KR102488482B1 - 나노입자가 표면에 코팅된 생체이식용 구조체, 및 이의 용도 및 제조 방법 - Google Patents

Abstract

본 출원은 나노입자가 표면에 코팅된 생체이식용 구조체, 및 이의 용도 및 제조 방법에 관한 것으로서, 일 실시예의 생체이식용 구조체에 의하면, 초음파 인가를 통해 표면 나노입자의 진동이 유도됨으로써, 세포의 증식 및 대사 활동을 조절할 수 있다. 이로 인해, 상기 생체이식용 구조체를 사용하는 경우, 약물 방출 삽입물의 사용 및 외과적인 수술 없이도 비침습적으로 재협착증을 예방 및 치료할 수 있으며, 특정 약물을 사용할 수 없는 환자에게도 적용할 수 있다. 또한, 상기 생체이식용 구조체는 스텐트, 임플란트 등 다양한 삽입형 소재에 적용되어 세포의 대사 활동을 조절할 수 있다. 따라서, 상기 생체이식용 구조체는 세포의 대사 활동 조절이 요구되는 다양한 질환의 예방 또는 치료를 위해 사용될 수 있다.

Description

나노입자가 표면에 코팅된 생체이식용 구조체, 및 이의 용도 및 제조 방법{Structure for bio-implant coated with nanoparticles, and use and manufacturing method thereof}

나노입자가 표면에 코팅된 생체이식용 구조체, 및 이의 용도 및 제조 방법에 관한 것이다.

스텐트 (stent)는 좁아진 혈관을 다시 넓혀 주는 그물망으로서 심장 근육에 혈액을 공급하는 관상동맥이 동맥경화로 좁아지면 협심증이나 심근경색증이 생기게 되는 바 이를 치료하는 방법의 수술에 사용한다. 스텐트를 사용한 심혈관 확장술 시술을 받은 환자의 약 20 내지 30%는 혈관이 다시 협착되는 재협착증이 발병한다. 이러한 재협착의 주된 원인은 혈관내막 증식에 의한 것으로, 스텐트를 재삽입하는 외과적인 수술이나, 약물방출형 스텐트의 삽입으로 예방 및 치료가 이루어지고 있다.

그러나 외과적인 수술은 환자에게 부담이 크고, 약물방출 스텐트는 시장의 약 98.1%가 외국산 제품으로 국산 제품 개발 및 사용은 미비한 상황이다. 이에 따라 국산화 되고, 외과적 수술 없이도 유지 및 관리가 가능한 스텐트에 대한 연구가 활발히 이루어지고 있으나 (KR 등록특허 10-1791892), 아직은 미비한 실정이다.

일 양상은 생체이식용 본체; 및 상기 본체의 표면에 코팅된 나노입자를 포함하는 생체이식용 구조체를 제공하는 것이다.

다른 양상은 상기 생체이식용 구조체를 포함하는 스텐트 및 임플란트를 제공하는 것이다.

또 다른 양상은 생체이식용 본체의 표면에 나노입자를 코팅하는 단계를 포함하는 생체이식용 구조체를 제조하는 방법 및 상기 방법에 의해 제조된 생체이식용 구조체를 제공하는 것이다.

또 다른 양상은 상기 생체이식용 구조체에 초음파를 인가하는 단계를 포함하는 세포의 증식을 조절하는 방법 및 상기 방법을 이용하는 재협착증을 예방 또는 치료하는 방법을 제공하는 것이다.

본 출원의 다른 목적 및 이점은 첨부한 청구범위 및 도면과 함께 하기의 상세한 설명에 의해 보다 명확해질 것이다. 본 명세서에 기재되지 않은 내용은 본 출원의 기술 분야 또는 유사한 기술 분야 내 숙련된 자이면 충분히 인식하고 유추할 수 있는 것이므로 그 설명을 생략한다.

본 출원에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.

일 양상은 생체이식용 본체; 및 상기 본체의 표면에 코팅된 나노입자를 포함하는 생체이식용 구조체를 제공한다.

상기 생체이식용 본체는 평평한 판 형상 구조를 가지거나, 원통형 튜브 형상 구조를 가질 수 있고, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 생체이식용 본체는 금속 또는 고분자 물질로 제조된 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 생체이식용 본체는 중량평균분자량 약 10 내지 1,000,000, 약 100 내지 100,000, 또는 약 1,000 내지 10,000 g/mol의 고분자를 포함하는 것일 수 있다. 더욱 구체적으로, 상기 생체이식용 본체는 스테인레스 스틸, 코발트-크롬, 백금-크롬, 탄탈륨, 티타늄, 니티놀, 플래티늄-이리듐, 금, 백금, 은, 마그네슘, 및 이들의 합금으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 어느 하나의 금속; 또는 폴리글리콜산 (PGA), 폴리-L-락트산 (PLLA), 폴리-D-락트산 (PDLA), 폴리-D,L-락트산 (PDLLA), 폴리-카프로락톤 (PCL), 폴리락트산-글리콜산 공중합체 (PLGA), 폴리락티드-코-카프로락톤 (PLCL), 타이로신폴리카보네이트, 살리실산 함유 고분자, 폴리에틸렌글리콜, 폴리아미노산, 폴리안하이드라이드, 폴리오르쏘에스테르, 폴리디옥사논, 폴리포스파겐, 셀룰로오스 아세테이트 부틸레이트, 셀룰로오스 트리아세테이트, 폴리락티드 (PLA), 폴리트리메틸렌카보네이트 (PTMC), 폴리-히드록시부티레이트 (PHB), 및 이들의 공중합체로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 어느 하나의 고분자를 포함하는 것일 수 있고, 바람직하게는, 코발트-크롬을 포함하는 것일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 금속 또는 고분자 물질은 생분해성 물질인 것일 수 있다. 따라서, 상기 생체이식용 본체는 생분해성 금속 또는 생분해성 고분자로 제조된 것으로서, 생분해성의 특성을 가지는 것일 수 있다.

용어, "생분해성 (biodegradable)"은 적어도 분해의 한 과정에서 생물의 대사가 관여하여 고분자량 물질이 저분자량 물질로 변하는 특성을 의미한다. 이상적인 생분해성 물질은 사용하고 있는 동안에는 우수한 성능을 발휘하고 폐기 후에는 자연계의 미생물 또는 효소에 의해 신속하게 분해되는 것이 바람직하다.

또한, 상기 나노입자는 금속, 비금속, 세라믹, 플라스틱, 고분자, 생물학적 소재, 반도체, 양자점, 또는 이들의 하나 이상의 복합재질로 이루어진 것일 수 있고, 바람직하게는, 상기 나노입자는 금속 나노입자를 포함하는 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 나노입자는 Li, Na, K, Rb, Cs, Fr, Mg, Ca, Sr, Ba, Ra, Sc, Y, Lu, Ti, Zr, Hf, Nb, Ta, Cr, Mo, W, Mn, Re, Fe, Ru, Os, Co, Rh, Ir, Ni, Pd, Pt, Cu, Ag, Au, Zn, Ga, In, Ti, Sn, Bi, Si, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 어느 하나의 금속 나노입자를 포함하는 것일 수 있고, 바람직하게는, 금 나노입자를 포함할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 나노입자는 생분해성 나노입자인 것일 수 있다.

상기 나노입자는 평균 지름이 약 1 nm 내지 약 100 nm인 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 나노입자는 평균 지름이 약 1 nm 내지 약 80 nm, 약 1 nm 내지 약 50 nm, 약 1 nm 내지 약 40 nm, 약 1 nm 내지 약 30 nm, 약 1 nm 내지 약 20 nm, 약 1 nm 내지 약 10 nm, 약 2 nm 내지 약 100 nm, 약 2 nm 내지 약 80 nm, 약 2 nm 내지 약 50 nm, 약 2 nm 내지 약 40 nm, 약 2 nm 내지 약 30 nm, 약 2 nm 내지 약 20 nm, 약 2 nm 내지 약 10 nm, 약 4 nm 내지 약 100 nm, 약 4 nm 내지 약 80 nm, 약 4 nm 내지 약 50 nm, 약 4 nm 내지 약 40 nm, 약 4 nm 내지 약 30 nm, 약 4 nm 내지 약 20 nm, 또는 약 4 nm 내지 약 10 nm인 것일 수 있고, 바람직하게는, 약 4 nm 내지 약 10 nm인 것일 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.

상기 나노입자는 표면 개질화된 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 나노입자의 표면 말단은 이온성 작용기를 포함하는 것일 수 있다. 상기 이온성 작용기는 아민기, 알데히드기, 수산기, 및 티올기로 구성된 군에서 선택되는 적어도 어느 하나의 양이온성 작용기; 또는 카르복실기, 카르복실산 유도체기 (C(=O)-Cl, C(=O)-Br, C(=O)-O-succinimide), 이소시아네이트기, 및 이소티오시아네이트기로 구성된 군에서 선택되는 적어도 어느 하나의 음이온성 작용기일 수 있고, 바람직하게는, 아민기일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 이온성 작용기는 세포 표면을 표적화하는 화학작용기 (예컨대, RGD, EFRG 등의 펩타이드)일 수 있다.

상기 생체이식용 구조체의 상기 나노입자는 상기 생체이식용 본체의 표면에 코팅된 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 나노입자는 상기 생체이식용 본체의 일측 표면 또는 표면 중 일부 표면에 코팅된 것일 수 있다.

상기 나노입자가 상기 생체이식용 본체의 표면에 코팅된 것은, 상기 나노입자가 상기 생체이식용 본체의 표면에 연결된 것을 의미할 수 있다.

상기 연결은 상기 나노입자와 상기 생체이식용 본체 사이의 화학적 또는 물리적 결합을 의미할 수 있다.

구체적으로, 상기 생체이식용 구조체의 상기 나노입자는 링커에 의하여 상기 생체이식용 본체의 표면에 연결되어 있는 것일 수 있다.

상기 링커는 탄성력을 가지는 고분자를 포함할 수 있다.

상기 탄성력을 가지는 고분자는 탄성력을 가지는 폴리머 사슬을 포함하는 선형고분자 (linear polymer)일 수 있다. 구체적으로, 상기 탄성력을 가지는 고분자는 폴리비닐알콜 (PVA), 폴리우레탄, 폴리-L-락트산, 셀룰로오스 에스테르, 폴리에틸렌글리콜 (PEG), 카르복시메틸 덱스트란, 콜라겐, 피브로넥틴, 비트로넥틴, 엘라스틴, 라미닌, 헤파린, 피브린, 셀룰로오스, 및 비정질 탄소로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 어느 하나의 고분자일 수 있고, 바람직하게는, 폴리에틸렌글리콜 (PEG)일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 탄성력을 가지는 고분자는 중량평균분자량 약 100 내지 10,000, 약 1,000 내지 5,000, 약 1,000 내지 3,000, 약 3,000 내지 10,000, 약 3,000 내지 8,000, 또는 약 4,000 내지 6,000 g/mol의 고분자를 포함하는 것일 수 있다. 일 구체예에 따르면, 상기 탄성력을 가지는 고분자의 중량평균분자량이 상기 수치범위를 벗어나는 경우, 상기 나노입자와 상기 생체이식용 본체의 연결이 불안정할 수 있다.

일 구체예에 따르면, 상기 탄성력을 가지는 고분자 또는 고분자 사슬의 일측 말단과 상기 생체이식용 본체의 표면이 연결되고, 상기 탄성력을 가지는 고분자 또는 고분자 사슬의 타측 말단과 상기 나노입자, 구체적으로는, 상기 표면 개질화된 나노입자의 표면 말단부의 이온성 작용기가 연결됨으로써, 상기 생체이식용 구조체의 상기 나노입자는 상기 생체이식용 본체의 표면에 코팅되는 것일 수 있다.

상기 연결은 공유 결합, 이온 결합, 금속 결합, 수소 결합, 반데르 발스 결합, 또는 이들의 조합에 의하여 결합하는 것을 의미할 수 있다.

일 구체예에 따르면, 상기 생체이식용 구조체에 있어서, 상기 탄성력을 가지는 고분자 또는 고분자 사슬, 구체적으로는, 폴리에틸렌글리콜 (PEG)의 일측 말단과 상기 생체이식용 본체의 연결은 Si-O 공유결합에 의한 것일 수 있다. 또한, 일 구체예에 따르면, 상기 생체이식용 구조체에 있어서, 상기 탄성력을 가지는 고분자 또는 고분자 사슬, 구체적으로는, 폴리에틸렌글리콜 (PEG)의 타측 말단과 상기 나노입자, 구체적으로는, 상기 표면 개질화된 나노입자의 표면 말단부의 아민기의 연결은 N-H 공유결합에 의한 것일 수 있다.

상기 생체이식용 구조체의 상기 나노입자는 초음파에 의하여 진동하는 것일 수 있다. 예컨대, 생체 내로 상기 생체이식용 구조체가 이식된 상태에서 생체 내 또는 생체 외에서 상기 생체이식용 구조체를 향하여 초음파를 인가하면 상기 생체이식용 구조체의 상기 나노입자는 초음파에 의하여 진동하는 것일 수 있다.

일 구체예에 따르면, 도 1에 나타낸 바와 같이, 상기 생체이식용 구조체에 초음파를 인가하면, 상기 나노입자가 진동할 수 있다. 이때, 상기 나노입자는 상기 탄성력을 가지는 고분자 또는 고분자 사슬에 의하여 상기 생체이식용 본체의 표면에 연결된 상태로 진동하는 것일 수 있다. 또한, 상기 나노입자의 진동에 의해 상기 생체이식용 구조체 주변의 세포를 자극할 수 있다.

따라서, 상기 생체이식용 구조체의 상기 나노입자는 세포와 접촉하는 것일 수 있다.

일 구체예에 따르면, 상기 생체이식용 구조체는 상기 생체이식용 구조체 주변의 세포의 증식 및 대사 활동을 선택적으로 조절할 수 있는 것일 수 있다.

구체적으로, 일 구체예에 따르면, 상기 생체이식용 구조체는 평활근세포 (smooth muscle cell: SMC)의 증식 억제 효과, 혈관내피세포 (vascular endothelial cell: VEC)의 증식 촉진 효과, 또는 혈관내피세포간 결합 강화 효과를 나타내는 것일 수 있다.

용어, "평활근세포 (smooth muscle cell: SMC)"는 혈관을 지탱하는 근육 세포를 의미한다. 평활근세포는 일반적인 스텐트 시술 후, 시술에 의해 발생하는 상처를 통해 혈관내피세포보다 빠르게 증식될 수 있는 것으로 알려져 있다. 이 경우, 재협착증이 발생할 수 있다.

용어, "혈관내피세포 (vascular endothelial cell: VEC)"는 혈관에서 혈액이 통과하는 내부를 감싸는 세포를 의미한다. 일반적인 스텐트 시술 후, 혈관내피세포가 평활근세포보다 빠르게 증식되어야 재협착증을 예방할 수 있다.

용어 "재협착증 (restenosis)"은 혈관이 좁아지는 협착증이 다시 발생하는 것 (예컨대, 증상)을 의미한다. 재협착증은 보통 좁아진 동맥이나 다른 큰 혈관이 좁아져 폐색을 없애기 위해 치료를 받았으나 그 뒤에 다시 좁아진 것과 관련될 수 있으며, 특히, 풍선혈관 성형술을 받은 환자에게 약 25 내지 50% 정도로 높은 발병률을 보이는 것으로 알려져 있다. 이러한 대다수의 환자들은 약 6개월 이내로 추가적인 혈관 성형술을 필요로 한다. 재협착증의 주된 원인은 혈관내막 증식에 의한 것으로 알려져 있으며, 구체적으로, 평활근세포의 과도한 증식, 혈소판 혈전 (또는 응집), 및 염증반응 등과 관련되어 있다고 알려져 있다.

일 구체예에 따르면, 생체 내에 삽입된 상기 생체이식용 구조체에 초음파를 인가하면, 상기 생체이식용 구조체의 상기 나노입자가 진동할 수 있고, 상기 나노입자의 진동에 의해 상기 생체이식용 구조체 주변의 세포가 자극을 받을 수 있다. 이로 인해, 평활근세포의 증식이 억제되거나, 혈관내피세포의 증식이 촉진되거나, 혈관내피세포간 결합이 강화될 수 있다.

일 구체예에 따르면, 생체 내에 삽입된 상기 생체이식용 구조체에 초음파를 인가하면, 상기 나노입자의 진동에 의해 상기 생체이식용 구조체 주변의 평활근세포에 있어서 vinculin 유전자 (세포-기질간 접착 관련 유전자) 또는 connexin43 유전자 (세포-세포간 결합 관련 유전자)의 발현 정도가 감소하거나, α-SMA 유전자 (세포의 수축 및 근육 형성 관련 유전자)의 발현 정도가 증가할 수 있다. 또한, 상기 나노입자의 진동에 의해 상기 생체이식용 구조체 주변의 혈관내피세포에 있어서 connexin43 유전자의 발현 정도가 증가하거나, vinculin 또는 vWF 유전자 (혈소판 결합 수용체 관련 유전자)의 발현 정도가 감소할 수 있다. 이는, 상기 나노입자의 진동에 의해 상기 생체이식용 구조체 주변의 평활근세포에 있어서 세포간 결합이 감소하거나, 증식형 세포가 아닌 수축형 세포가 증가할 수 있고, 이로 인해, 평활근세포의 증식이 억제될 수 있음을 의미한다. 또한, 상기 나노입자의 진동에 의해 상기 생체이식용 구조체 주변의 혈관내피세포에 있어서 세포간 결합이 증가하거나, 혈소판 응집이 억제될 수 있고, 이로 인해, 혈관내피세포의 증식 또는 견고한 혈관내피세포층 형성이 촉진되거나, 혈관내막의 과형성이 억제될 수 있음을 의미한다. 따라서, 일 구체예에 따르면, 상기 생체이식용 구조체를 사용하는 경우, 약물 방출 삽입물의 사용 및 외과적인 수술 없이도 비침습적으로 재협착증을 예방 및 치료할 수 있다. 즉, 상기 생체이식용 구조체는 우수한 재협착증 예방 또는 치료 효과를 나타낼 수 있다.

다른 양상은 상기 생체이식용 구조체를 포함하는 스텐트 및 임플란트를 제공한다.

용어, "스텐트"는 혈관, 위장관, 담도 등 혈액이나 체액의 흐름이 순조롭지 못할 때 좁아지거나 막힌 부위에 삽입하여 그 흐름을 정상화하는 데 사용하는 의료용 장치를 의미할 수 있다.

용어, "임플란트"는 소실된 생물학적 조직을 대체하거나 조직으로서 동작하기 위해 만들어진 인공의 디바이스를 의미하고, 치과 분야에서는, 치아가 있을 자리에 심는 인공 치아 구조물을 의미한다.

상기 스텐트 또는 임플란트에서 언급된 용어 또는 요소 중 상기 구조체에 대한 설명에서 언급된 것과 같은 것은, 앞에서 상기 구조체에 대한 설명에서 언급된 바와 같은 것으로 이해된다.

또 다른 양상은 생체이식용 본체의 표면에 나노입자를 코팅하는 단계를 포함하는 생체이식용 구조체를 제조하는 방법 및 상기 방법에 의해 제조된 생체이식용 구조체를 제공한다.

상기 방법은 상기 나노입자를 코팅하는 단계 이전에, 상기 나노입자의 표면을 개질화하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 나노입자의 표면을 개질화하는 단계에서는, 상기 나노입자의 표면 말단에 이온성 작용기가 포함, 결합, 또는 연결되도록 하는 것일 수 있다.

상기 방법에 있어서, 상기 코팅하는 단계에서는, 탄성력을 가지는 고분자에 의하여 상기 생체이식용 본체의 표면에 상기 나노입자를 연결하는 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 방법에 있어서, 상기 코팅하는 단계에서는, 상기 탄성력을 가지는 고분자 또는 고분자 사슬의 일측 말단과 상기 생체이식용 본체의 표면을 연결하고, 상기 탄성력을 가지는 고분자 또는 고분자 사슬의 타측 말단과 상기 나노입자, 구체적으로는, 상기 표면 개질화된 나노입자의 표면 말단부의 이온성 작용기를 연결함으로써, 상기 생체이식용 본체의 표면에 상기 나노입자를 연결하는 것일 수 있다.

상기 제조 방법에서 언급된 용어 또는 요소 중 상기 구조체, 스텐트, 또는 임플란트에 대한 설명에서 언급된 것과 같은 것은, 앞에서 상기 구조체, 스텐트, 또는 임플란트에 대한 설명에서 언급된 바와 같은 것으로 이해된다.

또 다른 양상은 상기 생체이식용 구조체에 초음파를 인가하는 단계를 포함하는 세포의 증식을 조절하는 방법을 제공한다.

상기 방법은 상기 초음파를 인가하는 단계 이전에 상기 생체이식용 구조체를 개체의 생체 내로 삽입하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

상기 생체이식용 구조체에 초음파를 인가하는 단계는 상기 생체이식용 구조체가 삽입된 개체의 체외에서 상기 삽입된 생체이식용 구조체를 향하여 초음파를 인가하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 생체이식용 구조체에 인가되는 초음파는 약 1 내지 30 MHz의 초음파인 것일 수 있다.

상기 방법에 있어서, 상기 "세포의 증식을 조절하는"은 세포의 증식을 촉진 또는 억제시키는 것을 의미할 수 있다. 일 구체예에 따르면, 상기 방법에 의하여, 혈관내피세포의 증식을 촉진시키거나 평활근세포의 증식을 억제시킬 수 있다. 구체적으로, 상기 방법에 의하여, 상기 생체이식용 구조체가 삽입된 개체의 생체 내 세포의 증식을 조절, 즉, 세포의 증식을 촉진 또는 억제시킬 수 있다.

상기 방법은 상기 초음파를 인가하는 단계에서 상기 생체이식용 구조체에 약 3 분 내지 9 분 동안 초음파를 인가하는 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 방법은 상기 초음파를 인가하는 단계에서 상기 생체이식용 구조체에 약 3 분 내지 8 분, 약 3 분 내지 7 분, 약 3 분 내지 6 분, 약 4 분 내지 9 분, 약 4 분 내지 8 분, 약 4 분 내지 7 분, 약 4 분 내지 6 분, 약 5 분 내지 9 분, 약 5 분 내지 8 분, 또는 바람직하게는, 약 5 분 내지 7 분 동안 초음파를 인가하는 것일 수 있다. 일 구체예에 따르면, 상기 초음파를 인가하는 단계에서 상기 생체이식용 구조체에 약 3 분 미만으로 초음파를 인가하는 경우, 평활근세포의 증식을 억제할 수 없고, 약 9 분을 초과하여 초음파를 인가하는 경우, 혈관내피세포의 증식이 촉진되지 않을 수 있다. 이로 인해, 재협착증 예방 또는 치료 효과가 감소할 수 있다.

또 다른 양상은 상기 생체이식용 구조체에 초음파를 인가하는 단계를 포함하는 개체의 재협착증을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.

구체적으로, 상기 개체의 재협착증을 예방 또는 치료하는 방법은 상기 생체이식용 구조체에 초음파를 인가하는 단계를 포함하는 세포의 증식을 조절하는 방법을 이용하는 것일 수 있다. 즉, 상기 생체이식용 구조체에 초음파를 인가함으로써, 평활근세포의 증식을 억제시키거나, 혈관내피세포의 증식을 촉진시켜 개체의 재협착증을 예방 또는 치료할 수 있다.

용어,"예방"은 상기 생체이식용 구조체의 삽입, 투여, 적용에 의하여 개체의 재협착증을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미할 수 있다.

용어, "치료"는 상기 생체이식용 구조체의 삽입, 투여, 적용에 의하여 개체의 재협착증에 대한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미할 수 있다.

상기 개체는 인간 또는 인간을 제외한 포유동물일 수 있다. 보다 구체적으로는, 상기 개체는 질병의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 인간, 비인간인 영장류, 생쥐, 개, 고양이, 말, 및 소 등의 포유류를 의미할 수 있다.

상기 방법에서 언급된 용어 또는 요소 중 상기 구조체, 스텐트, 임플란트, 또는 제조 방법에 대한 설명에서 언급된 것과 같은 것은, 앞에서 상기 구조체, 스텐트, 임플란트, 또는 제조 방법에 대한 설명에서 언급된 바와 같은 것으로 이해된다.

일 양상에 따른 생체이식용 구조체에 의하면, 초음파 인가를 통해 표면 나노입자의 진동이 유도됨으로써, 세포의 증식 및 대사 활동을 조절할 수 있다.

구체적으로, 상기 생체이식용 구조체는 평활근세포의 증식 억제 효과, 혈관내피세포의 증식 촉진 효과, 또는 혈관내피세포간 결합 강화 효과를 나타낼 수 있다. 이로 인해, 상기 생체이식용 구조체를 사용하는 경우, 약물 방출 삽입물의 사용 및 외과적인 수술 없이도 비침습적으로 재협착증을 예방 및 치료할 수 있으며, 특정 약물을 사용할 수 없는 환자에게도 적용할 수 있다.

또한, 일 양상에 따른 생체이식용 구조체는 스텐트, 임플란트 등 다양한 삽입형 소재에 적용되어 세포의 대사 활동을 조절할 수 있다. 따라서, 상기 생체이식용 구조체는 세포의 대사 활동 조절이 요구되는 다양한 질환의 예방 또는 치료를 위해 사용될 수 있다.

도 1은 일 실시예의 생체이식용 본체의 표면에 나노입자가 코팅된 생체이식용 구조체에 초음파를 처리하여 나노입자의 진동 (a) 및 세포 자극 (b)을 유도하는 기작을 나타내는 모식도, 및 세포 자극 결과는 나타내는 이미지 (c)이다.
도 2는 일 실시예의 아민기로 표면 개질화된 나노입자 (AuNP)를 나타내는 모식도 (a), 상기 나노입자의 크기를 나타내는 그래프 (b), 및 일 실시예의 아민기로 표면 개질화된 나노입자 (AuNP)를 확인한 결과를 나타내는 이미지 (c)이다.
도 3은 일 실시예의 생체이식용 본체의 표면에 나노입자가 코팅된 생체이식용 구조체를 제조하는 과정을 나타내는 모식도 (a) 및 상기 생체이식용 본체의 표면에 상기 나노입자의 결합 여부를 확인한 결과를 나타내는 그래프 (b 및 c)이다.
도 4는 일 실시예의 생체이식용 본체의 표면에 나노입자가 코팅된 생체이식용 구조체에 초음파를 처리하였을 때의 전류 임피던스 변화를 분석한 결과를 나타내는 도면이다: 금 나노입자를 코팅한 CoCr의 전류 임피던스 측정 방법을 나타내는 모식도 (a); CoCr의 초음파 처리에 따른 전류 임피던스 변화를 나타내는 그래프 (b); CoCr 표면에 금 나노입자를 코팅한 후의 전류 임피던스 변화를 나타내는 그래프 (c); 및 금 나노입자를 코팅한 CoCr에 초음파를 처리하였을 때의 전류 임피던스 변화를 나타내는 그래프 (d).
도 5는 일 실시예의 생체이식용 본체의 표면에 나노입자가 코팅된 생체이식용 구조체의 평활근세포 (좌측) 및 혈관내피세포 (우측)의 증식 조절 효과를 나타내는 그래프이다.
도 6은 일 실시예의 생체이식용 본체의 표면에 나노입자가 코팅된 생체이식용 구조체에 의한 평활근세포 (a) 및 혈관내피세포 (b)에서의 유전자 발현 양상의 변화를 확인한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 7은 일 실시예의 생체이식용 구조체의 종류 및 초음파 처리 시간에 따른 평활근세포의 증식 정도를 비교한 결과를 나타내는 그래프이다: CoCr (a); CoCr-PEG (b); CoCr-PEG-AuNP (c); 및 TCPS (d).
도 8은 일 실시예의 생체이식용 구조체의 종류 및 초음파 처리 시간에 따른 혈관내피세포의 증식 정도를 비교한 결과를 나타내는 그래프이다: CoCr (a); CoCr-PEG (b); CoCr-PEG-AuNP (c); 및 TCPS (d).

이하 본 발명을 실험예 및 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실험예 및 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실험예 및 실시예에 한정되는 것은 아니다.

또한, 본 명세서에서 특별한 정의가 없으면, 본 명세서에 사용된 모든 과학적 및 기술적인 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 당업자에 의하여 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가질 수 있다.

실시예 1. 생체이식용 구조체의 제조

본 실시예에서는 생체이식용 본체의 표면에 나노입자를 코팅하여 생체이식용 구조체를 제조하였다.

먼저, 도 2a에 나타낸 바와 같이, 금 나노입자 (AuNP)의 표면을 아민기로 개질화하였다.

구체적으로, 도데실아민 (dodecylamine)이 표면에 코팅되어 있는 금 나노입자에 트리메틸아민 (TMA)과 티올-폴리에틸린글리콜-아민 (SH-PEG-NH2)이 약 9:1의 비율로 혼합된 용액을 처리하여 약 1 시간 동안 반응시켰다. 최종 산물을 다이클로로메테인으로 씻어준 후, 증류수에 분산시키고, 투석백 (MWCO 10,000)으로 3 일 동안 투석시켰다. 표면이 아민기로 개질된 금 나노입자의 크기는 동적 광산란 입도 분석기와 전자투과현미경으로 확인하였다.

그 결과, 도 2b 및 2c에 나타낸 바와 같이, 아민기로 표면 개질화된 나노입자를 확인하였고, 상기 나노입자의 크기는 약 4 내지 10 nm임을 확인하였다.

다음으로, 도 3a에 나타낸 바와 같이, PEG를 사용하여 CoCr 표면에 상기 표면 개질화된 금 나노입자를 코팅하여, 생체이식용 구조체를 제조하였다.

구체적으로, SiC emery paper로 연마한 (polishing) CoCr 표면을 O₂ 플라즈마로 약 1 분 동안 코팅하였고, 바로 NHS-terminated PEG-silane 용액에 담궈 약 2 시간 동안 반응시켰다. CoCr 표면과 반응하지 않은 PEG는 약 95% 에탄올로 씻어주었다. CoCr 표면을 금 나노입자로 코팅하기 위하여, CoCr 표면에 화학적으로 고정된 NHS기에 대하여 아민기로 표면 개질된 금 나노입자 분산액을 약 12 시간 동안 처리하여 반응시켰다.

또한, 상기 제조된 생체이식용 구조체에 대하여, CoCr 표면에 금 나노입자의 결합 여부를 확인하기 위하여, XPS 및 AFM 분석을 수행하였다.

구체적으로, X선 광전자 분광법 측정을 위하여 금나노입자를 코팅한 CoCr과 PEG만 코팅한 CoCr, 및 아무것도 코팅하지 않은 CoCr을 준비하였고, Au4f, Si2p, 및 C1s의 결합에너지를 측정하였다. Survey 스캔을 위하여 약 200 eV의 에너지 세기로 진행하였고, narrow scan은 약 50 eV의 에너지 세기를 사용하였다. 스캔 영역은 약 400 μm로 진행하였다.

또한, 금 나노입자의 표면 코팅 밀도를 확인하기 위하여 AFM을 수행하였다. 표면 스캔이 용이하도록 커버 글라스 표면에 CoCr 표면 처리와 동일한 과정을 통해 금 나노입자를 코팅하였다. 그 후, AFM의 탭핑 모드 방식을 이용하여 nm 수준에서의 표면의 Profile을 측정하였다.

그 결과, 도 3b 및 3c에 나타낸 바와 같이, 상기 제조된 생체이식용 구조체는 CoCr의 표면에 표면 개질화된 금 나노입자가 안정적으로 결합되어 있음을 확인하였다. 특히, 5K-PEG (Mw: 약 5000 g/mol)를 사용하는 경우, 2K-PEG (Mw: 약 2000 g/mol)를 사용하는 경우와 비교하여, CoCr의 표면에 표면 개질화된 금 나노입자가 더욱 안정적으로 결합되어 있음을 확인하였다.

본 실시예를 통해, 생체이식용 본체의 표면에 나노입자가 코팅된 생체이식용 구조체를 수득하였음을 확인하였다.

실시예 2. 생체이식용 구조체의 초음파에 대한 반응성 확인

본 실시예에서는 상기 실시예 1에서 제조된 생체이식용 구조체에 대하여 초음파에 대한 반응성을 확인하기 위하여 전류 임피던스를 측정하였다.

구체적으로, 도 4a에 나타낸 바와 같이, 전류 임피던스를 측정하기 위하여 금 나노입자를 코팅한 CoCr을 트랜듀서와 약 10 cm 거리를 두어 위치시켰다. 초음파에 의하여 CoCr 표면의 금 나노입자를 진동시키면서, 동시에 전류 임피던스를 측정하기 위하여, 약 1.5 MHz의 세기의 초음파 (사인파)를 펄스 없이 조사하였다. 전류 임피던스는 약 1 MHz부터 약 1 KHz 사이에서 약 20 mV 정현파 전압 진폭을 주었고, 전위는 0 mv를 적용하였다.

그 결과, 도 4b에 나타낸 바와 같이, 금 나노입자로 코팅되지 않은 CoCr의 경우, 초음파 처리에 의한 전류 임피던스의 변화가 관찰되지 않음을 확인하였다. 또한, 도 4c에 나타낸 바와 같이, 초음파 처리 전, 금 나노입자로 코팅된 CoCr (CoCr-AuNP)의 경우, 금 나노입자로 코팅되지 않은 CoCr에 비해 전류 임피던스가 더 감소함을 확인하였다. 반면, 도 4d에 나타낸 바와 같이, 초음파 처리 후, 금 나노입자로 코팅된 CoCr (CoCr-AuNP)의 경우, 금 나노입자로 코팅되지 않은 CoCr에 비해 전류 임피던스가 더 증가함을 확인하였다.

이러한 결과는, 금은 전류 임피던스가 낮은 재료이기 때문에, 금 나노입자의 코팅은 CoCr의 임피던스를 감소시키는 효과가 있는 것이고, 초음파를 처리하는 경우, 초음파에 의해 CoCr 표면의 금 나노입자가 진동하면서, CoCr 표면에 대한 금 나노입자의 코팅 효과가 약해지면서 임피던스가 다시 증가하는 것임을 보여주는 것이다.

본 실시예를 통해, 생체이식용 본체의 표면에 나노입자가 코팅된 생체이식용 구조체에 있어서, 상기 나노입자는 초음파에 반응하여 진동하는 것임을 확인하였다.

실시예 3. 초음파 처리에 의한 생체이식용 구조체의 세포 증식 조절 능력 평가

본 실시예에서는 상기 실시예 1에서 제조된 생체이식용 구조체의 세포 증식 조절 능력을 평가하기 위하여, 상기 제조된 생체이식용 구조체에 초음파을 처리한 후, 주변의 평활근세포 및 혈관내피세포의 증식 정도를 분석하였다. 나노입자로 코팅되지 않은 CoCr에 초음파를 처리하지 않은 경우에 대해서도 주변의 평활근세포 및 혈관내피세포의 증식 정도를 측정하여 비교군으로서 사용하였다.

구체적으로, 세포의 증식 정도를 분석하기 위하여 세포가 부착된 CoCr 기판에 CCK-8 시약을 약 10% 함유한 배지 약 400 μL를 처리한 후, 인큐베이터에서 약 2 시간 동안 반응시켰다. 반응 후 상층액의 흡광도를 약 450 nm에서 측정하였다.

그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 금 나노입자로 코팅된 CoCr (CoCr-AuNP)에 초음파를 처리한 경우, 비교군 대비 평활근세포의 증식이 현저히 감소하였고, 혈관내피세포의 증식에 있어서는 큰 차이를 나타내지 않음을 확인하였다.

또한, 상기 제조된 생체이식용 구조체에 초음파을 처리한 후, 주변의 평활근세포 및 혈관내피세포의 변화를 시각적으로 확인하기 위하여, 세포 염색 후 형광 이미지 촬영을 수행하였다. 나노입자로 코팅되지 않은 CoCr에 초음파를 처리하지 않은 경우를 비교군으로서 사용하였다.

구체적으로, CoCr 표면에서 배양된 세포를 약 4% 포름알데하이드 용액으로 약 15 분 동안 고정시켰다. 그 후, phosphate buffered saline으로 씻어준 후, 약 0.1% Triton X100을 약 3 분 동안 처리하였다. 평활근세포에는 F-actin을 염색할 수 있는 phalloidin Alexa 488을 약 30 분 동안 처리하였다. 혈관내피세포는 VE-cadherin antibody 희석액으로 약 1 시간 동안 염색되었고, 그 후, 혈관내피세포에 Alexa488-goat IgG 항체를 약 30 분 동안 처리하였다. 세포의 핵은 DAPI를 처리하여 염색하였다.

그 결과, 도 1b 및 1c에 나타낸 바와 같이, 금 나노입자로 코팅된 CoCr (CoCr-AuNP)에 초음파를 처리한 경우, 비교군 대비 평활근세포의 증식이 현저히 감소하였고, 혈관내피세포의 증식이 증가함과 동시에, 혈관내피세포간 결합이 현저히 강화되었음을 확인하였다.

본 실시예를 통해, 생체이식용 본체의 표면에 나노입자가 코팅된 생체이식용 구조체에 초음파를 처리하면, 상기 생체이식용 구조체 주변의 세포의 증식 및 대사 활동을 선택적으로 조절할 수 있음을 확인하였다. 구체적으로, 상기 생체이식용 구조체는 초음파 처리에 의해, 평활근세포의 증식 억제 효과, 혈관내피세포간 결합 강화 효과, 또는 혈관내피세포의 증식 촉진 효과를 나타냄을 확인하였다.

따라서, 본 실시예를 통해, 상기 생체이식용 구조체는 초음파 처리에 의해, 재협착증 예방 또는 치료 효과를 나타낼 수 있음을 확인하였다.

실시예 4. 생체이식용 구조체에 의한 세포 유전자 발현 양상 변화 확인

본 실시예에서는 상기 실시예 1에서 제조된 생체이식용 구조체에 의한 세포 유전자 발현 양상 변화를 확인하기 위하여, 상기 제조된 생체이식용 구조체에 초음파을 처리한 후, 주변의 평활근세포 및 혈관내피세포에서의 vinculin, connexin43, α-SMA, 및 vWF 유전자의 발현 정도를 분석하였다. 나노입자로 코팅되지 않은 CoCr에 초음파를 처리하지 않은 경우에 대해서도 주변의 평활근세포 및 혈관내피세포에서의 유전자 발현 정도를 분석하여 비교군으로서 사용하였다.

구체적으로, 세포에 라이시스 버퍼 (lysis buffer)를 처리한 후, 용액을 수거하여 컬럼 방식의 RNA 분리 키트 (RNeasy mini kit, Qiagen)를 사용하여 RNA를 분리하였다. 분리한 RNA를 Maxime RT PreMix (iNtRON, Korea)에 섞은 후 약 42˚C에서 약 90 분 동안 반응시켜 cDNA로 합성하였다. 유전자 발현 양상을 알아보기 위하여 합성한 cDNA를 해당 유전자의 프라이머 및 SYBR premix Ex Taq와 섞어준 후 실시간 유전자 중합효소 연쇄반응을 진행하였다. 어닐링 (Annealing)은 약 60˚C에서 진행하였다. 평활근세포에서 추출한 유전자에 대해서는 vinculin, connexin43, 및 a-SMA의 발현량을 측정하였고, 혈관내피세포에서 추출한 유전자에 대해서는 vinculin, connexin43, 및 vWF의 발현량을 측정하였다. 하우스키핑 유전자 (Housekeeping gene)로는 GAPDH를 사용하였다. 최종적으로 얻어진 각각의 유전자에 대한 Ct 값은 GAPDH에 대하여 delta Ct를 계산한 후, 다시 CoCr에서 발현한 해당 유전자에 대하여 deltadeltaCt 값을 계산하였다.

그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, 금 나노입자로 코팅된 CoCr (CoCr-AuNP)에 초음파를 처리한 경우, 비교군 대비 주변의 평활근세포에 있어서 connexin43 유전자 (세포-세포간 결합 관련 유전자)의 발현 정도가 현저히 감소하고, α-SMA 유전자 (세포의 수축 및 근육 형성 관련 유전자)의 발현 정도가 현저히 증가함을 확인하였다. 또한, 주변의 혈관내피세포에 있어서 connexin43 유전자의 발현 정도가 현저히 증가하고, vWF 유전자 (혈소판 결합 수용체 관련 유전자)의 발현 정도가 현저히 감소함을 확인하였다.

이는, 상기 금 나노입자로 코팅된 CoCr (CoCr-AuNP)에 초음파를 처리한 경우, 상기 금 나노입자의 진동에 의해 주변의 평활근세포에 있어서 세포간 결합이 감소하거나, 증식형 세포가 아닌 수축형 세포가 증가할 수 있고, 이로 인해, 평활근세포의 증식이 억제될 수 있음을 의미한다. 또한, 주변의 혈관내피세포에 있어서 세포간 결합이 증가하거나, 혈소판 응집이 억제될 수 있고, 이로 인해, 혈관내피세포의 증식 또는 견고한 혈관내피세포층 형성이 촉진되거나, 혈관내막의 과형성이 억제될 수 있음을 의미한다.

본 실시예를 통해, 생체이식용 본체의 표면에 나노입자가 코팅된 생체이식용 구조체에 초음파를 처리하면, 상기 생체이식용 구조체 주변의 세포의 증식 및 대사 활동을 선택적으로 조절할 수 있음을 확인하였다. 따라서, 상기 생체이식용 구조체는 초음파 처리에 의해, 재협착증 예방 또는 치료 효과를 나타낼 수 있음을 확인하였다.

실시예 5. 생체이식용 구조체의 종류 및 초음파 처리 시간에 따른 세포 증식 비교

본 실시예에서는 생체이식용 구조체의 종류 및 초음파 처리 시간에 따른 세포 증식 정도를 비교하였다.

구체적으로, 나노입자로 코팅되지 않은 CoCr (CoCr); PEG로 코팅된 CoCr (CoCr-PEG); 금 나노입자로 코팅된 CoCr (CoCr-PEG-AuNP); 및 나노입자로 코팅되지 않은 TCPS (Tissue culture polystyrene)의 생체이식용 구조체를 준비하였다. 상기 각 생체이식용 구조체에 대하여 초음파 처리 시간에 따른 평활근세포 및 혈관내피세포의 증식 정도를 분석하였다. 구체적인, 분석 방법은 상기 실시예 3에 기재된 바와 동일하다.

그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, 금 나노입자로 코팅된 CoCr (CoCr-PEG-AuNP)에 대하여 약 6 내지 9 분 동안 초음파를 처리한 경우, 다른 실험군 대비 평활근세포의 증식이 현저히 억제됨을 확인하였다.

또한, 도 8에 나타낸 바와 같이, 금 나노입자로 코팅된 CoCr (CoCr-PEG-AuNP)에 대하여 약 3 내지 6 분 동안 초음파를 처리한 경우, 다른 실험군 대비 혈관내피세포의 증식이 현저히 증가됨을 확인하였다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims (18)

1. 생체이식용 본체; 및 상기 본체의 표면에 코팅된 나노입자를 포함하는 생체이식용 구조체로서,
   상기 나노입자는 탄성력을 가지는 고분자에 의하여 상기 생체이식용 본체의 표면에 연결되어 있고,
   초음파 인가시 상기 나노입자가 상기 탄성력을 가지는 고분자에 의하여 상기 생체이식용 본체의 표면에 연결된 상태로 진동하는 것인, 생체이식용 구조체.
2. 삭제
3. 청구항 1에 있어서, 상기 생체이식용 본체는 스테인레스 스틸, 코발트-크롬, 백금-크롬, 탄탈륨, 티타늄, 니티놀, 플래티늄-이리듐, 금, 백금, 은, 마그네슘, 및 이들의 합금으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 어느 하나의 금속; 또는 폴리글리콜산 (PGA), 폴리-L-락트산 (PLLA), 폴리-D-락트산 (PDLA), 폴리-D, L-락트산 (PDLLA), 폴리-카프로락톤 (PCL), 폴리락트산-글리콜산 공중합체 (PLGA), 폴리락티드-코-카프로락톤 (PLCL), 타이로신폴리카보네이트, 살리실산 함유 고분자, 폴리에틸렌글리콜, 폴리아미노산, 폴리안하이드라이드, 폴리오르쏘에스테르, 폴리디옥사논, 폴리포스파겐, 셀룰로오스 아세테이트 부틸레이트, 셀룰로오스 트리아세테이트, 폴리락티드 (PLA), 폴리트리메틸렌카보네이트 (PTMC), 폴리-히드록시부티레이트 (PHB), 및 이들의 공중합체로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 어느 하나의 고분자를 포함하는 것인, 생체이식용 구조체.
4. 청구항 1에 있어서, 상기 생체이식용 본체는 중량평균분자량 10 내지 1,000,000 g/mol의 고분자를 포함하는 것인, 생체이식용 구조체.
5. 청구항 1에 있어서, 상기 나노입자는 Li, Na, K, Rb, Cs, Fr, Mg, Ca, Sr, Ba, Ra, Sc, Y, Lu, Ti, Zr, Hf, Nb, Ta, Cr, Mo, W, Mn, Re, Fe, Ru, Os, Co, Rh, Ir, Ni, Pd, Pt, Cu, Ag, Au, Zn, Ga, In, Ti, Sn, Bi, Si, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 어느 하나의 금속 나노입자를 포함하는 것인, 생체이식용 구조체.
6. 청구항 1에 있어서, 상기 나노입자는 평균 지름이 1 내지 100 nm인 것인, 생체이식용 구조체.
7. 삭제
8. 삭제
9. 삭제
10. 청구항 1 및 3 내지 6 중 어느 한 항의 생체이식용 구조체를 포함하는 스텐트.
11. 청구항 1 및 3 내지 6 중 어느 한 항의 생체이식용 구조체를 포함하는 임플란트.
12. 생체이식용 본체의 표면에 나노입자를 코팅하는 단계를 포함하는 생체이식용 구조체를 제조하는 방법으로서,
    상기 코팅은 탄성력을 가지는 고분자에 의하여 상기 생체이식용 본체의 표면에 상기 나노입자를 연결하는 것이고,
    상기 생체이식용 구조체는 초음파 인가시 상기 나노입자가 상기 탄성력을 가지는 고분자에 의하여 상기 생체이식용 본체의 표면에 연결된 상태로 진동하는 것인, 생체이식용 구조체를 제조하는 방법.
13. 삭제
14. 삭제
15. 청구항 1 및 3 내지 6 중 어느 한 항의 생체이식용 구조체에 초음파를 인가하는 단계를 포함하는 세포의 증식을 조절하는 방법.
16. 청구항 15에 있어서, 상기 초음파를 인가하는 단계에서 상기 생체이식용 구조체에 3 분 내지 9 분 동안 초음파를 인가하는 것인, 방법.
17. 청구항 15에 있어서, 상기 초음파는 1 내지 30 MHz의 초음파인 것인, 방법.
18. 청구항 15의 방법을 이용하는 개체의 재협착증을 예방 또는 치료하는 방법으로서,
    상기 개체는 인간을 제외한 포유동물인 것인, 재협착증을 예방 또는 치료하는 방법.

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