KR102497997B1 - Biomarker for detecting Novichok and method for detecting Novichok using the same - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 노비촉 검출용 바이오마커 및 이를 이용한 노비촉의 검출방법에 관한 것으로, 구체적으로는 혈액 내 노비촉 검출을 위한 부티릴콜린에스터라제 유래의 바이오마커와 이를 이용하여 노비촉을 검출하는 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a biomarker for detecting Novichok and a method for detecting Novichok using the same, and specifically, a biomarker derived from butyrylcholinesterase for detecting Novichok in blood and a method for detecting Novichok using the same It is about.
노비촉(Novichok)은 새로운 유형의 유기인 신경작용제(organophosphorus nerve agent: OPNA, 이하 '신경작용제'와 '신경화학작용제'를 혼용하여 사용함)로서 콜린에스터라제(cholinesterase: ChE) 활성을 빠르게 비활성화하는 작용을 하고 가장 강력한 독극물 중의 하나이다. Novichok is a new type of organophosphorus nerve agent (OPNA, hereinafter 'nerve agent' and 'neurochemical agent' used interchangeably) that rapidly inactivates cholinesterase (ChE) activity It acts as a poison and is one of the most powerful poisons.
에틸(1-(디에틸아미노)에틸리덴)포스포아미도플루오리데이트(Ethyl (1-(diethylamino)ethylidene)phosphoramidofluoridate: A234)는 2018년 스크리팔 부녀 음독 사건에 사용되었고, 그 후 노비촉은 2020년 6월 화학무기금지협약(Chemical Weapons Convention, CWC) 목록에 새로운 신경작용제로 포함되었다. 이 신경작용제는 2020년 나발니 음독 사건에서 추가로 발견되었다. Ethyl (1-(diethylamino)ethylidene)phosphoramidofluoridate (A234) was used in the Skripal woman poisoning case in 2018, after which Novichok In June 2020, it was included as a new nerve agent on the Chemical Weapons Convention (CWC) list. This nerve agent was further discovered in the 2020 Navalni poisoning case.
종래 유기인 신경작용제로 알려진 사린(sarin: GB), 소만(soman: GD), 또는 신경독(VX)은 인간 아세틸콜린에스터라제의 세린(202Ser)과 반응하여 아세틸콜린의 분해를 억제함으로써 신경계의 기능 부전을 초래한다. 아세틸콜린에스터라제(AChE)와 부티릴콜린에스터라제(BChE)는 활성 중심에 세린 잔기가 포함된 세린 가수분해효소이다. 아세틸콜린에스터라제는 주로 신경 전달 물질인 아세틸콜린(ACh)을 아세틸과 콜린으로 가수분해하여 규칙적인 신경 기능을 가능하게 하는 역할을 하며, 종래 유기인 신경작용제에 의한 아세틸콜린에스터라제의 억제는 아세틸콜린의 축적을 초래하여 콜린성 신경 자극을 차단함으로써 마비, 질식 및 사망으로 이어진다. 노비촉 제제는 피해자 임상 보고서에 따르면 부티릴콜린에스터라제 활성을 억제하여 신경 독성을 나타내는 것으로 보고되었다.Sarin (GB), soman (GD), or neurotoxin (VX), conventionally known as an organic phosphorus nerve agent, reacts with serine (202Ser) of human acetylcholinesterase to inhibit the degradation of acetylcholine, thereby reducing the nervous system's cause dysfunction. Acetylcholinesterase (AChE) and butyrylcholinesterase (BChE) are serine hydrolases containing a serine residue in the active center. Acetylcholinesterase mainly serves to hydrolyze acetylcholine (ACh), a neurotransmitter, into acetyl and choline to enable regular nerve function, and inhibition of acetylcholinesterase by conventional organophosphorus nerve agents results in the accumulation of acetylcholine, which blocks cholinergic nerve impulses, leading to paralysis, asphyxiation and death. Novichok preparations have been reported to exhibit neurotoxicity by inhibiting the activity of butyrylcholinesterase, according to the victim's clinical report.
사린, 소만 등의 신경작용제는 피해자의 중독 여부를 확인하기 위한 바이오마커가 규명되어 있으나, 2018년 최초로 실존 확인된 노비촉 계열 신경작용제는 탐지 및 검증을 위한 표식인자가 알려져 있지 않다. 노비촉 계열 물질은 인(P)을 중심으로 한 화학구조를 가지는데, 사린(GB), 소만(GD)이 유사한 구조를 가지고 있음에 착안하여 바이오마커 연구가 수행되었으나, 노비촉 만의 화학적 특징을 고려하여 분석/검출 효율을 극대화한 바이오마커에 관한 연구 결과는 없었다. For nerve agents such as sarin and soman, biomarkers have been identified to determine whether victims are poisoned, but the Novichok series of nerve agents, which were first confirmed to exist in 2018, have no known markers for detection and verification. Novichok-based substances have a chemical structure centered on phosphorus (P). Biomarker research has been conducted based on the fact that sarin (GB) and soman (GD) have a similar structure, but Novichok's unique chemical characteristics There was no research result on biomarkers that maximized analysis/detection efficiency.
이에 본 발명자들은 종래 유기인 신경작용제와 다른 노비촉의 물리적 특성 및 분해 특성을 발견하고 이를 활용하여 극미량의 노비촉을 우수한 감도로 검출할 수 있는 노비촉 검출용 바이오마커 및 이를 이용한 노비촉의 검출방법을 개발하였다.Therefore, the present inventors discovered the physical properties and decomposition characteristics of Nobichok, which are different from conventional organic phosphorus nerve agents, and utilized them to develop a biomarker for detecting Novichok that can detect a very small amount of Novichok with excellent sensitivity and a method for detecting Novichok using the same. developed.
본 발명의 목적은, 혈액 내 노비촉 검출을 위한 부티릴콜린에스터라제 유래의 바이오마커와 이를 이용한 노비촉의 검출방법을 제공하는데 있다.An object of the present invention is to provide a biomarker derived from butyrylcholinesterase for detecting Novichok in blood and a method for detecting Novichok using the same.
본 발명의 다른 목적은, 극미량의 노비촉을 우수한 감도로 검출할 수 있는 노비촉 검출용 바이오마커 및 이를 이용한 노비촉의 검출방법을 제공하는데 있다. Another object of the present invention is to provide a biomarker for detecting nobitok capable of detecting a very small amount of nobitok with excellent sensitivity and a method for detecting nobitok using the same.
본 발명이 해결하고자 하는 과제는 이상에서 언급한 과제(들)로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제(들)는 이하의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.The problem to be solved by the present invention is not limited to the above-mentioned problem (s), and another problem (s) not mentioned will be clearly understood by those skilled in the art from the following description.
본 발명의 일 측면에 따르면, 본 발명은 부티릴콜린에스터라제의 촉매 삼잔기(catalytic triad) 내 세린 잔기에 노비촉이 공유 결합한, 노비촉 검출용 바이오마커를 제공한다.According to one aspect of the present invention, the present invention provides a biomarker for detecting Novichok, in which Novichok is covalently bound to a serine residue in the catalytic triad of butyrylcholinesterase.
상기 노비촉 검출용 바이오마커는 단백질 분해효소 처리를 통해 얻은 노나펩타이드일 수 있다.The biomarker for detecting Novichok may be a nonapeptide obtained through proteolytic enzyme treatment.
상기 노비촉 검출용 바이오마커는 혈액 또는 혈액에서 추출된 성분을 시료로 사용할 수 있다.The biomarker for detecting Novichok may use blood or a component extracted from blood as a sample.
상기 노비촉 검출용 바이오마커는 액체 크로마토그래피-질량분석으로 검출하는 것 일 수 있다.The biomarker for detecting Novichok may be detected by liquid chromatography-mass spectrometry.
상기 노비촉 검출용 바이오마커는 1가 하전된 분자이온 [M+H]+; 2가 하전된 분자이온 [M+2H]2+; 또는 1가 하전된 분자이온 [M+H]+ 및 2가 하전된 분자이온 [M+2H]2+ 인 것 일 수 있다.The biomarker for detecting Novichok is a monovalently charged molecular ion [M+H] + ; 2-charged molecular ion [M+2H] 2+ ; Alternatively, it may be a 1-charged molecular ion [M+H] + and a 2-charged molecular ion [M+2H] 2+ .
상기 1가 하전된 분자이온 [M+H]+ 또는 2가 하전된 분자이온 [M+2H]2+ 은 액체크로마토그래피-질량분석을 위한 전자분무 이온화 과정에서 수득되는 것 일 수 있다.The uni-charged molecular ion [M+H] + or the 2-charged molecular ion [M+2H] 2+ may be obtained in an electrospray ionization process for liquid chromatography-mass spectrometry.
상기 노비촉은 하기 화학식 1로 나타내는 것 일 수 있다:The Novichok may be represented by Formula 1 below:
[화학식 1][Formula 1]
상기 식에서, In the above formula,
R1 내지 R2는 서로 독립적으로, 수소, 치환 또는 비치환된 탄소수 1 내지 10의 알킬기, 치환 또는 비치환된 탄소수 1 내지 10의 사이클로알킬기로 이루어진 군으로부터 선택되고, R 1 to R 2 are each independently selected from the group consisting of hydrogen, a substituted or unsubstituted alkyl group having 1 to 10 carbon atoms, and a substituted or unsubstituted cycloalkyl group having 1 to 10 carbon atoms;
R3 내지 R4는 서로 독립적으로, 치환 또는 비치환된 탄소수 1 내지 10의 알킬기, 치환 또는 비치환된 탄소수 1 내지 10 이하의 사이클로알킬기로 이루어진 군으로부터 선택된다.R 3 to R 4 are each independently selected from the group consisting of a substituted or unsubstituted alkyl group having 1 to 10 carbon atoms and a substituted or unsubstituted cycloalkyl group having 1 to 10 carbon atoms or less.
또한, 본 발명은 하기 화학식 2로 나타내는 노비촉 검출용 바이오마커를 제공한다:In addition, the present invention provides a biomarker for detecting Novichok represented by Formula 2 below:
[화학식 2][Formula 2]
상기 식에서, In the above formula,
R1 내지 R2는 서로 독립적으로, 수소, 치환 또는 비치환된 탄소수 1 내지 10의 알킬기, 치환 또는 비치환된 탄소수 1 내지 10의 사이클로알킬기로 이루어진 군으로부터 선택되고, R 1 to R 2 are each independently selected from the group consisting of hydrogen, a substituted or unsubstituted alkyl group having 1 to 10 carbon atoms, and a substituted or unsubstituted cycloalkyl group having 1 to 10 carbon atoms;
R3 내지 R4는 서로 독립적으로, 치환 또는 비치환된 탄소수 1 내지 10의 알킬기, 치환 또는 비치환된 탄소수 1 내지 10 이하의 사이클로알킬기로 이루어진 군으로부터 선택된다.R 3 to R 4 are each independently selected from the group consisting of a substituted or unsubstituted alkyl group having 1 to 10 carbon atoms and a substituted or unsubstituted cycloalkyl group having 1 to 10 carbon atoms or less.
또한, 본 발명은 하기 화학식 3으로 나타내는 2가 하전된 분자이온 [M+2H]2+ 인 노비촉 검출용 바이오마커를 제공한다:In addition, the present invention provides a biomarker for detecting Novichok, which is a divalently charged molecular ion [M+2H] 2+ represented by Formula 3 below:
[화학식 3][Formula 3]
상기 식에서, In the above formula,
R1 내지 R2는 서로 독립적으로, 수소, 치환 또는 비치환된 탄소수 1 내지 10의 알킬기, 치환 또는 비치환된 탄소수 1 내지 10의 사이클로알킬기로 이루어진 군으로부터 선택되고, R 1 to R 2 are each independently selected from the group consisting of hydrogen, a substituted or unsubstituted alkyl group having 1 to 10 carbon atoms, and a substituted or unsubstituted cycloalkyl group having 1 to 10 carbon atoms;
R3 내지 R4는 서로 독립적으로, 치환 또는 비치환된 탄소수 1 내지 10의 알킬기, 치환 또는 비치환된 탄소수 1 내지 10 이하의 사이클로알킬기로 이루어진 군으로부터 선택된다.R 3 to R 4 are each independently selected from the group consisting of a substituted or unsubstituted alkyl group having 1 to 10 carbon atoms and a substituted or unsubstituted cycloalkyl group having 1 to 10 carbon atoms or less.
상기 노비촉 검출용 바이오마커로서, 상기 2가 하전된 분자이온 [M+2H]2+ 이 1가 하전된 분자이온 [M+H]+ 보다 검출 민감도가 더 높은 것 일 수 있다. As the biomarker for detecting Novichok, the divalently charged molecular ion [M+2H] 2+ may have higher detection sensitivity than the monovalently charged molecular ion [M+H] + .
상기 노비촉 검출용 바이오마커로서, 상기 2가 하전된 분자이온 [M+2H]2+ 이 1가 하전된 분자이온 [M+H]+ 보다 낮은 에너지로도 파편화가 될 수 있다.As the biomarker for detecting Novichok, the 2-charged molecular ion [M+2H] 2+ can be fragmented even with lower energy than the 1-charged molecular ion [M+H] + .
본 발명의 다른 측면에 따르면, 본 발명은 전술한 노비촉 검출용 바이오마커를 이용한 노비촉의 검출방법을 제공한다.According to another aspect of the present invention, the present invention provides a method for detecting nobitok using the above-described biomarker for detecting nobitok.
또한, 본 발명은 (a) 혈액 시료를 준비하는 단계; (b) 상기 (a) 단계에서 준비된 시료를 단백질 분해효소로 처리하는 단계; 및 (c) 상기 (b) 단계에서 처리된 시료에 대하여 액체크로마토그래피-질량분석을 수행하여 전술한 노비촉 검출용 바이오마커를 검출하는 단계; 를 포함하는, 노비촉의 검출방법을 제공한다.In addition, the present invention comprises the steps of (a) preparing a blood sample; (b) treating the sample prepared in step (a) with a proteolytic enzyme; and (c) performing liquid chromatography-mass spectrometry on the sample treated in step (b) to detect the aforementioned biomarker for detection of Novichok; It provides a method for detecting a nobichok, including a.
상기 (c) 단계에서 액체크로마토그래피-질량분석은 HCD(Higher energy C-trap dissociation) 파편화 기술을 이용한 이차 질량분석을 추가로 수행하는 것 일 수 있다.In the step (c), the liquid chromatography-mass spectrometry may further perform secondary mass spectrometry using a higher energy C-trap dissociation (HCD) fragmentation technique.
상기 노비촉의 검출방법은 자성 비드와 항-부티릴콜린에스터라제 항체를 이용하는 것 일 수 있다.The Novichok detection method may be to use magnetic beads and an anti-butyrylcholinesterase antibody.
상기 노비촉의 검출방법은 노비촉에 노출된 혈액 시료를 대상으로 할 경우, 상기 (b) 단계에서 처리된 시료는 하기 화학식 2로 나타내는 노비촉 검출용 바이오 마커를 포함하는 것 일 수 있다:In the method for detecting Novichok, when a blood sample exposed to Novichok is used as a target, the sample treated in step (b) may include a biomarker for detecting Novichok represented by Formula 2 below:
[화학식 2][Formula 2]
상기 식에서, In the above formula,
R1 내지 R2는 서로 독립적으로, 수소, 치환 또는 비치환된 탄소수 1 내지 10의 알킬기, 치환 또는 비치환된 탄소수 1 내지 10의 사이클로알킬기로 이루어진 군으로부터 선택되고, R 1 to R 2 are each independently selected from the group consisting of hydrogen, a substituted or unsubstituted alkyl group having 1 to 10 carbon atoms, and a substituted or unsubstituted cycloalkyl group having 1 to 10 carbon atoms;
R3 내지 R4는 서로 독립적으로, 치환 또는 비치환된 탄소수 1 내지 10의 알킬기, 치환 또는 비치환된 탄소수 1 내지 10 이하의 사이클로알킬기로 이루어진 군으로부터 선택된다.R 3 to R 4 are each independently selected from the group consisting of a substituted or unsubstituted alkyl group having 1 to 10 carbon atoms and a substituted or unsubstituted cycloalkyl group having 1 to 10 carbon atoms or less.
상기 노비촉의 검출방법은 노비촉에 노출된 혈액 시료를 대상으로 할 경우, 상기 (c) 단계에서 하기 화학식 3으로 나타내는 2가 하전된 분자이온 [M+2H]2+ 인 노비촉 검출용 바이오 마커를 검출하는 것 일 수 있다:The method for detecting Novichok is a biomarker for detecting Novichok, which is a divalently charged molecular ion [M+2H] 2+ represented by Formula 3 in the step (c) when a blood sample exposed to Novichok is used as a target. can be to detect:
[화학식 3][Formula 3]
상기 식에서, In the above formula,
R1 내지 R2는 서로 독립적으로, 수소, 치환 또는 비치환된 탄소수 1 내지 10의 알킬기, 치환 또는 비치환된 탄소수 1 내지 10의 사이클로알킬기로 이루어진 군으로부터 선택되고, R 1 to R 2 are each independently selected from the group consisting of hydrogen, a substituted or unsubstituted alkyl group having 1 to 10 carbon atoms, and a substituted or unsubstituted cycloalkyl group having 1 to 10 carbon atoms;
R3 내지 R4는 서로 독립적으로, 치환 또는 비치환된 탄소수 1 내지 10의 알킬기, 치환 또는 비치환된 탄소수 1 내지 10 이하의 사이클로알킬기로 이루어진 군으로부터 선택된다.R 3 to R 4 are each independently selected from the group consisting of a substituted or unsubstituted alkyl group having 1 to 10 carbon atoms and a substituted or unsubstituted cycloalkyl group having 1 to 10 carbon atoms or less.
본 발명에 따르면, 혈액 내 노비촉 검출을 위한 부티릴콜린에스터라제 유래의 바이오마커와 이를 이용한 노비촉의 검출방법을 제공하는 효과가 있다.According to the present invention, there is an effect of providing a biomarker derived from butyrylcholinesterase for detecting Novichok in blood and a method for detecting Novichok using the same.
또한, 본 발명에 따르면, 부티릴콜린에스터라제 유래의 바이오마커를 포함한 시료를 액체 크로마토그래피-질량분석을 위한 전자분무 이온화 처리를 하여 수득되는 1가 하전된 분자이온 또는 2가 하전된 분자이온을 노비촉 검출용 바이오마커로 제공하는 효과가 있다.In addition, according to the present invention, a monovalently charged molecular ion or a divalently charged molecular ion obtained by subjecting a sample containing a biomarker derived from butyrylcholinesterase to electrospray ionization treatment for liquid chromatography-mass spectrometry It has the effect of providing as a biomarker for detecting Novichok.
또한, 본 발명에 따르면, 노비촉을 액체크로마토그래피-질량분석으로 검출 시 노비촉 검출용 바이오마커로서 2가 하전된 분자이온이 1가 하전된 분자이온 보다 더 높은 신호세기를 나타내고 더 낮은 에너지로도 파편화가 가능하여 노비촉의 극미량 검출 및 구조정보를 더 효율적으로 확인할 수 있는 효과가 있다.In addition, according to the present invention, when Novichok is detected by liquid chromatography-mass spectrometry, a divalently charged molecular ion as a biomarker for detecting Novichok exhibits a higher signal intensity than a monovalently charged molecular ion and has a lower energy. Fragmentation is also possible, so there is an effect of detecting very small amounts of nobitok and confirming structural information more efficiently.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 노비촉 검출방법의 공정 흐름도를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 노비촉 A232의 검출방법에서 액체크로마토그래피-질량분석(LC-MS/HRMS)의 이차 질량분석 과정에서 이루어지는 노비촉(A232) 검출용 바이오마커의 파편화 과정을 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 노비촉 A232 검출용 바이오마커에 대한 액체크로마토그래피-질량분석의 추출이온크로마토그램(Extracted Ion Chromatogram, EIC) 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 노비촉 A232 검출용 바이오마커의 2가 하전된 분자이온 [M+2H]2+의 액체크로마토그래피-질량분석의 이차 질량분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 노비촉 A234 검출용 바이오마커에 대한 액체크로마토그래피-질량분석의 추출이온크로마토그램(EIC) 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 노비촉 A234 검출용 바이오마커의 액체크로마토그래피-질량분석의 이차 질량분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 노비촉 A232, A234 검출용 바이오마커의 1가 하전된 분자이온 [M+H]+과 2가 하전된 분자이온 [M+2H]2+의 추출이온크로마토그램(EIC) 세기를 비교한 그래프이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 VX 또는 GB에 의해 저해된 바이오마커의 1가 하전된 분자이온 [M+H]+과 2가 하전된 분자이온 [M+2H]2+의 추출이온크로마토그램(EIC) 세기를 비교한 그래프이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 VX에 의해 저해된 바이오마커 2가 하전된 분자이온 [M+2H]2+ 액체크로마토그래피-질량분석의 이차 질량분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 GB에 의해 저해된 바이오마커 2가 하전된 분자이온 [M+2H]2+ 액체크로마토그래피-질량분석의 이차 질량분석 결과를 나타낸 그래프이다.1 is a process flow diagram of a method for detecting a knobby chok according to an embodiment of the present invention.
Figure 2 is a fragmentation process of the biomarker for detecting Novichok (A232) in the secondary mass spectrometry process of liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS / HRMS) in the method for detecting Novichok A232 according to an embodiment of the present invention. is shown.
Figure 3 is a graph showing the extracted ion chromatogram (EIC) results of liquid chromatography-mass spectrometry for the biomarker for detecting Novichok A232 according to an embodiment of the present invention.
4 is a graph showing secondary mass spectrometry results of liquid chromatography-mass spectrometry of the divalently charged molecular ion [M+2H] 2+ of a biomarker for detecting Novichok A232 according to an embodiment of the present invention.
5 is a graph showing extracted ion chromatogram (EIC) results of liquid chromatography-mass spectrometry for a biomarker for detecting Novichok A234 according to an embodiment of the present invention.
6 is a graph showing secondary mass spectrometry results of liquid chromatography-mass spectrometry of a biomarker for detecting Novichok A234 according to an embodiment of the present invention.
Figure 7 shows the extracted ions of the 1-charged molecular ion [M+H] + and the 2-charged molecular ion [M+2H] 2+ of the biomarker for detecting Novichok A232 and A234 according to an embodiment of the present invention. It is a graph comparing chromatogram (EIC) intensities.
Figure 8 shows the extracted ions of the 1-charged molecular ion [M+H] + and the 2-charged molecular ion [M+2H] 2+ of the biomarker inhibited by VX or GB according to an embodiment of the present invention. It is a graph comparing chromatogram (EIC) intensities.
9 is a graph showing secondary mass spectrometry results of charged molecular ion [M+2H] 2+ liquid chromatography-mass spectrometry of
10 is a graph showing secondary mass spectrometry results of charged molecular ion [M+2H] 2+ liquid chromatography-mass spectrometry of
본 발명을 상세하기 설명하기 전에, 본 명세서에서 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 무조건 한정하여 해석되어서는 아니되며, 본 발명의 발명자가 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해서 각종 용어의 개념을 적절하게 정의하여 사용할 수 있고, 더 나아가 이들 용어나 단어는 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야 함을 알아야 한다.Before describing the present invention in detail, the terms or words used in this specification should not be construed as unconditionally limited in a conventional or dictionary sense, and in order for the inventor of the present invention to explain his/her invention in the best way It should be noted that concepts of various terms may be appropriately defined and used, and furthermore, these terms or words should be interpreted as meanings and concepts corresponding to the technical spirit of the present invention.
즉, 본 명세서에서 사용된 용어는 본 발명의 바람직한 실시예를 설명하기 위해서 사용되는 것일 뿐이고, 본 발명의 내용을 구체적으로 한정하려는 의도로 사용된 것이 아니며, 이들 용어는 본 발명의 여러 가지 가능성을 고려하여 정의된 용어임을 알아야 한다.That is, the terms used in this specification are only used to describe preferred embodiments of the present invention, and are not intended to specifically limit the contents of the present invention, and these terms represent various possibilities of the present invention. It should be noted that it is a defined term.
또한, 본 명세서에 있어서, 단수의 표현은 문맥상 명확하게 다른 의미로 지시하지 않는 이상, 복수의 표현을 포함할 수 있으며, 유사하게 복수로 표현되어 있다고 하더라도 단수의 의미를 포함할 수 있음을 알아야 한다.In addition, in this specification, it should be noted that singular expressions may include plural expressions unless the context clearly indicates otherwise, and similarly, even if they are expressed in plural numbers, they may include singular meanings. do.
본 명세서의 전체에 걸쳐서 어떤 구성 요소가 다른 구성 요소를 "포함"한다고 기재하는 경우에는, 특별히 반대되는 의미의 기재가 없는 한 임의의 다른 구성 요소를 제외하는 것이 아니라 임의의 다른 구성 요소를 더 포함할 수도 있다는 것을 의미할 수 있다.Throughout this specification, when a component is described as "including" another component, it does not exclude any other component, but further includes any other component, unless otherwise stated. It can mean you can do it.
또한, 이하에서, 본 발명을 설명함에 있어서, 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 구성, 예를 들어, 종래 기술을 포함하는 공지기술에 대한 상세한 설명은 생략될 수도 있다.In addition, in the following description of the present invention, a detailed description of a configuration that is determined to unnecessarily obscure the subject matter of the present invention, for example, the known technology including the prior art, may be omitted.
이하, 본 발명을 더욱 자세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail.
노비촉 검출용 바이오마커Biomarkers for detecting Novichok
본 발명은 부티릴콜린에스터라제의 촉매 삼잔기(catalytic triad) 내 세린 잔기에 노비촉이 공유 결합한, 노비촉 검출용 바이오마커를 제공한다.The present invention provides a biomarker for detecting Novichok, in which Novichok is covalently bound to a serine residue in the catalytic triad of butyrylcholinesterase.
노비촉은 유기인 신경작용제(OPNA) 중 하나인 물질로 부티릴콜린에스터라제(butyrylcholinesterase, BChE) 활성을 억제하여 신경 독성을 나타내는 것으로 보고되었고, 2020년 화학무기금지협약(CWC) 목록에 새로운 신경작용제로 포함되었다. Novichok is one of the organic phosphorus nerve agents (OPNA) and has been reported to exhibit neurotoxicity by inhibiting the activity of butyrylcholinesterase (BChE). Included as a nerve agent.
본 발명의 노비촉은 화학식 1로 나타내는 것으로, 화학무기금지협약(CWC) 1.A.14.에서 규정하는 노비촉 계열의 제제를 모두 포함하며, 대표적인 예로는 A232와 A234가 있다. The Novichok of the present invention is represented by
[화학식 1][Formula 1]
상기 식에서, In the above formula,
R1 내지 R2는 서로 독립적으로, 수소, 치환 또는 비치환된 탄소수 1 내지 10의 알킬기, 치환 또는 비치환된 탄소수 1 내지 10의 사이클로알킬기로 이루어진 군으로부터 선택되고, R 1 to R 2 are each independently selected from the group consisting of hydrogen, a substituted or unsubstituted alkyl group having 1 to 10 carbon atoms, and a substituted or unsubstituted cycloalkyl group having 1 to 10 carbon atoms;
R3 내지 R4는 서로 독립적으로, 치환 또는 비치환된 탄소수 1 내지 10의 알킬기, 치환 또는 비치환된 탄소수 1 내지 10의 사이클로알킬기로 이루어진 군으로부터 선택된다.R 3 to R 4 are each independently selected from the group consisting of a substituted or unsubstituted alkyl group having 1 to 10 carbon atoms and a substituted or unsubstituted cycloalkyl group having 1 to 10 carbon atoms.
[CWC 1.A.14.][CWC 1.A.14.]
[A232][A232]
[A234][A234]
상기 노비촉은 흡입, 피부, 점막 등을 통해 체내로 들어가 혈액 내의 부티릴에스터라제의 효소 활성부위인 촉매 삼잔기(catalytic triad) 내에 위치한 세린 잔기에 공유결합하여 부티릴콜린에스터라제의 효소 활성을 저해할 수 있다. The Novichok enters the body through inhalation, skin, mucous membranes, etc., and covalently binds to a serine residue located in the catalytic triad, which is the enzyme active site of butyrylcholinesterase in the blood, to form the enzyme of butyrylcholinesterase. activity may be impaired.
상기 노비촉 검출용 바이오마커는 노비촉에 의해 저해된 부티릴콜린에스터라제 일 수 있고, 이는 부티릴콜린에스터라제에 노비촉이 공유결합된 형태일 수 있다. The biomarker for detecting Novichok may be butyrylcholinesterase inhibited by Novichok, which may be a form in which Novichok is covalently bonded to butyrylcholinesterase.
상기 노비촉 검출용 바이오마커는 단백질 분해효소 처리를 통해 얻은 펩타이드 단편일 수 있고, 바람직하게는 9개의 아미노산으로 이루어진 노나펩타이드 일 수 있다. The biomarker for detecting Novichok may be a peptide fragment obtained through protease treatment, and preferably may be a nonapeptide composed of 9 amino acids.
본 발명에 따른 노나펩타이드는 하기 화학식 2로 나타낼 수 있다:Nonapeptide according to the present invention can be represented by the following formula (2):
[화학식 2][Formula 2]
상기 식에서, In the above formula,
R1 내지 R2는 서로 독립적으로, 수소, 치환 또는 비치환된 탄소수 1 내지 10의 알킬기, 치환 또는 비치환된 탄소수 1 내지 10의 사이클로알킬기로 이루어진 군으로부터 선택되고, R 1 to R 2 are each independently selected from the group consisting of hydrogen, a substituted or unsubstituted alkyl group having 1 to 10 carbon atoms, and a substituted or unsubstituted cycloalkyl group having 1 to 10 carbon atoms;
R3 내지 R4는 서로 독립적으로, 치환 또는 비치환된 탄소수 1 내지 10의 알킬기, 치환 또는 비치환된 탄소수 1 내지 10의 사이클로알킬기로 이루어진 군으로부터 선택된다.R 3 to R 4 are each independently selected from the group consisting of a substituted or unsubstituted alkyl group having 1 to 10 carbon atoms and a substituted or unsubstituted cycloalkyl group having 1 to 10 carbon atoms.
상기 화학식 2에 따른 노나펩타이드의 일 예인 A232 저해된 부티릴콜린에스터라제 노나펩타이드(이하, A232 저해된 노나펩타이드)는 다음과 같다:A232 inhibited butyrylcholinesterase nonapeptide (hereinafter referred to as A232 inhibited nonapeptide), which is an example of the nonapeptide according to
[A232 저해된 노나펩타이드][A232 inhibited nonapeptide]
상기 노비촉 검출용 바이오마커는 혈액 또는 혈액에서 추출된 성분을 시료로 사용할 수 있고, 바람직하게는 혈액에서 추출된 혈장 또는 혈청을 사용할 수 있다. The biomarker for detecting Novichok may use blood or a component extracted from blood as a sample, and preferably plasma or serum extracted from blood.
상기 노비촉 검출용 바이오마커는 액체 크로마토그래피-질량분석으로 검출하는 것 일 수 있다. 액체 크로마토그래피-질량분석을 통해 시료 내 상기 노비촉 검출용 바이오마커의 유무를 확인할 수 있다. 액체 크로마토그래피-질량분석으로는 LC-MS, LC-MS/MS, LC-MS/HRMS 등을 이용할 수 있다. The biomarker for detecting Novichok may be detected by liquid chromatography-mass spectrometry. The presence or absence of the biomarker for detecting Novichok in the sample can be confirmed through liquid chromatography-mass spectrometry. As liquid chromatography-mass spectrometry, LC-MS, LC-MS/MS, LC-MS/HRMS and the like can be used.
상기 노비촉 검출용 바이오마커는 상기 노나펩타이드의 하전된 분자이온 일 수 있고, 1가 하전된 분자이온 [M+H]+; 2가 하전된 분자이온 [M+2H]2+; 또는 1가 하전된 분자이온 [M+H]+ 및 2가 하전된 분자이온 [M+2H]2+ 일 수 있고, 바람직하게는 2가 하전된 분자이온 [M+2H]2+ 일 수 있다. 본 명세서에서 1가 하전된 분자이온과 [M+H]+은 동일한 의미이고, 2가 하전된 분자이온과 [M+2H]2+은 동일한 의미이다.The biomarker for detecting Novichok may be a charged molecular ion of the nonapeptide, a monovalently charged molecular ion [M+H] + ; 2-charged molecular ion [M+2H] 2+ ; Alternatively, it may be a uni-charged molecular ion [M+H] + and a 2-charged molecular ion [M+2H] 2+ , preferably a 2-charged molecular ion [M+2H] 2+ . . In the present specification, 1-charged molecular ion and [M+H] + mean the same, and 2-charged molecular ion and [M+2H] 2+ mean the same.
상기 노나펩타이드의 1가 하전된 분자이온 또는 2가 하전된 분자이온은 액체크로마토그래피-질량분석을 위한 전자분무 이온화 과정에서 수득되는 것 일 수 있다.The univalently charged molecular ion or the divalently charged molecular ion of the nonapeptide may be obtained in an electrospray ionization process for liquid chromatography-mass spectrometry.
본 발명에 따른 노비촉 검출용 바이오마커는 하기 화학식 3으로 나타낼 수 있다:The biomarker for detecting Novichok according to the present invention may be represented by Formula 3 below:
[화학식 3][Formula 3]
상기 식에서, In the above formula,
R1 내지 R2는 서로 독립적으로, 수소, 치환 또는 비치환된 탄소수 1 내지 10의 알킬기, 치환 또는 비치환된 탄소수 1 내지 10의 사이클로알킬기로 이루어진 군으로부터 선택되고, R 1 to R 2 are each independently selected from the group consisting of hydrogen, a substituted or unsubstituted alkyl group having 1 to 10 carbon atoms, and a substituted or unsubstituted cycloalkyl group having 1 to 10 carbon atoms;
R3 내지 R4는 서로 독립적으로, 치환 또는 비치환된 탄소수 1 내지 10의 알킬기, 치환 또는 비치환된 탄소수 1 내지 10의 사이클로알킬기로 이루어진 군으로부터 선택된다.R 3 to R 4 are each independently selected from the group consisting of a substituted or unsubstituted alkyl group having 1 to 10 carbon atoms and a substituted or unsubstituted cycloalkyl group having 1 to 10 carbon atoms.
상기 화학식 3에 따른 노비촉 검출용 바이오마커의 일 예인 A232, A234 저해된 부티릴콜린에스터라제 노나펩타이드의 2가 하전된 분자이온(이하, A232, A234 저해된 노나펩타이드의 2가 하전된 분자이온)은 다음과 같다:A divalently charged molecular ion of A232, A234 inhibited butyrylcholinesterase nonapeptide, which is an example of a biomarker for detecting Novichok according to Formula 3 (hereinafter, a divalently charged molecule of A232, A234 inhibited nonapeptide) ions) are:
[A232 저해된 노나펩타이드의 2가 하전된 분자이온][A232 Divalently Charged Molecular Ion of Inhibited Nonapeptide]
[A234 저해된 노나펩타이드의 2가 하전된 분자이온][A234 Divalently Charged Molecular Ion of Inhibited Nonapeptide]
상기 노비촉 검출용 바이오마커는 2가 하전된 분자이온이 1가 하전된 분자이온 보다 검출 민감도가 더 높을 수 있다. 도 7을 참조하면, 2가 하전된 분자이온이 1가 하전된 분자이온 보다 약 2배 가량 높은 봉우리 면적 값(높은 신호세기)을 가지며, 이는 극미량 질량분석시 2배 가량 더 높은 검출 민감도(낮은 분석한계)를 가짐을 의미한다.In the biomarker for detecting Novichok, a divalently charged molecular ion may have higher detection sensitivity than a monovalently charged molecular ion. Referring to FIG. 7, a molecular ion with a charge of 2 has a peak area value (high signal intensity) that is about twice as high as that of a molecular ion with a charge of 1, which is about 2 times higher detection sensitivity (lower analysis limits).
상기 노비촉 검출용 바이오마커는 2가 하전된 분자이온이 1가 하전된 분자이온 보다 낮은 에너지로도 파편화가 될 수 있다. 구체적으로는 2가 하전된 분자이온이 1가 하전된 분자이온 보다 30% 낮은 에너지로도 충분히 파편화가 이루어져, 이차 질량분석(MS/MS)에서 더 높은 노비촉-유래 딸이온 세기를 가진다.In the biomarker for detecting Novichok, the divalently charged molecular ion can be fragmented even with lower energy than the monovalently charged molecular ion. Specifically, the divalently charged molecular ion is sufficiently fragmented even with 30% lower energy than the monovalently charged molecular ion, and thus has a higher Novichok-derived daughter ion intensity in secondary mass spectrometry (MS/MS).
이와 같이 2가 하전된 분자이온이 1가 하전된 분자이온 보다 높은 신호세기를 가지고 낮은 에너지로도 파편화될 수 있는 특성을 통해, 2가 하전된 분자이온을 바이오마커로 사용하는 경우 극미량의 노비촉 검출 및 신경화학작용제의 구조정보 획득에 유리하게 사용될 수 있음을 알 수 있다.As such, when a divalently charged molecular ion is used as a biomarker, a very small amount of nobichok is detected through the characteristics that a divalently charged molecular ion has a higher signal intensity than a monovalently charged molecular ion and can be fragmented even at low energy. It can be seen that it can be advantageously used for detection and acquisition of structural information of neurochemical agents.
노비촉의 검출방법How to detect Knobbitok
본원발명은 전술한 노비촉 검출용 바이오마커를 이용한 노비촉의 검출방법을 제공한다.The present invention provides a method for detecting Nobichok using the biomarker for detecting Novichok described above.
도 1을 참조하면, 본 발명의 노비촉 검출방법은, 혈액 시료를 준비하는 단계(S10); 단백질 분해효소로 처리하는 단계(S20); 및 액체크로마토그래피-질량분석으로 바이오마커를 검출하는 단계(S30); 를 포함한다. 이하, 단계별로 상세히 설명한다.Referring to FIG. 1 , the method for detecting Knobite according to the present invention includes preparing a blood sample (S10); Treatment with a proteolytic enzyme (S20); and detecting the biomarker by liquid chromatography-mass spectrometry (S30); includes Hereinafter, step by step will be described in detail.
(a) 혈액 시료를 준비한다(S10).(a) A blood sample is prepared (S10).
노비촉에 노출되거나 노비촉 중독이 의심되는 대상의 혈액으로부터 혈액 내의 단백질이 포함되어 있는 혈장 또는 혈청을 추출하여 시료를 준비한다.Samples are prepared by extracting plasma or serum containing proteins in the blood from the blood of a subject exposed to Novichok or suspected of being poisoned by Novichok.
(b) 단백질 분해효소로 처리한다(S20).(b) Treatment with protease (S20).
상기 (a) 단계에서 준비된 시료를 단백질 분해효소로 처리한다. 단백질 분해효소는 단백질을 가수분해하여 펩타이드로 분해할 수 있는 효소라면 특별히 제한되지 않으며, 예를 들면 펩신, 레닌, 트립신, 키모트립신 등을 사용할 수 있다. The sample prepared in step (a) is treated with a proteolytic enzyme. The proteolytic enzyme is not particularly limited as long as it is an enzyme capable of hydrolyzing proteins into peptides, and for example, pepsin, renin, trypsin, chymotrypsin, and the like can be used.
본 단계를 통해 노비촉에 의해 저해된 부티릴콜린에스터라제가 단백질 분해효소에 의해 가수분해 되어 노나펩타이드 단편의 형태로 분해될 수 있다. 상기 단백질 분해효소로 펩신, 레닌을 사용하는 경우 본 발명의 노나펩타이드 서열만을 획득할 수 있으므로 이들을 사용하는 것이 바람직하다.Through this step, butyrylcholinesterase inhibited by Novichok can be hydrolyzed by a proteolytic enzyme to be degraded in the form of a nonapeptide fragment. When pepsin and renin are used as the proteolytic enzyme, only the nonapeptide sequence of the present invention can be obtained, so it is preferable to use them.
노비촉에 노출된 혈액 시료를 대상으로 할 경우, 본 단계에서 단백질 분해효소로 처리된 시료는 하기 화학식 2로 나타내는 노비촉 검출용 바이오 마커를 포함할 수 있다:In the case of a blood sample exposed to Novichok, the sample treated with the proteolytic enzyme in this step may include a biomarker for detecting Novichok represented by
[화학식 2][Formula 2]
상기 식에서, In the above formula,
R1 내지 R2는 서로 독립적으로, 수소, 치환 또는 비치환된 탄소수 1 내지 10의 알킬기, 치환 또는 비치환된 탄소수 1 내지 10의 사이클로알킬기로 이루어진 군으로부터 선택되며, R 1 to R 2 are each independently selected from the group consisting of hydrogen, a substituted or unsubstituted alkyl group having 1 to 10 carbon atoms, and a substituted or unsubstituted cycloalkyl group having 1 to 10 carbon atoms;
R3 내지 R4는 서로 독립적으로, 치환 또는 비치환된 탄소수 1 내지 10의 알킬기, 치환 또는 비치환된 탄소수 1 내지 10의 사이클로알킬기로 이루어진 군으로부터 선택된다.R 3 to R 4 are each independently selected from the group consisting of a substituted or unsubstituted alkyl group having 1 to 10 carbon atoms and a substituted or unsubstituted cycloalkyl group having 1 to 10 carbon atoms.
본 단계에서 시료에 단백질 분해효소를 처리하고 노나펩타이드 단편을 분리하기 위하여 자성 비드와 항-부티릴콜린에스터라제 항체를 이용할 수 있다. 구체적으로는 하기 실시예에 설명된 바와 같이 수행할 수 있다.In this step, magnetic beads and anti-butyrylcholinesterase antibody may be used to treat the sample with proteolytic enzyme and isolate the nonapeptide fragment. Specifically, it may be performed as described in the following examples.
(c) 액체크로마토그래피-질량분석으로 노비촉 검출용 바이오마커를 검출한다(S30). (c) A biomarker for detection of Novichok is detected by liquid chromatography-mass spectrometry (S30).
본 단계에서 액체크로마토그래피-질량분석으로 시료 내 바이오마커의 유무를 확인하여 검출할 수 있다.In this step, the presence or absence of the biomarker in the sample can be confirmed and detected by liquid chromatography-mass spectrometry.
노비촉에 노출된 혈액 시료를 대상으로 할 경우, 본 단계에서 하기 화학식 3으로 나타내는 2가 하전된 분자이온인 노비촉 검출용 바이오 마커를 검출할 수 있다:In the case of a blood sample exposed to Novichok, a biomarker for detecting Novichok, which is a divalently charged molecular ion represented by Formula 3 below, can be detected in this step:
[화학식 3][Formula 3]
상기 식에서, In the above formula,
R1 내지 R2는 서로 독립적으로, 수소, 치환 또는 비치환된 탄소수 1 내지 10의 알킬기, 치환 또는 비치환된 탄소수 1 내지 10의 사이클로알킬기로 이루어진 군으로부터 선택되며, R 1 to R 2 are each independently selected from the group consisting of hydrogen, a substituted or unsubstituted alkyl group having 1 to 10 carbon atoms, and a substituted or unsubstituted cycloalkyl group having 1 to 10 carbon atoms;
R3 내지 R4는 서로 독립적으로, 치환 또는 비치환된 탄소수 1 내지 10의 알킬기, 치환 또는 비치환된 탄소수 1 내지 10의 사이클로알킬기로 이루어진 군으로부터 선택된다.R 3 to R 4 are each independently selected from the group consisting of a substituted or unsubstituted alkyl group having 1 to 10 carbon atoms and a substituted or unsubstituted cycloalkyl group having 1 to 10 carbon atoms.
상기 액체 크로마토그래피-질량분석으로는 LC-MS, LC-MS/MS, LC-MS/HRMS 등을 이용할 수 있다. 도 3의 EIC 결과를 참조하면, 질량 대 전하비(m/z) 493.71932-493.72228에 해당하는 피크를 통해 시료 내에 A232 저해된 부티릴콜린에스터라제 2가 하전된 분자이온(m/z=493.7208)이 포함되어 있었음을 확인할 수 있다. 마찬가지로 도 5의 EIC를 참조하면, 질량 대 전하비(m/z) 500.72710-500.73010에 해당하는 피크를 통해 시료 내에 A234 저해된 부티릴콜린에스터라제 2가 하전된 분자이온(m/z=500.7286)이 포함되어 있었음을 확인할 수 있다.As the liquid chromatography-mass spectrometry, LC-MS, LC-MS/MS, LC-MS/HRMS and the like can be used. Referring to the EIC results of FIG. 3, A232-inhibited
상기 액체크로마토그래피-질량분석에서 HCD(Higher energy C-trap dissociation) 파편화 기술을 이용할 수 있다. 도 2는 노비촉 A232의 검출방법에서 액체크로마토그래피-질량분석의 이차 질량분석 과정에서 이루어지는 노비촉(A232) 검출용 바이오마커의 파편화 과정을 나타낸 것으로, 4가지의 물질로 파편화 되는 것을 알 수 있다. 도 4의 이차 질량분석 결과를 참조하면, 4가지 물질의 피크를 확인할 수 있고, 특히 질량 대 전하비(m/z) 209.10471에 해당하는 피크를 통해 시료 내에 A232가 결합되어 있었음을 직접적으로 확인할 수 있다.In the liquid chromatography-mass spectrometry, a higher energy C-trap dissociation (HCD) fragmentation technique may be used. Figure 2 shows the fragmentation process of the biomarker for detecting Novichok (A232) in the secondary mass spectrometry process of liquid chromatography-mass spectrometry in the detection method of Novichok A232, and it can be seen that it is fragmented into four substances. . Referring to the results of secondary mass spectrometry in FIG. 4, peaks of four materials can be confirmed, and in particular, it can be directly confirmed that A232 was bound in the sample through the peak corresponding to the mass-to-charge ratio (m/z) of 209.10471. there is.
실시예Example
이하, 본 발명을 구체적으로 설명하기 위해 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명에 따른 실시예는 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 아래에서 상술하는 실시예에 한정되는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해서 제공되는 것이다.Hereinafter, examples will be described in detail to explain the present invention in detail. However, the embodiments according to the present invention can be modified in many different forms, and the scope of the present invention should not be construed as being limited to the embodiments described below. The embodiments of the present invention are provided to more completely explain the present invention to those skilled in the art.
재료ingredient
A232(CAS 2387496-04-8), A234(CAS 2387496-06-0), VX(CAS 50782-69-9) 및 GB(CAS 107-44-8)의 합성에 필요한 화학물질 및 시약은 Sigma-Aldrich(서울, 한국)에서 구입하였고, LC-MS/MS 용 용매는 Merck(서울, 한국)에서 구입하였다. 합성된 A232, A234, VX 및 GB는 핵 자기 공명 분광법으로 확인되었고, 순도는 95% 이상이었다. 노비촉 저해된 부티릴콜린에스터라아제의 제조에 EDTA-저해된 인간 혈청(EDTA-inhibited pooled human serum; Innovative Research, Novi, MI, USA)을 사용하였다. Sigma- It was purchased from Aldrich (Seoul, Korea), and the solvent for LC-MS/MS was purchased from Merck (Seoul, Korea). The synthesized A232, A234, VX and GB were confirmed by nuclear magnetic resonance spectroscopy, and the purity was over 95%. EDTA-inhibited pooled human serum (Innovative Research, Novi, MI, USA) was used for the preparation of Novichok-inhibited butyrylcholinesterase.
방법method
1) 혈청이 담긴 4개의 용기에 A232, A234, VX 및 GB을 각각 10 μg/mL의 농도로 투입 후 37 ℃에서 18 시간 반응시켜 각 시료 1 mL를 수득하였다. 1) A232, A234, VX, and GB were added at a concentration of 10 µg/mL each to four containers containing serum, and reacted at 37 °C for 18 hours to obtain 1 mL of each sample.
2) Dynabead M-280 Tosylactivated (ThermoFisher) 자성 비드 10 mg에 제품의 매뉴얼에 따라 마우스 모토클로날 항-인간 부티릴콜린에스터라제 항체(mouse monoclonal anti-human Butyrylcholinesterase; HAH-002-01-02, ThermoFisher) 100 μg을 결합시켰다. 결합이 완료된 비드-항체 복합체는 PBS를 이용하여 20 mg bead/mL의 농도로 준비하였다.2) To 10 mg of Dynabead M-280 Tosylactivated (ThermoFisher) magnetic beads, mouse monoclonal anti-human butyrylcholinesterase antibody (HAH-002-01-02, ThermoFisher) 100 μg were combined. The bound bead-antibody complex was prepared at a concentration of 20 mg bead/mL using PBS.
3) 상기 1)에서 준비된 시료 1 mL 당 상기 2)에서 준비된 비드-항체 복합체 100 μL를 첨가하고 상온에서 1시간 동안 교반하였다.3) 100 μL of the bead-antibody complex prepared in 2) was added per 1 mL of the sample prepared in 1) above, and the mixture was stirred at room temperature for 1 hour.
4) 자성 스탠드를 이용하여 상층액을 제거하고, 남은 비드-항체 복합체는 1 mL PBS로 3회 세척하였다.4) The supernatant was removed using a magnetic stand, and the remaining bead-antibody complex was washed three times with 1 mL PBS.
5) 자성 스탠드를 이용하여 세척에 사용한 PBS를 제거한 후 80 μL의 증류수를 첨가하였다.5) After removing the PBS used for washing using a magnetic stand, 80 μL of distilled water was added.
6) 상기 5)의 용액에 20 μL의 펩신 용액(5% 포름산 용액에 2 mg/mL 농도로 제조됨)을 넣고, 짧게 교반하였다.6) 20 μL of pepsin solution (prepared in 5% formic acid solution at a concentration of 2 mg/mL) was added to the solution of 5) above, and briefly stirred.
7) 비드-항체 복합체가 용액에 완전히 분산되면 37℃에서 2시간 동안 교반하며 반응시켰다.7) When the bead-antibody complex was completely dispersed in the solution, it was stirred and reacted at 37°C for 2 hours.
8) 반응이 끝나면 자성 스탠드를 이용하여 비드를 침전시킨 후, 상층액을 0.4 mL Centricon (10 kDa MWCO)에 옮겼다.8) After the reaction was completed, beads were precipitated using a magnetic stand, and the supernatant was transferred to 0.4 mL Centricon (10 kDa MWCO).
9) 15000 r/min으로 30분간 원심분리하여 초여과를 수행하였다.9) Ultrafiltration was performed by centrifugation at 15000 r/min for 30 minutes.
10) 용출액(Filtrate)을 LC 분석용 병에 옮겨, LC-MS/HRMS 분석을 실시하였다.10) The filtrate was transferred to a bottle for LC analysis, and LC-MS/HRMS analysis was performed.
11) LC-MS/HRMS 분석에서 LC 조건은 아래와 같다:11) LC conditions in LC-MS/HRMS analysis are as follows:
- 이동상: A - 0.1% 포름산 증류수, B - 0.1% 포름산 아세토니트릴- Mobile phase: A - 0.1% formic acid distilled water, B - 0.1% formic acid acetonitrile
- 용매 기울기: 아래의 표와 같이 진행한다.- Solvent gradient: Proceed as shown in the table below.
- 유속: 0.3 μL/min- Flow rate: 0.3 μL/min
- 분석용 컬럼: Thermo EASY-Spray PepMap RSLC C18, 150 mm x 150 μm x 10 nm- Analytical column: Thermo EASY-Spray PepMap RSLC C18, 150 mm x 150 μm x 10 nm
- 컬럼 온도: 30 ℃- column temperature: 30 ℃
12) LC-MS/HRMS 분석에서 질량분석기 조건은 아래와 같다:12) Mass spectrometer conditions in LC-MS/HRMS analysis are as follows:
- 질량분석기 제조사/타입: Thermo Scientific Q Exactive- Mass spectrometer manufacturer/type: Thermo Scientific Q Exactive
- 이온화 방식: nano-ESI- Ionization method: nano-ESI
- 극성: 양극성- Polarity: Bipolar
- 전자분무 전압: 1.5 kV 내지 1.7 kV- electrospray voltage: 1.5 kV to 1.7 kV
- MS/MS 스캔 방식: targeted Single Ion Monitoring with data-dependent MS2)- MS/MS scan method: targeted Single Ion Monitoring with data-dependent MS2)
- HCD 충돌 에너지: 16 eV- HCD collision energy: 16 eV
- HCD 충돌 가스: 질소- HCD collision gas: nitrogen
- 스캔 속도: 초당 1스캔- Scan rate: 1 scan per second
도 3은 A232에 의해 저해된 인간 혈청 시료를 상기 방법으로 처리하여 얻은 바이오마커 중 [M+2H]2+ 이온에 대한 액체크로마토그래피-질량분석 결과로, 고해상도 질량분석기를 이용하여 ± 3 ppm의 질량 정확도 기준으로 추출한 크로마토그램(Extracted Ion Chromatogram, EIC)이다. Figure 3 is a liquid chromatography-mass spectrometry result for [M+2H] 2+ ion among biomarkers obtained by treating a human serum sample inhibited by A232 by the above method, using a high-resolution mass spectrometer, ± 3 ppm This is an extracted ion chromatogram (EIC) based on mass accuracy.
도 4는 A232에 의해 저해된 바이오마커 [M+2H]2+ 이온에 대한 이차 질량분석(MS/MS) 결과로, HCD (Higher energy C-trap Dissociation) 파편화 기술을 이용하여 초고순도 질소 가스를 매질로써 16% NCE를 부여하여 파편화를 수행한 결과물이다. 도 4의 질량 대 전하비(m/z) 209.10471에 해당하는 질량 봉우리는 시료에 처리된 A232의 구조를 가지고 있는 질량봉우리로, 분석한 바이오마커에 목표로 한 신경화학작용제가 실제로 결합해 있었음을 직접적으로 증명하는 자료이다. 이후의 전하비(m/z)가 778.33636, 673.29352, 602.25629 에 해당하는 봉우리는 노나펩타이드가 HCD cell에서 파편화되어 발생하는 딸이온으로, 해당 노나펩타이드의 검출에 사용해 온 정보들이다.4 is a secondary mass spectrometry (MS/MS) result for the biomarker [M+2H] 2+ ions inhibited by A232, using ultra-high purity nitrogen gas using HCD (Higher energy C-trap Dissociation) fragmentation technology This is the result of fragmentation by applying 16% NCE as a medium. The mass peak corresponding to the mass-to-charge ratio (m/z) of 209.10471 in FIG. 4 is a mass peak having the structure of A232 treated in the sample, indicating that the target neurochemical agent was actually bound to the analyzed biomarker. It is a direct proof. Peaks corresponding to charge ratios (m/z) of 778.33636, 673.29352, and 602.25629 are daughter ions generated by fragmentation of nonapeptide in the HCD cell, and are information that has been used to detect the nonapeptide.
도 5는 A234에 의해 저해된 바이오마커 [M+2H]2+ 이온에 대한 액체크로마토그래피-질량분석 결과로 도 3과 동일한 방법으로 수행된 결과이다.FIG. 5 shows liquid chromatography-mass spectrometry results for the biomarker [M+2H] 2+ ions inhibited by A234, performed in the same manner as in FIG. 3 .
도 6은 A234에 의해 저해된 바이오마커 [M+2H]2+ 이온에 대한 이차 질량분석(MS/MS) 결과로, 도 4와 동일한 방법으로 수행된 결과이다.FIG. 6 shows secondary mass spectrometry (MS/MS) results for the biomarker [M+2H] 2+ ions inhibited by A234, and results obtained in the same manner as in FIG. 4 .
도 7은 A232 또는 A234에 의해 저해된 바이오마커 [M+2H]2+ 이온에 기존 작용제의 연구결과를 통해 유추 가능한 [M+H]+ 이온의 EIC 세기를 비교하여 나타낸 것이다. 이에 따르면, 본 발명의 바이오마커의 [M+2H]2+ 이온이 [M+H]+ 이온 보다 약 2배 가량 높은 봉우리 면적 값(높은 신호세기)을 가지며, 이는 극미량 질량분석시 2배 가량 더 높은 검출 민감도(낮은 분석한계)를 가짐을 의미한다.Figure 7 shows a comparison of the EIC intensity of the [M+2H] 2+ ion, a biomarker inhibited by A232 or A234, of the [M+H] + ion, which can be inferred through research results of existing agents. According to this, the [M+2H] 2+ ion of the biomarker of the present invention has a peak area value (high signal intensity) about twice as high as that of the [M+H] + ion, which is about twice as high in trace mass spectrometry. It means having a higher detection sensitivity (lower analytical limit).
도 8은 VX 또는 GB에 의해 저해된 바이오마커 [M+2H]2+ 이온에 기존 작용제의 연구결과를 통해 유추 가능한 [M+H]+ 이온의 EIC 세기를 비교하여 나타낸 것이다. 도 7과 비교할 때 본 발명에 따른 바이오마커 [M+2H]2+ 이온은 노비촉에 의해 저해된 부티릴콜린에스터라아제에서만 높은 검출 민감도를 가지며, 기존의 신경화학작용제 VX 또는 GB에 의해 저해된 부티릴콜린에스터라아제에는 해당하지 않음을 알 수 있다.8 shows a comparison of the EIC intensity of the [M+2H] 2+ ion, a biomarker inhibited by VX or GB, of the [M+H] + ion, which can be inferred through research results of existing agents. Compared to FIG. 7, the biomarker [M+2H] 2+ ion according to the present invention has high detection sensitivity only for butyrylcholinesterase inhibited by Novichok, and inhibited by conventional neurochemical agents VX or GB. It can be seen that this does not apply to butyrylcholinesterase.
도 9는 VX에 의해 저해된 바이오마커 [M+2H]2+ 이온에 대한 이차 질량분석(MS/MS) 결과로, 도 4와 동일한 방법으로 수행된 결과이다.FIG. 9 shows secondary mass spectrometry (MS/MS) results for the biomarker [M+2H] 2+ ions inhibited by VX, and results obtained in the same manner as in FIG. 4 .
도 10은 GB에 의해 저해된 바이오마커 [M+2H]2+ 이온에 대한 이차 질량분석(MS/MS) 결과로, 도 4와 동일한 방법으로 수행된 결과이다.FIG. 10 shows secondary mass spectrometry (MS/MS) results for the biomarker [M+2H] 2+ ions inhibited by GB, and results obtained in the same manner as in FIG. 4 .
도 3 내지 도 6, 도 9 내지 도 10을 참조하면, 도 3 및 도 5, 도 4 및 도 6은 서로 동일한 경향성을 나타냄을 확인할 수 있으며 이와 같은 경향성은 도 9와 도 10에서 관찰되지 않음을 확인할 수 있다. 이로부터 본 발명에 따른 노비촉 검출용 바이오마커 및 이를 이용한 노비촉의 검출방법은 화학무기금지협약(CWC)의 1.A.14.에서 규정하는 노비촉 계열 신경화학작용제에 대해 일반적으로 적용 가능함을 알 수 있다.Referring to FIGS. 3 to 6 and 9 to 10, it can be confirmed that FIGS. 3 and 5, FIGS. 4 and 6 show the same tendency, and this tendency is not observed in FIGS. 9 and 10. You can check. From this, it can be seen that the biomarker for detecting Novichok and the method for detecting Novichok using the same according to the present invention are generally applicable to Novichok-based neurochemical agents specified in Article 1.A.14 of the Chemical Weapons Convention (CWC). Able to know.
또한, 노비촉 저해된 바이오마커 [M+2H]2+ 이온은 [M+H]+ 이온보다 30% 낮은 에너지로도 충분히 파편화가 이뤄져, 이차 질량분석(MS/MS)에서 더 높은 노비촉-유래 딸이온 세기를 가진다. 이 두 가지 특성을 통해 노비촉 저해된 바이오마커 [M+2H]2+ 이온은 극미량의 노비촉 검출 및 신경화학작용제의 구조정보 획득에 유리하게 사용될 수 있다.In addition, the Novichok-inhibited biomarker [M+2H] 2+ ions were sufficiently fragmented with 30% lower energy than the [M+H] + ions, resulting in higher Novichok- Origin daughter has a century. Through these two characteristics, the biomarker [M+2H] 2+ ions that are inhibited by Novichok can be advantageously used to detect very small amounts of Novichok and obtain structural information of neurochemical agents.
지금까지 본 발명의 일 실시예에 따른 노비촉 검출용 바이오마커 및 이를 이용한 노비촉의 검출방법에 관한 구체적인 실시예에 관하여 설명하였으나, 본 발명의 범위에서 벗어나지 않는 한도 내에서는 여러 가지 실시 변형이 가능함은 자명하다.So far, specific examples of a biomarker for detecting a nobitok and a method for detecting a nobitok using the biomarker according to an embodiment of the present invention have been described, but various modifications are possible within the limits that do not depart from the scope of the present invention. self-explanatory
그러므로 본 발명의 범위는 설명된 실시예에 국한되어 정해져서는 안 되며, 후술하는 특허청구범위뿐만 아니라 이 특허청구범위와 균등한 것들에 의해 정해져야 한다.Therefore, the scope of the present invention should not be limited to the described embodiments and should not be defined, and should be defined by not only the claims to be described later, but also those equivalent to these claims.
즉, 전술된 실시예는 모든 면에서 예시적인 것이며, 한정적인 것이 아닌 것으로 이해되어야 하며, 본 발명의 범위는 상세한 설명보다는 후술될 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 그 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.That is, it should be understood that the above-described embodiments are illustrative in all respects and not restrictive, and the scope of the present invention is indicated by the claims to be described later rather than the detailed description, and the meaning and scope of the claims and All changes or modified forms derived from the equivalent concept should be construed as being included in the scope of the present invention.
Claims (15)
(b) 상기 (a) 단계에서 준비된 시료를 단백질 분해효소로 처리하는 단계; 및
(c) 상기 (b) 단계에서 처리된 시료에 대하여 액체크로마토그래피-질량분석을 수행하여 노비촉 중독 확인용 바이오마커를 검출하는 단계; 를 포함하는 노비촉 중독 확인방법에서,
상기 노비촉 중독 확인용 바이오마커는 부티릴콜린에스터라제의 촉매 삼잔기(catalytic triad) 내 세린 잔기에 노비촉이 공유 결합한 것으로 하기 화학식 3으로 나타내는 2가 하전된 분자이온 [M+2H]2+ 이고,
상기 (c) 단계에서 사용되는 바이오마커인 2가 하전된 분자이온 [M+2H]2+ 이 1가 하전된 분자이온 [M+H]+ 보다 파편화에 더 낮은 에너지가 사용되고, 검출 민감도가 더 높은 것을 특징으로 하는,
노비촉 중독 확인방법:
[화학식 3]
상기 식에서,
R1 내지 R2는 서로 독립적으로, 수소, 치환 또는 비치환된 탄소수 1 내지 10의 알킬기, 치환 또는 비치환된 탄소수 1 내지 10의 사이클로알킬기로 이루어진 군으로부터 선택되고,
R3 내지 R4는 서로 독립적으로, 치환 또는 비치환된 탄소수 1 내지 10의 알킬기, 치환 또는 비치환된 탄소수 1 내지 10 이하의 사이클로알킬기로 이루어진 군으로부터 선택된다.
(a) preparing a blood sample;
(b) treating the sample prepared in step (a) with a proteolytic enzyme; and
(c) performing liquid chromatography-mass spectrometry on the sample treated in step (b) to detect a biomarker for confirming Novichok poisoning; In the method for confirming the poisoning of Novichok,
The biomarker for confirming Novichok poisoning is a divalently charged molecular ion [M+2H] 2 represented by Formula 3 below in which Novichok is covalently bonded to a serine residue in the catalytic triad of butyrylcholinesterase. + is
The 2-charged molecular ion [M+2H] 2+ , which is the biomarker used in step (c), uses lower energy for fragmentation than the 1-charged molecular ion [M+H] + , and has higher detection sensitivity. characterized by high
How to identify Novichok poisoning:
[Formula 3]
In the above formula,
R 1 to R 2 are each independently selected from the group consisting of hydrogen, a substituted or unsubstituted alkyl group having 1 to 10 carbon atoms, and a substituted or unsubstituted cycloalkyl group having 1 to 10 carbon atoms;
R 3 to R 4 are each independently selected from the group consisting of a substituted or unsubstituted alkyl group having 1 to 10 carbon atoms and a substituted or unsubstituted cycloalkyl group having 1 to 10 carbon atoms or less.
상기 (c) 단계에서 액체크로마토그래피-질량분석은 HCD(Higher energy C-trap dissociation) 파편화 기술을 이용한 이차 질량분석을 추가로 수행하는 것을 특징으로 하는,
노비촉 중독 확인방법.
According to claim 11,
In step (c), liquid chromatography-mass spectrometry is characterized by additionally performing secondary mass spectrometry using HCD (Higher energy C-trap dissociation) fragmentation technology.
Methods for determining Novichok poisoning.
자성 비드와 항-부티릴콜린에스터라제 항체를 이용하는 것을 특징으로 하는,
노비촉 중독 확인방법.
According to claim 11,
Characterized in that using magnetic beads and anti-butyrylcholinesterase antibody,
Methods for determining Novichok poisoning.
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|---|---|---|---|---|
| KR20100075772A (en) | 2006-11-13 | 2010-07-05 | 아테리스 테크놀로지스, 엘엘씨 | Pesticide biomarker |
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Patent Citations (1)
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|---|---|---|---|---|
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Daan Noort et al., Chem. Res. Toxicol., (2021.07.), Vol. 34, pp 1926-1932. 1부.* * |
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