KR102484160B1 - Magnetic agarose bead (MAB) grafted with metal ion-complex for affinity-based separation of macromolecules and its preparation method thereof - Google Patents

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Abstract

본 발명은 단백질 분리능을 갖는 자성 아가로스 비드로, 상기 자성 아가로스 비드는 내부에 상자성 산화철을 함유하고, 상기 자성 아가로스 비드의 표면에 그라프트된 브러쉬형 고분자와 금속이온 착화합물이 결합된 것을 특징으로 하는, 자성 아가로스 비드에 관한 것이다. The present invention is a magnetic agarose bead having protein separation ability, wherein the magnetic agarose bead contains paramagnetic iron oxide therein, and a brush-type polymer grafted on the surface of the magnetic agarose bead is bonded with a metal ion complex. To, it relates to magnetic agarose beads.

Description

거대분자의 친화기반 분리용 금속이온 착화합물이 그라프트된 자성 아가로스 비드 및 그의 제조방법{Magnetic agarose bead (MAB) grafted with metal ion-complex for affinity-based separation of macromolecules and its preparation method thereof}Magnetic agarose bead (MAB) grafted with metal ion-complex for affinity-based separation of macromolecules and its preparation method thereof}

본 발명은 초상자성 산화철 (SPIO, Superparamagnetic iron oxide)을 함유하는 고기능화 자성 아가로스 비드 (MAB, magnetic agarose bead) 및 그의 제조방법에 관한 것으로, 상세하게는 표적 거대분자의 분리 효율을 증대시킨 자성 아가로스 비드 및 그의 제조방법에 관한 것이다. The present invention relates to a highly functional magnetic agarose bead (MAB) containing superparamagnetic iron oxide (SPIO) and a method for producing the same, and in detail, to a magnetic agarose with increased separation efficiency of a target macromolecule. It relates to rose beads and a manufacturing method thereof.

신약 개발을 위한 기초 연구와 바이오 의약 연구 등을 위해 프로테오믹스 연구는 매우 중요하다. 더욱이, 단백질을 포함한 거대분자의 효율적인 분리와 정제는 거대분자들의 고차 구조와 활성 유지 등의 측면에서 중요하다. 특정 거대분자의 효과적인 분리를 위해 유전자 변형을 통해 특정 단백질의 에피토프가 발현되도록 하거나 표지 물질이 단백질에 발현되도록 함으로써 항체나 금속 이온과의 착체 형성을 통해 표적 단백질을 분리하는 방법이 주로 이용되어 왔다. Proteomics research is very important for basic research for new drug development and biopharmaceutical research. Moreover, efficient separation and purification of macromolecules, including proteins, is important in terms of maintaining high-order structures and activities of macromolecules. For the effective separation of a specific macromolecule, a method of isolating a target protein through complex formation with an antibody or metal ion by expressing an epitope of a specific protein through genetic modification or expressing a labeling material on the protein has been mainly used.

상기 발현 또는 생산된 단백질 등 거대분자를 분리하기 위한 다양한 기술이 연구개발되어 왔고 주로 컬럼 크로마토그래피, 멤브레인, 막 투석 등의 방법이 이용되어왔다. 상기 분리 방법들에 적용된 컬럼 충진 담체, 분리막, 투석막 등은 담체 및 멤브레인의 표면과 기공의 물리화학적 특성 특히, 기공의 크기에 따른 거대분자의 확산, 투과 속도의 차이 및 정전기적 특성 등을 주로 이용해왔다.Various technologies for isolating macromolecules such as the expressed or produced proteins have been researched and developed, and methods such as column chromatography, membrane, and membrane dialysis have been mainly used. Column packing carriers, separation membranes, dialysis membranes, etc. applied to the above separation methods mainly use the physicochemical properties of the surface and pores of the carrier and membrane, in particular, diffusion of macromolecules according to the size of the pores, difference in permeation rate, and electrostatic characteristics. have been

단백질과 같은 거대분자를 유전자 변형을 통해 분자의 말단에 히스티딘 (His, histidine)이 발현되도록 하고, 이러한 His 표지 분자와 착화합물을 형성할 수 있는 금속 이온을 갖는 담체를 결합시키는 즉, 분리 대상 표적 물질과 금속 이온의 수용체-리간드 결합을 형성하게 함으로써 분리 효율을 증가시키는 친화도 기반 분리가 확대되고 있다. Macromolecules such as proteins are genetically modified so that histidine (His, histidine) is expressed at the end of the molecule, and a carrier having a metal ion capable of forming a complex with the His-labeled molecule is bound, that is, the target material to be separated. Affinity-based separations that increase separation efficiency by forming a receptor-ligand bond between a metal ion and a metal ion are expanding.

이러한 친화도 기반 거대 분자 분리는 멤브레인, 컬럼 크로마토그래피, 막 투석 등에 폭 넓게 적용되고 있으며 특히, 친화도 기반 자성 담체는 분리 효율 증진과 사용 편의성 등으로 인해 그 적용이 확대되고 있다.Such affinity-based macromolecular separation is widely applied to membranes, column chromatography, membrane dialysis, etc. In particular, the application of affinity-based magnetic carriers is expanding due to improved separation efficiency and ease of use.

단백질과 같은 거대분자의 순도와 수득률의 향상을 위해서는 거대분자의 분리 정제 효율의 증가가 필수적이다. 거대분자의 분리를 위한 담체 매트릭스는 주로 거대분자의 확산에 기반하여 그 효율의 개선이 요구되어 왔다. 친화 기반 거대분자 분리는 크게 항원-항체의 면역반응을 이용하는 방식과 담체 매트릭스가 금속 리간드를 가지며 금속 리간드와 결합능이 있는 거대분자가 착화합물을 형성하여 담체와 거대분자가 결합하는 방식이 이용되어왔다.In order to improve the purity and yield of macromolecules such as proteins, it is essential to increase the separation and purification efficiency of macromolecules. Improvement in the efficiency of a carrier matrix for separation of macromolecules has been required mainly based on the diffusion of macromolecules. The affinity-based separation of macromolecules has largely been used: a method using an antigen-antibody immune response and a method in which a carrier matrix has a metal ligand and a macromolecule capable of binding to the metal ligand forms a complex to bind the macromolecule to the carrier.

따라서, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 상기 친화도 기반 거대분자 분리 효율을 향상시키고자 하는 것이다. 본 발명의 과제는 일정 면적 또는 공간의 담체에 표적 단백질을 결합하는 리간드의 수를 증가시켜 단백질과 같은 거대분자의 분리 효율을 향상시키고자 한다. Therefore, the problem to be solved by the present invention is to improve the affinity-based macromolecular separation efficiency. An object of the present invention is to improve the separation efficiency of macromolecules such as proteins by increasing the number of ligands that bind target proteins to a carrier of a certain area or space.

상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 단백질 분리능을 갖는 자성 아가로스 비드로, 상기 자성 아가로스 비드는 내부에 상자성 산화철을 함유하고, 상기 자성 아가로스 비드의 표면에 그라프트된 브러쉬형 고분자와 금속이온 착화합물이 결합된 것을 특징으로 하는, 자성 아가로스 비드를 제공한다. 상기 비드의 표면은 비드에 형성된 기공의 표면 또는 내부를 포함하는 개념으로 이해될 수 있다. In order to solve the above problems, the present invention is a magnetic agarose bead having protein separation ability, the magnetic agarose bead contains paramagnetic iron oxide therein, and a brush-type polymer and a metal grafted on the surface of the magnetic agarose bead Provided is a magnetic agarose bead, characterized in that an ionic complex is bound thereto. The surface of the bead may be understood as a concept including the surface or inside of pores formed in the bead.

본 발명은 고기능화 자성 아가로스 비드 (MAB, Magnetic agarose bead)의 제공에 관한 것이다. 본 발명의 일 구현예에서 자성 입자를 포함하는 자성 아가로스 비드를 이용하여 금속 이온 배위능 및/또는 표적 단백질 분리능이 우수한 고기능화 자성 아가로스 비드 및 이의 제조방법을 제공한다. 또한, 본 발명의 다른 구현예를 통해 상기 고기능화 자성 아가로스 비드를 이용한 거대분자의 분리 방법을 제공한다. 다른 구현예에서 자성 아가로스 비드가 갖는 자성을 이용하여 분리 대상 화합물을 흡착시켜 고효율로 물질을 정제하는 방법을 제공한다. The present invention relates to the provision of highly functional magnetic agarose beads (MAB). In one embodiment of the present invention, highly functionalized magnetic agarose beads having excellent metal ion coordination ability and/or target protein separation ability using magnetic agarose beads containing magnetic particles and a method for preparing the same are provided. In addition, another embodiment of the present invention provides a method for separating macromolecules using the highly functionalized magnetic agarose beads. In another embodiment, a method for purifying a material with high efficiency by adsorbing a compound to be separated using the magnetism of magnetic agarose beads is provided.

본 발명의 일 실시예는 솔-젤 변환에 의해 다공성을 가지면서 SPIO 도입으로 자성이 부여된 자성 아가로스 비드 (MAB, MAGNETIC AGAROSE BEAD)의 표면과 기공에 산화-환원 라디칼 사슬반응을 통해 아세트산(AA)을 그라프트 중합시키고, NTA-Ni를 도입하여 His-6 표지된 단백질과 같은 거대분자를 고효율로 분리하고, 자성을 이용하여 용이하게 정제하는 자성 아가로스 비드 (MAB, MAGNETIC AGAROSE BEAD)에 관한 것이다.One embodiment of the present invention is acetic acid (MAB, MAGNETIC AGAROSE BEAD) through oxidation-reduction radical chain reaction on the surface and pores of magnetic agarose beads (MAB, MAGNETIC AGAROSE BEAD) having porosity by sol-gel conversion and having magnetism imparted by SPIO introduction AA) is graft polymerized, and NTA-Ni is introduced to separate macromolecules such as His-6-labeled proteins with high efficiency, and to magnetic agarose beads (MAB, MAGNETIC AGAROSE BEAD) that are easily purified using magnetism. it's about

본 발명의 또 다른 실시예는 단백질과 같은 거대분자의 분리를 위한 친화성 기반 담체에 금속 리간드와 결합할 수 있는 관능기를 브러쉬 형태의 고분자로 그라프팅시켜 거대분자와 결합할 수 있는 금속 리간드의 수를 증가시킴으로써 자성 아가로스 비드의 거대분자에 대한 분리 효율을 극대화하고, 자성을 이용하여 자성 아가로스 비드 (MAB, MAGNETIC AGAROSE BEAD)에 흡착된 거대분자를 영구자석에 의해 분리하는 고기능화 자성 아가로스 비드 (MAB, MAGNETIC AGAROSE BEAD)에 관한 것이다.Another embodiment of the present invention is to graft a functional group that can bind to a metal ligand to an affinity-based carrier for separation of macromolecules such as proteins with a brush-type polymer, thereby increasing the number of metal ligands that can bind to macromolecules. Highly functional magnetic agarose beads that maximize the separation efficiency for macromolecules of magnetic agarose beads by increasing the (MAB, MAGNETIC AGAROSE BEAD).

본 발명의 일 측면은 상자성 산화철 입자를 포함하는 자성 아가로스 비드를 제공한다. 상기 자성 아가로스 비드는 상자성 산화철 입자에 대한 아가로스의 중량비가 1: 2 내지 8(상자성 산화철 입자:아가로스), 바람직하게는 1: 4 내지 6의 중량비를 가질 수 있다. 중량비가 1:2 미만인 경우는 아가로스 비드 내에서 SPIO입자의 회합이 증가하고 자화도가 증가하지만 회합된 SPIO입자의 아가로스 비드 내 분포가 불균일한 문제가 있고, 중량비가 1:8 을 초과하는 경우는 아가로스 비드 내 SPIO입자의 회합이 감소하고 아가로스 비드 내 분포가 균일하지만, 자화도가 지나치게 감소하는 문제가 있다. One aspect of the present invention provides magnetic agarose beads comprising paramagnetic iron oxide particles. The magnetic agarose beads may have a weight ratio of agarose to paramagnetic iron oxide particles of 1:2 to 8 (paramagnetic iron oxide particles:agarose), preferably 1:4 to 6. If the weight ratio is less than 1:2, the association of the SPIO particles in the agarose beads increases and the magnetization increases, but there is a problem of uneven distribution of the associated SPIO particles in the agarose beads, and if the weight ratio exceeds 1:8 In this case, the association of SPIO particles in the agarose beads is reduced and the distribution in the agarose beads is uniform, but the magnetization is excessively reduced.

상기 상자성 산화철은 초상자성 산화철(superparamagnetic iron oxide, SPIO)인 것이 바람직하다. 상기 상자성 산화철은 바람직하게 입자가 약 70 내지 800 nm(나노미터), 더 바람직하게 100 내지 600 nm, 더 바람직하게 300 내지 500 nm의 평균 직경을 가질 수 있다. 상기 '약'이라 함은 오차범위 ±1nm까지 포함된다는 의미로 이해될 수 있다. 평균 입경의 측정 방법은 업계의 통상적인 방법으로 측정할 수 있으며, 예를 들어 현미경법 (microscopy)으로 광학 현미경법 (optic microscopy), 투과 전자 현미경법 (TEM), 주사 전자 현미경법 (scanning electron microscopy, SEM) 등을 통해 측정할 수 있으며, 측정방법에 한정되지 않는다. SPIO가 상기한 크기를 갖는 경우, 자기장 하에서 충분한 자기모멘트를 나타내어 거대분자를 흡착한 고기능화 자성 아가로스 비드를 영구자석으로 분리하기에 용이한 장점을 갖는다. SPIO의 크기가 70 nm 이하인 경우, 극초상자성 산화철의 특성을 나타내어 자기장 하에서 나타내는 자기모멘트가 낮아 거대분자를 흡착한 자성 아가로스 비드 (MAB)를 영구자석을 이용하여 분리할 때, 비드의 견인이 용이하지 않고, SPIO의 크기가 800 nm 이상인 경우, 아가로스 비드 내에서 SPIO가 소수성 인력에 의해 응집하는 경향의 증가로 비드 내에 SPIO가 균일하게 분포하기 어려운 문제가 있다. 또한, 상기 입자 크기를 가질 때 브러쉬형 중합체가 아가로스 비드 표면에 결합되는 것을 방해하지 않아 본 발명의 목적 달성에 유리할 수 있다. The paramagnetic iron oxide is preferably superparamagnetic iron oxide (SPIO). The paramagnetic iron oxide particles may preferably have an average diameter of about 70 to 800 nm (nanometers), more preferably 100 to 600 nm, and more preferably 300 to 500 nm. The term 'about' may be understood to mean that an error range of ±1 nm is included. The average particle diameter can be measured by a conventional method in the industry, for example, optical microscopy, transmission electron microscopy (TEM), and scanning electron microscopy (microscopy). , SEM), etc., and is not limited to the measurement method. When the SPIO has the above size, it exhibits a sufficient magnetic moment under a magnetic field, and thus has the advantage of easily separating the highly functionalized magnetic agarose beads adsorbed with macromolecules into permanent magnets. When the size of SPIO is 70 nm or less, it exhibits the characteristics of hyperparamagnetic iron oxide and has a low magnetic moment under a magnetic field, making it easy to pull the beads when separating magnetic agarose beads (MAB) adsorbed with macromolecules using a permanent magnet. Otherwise, when the size of the SPIO is 800 nm or more, it is difficult to uniformly distribute the SPIO within the bead due to the increased tendency of the SPIO to aggregate due to hydrophobic attraction within the agarose bead. In addition, when having the above particle size, it may be advantageous to achieve the object of the present invention because it does not prevent the brush-type polymer from binding to the surface of the agarose bead.

상기 아가로스 비드의 평균 직경은 특별히 제한되지 않으며, 상기 아가로스 비드 내에 SPIO가 안정적으로 봉입되고 브러쉬형 중합체가 아가로스 표면에 안정적으로 결합될 수 있다면 아가로스 비드의 크기는 제한없이 사용될 수 있다. 예를 들어 평균 직경은 10 내지 210 ㎛(마이크로미터) 범위일 수 있고, 15 내지 205㎛ 범위일 수 있다. The average diameter of the agarose beads is not particularly limited, and the size of the agarose beads may be used without limitation as long as SPIO is stably encapsulated in the agarose beads and the brush-type polymer can be stably bonded to the agarose surface. For example, the average diameter may be in the range of 10 to 210 μm (micrometers), and may be in the range of 15 to 205 μm.

본 발명의 일 측면에서 제공되는 자성 아가로스 비드 (MAB)는 아가로스 비드 내에 함유되는 상자성 산화철 표면을 코팅하지 않는다. 예를 들어 카르복시메틸 덱스트란 또는 덱스트란과 같은 친수성 입자를 코팅하지 않고 사용할 수 있다. 코팅되지 않은 산화철 나노입자는 자성 아가로스 비드의 표면에 브러쉬형 고분자를 그라프트할 때 고른 분포가 가능하게 할 수 있다. 상기 친수성 입자로 코팅된 자성 나노입자를 사용하여 아가로스 비드를 제조하는 경우, 아가로스 비드 내에 자성 나노입자의 분포가 균일할 수 있다. 아가로스 비드 내에서 자성 나노입자가 일정 수준의 회합을 이루지 못하는 경우 자화도가 약해질 가능성이 있다. 따라서, 본 발명에서 친수성 입자로 코팅하지 않은 자성 나노입자를 사용한 이유는 자성 입자들이 아가로스 비드 내에서 적절한 자화도를 가질 수 있을 정도의 회합체를 형성하도록 하기 위해서이다. 그리고 친수성 입자로 코팅된 자성 나노입자를 사용하는 경우, 아가로스 비드의 표면 또는 기공에 친수성 입자로 코팅된 자성 나노입자가 노출되어 고분자 단량체와 반응할 가능성이 있어 이를 막기 위해 친수성 입자로 상자성 산화철을 코팅하지 않는다. 친수성 입자로 코팅되지 않은 자성입자를 사용하는 경우 자성 아가로스 비드 제조에 있어서 공정의 단순화와 경제성을 확보할 수 있다는 장점도 있다.The magnetic agarose beads (MAB) provided in one aspect of the present invention do not coat the surface of the paramagnetic iron oxide contained in the agarose beads. For example, hydrophilic particles such as carboxymethyl dextran or dextran may be used without coating. Uncoated iron oxide nanoparticles can be evenly distributed when the brush-type polymer is grafted onto the surface of magnetic agarose beads. When agarose beads are prepared using the magnetic nanoparticles coated with the hydrophilic particles, the magnetic nanoparticles may be uniformly distributed in the agarose beads. If the magnetic nanoparticles do not form a certain level of association within the agarose beads, the magnetization may be weakened. Accordingly, the reason why magnetic nanoparticles that are not coated with hydrophilic particles are used in the present invention is to allow the magnetic particles to form an aggregate in an agarose bead that can have an appropriate degree of magnetization. In addition, when magnetic nanoparticles coated with hydrophilic particles are used, there is a possibility that the magnetic nanoparticles coated with hydrophilic particles are exposed to the surface or pores of the agarose beads and react with polymer monomers. To prevent this, paramagnetic iron oxide is used as hydrophilic particles. do not coat In the case of using magnetic particles that are not coated with hydrophilic particles, there are also advantages in that process simplification and economic feasibility can be secured in manufacturing magnetic agarose beads.

상기 자성 아가로스 비드의 표면은 브러쉬형 고분자가 그라프트될 수 있다. 상기 브러쉬형 고분자는 고분자 구조의 곁사슬이 주사슬에 부착된 고분자를 일컫는 것으로 알려져 있다. 상기 그라프트는 그라프트 중합(graft polymerization)이라고도 불린다. 상기 결합은 바람직하게 공유결합이다. 본 발명의 자성 비드는 SPIO를 함유하는 자성 아가로스 비드의 히드록실기에 카르복실기를 갖는 브러쉬형 고분자의 단량체를 그라프트 중합시켜 사슬중합체가 형성될 수 있다. 본 발명의 자성 아가로스 비드는 상기 사슬중합체와 금속이온 착화합물이 결합된 형태를 갖는다. 브러쉬형 중합체는 통상적으로 백본(backbone) 사슬과, 각각의 분기점에 매달린 2개의 암을 갖거나, 또는 골격과, 각각의 분기점에 각각 매달린 하나의 암을 갖는 중합체이고, 모든 암이 동일한 방향으로 뻗어있지는 않다. 상기 브러쉬형 고분자는 폴리아크릴산, 폴리메타크릴산, 폴리아스팔트산, 폴리 글루탐산, 폴리락트산, 히알루로닉산 및 알긴산으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 포함할 수 있다. 구체적으로 상기 자성 아가로스 비드에 그라프팅시키는 고분자는 라디칼 중합을 이용하는 폴리아크릴산 또는 폴리메타크릴산, 개환 중합을 이용하는 폴리아스팔트산, 폴리 글루탐산 또는 폴리락트산, 말단 반응성을 이용하는 히알루로닉산 또는 알긴산 등이 있고, 바람직하게는 라디칼 중합을 이용하는 폴리아크릴산 또는 폴리메타크릴산이고, 가장 바람직하게는 폴리아크릴산이다. 상기 폴리아크릴산이 이용될 때 분리 대상 표적 거대분자에 대해 결합능이 증진되어 표적 거대분자와의 친화도가 증진되어 분리 효율이 증진될 수 있다. The surface of the magnetic agarose beads may be grafted with a brush-type polymer. The brush-type polymer is known to refer to a polymer in which a side chain of a polymer structure is attached to a main chain. The graft is also called graft polymerization. The bond is preferably a covalent bond. In the magnetic beads of the present invention, a chain polymer may be formed by graft polymerization of a brush-type polymer monomer having a carboxyl group to a hydroxyl group of a magnetic agarose bead containing SPIO. The magnetic agarose beads of the present invention have a form in which the chain polymer and the metal ion complex are combined. Brush-like polymers are polymers that usually have a backbone chain and two arms hanging from each branch, or a backbone and one arm hanging from each branch, all arms extending in the same direction. There is not. The brush-type polymer may include at least one selected from the group consisting of polyacrylic acid, polymethacrylic acid, polyasphaltic acid, polyglutamic acid, polylactic acid, hyaluronic acid, and alginic acid. Specifically, the polymer to be grafted onto the magnetic agarose beads is polyacrylic acid or polymethacrylic acid using radical polymerization, polyasphaltic acid, polyglutamic acid or polylactic acid using ring-opening polymerization, hyaluronic acid or alginic acid using terminal reactivity. polyacrylic acid or polymethacrylic acid using radical polymerization is preferred, and polyacrylic acid is most preferred. When the polyacrylic acid is used, the binding ability to the target macromolecule to be separated is enhanced, and the affinity with the target macromolecule is increased, so that the separation efficiency can be improved.

상기 금속이온 착화합물은 이민 또는 아민 작용기를 갖는 화합물이 금속이온과 배위결합하여 형성되며, 상기 금속이온과 배위결합하는 이민 또는 아민 작용기를 갖는 화합물은 N α ,N α -비스(카르복시메틸)-L-리신 하이드레이트 (N α ,N α -Bis(carboxymethyl)-L-lysine hydrate (aminobutyl NTA, AB-NTA)), 1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸(1,4,7,10-Tetraazacyclododecane), 디에틸렌트리아민펜타아세트산(Diethylenetriaminepentaacetic acid) 및 에틸렌디아민테트라아세트산(Ethylenediaminetetraacetic acid)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 포함하며, 바람직하게 N α ,N α -비스(카르복시메틸)-L-리신 하이드레이트를 포함한다. 상기 화합물들은 모두 착화합물을 형성할 수 있지만, 특히 상기 N α ,N α -비스(카르복시메틸)-L-리신 하이드레이트는 사슬중합체의 관능기 예를 들어, 폴리아크릴산(PAA)의 측쇄 카르복실기와 반응시키기 위해서는 화합물들의 카르복실기들 중 일부를 protection하여 반응시킨 후 deprotection 하는 반응이 필요하지 않고, 화합물들을 본 발명의 브러쉬형 중합체들과 결합하였을 때 일정한 탄소수를 갖는 스페이서를 가질 수 있어 금속 이온 착화합물 형성 및 단백질의 흡착에 용이할 수 있다.The metal ion complex compound is formed by a compound having an imine or amine functional group coordinated with a metal ion, and the compound having an imine or amine functional group coordinated with the metal ion is N α ,N α -bis(carboxymethyl)-L -Lysine hydrate ( N α ,N α -Bis(carboxymethyl)-L-lysine hydrate (aminobutyl NTA, AB-NTA)), 1,4,7,10-tetraazacyclododecane (1,4,7,10 -Tetraazacyclododecane), diethylenetriaminepentaacetic acid (Diethylenetriaminepentaacetic acid), and ethylenediaminetetraacetic acid (Ethylenediaminetetraacetic acid), preferably containing at least one selected from the group consisting of N α , N α -bis (carboxymethyl) -L -Contains lysine hydrate. Although all of the above compounds can form a complex compound, in particular, the N α ,N α -bis(carboxymethyl)-L-lysine hydrate needs to be reacted with a functional group of a chain polymer, for example, a side chain carboxyl group of polyacrylic acid (PAA). After reacting by protecting some of the carboxyl groups of the compounds, there is no need for a deprotection reaction, and when the compounds are combined with the brush-type polymers of the present invention, they can have a spacer with a certain number of carbon atoms, thereby forming metal ion complexes and adsorbing proteins. can be facilitated in

상기 금속이온은 니켈(Ni), 코발트 (Co), 철 (Fe) 및 구리 (Cu)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 금속의 이온을 포함할 수 있으며, 바람직하게 거대분자와의 결합능을 고려해 니켈(Ni) 이온을 포함할 수 있다. 상기 금속이온 착화합물은 N α ,N α -비스(카르복시메틸)-L-리신 하이드레이트와 니켈(Ni)의 착화합물일 수 있다. The metal ion may include ions of one or more metals selected from the group consisting of nickel (Ni), cobalt (Co), iron (Fe) and copper (Cu), and preferably nickel in consideration of binding ability with macromolecules. (Ni) ions may be included. The metal ion complex may be a complex of N α ,N α -bis(carboxymethyl)-L-lysine hydrate and nickel (Ni).

본 발명의 상기 자성 아가로스 비드는 거대분자의 분리 또는 정제에 이용될 수 있으며, 특히 단백질, 펩타이드, 핵산 등과 같은 거대분자, 더욱더 특히 히스택(His-tag) 거대분자 분리 또는 정제용에 이용될 수 있다. 본 발명은 자성 아가로스 비드를 포함하는 히스택(His-tag) 거대분자 분리 또는 정제용 조성물을 제공한다. 상기 '히스택(His-tag, polyhistidine-tag) 거대분자'는 His (히스티딘) 잔기로 구성된 아미노산 모티프가 단백질의 말단 (N 말단 또는 C 말단)에 부착된 거대분자를 의미한다. 히스택을 이용한 단백질의 정제는 업계에서 널리 사용되고 있다. The magnetic agarose beads of the present invention can be used for separation or purification of macromolecules, in particular for separation or purification of macromolecules such as proteins, peptides and nucleic acids, and more particularly His-tag macromolecules. can The present invention provides a composition for separation or purification of His-tag macromolecules including magnetic agarose beads. The 'His-tag (polyhistidine-tag) macromolecule' refers to a macromolecule in which an amino acid motif consisting of a His (histidine) residue is attached to the terminal (N-terminus or C-terminus) of a protein. Protein purification using Histack is widely used in the industry.

본 발명의 다른 실시예는 금속이온 착화합물이 브러쉬형 고분자에 결합된 자성 아가로스 비드의 제조 방법을 제공한다. 하기 단계를 포함할 수 있다. Another embodiment of the present invention provides a method for preparing magnetic agarose beads in which a metal ion complex is bound to a brush-type polymer. It may include the following steps.

S1) 상자성 산화철을 아가로스 유화액과 혼합하여 상자성 산화철을 함유하는 자성 아가로스 비드(MAB)를 제조하는 단계,S1) preparing magnetic agarose beads (MAB) containing paramagnetic iron oxide by mixing paramagnetic iron oxide with an agarose emulsion;

S2) 상기 자성 아가로스 비드와 브러쉬형 고분자 단량체를 반응시켜 브러쉬형 고분자가 그라프트된 자성 아가로스 비드를 얻는 단계,S2) reacting the magnetic agarose beads with brush-type polymer monomers to obtain magnetic agarose beads grafted with brush-type polymers;

S3) 이민 또는 아민 작용기를 갖는 화합물을 상기 S2) 단계의 브러쉬형 고분자와 결합하는 단계, 및 S3) combining a compound having an imine or amine functional group with the brush-type polymer of step S2), and

S4) 상기 이민 또는 아민 작용기를 갖는 화합물과 착화합물을 형성하는 금속 이온을 반응시키는 단계.S4) reacting the compound having an imine or amine functional group with a metal ion forming a complex compound.

상기 S1) 단계는 철 이온(Fe2+, 및/또는 Fe3+ 이온)을 공침법을 이용하여 SPIO를 제조한 후, 아가로스 유화액을 이용하여 자성 아가로스 비드를 제조하는 단계를 포함한다. 상기 S1) 단계에서, 상기 아가로스 유화액은 유화액 총 중량 대비 1 내지 8 중량%의 아가로스를 포함하여 용액의 농도는 1 내지 8%, 바람직하게는 1.5 내지 7.5%일 수 있다. 상기 농도 범위를 가질 때 아가로스 비드의 크기 분포가 균일하다. The step S1) includes preparing SPIO using iron ions (Fe 2+ , and/or Fe 3+ ions) by a co-precipitation method, and then preparing magnetic agarose beads using an agarose emulsion. In the step S1), the agarose emulsion may contain 1 to 8% by weight of agarose based on the total weight of the emulsion, and the concentration of the solution may be 1 to 8%, preferably 1.5 to 7.5%. When having the above concentration range, the size distribution of the agarose beads is uniform.

아가로스 용액의 농도가 8% 초과일 경우, 아가로스 용액의 고점도로 인해 W/O 액적의 형성이 어려워 비드 형성율이 저조하고, 아가로스 용액의 농도가 1% 미만인 경우, 아가로스에 대한 SPIO의 농도가 매우 높아 아가로스 수용액 액적 내에서 SPIO가 액적의 중심부로 회합하는 문제가 있다. 상기 상자성 산화철을 아가로스 유화액과 300 내지 1,000rpm의 교반속도로, 바람직하게 350 내지 900 rpm의 교반속도로 22 내지 28℃의 온도에서 혼합할 수 있다. 상기 아가로스 유화액의 교반 속도가 300 rpm 미만이거나 1,000 rpm을 초과하는 경우, 액적의 크기가 불균일하여 생성되어 자성 아가로스 비드의 크기 분포가 불균일해지는 문제가 있을 수 있다. When the concentration of the agarose solution is more than 8%, the formation of W / O droplets is difficult due to the high viscosity of the agarose solution, and the bead formation rate is low, and when the concentration of the agarose solution is less than 1%, SPIO for agarose The concentration of is very high, and there is a problem in that SPIO in the droplet of the agarose solution is associated with the center of the droplet. The paramagnetic iron oxide may be mixed with the agarose emulsion at a stirring speed of 300 to 1,000 rpm, preferably at a stirring speed of 350 to 900 rpm at a temperature of 22 to 28 °C. When the stirring speed of the agarose emulsion is less than 300 rpm or greater than 1,000 rpm, there may be a problem in that the size distribution of the magnetic agarose beads is non-uniform due to the non-uniform size of the droplets.

상기 S2) 단계에서, 자성 아가로스 비드에 그라프팅시키는 고분자 단량체의 양은 아가로스의 히드록실기에 대하여 10 내지 100 몰%, 바람직하게는 20 내지 60 몰%일 수 있다. 즉, 아가로스 비드의 히드록실기 1몰 대비 10 내지 100몰 %의 고분자 단량체를 반응시켜 아가로스 비드의 표면에 그라프트 중합시킬 수 있다. 아가로스에 대한 고분자 단량체의 반응 몰비율이 10몰 % 미만인 경우 브러쉬 형태를 갖는 사슬형 그라프트중합체의 형성이 어렵고, 몰 비율이 100몰 %를 초과하는 경우 사슬형 그라프트중합체가 과밀하게 형성되어 금속이온 킬레이트화제와 단백질 결합이 어려울 수 있다. 상기 단계는 중합 개시제를 이용할 수 있으며, 바람직한 중합 개시제는 CAN (cerium ammonium nitrate), KPS (potassium persulfate), APS (ammonium persulfate) 및 PS/MBS (perulfate/metabisulfate)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 포함할 수 있으며, 바람직하게 안정적인 사슬중합체 그라프팅을 위해 CAN이 포함될 수 있다. 자성 아가로스 비드의 아가로스가 갖는 히드록실기와 중합 개시제의 몰비는 1: 0.1 내지 1.0, 바람직하게 1: 0.2 내지 0.6일 수 있으며, 상기 몰비를 가질 때 자성 아가로스 비드의 자성이나 표면적에 영향을 받지 않고 안정적으로 사슬형 그라프트 중합체가 형성될 수 있다. 상기 중합 개시제는 자성 아가로스 비드에 그라프팅시키는 고분자 단량체의 양의 양과 실질적으로 동일한 양을 사용할 수 있으며, 바람직하게 아가로스의 히드록실기에 대하여 10 내지 100 몰%, 바람직하게는 20 내지 60 몰%일 수 있다.In the step S2), the amount of the polymer monomer grafted onto the magnetic agarose beads may be 10 to 100 mol%, preferably 20 to 60 mol%, based on the hydroxyl group of the agarose. That is, graft polymerization may be performed on the surface of the agarose beads by reacting 10 to 100 mol% of the polymer monomer with respect to 1 mol of the hydroxyl group of the agarose beads. When the reaction molar ratio of the polymer monomer to agarose is less than 10 mol%, it is difficult to form a chain-type graft polymer having a brush shape, and when the molar ratio exceeds 100 mol%, the chain-type graft polymer is overcrowded. Metal ion chelating agents and protein binding can be difficult. In the above step, a polymerization initiator may be used, and a preferred polymerization initiator is at least one selected from the group consisting of cerium ammonium nitrate (CAN), potassium persulfate (KPS), ammonium persulfate (APS), and perulfate/metabisulfate (PS/MBS). CAN may be included, preferably for stable chain polymer grafting. The molar ratio of the hydroxyl group of the agarose of the magnetic agarose beads and the polymerization initiator may be 1: 0.1 to 1.0, preferably 1: 0.2 to 0.6, and the molar ratio affects the magnetism or surface area of the magnetic agarose beads A chain-like graft polymer can be stably formed without being subjected to The polymerization initiator may be used in an amount substantially equal to the amount of the polymer monomer grafted onto the magnetic agarose beads, preferably 10 to 100 mol%, preferably 20 to 60 mol, based on the hydroxyl group of the agarose. may be %.

상기 S3) 단계의 이민 또는 아민 작용기를 갖는 화합물은 N α ,N α -비스(카르복시메틸)-L-리신 하이드레이트, 1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸, 디에틸렌트리아민펜타아세트산 및 에틸렌디아민테트라아세트산으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 포함할 수 있으며, 바람직하게 단백질 분리능을 고려하여 N α ,N α -비스(카르복시메틸)-L-리신 하이드레이트를 이용할 수 있다. The compound having an imine or amine functional group in step S3) is N α ,N α -bis(carboxymethyl)-L-lysine hydrate, 1,4,7,10-tetraazacyclododecane, diethylenetriaminepentaacetic acid and ethylenediaminetetraacetic acid, and may include at least one selected from the group consisting of, preferably, N α ,N α -bis(carboxymethyl)-L-lysine hydrate in consideration of protein separation ability.

상기 S4) 단계의 금속이온은 니켈(Ni), 코발트 (Co), 철 (Fe) 및 구리 (Cu)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 금속의 이온을 포함할 수 있으며, 바람직하게 바람직하게 단백질 분리능을 고려하여 니켈(Ni)을 이용할 수 있다. The metal ion in step S4) may include ions of one or more metals selected from the group consisting of nickel (Ni), cobalt (Co), iron (Fe), and copper (Cu), and preferably have protein resolution. Considering this, nickel (Ni) can be used.

본 발명의 자성 비드는 His-6 표지된 단백질에 대하여 선택적인 결합능을 가지며 아가로스 비드의 표면과 기공을 PAA와 같은 물질로 고기능화 하지 않은 기존의 자성 아가로스 비드에 비해 His-6 표지된 단백질의 결합 자리의 수가 증가한다. 이 때, PAA에 비해 측쇄에 보다 많은 관능기를 갖는 고분자를 자성 아가로스 비드에 결합시키거나 관능기가 풍부한 단량체를 그라프 중합시켜 NTA를 도입하는 것을 분리효율의 증진을 위한 접근법으로 고려할 수 있다.The magnetic beads of the present invention have a selective binding ability to His-6-labeled proteins, and compared to conventional magnetic agarose beads in which the surface and pores of the agarose beads are not highly functionalized with materials such as PAA, His-6-labeled proteins The number of binding sites increases. At this time, it may be considered as an approach to improve the separation efficiency to introduce NTA by binding a polymer having more functional groups on the side chain than PAA to magnetic agarose beads or by graft polymerization of a monomer rich in functional groups.

본 발명은 상기 제조방법으로 제조된 히스택(His-tag) 거대분자 분리 또는 정제용 자성 아가로스 비드를 제공한다. The present invention provides magnetic agarose beads for separation or purification of His-tag macromolecules prepared by the above preparation method.

본 발명의 일 구현예는 히스택(His-tag) 거대분자의 정제 방법을 제공한다. One embodiment of the present invention provides a method for purifying a His-tag macromolecule.

상기 제조방법으로 제조된, 금속이온 착화합물이 브러쉬형 고분자에 결합된 자성 아가로스 비드를 제공하는 단계, 혼합물 중의 히스택(His-tag)된 거대분자를 상기 자성 아가로스 비드와 결합시켜 히스택(His-tag) 거대분자-자성 아가로스 비드 복합체를 제조하는 단계 및 상기 히스택(His-tag) 거대분자-자성 아가로스 비드 복합체를 외부 자장으로 혼합물에서 정제하는 단계를 포함할 수 있다. Providing magnetic agarose beads prepared by the above manufacturing method, in which a metal ion complex is bound to a brush-type polymer, His-tag macromolecules in the mixture are combined with the magnetic agarose beads to form His-tags ( Preparing a His-tag macromolecular-magnetic agarose bead complex and purifying the His-tag macromolecular-magnetic agarose bead complex from a mixture using an external magnetic field.

상기 금속이온 착화합물이 브러쉬형 고분자에 결합된 자성 아가로스 비드는 상자성 산화철을 포함하는 아가로스 비드의 표면에 폴리아크릴산, 폴리메타크릴산, 폴리아스팔트산, 폴리 글루탐산, 폴리락트산, 히알루로닉산 및 알긴산으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 고분자가 그라프트될 수 있으며, 바람직하게 폴리아크릴산이 그라프트될 수 있다. The magnetic agarose beads in which the metal ion complex is bound to a brush-type polymer are polyacrylic acid, polymethacrylic acid, polyasphaltic acid, polyglutamic acid, polylactic acid, hyaluronic acid and alginic acid on the surface of the agarose beads containing paramagnetic iron oxide. Any one or more polymers selected from the group consisting of may be grafted, preferably polyacrylic acid may be grafted.

상기 금속이온 착화합물은 N α ,N α -비스(카르복시메틸)-L-리신 하이드레이트와 니켈(Ni)의 착화합물일 수 있다. The metal ion complex may be a complex of N α ,N α -bis(carboxymethyl)-L-lysine hydrate and nickel (Ni).

상기 거대분자는 단백질, 펩타이드 및 핵산으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 포함할 수 있다.The macromolecule may include any one or more selected from the group consisting of proteins, peptides and nucleic acids.

본 발명의 일 구현예는 히스택(His-tag) 거대분자의 분리 방법을 제공한다. One embodiment of the present invention provides a method for separating His-tag macromolecules.

상기 제조방법으로 제조된, 금속이온 착화합물이 브러쉬형 고분자에 결합된 자성 아가로스 비드를 제공하는 단계, 및 혼합물 중의 히스택(His-tag)된 거대분자를 상기 자성 아가로스 비드로 흡착시켜 상기 자성 아가로스 비드로 히스택(His-tag)된 거대분자를 분리하는 단계를 포함할 수 있다. Providing magnetic agarose beads prepared by the above manufacturing method, in which a metal ion complex is bound to a brush-type polymer, and adsorbing His-tagged macromolecules in the mixture to the magnetic agarose beads to obtain the magnetic properties of the agarose beads. Separating His-tagged macromolecules with agarose beads may be included.

본 발명의 고기능화 자성 아가로스 비드 (MAB, magnetic agarose bead)은 카르복실기를 갖는 PAA가 자성 아가로스의 표면과 기공에 모두 존재할 수 있기 때문에, 기존의 자성 아가로스 비드에 비해 NTA와 같은 금속 이온의 킬레이트화제가 매우 풍부하게 존재할 수 있다. 따라서, 본 발명의 고기능화 자성 아가로스 비드는 분리 대상인 표적 거대분자의 분리효율에 있어서 기존의 자성 아가로스 비드에 비해 우수하고, 다른 표적 거대분자의 친화도 기반 분리를 위한 담체로 활용이 가능하다.The highly functional magnetic agarose beads (MAB) of the present invention can chelate metal ions such as NTA compared to conventional magnetic agarose beads because PAA having a carboxyl group can exist on both the surface and pores of magnetic agarose. Topics can exist in great abundance. Therefore, the highly functional magnetic agarose beads of the present invention are superior to conventional magnetic agarose beads in the separation efficiency of target macromolecules to be separated, and can be used as carriers for affinity-based separation of other target macromolecules.

본 명세서에 첨부되는 다음의 도면들은 본 발명의 바람직한 실시예를 예시하는 것이며, 전술한 발명의 내용과 함께 본 발명의 기술을 더욱 이해시키는 역할을 하는 것이므로, 본 발명은 그러한 도면에 기재된 사항에만 한정되어 해석되어서는 아니 된다.
도 1은 크기가 400 nm인 SPIO 및 자성 아가로스 비드의 X선회절 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 2의 (가), (나) 및 (다)는 일정량의 SPIO에 대하여 아가로스의 농도가 각각 2%, 4% 및 8%인 용액을 사용하여 제조한 자성 아가로스 비드의 광학 현미경 이미지이다.
도 3의 (가)는 농도가 각각 1%, 2%, 4% 및 6%인 아가로스 용액을 사용하여 제조한 자성 아가로스 비드, (나)는 아가로스 유화액의 제조에 적용된 교반기의 분당 회전수에 따른 자성 아가로스 비드의 직경을 나타낸 것이다.
도 4는 SPIO와 아가로스의 중량 비율에 따른 자성 아가로스 비드의 자기이력 곡선을 나타낸 것이다.
도 5의 (가)는 SPIO와 자성 아가로스 비드의 합성, (나)는 MAB-PAA의 합성 및 (다)는 MAB-PAA-NTA의 합성을 나타낸 것이다.
도 6은 중합 개시제인 세륨 4가 이온 (Ce+4)의 농도에 따라 자성 아가로스 비드 에 그라프트 중합한 PAA를 푸리에 변환 적외선 (FT-IR) 분광 분석한 결과를 나타낸 것이다.The following drawings attached to this specification illustrate preferred embodiments of the present invention, and serve to further understand the technology of the present invention together with the contents of the above-described invention, so the present invention is limited only to those described in the drawings. and should not be interpreted.
1 shows the results of X-ray diffraction analysis of SPIO and magnetic agarose beads having a size of 400 nm.
2 (A), (B), and (C) are optical microscope images of magnetic agarose beads prepared using solutions having a concentration of 2%, 4%, and 8% of agarose, respectively, with respect to a certain amount of SPIO. .
3 (A) shows magnetic agarose beads prepared using agarose solutions having concentrations of 1%, 2%, 4%, and 6%, respectively, and (B) shows rotation per minute of the stirrer applied to the preparation of the agarose emulsion. It shows the diameter of magnetic agarose beads according to the number.
4 shows hysteresis curves of magnetic agarose beads according to the weight ratio of SPIO and agarose.
5 (a) shows the synthesis of SPIO and magnetic agarose beads, (b) the synthesis of MAB-PAA, and (c) the synthesis of MAB-PAA-NTA.
FIG. 6 shows the results of Fourier transform infrared (FT-IR) spectroscopic analysis of PAA graft-polymerized onto magnetic agarose beads according to the concentration of cerium tetravalent ion (Ce +4 ) as a polymerization initiator.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예 등을 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명에 따른 실시예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 하기 실시예들에 한정되는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 발명의 실시예들은 본 발명이 속한 분야에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.Hereinafter, examples and the like will be described in detail to aid understanding of the present invention. However, the embodiments according to the present invention can be modified in many different forms, and the scope of the present invention should not be construed as being limited to the following examples. Embodiments of the present invention are provided to more completely explain the present invention to those skilled in the art.

<실시예 1> 자성 아가로스 비드의 제조<Example 1> Preparation of magnetic agarose beads

자성 아가로스 비드 은 제 1단계에서 SPIO를 제조한 후, 제 2단계에서 SPIO를 아가로스 용액에 가하여 제조하는 과정을 통해 준비되었다. The magnetic agarose beads were prepared by preparing SPIO in the first step and then adding the SPIO to the agarose solution in the second step.

제 1 단계 (SPIO 제조 단계) 에서 우선 탈이온수 50 mL에 10.4 g의 FeCl3·6H2O (97%, Sigma-Aldrich Co., MO, USA), 4.0 g의 FeCl2·4H2O (98%, Sigma-Aldrich Co., MO, USA) 및 1.7 mL의 12M HCl을 가한 후 교반하여 녹였다. 상기 제조된 용액을 N2 가스로 20분간 탈기시켰다. 한편, 500 mL의 1.5 M NaOH용액을 제조하고 15분간 탈기한 후 반응기에 가하고 80 ℃로 가열하였다. 초자 또는 실리콘 교반봉을 이용하여 상기 NaOH용액을 1000 rpm의 속도로 강하게 교반하면서 상기 제조한 철이온 용액을 dropping funnel을 이용해 30분 동안 점적하였다. 이 때, 반응 용액의 온도는 80 ℃로 유지하였고 산소의 침투를 막기 위해 N2 가스를 사용하였다. 반응 후, 생성된 산화철 입자를 반응 매질로부터 자석을 이용하여 분리하였고, 분리된 산화철을 500 mL의 탈이온수로 4회 세척하였다. 세척 후 얻어진 산화철 입자를 500 mL의 탈기한 탈이온수에 분산시킨 액의 pH는 11.0 이었다. In the first step (SPIO preparation step), 10.4 g of FeCl 3 6H 2 O (97%, Sigma-Aldrich Co., MO, USA) and 4.0 g of FeCl 2 4H 2 O (98 %, Sigma-Aldrich Co., MO, USA) and 1.7 mL of 12M HCl were added and dissolved by stirring. The prepared solution was degassed with N 2 gas for 20 minutes. Meanwhile, 500 mL of 1.5 M NaOH solution was prepared, degassed for 15 minutes, and then added to the reactor and heated to 80 °C. While strongly stirring the NaOH solution at a speed of 1000 rpm using a glass jar or a silicon stirring rod, the prepared iron ion solution was dropped for 30 minutes using a dropping funnel. At this time, the temperature of the reaction solution was maintained at 80 °C and N 2 gas was used to prevent oxygen permeation. After the reaction, the produced iron oxide particles were separated from the reaction medium using a magnet, and the separated iron oxide was washed 4 times with 500 mL of deionized water. The pH of the solution in which the iron oxide particles obtained after washing were dispersed in 500 mL of degassed deionized water was 11.0.

제 2단계 (SPIO 함유 아가로스 비드 제조 단계) 에서 상기 1 단계에서 제조한 산화철 입자를 80 ℃에서 교반 중인 4 % 아가로스 (Type 1, Sigma-Aldrich Co., MO, USA) 용액에 첨가하였다. 산화철이 첨가된 아가로스 용액을 50 ℃로 냉각시키고, 상기 아가로스 용액을 격렬히 교반하면서 사이클로헥산 (99%, Sigma-Aldrich Co., MO, USA)에 Span85® (Sigma, MO, USA)를 4% (v/v) 농도로 녹인 용액을 첨가하였다. 산화철 입자들이 내부에 함입되어 있는 구형의 아가로스 입자가 제조되었다.In the second step (preparation of SPIO-containing agarose beads), the iron oxide particles prepared in step 1 were added to a 4% agarose (Type 1, Sigma-Aldrich Co., MO, USA) solution being stirred at 80 °C. The iron oxide-added agarose solution was cooled to 50° C., and Span85® (Sigma, MO, USA) was added to cyclohexane (99%, Sigma-Aldrich Co., MO, USA) for 4 days while vigorously stirring the agarose solution. The dissolved solution was added in % (v/v) concentration. Spherical agarose particles in which iron oxide particles were embedded were prepared.

<실험예 1> 자성 아가로스 비드의 XRD 분석<Experimental Example 1> XRD analysis of magnetic agarose beads

실시예 1에서 제조된 크기가 400 nm인 SPIO의 XRD 패턴을 Cu Kα 방사선을 사용하는 X-ray powder diffractometer (D8 ADVANCE, Bruker AXS GmbH, Kalsruhe, Germany)를 이용하여 분석하였고, 그 결과를 도 1에 나타내었다.The XRD pattern of SPIO having a size of 400 nm prepared in Example 1 was analyzed using an X-ray powder diffractometer (D8 ADVANCE, Bruker AXS GmbH, Kalsruhe, Germany) using Cu Kα radiation, and the results are shown in FIG. 1 shown in

상기 실시예 1에서 제조된 SPIO과 SPIO 함유 아가로스 비드는 모두 마그네타이트의 고유 피크들을 나타내는 것으로부터 아가로스 비드 내의 초상자성 산화철이 결정성을 유지함을 확인하였다.Since both the SPIO and SPIO-containing agarose beads prepared in Example 1 exhibited peaks unique to magnetite, it was confirmed that the superparamagnetic iron oxide in the agarose beads maintained crystallinity.

<실험예 2> 자성 아가로스 비드의 광학 현미경 관찰 및 입도 분석<Experimental Example 2> Optical microscope observation and particle size analysis of magnetic agarose beads

실시예 1에 개시한 자성 아가로스 비드 제조 방법에 따라 농도가 각각 2%, 4% 및 8%인 아가로스 용액을 사용하여 제조한 자성 아가로스 비드의 광학 현미경 (Leica DMI3000 B, Leica Microsystems, Wetzlar, Germany) 이미지를 도 2에 나타내었다. 아가로스 용액의 농도가 증가할수록 유화 용액 내에 아가로스의 액적의 수가 증가하고, 아가로스에 대한 SPIO의 농도가 낮아져 아가로스 액적 내 회합이 감소함으로써 자성 아가로스 비드 내에 SPIO가 더 균일하게 분포하는 경향을 나타내었다.Optical microscopy of magnetic agarose beads (Leica DMI3000 B, Leica Microsystems, Wetzlar , Germany) images are shown in FIG. 2 . As the concentration of the agarose solution increases, the number of agarose droplets in the emulsified solution increases, and the SPIO concentration in the agarose decreases, resulting in a decrease in agarose droplet association, resulting in a more uniform distribution of SPIO within the magnetic agarose beads. showed

한편, 실시예 1에서 개시한 자성 아가로스 비드 제조법에 따라 농도가 각각 1%, 2%, 4% 및 6%인 아가로스 용액을 사용하여 제조한 자성 아가로스 비드의 직경을 입도 분석기 (Microtrac 3000, Microtrac Inc., Montgomeryville, PA, USA)를 이용하여 25 °C에서 측정하였고, 그 결과를 도 3의 (가)에 나타내었다. 아가로스의 농도가 증가할수록 생성되는 자성 아가로스 비드의 평균 직경은 증가하였고, 2% 아가로스를 제외하고 비드의 직경의 분포도 증가하는 경향을 나타내었다. On the other hand, the diameter of the magnetic agarose beads prepared using agarose solutions having concentrations of 1%, 2%, 4%, and 6%, respectively, according to the method for preparing magnetic agarose beads disclosed in Example 1, was measured using a particle size analyzer (Microtrac 3000 , Microtrac Inc., Montgomeryville, PA, USA) was measured at 25 °C, and the results are shown in (a) of FIG. As the agarose concentration increased, the average diameter of the magnetic agarose beads produced increased, and the distribution of the diameters of the beads showed a tendency to increase, except for 2% agarose.

또한, 아가로스 유화액의 제조에 적용된 교반기의 회전수에 따른 자성 아가로스 비드의 직경을 도 3의 (나)에 나타내었다. 아가로스 유화액의 액적을 형성시키는데 적용하는 기계식 교반기의 교반속도를 증가시킴에 따라 생성되는 자성 아가로스 비드의 직경은 증가하였고, 1,200 rpm과 같은 고속 교반 조건에서 자성 아가로스 비드의 직경의 불균일성은 증가하였다.In addition, the diameter of the magnetic agarose beads according to the number of revolutions of the stirrer applied to the preparation of the agarose emulsion is shown in FIG. 3 (b). As the stirring speed of the mechanical stirrer used to form the droplets of the agarose emulsion was increased, the diameter of the magnetic agarose beads produced increased, and the non-uniformity of the diameter of the magnetic agarose beads increased under high-speed stirring conditions such as 1,200 rpm. did

<실험예 3> 자성 아가로스 비드의 자기 이력 곡선 분석<Experimental Example 3> Hysteresis curve analysis of magnetic agarose beads

실시예 1에 개시한 제조 방법에 따라 SPIO에 대한 아가로스의 중량비가 각각 0, 2, 4, 6 및 8 인 조건에서 제조한 자성 아가로스 비드의 자기이력 특성을 진동형 자력측정기 (Vibrating Sample Magnetometer, PMC MicroMag 2900-2 AGM, Lake Shore Cryotronics, Inc., OH, USA)을 이용하여 측정하였고, 그 결과를 도 4에 나타내었다. 도 4에 나타낸 것과 같이 상기 실시예 1에서 제조된 자성 아가로스 비드 는 초상자성 산화철의 자기이력 특성을 나타내었고, SPIO에 대한 아가로스의 중량이 증가할수록 자성 아가로스 비드의 자기이력 패턴의 변화없이 자화도가 감소하는 경향을 나타내어 자성 아가로스 비드 내에 SPIO의 회합이 감소함을 확인하였다.According to the manufacturing method disclosed in Example 1, the hysteresis characteristics of the magnetic agarose beads prepared under the condition that the weight ratio of agarose to SPIO was 0, 2, 4, 6, and 8, respectively, were measured using a vibrating sample magnetometer (Vibrating Sample Magnetometer, The measurement was performed using a PMC MicroMag 2900-2 AGM, Lake Shore Cryotronics, Inc., OH, USA), and the results are shown in FIG. 4 . As shown in FIG. 4, the magnetic agarose beads prepared in Example 1 exhibited the hysteresis characteristics of superparamagnetic iron oxide, and as the weight of the agarose for SPIO increased, the hysteresis pattern of the magnetic agarose beads did not change. As the magnetization tended to decrease, it was confirmed that the association of SPIO within the magnetic agarose beads decreased.

<실시예 2> MAB-PAA 및 MAB-PAA-NTA 제조<Example 2> Preparation of MAB-PAA and MAB-PAA-NTA

PAA를 자성 아가로스 비드 에 그라프트시킨 후, NTA를 PAA에 결합시킨 MAB (MAB-PAA-NTA)의 합성 과정 도 5의 (나)와 (다)에 나타내었고, 실시예 1의 자성 아가로스 비드 합성은 도 5의 (가) 그리고 하기 실시예 3의 MAB-PAA-NTA과 Ni 이온의 착화합물 형성은 도 5의 (다)에 나타내었다. 도 5의 (가)에 나타낸 것과 같이 실시예 1에 제시된 방법을 통해 제조된 자성 아가로스 비드 는 표면에 기공을 가지며, 그 표면과 기공에 풍부한 카르복실기를 갖도록 하기 위해서 자성 아가로스 비드의 아가로스의 주쇄에 AA를 그라프트 중합하여 브러쉬(brush) 형태의 PAA가 도입되도록 하였고, 제조된 PAA-g-MAB (MAB-PAA)의 카르복실기에 NTA를 결합시켰다. MAB-PAA-NTA의 합성은 자성 아가로스 비드 에 AA를 그라프트 중합하는 제 1단계 및 자성 아가로스 비드 -PAA의 카르복실기를 숙신이미딜에스터로 활성화시킨 후, NTA의 아민기와 아미드 커플링시키는 제 2단계 반응을 통해 수행되었다.The synthesis process of MAB (MAB-PAA-NTA) in which PAA was grafted onto magnetic agarose beads and NTA was bound to PAA is shown in (b) and (c) in FIG. 5, and the magnetic agarose of Example 1 Bead synthesis is shown in FIG. 5 (a), and the formation of a complex compound between MAB-PAA-NTA and Ni ions in Example 3 is shown in FIG. 5 (c). As shown in (a) of FIG. 5, the magnetic agarose beads prepared by the method presented in Example 1 have pores on the surface, and in order to have carboxyl groups rich in the surface and pores, the agarose of the magnetic agarose beads AA was graft-polymerized to the main chain to introduce brush-type PAA, and NTA was bonded to the carboxyl group of the prepared PAA-g-MAB (MAB-PAA). The synthesis of MAB-PAA-NTA involves the first step of graft polymerization of AA on magnetic agarose beads, activating the carboxyl group of magnetic agarose beads-PAA with succinimidyl ester, and then coupling the amine group and amide of NTA. It was carried out via a two-step reaction.

제 1 단계 (MAB-PAA 합성, MAB에 AA의 그라프트 중합)Step 1 (MAB-PAA synthesis, graft polymerization of AA to MAB)

3구 둥근 바닥 플라스크에 건조 중량 기준 0.5 g의 자성 아가로스 비드 와 100 mL의 탈이온수를 가하고 30분 동안 질소 가스로 탈기하였다. 0.1 M 질산 용액에 CAN (98.5%, cerium ammonium nitrate, Sigma-Aldrich Co., MO, USA)의 농도가 0.4 M이 되도록 CAN 용액을 제조한 후, 질소 분위기를 유지하면서 상기 반응 플라스크에 6.34 mL의 0.4 M CAN 용액을 서서히 가하였다. 10분 동안 개시 반응을 진행 한 후, 2.5 g의 AA (99.99%, Aldrich, MO, USA)을 가하고, 반응액의 온도를 30 ℃로 승온하여 4시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 후, 생성물을 자석으로 분리하고 메틸 알코올과 탈이온수로 수회 세정하였다. 생성물의 물리화학적 특성 분석을 위해 일부 시료는 동결 건조하여 준비하였다.0.5 g dry weight of magnetic agarose beads and 100 mL of deionized water were added to a three-necked round bottom flask and degassed with nitrogen gas for 30 minutes. After preparing a CAN solution such that the concentration of CAN (98.5%, cerium ammonium nitrate, Sigma-Aldrich Co., MO, USA) is 0.4 M in a 0.1 M nitric acid solution, 6.34 mL of CAN solution was added to the reaction flask while maintaining a nitrogen atmosphere. A 0.4 M CAN solution was added slowly. After the initiation reaction proceeded for 10 minutes, 2.5 g of AA (99.99%, Aldrich, MO, USA) was added, and the temperature of the reaction mixture was raised to 30 °C and reacted for 4 hours. After the reaction was over, the product was separated with a magnet and washed several times with methyl alcohol and deionized water. Some samples were prepared by freeze-drying for the analysis of physicochemical properties of the product.

제 2 단계 (MAB-PAA-NTA 합성: MAB-PAA에 NTA의 도입)Second step (MAB-PAA-NTA synthesis: introduction of NTA into MAB-PAA)

0.1 M EDC (>98%, 1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide, TCI Co, Ltd, Tokyo, Japan) 와 0.1 M NHS (>98%, N-hydroxysuccinimide, TCI Co, Ltd, Tokyo, Japan)을 포함한 수용액에 상기 1단계에서 준비한 MAB-PAA를 침지하여 MAB-PAA의 카르복실기를 활성화시켰다. 반응을 마친 활성화 MAB-PAA를 각각 탈이온수와 에틸 알코올로 수세한 후 N2 가스를 이용하여 건조하였다. NHS 활성화 MAB-PAA를 aminobutyl NTA (AB-NTA) (0.1 M, ≥97.0% (TLC), Nα,Nα-Bis(carboxymethyl)-L-lysine hydrate, Aldrich Co., MO, USA) 수용액에 침지한 후, 탈이온수로 수세하고 N2 가스를 이용하여 건조하였다.0.1 M EDC (>98%, 1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide, TCI Co, Ltd, Tokyo, Japan) and 0.1 M NHS (>98%, N-hydroxysuccinimide, TCI Co, Ltd, Tokyo, Japan) ) was immersed in the aqueous solution containing MAB-PAA prepared in step 1 to activate the carboxyl group of MAB-PAA. After completion of the reaction, the activated MAB-PAA was washed with deionized water and ethyl alcohol, respectively, and then dried using N 2 gas. NHS-activated MAB-PAA was immersed in an aqueous solution of aminobutyl NTA (AB-NTA) (0.1 M, ≥97.0% (TLC), Nα,Nα-Bis(carboxymethyl)-L-lysine hydrate, Aldrich Co., MO, USA). After that, it was washed with deionized water and dried using N 2 gas.

<실험예 4> MAB-PAA의 FT-IR 분석<Experimental Example 4> FT-IR analysis of MAB-PAA

실시예 1의 방법에 따라 제조된 자성 아가로스 비드 및 실시예 2의 방법에 따라 개시제의 농도를 달리하여 제조된 MAB-PAA의 FT-IR 분광 분석을 위해 각각의 시료를 동결 건조하였다. 동결 건조한 시료를 KBr 펠렛을 제조한 후, 4,000 ~ 400 cm-1 의 파장범위에서 각 시료의 분광 특성을 FT-IR 분광 광도계 (Nicolet 5700, Thermo Scientific, Madison, WI, USA)를 이용하여 분석하였고, 그 결과를 도 6에 나타내었다.For FT-IR spectroscopic analysis of the magnetic agarose beads prepared according to the method of Example 1 and the MAB-PAA prepared by varying the concentration of the initiator according to the method of Example 2, each sample was freeze-dried. After preparing KBr pellets from freeze-dried samples, the spectral characteristics of each sample in the wavelength range of 4,000 to 400 cm-1 were analyzed using an FT-IR spectrophotometer (Nicolet 5700, Thermo Scientific, Madison, WI, USA). , and the results are shown in FIG. 6 .

도 6에서 MAB를 제외한 MAB-PAA들은 자성 아가로스 비드 에 AA를 그래프트 중합하는 과정에서 개시제인 CAN을 아가로스의 히드록실기에 대해 10 몰%부터 100 몰%까지 변화시켜 제조한 것이다. FT-IR 분석 결과, 930 cm-1에서 나타나는 아가로스 고유의 3, 6-anhydrogalatose 특성 피크의 강도는 CAN의 농도에 관계없이 유지되었고, 1560 cm-1에서 PAA의 카르복실레이트의 C=O 스트레칭 피크의 강도는 CAN 농도에 의존적이었으며, PAA의 그라프트에 바람직한 CAN의 농도는 20 몰% ~ 60 몰%의 범위가 바람직한 것으로 분석되었다.In FIG. 6, MAB-PAAs except for MAB were prepared by varying the amount of CAN, an initiator, from 10 mol% to 100 mol% with respect to the hydroxyl group of agarose in the process of graft polymerization of AA on magnetic agarose beads. As a result of FT-IR analysis, the intensity of the 3,6-anhydrogalatose characteristic peak of agarose at 930 cm -1 was maintained regardless of the concentration of CAN, and the C=O stretching of the carboxylate of PAA at 1560 cm -1 The intensity of the peak was dependent on the CAN concentration, and it was analyzed that the range of 20 mol% to 60 mol% was preferred for the concentration of CAN for grafting of PAA.

<실시예 3> MAB-PAA-NTA와 Ni 이온의 착화합물 형성<Example 3> Complex compound formation of MAB-PAA-NTA and Ni ions

MAB-PAA-NTA의 Ni 이온에 대한 흡착능은 실시예 2에서 제조된 MAB-PAA-NTA와 30 mL의 0.1 M NiCl2 용액을 반응시켜 형성시켰고, 착화합물 형성 전후의 Ni 이온의 양을 ICP-MS (유도결합플라즈마-질량분석기, Thermo Fischer Scientific iCAP Qc, Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA, USA)로 분석하여 Ni의 착화합물 형성능을 평가하였고 그 결과를 표 1에 나타내었다.The adsorption capacity of MAB-PAA-NTA for Ni ions was determined by reacting the MAB-PAA-NTA prepared in Example 2 with 30 mL of 0.1 M NiCl 2 solution, and the amount of Ni ions before and after formation of the complex was measured by ICP-MS. (Inductively coupled plasma-mass spectrometer, Thermo Fischer Scientific iCAP Qc, Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA, USA) was analyzed to evaluate the ability of Ni to form complex compounds, and the results are shown in Table 1.

단위unit Ni 농도1) Ni concentration 1) 킬레이트 형성 전before chelation mg/Lmg/L 5,900 5,900 킬레이트 형성 후After chelate formation mg/Lmg/L 5,140 5,140 MAB-PAA-NTA의Ni 흡착능Ni adsorption capacity of MAB-PAA-NTA mg Ni/g MAB-PAA-NTAmg Ni/g MAB-PAA-NTA 97.42) 97.4 2)

1) Inductive Coupled Plasma (ICP)-MS analysis 1) Inductive Coupled Plasma (ICP)-MS analysis

2) 22.8 mg of Ni adsorbed / 0.234 g of MAB-PAA-NTA 2) 22.8 mg of Ni adsorbed / 0.234 g of MAB-PAA-NTA

<실험예 5> MAB-PAA-NTA-Ni 비드를 이용한 His6-표지 유비퀴틴의 분리<Experimental Example 5> Separation of His6-labeled ubiquitin using MAB-PAA-NTA-Ni beads

실시예 3에서 제조한 MAB-PAA-NTA-Ni 비드의 His6-표지 단백질에 대한 분리 효율을 PAA와 같은 고분자가 자성 아가로스 비드에 그라프트되지 않은 시판 제품인 Ni-NTA MAB (Ni-NTA Magnetic Agarose Beads, Qiagen, Hilden, Germany)과 비교하여 실시하였다. 재조합 인간 유비퀴틴 (N 말단 히스티틴 표지, Sigma, MO, USA)의 분리 효율 시험은 시판 제품에서 제공하는 시험 프로토콜에 따라 시험하였고, 단백질의 양은 Bradford assay로 결정하였으며, 실험 결과를 표 2에 제시하였다.The separation efficiency of the MAB-PAA-NTA-Ni beads prepared in Example 3 for His6-labeled proteins was compared with Ni-NTA MAB (Ni-NTA Magnetic Agarose Beads, Qiagen, Hilden, Germany). The separation efficiency test of recombinant human ubiquitin (N-terminal histitine label, Sigma, MO, USA) was tested according to the test protocol provided by the commercial product, and the amount of protein was determined by Bradford assay. The test results are shown in Table 2. .

실시예 3Example 3 비교예comparative example 시료sample MAB-PAA-NTA-NiMAB-PAA-NTA-Ni Ni-NTA Magnetic Agarose Beads® (Qiagen)Ni-NTA Magnetic Agarose Beads® (Qiagen) 시료 부피 (uL)Sample volume (uL) 25 25 2525 흡착 전 His6-유비퀴틴 양 (ug)Amount of His6-ubiquitin before adsorption (ug) 96.6 96.6 96.696.6 용리액의 His6-유비퀴틴 양 (ug)The amount of His6-ubiquitin in the eluent (ug) 7373 50.950.9 분리 효율 (용리액의 His6-유비퀴틴 양 (ug)/ 흡착 전 His6-유비퀴틴 양 (ug)) x 100Separation efficiency (amount of His6-ubiquitin in eluent (ug)/amount of His6-ubiquitin before adsorption (ug)) x 100 76.576.5 52.752.7

MAB-PAA-NTA-Ni의 His6-표지 유비퀴틴의 분리효율은 75.6%였고, 시판 Ni-NTA-MAB의 분리 효율이 52.7%였다. 상기 시험 결과는 MAB-PAA-NTA-Ni에서 자성 아가로스 비드의 표면과 기공에 존재하는 브러쉬형의 PAA-NTA-Ni이 His6-표지 단백질의 흡착뿐만 아니라 용리액의 이미다졸에 의한 탈착에 있어서 바람직함을 나타낸다. 이러한 경향은 MAB-PAA-NTA-Ni가 PAA 브러쉬 층을 갖지 않는 시판 제품에 비해 비드의 표면과 기공에 단백질과 배위결합을 형성할 수 있는 리간드의 수가 많아 His6 표지 단백질의 흡착에 유리하기 때문으로 생각된다.The separation efficiency of His6-labeled ubiquitin of MAB-PAA-NTA-Ni was 75.6%, and the separation efficiency of commercially available Ni-NTA-MAB was 52.7%. The above test results show that the brush-type PAA-NTA-Ni present on the surface and pores of magnetic agarose beads in MAB-PAA-NTA-Ni is preferred for adsorption of His6-labeled proteins as well as desorption by imidazole in the eluent. indicates that This tendency is because MAB-PAA-NTA-Ni has a large number of ligands that can form coordination bonds with proteins on the surface and pores of the bead compared to commercially available products that do not have a PAA brush layer, which is advantageous for adsorption of His6-labeled protein. I think.

Claims (12)

단백질 분리능을 갖는 자성 아가로스 비드로,
상기 자성 아가로스 비드는 내부에 상자성 산화철을 함유하고,
상기 자성 아가로스 비드의 표면에 그라프트된 브러쉬형 고분자와 금속이온 착화합물이 결합된 것을 특징으로 하며,
상자성 산화철은 표면이 코팅되지 않고 70 내지 800 nm의 평균입자크기를 가지며,
상기 상자성 산화철과 아가로스의 중량비는 1: 2 내지 8인, 자성 아가로스 비드. A magnetic agarose bead with protein separation ability,
The magnetic agarose beads contain paramagnetic iron oxide therein,
Characterized in that the brush-type polymer grafted on the surface of the magnetic agarose beads and the metal ion complex are combined,
Paramagnetic iron oxide has an average particle size of 70 to 800 nm without a surface coating,
The weight ratio of the paramagnetic iron oxide and agarose is 1: 2 to 8, magnetic agarose beads. 제1항에 있어서, 상기 브러쉬형 고분자는 폴리아크릴산, 폴리메타크릴산, 폴리아스팔트산, 폴리글루탐산, 폴리락트산, 히알루로닉산 및 알긴산으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 포함하는 자성 아가로스 비드. The magnetic agarose beads of claim 1, wherein the brush-type polymer includes at least one selected from the group consisting of polyacrylic acid, polymethacrylic acid, polyasphaltic acid, polyglutamic acid, polylactic acid, hyaluronic acid, and alginic acid. 제1항에 있어서, 상기 금속이온 착화합물은
이민 또는 아민 작용기를 갖는 화합물이 금속이온과 배위결합하여 형성된 것을 특징으로 하는 자성 아가로스 비드. The method of claim 1, wherein the metal ion complex compound
Magnetic agarose beads, characterized in that formed by a compound having an imine or amine functional group coordinated with a metal ion. 제3항에 있어서, 상기 금속이온과 배위결합하는 이민 또는 아민 작용기를 갖는 화합물은 N α ,N α -비스(카르복시메틸)-L-리신 하이드레이트, 1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸, 디에틸렌트리아민펜타아세트산 및 에틸렌디아민테트라아세트산으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 포함하는 자성 아가로스 비드. The method of claim 3, wherein the compound having an imine or amine functional group that coordinates with the metal ion is N α , N α -bis (carboxymethyl) -L-lysine hydrate, 1,4,7,10-tetraazacyclodo A magnetic agarose bead containing at least one selected from the group consisting of decane, diethylenetriaminepentaacetic acid and ethylenediaminetetraacetic acid. 제1항에 있어서, 상기 금속이온 착화합물은 N α ,N α -비스(카르복시메틸)-L-리신 하이드레이트와 니켈(Ni)의 착화합물인 것을 특징으로 하는 자성 아가로스 비드. The magnetic agarose beads according to claim 1, wherein the metal ion complex is a complex of N α ,N α -bis(carboxymethyl)-L-lysine hydrate and nickel (Ni). 제1항 내지 제5항 중 어느 하나의 항의 자성 아가로스 비드를 포함하는, 혼합물 중의 히스택(His-tag) 거대분자 정제용 조성물. A composition for purifying His-tag macromolecules in a mixture, comprising the magnetic agarose beads of any one of claims 1 to 5. S1) 상자성 산화철을 아가로스 유화액과 혼합하여 상자성 산화철을 함유하는 자성 아가로스 비드(MAB)를 제조하는 단계;
S2) 상기 자성 아가로스 비드와 브러쉬형 고분자 단량체를 반응시켜 브러쉬형 고분자가 그라프트된 자성 아가로스 비드를 얻는 단계;
S3) 이민 또는 아민 작용기를 갖는 화합물을 상기 S2) 단계의 브러쉬형 고분자와 결합하는 단계; 및
S4) 상기 이민 또는 아민 작용기를 갖는 화합물과 착화합물을 형성하는 금속 이온을 반응시키는 단계를 포함하며,
상기 S1) 단계는 상기 상자성 산화철과 아가로스의 중량비가 1: 2 내지 8이며,
여기서 상자성 산화철은 표면이 코팅되지 않고 70 내지 800 nm의 평균입자크기를 가지는, 금속이온 착화합물이 브러쉬형 고분자에 결합된 자성 아가로스 비드의 제조 방법. S1) preparing magnetic agarose beads (MAB) containing paramagnetic iron oxide by mixing paramagnetic iron oxide with an agarose emulsion;
S2) reacting the magnetic agarose beads with brush-type polymer monomers to obtain magnetic agarose beads grafted with brush-type polymers;
S3) combining a compound having an imine or amine functional group with the brush-type polymer of step S2); and
S4) reacting the compound having an imine or amine functional group with a metal ion forming a complex;
In step S1), the weight ratio of the paramagnetic iron oxide and agarose is 1: 2 to 8,
Here, the paramagnetic iron oxide is not coated on the surface and has an average particle size of 70 to 800 nm, a method for producing magnetic agarose beads in which a metal ion complex is bound to a brush-type polymer. 제7항에 있어서, S1) 단계의 상기 아가로스 유화액은 유화액 총 중량 대비 1 내지 8 중량%의 아가로스를 포함하는 것을 특징으로 하는 금속이온 착화합물이 브러쉬형 고분자에 결합된 자성 아가로스 비드의 제조 방법. The method of claim 7, wherein the agarose emulsion in step S1) contains 1 to 8% by weight of agarose based on the total weight of the emulsion. Preparation of magnetic agarose beads in which a metal ion complex is bound to a brush-type polymer method. 제7항에 있어서, S1) 단계는 상자성 산화철을 아가로스 유화액과 300 내지 1,000rpm의 교반속도로 22 내지 28℃의 온도에서 혼합하는 것을 특징으로 하는 금속이온 착화합물이 브러쉬형 고분자에 결합된 자성 아가로스 비드의 제조 방법. The method of claim 7, wherein step S1) is a magnetic agarose in which a metal ion complex compound is bonded to a brush-type polymer, characterized in that the paramagnetic iron oxide is mixed with the agarose emulsion at a temperature of 22 to 28 ° C at a stirring speed of 300 to 1,000 rpm. How to make loinbeads. 제7항에 있어서, S2) 단계의 상기 자성 아가로스 비드와 반응시키는 브러쉬형 고분자의 단량체는 자성 아가로스 비드의 히드록실기에 대하여 10 내지 100 몰%의 비율로 반응시키는 것을 특징으로 하는 금속이온 착화합물이 브러쉬형 고분자에 결합된 자성 아가로스 비드의 제조 방법.The metal ion according to claim 7, wherein the monomer of the brush-type polymer reacted with the magnetic agarose beads in step S2) is reacted in an amount of 10 to 100 mol% with respect to the hydroxyl group of the magnetic agarose beads. Method for producing magnetic agarose beads in which a complex compound is bound to a brush-type polymer. 제7항에 있어서, S4) 단계의 금속이온은 니켈(Ni), 코발트 (Co), 철 (Fe) 및 구리 (Cu)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 금속의 이온을 포함하는 금속이온 착화합물이 브러쉬형 고분자에 결합된 자성 아가로스 비드의 제조 방법.The method of claim 7, wherein the metal ion in step S4) is a metal ion complex compound containing at least one metal ion selected from the group consisting of nickel (Ni), cobalt (Co), iron (Fe), and copper (Cu). Method for producing magnetic agarose beads coupled to brush-type polymers. 히스택(His-tag) 거대분자의 정제 방법에 있어서,
제7항 내지 제11항 중 어느 하나의 제조방법으로 제조된, 금속이온 착화합물이 브러쉬형 고분자에 결합된 자성 아가로스 비드를 제공하는 단계;
혼합물 중의 히스택(His-tag)된 거대분자를 상기 자성 아가로스 비드와 결합시켜 히스택(His-tag) 거대분자-자성 아가로스 비드 복합체를 제조하는 단계; 및
상기 히스택(His-tag) 거대분자-자성 아가로스 비드 복합체를 외부 자장으로 혼합물에서 정제하는 단계를 포함하며,
상기 자성 아가로스 비드는 상자성 산화철과 아가로스의 중량비가 1: 2 내지 8이고,
여기서 상자성 산화철은 표면이 코팅되지 않고 70 내지 800 nm의 평균입자크기를 가지는, 히스택(His-tag) 거대분자의 정제 방법.In the purification method of His-tag macromolecules,
Providing a magnetic agarose bead in which a metal ion complex is bound to a brush-type polymer, prepared by the method of any one of claims 7 to 11;
preparing a His-tag macromolecule-magnetic agarose bead complex by combining His-tagged macromolecules in the mixture with the magnetic agarose beads; and
Purifying the His-tag macromolecular-magnetic agarose bead complex from the mixture with an external magnetic field,
The magnetic agarose beads have a weight ratio of paramagnetic iron oxide and agarose of 1: 2 to 8,
Here, the paramagnetic iron oxide has an average particle size of 70 to 800 nm without surface coating, His-tag macromolecule purification method.
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