KR102470487B1 - 세포 스페로이드 형성 및 전달을 위한 콜라겐이 충진된 고다공성 생분해성 마이크로 입자의 제조방법 - Google Patents

세포 스페로이드 형성 및 전달을 위한 콜라겐이 충진된 고다공성 생분해성 마이크로 입자의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은, 세포 스페로이드 형성 및 전달을 위한 콜라겐이 충진된 고다공성 생분해성 마이크로 입자의 제조방법에 관한 것으로, 생분해성 고분자 및 기공 유도체를 포함하는 제1 고분자 용액을 제조하는 단계; PVA를 포함하는 제2 고분자 용액을 제조하는 단계; 미세유체 채널에서 분산상으로 상기 제1 고분자 용액과 연속상으로 상기 제2 고분자 용액을 흘려주면서 미세액적을 형성하는 단계; 상기 미세 액적을 동결 건조하면서 기공 유도체를 제거하여 다공성 입자를 형성하는 단계; 및 상기 다공성 입자 내에 콜라겐 및 세포를 함침시키는 단계; 를 포함하는, 스페로이드 형성 및 전달을 위한, 콜라겐 충진된 다공성 입자의 제조방법 및 상기 방법으로 제조된 스페로이드 형성 및 전달을 위한, 콜라겐 충진된 다공성 입자에 관한 것이다.

Description

세포 스페로이드 형성 및 전달을 위한 콜라겐이 충진된 고다공성 생분해성 마이크로 입자의 제조방법{METHOD FOR PREPARING COLLAGEN FILLED HIGHLY POROUS MICROSPHERE FOR DELIVERY AND FORMATION OF CELL SPHEROID}
본 발명은, 세포 스페로이드 형성 및 전달을 위한 콜라겐이 충진된 고다공성 생분해성 마이크로 입자의 제조방법에 관한 것이며, 상기 제조방법에 의한 세포 스페로이드 형성 및 전달을 위한 콜라겐이 충진된 고다공성 생분해성 마이크로 입자를 제공한다.
일반적으로 세포의 배양에 있어서는 2차원 방향으로 퍼진 단층세포의 배양이 이루어지고 있으므로, 2차원 세포배양은 우리 체내 세포 환경 조건을 제대로 모사하지는 못한다는 한계점을 지니고 있다.
3차원 세포 배양 기술이 개발되었으며, 3차원 세포 배양 기술은, 생체와 유사한 환경을 체외에서 인공적으로 조성하여 세포가 모든 차원에서 성장하거나 주변환경과 상호작용할 수 있도록 허용하는 세포 배양 모델을 통칭한다.
생체 대응성이 뛰어난 3차원 세포 배양 모델은 2차원 세포 배양 모델과 달리 세포, 세포외기질, 세포배양용기, 세포성장인자 등의 조합으로 만들어져 다양한 조합에 따라서 세포배양모델이 달라지는 다양성을 가지고 있다.
3차원 세포 배양 모델은 재생 의료나 하이브리드(hybrid) 인공장기, 생체 유용 물질 생산, 생물 조직이나기관 장기의 기능의 조사·탐색, 신약의 스크리닝(screening), 내분비 교란 물질 등의 영향을 평가하는 동물실험 대체법, 센서(sensor)기능을 가지는 세포 칩 등의 각 분야의 산업에 이용 가능성이 있다.
최근에는 생체 내와 동등한 기능을 갖는 3차원 세포 조직인 스페로이드(spheroid)의 배양이 주목을 받고 있다. 암을 모사하기 위한 세포 응집(cell aggregation)을 유도하기도 하고, 당뇨 치료를 위한 인슐린의 정상분비를 유도하기 위해서 췌장 세포를 이식함에 있어 응집된 세포를 이식하는 방법 등이 쓰이고 있고, 줄기 세포 연구가 성숙됨에 따라 배아 줄기세포를 3차원 배양하여 각종 분화 기전의 연구에 응용하기 위한 여러 가지 방법이 시도되고 있으므로, 스페로이드의 대량 생산 기술 및 상용화가 요구되고 있다.
따라서, 보다 우수하고 신뢰할 수 있는 정밀도가 보장될 뿐만 아니라 체내 주입 시 물리적 손상을 최소화하고 안정적으로 조직 재생 기능을 제공할 수 있는 3차원 스페로이드의 제조 기술 및 3차원 스페로이드를 이용한 세포 배양기술의 개발이 필요하다.
본 발명은, 상기 언급한 문제점을 해결하기 위해서, 균일한 입자 분포를 가지면서, 입자에 복수의 스페로이드를 형성시킬 수 있어 조직 재생에 유리하고, 체내에 스페로이드를 주입할 경우 주입할 때 발생할 수 있는 물리적인 손상을 최소화시킬 수 있는, 스페로이드 형성 및 전달을 위한, 콜라겐 충진된 다공성 입자의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명은, 본 발명에 의한 콜라겐 충진된 다공성 입자의 제조방법으로 제조된, 스페로이드 형성 및 전달을 위한, 콜라겐 충진된 다공성 입자를 제공하는 것이다.
본 발명의 일 실시예에 따라, 생분해성 고분자 및 기공 유도체를 포함하는 제1 고분자 용액을 제조하는 단계; PVA(polyviniyalcohol)를 포함하는 제2 고분자 용액을 제조하는 단계; 미세유체 채널에서 분산상으로 상기 제1 고분자 용액과 연속상으로 상기 제2 고분자 용액을 흘려주면서 미세액적을 형성하는 단계; 상기 미세 액적을 동결 건조하면서 기공 유도체를 제거하여 다공성 입자를 형성하는 단계; 및 상기 다공성 입자 내에 콜라겐 및 세포를 함침시키는 단계; 를 포함하는, 스페로이드 형성 및 전달을 위한, 콜라겐 충진된 다공성 입자의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명의 일 실시예에 따라, 상기 생분해성 고분자는, 폴리-(β-카프로락톤)(poly(β-carprolactone), PCL), 폴리(락트산-co-글리콜산)(poly(lactic-coglycolic acid), PLGA), 폴리글리콜산(poly(glycolic acid), PGA) 및 폴리락트산(poly(lactic acid), PLA)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하고, 상기 기공 유도체는, 캄펜(camphene) 및 젤라틴으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따라, 상기 고분자 용액을 제조하는 단계는, 생분해성 고분자의 용액을 제조하는 단계; 기공 유도체 용액을 제조하는 단계; 및 상기 생분해성 고분자 용액 및 상기 기공 유도체 용액을 혼합하는 단계; 를 포함하고, 상기 생분해성 고분자 용액 대 상기 기공 유도체 용액의 혼합비(중량비)는, 75 : 25 내지 25 : 75인 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따라, 상기 다공성 입자는, 100 ㎛ 내지 500 ㎛ 입자 크기 및 1 ㎛ 내지 100 ㎛ 기공 크기를 갖는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따라, 상기 다공성 입자 내에 콜라겐 및 세포를 함침시키는 단계는, 상기 다공성 입자의 표면을 개질하는 단계; 상기 표면 개질된 다공성 입자; 와 세포를 포함하는 제1 콜라겐 용액을 혼합하는 단계; 5 ℃ 이하의 온도에서 원심분리하는 단계; 상기 원심분리하는 단계 이후에 상기 다공성 입자 및 제2 콜라겐 용액을 혼합하는 단계; 및 상기 다공성 입자를 용액 내에 분산시키고 상기 다공성 입자 내에 함침된 콜라겐을 경화하는 단계;를 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따라, 상기 콜라겐을 경화하는 단계는, 35 ℃ 내지 40 ℃ 온도에서 경화하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따라, 상기 콜라겐을 경화하는 단계는, 기공 내 50 부피% 내지 100 부피%로 콜라겐을 충진시키는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따라, 상기 콜라겐을 경화하는 단계의 용액은, 세포 배양액이고, 상기 콜라겐을 경화하는 단계 이후에, 세포를 배양하는 단계; 를 더 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따라, 상기 세포는, 간 세포인 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따라, 상기 다공성 입자를 표면 개질하는 단계는, 상기 다공성 입자를 탄소수 1 내지 3의 알코올 용액 내에 담그는 단계; 및 상기 다공성 입자를 탈이온수 및 PBS 용액으로 세척하는 단계; 를 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따라, 본 발명에 의한 방법으로 제조되고, 간 스페로이드 형성 및 전달을 위한, 콜라겐 충진된 다공성 입자에 관한 것이다.
본 발명은, 미세유체 시스템을 이용하여 크기가 균일한 다공성 입자를 제조하고, 이를 이용하여 세포 스페로이드를 제작함으로써, 하나의 입자에 복수의 스페로이드를 형성시키고, 이를 통해 조직 재생에 유리하며 체내에 스페로이드를 주입할 경우 물리적인 손상으로부터 세포 스페로이드를 보호할 수 있다. 또한, 본 발명은, 생체 내 재생공학 및 세포 치료제로써 활용할 수 있는 세포 스페로이드를 제공할 수 있다.
도 1은, 본 발명의 일 실시예에 따라, 본 발명에 의한 콜라겐 충진된 다공성 입자의 제조방법에서 미세유체 시스템에 의한 액적 형성 공정을 예시적으로 나타낸 것있다.
도 2는, 본 발명의 일 실시예에 따라, 본 발명에 의한 콜라겐 충진된 다공성 입자의 제조방법에서 다공성 입자의 형성 공정을 예시적으로 나타낸 것이다.
도 3은, 본 발명의 일 실시예에 따라, 본 발명에 의한 콜라겐 충진된 다공성 입자의 제조방법에서 콜라겐의 함침 공정, 세포배양 공정 및 활용을 예시적으로 나타낸 것이다.
도 4는, 본 발명의 일 실시예에 따라, 실시예에서 제조된 스페로이드의 세포 콜라겐 경화 및 세포 배양 결과를 이미지로 나타낸 것이다.
도 5는, 본 발명의 일 실시예에 따라, 실시예에서 제조된 스페로이드의 세포 독성(Live/Dead cell analysis) 분석 결과를 이미지로 나타낸 것이다.
도 6은, 본 발명의 일 실시예에 따라, 실시예에서 제조된 스페로이드에 위치한 세포 수의 분석 결과를 이미지로 나타낸 것이다.
이하 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 실시예들을 상세히 설명한다. 본 발명을 설명함에 있어서, 관련된 공지 기능 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략할 것이다. 또한, 본 명세서에서 사용되는 용어들은 본 발명의 바람직한 실시예를 적절히 표현하기 위해 사용된 용어들로서, 이는 사용자, 운용자의 의도 또는 본 발명이 속하는 분야의 관례 등에 따라 달라질 수 있다. 따라서, 본 용어들에 대한 정의는 본 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 내려져야 할 것이다. 각 도면에 제시된 동일한 참조 부호는 동일한 부재를 나타낸다.
명세서 전체에서, 어떤 부재가 다른 부재 "상에" 위치하고 있다고 할 때, 이는 어떤 부재가 다른 부재에 접해 있는 경우뿐 아니라 두 부재 사이에 또 다른 부재가 존재하는 경우도 포함한다.
명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
본 발명은, 본 발명에 의한 스페로이드 형성 및 전달을 위한, 콜라겐 충진된 다공성 입자의 제조방법에 관한 것으로, 본 발명의 일 실시예에 따라, 상기 제조방법은, 미세유체 시스템을 이용하여 균일한 입자 분포를 가지면서 생체 내 주입 시 물리적 손상을 줄일 수 있는 3차원 구조체이고 생분해성을 갖는 다공성 입자를 제공할 수 있다. 또한, 세포 배양이 잘 이루어져 우수한 세포 스페로이드로 제조할 수 있는, 다공성 입자를 제공할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따라, 상기 제조방법은, 제1 고분자 용액을 제조하는 단계; 제2 고분자 용액을 제조하는 단계; 미세액적을 형성하는 단계; 다공성 입자를 형성하는 단계; 및 콜라겐 및 세포를 함침시키는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따라, 상기 제1 고분자 용액을 제조하는 단계는, 용매, 생분해성 제1 고분자(또는, 생분해성 고분자로 칭함) 및 기공 유도체를 포함하는 제1 고분자 용액을 제조하는 단계이며, 상기 제1 고분자 용액은, 용매 내에 제1 고분자 및 기공 유도체가 용해된 상태일 수 있다.
본 발명의 일 예로, 상기 기공 유도체는 모노테르펜(Monoterpene) 계열의 화합물, 젤라틴 또는 이둘을 포함하고, 예를 들어, 모노테르펜(Monoterpene) 계열의 화합물은, 캄펜(camphene), CAMPANE, CAMPHANE, 델타-3-카렌(δ-3-carene), P-사이멘(p-cymene), 리모넨(limonene), 미르센(myrcene), 시스-오시멘(cis-ocimene), 알파-펠란드렌(α-phellandrene), 베타-펠란드렌(β-phellandrene), 알파-피넬(α-pinene), 베타-피넨(β-pinene), 사비넨(sabinene), 알파-테르피넨(α-terpinene), 감마-테르피넨(γ-terpinene), 테르피넨(terpinolene) 및 알파-튜옌(α-thujene)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 캄펜(camphene)일 수 있다.
본 발명의 일 예로, 제1 고분자, 즉, 상기 생분해성 고분자는, 폴리-(β-카프로락톤)(poly(β-carprolactone), PCL), 폴리(락트산-co-글리콜산)(poly(lactic-coglycolic acid), PLGA), 폴리글리콜산(poly(glycolic acid), PGA), 폴리락트산(poly(lactic acid), PLA), 폴리안하이드리드(poly(anhydrides)), 폴리오르토에스테르(polyorthoesters), 폴리에틸렌글리콜(poly(ethyleneglycol)), 폴리우레탄(polyurethane), 폴리아크릴산(polyacrylic acid), 폴리-N-이소프로필아크릴아마이드(poly (N-isopropyl acrylamide), CAMPHANE 및 폴리(에틸렌옥사이드)-폴리(프로필렌옥사이드)-폴리(에틸렌옥사이드)공중합체(pol y(ethyleneoxide)-poly(propyleneoxide)-poly (ethyleneoxide) copolymer) 으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 예로, 상기 제1 고분자 및 상기 기공 유도체는 각각 용매에 용해 및/또는 분산된 이후에 혼합될 수 있다. 즉, 상기 제1 고분자 용액을 제조하는 단계는, 생분해성 고분자의 용액을 제조하는 단계; 기공 유도체 용액을 제조하는 단계; 및 상기 생분해성 고분자 용액 및 상기 기공 유도체 용액을 혼합하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 각 용액의 용매는 동일하거나 또는 상이할 수 있다.
예를 들어, 상기 제1 고분자는, 상기 생분해성 고분자 용액 중 5 중량% 내지 10 중량%로 포함되고, 상기 기공 유도체는, 상기 기공 유도체 용액 중 40 중량% 내지 80 중량%로 포함될 수 있다.
예를 들어, 상기 생분해성 고분자 용액 및 상기 기공 유도체 용액을 혼합하는 단계에서 상기 생분해성 고분자 용액 대 상기 기공 유도체 용액의 혼합비(중량비)는, 75 : 25 내지 25 : 75일 수 있으며, 상기 비율 범위 내에 포함되면 저절한 기공비율을 형성하고, 기공비율의 증가에 따른 입자의 강도 저하를 방지할 수 있다. 즉, 기공 유도체의 혼합비가 증가할수록 내부의 기공비율 증가에 따른 강도가 떨어져 강도에 취약해질 수 있다.
본 발명의 일 예로, 상기 제1 고분자는, 상기 제1 고분자 용액 중 1 중량% 내지 10 중량%; 5 중량% 내지 10 중량%; 또는 3 중량% 내지 5 중량%로 포함되고, 상기 기공 유도체는, 상기 제1 고분자 용액 중 40 중량% 내지 99 중량%; 50 중량% 내지 95 중량%; 또는 80 중량% 내지 90 중량%로 포함될 수 있다. 상기 범위 내에 포함되면 기공 크기 및 기공 부피가 증가된 다공성 입자를 제공할 수 있으며, 예를 들어, 기공 유도체의 농도가 80 %이상일 경우에 기공이 큰 다공성 입자의 생성에 유리할 수 있다.
본 발명의 일 예로, 상기 용매는, 잔량 또는 상기 제1 고분자 용액 중 5 중량% 내지 50중량%로 포함될 수 있다. 상기 용매는, 물 및/또는 유기용매이며, 상기 유기용매는, 디클로로메탄, 디메틸카보네이트, 클로로포름, 탄소수 1 내지 5의 알콜, 헥산, 헵탄, 펜탄, 옥탄, 아세톤, 에틸아세테이트, 염화메틸렌, 사염화탄소, 벤젠, o-디클로로벤젠, 톨루엔, 자일렌, 펜탄, 메시틸렌(mesitylene), 시클로헥산, 디에틸에테르, 테트라클로로에틸렌 아세토니트릴, 디메틸설폭사이드, 디메틸포름아마이드, 트리크로로에틸렌 및 올레익산 및 리놀레익산으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 분산상을 형성을 위해서 비극성 용매이며, 예를 들어, 디클로로메탄, 디메틸카보네이트, 클로로포름, 시클로헥산, 사염화탄소, 에틸 아세테이트, 톨루엔, 펜탄, 헥산, 헵탄, 옥탄, 올레익산 및 리놀레익산일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따라, 상기 제2 고분자 용액을 제조하는 단계는, 미세유체 시스템에서 비분산상(즉, 연속상)으로 적용될 수 있는 제2 고분자 용액을 제조하는 것으로, 상기 제2 고분자는 제2 고분자 용액 중 10 중량% 이하로 묽은 농도이며, 이는 미세유체 시스템에에서 비분산상(즉, 연속상)으로 흐름을 제공하여 균일한 미세 액적 형성에 도움을 줄 수 있다. 예를 들어, 상기 용매는, 물, 유기용매 또는 이 둘을 포함하고, 상온 내지 100 ℃; 또는 50 내지 90 ℃ 온도에서 가열하여 제2 고분자가 충분히 용해된 제2 고분자 용액을 제조할 수 있다.
본 발명의 일 예로, 상기 제2 고분자는, 물에 용해성을 갖는 고분자이며, 폴리비닐알코올(polyviniyalcohol)일 수 있다. 상기 용매는 상기 제1 고분자 용액에서 언급한 용매 중 선택될 수 있으며, 바람직하게는 연속상으로 작용하기 위해서는 친수성 용매 및 물이다.
본 발명의 일 실시예에 따라, 상기 미세액적을 형성하는 단계는, 미세유체 채널 내에서 미세액적을 형성하는 단계이며, 즉, 도 1을 참조하면, 미세유체 채널에 분산상으로 상기 제1 고분자 용액과 연속상으로 상기 제2 고분자 용액을 흘려주면서 미세액적을 형성하는 단계이다. 이러한 미세유체 시스템을 이용할 경우에 크기가 균일한 입자의 형성이 가능하고, 다음 단계에 언급되는 건조 공정을 통해 미세 다공성 입자를 형성할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따라, 상기 다공성 입자를 형성하는 단계는, 상기 미세액적에서 기공 유도체를 제거하여 다공성 입자를 형성하는 단계이며, 예를 들어, 도 2를 참조하면, 제1 고분자 내에 기공 유도체가 분포된 미세 액적에서 용매를 제거한 이후에 동결 건조를 통해 기공 유도체를 제거하여 다공성 입자를 형성할 수 있다. 예를 들어, 상기 용매는 미세액적을 제2 고분자 용액 내에 넣고 1 시간 이상; 2 시간 이상; 또는 2 시간 내지 20 시간 동안 교반한 이후 세정, 예를 들어, 탈이온수로 세정하여 제거할 수 있다. 상기 동결 건조는 압력 30 Pa 내지 60 Pa, -30 ℃ 내지 -40 ℃ 또는 25 ℃ 에서 50 ℃ 온도에서 40 시간 내지 80 시간; 또는 45 내지 75 시간 동안 이루어질 수 있다.
본 발명의 일 예로, 상기 다공성 입자는, 100 ㎛ 내지 500 ㎛ 입자 크기 및 1 ㎛ 내지 100 ㎛; 10 ㎛ 내지 100 ㎛; 또는 50 ㎛ 내지 90 ㎛기공 크기를 가질 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따라, 상기 콜라겐 및 세포를 함침시키는 단계는, 상기 다공성 입자의 기공 내에 콜라겐 및 세포를 함침시키는 단계이며, 예를 들어, 상기 다공성 입자 내에 콜라겐 및 세포를 함침시키는 단계는, 표면 개질된 다공성 입자를 적용할 수 있다. 보다 구체적으로, 도 3을 살펴보면, 상기 다공성 입자의 표면을 개질하는 단계; 상기 표면 개질된 다공성 입자;와 세포를 포함하는 제1 콜라겐 용액을 혼합하는 단계; 저온에서 원심분리하는 단계; 상기 원심분리하는 단계 이후에 상기 다공성 입자 및 제2 콜라겐 용액을 혼합하는 단계; 및 상기 다공성 입자 내에 함침된 콜라겐을 경화하는 단계; 를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 예로, 상기 다공성 입자의 표면을 개질하는 단계는, 상기 다공성 입자를 친수성 유기 용매를 이용하는 것으로, 예를 들어, 상기 다공성 입자를
탄소수 1 내지 3의 알코올 용액 내에 담그는 단계; 및 상기 다공성 입자를 탈이온수 및 완용액으로 세척하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 완충액은, TEA 완충액, 트리스 완충액, 인산염 완충액(Phosphate-buffered saline, PBS), 파이로인산염 완충액, HEPES 완충액, POPSO 완충액 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 실시예에 따라, 상기 저온에서 원심분리하는 단계는, 5 ℃ 이하의 온도; 또는 2 ℃ 내지 1 ℃ 온도에서 원심분리하여 콜라겐 및 세포가 함침된 다공성을 입자를 침전시키고, 상층액을 제거하여 여분의 콜라겐(및/또는 세포)를 제거하는 단계이다.
본 발명의 일 실시예에 따라, 상기 다공성 입자 및 제2 콜라겐 용액을 혼합하는 단계는, 상기 원심분리하는 단계 이후에 획득한 상기 다공성 입자와 상기 제1 콜라겐 용액과 동일하거나 또는 상이한 양의 콜라겐을 포함하는 제2 콜라겐 용액을 혼합하는 단계이며, 이는 상기 다공성 입자 내에 충분한 콜라겐을 함침시키는 것으로, 원심분리 후 여분의 콜라겐 제거 후 콜라겐을 혼합할 경우 가라앉은 세포를 균일하게 혼합여 주입할 수 있으며, 여분의 콜라겐으로 제거함으로써 마이크로 입자에 채워진 콜라겐 외 부수의 콜라겐 덩어리의 생성을 방지할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따라, 상기 다공성 입자 내에 함침된 콜라겐을 경화하는 단계는, 상기 다공성 입자를 용액 내에 분산시켜 함침된 콜라겐을 경화하는 것으로, 상기 용액은 세포 배양액이며, 35 ℃ 내지 40 ℃ 온도의 인큐베이터 내에서 상기 콜라겐을 경화하는 단계이다. 상기 세포 배양액은, 본 발명의 기술 분야에서 알려진 세포 배양액을 배양 대상에 따라 적절하게 선택하여 적용할 수 있고, 본 명세서에는 구체적으로 언급하지 않는다.
본 발명의 일 예로, 상기 경화 공정을 통해 기공 내 100 부피% 미만; 90 부피 % 이하; 또는 20 부피% 내지 70 부피%로 콜라겐을 충진시킬 수 있다. 상기 경화된 콜라겐은 세포 배양 및 지지를 위한 세포외 기질(extracellular matrix)로 작용할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따라, 상기 콜라겐을 경화하는 단계 이후에 세포를 배양하는 단계를 더 포함할 수 있다. 이는 세포 배양액 내에 이루어지고, 본 발명의 기술 분야에서 알려진 세포 배양액을 적용할 수 있고, 본 명세서에는 구체적으로 언급하지 않는다. 상기 세포 배양액은, 세포의 종류에 따라 적절하게 선택될 수 있으며, 예를 들어, 37 ℃, 5% CO2 성장 환경을 제공하는 인큐베이터 내에서 배양되며, 세포 스페로이드를 형성할 수 있다.
본 발명의 일 예로, 상기 배양세포는, 본 발명의 다공성 입자의 용도에 따라 적절하게 선택될 수 있으며, 상기 배양세포는 본 발명의 기술 분야에서 알려진 세포의 적용이 가능하다. 예를 들어, 조직, 근육, 피부, 장기, 골, 골수, 연골, 혈액 등에서 분리된 세포이며, 보다 구체적으로, 상피세포, 섬유아세포, 골아세포, 연골세포, 심근 세포, 간세포, 인간 유래 제대혈 세포, 중간엽 줄기세포, 혈관내피전구세포(endothelial Progenitor Cell), 배아줄기세포(embryonic stem cell), 근모세포(myoblast), 심장줄기세포(cardiac stem cell) 등일 수 있다. 또한, 상기 중간엽 줄기세포는 이에 제한되지 않으나 골수, 근육, 지방, 제대혈, 양막, 또는 양수로부터 분리된 것일 수 있다. 상기 혈관 내피 전구세포는 이에 제한되지 않으나 혈액, 제대혈, 배아 또는 골수로부터 분리된 것일 수 있다.
이하, 실시예에 의하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
다공성 마이크로 입자의 제조방법
5% 폴리카프로락톤(PCL)과 80% 캄펜(camphene porogen)을 클로로폼에 각각 바이알에 넣고 용해한 이후에 두 용액을 6:4 (wt.%/wt.%)로 혼합하였다. 2% 폴리비닐알코올용액을 탈이온수를 이용하여 90 ℃에서 8시간이상 가열하여 제조하였다.
5% 폴리카프로락톤 용액은 분산상으로, 2% 폴리비닐알코올 용액은 연속상으로 미세유체 시스템에 넣고 흘려주었다. 제조되는 미세액적은 2% 폴리비닐알코올용액이 있는 비커에 넣고 300 RPM으로 저어주었다. 5시간 뒤에 탈이온수으로 세척한 후 동결건조를 통하여 기공유도물질을 제거하였다. 여기서 %는 wt.%이다.
콜라겐이 충진된 다공성 입자를 이용한 간 스페로이드 배양법
다공성 입자의 표면 개질 및 세척을 위해서 70% 알코올에 1시간정도 담그어 놓고, 탈이온수 및 PBS용액을 이용하여 에탄올을 세척하였다. 2% 콜라겐과 간세포를 혼합하고 다공성 입자가 있는 Vial을 넣고 피펫팅을 로 충분히 혼합하였다.
도 3에 나타낸 바와 같이, 3000RPM에서 5분간 원심분리기를 이용하여 입자를 다운시키고 여분의 콜라겐을 최대한 제거하였다. 교반기를 이용하여 콜라겐과 다공성 입자를 다시 혼합하였다. 세포배양액 용액에 콜라겐이 충진된 다공성 입자를 넣고 37 ℃의 인큐베이터에 1시간이상 넣고 콜라겐을 경화하였다.
다공성 입자, 세포 시딩 및 1일 이후 세포 시딩, 콜라겐 경화 후 및 콜라겐 경화 후 5일 이후의 이미지를 도 4에 나타내었다. 도 4에서 세포가 포함된 콜라겐을 세포에 포함시킨 후 37도에서 한시간 동안 경화한 후 콜라겐에 포함되지 않은 세포를 제거한 후 빠져나온 세포를 제거한 후 1~5 일까지 마이크로입자를 관찰하였다. 광학 현미경을 통하여 세포가 콜라겐 내부에 위치하고 있는 것을 확인할 수 있다.
도 5는 다공성 마이크로 입자에서 Live dead 분석을 통하여 세포 생존율을 확인하였다. 세포가 점차적으로 증가해 다공성 입자 내부에서 세포 스페로이드를 이루는 것을 확인할 수 있다.
도 6은, 다공성 마이크로 입자에 위치한 세포의 수를 명확하게 파악하기 위해 세포핵을 염색하는 DAPI 분석을 진행하였으며 시간이 지날수록 많은 수의 세포가 스페로이드 형태로 입자의 기공내부에 위치한 것을 확인할 수 있다.
본 발명은, 간스페로이드 배양 및 전달을 위한 콜라겐이 충진된 생분해성 다공성 입자를 제작하는 방법을 제공하는 것이며, 유기용매에 생분해성 고분자와 기공유도체를 분산하여 혼합한 후 미세유체 시스템을 통하여 고분자 용액은 분산상, PVA 용액은 연속상으로 흘려주어 크기가 균일한 입자를 제조하며 추후 동결 건조를 통하여 기공유도체를 제거하여 다공성 입자를 제작하였다. 제작된 다공성 입자는 표면을 개질한 후 세포가 혼합되어 있는 콜라겐 용액을 채워 놓고 남아 있는 방식으로 콜라겐이 충진된 생분해성 다공성 입자를 제조하였다. 상기 콜라겐이 충진된 다공성 입자를 이용하여 세포 스페로이드를 제작하였고, 상기 세포 스페로이드는 하나의 입자에 복수의 스페로이드를 형성시킬 수 있으므로, 조직 재생에 유리하고, 체내에 스페로이드를 주입할 경우 주입할 때 발생할 수 있는 물리적인 손상으로부터 세포 스페로이드를 보호할 수 있다.
이상과 같이 실시예들이 비록 한정된 실시예와 도면에 의해 설명되었으나, 해당 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 상기의 기재로부터 다양한 수정 및 변형이 가능하다. 예를 들어, 설명된 기술들이 설명된 방법과 다른 순서로 수행되거나, 및/또는 설명된 구성요소들이 설명된 방법과 다른 형태로 결합 또는 조합되거나, 다른 구성요소 또는 균등물에 의하여 대치되거나 치환되더라도 적절한 결과가 달성될 수 있다. 그러므로, 다른 구현들, 다른 실시예들 및 특허청구범위와 균등한 것들도 후술하는 특허청구범위의 범위에 속한다.

Claims (11)

  1. 생분해성 고분자 및 기공 유도체를 포함하는 제1 고분자 용액을 제조하는 단계;
    PVA(polyviniyalcohol)를 포함하는 제2 고분자 용액을 제조하는 단계;
    미세유체 채널에서 분산상으로 상기 제1 고분자 용액과 연속상으로 상기 제2 고분자 용액을 흘려주면서 미세액적을 형성하는 단계;
    상기 미세 액적을 동결 건조하면서 기공 유도체를 제거하여 다공성 입자를 형성하는 단계; 및
    상기 다공성 입자 내에 콜라겐 및 세포를 함침시키는 단계;
    를 포함하고,
    상기 고분자 용액을 제조하는 단계는,
    생분해성 고분자 용액 및 기공 유도체 용액을 혼합하는 단계를 포함하고,
    상기 생분해성 고분자 용액 및 상기 기공 유도체 용액은 동일한 유기 용매를 포함하고,
    상기 생분해성 고분자는 상기 생분해성 고분자 용액 중 5 중량% 내지 10 중량%이고,
    상기 기공 유도체는, 상기 기공 유도체 용액 중 40 중량% 내지 80 중량%로 포함되고, 모노테르펜계 화합물을 포함하는 것인,
    스페로이드 형성 및 전달을 위한, 콜라겐 충진된 다공성 입자의 제조방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 생분해성 고분자는, 폴리-(β-카프로락톤)(poly(β-carprolactone), PCL), 폴리(락트산-co-글리콜산)(poly(lactic-coglycolic acid), PLGA), 폴리글리콜산(poly(glycolic acid), PGA) 및 폴리락트산(poly(lactic acid), PLA)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하고,
    상기 기공 유도체는, 캄펜(camphene), 델타-3-카렌(δ-3-carene), P-사이멘(p-cymene), 리모넨(limonene), 미르센(myrcene), 시스-오시멘(cis-ocimene), 알파-펠란드렌(α-phellandrene), 베타-펠란드렌(β-phellandrene), 알파-피넬(α-pinene), 베타-피넨(β-pinene), 사비넨(sabinene), 알파-테르피넨(α-terpinene), 감마-테르피넨(γ-terpinene), 테르피넨(terpinolene) 및 알파-튜옌(α-thujene)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 것인,
    콜라겐 충진된 다공성 입자의 제조방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 고분자 용액을 제조하는 단계는,
    생분해성 고분자의 용액을 제조하는 단계;
    기공 유도체 용액을 제조하는 단계; 및
    상기 생분해성 고분자 용액 및 상기 기공 유도체 용액을 혼합하는 단계;
    를 포함하고,
    상기 생분해성 고분자 용액 대 상기 기공 유도체 용액의 혼합비(중량비)는, 75 : 25 내지 25 : 75인 것인,
    콜라겐 충진된 다공성 입자의 제조방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 다공성 입자는, 100 ㎛ 내지 500 ㎛ 입자 크기 및 1 ㎛ 내지 100 ㎛ 기공 크기를 갖는 것인,
    콜라겐 충진된 다공성 입자의 제조방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 다공성 입자 내에 콜라겐 및 세포를 함침시키는 단계는,
    상기 다공성 입자의 표면을 개질하는 단계;
    상기 표면 개질된 다공성 입자; 와 세포를 포함하는 제1 콜라겐 용액을 혼합하는 단계;
    5 ℃ 이하의 온도에서 원심분리하는 단계;
    상기 원심분리하는 단계 이후에 상기 다공성 입자 및 제2 콜라겐 용액을 혼합하는 단계; 및
    상기 다공성 입자를 용액 내에 분산시키고 상기 다공성 입자 내에 함침된 콜라겐을 경화하는 단계;
    를 포함하는 것인,
    콜라겐 충진된 다공성 입자의 제조방법.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 콜라겐을 경화하는 단계는, 35 ℃ 내지 40 ℃ 온도에서 경화하는 것인,
    콜라겐 충진된 다공성 입자의 제조방법.
  7. 제5항에 있어서,
    상기 콜라겐을 경화하는 단계는, 기공 내 50 부피% 내지 100 부피%로 콜라겐을 충진시키는 것인,
    콜라겐 충진된 다공성 입자의 제조방법.
  8. 제5항에 있어서,
    상기 콜라겐을 경화하는 단계의 용액은, 세포 배양액이고,
    상기 콜라겐을 경화하는 단계 이후에, 세포를 배양하는 단계;
    를 더 포함하는 것인,
    콜라겐 충진된 다공성 입자의 제조방법.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 세포는, 간 세포인 것인,
    콜라겐 충진된 다공성 입자의 제조방법.
  10. 제5항에 있어서,
    상기 다공성 입자를 표면 개질하는 단계는,
    상기 다공성 입자를 탄소수 1 내지 3의 알코올 용액 내에 담그는 단계; 및
    상기 다공성 입자를 탈이온수 및 PBS 용액으로 세척하는 단계;
    를 포함하는 것인,
    콜라겐 충진된 다공성 입자의 제조방법.
  11. 제1항의 방법으로 제조되고,
    간 스페로이드 형성 및 전달을 위한, 콜라겐 충진된 다공성 입자.


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