KR102495917B1 - Method of producing 5'-triphosphate oligoadenylate - Google Patents
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Abstract
서열번호 1의 염기서열을 갖는 DNA 주형과 T7 중합효소를 반응시키는 단계를 포함하는, 5'-삼인산올리고아데닐레이트 제조방법, 및 서열번호 1의 염기서열을 갖는 DNA 주형을 포함하는 5'-삼인산올리고아데닐레이트 제조용 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 기존의 시험관 내 전사 기술에서 사용된 주형과 상이한 주형을 사용하여 5'-삼인산이 결합된 짧은 길이의 선형 올리고아데닐레이트 리보핵산을 제조할 수 있음을 새롭게 규명하였다. 본 발명의 제조방법으로 합성된 5’-삼인산 선형 올리고아데닐레이트는 미생물의 신규 신호전달물질로 밝혀진 사이클릭 올리고아데닐레이트의 전구 물질로 사용될 수 있고, 다양한 면역 기능에 작용하므로 면역 관련 질환의 치료 연구 등 광범위한 분야에 유용하게 사용될 수 있다.A method for producing 5'-triphosphate oligoadenylate comprising reacting a DNA template having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 with T7 polymerase, and a 5'-triphosphate comprising a DNA template having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 It relates to a composition for preparing oligoadenylate triphosphate.
The present invention has newly identified that short-length linear oligoadenylate ribonucleic acid to which 5'-triphosphate is bound can be prepared using a template different from that used in conventional in vitro transcription techniques. The 5'-triphosphate linear oligoadenylate synthesized by the production method of the present invention can be used as a precursor of cyclic oligoadenylate, which has been found to be a novel signal transducer for microorganisms, and acts on various immune functions, thereby preventing immune-related diseases. It can be usefully used in a wide range of fields such as treatment research.
Description
서열번호 1의 염기서열을 갖는 DNA 주형과 T7 중합효소를 반응시키는 단계를 포함하는 5'-삼인산올리고아데닐레이트 제조방법, 및 서열번호 1의 염기서열을 갖는 DNA 주형을 포함하는 5'-삼인산올리고아데닐레이트 제조용 조성물에 관한 것이다.A method for preparing oligoadenylate 5'-triphosphate comprising reacting a DNA template having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 with T7 polymerase, and a 5'-triphosphate comprising a DNA template having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 It relates to a composition for preparing oligoadenylate.
올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)는 핵산 중합체로서, 이를 이용한 치료제는 유전자 발현을 조절하는 기술과 함께 차세대 의약품으로 상당한 잠재력을 지니고 있으며, 올리고뉴클레오티드는 타깃 유전자를 선택적으로 표적화하도록 설계할 수 있으므로, 정밀 의학을 가능하게 한다. 최근에는, 다양한 뉴클레오티드 유도체가 세포에 작용하여 세포 사멸을 유도하거나 사이토카인을 분비시켜 인체의 면역 기능을 강화한다고 보고되고 있다. 따라서, 올리고뉴클레오티드의 합성 방법은 RNA 치료제 분야의 원료 공급과 관련하여 그 수요가 점차 증가하고 있다. Oligonucleotides are nucleic acid polymers, and therapeutic agents using them have considerable potential as next-generation medicines along with technology to regulate gene expression, and oligonucleotides can be designed to selectively target target genes, enabling precision medicine. let it Recently, it has been reported that various nucleotide derivatives act on cells to induce apoptosis or secrete cytokines to enhance the immune function of the human body. Therefore, the demand for oligonucleotide synthesis methods is gradually increasing in relation to the supply of raw materials in the field of RNA therapeutics.
한편, CRISPR-Cas 시스템은 원핵세포에서 외부에서 침입한 유전 인자에 대항하는 방어 기전을 제공한다. 이들은 침입한 전사체를 인지하고 분해하는데, 주로 RNA 가이드 인지 및 간섭 현상을 통해서 그 기능이 수행된다. Cas10 활성화에 의해서 생성되는 사이클릭 올리고아데닐화 제2형 메신저(cyclic oligoadenylated second messenger)가, CRISPR-연관 리보핵산분해효소로서 침입한 전사체를 분해하는 기능을 하는 Csm6를 활성화 시킨다는 연구 결과가 보고된 바 있다 (Nature 548: 543-548, 2017). 즉, 사이클릭 올리고아데닐레이트는 미생물에서 생성되는 신호전달물질로 밝혀졌으며, 상기 사이클릭 올리고아데닐레이트의 전구 물질 중 하나로서 5'-삼인산 선형 올리고아데닐레이트가 알려져 있다.On the other hand, the CRISPR-Cas system provides a defense mechanism against genetic factors invading from the outside in prokaryotic cells. They recognize and degrade invading transcripts, mainly through RNA guide recognition and interference. A study reported that the cyclic oligoadenylated second messenger generated by Cas10 activation activates Csm6, a CRISPR-associated ribonucleic acid lyase that functions to degrade invaded transcripts. (Nature 548: 543-548, 2017). That is, cyclic oligoadenylate has been found to be a signal transducer produced by microorganisms, and 5'-triphosphate linear oligoadenylate is known as one of the precursors of the cyclic oligoadenylate.
이렇듯 다양한 기능을 하는 올리고뉴클레오티드의 제조 방법과 관련하여, 종래의 화학적 합성 방법으로는 5' 말단이 하이드록실(hydroxyl)기로 이루어진 선형 올리고아데닐레이트의 생산만 가능하며, 5' 말단에 삼인산을 가진 리보핵산으로 대체하는 통상적인 치환 기술이 없는 바, 상당한 시간과 비용을 통한 합성 단계를 거쳐야 한다. 반면, 화학적 합성이 아닌 일반적인 시험관 내 리보핵산 전사 기술을 통하여 5' 말단에 삼인산을 가진 리보핵산을 제조하여도, 5' 말단이 구아닐레이트로 시작되며, 염기의 길이가 통상적으로 20개 이상의 길이를 가진 리보핵산만이 제조 가능하다.Regarding the method for producing oligonucleotides having various functions, conventional chemical synthesis methods can only produce linear oligoadenylates having a hydroxyl group at the 5' end, and having triphosphate at the 5' end. Since there is no conventional substitution technology for replacing with ribonucleic acid, it is necessary to go through a synthesis step with considerable time and cost. On the other hand, even if ribonucleic acid having triphosphate at the 5' end is prepared through general in vitro ribonucleic acid transcription technology rather than chemical synthesis, the 5' end starts with guanylate and the length of the base is usually 20 or more. Only ribonucleic acids with can be produced.
이러한 배경 하에서, 본 발명자들은 기존의 시험관 내 전사 기술에서 사용되는 주형과 상이한 주형을 사용하여 5' 삼인산이 결합된 짧은 길이의 선형 올리고아데닐레이트 리보핵산을 제조함으로써 본 발명을 완성하였다.Under this background, the present inventors completed the present invention by preparing a short-length linear oligoadenylate ribonucleic acid to which 5' triphosphate is bonded using a template different from that used in conventional in vitro transcription techniques.
본 발명의 목적은 서열번호 1의 염기서열을 갖는 DNA 주형과 T7 중합효소를 반응시키는 단계를 포함하는 5'-삼인산올리고아데닐레이트 제조방법을 제공하는 것이다.An object of the present invention is to provide a method for producing 5'-triphosphate oligoadenylate comprising the step of reacting a DNA template having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 with T7 polymerase.
본 발명의 다른 하나의 목적은 서열번호 1의 염기서열을 갖는 DNA 주형을 포함하는 5'-삼인산올리고아데닐레이트 제조용 조성물을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a composition for preparing 5'-triphosphate oligoadenylate comprising a DNA template having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.
이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 발명에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.A detailed description of this is as follows. Meanwhile, each description and embodiment disclosed in the present invention may also be applied to each other description and embodiment. That is, all combinations of the various elements disclosed herein fall within the scope of the present invention. In addition, it cannot be seen that the scope of the present invention is limited by the specific descriptions described below.
또한, 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 통상의 실험만을 사용하여 본 발명에 기재된 본 발명의 특정 양태에 대한 다수의 등가물을 인지하거나 확인할 수 있다. 또한, 이러한 등가물은 본 발명에 포함되는 것으로 의도된다.In addition, those skilled in the art will recognize, or be able to ascertain using no more than routine experimentation, many equivalents to the specific embodiments of the invention described herein. Also, such equivalents are intended to be included in this invention.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 하나의 양태는 서열번호 1의 염기서열을 갖는 DNA 주형과 T7 중합효소를 반응시키는 단계를 포함하는 5'-삼인산올리고아데닐레이트 제조방법을 제공한다.One aspect of the present invention for achieving the above object provides a method for producing 5'-triphosphate oligoadenylate comprising the step of reacting a DNA template having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 with T7 polymerase.
본 발명의 서열번호 1의 염기서열을 갖는 DNA 주형은, RNA 중합효소의 전사를 위한 DNA 주형을 의미한다. 구체적으로, 상기 서열번호 1의 염기서열을 갖는 DNA 주형은 T7 프로모터 영역을 포함할 수 있으며, 시험관 내 전사에서 사용되는 DNA 주형을 의미할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명에서 "DNA 주형" 또는 "주형 DNA"는 혼용하여 사용될 수 있다.A DNA template having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 of the present invention means a DNA template for transcription of RNA polymerase. Specifically, the DNA template having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 may include a T7 promoter region, and may refer to a DNA template used for in vitro transcription, but is not limited thereto. In the present invention, "DNA template" or "template DNA" may be used interchangeably.
본 발명의 "시험관 내(in vitro)"는 살아있는 생명체 내부가 아니라 시험관과 같이 제어가 가능한 환경에서 수행되는 실험 과정을 의미한다. 상기 시험관 내부의 환경에서는 다양한 변인을 용이하게 통제할 수 있어 효율적으로 결과를 확인할 수 있다." In vitro " of the present invention refers to an experimental process performed in a controllable environment such as a test tube, not inside a living organism. In the environment inside the test tube, various variables can be easily controlled, and the results can be efficiently confirmed.
본 발명의 "시험관 내 전사(in vitro transcription)"는 박테리오파지 시스템의 구성 요소를 이용하여 시험관 내에서 DNA에서 RNA를 합성하는 기술로서, RNA 중합효소와 그 보조 인자, dNTP 및 DNA 주형을 이용한다. 상기 시험관 내 전사 기술은 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있으며, 시판되는 키트 등을 이용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.The " in vitro transcription" of the present invention is a technique for synthesizing RNA from DNA in vitro using components of a bacteriophage system, using RNA polymerase, its cofactor, dNTP, and DNA template. For the in vitro transcription technique, a method known in the art may be used, and a commercially available kit may be used, but is not limited thereto.
기존의 시험관 내 전사 기술에서는, DNA 주형으로서 5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3'의 핵산 서열을 이용하였으나, 이 경우, 5' 말단이 구아닐레이트로 시작되는 뉴클레오티드만이 제조된다는 점에서 한계가 있었다. 이에, 본 발명자들은 종래 시험관 내 전사에서 사용되던 주형과 상이한 DNA 주형인 5'-TAATACGACTCACTATAAAA-3' DNA 주형 (서열번호 1)을 이용하여, 5' 삼인산이 결합된 선형 올리고아데닐레이트를 제조할 수 있음을 최초로 규명하였다.In the conventional in vitro transcription technology, a nucleic acid sequence of 5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3' was used as a DNA template, but in this case, there is a limitation in that only nucleotides whose 5' ends start with guanylate are prepared. Accordingly, the present inventors prepared a 5' triphosphate-linked linear oligoadenylate using a 5'-TAATACGACTCACTATAAAA-3' DNA template (SEQ ID NO: 1), which is a DNA template different from the template used in in vitro transcription. It was first established that it could be
본 발명의 T7 중합효소(T7 polymerase)는 T7 박테리오파지로부터 유래된 DNA 의존적인 RNA 중합효소이다. 상기 T7 중합효소는 시험관 내 전사에서 사용될 수 있으며, 시판되는 물질을 사용할 수 있다.The T7 polymerase of the present invention is a DNA-dependent RNA polymerase derived from T7 bacteriophage. The T7 polymerase can be used for in vitro transcription, and a commercially available material can be used.
본 발명의 "5'-삼인산올리고아데닐레이트(triphosphateadenylate)"는 5' 말단에 삼인산을 가지고 2개 이상의 AMP가 연결된 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 상기 5'-삼인산올리고아데닐레이트는 2개 이상의 AMP를 포함할 수 있으며, 구체적으로, 3 내지 8개, 4 내지 8개, 또는 5 내지 7개의 AMP를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 더욱 구체적으로는, 6개 또는 7개의 AMP를 포함할 수 있으며, 이 경우, 상기 5'-삼인산올리고아데닐레이트는 5'-삼인산헥사아데닐레이트(5'-triphosphate hexa-adenylate) 또는 5'-삼인산헵타아데닐레이트(5'-triphosphate hepta-adenylate)일 수 있다."5'-triphosphate oligoadenylate" of the present invention refers to an oligonucleotide having triphosphate at the 5' end and two or more AMPs linked thereto. The 5'-triphosphate oligoadenylate may include two or more AMPs, specifically, may include 3 to 8, 4 to 8, or 5 to 7 AMPs, but is not limited thereto. More specifically, it may include 6 or 7 AMPs, and in this case, the 5'-triphosphate oligoadenylate is 5'-triphosphate hexaadenylate or 5'-triphosphate hexaadenylate. -It may be 5'-triphosphate hepta-adenylate.
5'-삼인산올리고아데닐레이트의 제조 방법과 관련하여, 종래의 화학적 합성 방법으로는 5' 말단이 하이드록실(hydroxyl)기로 이루어진 선형 올리고아데닐레이트의 생산만 가능하며, 5' 말단에 삼인산을 가진 리보핵산으로 대체하는 통상적인 치환 기술이 없는 바, 상당한 시간과 비용을 통한 합성 단계를 거쳐야 한다. 반면, 화학적 합성이 아닌 일반적인 시험관 내 리보핵산 전사 기술을 통하여 5' 말단에 삼인산을 가진 리보핵산을 제조하여도, 5' 말단이 구아닐레이트로 시작되며, 염기의 길이가 통상적으로 20개 이상의 길이를 가진 리보핵산만이 제조 가능하였다. 이에, 본 발명자들은 기존의 시험관 내 전사 기술에서 사용되는 주형과 상이한 주형을 사용하여, 5' 삼인산이 결합된 짧은 길이의 선형 올리고아데닐레이트를 시험관 내 전사 기술을 이용하여 제조할 수 있는 방법을 최초로 규명하였다.Regarding the method for producing 5'-triphosphate oligoadenylate, conventional chemical synthesis methods can only produce linear oligoadenylates in which the 5' end is composed of a hydroxyl group, and triphosphate is added to the 5' end. Since there is no conventional substitution technology for replacing ribonucleic acid with ribonucleic acid, it is necessary to go through a synthesis step through considerable time and cost. On the other hand, even if ribonucleic acid having triphosphate at the 5' end is prepared through general in vitro ribonucleic acid transcription technology rather than chemical synthesis, the 5' end starts with guanylate and the length of the base is usually 20 or more. Only ribonucleic acids with were able to be prepared. Accordingly, the present inventors have developed a method for preparing a short-length linear oligoadenylate to which 5' triphosphate is bonded using in vitro transcription technology using a template different from that used in conventional in vitro transcription technology. first identified.
본 발명의 "올리고뉴클레오티드"는 "리보핵산"과 혼용하여 사용될 수 있다."Oligonucleotide" of the present invention may be used interchangeably with "ribonucleic acid".
본 발명의 5'-삼인산올리고아데닐레이트 제조방법은 시험관 내(in vitro)에서 수행되는 것일 수 있다. 본 발명의 구체적인 일 구현예에서, 시험관 내 전사 기술을 통해 5'-TAATACGACTCACTATAAAA-3' DNA 주형(서열번호 1)과 T7 중합효소를 반응시켜 5'-삼인산올리고아데닐레이트를 수득하고 (실시예 1), 그 종류를 확인한 결과, 5'-triphosphate hexa-adenylate 및 5'-triphosphate hepta-adenylate가 주로 생성된 것을 확인하였다 (실시예 3).The method for producing 5'-triphosphate oligoadenylate of the present invention may be performed in vitro . In a specific embodiment of the present invention, a 5'-TAATACGACTCACTATAAAA-3' DNA template (SEQ ID NO: 1) and T7 polymerase are reacted to obtain 5'-triphosphate oligoadenylate through in vitro transcription technology (Example 1), as a result of confirming the type, it was confirmed that 5'-triphosphate hexa-adenylate and 5'-triphosphate hepta-adenylate were mainly produced (Example 3).
본 발명의 5'-삼인산올리고아데닐레이트 제조방법은 rATP 또는 rGTP를 함께 반응시키는 것일 수 있다. 상기 반응은 20 내지 40℃, 30 내지 40℃, 또는 구체적으로 35 내지 40℃에서 수행되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 반응은 1 내지 5시간, 1 내지 4시간, 또는 구체적으로 1 내지 3시간 동안 수행되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.The method for producing 5'-triphosphate oligoadenylate of the present invention may be to react with rATP or rGTP. The reaction may be performed at 20 to 40 °C, 30 to 40 °C, or specifically 35 to 40 °C, but is not limited thereto. The reaction may be performed for 1 to 5 hours, 1 to 4 hours, or specifically 1 to 3 hours, but is not limited thereto.
본 발명의 5'-삼인산올리고아데닐레이트 제조방법은 Dnase를 처리하는 단계를 추가로 포함하는 것일 수 있다. 상기 Dnase의 처리는 DNA 주형의 제거를 위한 것일 수 있으며, 20 내지 40℃, 30 내지 40℃, 또는 구체적으로 35 내지 40℃에서 수행되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 Dnase의 처리는 30분 내지 4시간, 30분 내지 3시간, 또는 구체적으로 30분 내지 2시간 동안 수행되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.The method for producing 5'-triphosphate oligoadenylate of the present invention may further include a step of treating Dnase. The Dnase treatment may be for the removal of a DNA template, and may be performed at 20 to 40°C, 30 to 40°C, or specifically 35 to 40°C, but is not limited thereto. The Dnase treatment may be performed for 30 minutes to 4 hours, 30 minutes to 3 hours, or specifically 30 minutes to 2 hours, but is not limited thereto.
본 발명의 5'-삼인산올리고아데닐레이트 제조방법은 Dnase 효소를 불활성화시키는 단계를 추가로 포함하는 것일 수 있다. 상기 불활성화는 가열 또는 페놀클로로포름을 처리하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.The method for preparing oligoadenylate 5'-triphosphate of the present invention may further include a step of inactivating a Dnase enzyme. The inactivation may be performed by heating or treating with phenolchloroform, but is not limited thereto.
본 발명의 "5'-삼인산올리고아데닐레이트 제조방법"은 상기 생산된 5'-삼인산올리고아데닐레이트를 정제하는 단계를 추가적으로 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 5'-삼인산올리고아데닐레이트를 정제하는 단계는 당업계의 공지된 임의의 방법으로 수행될 수 있다. 구체적으로, 정제 방법으로는 에탄올 침전법, 친화성 크로마토그래피, 크기-배제 크로마토그래피 또는 이온 교환 크로마토그래피를 포함하는 다양한 공지의 방법들을 적용할 수 있으며, 필요에 따라서는 보다 높은 순도로 정제하기 위해 복수개의 서로 다른 방법을 조합하여 사용할 수 있다.The "method for preparing 5'-triphosphate oligoadenylate" of the present invention may additionally include a step of purifying the produced 5'-triphosphate oligoadenylate, but is not limited thereto. Purifying the 5'-triphosphate oligoadenylate may be performed by any method known in the art. Specifically, as the purification method, various known methods including ethanol precipitation method, affinity chromatography, size-exclusion "chromatography" or ion exchange "chromatography" may be applied, and if necessary, in order to purify to a higher purity. A plurality of different methods may be used in combination.
본 발명의 다른 하나의 양태는 서열번호 1의 염기서열을 갖는 DNA 주형을 포함하는 5'-삼인산올리고아데닐레이트 제조용 조성물을 제공한다.Another aspect of the present invention provides a composition for preparing 5'-triphosphate oligoadenylate comprising a DNA template having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.
본 발명의 "서열번호 1의 염기서열을 갖는 DNA 주형", 및 "5'-삼인산올리고아데닐레이트"은 상기 기재된 바와 같다.The "DNA template having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1" and the "5'-triphosphate oligoadenylate" of the present invention are as described above.
본 발명의 "5'-삼인산올리고아데닐레이트 제조용 조성물"은 T7 중합효소, rATP 또는 rGTP를 추가로 포함하는 것일 수 있다.The "composition for producing 5'-triphosphate oligoadenylate" of the present invention may further include T7 polymerase, rATP or rGTP.
본 발명의 "제조"는 생합성 반응을 통해 목적하는 화합물을 생성하는 과정을 말한다. 목적하는 물질을 수득할 때까지 여러 단계의 반응이 일어날 수 있으며, 각 단계에서 부수하여 화학적, 물리적인 단리·정제·분석이 이루어질 수 있다."Preparation" of the present invention refers to a process of producing a desired compound through a biosynthetic reaction. Several stages of reaction may occur until the desired substance is obtained, and chemical and physical isolation, purification, and analysis may be performed in conjunction with each stage.
본 발명의 구체적인 일 구현예에서, 상기 제조는 5'-삼인산올리고아데닐레이트를 목적하는 화합물로서 수득하는 과정일 수 있으며, 상기 5'-삼인산올리고아데닐레이트는 서열번호 1의 염기서열을 갖는 DNA 주형으로부터 생성될 수 있다.In a specific embodiment of the present invention, the preparation may be a process of obtaining 5'-triphosphate oligoadenylate as a desired compound, wherein the 5'-triphosphate oligoadenylate has the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 Can be generated from a DNA template.
본 발명의 "5'-삼인산올리고아데닐레이트 제조용 조성물"은 시험관 내(in vitro) 조건에서 서열번호 1의 염기서열을 갖는 DNA 주형을 이용하여 5'-삼인산올리고아데닐레이트를 생산하는 데 이용될 수 있다. The "composition for producing 5'-triphosphate oligoadenylate" of the present invention is used to produce 5'-triphosphate oligoadenylate using a DNA template having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 under in vitro conditions. It can be.
본 발명은 기존의 시험관 내 전사 기술에서 사용된 주형과 상이한 주형을 사용하여 5'-삼인산이 결합된 짧은 길이의 선형 올리고아데닐레이트 리보핵산을 제조할 수 있음을 새롭게 규명하였다. 본 발명의 제조방법으로 합성된 5’-삼인산 선형 올리고아데닐레이트는 미생물의 신규 신호전달물질로 밝혀진 사이클릭 올리고아데닐레이트의 전구 물질로 사용될 수 있고, 다양한 면역 기능에 작용하므로 면역 관련 질환의 치료 연구 등 광범위한 분야에 유용하게 사용될 수 있다.The present invention has newly identified that short-length linear oligoadenylate ribonucleic acid to which 5'-triphosphate is bound can be prepared using a template different from that used in conventional in vitro transcription techniques. The 5'-triphosphate linear oligoadenylate synthesized by the production method of the present invention can be used as a precursor of cyclic oligoadenylate, which has been found to be a novel signal transducer for microorganisms, and acts on various immune functions, thereby preventing immune-related diseases. It can be usefully used in a wide range of fields such as treatment research.
도 1은 32P-ATP의 반응 참여 정도를 확인한 젤 전기영동 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 5'-삼인산올리고아데닐레이트의 생성 여부를 확인한 LC/MS 결과를 나타낸 도이다.1 is a diagram showing the results of gel electrophoresis confirming the degree of participation of 32P-ATP in the reaction.
Figure 2 is a diagram showing the LC / MS results to determine whether 5'-triphosphate oligoadenylate is produced.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail through examples. These examples are intended to explain the present invention in more detail, and the scope of the present invention is not limited by these examples.
실시예 1. 시험관 내 전사 기술을 이용한 5'-삼인산올리고아데닐레이트 제조Example 1. Preparation of 5'-triphosphate oligoadenylate using in vitro transfer technology
시험관 내 전사 기술(in vitro transcription)을 이용하여 5'-삼인산이 결합된 짧은 길이의 선형 올리고아데닐레이트 리보핵산을 제조하고자 하였다. 구체적으로, T7 프로모터 영역을 포함한 5'-TAATACGACTCACTATAAAA-3' DNA 주형 (서열번호 1)과 rATP (또는 rGTP), T7 중합효소, 반응 완충액을 37℃에서 2시간 동안 반응시켰다. 그 후, DNA 주형의 제거를 위하여 Dnase를 37℃에서 1시간 처리하고, 가열 및 페놀클로로포름을 이용하여 효소를 불활성화시켰다. 최종적으로, 에탄올 침전법을 활용하여 5'-삼인산올리고아데닐레이트를 수득하였다.An attempt was made to prepare a short-length linear oligoadenylate ribonucleic acid to which 5'-triphosphate was bonded using in vitro transcription. Specifically, the 5'-TAATACGACTCACTATAAAA-3' DNA template (SEQ ID NO: 1) including the T7 promoter region, rATP (or rGTP), T7 polymerase, and reaction buffer were reacted at 37°C for 2 hours. Thereafter, to remove the DNA template, Dnase was treated at 37° C. for 1 hour, and the enzyme was inactivated using heat and phenol chloroform. Finally, 5'-triphosphate oligoadenylate was obtained using an ethanol precipitation method.
실시예 2. 반응 활성 확인Example 2. Confirmation of reaction activity
방사능동위원소 32P-ATP를 이용하여 ATP가 어느 정도의 수율로 반응에 참여하였는지 여부를 denaturing urea polyacrylamide gel electrophoresis를 통해 확인하였다. Using the radioactive isotope 32P-ATP, it was confirmed by denaturing urea polyacrylamide gel electrophoresis whether ATP participated in the reaction at a certain yield.
그 결과, 도 1에 나타난 바와 같이, 32P-ATP가 반응에 모두 참여하여 새로운 생성물이 제조된 것을 확인하였다.As a result, as shown in FIG. 1, it was confirmed that all 32P-ATP participated in the reaction to produce a new product.
실시예 3. 5'-삼인산올리고아데닐레이트의 생성 여부 확인Example 3. Confirmation of the production of 5'-triphosphate oligoadenylate
실시예 2에서 새롭게 합성된 생성물의 종류를 확인하기 위하여 LC/MS 분석을 진행하였다.LC/MS analysis was performed to confirm the type of the newly synthesized product in Example 2.
그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, 5'-triphosphate hexa-adenylate 및 5'-triphosphate hepta-adenylate가 주로 생성된 것을 알 수 있었다.As a result, as shown in FIG. 2, it was found that 5'-triphosphate hexa-adenylate and 5'-triphosphate hepta-adenylate were mainly produced.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.From the above description, those skilled in the art to which the present invention pertains will be able to understand that the present invention may be embodied in other specific forms without changing its technical spirit or essential features. In this regard, it should be understood that the embodiments described above are illustrative in all respects and not limiting. The scope of the present invention should be construed as including all changes or modifications derived from the meaning and scope of the following claims and their equivalent concepts rather than the detailed description above.
<110> KOREA RESEARCH INSTITUTE OF BIOSCIENCE AND BIOTECHNOLOGY <120> Method of producing 5'-triphosphate oligoadenylate <130> KPA201477-KR <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA template <400> 1 taatacgact cactataaaa 20 <110> KOREA RESEARCH INSTITUTE OF BIOSCIENCE AND BIOTECHNOLOGY <120> Method of producing 5'-triphosphate oligoadenylate <130> KPA201477-KR <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> DNA template <400> 1 taatacgact cactataaaa 20
Claims (8)
A method for producing 5'-triphosphate oligoadenylate comprising the step of reacting a DNA template having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 with T7 polymerase.
The method of claim 1, wherein the 5'-triphosphate oligoadenylate is 5'-triphosphate hexaadenylate or 5'-triphosphate hepta-adenylate ), which is, 5'-triphosphate oligoadenylate production method.
According to claim 1, wherein the production method is carried out in vitro ( in vitro ), 5'-triphosphate oligoadenylate production method.
The method of claim 3, wherein rATP or rGTP are reacted together.
[Claim 5] The method of claim 4, further comprising the step of treating Dnase.
A composition for preparing 5'-triphosphate oligoadenylate comprising a DNA template having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.
The method of claim 6, wherein the 5'-triphosphate oligoadenylate is 5'-triphosphate hexaadenylate or 5'-triphosphate hepta-adenylate ), which is, 5'- triphosphate oligoadenylate composition for preparing.
The composition of claim 6, wherein the composition further comprises a T7 polymerase.
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