KR102475101B1

KR102475101B1 - 다양한 미생물 및 항생제 내성균에 항생 효과를 갖는 항생 펩타이드

Info

Publication number: KR102475101B1
Application number: KR1020200107779A
Authority: KR
Inventors: 김찬길; 김철근; 김경민; 변규태; 원형식; 이승현; 김보람
Original assignee: 주식회사 씨쥐케이바이오파마엘티디
Priority date: 2020-08-26
Filing date: 2020-08-26
Publication date: 2022-12-07
Also published as: KR20220026803A

Abstract

본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드 및 상기 펩타이드의 말단에 공유결합으로 연결된 세포 투과 펩타이드를 포함하는 항생 펩타이드에 관한 것으로, 상기 항생 펩타이드는 적혈구 용혈 현상을 유발하지 않고, 정상 세포에는 정상 세포에는 독성이 낮으면서 다양한 병원성 미생물 및 항생제 내성균에 대한 항생 활성이 우수하다.

Description

다양한 미생물 및 항생제 내성균에 항생 효과를 갖는 항생 펩타이드{ANTIBIOTIC PEPTIDE WITH ANTIBIOTIC EFFECT ON VARIOUS MICROORGANISMS AND ANTIBIOTICS RESISTANT BACTERIA}

본 발명은 다양한 미생물 및 항생제 내성균에 우수한 항생 효과를 나타내는 항생 펩타이드에 관한 것이다.

영국 정부가 2016년 발표한 항생제 내성균 (AMR: antimicrobial resistance) 보고서에 따르면 현재 전 세계적으로 70만 명 이상, 유럽과 미국에서 5만 명 이상이 항생제 내성균의 감염에 의해 숨지고 있으며, 인류가 특별한 조치를 취하지 않으면 2050년에는 약 1000만 명 이상의 사망자와 이에 따라 100조 달러 이상의 손실이 발생할 것이라고 예측된다(비특허문헌 1).

이처럼 항생제 내성균에 의한 감염은 인류를 위협하는 가장 무서운 질환이지만 이를 치료하기 위한 새로운 항생제 개발은 상대적으로 뒤쳐져 있어서 자칫 항생제가 없었던 시절로 돌아갈지도 모른다는 우려가 커지고 있다. 항생제 내성균 감염의 또 다른 문제는 새로운 항생제가 개발되어도 이에 대한 내성균이 몇 년 안에 발생한다는 사실이다. 이러한 사실은 지금과 같은 항생제 대신 내성을 유발하지 않는 새로운 기전의 항생제 개발이 필요하다는 것을 시사한다. 이러한 전략의 하나로 제안되는 것이 바로 항생 펩타이드를 이용한 치료제이다.

다양한 항생 펩타이드는 미생물의 막을 파괴하거나 그 안으로 침투하여 세포 대사에 중요한 기작들을 억제하는 등의 방법으로 항생 효과를 나타내는 것으로 알려져 있다. 대표적인 항생 펩타이드에는 부포린(buforin), 디펜신 (defensing), 머게이닌(magainin) 등이 있으며, 머게이닌은 항균 활성뿐만 아니라 폐암세포에서 항암 효과를 나타낸다고 알려져 있다 (비특허문헌 2).

이러한 상황에서 본 발명자들은 전사인자 CP2c 유래 펩타이드가 항암 활성(특허문헌 1 및 2)뿐만 아니라 항생 활성이 있는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

1. 대한민국 공개특허 제10-2016-0117198호 2. 대한민국 공개특허 제10-2018-0024581호

1. 항생제 내성 극복을 위한 항독성제 연구 개발 동향 - KHIDI 전문가 리포트 | 2017-5 2. Park, C.B. et al., Biochem. Biophys. Res.Comm., 218, pp408-413, 1996

본 발명의 목적은 다양한 미생물과 항생제 내성균에 대해 항생 활성을 나타내는 항생 펩타이드를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 양상은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드; 및 상기 펩타이드의 일 말단에 공유결합으로 연결된 세포 투과 펩타이드;를 포함하는 항생 펩타이드를 제공한다.

본 명세서에 사용된 용어, "항생 펩타이드(antibiotic peptides)"는 10개 내지 50개의 아미노산으로 구성된 항균 활성을 갖는 작은 크기의 펩타이드로 세포막에 구멍을 내서 막전위를 소실시키거나, 세포막을 투과한 후 세포내 타겟에 작용하여 세균을 사멸시키는 것으로 알려져 있다.

본 발명에서, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열(NYPQRP)을 포함하는 펩타이드는 다양한 암에서 발현되는 전사인자인 CP2c를 표적하는 펩타이드로 암의 증식과 생장을 억제하는 것으로 알려져 있다(특허문헌 1 및 2). 그러나 상기 펩타이드의 항생, 항균 활성과 관련된 효과는 아직까지 알려진 것이 없다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드(K1)는 자체로는 항생 활성을 나타내지 않으나, iRGD 또는 dNP2와 같은 세포 투과 펩타이드와 결합되면 우수한 항생 활성을 나타낸다.

본 발명에서, 상기 공유결합은 펩타이드 결합(peptide bond), 아마이드 결합(amide bond), 카보닐 결합(carbonyl bond), 에스터 결합(ester bond), 황화 에스터 결합(thioester bond) 및 설폰 아마이드 결합(sulfonamide bond)으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으며, 예를 들어 펩타이드 결합일 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 항생 펩타이드는 그람 양성균, 그람 음성균 및/또는 항생제 내성균에 항생 활성을 나타낸다.

본 발명에서, 상기 그람 양성균은 당업계에 공지된 모든 그람 양성균인 것이 바람직하며, 예를 들어 포도상구균 속(Staphylococcus), 리스테리아 속 (Listeria), 코리네박테리움 속(Corynebacterium) 등을 포함할 수 있다. 구체적으로 황색포도상구균(Staphylococcus aureus) 또는 표피포도상구균 (Staphylococcus epidermidis)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 그람 음성균은 당업계에 공지된 모든 그람 음성균인 것이 바람직하며, 예를 들어 대장균 속(Escherichia), 슈도모나스 속(Pseudomonas), 아시네토박터 속(Acinetobacter), 살모넬라 속(Salmonella) 등을 포함할 수 있다. 구체적으로 대장균(Escherichia coli) 또는 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 항생제 내성균은 메티실린 내성 황색포도상구균(methicillin-resistant Staphylococcus aureus, MRSA), 다제내성 녹농균(multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa, MDRPA), 반코마이신 내성 장내 구균(vancomycin-resistant Enterococcus faecium, VREF), 반코마이신 내성 황색포도상구균 (Vancomycin-resistant S.aureus, VRSA), 다제내성 부동간균(Multidrug-resistant Acinetobacter baumanni, MRAB) 및 카바페넴 내성 장내 세균속균종 (Carbapenem-resistant Enterobactericeae, CRE)으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 명세서에 사용된 용어, "세포 투과 펩타이드(cell penetrating peptide, CPP)"는 펩타이드에 연결된 운반 대상을 세포 내로 전달할 수 있는 펩타이드를 의미하며, 세포 투과 도메인, 세포 침투 펩타이드, 세포 침투 도메인 등의 용어와 상호 혼용될 수 있다. 상기 운반 대상에는 펩타이드, 핵산, 화합물, 탄수화물, 지질 등이 사용될 수 있으며, 본 발명에서는 서열번호 1의 펩타이드를 사용하였다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 세포 투과 펩타이드는 iRGD (서열번호 2; CRGDKGPDC), dNP2 (서열번호 4; KIKKVKKKGRKGSKIKKVKKKGRK), TAT (서열번호 6; YGRKKRRQRRR), VP22 (서열번호 7; DAATATRGRSAASRPTERPRAPARSASRPRRPVE), HIV-TAT (서열번호 8; GRKKRRQRRRPQ), MPG (서열번호 9; Ac-GALFLGFLGAAGSTMGAWSQPKKKRKV-cya), PEP-1 (서열번호 10; Ac-KETWWETWWTEWSQPKKKRKC-cya), EB1 (서열번호 11; LIKLWSHLIHIWFQNRRLKWKKK), transportan (서열번호 12; GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL), p-Antp (서열번호 13; RQIKIWFQNRRMKWKK), hCT(18-32)(서열번호 14; KFHTFPQTAIGVGAP-NH₂), KLA (서열번호 15; KLALKLALKALKAALKLA) 및 올리고아르기닌 (서열번호 16; RRRRRRRR)으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으며, 구체적으로는 iRGD 또는 dNP2가 사용될 수 있다. MPG 및 PEP-1에서 cya는 시스테인산 (cysteic acid)을 의미한다.

본 발명에서, 상기 세포 투과 펩타이드는 서열번호 1의 아미노산 서열(NYPQRP)을 포함하는 펩타이드의 N-말단 또는 C-말단에 연결될 수 있다.

예를 들어, 세포 투과 펩타이드로 iRGD를 사용하면 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열의 C-말단에 연결할 수 있으며, 이 경우 iRGD 서열 내에 존재하는 2개의 시스테인을 연결하여 필요에 따라 원형화(cyclization) 시킬 수 있다.

또한, 세포 투과 펩타이드로 dNP2를 사용하면 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열의 N-말단 또는 C-말단에 연결할 수 있다. 본 발명에서는 기존의 연구 결과 N-말단에 연결하는 것이 항생 효과가 우수한 것을 확인하였으므로 dNP2를 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열의 N-말단에 연결하였다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 항생 펩타이드는 당업계에 알려진 방법에 따라 N-말단 및/또는 C-말단이 수식, 변형될 수 있으며, 예를 들어 N-말단 아세틸화 및/또는 C-말단 아미드화와 같은 변형이 이루어질 수 있다. 펩타이드 말단의 수식/변형에 의해 펩타이드의 분해를 억제할 수 있고, 생체내 지속 시간을 증가시킬 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 항생 펩타이드는 서열번호 3 또는 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

본 발명의 다른 양상은 상기 항생 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 항생용 조성물을 제공한다.

상기 항생 펩타이드는 항생 활성은 우수하면서 정상 세포에 대한 독성은 낮고, 용혈 현상 또한 유발하지 않으므로 항생제와 같은 항생용 조성물의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명의 항생 펩타이드는 임상 투여시 비경구로 투여가 가능하며 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다. 비경구 투여는 직장, 정맥, 복막, 근육, 동맥, 경피, 비강(nasal), 흡입, 안구 및 피하와 같은 경구 이외의 경로를 통한 투여를 의미할 수 있다. 본 발명의 항생 펩타이드를 의약품으로 사용하는 경우, 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 추가로 함유할 수 있다.

즉, 본 발명의 항생 펩타이드는 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수용성제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수용성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 리우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

또한, 본 발명의 항생 펩타이드는 생리식염수 또는 유기용매와 같이 약제로 허용된 여러 전달체(carrier)와 혼합되어 사용될 수 있고, 안정성이나 흡수성을 증가시키기 위하여 글루코스, 수크로스 또는 덱스트란과 같은 카보하이드레이트, 아스코르브산(ascorbic acid) 또는 글루타치온과 같은 항산화제(antioxidants), 킬레이트화제(chelating agents), 저분자 단백질 또는 다른 안정화제(stabilizers)들이 약제로 사용될 수 있다.

본 발명의 항생 펩타이드는 볼루스(bolus) 형태 혹은 상대적으로 짧은 기간 동안 주입(infusion) 등에 의해 단일 투여(single dose)로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여(multiple dose)에 의해 장기간 투여될 수 있다. 상기 투여 형태, 기간은 약의 투여 경로 및 치료 횟수뿐만 아니라 환자의 나이 및 건강상태 등 다양한 요인들을 고려하여 결정되는 것이므로 이러한 점을 고려할 때, 이 분야의 통상적인 지식을 가진 자라면 본 발명의 항생 펩타이드의 적절한 유효 투여량을 결정할 수 있을 것이다.

본 발명의 항생용 조성물은 항생제, 항균제와 같은 약학적 조성물의 제조에 사용될 수 있다.

본 발명의 또 다른 양상은 상기 항생 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 항생용 식품 첨가제를 제공한다.

상기 항생 펩타이드는 항생 활성은 우수하면서 정상 세포에 대한 독성은 낮고, 용혈 현상 또한 유발하지 않으므로 항생용 식품 첨가제의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명의 항생 펩타이드를 식품 첨가물로 사용하는 경우, 상기 항생 펩타이드를 그대로 첨가하거나 다른 식품 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 유효성분의 혼합양은 그의 사용 목적에 따라 적절하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 항생 펩타이드는 원료에 대하여 15 중량부 이하, 바람직하게는 10 중량부 이하의 양으로 첨가된다. 그러나 장기간 섭취의 경우에 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안정성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.

상기 식품의 종류는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소시지, 빵, 초코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 식품을 모두 포함한다.

또한, 본 발명은 상기 항생 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 항생용 화장료 조성물을 제공한다.

상기 항생 펩타이드는 항생 활성은 우수하면서 정상 세포에 대한 독성은 낮고, 용혈 현상 또한 유발하지 않으며, 세포 투과 펩타이드를 포함하여 세포막 투과가 용이하므로 항생용 화장료 조성물의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 상기 항생 펩타이드 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들이 포함되며, 예켠대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함한다.

본 발명의 화장료 조성물에 있어서, 통상적으로 함유되는 화장료 조성물에 본 발명의 펩타이드는 0.1 내지 50중량%, 바람직하게는 1 내지 10 중량%의 양으로 첨가될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수(스킨), 영양 화장수(밀크로션), 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이크림, 클렌징 크림, 클렌징 포옴, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명의 다른 양상은 상기 항생 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 항생용 의약외품 조성물을 제공한다.

본 명세서에 사용된 용어, "의약외품 조성물"은 사람이나 동물의 질병을 치료, 경감, 처치 또는 예방할 목적으로 사용되는 섬유, 고무제품 또는 이와 유사한 것, 인체에 대한 작용이 약하거나 인체에 직접 작용하지 않으며, 기구 또는 기계가 아닌 것과 이와 유사한 것, 감염 예방을 위하여 살균, 살충 및 이와 유사한 용도로 사용되는 제제 중 하나에 해당하는 물품을 말한다. 사람이나 동물의 질병을 진단, 치료, 경감, 처치 또는 예방할 목적으로 사용하는 물품 중 기구, 기계 또는 장치가 아닌 것 및 사람이나 동물의 구조와 기능에 약리학적 영향을 줄 목적으로 사용하는 물품 중 기구, 기계 또는 장치가 아닌 것을 제외한 물품을 의미하며, 구체적으로 피부 외용제 또는 개인위생 용품일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 의약외품 조성물은 항균 효과를 나타낼 수 있다면 항생 펩타이드를 다양한 중량%로 포함할 수 있으며, 바람직하게는 0.00001 내지 10 중량%로 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명은 또한, 상기 항생 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 항균용 사료 첨가제를 제공한다.

상기 사료첨가제는 항생 펩타이드를 포함하고 있는 사료 첨가제로, 가축에게 급여함으로써 병원성 세균에 의한 감염성 질환을 예방 또는 개선하는 것을 특징으로 한다. 상기 사료 첨가제는 발효사료, 배합사료, 펠렛 형태 및 사일레지 등의 형태로 제조될 수 있다.

본 발명의 일 예에 따른 항생 펩타이드는 적혈구 용혈 현상을 유발하지 않고, 정상 세포에는 독성이 낮으면서 다양한 병원성 미생물 및 항생제 내성균에 대한 항생 활성이 우수하다.

도 1은 대장균과 다양한 종류의 펩타이드(K1, C1-4, K36-5, K2 및 K36)를 반응시킨 후 생장 저해 정도를 확인한 결과이다.
도 2는 병원성 미생물 및 항생제 내성 미생물과 다양한 종류의 펩타이드를 반응시킨 후 최소 생장 저해 농도(MIC)를 확인한 결과이다.
도 3은 K2-FITC 펩타이드와 황색포도상구균(S.aureus)을 반응시킨 후 펩타이드 농도, 반응 시간에 따른 펩타이드의 세포 침투 정도를 확인한 결과이다.
도 4는 K2-10(K2+FITC) 펩타이드와 대장균(E.coli)을 반응시킨 후 펩타이드 농도, 반응 시간에 따른 펩타이드의 세포 침투 정도를 확인한 결과이다.
도 5는 K36 펩타이드가 황색포도상구균(S.aureus) 세포막의 탈분극을 유도하는지 여부를 확인한 결과이다.
도 6은 K36 또는 K2 펩타이드와 중국 햄스터 난소 세포(A 및 B) 및 효모인 피치아 파스토리스(C)를 반응시킨 후 생장 저해 정도를 확인한 결과이다.
도 7은 K2 및 K36 펩타이드와 적혈구를 반응시킨 후 적혈구의 용혈 정도를 확인한 결과이다.

이하 하나 이상의 구체예를 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

제조예 1: 항생 펩타이드 제작

하기 5종의 펩타이드를 애니젠(대한민국)에 의뢰하여 합성하였다.

K1: Ac-NYPQRP-NH2 (서열번호 1: NYPQRP)

C1-4: Ac-CRGDKGPDC-NH2 (iRGD) (서열번호 2: CRGDKGPDC)

K2: Ac-NYPQRPCRGDKGPDC-NH2 (K1+iRGD) (서열번호 3: NYPQRPCRGDKGPDC)

K36-5: KIKKVKKKGRKGSKIKKVKKKGRK (dNP2) (서열번호 4)

K36: Ac-KIKKVKKKGRKGSKIKKVKKKGRKGGNYPQRP-NH2 (K1+dNP2) (서열번호 5: KIKKVKKKGRKGSKIKKVKKKGRKGGNYPQRP)

상기 펩타이드에서 iRGD, dNP2는 세포 투과 펩타이드이고, Ac는 N-말단이 아세틸화된 펩타이드(acetylated peptide), NH2는 C-말단이 아미드화된 펩타이드 (amidated peptide)를 의미한다. 펩타이드의 일 말단을 수식한 것은 N-, C-term protease에 의한 펩타이드 분해를 억제하고, 본 항생 펩타이드의 자연적 특성을 최대한 살리기 위함이다.

실험예 1: 각 펩타이드의 항생 효과 확인

하기 4종의 병원균 및 3종의 항생제 내성균을 준비하였다.

- 대장균(Escherichia coli, 이하 E. coli로 기재함; 한국생명공학연구원 생물자원센터에서 분양 받음, #KCTC1682)

- 황색포도상구균(Staphylococcus aureus, 이하 S. aureus로 기재함; 한국생명공학연구원 생물자원센터에서 분양 받음, #KCTC1621)

- 녹농균(Pseudomonas aeruginosa, 이하 P. aeruginosa로 기재함; 한국생명공학연구원 생물자원센터에서 분양 받음, #KCTC 1637)

- 표피포도상구균(Staphylococcus epidermidis, 이하 S. epidermidis로 기재함; 한국생명공학연구원 생물자원센터에서 분양 받음, #KCTC 1917)

- 메티실린 내성 황색포도상구균(methicillin-resistant S. aureus, 이하 MRSA로 기재함; 서울여자대학교에서 제공 받음, #CCARM 3089)

- 다제내성 녹농균(multidrug-resistant P. aeruginosa, 이하 MDRPA로 기재함; ATCC (American Type Culture Collection, 미국)에서 구입, #CCARM 2095)

- 반코마이신 내성 장내 구균(vancomycin-resistant Enterococcus faecium, 이하 VREF로 기재함; ATCC에서 구입, #ATCC 51559)

96웰 폴리스티렌 플레이트에 상기 7종의 미생물 각각을 1% 펩톤으로 2x10⁶ CFU/㎖ 농도로 희석하여 분주하고, 상기 제조예 1의 각 펩타이드를 시작 농도 100 μM에서 1/2씩 1% 펩톤으로 희석하여 첨가하였다. 96웰 폴리스티렌 플레이트를 교반 배양기(shaking incubater)에서 200 rpm, 37℃ 조건에서 18시간 내지 24시간 동안 배양하였다. 이후 육안으로 관찰하거나 또는 OD₆₀₀에서 흡광도를 측정하여 미생물의 생장이 억제되는 최소 농도(minimal inhibitory concentration, MIC)를 확인하였다. 양성 대조군으로는 멜리틴(melittin; Sigma-Alrich, 미국, Cat#M2272) 및 암피실린(ampicillin)을 사용하였다.

그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이 E. coli는 멜리틴, 암피실린, K2 및 K36 펩타이드에 의해 생장이 억제되는 것을 알 수 있었다. 또한, 도 2의 표에 개시된 바와 같이 K1 펩타이드, K36-5 펩타이드는 항생 효과를 전혀 나타내지 않았고, K36 펩타이드 및 멜리틴의 항생 효과가 현저히 우수한 것을 확인할 수 있었다. 특히 K36 펩타이드는 항생제 내성균에 대해서도 우수한 항생 효과를 나타내었다.

실험예 2: K2 펩타이드의 세포내 침투 여부 확인- S. aureus

S. aureus의 콜로니 하나를 96웰 플레이트에서 OD₆₀₀ 값이 0.4 내지 0.5가 될 때까지 배양한 후 배양액의 OD₆₀₀ 값이 0.05 내지 0.1이 되도록 신선한 LB로 희석하였다. 희석한 배양액을 K2-FITC (10 또는 20 μM)와 37℃에서 3시간 또는 6시간 동안 반응시키고, PDL(poly d-lysine)이 코팅된 유리바닥 접시 (glass bottom dish)에 배양액을 올려 37℃에서 30분 동안 S. aureus의 부착을 유도하였다. PBS로 접시를 3회 세척하고, 4% 파라포름알데히드로 실온에서 15분 동안 S. aureus를 고정시킨 후 DAPI 염색을 수행하였다. 이후 샘플을 마운팅하여 커버슬립을 올리고, 공초점 현미경(NIKON A1; NIKON, 일본)으로 이미지를 촬영하였다.

그 결과, 도 3에 개시된 바와 같이 K2-FITC 펩타이드가 그람 양성균인 S. aureus에 대해 농도 및 시간 의존적으로 항생 활성을 나타내고, 형광을 통해 K2 펩타이드가 세포 내로 침투하여 항생 활성을 나타낸다는 것을 확인할 수 있었다.

실험예 3: K2 펩타이드의 세포내 침투 여부 확인- E. coli

실험 전날 밤 E. coli를 배지에 접종하여 200 rpm, 37℃ 조건에서 밤새 배양하였다. 다음날 배양액의 OD₆₀₀ 값이 0.25가 되도록 희석하여 튜브로 옮기고 3분 동안 원심분리(4000 rpm, 4℃)하여 E. coli를 회수하였다. 회수한 E. coli와 PBS 3 ㎖을 섞어서 라운드 튜브에 1 ㎖씩 분주하고, 실험 조건에 따라 K2-10 펩타이드(K2 펩타이드에 FITC 형광이 결합된 펩타이드)를 0, 5 및 10 μM 농도로 첨가하여 200 rpm, 37℃ 조건에서 1시간 동안 반응시켰다. 양성 대조군으로는 트리톤 X-100(Triton X-100)을 사용하였다. 이후 라운드 튜브의 내용물을 에펜도르프 튜브로 옮기고 3분 동안 원심분리(4000 rpm, 4℃)하여 E. coli를 회수하였다. 회수한 E. coli에 PBS 1 ㎖를 첨가하여 세척 및 원심분리하는 과정을 3회 수행하였다. 이후 E.coli를 PBS 1 ㎖에 현탁시켜 FACS를 진행하였다.

실험 결과, 도 4에 개시된 바와 같이 K2-10 펩타이드 처리 농도가 증가할수록 FITC 세기가 증가하는 것을 확인하여 K2 펩타이드가 세포 내로 침투하여 항생 활성을 나타낸다는 것을 알 수 있었다.

실험예 4: K36 펩타이드의 막 분극화 확인

S. aureus를 배지에 접종하여 OD₆₀₀ 값이 0.4(중간 대수기(mid-log phase))가 되도록 37℃에서 교반하면서 배양하여 원심분리로 회수하였다. 회수한 S. aureus를 세척 버퍼(20 mM 글루코스 및 5 mM 히피스(HEPES), pH 7.4)로 2회 세척하고, OD₆₀₀ 값이 0.05가 되도록 세척 버퍼로 희석하였다. 희석한 S. aureus 현탁액을 안정적인 형광 수치가 나올 때까지 막 전위-민감성 염료인 DiSC3(5) (여기 파장 622 ㎚, 발광 파장 670 ㎚) 20 nM과 반응시켰다. 반응에서 안정적인 형광 수치가 나온다는 것은 상기 DiSC3(5) 염료가 박테리아 막에 완전히 삽입된 것을 의미한다. 이후 K36 펩타이드를 상이한 농도로 첨가하고, DiSC3(5)에서 여기되는 형광 강도의 변화를 측정하여 막 분극화(membrane depolarization)를 관찰하였다.

그 결과, 도 5에 개시된 바와 같이 막의 탈분극을 유도하는 멜리틴과 달리 K36 펩타이드는 그람 양성균인 S. aureus에서 탈분극을 유도하지 않는 것을 알 수 있었다. 이 결과는 박테리아의 세포막을 표적하는 일반적인 항생 펩타이드와 다르게 K36 펩타이드는 다른 기작으로 항생 활성을 나타낸다는 것을 의미한다.

실험예 5: 정상 세포에 대한 K2 및 K36 펩타이드의 활성 확인

5-1. 중국 햄스터 난소 세포 (Chinese Hanster Ovary cell, CHO cell)

96웰 폴리스티렌 플레이트에 ExpiCHO 배지로 희석한 K36 펩타이드(시작 농도 100 μM)를 분주하고, CHO-S 세포(Invitrogen, 미국, ExpiCHO-S, Cat#A29127)를 각 웰에 3x10⁶ 세포/㎖ 농도로 분주하였다. 상기 CHO-S 세포를 교반 배양기에서 120 rpm, 37℃ 및 8% CO₂ 조건에서 24시간 동안 배양하였다. 이후 각 웰에 CCK-8 용액을 10 ㎕씩 첨가하고, OD450에서 흡광도를 측정하여 생장 저해 정도를 확인하였다.

확인 결과, 도 6의 A 및 B에 개시된 바와 같이 K36 펩타이드는 정상 세포인 CHO-S 세포의 생장은 억제하지 않는 것을 알 수 있었다.

5-2. 효모 피치아 파스토리스( Pichia pastoris )

96웰 폴리스티렌 플레이트에 1% 펩톤으로 희석한 K2 펩타이드(시작 농도 100 μM)를 분주하고, 중간 대수기로 배양한 피치아 파스토리스 2종(KM71 및 GS115)을 첨가하였다. 상기 피치아 파스토리스를 교반 배양기에서 200 rpm, 30℃ 조건에서 24시간 동안 배양하였다. 육안으로 관찰하거나 또는 OD600에서 흡광도를 측정하여 생장 저해 정도를 확인하였다.

확인 결과, 도 6의 C에 개시된 바와 같이 K2는 정상 세포인 피치아 파스토리스의 생장은 억제하지 않는 것을 알 수 있었다.

실험예 6: K2 및 K36 펩타이드의 용혈 여부 확인

임의의 공여자로부터 혈액 25 ㎖을 채휘하여 500xg에서 5분 동안 원심분리하고, 튜브에 적혈구용적(hematocrit; 적색, 저층) 및 혈장(plasma; 노란색, 상층) 부피를 표시하였다. 마이크로파이펫으로 혈장을 조심스럽게 제거하고, 원래의 혈장 부피만큼 150 mM 염화나트륨 용액을 첨가하였다. 튜브의 뚜껑을 닫은 후 수회 뒤집어서 적혈구와 염화나트륨 용액을 혼합하고 500xg에서 5분 동안 원심분리하였다. 상층액을 제거하고, 다시 염화나트륨 용액을 첨가하여 원심분리하는 과정을 반복하여 적혈구를 세척하였다. 세척이 끝나면 적혈구를 실험할 펩타이드 농도에 따라 여러 개의 튜브에 분주하였다. 각 튜브를 500xg에서 5분 동안 원심분리하고, 전체 부피를 튜브에 표시한 후 상층액을 제거하였다. 제거한 상층액의 부피만큼 버퍼를 첨가하였다. 50 ㎖ 튜브에 PBS 49 ㎖, 상기 적혈구 1 ㎖을 넣어 적혈구를 1/50으로 희석하였다.

V자 바닥의 96웰 플레이트에 희석한 적혈구 190 ㎕, PBS에 희석한 K2 또는 K36 펩타이드 10 ㎕를 분주하여 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 이후 플레이트를 500xg에서 5분 동안 원심분리하고, 상층액 100 ㎕를 다른 96웰 플레이트로 옮겼다. 플레이트 리더기(plate reader)로 파장 400 내지 541 ㎚에서 상층액의 흡광도를 측정하였다.

측정 결과, 도 7에 개시된 바와 같이 적혈구를 용혈시키는 트리톤 X-100과 달리 K2 및 K36 펩타이드는 적혈구를 용혈시키지 않는 것을 확인할 수 있었다. 이 결과는 K2 및 K36 펩타이드가 세포독성을 띄지 않는 안전한 물질이라는 것을 의미한다.

<110> Konkuk University Glocal Industry-Academic Collaboration Foundation Industry-University Cooperation Foundation Hanyang University <120> ANTIBIOTIC PEPTIDE WITH ANTIBIOTIC EFFECT ON VARIOUS MICROORGANISMS AND ANTIBIOTICS RESISTANT BACTERIA <130> P20U10C1471 <160> 16 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> antibiotic peptide K1 <400> 1 Asn Tyr Pro Gln Arg Pro 1 5 <210> 2 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CPP_iRGD <400> 2 Cys Arg Gly Asp Lys Gly Pro Asp Cys 1 5 <210> 3 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> K1+iRGD <400> 3 Asn Tyr Pro Gln Arg Pro Cys Arg Gly Asp Lys Gly Pro Asp Cys 1 5 10 15 <210> 4 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CPP_dNP2 <400> 4 Lys Ile Lys Lys Val Lys Lys Lys Gly Arg Lys Gly Ser Lys Ile Lys 1 5 10 15 Lys Val Lys Lys Lys Gly Arg Lys 20 <210> 5 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> K1+dNP2 <400> 5 Lys Ile Lys Lys Val Lys Lys Lys Gly Arg Lys Gly Ser Lys Ile Lys 1 5 10 15 Lys Val Lys Lys Lys Gly Arg Lys Gly Gly Asn Tyr Pro Gln Arg Pro 20 25 30 <210> 6 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CPP_TAT <400> 6 Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg 1 5 10 <210> 7 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CPP_VP22 <400> 7 Asp Ala Ala Thr Ala Thr Arg Gly Arg Ser Ala Ala Ser Arg Pro Thr 1 5 10 15 Glu Arg Pro Arg Ala Pro Ala Arg Ser Ala Ser Arg Pro Arg Arg Pro 20 25 30 Val Glu <210> 8 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CPP_HIV-TAT <400> 8 Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Gln 1 5 10 <210> 9 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CPP_MPG <400> 9 Gly Ala Leu Phe Leu Gly Phe Leu Gly Ala Ala Gly Ser Thr Met Gly 1 5 10 15 Ala Trp Ser Gln Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val 20 25 <210> 10 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CPP_PEP-1 <400> 10 Lys Glu Thr Trp Trp Glu Thr Trp Trp Thr Glu Trp Ser Gln Pro Lys 1 5 10 15 Lys Lys Arg Lys Cys 20 <210> 11 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CPP_EB1 <400> 11 Leu Ile Lys Leu Trp Ser His Leu Ile His Ile Trp Phe Gln Asn Arg 1 5 10 15 Arg Leu Lys Trp Lys Lys Lys 20 <210> 12 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CPP_transportan <400> 12 Gly Trp Thr Leu Asn Ser Ala Gly Tyr Leu Leu Gly Lys Ile Asn Leu 1 5 10 15 Lys Ala Leu Ala Ala Leu Ala Lys Lys Ile Leu 20 25 <210> 13 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CPP_p-Antp <400> 13 Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys 1 5 10 15 <210> 14 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CPP_hCT(18-32) <400> 14 Lys Phe His Thr Phe Pro Gln Thr Ala Ile Gly Val Gly Ala Pro 1 5 10 15 <210> 15 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CPP_KLA <400> 15 Lys Leu Ala Leu Lys Leu Ala Leu Lys Ala Leu Lys Ala Ala Leu Lys 1 5 10 15 Leu Ala <210> 16 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CPP_Oligoarginine <400> 16 Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg 1 5

Claims

하기로 이루어진 항생 펩타이드를 포함하는 항생용 조성물:
서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드; 및
상기 펩타이드의 일 말단에 링커로 연결되고, 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 세포 투과 펩타이드.
제1항에 있어서, 항생 펩타이드는 그람 양성균, 그람 음성균 또는 항생제 내성균에 항생 활성을 나타내는 것인, 항생용 조성물.
제2항에 있어서, 상기 그람 양성균은 황색포도상구균(Staphylococcus aureus) 또는 표피포도상구균(Staphylococcus epidermidis)인 것인, 항생용 조성물.
제2항에 있어서, 상기 그람 음성균은 대장균(Escherichia coli) 또는 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)인 것인, 항생용 조성물.
제2항에 있어서, 상기 항생제 내성균은 메티실린 내성 황색포도상구균 (methicillin-resistant Staphylococcus aureus), 다제내성 녹농균(multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa), 반코마이신 내성 장내 구균(vancomycin-resistant Enterococcus faecium), 반코마이신 내성 황색포도상구균 (Vancomycin-resistant S. aureus), 다제내성 부동간균(Multidrug-resistant Acinetobacter baumanni) 및 카바페넴 내성 장내 세균속균종(Carbapenem-resistant Enterobactericeae)으로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 항생용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 링커는 아미노산 서열 GG인 것인, 항생용 조성물.
삭제
하기로 이루어진 항생 펩타이드를 포함하는 항생용 식품 첨가제:
서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드; 및
상기 펩타이드의 일 말단에 링커로 연결되고, 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 세포 투과 펩타이드.
하기로 이루어진 항생 펩타이드를 포함하는 항생용 화장료 조성물:
서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드; 및
상기 펩타이드의 일 말단에 링커로 연결되고, 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 세포 투과 펩타이드.
하기로 이루어진 항생 펩타이드를 포함하는 항생용 의약외품 조성물:
서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드; 및
상기 펩타이드의 일 말단에 링커로 연결되고, 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 세포 투과 펩타이드.
하기로 이루어진 항생 펩타이드를 포함하는 항생용 사료 첨가제:
서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드; 및
상기 펩타이드의 일 말단에 링커로 연결되고, 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 세포 투과 펩타이드.