remdesivir)(IC50 범위 8.16)와 대비하여 SARS-CoV-2(protease Mpro)에 대해 우수한 결합 친화성을 갖기에 SARS-CoV-2 Mpro 억제제(바이러스 복제 차단)로 작용할 수 있고, 염증 조절을 하는 칸나비노이드수용체-2(CB-2)와 결합하여 폐 염증 손상을 감소시킬 수 있어 중증 급성 호흡기 증후군 코로나 바이러스 2(SARS-CoV-2) 감염증 치료제로서의 가능성을 확인하였다. 이외에도 △9-테트라하이드로칸나비놀산(△9-Tetrahydrocannabinolic acid), 칸나비놀(Cannabinol), 및 칸나비디올산(Cannabidiolic acid) 분자가 있었다.
따라서, 본 발명에서 선별한 칸나비노이드는 단독 또는 다른 약물과 병용하거나 함께 사용하여 중증 급성 호흡기 증후군 코로나 바이러스 2(SARS-CoV-2) 감염증 치료에 선도적인 역할을 할 수 있을 것으로 예견된다.
본 발명은 대마(Cannabis sativa L.) 잎 또는 미수정 암꽃의 추출물 또는 이의 분획물을 포함하는 중증 급성 호흡기 증후군 코로나 바이러스 2(SARS-CoV-2)에 대한 항바이러스 조성물을 제공한다.
상기 대마 잎 또는 미수정 암꽃은 마약류관리에 관한 법률에 따라서 대마 학술연구자 허가를 식품의약품안전처와 서울지방식품의약품안전청에서 받아 대마 재배자로부터 정식 절차에 따라 양도·양수된 것을 사용한다.
본 발명의 용어, "추출물"은 대마 잎 또는 미수정 암꽃을 추출 처리하여 얻어지는 추출액, 상기 추출액의 희석액이나 농축액, 상기 추출액을 건조하여 얻어지는 건조물, 상기 추출액의 조정제물이나 정제물, 또는 이들의 혼합물 등, 추출액 자체 및 추출액을 이용하여 형성 가능한 모든 제형의 추출물을 포함한다.
상기 대마 잎 또는 미수정 암꽃을 추출하는 방법은 특별히 제한되지 않으며, 당해 기술분야에서 통상적으로 사용하는 방법에 따라 추출할 수 있다. 상기 추출 방법의 비 제한적인 예로는, 열수 추출법, 초음파 추출법, 여과법, 환류 추출법, 초임계 추출법, 마이크로웨이브 추출법 등을 들 수 있으며, 이들은 단독으로 수행되거나 2종 이상의 방법을 병용하여 수행될 수 있다.
본 발명에서 상기 대마 잎 또는 미수정 암꽃을 추출하는데 사용되는 추출 용매의 종류는 특별히 제한되지 않으며, 당해 기술 분야에서 공지된 임의의 용매를 사용할 수 있다. 상기 추출 용매의 비제한적인 예로는 물, C1 내지 C4의 알코올 및 이들의 혼합 용매 등을 들 수 있으며, 이들은 단독으로 사용되거나 1종 이상 혼합하여 사용될 수 있다.
본 발명의 용어, "분획물"은 여러 다양한 구성 성분들을 포함하는 혼합물로부터 특정 성분 또는 특정 성분 그룹을 분리하기 위하여 분획을 수행하여 얻어진 결과물을 의미한다.
본 발명에서 상기 분획물을 얻는 분획 방법은 특별히 제한되지 않으며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용하는 방법에 따라 수행될 수 있다. 상기 분획 방법의 비제한적인 예로는, 다양한 용매를 처리하여 수행하는 용매분획법, 일정한 분자량 컷-오프 값을 갖는 한외 여과막을 통과시켜 수행하는 한외여과 분획법, 다양한 크로마토그래피(크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)를 수행하는 크로마토그래피 분획법, 및 이들의 조합 등이 있다. 구체적으로, 본 발명의 대마 잎을 추출하여 얻은 추출물에 소정의 용매를 처리하여 상기 추출물로부터 분획물을 얻는 방법을 들 수 있다.
상기 추출물 또는 분획물은 추출 후 건조 분말 형태로 제조되어 사용될 수 있지만, 이제 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 △9-테트라하이드로칸나비놀산(△9-Tetrahydrocannabinolic acid, △9-THCA), 하기 화학식 2로 표시되는 △9-테트라하이드로칸나비놀(△9-Tetrahydrocannabinol, △9-THC), 하기 화학식 3으로 표시되는 칸나비놀(Cannabinol, CBN), 하기 화학식 4로 표시되는 칸나비디올(Cannabidiol, CBD), 및 하기 화학식 5로 표시되는 칸나비디올산(Cannabidiolic acid, CBDA)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 칸나비노이드(cannabinoids, CBDs)를 포함하는 것을 특징으로 하는, 중증 급성 호흡기 증후군 코로나 바이러스 2(SARS-CoV-2)에 대한 항바이러스 조성물을 제공한다.
[화학식 1]
Figure 112020103646646-pat00001
[화학식 2]
Figure 112020103646646-pat00002
[화학식 3]
Figure 112020103646646-pat00003
[화학식 4]
Figure 112020103646646-pat00004
[화학식 5]
Figure 112020103646646-pat00005
상기 칸나비노이드(CBDs)는 대마(Cannabis sativa L.) 잎 또는 미수정 암꽃의 추출물 또는 이의 분획물 유래일 수 있다.
상기 칸나비노이드(CBDs)는 SARS-CoV-2 Mpro 프로테아제(protease) 내 GLN189, MET165, 및 GLU166 잔기와 결합하여 프로테아제 작용을 억제할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 항바이러스 조성물을 유효성분으로 포함하는, 중증 급성 호흡기 증후군 코로나 바이러스 2(SARS-CoV-2) 감염증 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다. 칸나비노이드(CBDs)에 속하는 △9-테트라하이드로칸나비놀산(△9-Tetrahydrocannabinolic acid, △9-THCA), △9-테트라하이드로칸나비놀(△9-Tetrahydrocannabinol, △9-THC), 칸나비놀(Cannabinol, CBN), 칸나비디올(Cannabidiol, CBD), 및 칸나비디올산(Cannabidiolic acid, CBDA)은 칸나비노이드수용체-2(cannabinoid’s receptor-2, CB-2)에 결합하여 작용제(agonist)로 작용함으로써 CB-2 수용체에 붙어 염증성 사이토카인을 억제하여 염증반응과 섬유증을 완화할 수 있다.
또한, 본 발명은 항바이러스 조성물; 및 로피나비르(lopinavir), 클로로퀸(chloroquine) 및 렘데시비르(remdesivir)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 약물을 포함하는, 중증 급성 호흡기 증후군 코로나 바이러스 2(SARS-CoV-2) 감염증 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
상기 로피나비르(lopinavir)는 기존에 HIV 치료제이며, 클로로퀸(chloroquine)은 항말라리아제이고, 렘데시비르(remdesivir)는 에볼라 치료제로 개발한 항바이러스제로 알려진 약물이다.
상기 약학조성물은 약학조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제, 붕해제, 감미제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제, 향미제, 항산화제, 완충액, 정균제, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 첨가제를 추가로 포함할 수 있다.
구체적으로 담체, 부형제 및 희석제는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 사용할 수 있으며, 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제할 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용할 수 있다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 있으며 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제 등이 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기재로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
또한, 상기 약학조성물은 통상적인 방법에 따라 과립제, 산제, 피복정, 정제, 환제, 캡슐제, 좌제, 겔, 시럽, 즙, 현탁제, 유제, 점적제 또는 액제로 제형화하여 사용할 수 있다. 상기 약학조성물은 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 복강내, 흉골내, 경피, 비측내, 흡입, 국소, 직장, 경구, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 대상체로 투여할 수 있다.
상기 칸나비노이드(cannabinoids, CBDs)의 바람직한 투여량은 대상체의 상태 및 체중, 질환의 종류 및 정도, 약물 형태, 투여경로 및 기간에 따라 달라질 수 있으며 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 본 발명의 일실시예에 따르면 이에 제한되는 것은 아니지만 1일 투여량이 0.01 내지 75 mg, 구체적으로는 10 내지 75 mg 일 수 있다. 투여는 하루에 한 번 투여할 수도 있고 수회로 나누어 투여할 수도 있으며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 항바이러스 조성물을 유효성분으로 포함하는 용액을 세포에 처리하는 단계를 포함하는, 중증 급성 호흡기 증후군 코로나 바이러스 2(SARS-CoV-2)의 사멸 증진 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 항바이러스 조성물; 및 로피나비르(lopinavir), 클로로퀸(chloroquine) 및 렘데시비르(remdesivir)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 약물과 병용투여하여 중증 급성 호흡기 증후군 코로나 바이러스 2(SARS-CoV-2)의 사멸 증진 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 (a) SARS-CoV-2 Mpro 프로테아제 내 GLN189, MET165, 및 GLU166 잔기와 결합하는 약물 후보물질을 선별하는 단계 및 (b) 상기 (a) 단계의 약물 후보물질과 대조물질과 비교하여 분자 결합 친화도(kcal/mol)가 우수한 약물 후보물질을 다시 선별하는 단계를 포함하는, 중증 급성 호흡기 증후군 코로나 바이러스 2(SARS-CoV-2)에 대한 항바이러스 약물의 스크리닝 방법을 제공한다.
상기 대조물질은 로피나비르(lopinavir), 클로로퀸(chloroquine) 및 렘데시비르(remdesivir)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상일 수 있으나, 반드시 이에 제한되는 것은 아니다.
따라서, 본 발명에 따른 항바이러스 조성물은 중증 급성 호흡기 증후군 코로나 바이러스 2(SARS-CoV-2)에 대한 증식 억제 효과가 뚜렷하고 칸나비노이드수용체-2(CB-2)에 붙어 염증반응과 섬유증을 완화할 수 있어, 바이러스 증식 억제 및 사이토카인 폭풍과 같은 염증 치료에 모두에 효과가 있어 중증 급성 호흡기 증후군 코로나 바이러스 2(SARS-CoV-2) 치료제로서 널리 이용될 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
<실험예>
하기 실험예들은 본 발명에 따른 각각의 실시예에 공통적으로 적용되는 실험예를 제공하기 위한 것이다.
<재료 및 방법>
1. SARS-CoV-2 M pro 단백질 및 리간드 수집
가상 스크리닝을 위해 CASTp 서버 (http://sts.bioe.uic.edu/)를 사용하여 활성 사이트를 예측하였다. Schrodinger의 suite 에서 Protein preparation wizards 을 사용하여 표적 단백질을 준비하고 정제하였다.
과량의 공결정화 물 분자(co-crystallizing water molecules)가 삭제되고 적절한 수의 수소 원자가 추가되었다. 32 개의 칸나비노이드(CBDs)의 2D 구조는 PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)에서 시뮬레이션 설명 포맷(SDF)으로 다운로드 하였다.
2. 리간드 및 구조 기반 가상 스크리닝 준비
칸나비노이드(CBDs)는 Schrodinger의 suite의 LigPrep 도구를 사용하여 준비하였고, 밀도 기능적 접근법(density functional approach)을 사용하여 최소에너지로 최적화하였다. OPLS 2005 force field를 사용하여 본드 순서와 형태를 개선하고 최소화하였다. 이러한 준비된 리간드 라이브러리는 구조 기반 가상 스크리닝(structure-based virtual screening) 통해 받았으며, CASTp 서버를 사용하여 SARS-CoV-2 Mpro의 활성 부위를 예측하였다.
SARS-CoV-2 Mpro의 활성 포켓(active pocket)은 SARS-CoV-2 Mpro와 함께 VINA에 의한 25 회 실행하여 확인하였다(도 1).
예측된 활성 부위에서의 분자 형태 안정성은 CASTp 서버에 의해 예측된 부위를 통해 확인할 수 있었다. 리간드(ligand)는 단단한 개체로 처리된 반면, 수용체(receptor)는 유연한 개체로 처리되었다.
도킹(docking) 연구는 결과의 신뢰성, 유효성 및 재현성을 보장하기 위해 두 가지 도킹 프로그램을 수행하였다. 구체적으로, 도킹 프로그램인 AUTODOCK (Journal of computer-aided molecular design 24, 417-422) 및 VINA (Journal of computational chemistry 31, 455-461)를 이용하여 칸나비노이드(CBDs)와 SARS-CoV-2 Mpro 간의 결합에너지 및 상호 작용을 계산적 접근법(computational approach)을 사용하여 분석하였다(Journal of computer-aided molecular design 24, 417-422). 아울러, 칸나비노이드(CBDs)와 단백질의 상호작용을 시각화하기 위해 BIOVIA Discovery Studio Visualizer를 사용하였다.
3. 분자 동역학(MD) 시뮬레이션 및 에너지 계산
대마 잎 추출물에서 분리된 칸나비노이드(CBDs)에 속하는 5개의 분자 중 Δ9-THCA, Δ9-THC, CBN, CBD 및 CBDA를 대상으로 SARS-CoV-2 Mpro 에 대한 도킹 형태의 안정성을 확인하고자 하였다. 구체적으로, 분자 동역학적 시뮬레이션로서 SAMSUNG Intel (R) Core (TM) i5-CPU, 4GB RAM system, Windows 7 enterprise version (64)을 사용하는 YASARA dynamic software를 사용하였다.
이때 칸나비노이드 복합체의 최상의 도킹 결합 형태는 SARS-CoV-2 Mpro에 대한 결합 안정성을 통해 평가하였다.
칸나비노이드 복합체의 시뮬레이션 셀은 주기적인 셀 경계를 사용하여 정의되었으며, 밀도 0.997 g/L에서 물 용매로 채워졌다. 전체 시스템에 주기적인 시뮬레이션의 셀 경계 크기를 X = 61.30 A°, Y = 82.84 A°, Z = 52.14 A°로 설정하였다. 전하의 중성화를 위해 나트륨 및 염화 이온을 무작위로 배치하였다. Pka 값은 Asp, Glu, His 및 Lys 잔기의 측쇄에 대해서만 예측하였다.
AMBER14 분자 동역학적 힘의 영역(AMBER14 molecular dynamic force field)은 생리학적 조건 298K, pH 7.4 및 0.9% NaCl 하에서 MD 시뮬레이션을 통해 선택하였다. 시스템 에너지는 초기에 가파른 하강을 최소화하였고, 앞서 설명한 대로 이어서 수행하였다.
20 ns 이상의 MD 시뮬레이션은 일정한 온도와 압력에서 수행되었으며, 분자도킹(MD) 궤도는 추가 분석을 위해 250 ps 동안 저장되었다. 이러한 분자도킹(MD) 궤도(trajectory)는 YASARA 템플릿 파일( "md_analysis.mcr")을 사용하여 분석하였다(Krieger and Vriend, 2014). 또한, 복합체의 결합에너지 형태는 다른 YASARA 템플릿 파일( "md_analyzebindenergy.mcr")을 사용하여 분석하였다.
모델의 평균 형태 안정성은 시뮬레이션과 평균제곱근편차(RMSD)를 통해 추정되었다. YASARA 매뉴얼에 따르면, 자유결합에너지는 다음과 같이 엔트로피의 개입없이 계산된다. YASARA는 포지티브 결합에너지를 제공하므로 더 많은 포지티브 에너지는 선택된 역장에서 수용체와의 유리한 결합을 나타내는 반면, 네거티브 결합에너지는 약한 결합을 나타낸다.
분자도킹(MD) 시뮬레이션으로 얻은 궤도 분석 데이터는 SigmaPlot 10.0(SigmaPlot, 2006)을 사용하여 얻었다. CBD/SARS-CoV-2 Mpro 결합 형태는 Discovery Studio 시각화 소프트웨어를 사용하여 시각화하였다.
4. 밀도 기능적 접근법(DFT)에 의해 결정된 칸나비노이드(CBDs)의 구조적 안정성
프론티어 분자 궤도(Frontier molecular orbitals, FMO), 즉 HOMO (최고 점유 분자 궤도) 및 LUMO(최저 비점유 분자 궤도)는 밀도 기능적 접근법(DFT)을 사용하여 평가하였다.
Δ9-THCA, Δ9-THC, CBN, CBD 및 CBDA의 HOMO 및 LUMO를 결정하고, 이에 대한 HOMO-LUMO 에너지 갭은 다음 공식을 이용하여 계산하였다.
[수학식 1]
Figure 112020103646646-pat00006
화학적전위(Chemical potentials, μ) 및 화학적경도(chemical hardnesses, η)는 HOMO 및 LUMO와 관련된 에너지를 사용하여 계산하였다.
[수학식 2]
Figure 112020103646646-pat00007
[수학식 3]
Figure 112020103646646-pat00008
일반적으로 음의 EHOMO 값(negative EHOMO values)으로 정의되는 이온화전위(ionization potentials, I)를 사용하여, 전기음성도(Electronegativity, χ) 및 친전자성(electrophilicity, ω)을 계산하였다. 또한, 전자친화도(electron affinities, A)는 음의 ELUMO 값과 같도록 정의하였다.
[수학식 4]
Figure 112020103646646-pat00009
5. 칸나비노이드(CBDs) 추출을 위한 실험 절차
분취용 HPLC(Preparative HPLC)는 Phenomenex Luna C18 컬럼(250 x 21.2 mm, 10 μm)을 사용하여 자외선 검출기(220 nm)가 장착된 LC-Forte/R (YMC, USA)에서 수행하였고, 세미-분취용 LC(semi-preparative LC)(Gilson, USA)는 굴절률(RI) 검출기와 Phenomenex Luna C18(2) 컬럼 (250 × 10 mm, 5 μm)을 사용하여 수행하였다.
NMR 스펙트럼은 클로로포름-d(chloroform-d)에서 Varian Superconducting FT-NMR System(1H 및 13C 은 각각 500 및 125 MHz에서 수행함)를 통해 기록하였다. 클로로포름-d(chloroform-d)에서 양성자와 탄소 스펙트럼의 화학적 이동을 확인하였으며, 피크는 각각 7.26 ppm 및 77.0 ppm에서 잔류 용매 피크가 나타났다.
초고성능 액체크로마토그래피(UPLC) ESI 질량 분석법은 Shimadzu LCMS-2020 시스템을 사용하여 수행하였다. 청삼(Korean hemp, Cannabis sativa L.)은 식품의약품안전처와 서울지방식품의약품안전청의 규정된 양도/이전 승인 절차(승인번호 1564)에 따라 협회(경상북도 안동시)로부터 수득하였다. 2019년 7월에 청삼 잎을 수확하여 자연 건조하고, 잘게 썰어 상온에서 에탄올(200 ml)로 2 회 추출하여 여과하여 얻은 것을 사용하였다. 이렇게 얻은 에탄올 추출물(1.64 g)을 물에 현탁시킨 다음 연속적으로 헥산을 이용하여 분획하여 잔류물 720 mg을 수득하였다.
헥산:에틸아세테이트 단계적 구배(F1-10:0, F2-25:1, F3-10:1 및 F4-0; 각 200 ml)를 사용하여 실리카 개방형 컬럼크로마토그래피(Silica open column chromatography)(Merck, 230 - 400 mesh, 2.0 x 10.0 cm ID)를 수행하였다. F2 (187 mg) 분획물을 물(A) 및 MeCN (B)의 구배 시스템 (60 분에 걸쳐 70 ~ 85% MeCN)을 사용하여 분취용 HPLC (Phenomenex Luna C18 column; 250 × 21.2 mm, 10 μm)을 수행하였다. 이때 220 nm UV 검출기를 사용하여 10 ml/min 유속으로 4 개의 하위 분획물(a-d)을 수득하였다. 각 하위 분획물에 대한 추가 정제는 4 ml/min 유속에서 70 ~ 85% MeCN 용리액으로 사용하여 세미-분취용 HPLC (Phenomenex Luna C18 (2); 250 × 10 mm, 5μm)에서 수행하였다. 순수한 화합물 △9-THCA (17.0 mg), △9-THC (48 mg), CBN (1.1 mg) 및 CBD (1.9 mg)를 얻었다(도 2).
또 다른 칸나비노이드인 CBDA를 확보하기 위해 분획물 F3 (35 mg)을 220 nm UV 검출기를 사용하여 10 ml/min의 속도로 물 (A) 및 65 ~ 80% MeCN (B)로 60 분에 걸쳐 구배 용출시켜 분취용 HPLC(Phenomenex Luna C18 컬럼; 250 x 21.2 mm, 10 μm)로 추출하였다. 다음으로 이를 4 ml/min의 유속에서 65 ~ 80% MeCN 구배를 사용하여 세미-분취용 HPLC(Phenomenex Luna C18 (2); 250 × 10mm, 5μm)를 이용하여 정제함으로써 순수한 CBDA (7.9 mg)를 수득하였다. NMR 스펙트럼 결과를 이전에 보고된 문헌(The Journal of Organic Chemistry 57, 3627-3631; An International Journal of Plant Chemical and Biochemical Techniques 15, 345-354)과 비교하여 5 개의 분리된 화합물을 확인하였다.
6. 칸나비노이드(CBDs) 분석
정성 및/또는 정량 분석을 위해, 용매탈기장치(DGU-20A), 바이너리펌프 (LC-30AD), 자동시료주입기(SIL-30AC), 시스템컨트롤러장치(CBM-20A), 및 광다이오드어레이검출기로 구성된 분석 역상 Shimadzu Nexera X2 UHPLC 시스템 (SPD-M20A)과 컬럼오븐장치(CTO-20AC)를 사용하였다. 정성분석을 위해 Shimadzu LCMS-2020 시스템을 사용하여 ESI-MS(Electrospray ionization (ESI)-mass spectrometry (MS))을 수행하였다. Phenomenex Luna Omega 극성 C18 컬럼 (150 x 2.1 mm, 1.6 μm)을 사용하였다. 이동상은 다음과 같이 용매 A (물) 및 용매 B (아세토 니트릴)를 이원 구배로 구성하여 실험하였다(초기: 70% B, 10.0 분: 85% B, 11.0 분 : 95% B, 및 15.0 분 : 70% B). 이때 유속은 0.3 mL/min으로 설정하였고, 검출 파장은 220 nm를 사용하였다.
7. SARS-CoV-2에 대한 칸나비노이드(CBDs)의 시험관 내(in vitro) 항바이러스 활성 효과 확인
칸나비노이드(CBDs)의 항바이러스 활성은 종래에 알려진 방법(Jeon, S., Ko, M., Lee, J., Choi, I., Byun, S.Y., Park, S., Shum, D., and Kim, S. (2020). Identification of antiviral drug candidates against SARS-CoV-2 from FDA-approved drugs. Antimicrobial Agents and Chemotherapy.)에 따라 수행하였다.
구체적으로, Mining (IM) software를 사용하여 바이러스 N 단백질과 세포핵의 이미지 공초점현미경을 사용하여 분석하였다. 용량-반응곡선(dose-response curve, DRC)은 각 화합물에 대해 생성하였고, 시험관 내 약물 스크리닝 분석을 위해 Vero 세포는 American Type Culture Collection(ATCC CCL-81)로부터 수득하였다. 세포는 1X Antibiotic-Antimycotic solution(Gibco)과 heat-inactivated fetal bovine serum(FBS)이 포함된 Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM; Welgene)에서 37℃, 5% CO2 분위기 하에 두었다. SARS-CoV-2(βCoV/KOR/KCDC03/ 2020)는 질병관리본부(KCDC)에서 제공받았으며, Vero 세포에서 SARS-CoV-2 바이러스는를 증식시켰다. 아울러, Vero cells plaque assays를 수행하여 바이러스 역가(titers)를 측정하였다. 한국파스퇴르연구소는 국립보건원(National Institute of Health, KNIH)에서 발행한 규칙에 따라 질병관리본부(KCDC)에서 사용하도록 승인된 실험실에서 BSL-3 (Biosafety Level 3) 제어 절차에 근거하여 본 연구를 지원하였다.
8. 약물 및 시약
앞서 설명한 추출 및 정제하여 얻은 칸나비노이드(CBDs)를 사용하였고, 렘데시비르(HY-104077)는 MedChemExpress (Monmouth Junction, NJ)에서, 로피나 르(LPV; S1380)는 SelleckChem (텍사스 주 휴스턴)에서, 클로로퀸은 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)에서 구입하였다. Anti-SARS-CoV-2 N 단백질 항체는 Sino Biological Inc.(Beijing, China)에서 구입했으며, Hoechst 33342 및 Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG (H+L) secondary antibody는 Molecular Probes에서 구입하였다. 또한, 정상 염소 혈청과 파라포름알데히드(PFA)(32% 수용액)는 각각 Vector Laboratories, Inc. (Burlingame, CA) 및 Electron Microscopy Sciences (Hatfield, PA)에서 구입하였다.
9. 면역형광법(immunofluorescence)에 의해 결정된 용량-반응곡선(Dose-response curve, DRC) 분석
용량-반응곡선(DRC) 분석은 종래에 알려진 방법대로 수행하였다(Jeon, S., Ko, M., Lee, J., Choi, I., Byun, S.Y., Park, S., Shum, D., and Kim, S. (2020). Identification of antiviral drug candidates against SARS-CoV-2 from FDA-approved drugs. Antimicrobial Agents and Chemotherapy). 간단히 말해, Vero 세포는 384-well, μClear plate(Greiner Bio-One)에서 1X Antibiotic-Antimycotic solution(Gibco)과 2% FBS를 포함하는 DMEM에 웰당 1.2 x 104 개 세포로 파종하고, 24 시간 동안 유지한 후, 세포에 0.05 - 100 μM 농도 범위의 화합물로 두 번 처리하였다. 9 점 용량-반응곡선(DRC)이 생성되었고. 바이러스 감염의 경우 플레이트를 BSL-3 격리 시설로 옮기고 SARS-CoV-2를 MOI 값이 0.0125 되도록 추가하였다. 다음으로, 세포를 4% PFA로 24 hpi에 고정하고 면역형광법 Operetta(Perkin Elmer)을 이용하여 측정하였다.
한국 파스퇴르 연구소 내 소프트웨어를 사용하여 획득한 이미지는 감염 비율과 세포수를 추정하는데 사용하였으며, 항바이러스 활성은 음성(0.5% DMSO) 및 양성대조군(mock)에 대해 표준화되었다. 용량-반응곡선(DRC)은 Prism 또는 7XLfit 4 소프트웨어를 사용하여 sigmoidal dose-response model인 Y = Bottom + (Top - Bottom) / (1 + (IC50 / X)Hillslope)을 사용하여 측정되었다. 마지막으로 IC50 값은 정규화된 활동 데이터 세트에 맞는 곡선을 측정되었다. IC50 및 CC50 값을 중복 측정하였으며, 각 분석의 품질은 변동계수(%CV) 및 Z'-factors를 사용하여 검증하였다.
10. 분석기법을 통한 분리된 칸나비노이드(CBDs) 동정
1) △ 9 -테트라하이드로칸나비놀산(△ 9 -Tetrahydrocannabinolic acid, △ 9 -THCA)
1H NMR (500 MHz, CDCl3, CHCl3 = 7.26):δ12.20 (1H, brs), 6.39 (1H, s), 6.26 (1H, s), 3.23(1H, d, J = 8.4 Hz), 2.98-2.93 (1H, m), 2.81-2.76 (1H, m), 2.18-2.17 (2H, m), 1.94-1.91 (1H, m), 1.71-1.68 (1H, m), 1.68 (3H, s), 1.56-1.58 (2H, m), 1.47-1.41 (1H, m), 1.44 (3H, s), 1.38-1.34 (4H, m), 1.11 (3H, s), 0.90 (3H, t, J = 5.2 Hz). 13C NMR (125 MHz, CDCl3, CDCl3 = 77.00): δ 176.2, 164.7, 159.7, 147.0, 133.9, 123.5, 112.6, 109.8, 102.3, 78.8, 45.6, 36.5, 33.4, 32.0, 31.3, 31.2, 27.4, 25.0, 23.3, 22.5, 19.5, 14.1. LRMS (ESI) m/z calcd for C22H29O4 357.21(M-H)-, found 357.20.
2) △ 9 -테트라하이드로칸나비놀(△ 9 -Tetrahydrocannabinol, △ 9 -THC)
1H NMR (500 MHz, CDCl3, CHCl3 = 7.26):δ6.30(1H,s), 6.27 (1H,s), 6.14 (1H,s), 4.78 (1H,s), 3.20 (1H, d, J = 8.4 Hz), 2.43 (2H, td, J = 6.4 and 2.0 Hz), 2.17-2.15 (2H, m), 1.94-1.88 (1H, m), 1.71-1.67 (1H, m), 1.68 (3H, s), 1.55 (2H, q, J = 6.0 Hz), 1.44-1.37 (1H, m), 1.41 (3H, s), 1.32-1.24 (4H, m), 1.09 (3H, s), 0.87 (3H, t, J = 5.6 Hz). 13C NMR (125 MHz, CDCl3, CDCl3 = 77.00): δ 154.7, 154.1, 142.8, 134.4, 123.7, 123.6, 110.1, 109.0, 107.5, 45.8, 35.5, 33.5, 31.5, 31.1, 30.7, 27.5, 25.0, 23.4, 22.5, 19.3, 14.0. LRMS (ESI) m/z calcd for C21H29O2 313.22(M-H)-, found 313.20.
3) 칸나비놀(Cannabinol, CBN)
1H NMR (500 MHz, CDCl3, CHCl3 = 7.26): δ8.17(1H, s), 7.16 (1H, d, J = 6.0 Hz), 7.08 (1H, d, J = 6.0 Hz), 6.45 (1H, s), 6.30 (1H, s), 5.18 (1H, brs), 2.51 (2H, t, J = 6.4 Hz), 2.40 (3H, s), 1.64-1.57 (2H, m), 1.61 (6H, s), 1.36-1.26 (4H, m), 0.90 (3H, t, J = 6.0 Hz). 13C NMR (125 MHz, CDCl3, CDCl3 = 77.00): δ 154.6, 153.0, 144.5, 136.9, 136.8, 127.6, 127.5, 126.3, 122.6, 110.8, 109.8, 108.6, 77.3, 35.6, 31.4, 30.5, 27.1, 27.1, 22.5, 21.5, 14.0. LRMS (ESI) m/z calcd for C21H25O2 309.19(M-H)-, found 309.20.
4) 칸나비디올(Cannabidiol, CBD)
1H NMR (500 MHz, CDCl3, CHCl3 = 7.26):δ6.28 (1H, brs), 6.16 (1H, brs), 5.99 (1H, brs), 5.57(1H, s), 4.66 (2H, s), 4.55 (1H, s), 3.86-3.83 (1H, m), 2.43 (2H, t, J = 6.0 Hz), 2.39 (1H, td, J = 8.8 and 2.0 Hz), 2.27-2.20 (1H, m), 2.12-2.07 (1H, m), 1.86-1.73 (2H, m), 1.79 (3H, s), 1.65 (3H, s), 1.55 (2H, q, J = 6.0 Hz), 1.35-1.23 (4H, m), 0.87 (3H, t, J = 6.0 Hz). 13C NMR (125 MHz, CDCl3, CDCl3 = 77.00): δ 149.4, 149.4, 143.0, 140.1, 124.1, 113.7, 110.8, 110.8, 109.8, 107.9, 46.1, 37.2, 35.5, 31.5, 30.6, 30.4, 28.4, 23.7, 22.5, 20.5, 14.0. LRMS (ESI) m/z calcd for C21H29O2 313.22(M-H)-, found 313.20.
5) 칸나비디올산(Cannabidiolic acid, CBDA)
1H NMR (500 MHz, CDCl3, CHCl3 = 7.26): δ11.85 (1H, s), 6.68 (1H, s), 6.28 (1H, s), 5.58 (1H, s), 4.56 (1H, s), 4.40 (1H, s),4.12-4.10 (1H, m), 3.10-2.90 (1H, m), 2.86-2.82 (1H, m), 2.41-2.38 (1H, m), 2.26-2.22 (1H, m), 2.12 (1H, d, J = 14.0 Hz), 1.87-1.76 (2H, m), 1.81 (3H, s), 1.73 (3H, s), 1.60-1.58 (2H, m), 1.36-1.34 (4H, m), 0.91 (3H, t, J = 6.0 Hz). 13C NMR (125 MHz, CDCl3, CDCl3 = 77.00): δ 176.5, 164.2, 161.0, 147.7, 147.1, 140.5, 123.8, 114.4, 112.0, 111.3, 102.5, 46.6, 36.6, 35.3, 31.9, 31.2, 30.1, 27.7, 23.7, 22.5, 18.8, 14.1. LRMS (ESI) m/z calcd for C22H29O4 357.21(M-H)-, found 357.20.
<실시예 1> SARS-CoV-2 M pro 와 칸나비노이드(CBDs)의 분자도킹(Molecular docking) 및 분자 상호 작용 매핑 확인
칸나비노이드(CBDs)와 SARS-CoV-2 Mpro 간의 분자 상호 작용을 조사하기 위해 알려진 32 개의 칸나비노이드(CBDs)에 대한 가상 스크리닝을 수행하였다(표 1). 표 S1은 SARS-CoV-2 Mpro에 대한 칸나비노이드(CBDs)(T1-T32)와 양성대조군(C1-C5)의 분자 결합 친화도를 나타낸 것이다.
[표 1]
Figure 112020103646646-pat00010
Figure 112020103646646-pat00011
Figure 112020103646646-pat00012
SARS-CoV-2 Mpro의 활성 사이트는 CASTp 서버를 통해 식별하였고 무작위 25 회 실행하여 확인하였다. 결과적으로 SARS-CoV-2 Mpro의 domain-I는 CBD 도킹을 위한 활성 포켓으로 할당되었음을 확인할 수 있었다(도 1). 이는 α-케토아미드(α-ketoamide) 13b의 결과와 일치하였다.
칸나비노이드(CBDs)에 속하는 모든 분자는 -5.67 내지 -7.62 kcal/mol (VINA)의 결합에너지(binding energy)로 SARS-CoV-2 Mpro와 결합하는 것으로 나타냈다(표 S1). 32 개 칸나비노이드(CBDs)의 재도킹은 AUTODOCK을 사용하여 수행되었으며 32 개 모두 -8.40 kcal/mol 과 -10.89 kcal/mol 사이의 결합에너지를 가졌다(표 1). 아울러, 분자도킹 안정성과 SARS-CoV-2 Mpro 잔기와의 상호 작용을 기초로 하여, 32 개의 칸나비노이드(CBDs) 중 Δ9-THCA, Δ9-THC, CBN, CBD 및 CBDA가 SARS-CoV-2 Mpro에 대해 안정적인 도킹과 결합을 나타냄을 확인할 수 있었다.(도 3 및 도 4).
Δ9-THCA, CBN 및 CBDA는 AUTODOCK에 의해 각각 -10.89, -10.42 및 -10.44 kcal/mol의 결합에너지를 가졌고, Δ9-THC 및 CBD는 -10.42 및 -10.53 kcal/mol의 결합에너지를 가졌으며, 양성대조군인 α-케토아미드 13b는 각각 -9.50 kcal/mol의 결합에너지를 가졌다.
Δ9-THC와 SARS-CoV-2 Mpro 사이의 상호 작용은 1 개의 수소 결합과 10 개의 π-π 결합 상호 작용 잔기를 포함한다(도 3).
CBD-SARS-CoV-2 Mpro 복합체는 다양한 아미노산 잔기와 2 개의 수소 및 10 개의 π-π 상호 작용을 보였습니다. 구체적으로, Δ9-THCA, CBN 및 CBDA는 각각 2 개, 1 개, 3 개의 수소 결합 및 아미노산 잔기와의 10 개, 8 개 및 8 개의 π-π 상호 작용을 보여 주었다.
여기서 중요하게 볼 것은 SARS-CoV-2 Mpro와 결합한 5 개 분자(Δ9-THCA, Δ9-THC, CBN, CBD 및 CBDA)와 양성대조군인 α-케토아미드 13b의 경우 SARS-CoV-2 Mpro 의 GLN189, MET165, GLU166 잔기와 상호 작용하다는 점이다. 이는 SARS-CoV-2 Mpro를 억제하기 위해 이들 잔기와의 상호 작용이 필요함을 시사한다.
상세하게, SARS-CoV-2 Mpro의 아미노산 잔기와 5 개의 선택된 칸나비노이드(CBDs) 분자 사이의 수소 결합, π-π 결합, 및 기타 분자 내 상호 작용은 다른 칸나비노이드(CBDs)분자와 대비하여 더 나은 입체 구조적 안정성을 갖음을 의미한다.
아울러, SARS-CoV-2 Mpro의 결합 포켓을 사용한 5 개의 칸나비노이드(CBDs)인 Δ9-THCA, Δ9-THC, CBN, CBD 및 CBDA의 결합은 5 개의 참조 화합물인 파비피라비르(favipiravir), 본두셀핀 D(bonducellpin D), 리바비린(ribavirin), 랄테그라비르(raltegravir), 및 α- 케토아미드(α-ketoamide) 보다 더 높은 도킹 점수를 나타냈다(표 1 및 표 2).
하기 표 2는 SARS-CoV-2 Mpro와 CBD의 분자 결합친화도(Molecular binding affinities)를 나타낸 것으로, 여기서 굵은 글꼴로 표시된 것은 공통 아미노산 잔기를 나타낸 것이다. Δ9-THCA, Δ9-THC, CBN, CBD 및 CBDA는 앞서 설명한 바와 같이 실험한 칸나비노이드(CBDs) 화합물이고 PC는 양성대조군을 의미한다.
[표 2]
Figure 112020103646646-pat00013
<실시예 2> 칸나비노이드(CBDs)의 흡수(absorption), 분포(distribution), 대사(metabolism) 및 배설(excretion) 프로필
에너지 최적화된 칸나비노이드(CBDs) 분자 선정을 위해, Schrodinger 소프트웨어를 사용하여 ADME(Absorption, distribution, metabolism, and excretion) 프로파일을 분석하는데 사용하였다. 모든 칸나비노이드(CBDs)는 Lipinski 규칙에 따라 허용 가능한 분자량, Lipinski’s violation, n-OHNH donors, n-OH acceptors, 및 n-ROTB를 나타냈으며(표 3), 이러한 칸나비노이드(CBDs)가 우수한 흡수 프로필(absorption profiles)과 약리학적 효과를 나타낼 가능성이 있음을 확인할 수 있었다. 하기 표 3은 칸나비노이드(CBDs)의 우수한 경구 생체 이용률 및 단백질 결합 매개 변수를 나타내는 약동학적 매개 변수를 나타낸 것이다.
[표 3]
Figure 112020103646646-pat00014
<실시예 3> 밀도 기능적 접근법(DFT)에 의해 결정된 칸나비노이드(CBDs)의 안정성 확인
밀도 기능적 접근법(DFT) 및 Gaussian program package를 이용하여 5 개의 칸나비노이드(CBDs) 분자에 대한 HOMO 대 LUMO 에너지 갭을 계산하였다. Δ9-THC 및 CBD 각각의 HOMO 궤도는 2,2-디메틸크로만-5-올(2, 2-dimethylchroman-5-ol) 및 메틸-1 ', 2', 3 ', 4'-테트라하이드로-[1,1'- 비페닐]-2, 6-디올링(methyl-1 ', 2', 3 ', 4'-tetrahydro-[1,1'-biphenyl]-2, 6-diolring) 모티프에 있었다(도 5).
에너지 갭(Energy gap)은 CBDA 보다 Δ9-THC 및 CBD 에서 훨씬 더 높은 것으로 나타났다. 그러나 Δ9-THC 및 CBD의 LUMO는 각각 3-프로필-6a, 7, 8, 10a-테트라하이드로-6H-벤조[c]크로멘-1-올(3-propyl-6a, 7, 8, 10a-tetrahydro-6H-benzo[c]chromen-1-ol) 및 (S)-4, 5'- 디메틸 -1 ', 2', 3 ', 4'- 테트라히드로-[1, 1'- 비페닐]-2, 6-디올[(S)-4, 5'-dimethyl-1', 2', 3', 4'-tetrahydro-[1, 1'-biphenyl]-2, 6 -diol] 모티프에 있었다(도 5).
Δ9-THCA, CBN 및 CBDA의 HOMO 궤도는 각각 카르복시산 그룹을 갖는 크로멘(chromene), 지방족 측쇄가 있는 크로멘(chromene)이 융합된 싸이클릭 링(cyclic ring), 및 디하이드록실 벤조산 그룹에 각각 위치하였다.
프론티어 에너지 궤도 갭이 작은 분자는 화학적으로 반응성이 높고, 극성이 높으며, 운동 안정성이 낮고, 프론티어 궤도 사이의 HOMO 대 LUMO 갭이 높으면 안정성이 높다는 것은 이미 잘 알려져 있다(표 4). 표 4는 양자 화학 매개 변수에 대한 칸나비노이드(CBDs)의 밀도 기능적 접근법(DFT) 계산 결과이다.
[표 4]
Figure 112020103646646-pat00015
화합물 Δ9-THC 및 CBD는 Δ9-THCA, CBN 및 CBDA 보다 HOMO 대 LUMO 에너지 갭이 더 높았으며, 이는 Δ9-THC 및 CBD가 더 안정적임을 나타낸다. 화학적경도 (Chemical hardness, η)는 화학 공정 중 전자구름의 왜곡에 대한 저항으로 정의되며 이는 화합물의 안정성을 나타내는데, 흥미롭게도 Δ9-THC 및 CBD의 화학적경도 (Chemical hardness, η) 값은 Δ9-THCA, CBN 및 CBDA 보다 높았는바 Δ9-THC 및 CBD가 가장 우수한 안정성을 보여주었다.
<실시예 4> SARS-CoV-2에 대한 칸나비노이드(CBDs)의 시험관 내(in vitro) 항바이러스 효과 평가
SARS-CoV-2에 대한 칸나비노이드(CBDs)의 시험관 내(in vitro) 항바이러스 효과를 평가하고자 하였다. 앞서 확인한 바와 같이 칸나비노이드(CBDs)에 속하는 5 개의 분자, 즉 Δ9-THCA, Δ9-THC, CBN, CBD 및 CBDA는 성공적으로 분리 및 정제하여 수득하였고(표 2 및 도 2), Vero 세포를 사용하여 시험관 내 항 바이러스 활성을 평가하였다.
사내(in-house) Image Mining (IM) software를 사용하여 바이러스 N 단백질과 세포 핵을 공초점 현미경로 관찰하고 칸나비노이드(CBDs) 분자들에 대해 용량- 응곡선(DRC)을 도출하였다(도 6). 본 실험에서는 로피나비르(lopinavir), 클로로퀸(chloroquine) 및 렘데시비르(ramdesivir)를 표준약물로 사용되었다. IC50 값은 각각 9.78, 8.17 및 13.16 μM이며, 이는 이전 연구 결과(Jeon, S., Ko, M., Lee, J., Choi, I., Byun, S.Y., Park, S., Shum, D., and Kim, S. (2020). Identification of antiviral drug candidates against SARS-CoV-2 from FDA-approved drugs. Antimicrobial Agents and Chemotherapy.)와 일치하였다.
칸나비노이드(CBDs) 분자들 중 Δ9-THC 및 CBD는 IC50 값이 각각10.25 및 7.91 μM 이였는바 SARS-CoV-2에 대한 잠재적 항바이러스 활성을 보인 반면, Δ9-THCA, CBN 및 CBDA의 경우 IC50 값이 각각 13.17, 11.07 및 37.61 μM 로 중간 정도의 항바이러스 활성을 나타냈다.
가장 활성적인 화합물 CBD는 12.50 μM (99.19%) 농도에서 SARS-CoV-2 바이러스의 높은 억제를 보였으며 Vero 세포 생존율은 97.46% 이였다(도 6). 또한 50μM 농도에서 숙주 세포 생존율이 급격히 감소함을 알 수 있었다. 따라서, 12.50 μM의 CBD는 시험관 내에서 세포 독성을 유발하지 않고 SARS-CoV-2를 억제하기에 안전한 것으로 간주될 수 있다.
한편, CBD를 하루에 0.3 mg/kg/day로 투여하는 것은 크론병(Crohn’s disease)에 효과적이라는 보고가 있다. 인간의 경우 CBD는 <1 ~ 50mg/kg/day의 광범위한 용량 범위에 걸쳐 실험을 진행한 바 있었다(Costiniuk, C.T., Saneei, Z., Routy, J.-P., Margolese, S., Mandarino, E., Singer, J., Lebouch
Figure 112020103646646-pat00016
, B., Cox, J., Szabo, J., and Brouillette, M.-J. (2019). Oral cannabinoids in people living with HIV on effective antiretroviral therapy: CTN PT028-study protocol for a pilot randomised trial to assess safety, tolerability and effect on immune activation. BMJ open 9.).
아울러, Δ9-THC는 CB1R 및 CBR2의 부분적 작용제 역할을 하며 CB2R을 통해 면역 및 항염증 효과를 유도하는 것으로 보고된 바 있다(Pertwee, R. (2008). The diverse CB1 and CB2 receptor pharmacology of three plant cannabinoids: Δ9-tetrahydrocannabinol, cannabidiol and Δ9-tetrahydrocannabivarin. British journal of pharmacology 153, 199-215.
미국 식품의약국(FDA)은 1985년에 화학요법으로 유발된 메스꺼움 및 구토 개선을 위해 Δ9-THC를 승인하였으며, 2018년에는 Dravet 증후군(Dravet syndrome), 소아 간질(pediatric epilepsy) 및 Lennox-Gastaut 증후군의 치료를 위해 CBD를 승인한 바 있다.
CBD는 인간면역결핍바이러스(HIV)뿐만 아니라 매일 10-20 mg/kg/day 및 1.7-10 mg/kg/day로 경구투여될 때 에볼라증후군에서도 면역 활성화를 제어할 수 있다고 보고된바 있다(Konikoff, F.M. (2017). Low-dose cannabidiol is safe but not effective in the treatment for Crohn’s disease, a randomized controlled trial. Digestive diseases and sciences 62, 1615-1620.).
특히, 최근에 호주 보건부(Australian Department of Health)의 치료제 관리부(Therapeutic Goods Administration)는 저용량의 CBD는 외상 후 스트레스 장애에 이차적인 불안 및 불면증 치료를 위해 이용될 수 있는데, 10세 아동의 경우 25-40 mg/day, 성인의 경우 50-75 mg/day로 경구 또는 흡입기 또는 기화로 투여할 수 있다고 제안한바 있다. 또한 CBD는 국소 및 전신 만성 통증 관리를 위해 1 mg/kg/일로 투여되었는바, CBD는 하루에 최대 60 mg 까지 안전하다고 보고된바 있다.
또한 100 mg의 CBD 또는 10.8 mg THC와 10 mg CBD의 조합이 건강한 지원자에게 안전하고 견딜 수 있다고 보고된바 있다(Expert Committee on Drug Dependence, W.H.O. (2017). Thirty-ninth Meeting, Geneva.).
<실시예 5> 분자도킹(Molecular Docking) 시뮬레이션을 통한 CBD-SARS-CoV-2 M pro 복합체의 안정성 확인
분자도킹(Molecular Docking, MD) 시뮬레이션을 이용하여 CBD-SARS-CoV-2 Mpro 복합체의 움직임 및 형태 안정성을 추가로 평가하였다.
결합에너지가 가장 높은 복합체는 시간이 지남에 따라 상호 작용을 식별할 수 있었다. 생성된 궤도(trajectories)를 분석하여, 리간드 결합에너지(ligand binding energies), 제곱 평균 제곱근 편차(root mean square deviation, RMSD) 및 20 ns MD 동안 총 잠재적 에너지(total potential energies)를 결정하였다.
분석 결과, Δ9-THC 및 CBD의 평균 결합에너지는 각각 164.73 및 93.10 kcal/mol 이었다. 이러한 양성 결합에너지는 CBD가 분자도킹(MD) 실행 동안 SARS-CoV-2 Mpro와 강하게 결합하였음을 시사한다. Δ9-THC-SARS-CoV-2 Mpro 및 CBD-SARS-CoV-2 Mpro 복합체는 각각 1500 및 500 ps 후에서 궤도의 평형을 나타냈으며, 20 ns 분자도킹(MD) 실행 동안 견고한 안정성을 나타냈다. 흥미롭게도 Δ9-THC 및 CBD는 SARS-CoV-2 Mpro와의 제곱 평균 제곱근 편차(RMSD)에 있어 분자도킹(MD) 시뮬레이션 실행 중에 추가 변동을 나타내지 않았다(도 7).
Δ9-THCA, CBN 및 CBDA 복합체를 사용하는 SARS-CoV-2 Mpro의 MD 시뮬레이션 안정성 프로파일은 도 7에 나타냈다. 여기서 CBN은 1300 ps에서 안정성을 나타내고 Δ9-THCA는 1100 ps에서 안정성을 나타냈다(도 8). 한편, CBDA 분자는 백본(backbone) 및 중원자(heavy atoms)의 제곱 평균 제곱근 편차(RMSD)에서 더 많은 변동을 나타냈다. 이러한 관찰은 CBDA-SARS-CoV-2 Mpro 복합체가 Δ9-THC-SARS-CoV-2 Mpro 및 CBD-SARS-CoV-2 Mpro 복합체보다 덜 안정적임을 의미한다. Δ9-THC-SARS-CoV-2 Mpro 및 CBD-SARS-CoV-2 Mpro 복합체의 잠재적 에너지는 선형 궤도를 나타냈다. 따라서 제곱 평균 제곱근 편차(RMSD) 및 결합에너지를 통해 20 ns 분자도킹(MD) 시뮬레이션 동안 Δ9-THC 및 CBD와 SARS-CoV-2 Mpro의 결합안정성을 갖음을 확인할 수 있었다.
<실시예 6> 칸나비노이드(CBDs)에 의한 SARS-CoV-2 억제 메커니즘
SARS-CoV-2의 구조적 특징은 스파이크 당단백질(spike glycoprotein, S-protein, S), 키모트립신 유사 주요 프로테아제(chymotrypsin-like main protease), SARS-CoV-2 Mpro, 파파인 유사 프로테아제(papain-like protease) 및 RNA-의존성 RNA 중합 효소(RNA-dependent RNA polymerase)와 같은 여러 단백질이 있으며, 이는 SARS-CoV-2 발달에 중요한 역할을 한다(도 9). 숙주 폐 세포에서 SARS-CoV-2의 생활사(life cycle)는 스파이크 당단백질과 세포수용체 ACE2 사이의 결합에 의해 시작된다. 스파이크 당단백질(spike glycoprotein, S-protein, S)은 엔도솜 경로를 통해 숙주세포와 바이러스 외피 융합을 촉진하여 SARS-CoV-2 RNA의 숙주세포로의 세포 방출 및 바이러스 게놈 RNA의 복제 다단백질 pp1a 및 1ab 로 번역을 수행한다. 그런 다음 단백질 분해효소에 의해 작게 절단한다. SARS-CoV-2 Mpro 및 파파인 유사 프로테아제는 다단백질 처리에 필수적이다. 나중에 소유전체 mRNA(subgenomic mRNA)는 중합효소에 의해 생성되며, 이 경로에서 T-helper 세포와 M1 전염증성 대식세포(M1 pro-inflammatory macrophages)는 폐 세포 내부에 염증을 일으키는 인터루킨(interleukins)을 분비한다.
결과적으로, SARS-CoV-2 Mpro 활성을 억제하면 바이러스 복제가 차단되는데, 중요한 것은 아직 SARS-CoV-2 Mpro와 유사한 인간 프로테아제가 보고되지 않았다는 점이다. 따라서 SARS-CoV-2 Mpro에 대한 억제제는 독성이 가능성이 낮다고 볼 수 있겠다.
한편 칸나비노이드(CBDs)는 폐에서 CB-2 수용체의 활성화를 촉발하고 면역 억제, 세포자연사(apoptosis)를 유도하고, 항염증성 사이토카인 수준을 증가시키며, 전염증성 사이토카인 생성 및 조절 T 세포(regulatory T cells)의 유도를 억제한다고 알려져 있다.
본 연구 결과에 따르면, 분자도킹, DFT, MD 시뮬레이션은 칸나비노이드(CBDs)가 SARS-CoV-2 Mpro와 단단히 결합하고 안정적인 복합체를 형성하는 것으로 나타났다. 특히 칸나비노이드(CBDs) 분자 중 CBD 및 △9-THC의 시험관내(in vitro) 항바이러스 활성에 따르면, SARS-CoV-2를 두 가지 방식으로 억제하는 것으로 나타났다. 즉, SARS-CoV-2 Mpro에 결합하여 억제하고, 칸나비노이드수용체-2(CB-2)에 결합하여 작용제 역할을 하여 폐 세포에서 전염증성 사이토카인(pro-inflammatory cytokines)을 감소시킬 수 있다는 점이다(도 9).
본 연구에서는 칸나비노이드(CBDs)가 칸나비노이드수용체-2(CB-2)에 결합하여 염증성 사이토카인의 효과를 억제하는바, SARS-CoV-2 복제에 필수적인 SARS-CoV-2 Mpro와 결합력이 강한 칸나비노이드(CBDs)를 가상 스크리닝 하고자 하였다. 32개의 칸나비노이드(CBDs) 중에서 △9-THCA 및 CBD은 밀도 기능적 접근법(DFT)을 통해 계산한 결과, HOMO-LUMO 에너지 갭이 다른 분자들 보다 더 높았으며, 이는 이러한 분자가 SARS-CoV-2 Mpro와 안정적으로 결합할 수 있음을 의미한다. 분자도킹(MD) 시뮬레이션에서도 Δ9-THC-SARS-CoV-2 Mpro 와 CBD-SARS-CoV-2 Mpro 복합체는 Δ9THCA, CBN 및 CBDA 복합체보다 더 나은 형태적 안정성을 보였다. 아울러, 시험관 내(in vitro) 항바이러스 효과가 우수함을 확인하였는바, Δ9-THC와 CBD가 SARS-CoV-2를 치료하기 위해 단일 또는 다른 약물과 함께 공동으로 사용될 수 있는 유용한 선도 분자임을 뒷받침한다. 본 연구는 인 실리코(in silico)와 시험관 내(in vitro)에서 수행하였으나, 향후 생체 내에서 CBD의 역할을 규명함으로써 SARS-CoV-2 치료제로 적극 활용될 수 있는 우수한 발명이다.

Claims (12)

  1. 하기 화학식 1로 표시되는 △9-테트라하이드로칸나비놀산(△9-Tetrahydrocannabinolic acid, △9-THCA), 하기 화학식 3으로 표시되는 칸나비놀(Cannabinol, CBN) 및 하기 화학식 5로 표시되는 칸나비디올산(Cannabidiolic acid, CBDA)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 칸나비노이드(cannabinoids, CBDs)를 포함하는 것을 특징으로 하는, 중증 급성 호흡기 증후군 코로나 바이러스 2(SARS-CoV-2)에 대한 항바이러스 조성물.
    [화학식 1]
    Figure 112022134299983-pat00017

    [화학식 3]
    Figure 112022134299983-pat00019

    [화학식 5]
    Figure 112022134299983-pat00021

  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 칸나비노이드는 대마(Cannabis sativa L.) 잎 또는 미수정 암꽃의 추출물 또는 이의 분획물 유래인 것을 특징으로 하는, 중증 급성 호흡기 증후군 코로나 바이러스 2(SARS-CoV-2)에 대한 항바이러스 조성물.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 칸나비노이드는 SARS-CoV-2 Mpro 프로테아제(protease) 내 GLN189, MET165, 및 GLU166 잔기와 결합하여 프로테아제 작용을 억제하는 것을 특징으로 하는, 중증 급성 호흡기 증후군 코로나 바이러스 2(SARS-CoV-2)에 대한 항바이러스 조성물.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중에서 선택된 어느 한 항의 항바이러스 조성물을 유효성분으로 포함하는, 중증 급성 호흡기 증후군 코로나 바이러스 2(SARS-CoV-2) 감염증 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  5. 제 4 항에 있어서,
    상기 항바이러스 조성물 내 칸나비노이드는 칸나비노이드수용체-2(cannabinoid’s receptor-2, CB-2)의 작용제(agonist)로 작용하여 염증성 사이토카인을 억제하는 것을 특징으로 하는, 중증 급성 호흡기 증후군 코로나 바이러스 2(SARS-CoV-2) 감염증 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  6. 제 4 항에 있어서,
    상기 항바이러스 조성물은 0.01 내지 75 mg/day 로 투여하는 것을 특징으로 하는, 중증 급성 호흡기 증후군 코로나 바이러스 2(SARS-CoV-2) 감염증 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  7. 삭제
  8. 제 1 항 내지 제 3 항 중에서 선택된 어느 한 항의 항바이러스 조성물을 유효성분으로 포함하는 용액을 세포에 처리하는 단계를 포함하는, in vitro에서 중증 급성 호흡기 증후군 코로나 바이러스 2(SARS-CoV-2)의 사멸 증진 방법.
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 제 1 항 내지 제 3 항 중에서 선택된 어느 한 항의 항바이러스 조성물 및 로피나비르(lopinavir), 클로로퀸(chloroquine) 및 렘데시비르(remdesivir)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 약물을 포함하는, 중증 급성 호흡기 증후군 코로나 바이러스 2(SARS-CoV-2) 감염증 예방 또는 치료용 약학 조성물.
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