KR102462705B1 - 음향 관류 디바이스 - Google Patents
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Abstract
유체 매질에서 생물학적 세포를 다른 물질로부터 분리하기 위한 음향 관류 디바이스가 개시된다. 상기 디바이스는 음향 챔버에 연결된, 유입구 포트, 유출구 포트 및 수집 포트를 포함한다. 초음파 트랜스듀서는 음향 챔버 내에 음향 정재파를 생성하여, 음향 챔버 내의 생물학적 세포가, 유체 매질이 배출되는 바이오리액터로 되돌아가도록 유지하면서, 연속적인 유체 유동이 수집 포트를 통해 회수되도록 한다.
Description
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2015년 11월 18일 자로 출원된 미국 가출원 특허 제62/256,952호, 2015년 10월 19일 자로 출원된 미국 가출원 특허 제62/243,211호, 2015년 8월 28일 자로 출원된 미국 가출원 특허 제62/211,057호, 및 2014년 12월 18일자로 출원된 미국 가출원 특허 제62/093,491호의 우선권 주장 출원이다. 본 출원은 전체적으로 참조로서 본 명세서에 병합된다.
생명 공학 분야는 지난 20년 동안 엄청나게 성장했다. 이러한 성장은 바이오리액터(bioreactor)에 사용할 수 있는 장비의 개선, 생체 시스템에 대한 이해 증진, 및 신체의 다양한 시스템과의 물질의 상호 작용 (이를테면, 모노 클론 항체 (monoclonal antibodies) 및 재조합 단백질)과의 상호 작용에 대한 지식의 증가 등을 포함한 많은 요인로 증가했다.
장비의 개선으로 재조합 단백질과 같은 생물학적으로 추출된 물질을 생산하는데 필요한 대량 생산 및 비용을 절감할 수 있다. 이는 많은 유형의 신약 치료법의 성공이 단백질 기반 제조 방법을 통해 이러한 물질을 대량 생산할 수 있는 능력에 직접적으로 기인한 제약 분야에서 특히 빈번하다.
새로운 생물학적 기반의 제제의 제조 과정에 사용되는 주요 구성 요소 중 하나는 바이오리액터 및 이와 관련된 부수적인 과정이다. 바이오리액터 분야의 성장 영역은 관류 과정 (perfusion process)을 통해 이루어졌다. 관류 과정은 자본 비용이 낮고 (배치 (batch)보다는 오히려) 연속적인 동작에 의한 유가식 (fed-batch) 과정과는 구별된다.
유가식 과정에서 배양물을 바이오리액터에 뿌린다, 성장 주기 동안 선택된 양분의 신선한 볼륨의 점진적인 추가는 생산성 및 성장을 개선하는데 사용된다. 배양물을 채취 (harvest)한 후 생성물을 회수한다. 불연속 유가식 바이오리액터 과정은 단순성 때문에, 또한 잘 알려진 발효 과정으로부터의 이월 (carryover)로 인해 매력적이다. 그러나, 유가식 바이오리액터는 높은 시동 비용을 가지며, 일반적으로 성장 사이클의 끝에서 비용 효율적인 양의 생성물을 얻기 위해 큰 볼륨을 가진다. 배치가 완료된 후에는 바이오리액터는 세척 및 멸균해야 하므로, 비생산적인 중단 (downtime)이 발생한다.
관류 바이오리액터는 바이오리액터에 공급되는 신선한 배지의 연속적인 공급을 처리하는 한편, 성장 억제 부산물은 끊임없이 제거된다. 비생산적인 중단은 관류 바이오리액터 과정으로 감소되거나 제거될 수 있다. 관류 배양물 (30-100 백만 cells/mL)에서 달성된 세포 밀도는 통상적으로 유가식 모드 (5-25 백만 cells/mL)보다 높다. 이러한 개선으로 인해 채취량의 오염은 감소하고 비용이 크게 증가함 없이 수율이 향상된다. 그러나, 관류 바이오리액터는 부산물이 제거될 시 배양물의 탈출을 방지하기 위해 세포 보유 디바이스를 필요로 한다. 이러한 세포 보유 시스템은 성공적인 동작을 위해, 관리, 제어 및 유지 보수가 필요한 관류 과정에 복잡성 수준을 더한다. 세포 보유 장비의 오작동이나 실패와 같은 동작 사안은 과거에 매력을 제한한 관류 바이오리액터에 따른 문제를 사전에 가졌다.
본 개시 내용은 다양한 실시예들에서 관류 바이오매뉴팩처링에 사용되는 음향 디바이스에 관한 것이다. 특히, 상기 디바이스는 관련된 바이오리액터에 결합된다. 바이오리액터 내에서 재조합 단백질 또는 모노 클론 항체와 같은 생체 분자가 생산된다. 그 다음, 음향 디바이스는 연속적으로 기반하여 세포로부터 이들 바람직한 생성물을 분리하는데 사용되며, 세포는 연속적으로 바이오리액터로 되돌아간다. 일반적으로, 세포 및 원하는 생성물을 함유하는 유체 매질은 음향 디바이스를 통해 지나가거나 흐르며, 다-차원 정재파(들)에 의해 분리된다. 유체 매질은 디바이스로 연속적으로 흘러갈 수 있고, 이때 원하는 생성물은 연속적으로 제거된다. 음향 관류 디바이스는 건강한 생존 세포를 바이오리액터로 되돌리는 반면, 원하는 생성물을 채취하고 추가 과정, 예컨대, 추가 필터링, 크로마토그래피 등을 위해 하류로 흐르게 된다. 추가적으로, 바이오리액터의 세포 배양 배지 (cell culture media)는, 채취 스트림으로 통과하여 유체 매질로부터 나와 바이오리액터로 재순환되기 위해 세포 단편이 또한 허용될 시에 정화된다. 이러한 결과는 전체 세포 배양 배지 사용량을 줄어들게 하며, 대규모 바이오리액터의 경우 하루 최대 20,000 달러의 비용 절감 효과를 기대할 수 있다.
다양한 실시예에서 음향 관류 디바이스가 개시되고, 상기 음향 관류 디바이스는: 음향 챔버; 유입구 포트, 상기 유입구 포트로부터 상기 음향 챔버로 안내되는 유입구 유동 경로; 상기 디바이스를 통해 그의 소스 (예컨대, 바이오리액터)로 다시 유동하는 재순환 유체를 위한 유출구 포트; 상기 음향 챔버에서 빠져나가는 유체의 생성물 스트림을 수집하는 적어도 하나의 수집 또는 채취 포트; 및 상기 적어도 하나의 채취 포트 아래에 있는 음향 챔버 내의 적어도 하나의 초음파 트랜스듀서;를 포함하고, 상기 적어도 하나의 초음파 트랜스듀서는 상기 음향 챔버로부터 상기 적어도 하나의 수집 또는 채취 포트로 안내되는 수집 또는 채취 유동 경로에 걸쳐 음향 정재파를 생성하기 위해, 전압 신호에 의해 구동되는 압전 물질을 포함한다. 상기 음향 정재파는 평면 또는 다-차원일 수 있거나, 그러한 파의 조합은 (일반적으로, 다수의 트랜스듀서로부터) 음향 챔버 내에 존재될 수 있다. 음향 정재파는 전체 세포를 저지하지만 원하는 생체분자 (예컨대, 재조합 단백질 및/또는 모노 클론 항체) 및 세포 단편과 같은 더 작은 물질을 통과시켜, 바이오리액터로 되돌아가는 유체로부터 제거되는 것을 허용하는 "힘 필드 (force field)"로 생각될 수 있다.
상기 유출구 포트는 일반적으로 상기 유입구 포트 아래에 있으며, 일반적으로 상기 디바이스의 바닥 말단부에 위치된다.
전술한 바와 같이, 상기 디바이스는 상기 디바이스의 상부에 하나 이상의 수집 또는 채취 포트를 가질 수 있다. 보다 특정한 일부 실시예에서, 상기 디바이스는 상기 디바이스의 상부 말단부 상에 서로 이격된 총 2 개의 채취 포트를 가질 수 있다.
특정 실시예에서, 상기 유입구 포트는 제 1 높이에서 디바이스의 제 1 말단부에 있고, 상기 적어도 하나의 초음파 트랜스듀서는 상기 제 1 높이보다 높은 제 2 높이에 있으며, 그리고 바닥 벽은 상기 유입구 포트로부터 상기 유출구 포트로 연장된다. 상기 유출구 포트는 상기 제 1 말단부에 대향한 상기 디바이스의 제 2 말단부에 위치될 수 있다. 상기 바닥 벽은 유입구 포트와 유출구 포트 사이의 라인에 대해 오목할 수 있다. 상기 디바이스는 상기 유입구 유동 경로 위의 상부 벽을 포함할 수 있다. 상기 유입구 포트, 유출구 포트 및 적어도 하나의 채취 포트 모두는 때로 디바이스의 전방 벽 상에 위치된다. 상기 전방 벽 그 자체는 평면일 수 있다 (즉, 평탄함)
상기 디바이스는 상기 적어도 하나의 초음파 트랜스듀서에 대향한 음향 챔버에 위치된 반사기를 더 포함할 수 있다. 대안적으로, 상기 디바이스는 동일한 높이에서 상기 채취 유동 경로의 대향 측면들 상에 위치되고 서로 향하는 총 2 개의 초음파 트랜스듀서를 가질 수 있거나, 또는 추가의 초음파 트랜스듀서가 수집/채취 유동 경로의 다수의 측면 상에 위치될 수 있다. 반사기는 2 개의 초음파 트랜스듀서 사이에 위치될 수 있다. 그러한 음향 정재파(들)의 평면, 다차원, 또는 조합을 형성하기에 적절하게 위치된 복수의 트랜스듀서/반사기 쌍이 있을 수도 있다.
특정 실시예에서, 상기 음향 정재파는, 동일한 자릿수 (same order of magnitude)를 가진 축 방향 힘 성분 및 측 방향 힘 성분을 가진 음향 방사력을 초래한다.
본 명세서에 개시된 디바이스의 다른 실시예에서, 상기 유입구 유동 경로는 유입구 포트로부터 디바이스의 바닥 말단부를 향해 하부 방향으로 그리고 유출구 포트를 지나서, 그 후에 음향 챔버를 향해 상부 방향으로 안내된다. 때로는 유입구 포트 및 적어도 하나의 채취 포트 둘 다는 디바이스의 상부 벽 상에 위치되며, 그리고 상기 유출구 포트는 디바이스의 전방 벽 상에 위치된다. 상기 적어도 하나의 초음파 트랜스듀서는 상기 디바이스의 후방 벽 또는 전방 벽에 장착될 수 있다. 이러한 음향 챔버의 바닥 벽은 경사진 평면이 될 수 있습니다. 반사기는 투명 물질로 이루어질 수 있다.
상기 유입구 유동 경로는 음향 정재파에 의해 생성된 음향 필드 아래에서 접선 방향의 유동 경로 (tangential flow path)를 생성하는 형상을 가질 수 있다. 본 명세서에서 볼 수 있는 여전히 추가적인 버전에서, 상기 유입구 유동 경로는 디바이스의 제 1 측면 상의 음향 챔버로 들어가며, 그리고 상기 유출구 포트는 (i) 디바이스의 제 1 측면 상에 위치되거나, 또는 (ii) 제 2 대향 측면에 위치된다. 상기 유입구 포트는 디바이스의 전방 측면 상에 위치될 수 있으며, 그리고 상기 적어도 하나의 채취 포트는 디바이스의 상부 벽 상에 위치될 수 있다. 상기 적어도 하나의 트랜스듀서는 디바이스의 전방 측면 또는 후방 측면 상에 위치될 수 있다. 보다 특정한 실시예에서, 2 개의 트랜스듀서가 있을 수 있고, 하나는 전방 측면 상에 그리고 다른 하나는 후방 측면 상에 있다. 여전히 다른 특정 실시예에서, 전방 또는 후방 측면 상의 초음파 트랜스듀서, 및 상기 트랜스듀서에 대향하는 각각의 후방 또는 전방 측면 상에 위치된 반사기가 있다.
상기 디바이스는 부착용 홀을 가진 장착 부재에 부착될 수 있다.
또한, 세포를 함유한 유체 매질로부터 세포를 분리하는 방법이 개시된다. 유체 매질은 적어도 하나의 초음파 트랜스듀서를 가진 전술한 구조체의 음향 관류 디바이스를 통해 유동된다. 상기 적어도 하나의 초음파 트랜스듀서는 음향 정재파를 생성하기 위해 구동된다. 세포에 풍부한 (enriched) 유체는 유출구 포트로부터 수집될 수 있으며, 세포에 고갈된 정화 유체는 적어도 하나의 채취 포트로부터 수집될 수 있다.
특정 실시예에서, 수집/채취 유동 경로를 통한 유속은 유입구 유동 경로를 통한 유속보다 적어도 한 자릿수가 작다. 특정 실시예에서, 유입구 포트를 통해 디바이스로 들어가는 유체 매질의 유속은 분당 약 1 리터이며, 그리고 상기 적어도 하나의 수집/채취 포트를 통해 상기 디바이스를 빠져나가는, 세포에 고갈된 유체의 유속은 분당 약 10 밀리미터이다. 대안적으로, 유입구 포트를 통해 들어가는 유속과 적어도 하나의 수집/채취 포트를 통해 빠져나가는 유속의 비율은, 음향 정재파가 세포의 주요 몸체에 의해 극복되지 않도록, 또는 달리 말하면, 대량의 세포가 수집/채취 포트(들)을 통해 디바이스에서 빠져나가기 시작하지 않도록 한다.
상기 방법은 디바이스의 적어도 하나의 채취 포트에 부착된 제 1 펌프 및 상기 디바이스의 유출구 포트에 부착된 제 2 펌프를 사용하여 상기 디바이스를 통해 유체 매질을 잡아당기는 단계를 더 포함할 수 있다.
또한 본 명세서에는 유동 디바이스가 개시되며, 상기 유동 디바이스는 (i) 1 차 유체 및 세포를 함유하는 유동 혼합물을 수용하며; 그리고 (ii) 제 1 음향 정재파를 사용하여, 상기 유동 혼합물로부터, 세포에 고갈된 채취 유체 스트림을 연속적으로 배출함으로써, 상기 유동 혼합물의 세포 농도를 변화시키도록 구성된다. 압력 상승은 음향 방사력과 함께, 음향 정재파의 에지에서 생성될 수 있다. 이러한 "에지 효과"는 음향 정재파의 에지에서 장벽으로 작용한다. 음향 정재파의 주파수는, 상이한 대조 인자 물질이 음향 정재파를 통해 저지 또는 허용될 수 있도록 변경될 수 있다.
상기 디바이스는, 세포에 고갈된 채취 유체 스트림이 제 2 음향 정재파를 통과하는 2 차 유동 챔버를 더 포함할 수 있으며, 상기 제 2 음향 정재파는 상기 제 1 음향 정재파보다 높은 주파수를 가진다.
본 명세서에서 유동 디바이스가 개시되고, 상기 유동 디바이스는: 1 차 유체 및 세포의 유동 혼합물을 수용하는 적어도 하나의 유입구; 제 1 초음파 음향 정재파를 생성하고, 상기 제 1 초음파 음향 정재파의 에지에서 생성된 압력 상승 및 음향 방사력을 사용하여 상기 유동 혼합물을 1 차 고 세포 농도 유체 스트림 (primary high cell concentration) 및 2 차 채취 유체 스트림으로 분리시키는 초음파 트랜스듀서; 상기 1 차 고 세포 농도 유체 스트림을 위한 유출구 포트; 및 상기 2 차 채취 유체 스트림을 위한 적어도 하나의 수집 포트;를 포함한다. 배출 포트 (bleed port)는 농축 유체/세포 혼합물을 추출하기 위해 존재할 수도 있다.
상기 디바이스는 상기 제 2 채취 유체 스트림이 제 2 음향 정재파를 통과하는 2 차 유동 챔버를 더 포함할 수 있고, 상기 제 2 음향 정재파는 상기 제 1 초음파 음향 정재파보다 높은 주파수를 가진다.
이들 및 다른 비-제한적인 특성은 이하에서 보다 상세하게 기술된다.
다음은 본 명세서에 개시된 예시적인 실시예를 도시하기 위한 것이며 이제 제한되지 않은 도면의 간략한 설명이다.
도 1은 초음파 트랜스듀서 및 반사기에 의해 생성된 단일 정재 (standing) 음향 파를 도시한다.
도 2는 유가식 바이오리액터 시스템을 관류 바이오리액터 시스템과 비교한 도면이다.
도 3은 교반 탱크 (stirred-tank) 바이오리액터의 다양한 구성 요소를 보여주는 단면도이다.
도 4는 2 개의 수집 또는 채취 포트 및 단일 초음파 트랜스듀서를 가진 본 개시 내용의 음향 관류 디바이스의 일 예시적인 실시예의 사시도이다.
도 5는 2 개의 초음파 트랜스듀서 사이에 단일 반사기가 위치된 본 개시 내용의 음향 관류 디바이스의 제 2 예시적인 실시예를 도시한다.
도 6은 본 개시 내용의 음향 관류 디바이스에 결합된 관류 바이오리액터 및 재순환 경로를 도시하는 개략도이다.
도 7은 본 개시 내용의 음향 관류 디바이스의 제 3 예시적인 실시예의 정면 단면도이다.
도 8은 도 7의 음향 관류 디바이스의 외부 사시도이다.
도 9는 본 개시 내용의 음향 관류 디바이스의 제 4 예시적인 실시예의 정면 단면도이다.
도 10은 도 9의 음향 관류 디바이스의 사시도이다.
도 11은 종래의 초음파 트랜스듀서의 단면도이다.
도 12는 본 개시 내용의 초음파 트랜스듀서의 단면도이다. 에어 갭은 트랜스듀서 내에 존재하며, 백킹 층 (backing layer) 또는 마모 플레이트는 존재하지 않는다.
도 13은 본 개시 내용의 초음파 트랜스듀서의 단면도이다. 에어 갭은 트랜스듀서 내에 존재하며, 백킹 층 또는 마모 플레이트도 존재한다.
도 14는 상이한 주파수에서 구동되는 정사각형 트랜스듀서에 대한 주파수 대 전기 임피던스 진폭의 그래프이다.
도 15는 유체 유동에 수직인 방향으로부터 도 14의 7 개의 공진 주파수 (전기 임피던스 진폭의 최소치)에 대한 포획 (trapping) 라인 구성을 도시한다.
도 16은 평면 변위를 벗어난 트랜스듀서 (좌측 스케일, 미터 단위) 및 음향 압력 진폭 (우측 스케일, Pa 단위)의 컴퓨터 시뮬레이션이다. 좌측 스케일 상단의 글자는 "x10-7"이라고 읽는다. 좌측 스케일의 상단에 있는 상향 삼각형 (upward-pointing triangle)의 텍스트는 "1.473x10-6"이라고 읽는다. 좌측 스케일의의 하단에 있는 하향 삼각형의 텍스트는 "1.4612x10-10"이라고 읽는다. 우측 스케일의 상단의 텍스트는 "x106"이라고 읽는다. 우측 스케일의 상단에 있는 상향 삼각형의 텍스트는 "1.1129x106"이라고 읽는다. 우측 스케일의 하단에 있는 하향 삼각형의 텍스트는 "7.357"이라고 읽는다. 삼각형은 주어진 스케일에 대해 이 도면에서 표시된 최대 값 및 최소 값을 보여준다. 수평 축은 X 축을 따라 챔버 내의 위치를 인치로 나타내고, 수직 축은 Y 축을 따라 챔버 내의 위치를 인치로 나타낸 것이다.
도 17은 복합 파 (composite waves)가 존재하는 결정체 (crystal)의 In-Plane 및 Out-of-Plane 변위를 도시한다.
도 18은 관련 바이오리액터에 유체 연결되는 본 개시 내용의 제 1 음향 관류 디바이스의 도면으로서, 디바이스의 다양한 포트를 관련 바이오리액터에 유체 연결하는 복수의 호스, 및 디바이스의 유출구 포트를 관련 바이오리액터에 유체 연결하는 유출 펌프를 도시한다.
도 19는 제 1 트랜스듀서와 제 2 트랜스듀서 사이의 음향 챔버 내의 반사기를 도시하는, 도 5의 또 다른 음향 관류 디바이스의 도면이다. 유체 매질이 또한 디바이스 내에 존재하며 화살표는 반사기와 제 1 트랜스듀서와 제 2 트랜스듀서 사이의 음향 필드를 나타내는 파와 더불어 유동의 방향을 나타내는 것으로 도시된다.
도 20은 2 개의 상이한 관류액/공급 속도에서 하나의 실험을 위해 유체 매질로부터 세포를 제거하는 효율을 도시한 그래프이다.
도 21은 실험을 위한 채취 유동 (관류액으로도 언급됨) 탁도 감소를 도시한 그래프이다.
도 22는 도 20 내지 도 21의 그래프에 대해 수행된 실험에 대한 다양한 유속에 대한 세포 생존력을 도시한 그래프이다.
도 23은 또 다른 실험을 위한 다양한 유속 및 유동 방법에 대한 총 세포 밀도 및 세포 보유를 도시한 그래프이다.
도 24는 도 23의 그래프에 대해 수행된 실험에 대한 다양한 유속에 대한 세포 생존력을 도시한 그래프이다.
도 25는 또 다른 실험을 위해 다양한 수의 초음파 트랜스듀서에 대한 총 세포 밀도 및 세포 보유를 도시한 그래프이다.
도 26은 도 25의 그래프에 대해 수행된 실험을 위해 다양한 수의 초음파 트랜스듀서에 대한 세포 생존력을 도시한 그래프이다.
도 27은 테스트된 또 다른 음향 관류 디바이스의 사진이다.
도 28은 관류 유속 또는 트랜스듀서 전압이 세포 보유에 미치는 영향을 도시한 그래프이다.
도 29a는 디바이스로 들어가는 공급물 스트림 (feed stream)의 입자의 ViCell Cell Analyzer로부터의 현미경 이미지이다. 공급물 스트림은 CHO 세포, 단백질 및 세포 단편을 함유하는 바이오리액터 유체이다. 도 29b는 공급물의 입자 직경 분포의 그래프로서, 2 모드 (bimodal) 분포를 나타낸다. 도 29b에서, y 축은 10 간격으로 0으로부터 200까지의 입자 수이다. x 축은 2의 간격으로 6으로부터 50까지의 미크론 단위의 입자 직경이다. 총 입자 수는 5539이고, 평균 입자 크기는 16.78 미크론, 표준 편차는 6.76 미크론, 모드 입자 크기는 10.56 미크론이다.
도 30a는 디바이스를 빠져나가는 관류액 (또는 정화된 채취 유동)의 현미경 이미지이다. 도 30b는 매우 작은 크기의 단일 모드 분포를 보여주는 관류 액의 입자 직경 분포의 그래프이다. 도 30b에서, y 축은 20 간격으로 0 내지 300의 입자 수이다. x 축은 2의 간격으로 6으로부터 50까지의 미크론 단위의 입자 직경이다. 총 입자 수는 2919이며, 평균 입자 크기는 10.08 미크론, 표준 편차는 3.75 미크론, 모드 입자 크기는 8.99 미크론이다.
도 31은 도 27의 디바이스 내의 속도 분포를 도시한 CFD 모델이다. 스케일 상단의 텍스트는 "x10-2"이라고 읽는다. 스케일의 상단에 있는 상향 삼각형의 텍스트는 "0.678"이라고 읽는다. 스케일의 하단에 있는 하향 삼각형의 텍스트는 "0"이라고 읽는다. 삼각형은 주어진 스케일에 대해 이 도면에서 표시된 최대 값 및 최소 값을 보여준다. 스케일은 0.5 간격으로 0으로부터 5m/s까지 진행되며 흑색은 스케일의 상단에 5를 표시하고 백색은 스케일의 하단에 0을 나타낸다.
도 32는 유동 경로, 음향 필드 및 음향 에지 효과를 도시하는, 도 27의 디바이스의 정면도이다.
도 33은 도 27의 음향 관류 디바이스를 2 개의 동작 모드로 도시한 합성 사진이다. 좌측 상에서, 디바이스는 시동 또는 세포 정착 모드에 있다. 우측 상에서, 디바이스는 안정된 세포 보유 모드에 있다.
도 34는 세포 보유에 사용된 음향 디바이스의 모델 시뮬레이션의 기하학적 구조를 도시한다. 상기 모델에는 두 개의 유체가 들어 있는데, 하나는 음향 필드 내에서 정화된 유체이고, 다른 하나는 음향 필드의 좌측에 높은 세포 밀도의 유체, 압전 트랜스듀서, 강철 반사기 및 알루미늄 하우징이다. 제 1 유체는 음향 필드 내의 물이었고 제 2 유체는 음향 필드의 바깥쪽 (좌측)의 수용액에서 15 % 농도의 CHO 세포이었다. 모델의 청색 실선은 두 유체 사이의 분리선을 나타낸다.
도 35a, 35b 및 35c는 압전 물질, 알루미늄 하우징 및 강철 반사기의 변위를 도시하는 그래프 (좌측 스케일)이며; 그리고 동작의 여러 주파수에서 도 34의 모델 시뮬레이션의 두 유체에서의 음향 압력 (우측 스케일)을 도시한다. 도 35a는 2.218MHz의 주파수에 있다. 도 35b는 2.2465MHz의 주파수에 있다. 도 35c는 2.3055MHz의 주파수에 있다. 세 그래프 모두의 경우, 좌측 스케일은 스케일 상단에 "x10-6" 또는 "x10-7"로 읽혀지는 텍스트로 표시되고 인치 단위이다. 우측 스케일은 스케일의 상단에 "x106"로 읽혀지는 텍스트로 표시되며 파스칼 단위이다. y 축은 0.2 간격으로 -0.8로부터 1.6까지 진행된다. x 축은 0.5 간격으로 -0.5로부터 1.5까지 진행된다.
도 36은 몇몇 동작 주파수로, 부유된 CHO 세포에 작용하는 전력 (N/W)에 의해 표준화된 평균 측 방향 힘 (N/W) 및 평균 측 방향 힘 (lateral force, N)을 도시한 그래프이다.
도 37은 본 개시 내용의 음향 관류 디바이스의 사진 (상부도)이다. 화살표는 유입구 포트로의 유동; 유출구 포트 외부로의 유동; 디바이스의 상부 외부로의 정화된 유체 유동 및 디바이스의 바닥 외부로의 농축물 유동을 나타낸다.
도 38은 도 37의 음향 관류 디바이스의 사진 (측면도)이다.
도 39는 도 37의 디바이스에 대한 세포 보유율 대 관류액 유속의 그래프이다.
도 40은 직접 유동 여과 (direct flow filtration, DFF) 및 접선 방향의 유동 여과 (tangential flow filtration, TFF)를 도시한 종래 기술 예이다
도 41은 세포가 포획되고, 무리를 이루고 (clustered), 채취 스트림으로부터 분리되는 관류 동안의 제 1 동작 모드를 도시한 사진이다. 디바이스는 중력의 방향을 나타내는 화살표와 함께 수직으로 동작된다.
도 42는 세포가 음향 정재파 필드에 진입하는 것을 방지하면서 더 작은 입자가 상기 필드를 통과하여 채취 스트림으로 통과하는 것을 허용하는 관류 동안의 제 2 동작 모드를 도시하는 사진이다. 디바이스는 중력의 방향을 나타내는 화살표에 따라 수직으로 동작된다.
도 1은 초음파 트랜스듀서 및 반사기에 의해 생성된 단일 정재 (standing) 음향 파를 도시한다.
도 2는 유가식 바이오리액터 시스템을 관류 바이오리액터 시스템과 비교한 도면이다.
도 3은 교반 탱크 (stirred-tank) 바이오리액터의 다양한 구성 요소를 보여주는 단면도이다.
도 4는 2 개의 수집 또는 채취 포트 및 단일 초음파 트랜스듀서를 가진 본 개시 내용의 음향 관류 디바이스의 일 예시적인 실시예의 사시도이다.
도 5는 2 개의 초음파 트랜스듀서 사이에 단일 반사기가 위치된 본 개시 내용의 음향 관류 디바이스의 제 2 예시적인 실시예를 도시한다.
도 6은 본 개시 내용의 음향 관류 디바이스에 결합된 관류 바이오리액터 및 재순환 경로를 도시하는 개략도이다.
도 7은 본 개시 내용의 음향 관류 디바이스의 제 3 예시적인 실시예의 정면 단면도이다.
도 8은 도 7의 음향 관류 디바이스의 외부 사시도이다.
도 9는 본 개시 내용의 음향 관류 디바이스의 제 4 예시적인 실시예의 정면 단면도이다.
도 10은 도 9의 음향 관류 디바이스의 사시도이다.
도 11은 종래의 초음파 트랜스듀서의 단면도이다.
도 12는 본 개시 내용의 초음파 트랜스듀서의 단면도이다. 에어 갭은 트랜스듀서 내에 존재하며, 백킹 층 (backing layer) 또는 마모 플레이트는 존재하지 않는다.
도 13은 본 개시 내용의 초음파 트랜스듀서의 단면도이다. 에어 갭은 트랜스듀서 내에 존재하며, 백킹 층 또는 마모 플레이트도 존재한다.
도 14는 상이한 주파수에서 구동되는 정사각형 트랜스듀서에 대한 주파수 대 전기 임피던스 진폭의 그래프이다.
도 15는 유체 유동에 수직인 방향으로부터 도 14의 7 개의 공진 주파수 (전기 임피던스 진폭의 최소치)에 대한 포획 (trapping) 라인 구성을 도시한다.
도 16은 평면 변위를 벗어난 트랜스듀서 (좌측 스케일, 미터 단위) 및 음향 압력 진폭 (우측 스케일, Pa 단위)의 컴퓨터 시뮬레이션이다. 좌측 스케일 상단의 글자는 "x10-7"이라고 읽는다. 좌측 스케일의 상단에 있는 상향 삼각형 (upward-pointing triangle)의 텍스트는 "1.473x10-6"이라고 읽는다. 좌측 스케일의의 하단에 있는 하향 삼각형의 텍스트는 "1.4612x10-10"이라고 읽는다. 우측 스케일의 상단의 텍스트는 "x106"이라고 읽는다. 우측 스케일의 상단에 있는 상향 삼각형의 텍스트는 "1.1129x106"이라고 읽는다. 우측 스케일의 하단에 있는 하향 삼각형의 텍스트는 "7.357"이라고 읽는다. 삼각형은 주어진 스케일에 대해 이 도면에서 표시된 최대 값 및 최소 값을 보여준다. 수평 축은 X 축을 따라 챔버 내의 위치를 인치로 나타내고, 수직 축은 Y 축을 따라 챔버 내의 위치를 인치로 나타낸 것이다.
도 17은 복합 파 (composite waves)가 존재하는 결정체 (crystal)의 In-Plane 및 Out-of-Plane 변위를 도시한다.
도 18은 관련 바이오리액터에 유체 연결되는 본 개시 내용의 제 1 음향 관류 디바이스의 도면으로서, 디바이스의 다양한 포트를 관련 바이오리액터에 유체 연결하는 복수의 호스, 및 디바이스의 유출구 포트를 관련 바이오리액터에 유체 연결하는 유출 펌프를 도시한다.
도 19는 제 1 트랜스듀서와 제 2 트랜스듀서 사이의 음향 챔버 내의 반사기를 도시하는, 도 5의 또 다른 음향 관류 디바이스의 도면이다. 유체 매질이 또한 디바이스 내에 존재하며 화살표는 반사기와 제 1 트랜스듀서와 제 2 트랜스듀서 사이의 음향 필드를 나타내는 파와 더불어 유동의 방향을 나타내는 것으로 도시된다.
도 20은 2 개의 상이한 관류액/공급 속도에서 하나의 실험을 위해 유체 매질로부터 세포를 제거하는 효율을 도시한 그래프이다.
도 21은 실험을 위한 채취 유동 (관류액으로도 언급됨) 탁도 감소를 도시한 그래프이다.
도 22는 도 20 내지 도 21의 그래프에 대해 수행된 실험에 대한 다양한 유속에 대한 세포 생존력을 도시한 그래프이다.
도 23은 또 다른 실험을 위한 다양한 유속 및 유동 방법에 대한 총 세포 밀도 및 세포 보유를 도시한 그래프이다.
도 24는 도 23의 그래프에 대해 수행된 실험에 대한 다양한 유속에 대한 세포 생존력을 도시한 그래프이다.
도 25는 또 다른 실험을 위해 다양한 수의 초음파 트랜스듀서에 대한 총 세포 밀도 및 세포 보유를 도시한 그래프이다.
도 26은 도 25의 그래프에 대해 수행된 실험을 위해 다양한 수의 초음파 트랜스듀서에 대한 세포 생존력을 도시한 그래프이다.
도 27은 테스트된 또 다른 음향 관류 디바이스의 사진이다.
도 28은 관류 유속 또는 트랜스듀서 전압이 세포 보유에 미치는 영향을 도시한 그래프이다.
도 29a는 디바이스로 들어가는 공급물 스트림 (feed stream)의 입자의 ViCell Cell Analyzer로부터의 현미경 이미지이다. 공급물 스트림은 CHO 세포, 단백질 및 세포 단편을 함유하는 바이오리액터 유체이다. 도 29b는 공급물의 입자 직경 분포의 그래프로서, 2 모드 (bimodal) 분포를 나타낸다. 도 29b에서, y 축은 10 간격으로 0으로부터 200까지의 입자 수이다. x 축은 2의 간격으로 6으로부터 50까지의 미크론 단위의 입자 직경이다. 총 입자 수는 5539이고, 평균 입자 크기는 16.78 미크론, 표준 편차는 6.76 미크론, 모드 입자 크기는 10.56 미크론이다.
도 30a는 디바이스를 빠져나가는 관류액 (또는 정화된 채취 유동)의 현미경 이미지이다. 도 30b는 매우 작은 크기의 단일 모드 분포를 보여주는 관류 액의 입자 직경 분포의 그래프이다. 도 30b에서, y 축은 20 간격으로 0 내지 300의 입자 수이다. x 축은 2의 간격으로 6으로부터 50까지의 미크론 단위의 입자 직경이다. 총 입자 수는 2919이며, 평균 입자 크기는 10.08 미크론, 표준 편차는 3.75 미크론, 모드 입자 크기는 8.99 미크론이다.
도 31은 도 27의 디바이스 내의 속도 분포를 도시한 CFD 모델이다. 스케일 상단의 텍스트는 "x10-2"이라고 읽는다. 스케일의 상단에 있는 상향 삼각형의 텍스트는 "0.678"이라고 읽는다. 스케일의 하단에 있는 하향 삼각형의 텍스트는 "0"이라고 읽는다. 삼각형은 주어진 스케일에 대해 이 도면에서 표시된 최대 값 및 최소 값을 보여준다. 스케일은 0.5 간격으로 0으로부터 5m/s까지 진행되며 흑색은 스케일의 상단에 5를 표시하고 백색은 스케일의 하단에 0을 나타낸다.
도 32는 유동 경로, 음향 필드 및 음향 에지 효과를 도시하는, 도 27의 디바이스의 정면도이다.
도 33은 도 27의 음향 관류 디바이스를 2 개의 동작 모드로 도시한 합성 사진이다. 좌측 상에서, 디바이스는 시동 또는 세포 정착 모드에 있다. 우측 상에서, 디바이스는 안정된 세포 보유 모드에 있다.
도 34는 세포 보유에 사용된 음향 디바이스의 모델 시뮬레이션의 기하학적 구조를 도시한다. 상기 모델에는 두 개의 유체가 들어 있는데, 하나는 음향 필드 내에서 정화된 유체이고, 다른 하나는 음향 필드의 좌측에 높은 세포 밀도의 유체, 압전 트랜스듀서, 강철 반사기 및 알루미늄 하우징이다. 제 1 유체는 음향 필드 내의 물이었고 제 2 유체는 음향 필드의 바깥쪽 (좌측)의 수용액에서 15 % 농도의 CHO 세포이었다. 모델의 청색 실선은 두 유체 사이의 분리선을 나타낸다.
도 35a, 35b 및 35c는 압전 물질, 알루미늄 하우징 및 강철 반사기의 변위를 도시하는 그래프 (좌측 스케일)이며; 그리고 동작의 여러 주파수에서 도 34의 모델 시뮬레이션의 두 유체에서의 음향 압력 (우측 스케일)을 도시한다. 도 35a는 2.218MHz의 주파수에 있다. 도 35b는 2.2465MHz의 주파수에 있다. 도 35c는 2.3055MHz의 주파수에 있다. 세 그래프 모두의 경우, 좌측 스케일은 스케일 상단에 "x10-6" 또는 "x10-7"로 읽혀지는 텍스트로 표시되고 인치 단위이다. 우측 스케일은 스케일의 상단에 "x106"로 읽혀지는 텍스트로 표시되며 파스칼 단위이다. y 축은 0.2 간격으로 -0.8로부터 1.6까지 진행된다. x 축은 0.5 간격으로 -0.5로부터 1.5까지 진행된다.
도 36은 몇몇 동작 주파수로, 부유된 CHO 세포에 작용하는 전력 (N/W)에 의해 표준화된 평균 측 방향 힘 (N/W) 및 평균 측 방향 힘 (lateral force, N)을 도시한 그래프이다.
도 37은 본 개시 내용의 음향 관류 디바이스의 사진 (상부도)이다. 화살표는 유입구 포트로의 유동; 유출구 포트 외부로의 유동; 디바이스의 상부 외부로의 정화된 유체 유동 및 디바이스의 바닥 외부로의 농축물 유동을 나타낸다.
도 38은 도 37의 음향 관류 디바이스의 사진 (측면도)이다.
도 39는 도 37의 디바이스에 대한 세포 보유율 대 관류액 유속의 그래프이다.
도 40은 직접 유동 여과 (direct flow filtration, DFF) 및 접선 방향의 유동 여과 (tangential flow filtration, TFF)를 도시한 종래 기술 예이다
도 41은 세포가 포획되고, 무리를 이루고 (clustered), 채취 스트림으로부터 분리되는 관류 동안의 제 1 동작 모드를 도시한 사진이다. 디바이스는 중력의 방향을 나타내는 화살표와 함께 수직으로 동작된다.
도 42는 세포가 음향 정재파 필드에 진입하는 것을 방지하면서 더 작은 입자가 상기 필드를 통과하여 채취 스트림으로 통과하는 것을 허용하는 관류 동안의 제 2 동작 모드를 도시하는 사진이다. 디바이스는 중력의 방향을 나타내는 화살표에 따라 수직으로 동작된다.
본 개시 내용은 원하는 실시예들 및 그에 포함된 예시들에 대한 다음의 상세한 설명을 참조함으로써 보다 쉽게 이해될 수 있다. 다음의 명세서 및 하기의 청구 범위에서, 다음의 의미를 가지는 것으로 정의되는 다수의 용어가 참조될 것이다.
명료성을 위해 하기의 설명에서 특정 용어들이 사용되지만, 이들 용어들은 도면들의 예시를 위해 선택된 실시예들의 특정 구조만을 언급하고자 하는 것이며, 그리고 본원의 권리 범위를 정의하거나 제한하려는 것은 아니다. 이하의 도면 및 이하의 설명에서, 동일한 번호는 유사한 기능의 구성요소들을 지칭하는 것으로 이해되어야 한다.
단수 형태 ("a", "an" 및 "the")는 문맥이 명확하게 달리 지시하지 않는 한 복수 대상을 포함한다.
용어 "포함하는 (comprising)"은 명명된 구성요소들의 존재를 요구하고 다른 구성요소들의 존재를 허용하는 것으로 본 명세서에서 사용된다. 용어 "포함하는"은, 단지 명명된 구성요소들의 존재를, 명명된 구성요소의 제조에 기인할 수 있는 임의의 불순물과 함께, 허용하는 용어 "구성되는 (consisting of)"를 포함하는 것으로 해석되어야 한다.
수치는, 값을 결정하기 위해, 동일한 유효 숫자의 수로 감소될 시에 동일한 수치, 및 본 출원에 기술된 유형의 종래의 측정 기술의 실험 오차 미만으로 명시된 값과는 상이한 수치를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
본 명세서에 개시된 모든 범위는 인용된 종점을 포함하고 독립적으로 조합할 수 있다 (예를 들어, "2 그램 내지 10 그램"의 범위는 종점, 2 그램 및 10 그램, 및 모든 중간 값을 포함함). 본 명세서에 개시된 범위 및 임의의 값의 종점은 정확한 범위 또는 값으로 제한되지 않으며; 이들은 범위 및/또는 값을 근사하는 값을 포함하기에 충분히 부정확하다.
수량과 관련하여 사용되는 수식어 "약"은 명시된 값을 포함하며 문맥에 따라 결정되는 의미를 가진다. 범위의 문맥에서 사용될 시, 수식어 "약"은 또한 두 종점의 절대 값에 의해 정의된 범위를 개시하는 것으로 고려되어야 한다. 예를 들어 "약 2 내지 약 10"의 범위는 또한 "2 내지 10"의 범위를 개시한다. 용어 "약"은 표시된 숫자의 플러스 또는 마이너스 10 %를 의미할 수 있다. 예를 들어, "약 10 %"는 9 % 내지 11 %의 범위를 나타낼 수 있으며, "약 1"은 0.9-1.1을 의미할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 많은 용어가 상대적인 용어라는 점에 유의해야 한다. 예를 들어, 용어 "상부" 및 "하부"는 위치에서 서로에 대해 상대적이며, 즉, 상부 구성요소는 주어진 배향에서 하부 구성요소보다 높은 높이에 위치하지만, 디바이스가 뒤집힌 경우에 이들 용어들은 변경될 수 있다. "유입구" 및 "유출구" 용어는 주어진 구조체와 관련하여 이들을 통과하여 유동하는 유체에 관한 것이고, 즉, 유체는 유입구를 통해 구조체로 유동하고 유출구를 통해 구조체 밖으로 유동한다. 용어 "상류" 및 "하류"는 유체가 다양한 구성요소를 통해 유체가 유동하는 방향에, 즉 하류 구성요소를 통해 유동하기 전에 상류 구성요소를 통과하는 유동 유체에 관련된다. 루프에서, 제 1 구성요소는 제 2 구성요소의 상류 및 하류 둘 다로 기술될 수 있음을 유의하여야 한다.
용어 "수평" 및 "수직"은 절대 기준, 즉 지면 레벨에 대한 방향을 나타내기 위해 사용된다. 그러나, 이들 용어는 구조체이 절대적으로 평행하거나 절대적으로 서로 수직이 되도록 요구하는 것으로 해석되어서는 아니되어야 한다. 예를 들어, 제 1 수직 구조체 및 제 2 수직 구조체는 반드시 서로 평행할 필요는 없다. 용어 "상부" 및 "바닥" 또는 "기저부"는 상부가 절대 기준, 즉 지구 표면에 대해 바닥/기저부보다 항상 높은 표면을 지칭하는데 사용된다. "상부 방향 "하부 방향"이라는 용어는 또한 절대 기준에 관한 것이다; 상부 방향은 항상 지구의 중력에 대항한다.
본 출원은 "동일한 자릿수 (the same order of magnitude)"를 언급한다. 보다 큰 수를 보다 작은 수로 나눈 몫이 10보다 작은 값인 경우, 두 개의 수가 동일한 자릿수로 나타난다.
바이오리액터는 재조합 단백질이나 모노 클론 항체와 같은 생체 분자를 만드는데 유용하다. 매우 일반적으로, 세포는 원하는 생성물을 생산하기 위해 배지를 갖는 바이오리액터 베슬 (vessel)에서 배양되고, 그 후에 본 개시 내용의 디바이스와 같은 음향 관류 디바이스에서 세포 및 배지로부터 분리되어 원하는 생성물을 채취한다. 음향 필터링 디바이스는 일부 원하는 생성물, 배지의 작은 부분, 및 세포보다 작은 세포 단편/잔해를 회수하고, 나머지는 바이오리액터 (특히 세포)로 다시 재순환시킨다. 중국 햄스터 난소 (Chinese hamster ovary, CHO), NS0 하이브리도마 (hybridoma) 세포, 아기 햄스터 신장 (baby hamster kidney, BHK) 세포, 곤충 세포 및 인간 세포 (예컨대, T-세포, B-세포, 줄기 세포, 적혈구)를 포함한 포유동물 세포 배양물, 및 살아있는/생물학적 세포의 사용은 일반적으로 의약품 또는 백신과 같은 다양한 용도에 사용되는 재조합 단백질 및 모노 클론 항체를 생산/발현하는 매우 효과적인 방식인 것으로 입증되었다. 바이오리액터 과정의 두 가지 일반적인 유형이 있다: 유가식 및 관류
많은 과학자와 기술자들에게 과정의 친숙함 때문에 주로 유가식 리액터가 현재 표준이지만, 관류 기술은 매우 빠른 속도로 성장하고 있다. 주로 연속 생산에 도움이 되기 때문에 많은 요인이 관류 바이오리액터 과정의 사용을 선호하다. 관류 바이오리액터의 자본 및 창업 비용은 더 적고, 더 작은 상류 및 하류 용량이 필요하며, 처리량은 더 높을 수 있고 과정은 연속적이며 과정은 유가식 방법보다 적은 볼륨 및 소수의 시드 단계를 사용한다. 관류 바이오리액터 과정 그 자체는 또한 개발, 규모 확장, 최적화, 파라미터 민감성 연구 및 유효성 검사에 더 적합하다.
관류 바이오리액터는 또한 세포 요법 과정에서 이용될 세포를 생성 시키는데 이용될 수 있다. 이러한 유형의 관류 바이오리액터에서, CAR T-세포, Jurkat T-세포 등과 같은 생물학적 세포는 관류 바이오리액터에서 배양된다. 본 개시 내용의 관류 디바이스에 사용되는 음향 정재파는 트랜스펙션 처리 (transfection process) 이후에 생존 가능한 세포와 생존할 수 없는 세포를 분리하는데 사용될 수 있다. 이는, 단지 생존 가능한 세포가 이용됨에 따라, 이러한 T-세포 요법으로 환자 접종의 개선된 효능을 허용한다. 생존할 수 없는 세포 및 세포 단편은 관류 과정을 통해 분리되며, 이들 물질은 2 차 유동으로 나가고 바이오리액터를 빠져나간다.
관류 바이오리액터 기술의 최근 개발은 또한 그 사용을 선호한다. 관류 바이오리액터에 대한 제어 기술 및 일반 지원 장비가 향상되어 관류 과정의 견고성이 향상된다. 관류 과정은 이제 최대 1000 리터 (L)의 볼륨을 가진 바이오리액터로 확장될 수 있다. 관류 바이오리액터의 세포 보유 시스템을 개선하면 이전에 비해 세포 손실이 적고 세포 밀도가 높아질 수 있다. 50 백만 cells/mL 초과의 세포 밀도는 약 20 백만 cells/mL의 유가식 세포 밀도에 비해, 이제 달성 가능하다. 더 낮은 오염 및 감염률은 관류 바이오리액터의 생산량을 향상시킨다. 이로써, 관류 과정에 대해, 비용의 상당한 증가 없이, 채취에서의 생성물 농도가 더 높아지며 수율도 보다 양호해지는 결과를 얻는다.
관류 바이오리액터는 특히 발현 세포 배양물로부터의 생체 분자의 연속 생산 및 채취 이전 과정에서의 상기 생체 분자의 더 짧은 체류 시간으로 인해 매력적이다. 발현된 생체 분자가 관류 바이오리액터로부터 추출되는 동안, 접선 유동 여과 (TFF) 또는 교호의 접선 유동 여과 (ATF)와 같은 여과 과정에 의해 표적 세포가 다시 보유된다. 세포는 그 후에 바이오리액터로 되돌아가 전체 세포 배양물의 생산을 유지하기 위해 영양 및 산소를 확실히 받는다. 관류 리액터 과정에서, 세포가 증식을 계속하므로 관류 생산 과정 전반에 걸쳐 세포 배양물 개체의 일부를 빼낼 필요도 있다.
여과의 TFF 및 ATF 과정은 (특히 높은 세포 밀도에서의) 생체 분자 생성물의 막힘/부착 및 손실과 같은 여러 문제를 가지고 있으며, 여과에 사용되는 중공 사막 방식 (hollow fiber membranes)의 특성과 모두 직접적인 관련이 있다. 그러므로, 원하는 생체분자 생성물의 손실을 최소화하고 막히지 않는 새로운 여과 과정을 발견하는 것이 바람직하다. 추가적으로, TFF 및 ATF는 바이오리액터 내에 모든 세포 잔해 및 미립자를 보유하게 되어, 바람직하지 않다. 그러므로, 세포 잔해 및 미립자의 통과를 허용하면서 세포 보유를 구별할 수 있는 과정이 유리할 수 있다.
요약하면, 본 개시 내용은 하나 이상의 압전 트랜스듀서로부터 다-차원의 음향 정재파(들)를 생성할 수 있는 음향 관류 디바이스에 관한 것으로, 상기 트랜스듀서는 진동의 "피스톤" 모드보다는 오히려 다중 모드 변위 패턴 (multi-mode displacement pattern)으로 이동하도록 전기적으로 이루어진다. 이러한 방식의 음향 정재파 생성을 통해, 압전 트랜스듀서가 하나의 큰 정재파만 생성되는 "피스톤" 모드에서 여기되는 경우보다 높은 측 방향 포획력이 생성된다. 이로써, 압전 트랜스듀서에 동일한 입력 전력으로, 다-차원 음향 정재파는 평면 음향 정재파에 비해 더 높은 측 방향 포획력을 가질 수 있다. 입력 전력은 제어된 유동에 대해 조정 가능하다. 이는 바이오리액터로부터 비롯된 유체 스트림의 단백질성 유체 정화를 용이하게 하는데 사용될 수 있다. 대안적으로, 음향 정재파는 또한 압전 트랜스듀서가 피스톤 모드에서 여기되어 평면 파를 생성하는 평면 정재파일 수 있다. 음향 정재파(들)는 또한 평면 및 다-차원의 음향 정재파의 조합일 수 있다. 이들 모든 정재파는 바이오리액터로부터의 세포가 다시 유지되고, 세포, 세포 단편 및 작은 잔해로부터 발현되는 생체분자 생성물이 통과할 수 있도록 "에지 효과 (edge effect)"를 생성하다.
음향 영동 (acoustophoresis)은 유체 분산으로부터 입자 분리에 대한 저전력, 무-압력-강하 (no-pressure-drop), 방해가 없는 고체 상태 접근법이다 (즉, 이는 다공성 필터로 보다 통상적으로 수행되는 분리를 달성하는데 사용되지만, 필터의 단점을 전혀 가지고 있지 않다). 특히, 본 개시 내용의 음향 관류 디바이스는 높은 유속을 갖는 유동 시스템에서의 분리를 위한 대규모 스케일 (macro-scale)의 바이오리액터와 함께 사용하기에 적합하다. 상기 음향 관류 디바이스는 고밀도 다-차원 초음파 정재파를 생성하여 낮은 유속에서 유체 드래그 및 부력 또는 중력의 결합 효과를 극복할 수 있는 음향 방사력을 초래하도록 설계된다. 결과적으로, 방사력은 표적 입자 (예컨대, 생물학적 세포)가 정재파의 평면을 가로지르는 것을 방지하는 필터로서 작용한다. 전술한 바와 같이, 정재파의 포획 능력은, 예를 들어, 유체의 유속, 음향 방사력 및 포획 및 침강을 통한 세포 보유를 최대화하기 위한 음향 필터링 디바이스의 형상을 변화시킴으로써 원하는 대로 변화될 수 있다. 이 기술은 에너지 비용을 크게 낮추면서 2 차 단계 (phases) 분리를 위한 친환경적이고 (green) 지속 가능한 대안을 제시한다. 우수한 입자 분리 효율은 1 미크론만큼 작은 입자 크기에 대해 입증되었다.
일반적으로, 입자로부터의 음향 필드의 산란은 3 차원 포착 필드로서 작용하는 3 차원 음향 방사력을 초래한다. 음향 방사력은 입자가 파장에 비해 작을 시에 입자 볼륨 (예컨대, 반경의 큐브)에 비례한다. 이는 주파수 및 음향 대조 인자에 비례한다. 또한, 음향 에너지 (예컨대, 음향 압력 진폭의 제곱)에 따라 스케일링된다. 고조파 여기의 경우, 힘의 정현파 공간 변화는 입자를 정재파 내의 안정된 위치로 유도한다. 입자에 작용하는 음향 방사력이 유체 항력 (drag force) 및 부력/중력의 결합 효과보다 강할 시에, 입자는 음향 정재파 필드 내에서 포획된다. 포획된 입자에 대한 측 방향 및 축 방향 음향 힘의 작용은 강화된 중력 (숙주 유체보다 더 무거운 입자) 또는 부력 (숙주 유체보다 가벼운 입자)을 통해 침강하는 입자의 농도, 응집 및/또는 합체를 통해 단단하게 팩킹된 무리의 형성을 초래한다. 추가적으로, Bjerkness 힘과 같은 2 차 입자-간 힘은 입자 응집에 도움을 준다.
대부분의 생물학적 세포 유형은 세포가 부유된 배지보다 높은 밀도와 낮은 압축률을 나타내어 세포와 배지 사이의 음향 대조 인자가 양수 값을 가진다. 결과적으로, 축 방향 음향 방사력 (ARF)은 세포를 정재파 압력 노드를 향해 유도한다 (drive). 음향 방사력의 축 방향 성분은 양의 대조 인자로 세포를 압력 노드 평면으로 유도하는 반면, 음의 대조 인자를 갖는 세포 또는 다른 입자는 압력 앤티-노드 평면 (pressure anti-nodal planes)으로 유도된다. 음향 방사력의 반경 방향 또는 측 방향 성분은 세포를 포획하는 힘이다. ARF의 반경 방향 또는 측면 방향 성분은 유체 항력과 중력의 결합 효과보다 크다. 작은 세포 또는 에멀전의 경우, 항력 FD는 다음과 같이 나타낼 수 있다:
여기서 Uf 및 Up은 유체 및 세포 속도, Rp는 입자 반경, μf 및 μp는 유체 및 세포의 동적 점성이며, 동적 점성의 비율이다. 부력 FB은 다음과 같이 표현된다:
다-차원의 초음파 정재파에 포획될 세포의 경우, 세포 상의 힘 밸런스가 0이어야하며, 그러므로 측 방향 음향 방사력 FLRF에 대한 식은 다음과 같이 주어진 것으로 발견될 수 있다:
알려진 크기 및 물질 속성의 세포 및 주어진 유속에 대해, 이 식은 측 방향 음향 방사력의 크기를 추정하는데 사용될 수 있다.
음향 방사력을 계산하는 데 사용되는 이론적 모델은 Gor'kov가 개발 한 공식을 기반으로 한다. 1 차 음향 방사력 FA은 필드 포텐셜 U, 
이며,
여기서 필드 전위 U는 다음과 같이 정의된다:
f1 및 f2는 다음과 같이 정의된 모노폴 (monopole) 및 다이폴 (dipole) 기여이며
여기서 ρ는 음향 압력이고, u는 유체 입자 속도이고, Λ는 세포 밀도 ρp 대 유체 밀도 ρf의 비율이고, σ는 세포 사운드 속도 cp 대 유체 사운드 속도 cf의 비율이고, Vo는 세포 볼륨이며, 그리고 <>는 파동의 기간에 걸친 평균 시간을 나타낸다.
Gor'kov의 이론은 유체 및 입자의 사운드 필드의 파장에 대해 작은 입자 크기에 제한되며, 그리고 유체 및 입자의 점성이 방사력에 미치는 영향도 고려하지 않는다. 파장에 대한 입자 크기에 대한 임의의 제한 없이, 입자에 대한 음향 방사력을 계산하기 위한 추가적인 수치 모델이 개발되어 왔다. 이 모델은 또한 유체 및 입자 점성의 영향을 포함하므로 음향 방사력을 보다 정확하게 계산한다. 구현된 모델은 AIP Conference Proceedings, Vol. 1474-1, pp. 255-258 (2012)에서 기술된 Yurii Ilinskii 및 Evgenia Zabolotskaya의 이론적인 작업을 기반으로 한다.
바람직하게는, 초음파 트랜스듀서(들)는 축 방향 힘을 수반하기 위해 부유된 입자에 측 방향 힘을 가하는 다-차원 정재파를 유체 내에 생성한다. 문헌에 공개된 통상적인 결과에 따르면 측 방향 힘은 축 방향 힘보다 두 자릿수가 작다. 반대로, 본 출원에 개시된 기술은 측 방향 힘이 축 방향 힘과 동일한 자릿수를 제공한다. 그러나, 본 명세서에 추가로 기술된 소정의 실시예에서, 상기 디바이스는 다-차원 음향 정재파를 생성하는 트랜스듀서 및 평면 음향 정재파를 생성하는 트랜스듀서를 사용한다. 본 개시 내용의 목적을 위해, 측 방향 힘이 축 방향 힘과 동일한 자릿수가 아닌 정재파는 "평면 음향 정재파 (planar acoustic standing wave)"로 고려된다. 본 개시 내용의 초음파 트랜스듀서(들)에 의해 생성된 총 음향 방사력 (ARF)의 측 방향 힘 성분은 상당하고, 최대 1cm/s 선형 속도에서 유체 항력을 극복하고 단단하게 팩킹된 무리들을 생성하기에 충분하며, 그리고 총 음향 방사력의 축 방향 힘 성분과 동일한 자릿수를 가진다.
본 개시 내용의 기술을 종래의 여과 기술의 기술과 대비시키는 것이 도움이 될 수 있다. 도 40은 두 가지 종래 기술의 여과 방법을 도시한다. 도 40의 좌측은 직접 유동 여과 (DFF)를 도시한다. DFF에서, 유체 및 입자의 전체 공급물 스트림 (4005)은 필터를 향해 안내된다. 필터 (4010)는 필터의 간극 크기 (pore size)보다 큰 입자 (4020)를 저지하는 반면, 더 작은 입자 (4030) 및 유체는 필터를 통과한다. 도 40의 우측은 접선 유동 여과 (TFF)를 도시한다. TFF에서, 공급물 스트림은 필터를 향해 안내되지 않는다. 오히려, 공급물 스트림은 필터의 접선 방향을 향하여 안내되고, 그 결과 공급물 스트림의 대부분은 필터 표면 위로 접선 방향으로 통과한다. 통상적으로, 이러한 공급물 스트림은 필터에 의해 한 번보다 많이 통과하도록 재순환된다. 훨씬 더 작은 여액 스트림 (filtrate stream, 4006)은 더 작은 입자들 (4030)을 함유하는 필터 멤브레인을 통해 당겨진다. DFF에 비해 TFF의 한가지 이점은 접선 방향 스트림이 필터의 막힘 및 부착을 감소시키고 필터의 상부 상에 있는 겔 층의 형성을 감소시킨다는 것이다.
본 개시 내용의 디바이스에서, 시동 중에, 음향 정재파에 의해 음향이 채워진 (ensonified) 유체는 세포를 포획하고 이를 단단하게 팩킹된 무리로 성장 시키고, 그 결과 세포 무리의 연속적인 중력 분리가 일어나는 과정에 의해 정화된다. 이러한 볼륨으로 흘러들어 가는 제한된 양의 새로운 세포가 있기 때문에, 이는 음향 정재파를 받는 유체를 빠르게 정화시키는 것을 초래한다. 이러한 상태에 도달할 시에, 시스템은 다음의 2 개의 유체를 포함하는 것으로 기술될 수 있다: 원하는 생성물 및 작은 세포 단편/잔해물 (음향 정재파를 통과함)을 함유하는 제 1 유체, 및 바이오리액터 유체 및 세포 모두 (음향 정재파에 의해 저지됨)를 함유하는 제 2 유체를 포함하는 것으로 기술될 수 있다. 2 개의 유체는 상이한 유효 음향 특성, 이를테면 사운드 속도 및 밀도를 가질 수 있으며, 이때 이 2 개의 유체 간의 계면은 잘 정의된다. 계면은 일반적으로 음향 정재파 필드의 하부 에지 근방에 위치하여 "음향 에지 효과"를 생성한다. 제 1 유체 (즉, 정화되며, 생성물, 일부 세포 및 세포 단편을 함유하는 유체)는 계면의 하류에 있고, 채취 유동을 나타내며, 음향 정재파 필드에 의해 음향이 채워진 유체의 볼륨을 차지한다. 제 2 유체 (즉, 바이오리액터 유체 및 대부분의 세포를 함유하는 유체)는 계면의 상류에 있다. 이 두 가지 상이한 유체는 도 33에서 볼 수 있다.
음향 정재파 필드는 두 유체 사이의 계면 상에서 음향 방사 압력 (즉, 압력 상승) 및 음향 필드의 음향 에지에서 힘을 가하여 상류 세포가 음향 필드에 들어가는 것을 방지한다. 계면 상에서의 방사 압력 및 힘의 발생은 생성물을 함유하는 제 1 유체가 계면을 통과하면서 상류 유체에 세포를 보유하도록 한다. 두 유체 사이의 계면에서 음향 방사력의 영향에 의해 저지된 세포는 바이오리액터로 연속적으로 되돌아가서, 영양 및 산소를 받아서 전체 세포 배양물의 생산을 유지하도록 하는 것을 확보할 수 있다.
계면 아래의 유동 필드의 순환 모션은 음향 필드에 의해 보유된 세포를 바이오리액터로 다시 이송시킨다. 순환 유동 모션은 1 차 재순환 유동에 의해 유도되며, 최대 시스템 효율을 위해 음향 챔버의 기하학적 구조 변화로 최적화될 수 있다. 이는 하기의 도 33과 관련하여 아래에서 더 자세히 논의될 것이다.
관류 중에, 본 개시 내용의 음향 관류 디바이스는 다수의 가능한 동작 모드를 가진다. 이들 모드 중 하나는 디바이스 내에서 지배적일 수 있거나, 또는 이들은 디바이스 내의 세포 및 유체의 분포에 따라 동시에 일어날 수 있다. 도 41에 도시된 제 1 동작 모드 (모드 1)에서, 유체 함유 세포 (4020) (밝은 색)는 여기에서 트랜스듀서 (4008)와 반사기 (4009) 사이에서 생성되는 음향 정재파 필드 (4040)에 들어간다. 다-차원 음향 정재파는 특정 지점에서 세포를 포획하고, 세포를 단단하게 팩킹된 무리 (4022)로 팩킹하고, 강화된 중력 침강을 통해 연속적으로 무리를 분리시킨다. 세포 무리는 정착되어, 접선 방향의 유동 경로 (화살표 4001로 표시됨)로 들어가고, 재순환 스트림에 의해 바이오리액터로 방향이 바뀐다. 더 작은 입자 (4030) (어두운 색)은 음향 정재파에 의해 포획되지 않고, 상기 음향 정재파를 통과하여 채취된다. 채취 유동 방향은 화살표 (4002)로 표시된다. 이러한 디바이스의 배향은 중요하고, 중력의 방향도 표시된다.
제 2 동작 모드 (모드 2)는 도 42에 도시되어 있으며, 여기서 음향 영동 시스템은 세포에 대한 강한 장벽을 생성하고 세포가 음향 필드로 들어가는 것을 방지한다. 여기에서, 세포의 장벽은 음향 정재파의 에지 효과를 통해 두 유체 사이에 확보된다. 제 1 정화 유체 스트림 (4050)은 음향 정재파 필드 및 채취 스트림 내에서 더 작은 입자/원하는 부산물 (4030)을 함유한다. 제 2 유체 스트림 (4055)은 음향 정재파 필드의 상류에 보유된 세포 (4020)를 함유한다. 채취 유동 방향은 화살표 (4002)로 표시된다. 이러한 동작 모드에서, 음향 에지 효과 (점선 (4007)으로 표시됨)가 실현된다. 매우 일반적으로, 음향 에지 효과는 세포를 다시 보유하고 이를 음향 필드로 들어가는 것을 방지하는 반면, 생성된 생체 분자 및 세포 단편을 함유하는 유체 스트림의 일 부분이 음향 에지에 의해 생성된 장벽을 통과하도록 허용된다. 음향 에지 아래의 접선 방향의 유동 경로 (화살표 4001)는 보유된 세포를 모으고 이를 주요 재순환 스트림으로 다시 흐르게 하고, 다시 바이오리액터로 흐르게 한다. 이는, 또한, 도 32를 참조하여 이하에서 더 논의될 것이다. 다시, 중력의 방향이 표시된다.
관류 응용에서, 음향 영동 디바이스의 셋업은 TFF의 것과 유사하다. 세포, 세포 잔해, 미립자 및 생성물, 즉 단백질을 함유하는 공급물 스트림은 바이오리액터로부터 관류 시스템으로 유동한다. 스트림의 일 부분은 음향 정재파의 하부 에지를 따라 접선 방식으로 흐르고, 바이오리액터로 재순환된다. 공급물 스트림의 보다 작은 부분이 채취되고, 즉 전환되고, 음향 정재파를 통해 흐른다. 여기서, 음향 정재파는 TFF의 필터와 매우 유사하게 기능하여, 세포가 음향 필드로 들어가는 것을 방해한다. 채취 스트림은 원하는 생체 분자 생성물뿐만 아니라 세포 잔해 및 미립자와 같은 더 작은 입자를 함유한다. 음향 정재파에 의해 보유되는 세포는 재순환 스트림에 의해 바이오리액터로 다시 이송된다. 본 명세서에 더 논의되는 도 32는 또한, 접선 유동 스트림을 사용하는 관류 디바이스를 도시한다.
관류 응용은 통상적으로 예컨대, 50 백만 cells/mL 초과한 높은 세포 밀도, 및 세포 정화 또는 오일/물 적용과는 달리 낮은 채취 속도를 수반한다. 2 개의 유체 스트림은 또한 상이한 유효 음향 속성, 즉, 배지/세포 혼합물의 사운드 속도 및 밀도를 가진다. 세포 밀도가 증가함에 따라, 두 유체 스트림의 음향 속성의 차이가 더 두드러지게 나타날 것이다. 음향 정재파 필드는 이제 세포로 채워진 제 2 유체 스트림 상의 음향 방사 압력, 즉 압력 상승뿐만 아니라, 유체에 부유된 세포 상의 음향 방사력을 가할 것이다. 이러한 방사 압력 및 방사력은 음향 필드의 상류 에지와 일치하는 두 유체 사이의 계면에서 작용하다. 음향 방사력의 이러한 "음향 에지" 효과가 충분히 강할 시에, 세포가 음향 필드로 들어가는 것은 방지될 것이다. 보유된 세포를 모으고 다시 이를 바이오리액터로 이송하기 위한 접선 방향의 유동 경로가 동등하게 중요하다.
음향 에지 효과는 또한 음향 벽 효과로 지칭되고, 강한 측 방향 힘을, 즉 채취 유동 방향으로 가하고 부유된 입자 상에서 음향 정재파의 축에 수직한 음향 필드의 에지에 기인하고, 이로 인해 상대적으로 더 큰 크기의 입자가 음향 필드에 들어가는 것을 방지하고 정화된 유체 (즉, 더 작은 크기의 생성물을 함유한 유체)만이 음향 필드로 들어가는 것을 허용하여, 음향 관류 세포 보유 디바이스를 생성할 수 있다. 이러한 방식으로, 정화된 유체만이 빠져나갈 수 있고, 세포는 방사력에 의해 억제된다. 이 힘은 절대 양 (positive)이 아니며, 이는 항상 세포를 계면에서 억제한다는 것, 즉, 힘이 상류 유동 방향으로 작용하여 이를 음향 에지로부터 벗어나는 것을 허용하지 않음을 의미한다. 전력 곡선의 다수의 피크 (아래 도 37의 논의 참조)는 평면 공진 모드 및 다-차원 동작 모드를 포함하여, 다수의 모드 동작이 있음을 보여 주며, 평면 및 다-차원 정재파 등의 활용을 통해 이러한 유형의 동작이 생성될 수 있음을 나타낸다. 1"x1" 치수를 가진 시스템에서, 약 30kHz마다 평면 공명이 존재한다. 도 37은 다-차원 모드의 존재를 나타내는 추가 피크의 증거를 보여준다. 단위 전력당, 이러한 모드는 평면 공진 모드와 동등하거나 심지어 더 나은 효과를 가질 수 있다. 전술한 바와 같이, 음향 방사력에 의해 저지된 세포는 그 후에 유동 필드 (즉, 계면 아래의 재순환 유동)의 스크러빙 모션에 의해 픽업될 수 있으며, 바이오리액터로 연속적으로 되돌아가, 이들이 영양 및 산소를 받아 전반적인 세포 배양물의 생산을 유지하는 것을 확보할 수 있다.
정화된 유체는 원하는 생성물 및 세포 단편을 모두 함유하며, 이들 모두는 전체 생존 세포보다 작다. 이러한 방식으로, 바이오리액터로 되돌아가는 배지는 세포 단편을 정화시킨다. 세포 단편은 원하는 생성물을 생산함 없이 배지를 흡수하여 관류 과정의 효율을 떨어뜨린다. 이로써, 본 개시 내용의 음향 관류 디바이스를 사용하여 이들 세포 단편을 제거함으로써 얻어지는 효율 이득 및 비용 절감이 있다. 정화된 유체의 추가 정화는 더 높은 주파수에서 동작하는 또 다른 트랜스듀서-반사기 쌍을 포함하는 제 2 디바이스 또는 2 차 유동 챔버를 사용하여 하류에서 달성될 수 있다. 이는 전술한 바와 동일한 방식으로 원래 음향 정재파를 우연히 통과시킬 수 있는 약 10 미크론 이하의 크기를 가진 입자를 포획하고 응집시킨다. 여전히 더 높은 주파수, 3 MHz 내지 20 MHz에서 동작하는 또 다른 트랜스듀서-반사기 쌍은 초기 음향 정재파 및 "에지 효과"를 통과한 작은 세포 파편 및 잔해를 포획, 응집 및 이탈하는데 활용될 수 있다. 원하는 생체 분자를 함유한, 이러한 3 중 (triple) 정화된 유체는 그 후에 직접 멸균 필터에 들어갈 수 있다. 예를 들어, 원래의 음향 관류 디바이스는 최대 약 4 MHz의 주파수로 동작할 수 있다. 이러한 제 2 및 제 3 음향 정재파 필드의 주파수는 더 작은 크기의 세포 단편을 포획하기 위해 약 6 MHz 내지 약 20 MHz, 및 가능하게는 더 높을 것으로 고려된다.
낮은 세포 밀도, 예컨대, 2 백만 cells/mL에서 바이오리액터의 시동 중에, 우선 기술된 동작 모드가 우세하다 (도 33, 좌측 이미지). 바이오리액터의 세포 밀도가 시간이 지남에 따라 증가하게 될 시에, 동작 모드는 점차적으로 모드 1로부터 모드 2로 스위칭되며, 양 모드는 동시에 공존할 수 있다.
음향 정재파가 이미 세포 밀도가 높은 (예컨대, 50 백만 cells/ mL) 바이오리액터에서 관류에 사용될 시에, 디바이스는 통상적으로 음향 정재파 내의 유체의 볼륨이 정화될 때까지 제 1 동작 모드 (도 33, 좌측 이미지)에서 시작하고, 상기 정화될 시점에서 동작은 제 2 기술된 동작 모드 (도 33, 우측 이미지)로 점차적으로 스위칭된다. 때로는, 동작 중에, 두 유체 사이의 계면의 교란 또는 발진으로서 일반적으로 나타나는 불안정성은 세포가 음향 정재파 내의 유체 볼륨으로 들어가도록 충분히 강하게 성장할 수 있으며, 그 시점에서, 짧은 기간 동안, 상기 디바이스는 양쪽 모드가 작동하는 결합된 동작 모드에서 작용한다 (즉, 에지 효과는 세포가 전술한 바와 같이 음향 필드로 들어가는 것을 방지하는 반면, 음향 필드는 음향 정재파 필드 내의 유체의 볼륨에 들어가는 세포를 정화시킴). 단단하게 팩킹된 세포 무리가 일단 안정화되면 (즉, 음향 정재파 내의 유체의 볼륨이 충분히 정화된다면), 동작 모드는 음향 에지 효과를 포함하는 제 2 기술된 동작 모드의 것이 된다. 외부 스위칭 없이, 전술된 바와 같이, 디바이스가 동작 모드 둘/하나로 동작할 수 있다는 점에 유의하는 것이 중요하다. 다시 말하면, 유체 스트림의 속성, 예컨대 스트림 내의 세포 농도 및 음향 필드는 어느 모드가 지배하는지를 지시한다.
본 개시 내용의 음향 정재파(들) 관류 디바이스는 사전에 문헌에 기술된 이전의 음향 필터 사용법과 다르게 동작된다. 사전에, 음향 영동은 재조합 단백질 치료제의 산업적 생산을 위한 가장 일반적인 숙주인 중국 햄스터 난소 세포 (CHO 세포)와 같은 단백질 생산물이 초음파 정재파 내에 포획되도록 동작되었다 (즉, 정지 위치 상태). 세포는 음향 필드에서 평면 세포 음향 정재파의 압력 노드 평면을 향해 개별 세포가 이동하게 됨으로써 보유되었다. 세포가 정재파에 보유되었을 시에, 전에 유동하는 세포 배양 배지의 물리적 스크러빙이 또한 있었고, 이로써 더 많은 세포가 이미 정재파 내에 있는 세포와 접촉할 시에 상기 더 많은 세포는 포획되었다. 정재파는 그 후 간헐적으로 차단되어 세포가 정재파에서 떨어지고 바이오리액터로 되돌아갈 수 있도록 하였다.
대조적으로, 본 개시 내용에서, 초음파 정재파는 블랭킷 (blanket) 또는 선택기 또는 "힘 필드"로서 사용된다. 정재파 내에서 생물학적 세포를 포획하는 것보다 오히려, 유체는 중력이 먼저 생물학적 세포에서 작용하여 상기 세포가 가라앉게 하는 방식으로 관류 디바이스를 통해 유동한다. 정재파는 필터링 디바이스의 상부 근방에 생성되며, 세포가 음향 필드로 들어가고 필터링 디바이스의 상부를 통해 빠져나가는 것을 방지하는 필터처럼 작동한다 (즉, 세포가 음향 필드로 다시 들어가지 못하도록 하는 힘 필드와 유사하게 작동함). 이로써, 2 개의 출력 스트림이 생성되고, 하나의 출력 스트림은 세포를 보유하고, 디바이스의 바닥에 있는 포트를 통해 빠져나가고, 다른 출력 스트림은 세포에서 고갈되고 디바이스의 상부에 있는 포트를 통해 빠져나간다 (두 출력 스트림에서의 세포 농도가 서로 비교됨). 음향 필드 내에서 세포의 응집에 거의 의존하지 않으며, 이는 음향 필터링 디바이스에서 세포의 보유 시간이 필요하지 않기 때문에 소정의 응용에서 특히 유리하다.
또 다른 방식으로 기술하면, 음향 관류 디바이스는 상이한 속도로 유동하는 2 개의 유체 스트림을 가진다. 발현 세포 배양물, 배양 배지, 생성물 및 다른 바이오리액터 성분을 가진 주요 유체 스트림은 디바이스로 들어가고, 부분적으로 2 차의, 낮은 볼륨, 낮은 유동 유체 스트림으로 전환된다. 이러한 2 차 유체 스트림은 다-차원 음향 정재파를 통과하고, 상기 다-차원 음향 정재파 (또는 일반적으로 음향 정재파)는 주요 세포 배양물을 저지하고 (hold back), 발현된 생체 분자, 모노 클론 항체 및 재조합 단백질이 서브미크론 및 미크론-크기의 세포 잔해와 같은 다른 작은 입자와 함께, 바이오리액터의 외부/하류를 통과하여 추가로 수집 및 처리되도록 한다. 주요 세포 배양물을 함유한 주요 유체 스트림은 그 후에 바이오리액터로 다시 재순환된다.
또 다른 적용에서, 음향 관류 디바이스는 세포 요법 적용을 위한 보유 디바이스 및 세포 세척 디바이스로서 작동할 수 있다. 연속적인 세포-배양물 적용에서, 이를테면 자가 (autologous) 및 동종이계 (allogeneic) 세포 요법에서, 초기에 매우 낮은 세포-밀도로 채취된 세포를 정화하고, 격리하고, 그 후에 증식시키는 것이 필요하다. 상대적으로 소수의 세포가 바이오리액터에 뿌려지고, 상기 바이오리액터에서 세포 수는 증가되어야 한다. 농축, 세척 및 배지 교환과 같은 추가 과정 단계는 다양한 응용 분야에 모두 필요하다. 이러한 모든 적용 분야에서의 공통성은 생존력에 영향을 미치지 않으면서 바이오리액터 (전통적이거나 일회용일 수 있음)에 세포를 보유하면서 배지를 연속적으로 순환, 첨가 및/또는 제거할 필요가 있다는 점이다. 본 명세서에 기술된 음향 세포 보유 시스템은 일정 범위의 세포 재순환 속도에 걸쳐 동작하고, 관류 범위 (또는 배지 제거 속도)에 걸쳐 세포를 효율적으로 보유하며, 그리고 전력 또는 주파수 조작을 통해 일부 백분율의 세포를 완전히 보유하거나 선택적으로 통과시키도록 조정될 수 있다. 전력 및 유속은 모두 모니터링되고 자동 제어 시스템에서 피드백으로 사용될 수 있다. 특수 유동 경로는 또한, 소량의 주요 유체 유동이 "제거되고 (sipped off)", 발현된 생체 분자가 주요 세포 배양물로부터 분리되도록, 사용될 수 있다.
음향 영동의 하나의 이점은 음향 방사력이 생물학적 세포 또는 원하는 생체분자 생성물에 해를 미치거나 부정적으로 영향을 미치지 않는다는 것이다. 게다가, 관류는 세포 배양물이 생존 가능하도록 유지되고 원하는 생성물이 그로부터 연속적으로 회수될 수 있도록 연속적이다.
관류 바이오리액터 시스템에서, 유체 스트림 (즉, 세포 배양 배지) 및 세포 잔해에 있는 발현된 물질로부터 생존 가능한 생물학적 세포를 여과 및 분리할 수 있는 것이 바람직하다. 앞서 언급한 바와 같이, 그러한 생물학적 세포는 큰 생체분자를 발현하도록 세포 게놈이 조작되는 중국 햄스터 난소 (Chinese hamster ovary, CHO) 세포를 포함할 수 있다. 그러한 생체분자는 재조합 단백질 또는 모노 클론 항체를 포함할 수 있으며, 회수될 원하는 생성물이다.
본 개시 내용의 음향 관류 디바이스는 필터로서 작용할 수 있는 고 세기 다-차원 음향 정재파를 유지하도록 설계되어, 더 작은 입자 (이를테면, 재조합 단백질 또는 세포 전해)를 통과시키면서 더 큰 입자 (이를테면, 생존 세포)를 배제시킨다. 일반적으로, 디바이스는 발진기 및 증폭기 (미도시)에 의해 구동되며, 디바이스 성능은 컴퓨터 (미도시)에 의해 모니터링 및 제어된다. 음향 스트리밍으로 인해 때때로 정재파의 주파수 또는 전압 진폭을 변조해야 할 필요성이 있을 수 있다. 이는 진폭 변조 및/또는 주파수 변조에 의해 이행될 수 있다. 정재파의 전파의 듀티 사이클은 또한 소정의 결과를 달성하기 위해 활용될 수 있다 (즉, 음향 빔은 상이한 시간 주기 또는 속도로 턴 온 및 차단될 수 있다).
도 1은, 정재파 (102)를 형성하기 위해 공진하도록 설정된 초음파 트랜스듀서 (103) 및 반사기 플레이트 (101)로 구성된 단일 정재파 시스템 (100)을 도시한다. 통상적으로 100 kHz 내지 100 MHz 범위의 여기 주파수가 트랜스듀서 (103)에 의해 인가된다. 트랜스듀서 (103)와 반사기 (101) 사이에 하나 이상의 다-차원 정재파가 생성된다. 이상적인 정재파는, 주파수 및 세기가 같고 반대 방향으로, 즉 트랜스듀서로부터 반사기로, 다시 그 반대로 이동하는 두 개의 전파 파 (propagating waves)의 합이다. 전파 파는 구조적으로 서로 간섭하여 이로써 정재파를 생성하다. 점선 (105)은 파의 제로-진폭을 나타내기 위해 사용된다. 노드는 파가 최소 진폭을 가진 지점이며, 도면 부호 107로 표시된다. 반-노드 (anti-node)는 파가 최대 진폭을 가진 지점이며, 도면 부호 109로 표시된다.
도 2는 유가식 바이오리액터 시스템 (201) (좌측)과 관류 바이오리액터 시스템 (202) (우측)을 비교하는 개략도이다. 좌측의 유가식 바이오리액터로 시작하여, 바이오리액터 (210)는 반응 베슬 (220)을 포함한다. 세포 배양 배지는 공급물 유입구 (222)를 통해 반응 베슬로 공급된다. 교반기 (225)는 세포 배양물 전반에 걸쳐 배지를 순환시키는데 사용된다. 여기서, 교반기는 한 세트의 회전 블레이드로 도시되지만, 순환을 일으키는 임의의 유형의 시스템이 고려된다. 바이오리액터는 성장/생산 사이클을 통해 종자 (seed) 배양물의 성장을 허용하며, 성장/생산 사이클 동안, 잔해, 폐기물 및 사용 불능 세포는 바이오리액터에 축적되어 원하는 생성물 (예컨대, 생체분자, 이를테면 모노 클론 항체, 재조합 단백질, 호르몬 등)도 생산될 것이다. 이러한 축적으로 인하여, 유가식 과정의 반응 베슬은 통상적으로 관류 과정에서보다 훨씬 더 크다. 그 후에 원하는 생성물은 생산 사이클 종료 시에 채취된다. 반응 베슬 (220)은 또한 물질을 제거하기 위한 유출구 (224)를 포함한다.
이제, 다시 우측의 관류 바이오리액터 (202)를 참조하면, 바이오리액터는 세포 배양 배지용 공급물 유입구 (222)를 갖는 반응 베슬 (220)을 포함한다. 교반기 (225)는 세포 배양물을 통해 배지를 순환시키는데 사용된다. 반응 베슬의 유출구 (224)는 본 개시 내용의 음향 관류 디바이스 (230)의 유입구 (232)에 유체 연결되며, 바이오리액터 내용물 (세포 및 원하는 생성물을 함유함)을 필터링 디바이스로 연속적으로 공급한다. 관류 디바이스는 반응 베슬의 하류에 위치되고, 원하는 생성물을 세포로부터 분리한다. 음향 관류 디바이스 (230)는 두 개의 별개의 유출구, 즉 생성물 유출구 (234) 및 재순환 유출구 (236)를 가진다. 생성물 유출구 (234)는 음향 관류 디바이스 (230)를 관류 디바이스의 하류의 격납 베슬 (240)에 유체 연결시키며, 상기 격납 베슬은 관류 디바이스로부터 원하는 생성물 (배지 추가)의 유동을 수용한다. 거기로부터, 추가 처리/정제 (purification)가 원하는 생성물을 격리/회수할 수 있다. 예를 들어, 이러한 음향 관류 디바이스의 추가 하류에는 ATF, TFF, 깊이 필터, 원심 분리기 등과 같은 추가적인 필터들이 있을 수 있다. 재순환 유출구 (236)는 음향 관류 디바이스 (230)를 반응 베슬 (220)의 재순환 유입구 (226)에 다시 유체 연결시키며, 그리고 연속적인 성장/생산을 위해 반응 베슬 내로 세포 및 세포 배양 배지를 다시 보내는데 사용된다. 달리 말하면, 반응 베슬과 관류 디바이스 사이에는 유체 루프가 있다. 관류 바이오리액터 시스템 (202) 내의 반응 베슬 (220)는 생성물의 연속 처리량을 가지고, 이로써 더 작게 만들어질 수 있다. 필터링 과정은 관류 바이오리액터의 처리량에 중요하다. 열악한 필터링 과정은 단지 낮은 처리량만 허용하고, 원하는 생성물의 낮은 수율을 초래할 것이다.
도 3은 본 개시 내용의 시스템에 유용한 일반적인 바이오리액터 (300)의 단면도이다. 본 명세서에 도시된 바와 같이, 바이오리액터는 내부 볼륨 (323)을 가진 반응 베슬 (320)을 포함한다. 베슬 상부의 공급물 유입구 (322)는 세포 배양 배지를 베슬 내로 공급하는데 사용된다. 교반기 (325)가 존재한다. 유출구 (324)는 베슬의 바닥에 도시된다. 열 재킷 (310)은 반응 베슬을 둘러싸고, 세포/배지의 온도를 조절하는데 사용된다. 통풍기 (312)는 가스를 내부 볼륨에 제공하기 위해 베슬의 바닥 상에 위치한다. 센서 (314)는 베슬의 상부 우측에 도시된다. 베슬로부터 세포 배양 배지를 제거하기 위한 또 다른 펌프 (318)와 같이, 베슬 내에 세포 배양 배지를 공급하기 위한 펌프 (316)가 도시된다.
전술한 관류 시스템은 본 개시 내용의 음향 관류 디바이스를 사용한다. 바이오리액터의 내용물은 음향 관류 디바이스를 통해 연속적으로 유동하여 원하는 생성물을 포획한다.
도 4는 전술한 시스템과 함께 사용될 수 있는 음향 관류 디바이스 (400)의 제 1 실시예이다. 상기 디바이스는 유입구 포트 (410), 유출구 포트 (430), 제 1 수집 포트 (470), 바닥 벽 (420) 및 음향 챔버 (450)를 포함한다. 음향 챔버 (450)는 또한 유체 세포로 지칭된다.
유입구 포트 (410)는 디바이스의 제 1 말단부 (412)에 위치된다. 일반적으로, 유입구 포트 (410)는 관련 바이오리액터에 유체 연결되며, 그리고 세포, 미립자 및 생성물을 갖는 유체 매질이 디바이스에 도입되는 유입구의 역할을 한다. 유입구 유동 경로 (451)는 유입구 포트 (410)로부터, 내부 볼륨을 포함한 음향 챔버 (450)로 이른다. 상부 벽 (411)은 유입구 포트로부터 음향 챔버로 이르는 유입구 유동 경로 위에 존재할 수 있으며, 상부 벽은 실질적으로 수평 배향을 가진다. 유입구 유동 경로는 단면적 (452) (점선 정사각형으로 도시됨)을 가진다.
유입구 포트 (410)는 디바이스의 바닥 말단부를 한정하는 유출구 포트 (430) 위의 제 1 높이 (402)에 위치된다. 달리 말하면, 유출구 포트 (430)는 음향 챔버 (450) 아래 또는 유입구 포트 (410) 아래, 또는 디바이스의 바닥 말단부 (416)에 위치한다. 유입구 포트 (410) 아래의 유출구 포트 (430)의 설치는 디바이스를 통과하는 유체 유동이 중력에 의해 유출구 포트 (430)를 향해 수동적으로 가압되도록, 그리고 유압 헤드 (hydraulic head)가 디바이스 내에 생성되도록 한다. 유출구 포트 (430)는 또한 숙주 유체가 유출구 포트 (430)를 통해 디바이스로부터 관련 바이오리액터로 재순환되거나 회수되기 때문에, 유체 재순환 포트로도 지칭될 수 있다. 본 명세서에 도시된 바와 같이, 유출구 포트 (430)는 또한 제 1 말단부 (412)에 대향하는, 디바이스의 제 2 말단부 (414)에 위치된다. 제 1 말단부 (412) 및 제 2 말단부 (414)가 x-축의 대향 말단부들로서 간주될 수 있는 반면, 바닥 말단부 (416) 및 상부 말단부 (418)는 z-축의 대향 말단부들로서 간주될 수 있다.
제 1 수집 포트 (470)는 디바이스의 상부 말단부 (418)에서 음향 챔버 (450) 위에 위치되며, 그리고 음향 챔버에 유체 연결된다. 디바이스는 추가적인 수집 포트, 이를테면, 제 1 수집 포트 (470)로부터 이격된 제 2 수집 포트 (472)를 포함할 수 있다. 제 1 및 제 2 수집 포트 (470, 472)는 일반적으로 디바이스로부터 원하는 생체분자 부산물의 일 부분을 채취 및 회수하는데 사용된다. 수집 또는 채취 유동 경로 (453)는 음향 챔버로부터 수집 포트 (470, 472)로 이른다. 수집 유동 경로는 단면적 (454) (점선 정사각형으로 도시됨)을 가진다. 일부 특정 실시예에서, 수집 유동 경로의 단면적 (454)은 유입구 유동 경로의 단면적 (452)보다 크다. 이는, 수집 포트 (470, 472)를 통과하는 유체의 유속이 유입 유체 유속보다 매우 낮게 만들어질 수 있는 하나의 방법이다. 관류 바이오매뉴팩처링에 사용될 시에, 수집 포트는 또한 관류 또는 채취 포트로도 지칭될 수 있다. 세포에서 고갈되고 원하는 생체분자 생성물, 세포 잔해 및 다른 미립자에 풍부한 유체가 채취되기 때문에, 수집 포트는 또한 채취 포트로도 지칭될 수 있으며, 그리고 수집 유동 경로는 또한 채취 유동 경로로도 지칭될 수 있다.
이러한 실시예에서, 바닥 벽 (420)은 디바이스의 유입구 포트 (410)로부터 유출구 포트 (430)까지 연장된다. 바닥 벽 (420)의 정확한 형상은 원하는 유체 유동을 얻기 위해 변할 수 있다. 본 명세서에서 도시된 바아 같이, 바닥 벽 (420)은 디바이스의 유입구 포트 (410)로부터 유출구 포트 (430)로 곡선을 이룬다. 점선 (401)으로 도시된, 유입구 포트 (410)와 유출구 포트 (430) 사이의 라인과 관련하여, 바닥 벽 (420)은 오목한 곡선을 가진다. 유출구 유동 경로 (432)는 음향 챔버 (450)로부터 유출구 포트 (430)로 이른다.
본 명세서에서 도시된 바와 같이, 제 1 초음파 트랜스듀서 (460)는, 제 1 높이 (402) (즉, 디바이스의 상부 말단부 (418)에 더 가까움) 위에 있고 수집 포트 (470, 472) 아래에 있는 제 2 높이 (404)에서 디바이스의 측벽 (440) 상에 위치된다. 음향 챔버 (450) 위에 있고 수집 포트 (470, 472) 아래에 있는 이러한 볼륨은 여기에서 채취 또는 수집 존 (456)으로 식별된다. 제 1 초음파 트랜스듀서 (460)는, 전압 신호에 의해 구동되어 수집 유동 경로 (453)를 걸쳐 음향 챔버 (450)에서 다-차원 정재파를 생성할 수 있는 압전 물질을 포함한다. 음향 방사력 필드는 이로써, 음향 챔버 (450)를 수집 포트들 (470, 472)로부터 분리시킨다.
도 4의 실시예에서, 디바이스는 제 1 초음파 트랜스듀서 (460)와 대향하는 벽 상에 위치된 반사기 (480)를 포함한다. 반사기는 또한 제 2 높이 (즉, 트랜스듀서와 동일한 높이)에 위치된다. 이와 함께, 트랜스듀서 (460) 및 반사기 (480)는도 1에 도시된 바와 같이 다-차원의 음향 정재파를 생성한다.
유입구 포트 (410), 유출구 포트 (430) 및 수집 포트 (470, 472) 모두는 이러한 도시된 실시예에서, 디바이스의 전방 벽 (475) 상에 위치한다. 또한, 이들 포트는 원하는 대로 임의의 다른 방향으로 향할 수 있는 것으로 고려된다. 전방 벽 (475)은 평탄한 또는 평평한 면을 갖는 것으로 본 명세서에 도시되고, 일정한 두께를 가진다. 그러나, 예를 들어, 단면적 (452, 454)을 변화시키기 위해, 전방 벽의 형상은 또한 원하는 대로 변화될 수 있다. 마지막으로, 디바이스의 후방 벽은 장착 부재 (mounting piece) (490)에 부착되며, 상기 장착 부재는, 동작시키기 위한 표면에 관류 디바이스를 부착시키는 홀들 (492)을 포함한다.
사용 시, 생물학적 세포 및 보다 작은 분자를 함유하는 유체 매질은 유입구 포트 (410)를 통해 음향 챔버 (450)로 들어간다. 음향 챔버 내에서, 중력은 생물학적 세포를 유출구 포트 (430)를 향해 하부 방향으로 끌도록 작용한다. 수동 침강 과정은 음향 챔버에서 발생되어, 디바이스의 바닥 말단부 (416)에서 생물학적 세포의 상대적으로 높은 농도를 갖는 유체, 및 디바이스의 상부 말단부 (418)에서 생물학적 세포의 상대적으로 낮은 농도를 갖는 유체를 생성한다. 들어오는 유체의 대부분과, 이로 인해 세포 집단의 대다수는 결코 음향 정재파(들)를 통과하지 못한다. 생물학적 세포의 농도가 높은 유체는 바이오리액터로 다시 펌핑되고, 생물학적 세포의 농도가 상대적으로 낮은 유체 (또한 원하는 생체 분자를 함유함)가 펌핑되어 수집 포트(들) (470,472)를 통해 수집된다. 디바이스의 음향 정재파(들)는 상당한 수의 생물학적 세포가 수집 포트(들) (470,472)를 통해 빠져나가는 것을 방지하도록 작용한다.
수집 또는 채취 유동 경로 (453)를 통한 유속은 다양한 실시예에서 유입구 유동 경로 (451)를 통과하는 유속보다 적어도 한 자릿수가 작다. 보다 특정한 실시예에서, 유입구 포트를 통해 디바이스에 진입하는 유체 매질의 유속은 분당 약 1 리터 (L/min)이고, 수집 포트(들)를 통해 디바이스를 빠져나가는, 세포에 고갈된 유체의 유속은 분당 약 10 밀리리터 (mL/min)이다. 일부 테스트에서, 2 리터 내지 10의 크기를 가진 바이오리액터는 최대 10 %의 효모 및 최대 50 백만 개의 cells/mL를 함유한 용액으로 테스트되었다. 유입구 포트를 통한 유속은 약 0.75 L/min 내지 약 3 L/min을 가지며, 이때 수집 유동 경로 (즉, 모든 수집 포트를 함께)를 통한 유속은 약 1 mL/min 내지 약 30 mL/min이다. 95 % 세포 회수율이 달성되었다.
본 개시 내용의 음향 관류 디바이스들은 매우 높은 세포 밀도, mL당 약 100 백만 개의 세포 및 아마도 mL당 약 60 백만 내지 약 120 백만 개의 세포의 범위를 필터링할 수 있는 반면, ATF와 같은 다른 여과 기술은 mL당 80 백만 개의 세포 미만의 밀도를 단지 필터링할 수 있다. 중공 사막 방식과 달리, 음향 정재파(들)는 또한 원하는 대로 세포의 통과를 허용하고, 나아가 미립자/잔해의 통과를 하용하도록 조정될 수 있다. 이는 바이오리액터의 세척 작업으로 작용할 수 있다. 연속적이고 정상 상태의 동작은 압력 변동없이 가능하며, 생성물 스트림은 바이오리액터 또는 필터링 디바이스에 축적되지 않다.
음향 관류 디바이스는 기술 분야에 공지된 적절한 물질로 제조될 수 있다. 그러한 물질은 고밀도 폴리에틸렌 (HDPE), 다른 플라스틱, 및 잠재적으로 금속 및 유리를 포함한다. 유체 유동 및 초음파 트랜스듀서 동작이 시각적으로 확인될 수 있도록 디바이스가 투명한 것이 매우 편리하다는 것이 확인되었다.
도 5는 음향 관류 디바이스 (500)의 또 다른 실시예를 도시한다. 이러한 실시예는 도 4에 도시된 디바이스 (400)와 매우 유사하다. 주된 차이점은 도 5의 음향 관류 디바이스 (500)가 수집 존 (456)에서 디바이스의 한 측벽 상의 제 1 초음파 트랜스듀서 (460) 및 그의 대향 측벽 상의 제 2 초음파 트랜스듀서 (562)를 가진다는 점이다. 달리 말하면, 2 개의 트랜스듀서 (460, 562)는 수집 유동 경로 (453)의 대향 측면들 상에 위치된다. 이러한 배치로, 반사기 (580)는 제 1 초음파 트랜스듀서 (460)와 제 2 초음파 트랜스듀서 (562) 사이의 수집 존 (456) 내에 위치한다. 트랜스듀서는, 반사기 (580), 및 제 1 및 제 2 초음파 트랜스듀서 (460, 562)가 전술한 바와 같이 유체 세포 (450)에서 다-차원 정재파(들)를 생성하도록, 또는 달리 말하면, 트랜스듀서가 서로 향하도록, 배향된다. 또한, 디바이스의 유출구 포트 (430)에 부착된 유출 펌프 (592)가 도시되어 있으며, 상기 유출 펌프는 디바이스를 통해 유동하는 유체 매질의 유속을 제어하는데 사용된다. 본 명세서에 도시되지 않았지만, 필터링 디바이스 (500)의 수집 포트 (보이지 않음)에 부착된 펌프가 있다.
이제, 도 6을 참조하면, 본 개시 내용의 관련 바이오리액터 (610) 및 음향 관류 디바이스 (630)를 포함하는 처리 시스템이 도시된다. 시스템은 관류 바이오리액터로 사용되기 위해 설치된다. 바이오리액터 (610)는 공급물 유입구 (622), 출구 (624) 및 재순환 유입구 (626)를 가진 반응 베슬 (620)을 포함한다. 신선한 배지가 첨가 파이프 (650)에 의해 공급물 유입구 (622) 내로 추가된다. 일부 리액터들은 또한 리액터 내에서 일정한 세포 밀도를 유지하기 위해 세포를 제거 또는 "배출 (bleed)"하는 유출구 또는 배출 포트 (여기에서는 미도시)를 포함할 것이다. 반응 베슬 (605)의 내용물은 교반기 (625)로 혼합된다. 원하는 생성물 (예컨대, 재조합 단백질)은 베슬 (620) 내에 위치된 세포에 의해 연속적으로 생성되고 바이오리액터의 배지에 존재한다. 관류 바이오리액터 내의 생성물 및 세포는 파이프 (652)를 통해 반응 베슬로부터 인출되고 유입구 포트 (632)를 통해 음향 관류 디바이스 (630)로 들어간다. 그곳에서 원하는 생성물의 일 부분이 세포로부터 분리된다. 원하는 생성물은 제 1 수집 포트 (634) (생성물 회수 포트임) 및 파이프 (654)를 통해 격납 베슬 (640)로 배출되거나, 또는 진정한 연속 생산 시스템의 경우, 일부 다른 하류 정제 과정을 통해 배출될 수 있다. 세포는 분리 후에 관류 바이오리액터로 되돌아가되, 음향 관류 디바이스의 유출구 포트 (636) (유체 재순환 포트임)로부터 파이프 (656)를 통해, 재순환 경로를 형성하는 반응 베슬의 재순환 유입구 (626)로 통과하여 되돌아간다. 음향 관류 디바이스의 다-차원 정재파(들)는 디바이스의 유체 세포와 수집 포트 사이에 분리 장벽을 생성하기 위해 사용되어, 매우 감소된 수의 생물학적 세포가 수집 포트 (634)에 수집된다.
도 7 및 도 8은 음향 관류 디바이스의 또 다른 예시적인 실시예의 도면이다. 도 7은 정면 단면도이고, 도 8은 외관 사시도이다. 특히, 이 실시예는 Class VI 물질 (예를 들어, 의료 디바이스의 등급 HDPE)를 사용하여, 또는 단일 또는 용접된 사출 성형 부품으로서, 세척 기계가공 기술로 제조될 수 있도록 특별히 설계된다. 이러한 방식으로, 이 실시예는 감마-안정적인 (gamma-stable) 단일 사용 디바이스의 예이다. 디바이스는 바이오버든 (bioburden)을 제거하기 위해 플러싱되고 (flushed), 그 후에 관류 바이오리액터에 존재하는 것과 같은 건강한 세포 배양물을 파괴할 수 있는 임의의 잠재적인 오염물을 멸균하기 위해 감마선 조사 (일반적으로 25-40 kGy)된다.
먼저, 도 7을 참조하면, 이 디바이스 (700)에서, 유입구 포트 (710) 및 수집 포트 (770) 둘 다는 디바이스의 상부 말단부 (718) 또는 디바이스의 상부 벽 (776)에 위치된다. 유출구 포트 (730)는 디바이스의 바닥 말단부 (716)에 위치된다. 여기서, 유입구 포트 (710) 및 유출구 포트 (730) 둘 다는 디바이스의 제 1 측면 (712) 상에 있다. 유입구 유동 경로 (751)는 유입구 포트로부터 바닥 말단부를 향해 하부 방향으로 그리고 유출구 포트를 지나 이어지는 채널 (755)의 형태로 되어 있으며, 채널은 음향 챔버 (750)로부터 분리된다 (여기서, 분리는 내부 벽 (756)에 의해 발생됨). 유체는 채널에서 하부 방향으로 유동하여, 음향 챔버 (750)를 향해 상부 방향으로 상승할 것이다. 음향 챔버의 바닥 벽 (720)은 유출구 포트 (730)를 향해 아래로 경사지는 경사진 평면이다. 초음파 트랜스듀서 (760)의 위치는 디바이스의 상부 말단부와 바닥 말단부 사이의, 2 개의 정사각형으로서 본 명세서에 도시된다. 수집 유동 경로 (753)는 트랜스듀서 위에 위치된다.
이제, 도 8을 참조하면, 디바이스 (700)는 3 차원 직사각형 하우징 (706) 내에 형성되는 것으로 도시된다. 디바이스의 바닥 말단부 (716)에서 유출구 포트 (730)가 전방 벽 (775) 상에 위치되는 것으로 보일 수 있다. 다시, 수집 포트 (770) 및 유입구 포트 (710)는 상부 벽 (776) 상에 위치된다. 전방 벽에는 투명 물질로 만들어진 관찰 창 (viewing window) (708)이 존재한다. 이 관찰 창을 통해, 초음파 트랜스듀서가 디바이스 하우징의 후방 벽 (778)에 장착되어 있는 것을 알 수 있다. 관찰 창은 다-차원 음향 정재파를 생성하는 반사기로서 작용한다.
도 9 및 도 10은 음향 관류 디바이스의 여전히 또 다른 예시적인 실시예의 도면이다. 도 9는 정면 단면도이며, 그리고 도 10은 사시도이다.
먼저, 도 9를 참조하면, 이 디바이스 (900)에는, 디바이스의 제 1 측면 (912)을 따라 디바이스의 전방 측면 (975) 상에 존재하는 유입구 포트 (910)가 있다. 유출구 포트 (930) (도 10에 가장 잘 도시됨)는 유입구 포트 (910)와 직접 대향하고 동일한 높이에 위치하며 또한 제 1 측면 (912) 상에 위치한다. 이러한 실시예에서, 유입구 포트 (910)로부터 유출구 포트 (930)까지 거의 직접적으로 유동하는 주요 유체 스스팀이 있고, 유입구 유동 경로 (951)는 디바이스의 제 1 측면 (912)으로부터 음향 챔버 (950) 내로의 작은 측면 유동만을 전환시킨다. 수집 포트 (970)는 디바이스의 상부 말단부 (918) 또는 디바이스의 상부 벽 (976)에 위치된다. 2차 유출구 포트 (980)는 또한 제 1 측면 벽 (979)으로부터 연장되는 디바이스의 제 1 측면 (912) 상에 위치되고, 유입구 포트 (910) 아래로 위치되어, 배출 포트로서 작용할 수 있다. 음향 챔버의 바닥 벽 (920)은 정점이 하부 방향으로 가늘어지도록 피라미드형 방식으로 형성된다. 배수 라인 (981)은 음향 챔버 (950)의 바닥으로부터 2 차 유출구 포트 (980)로 이어진다. 본 명세서에서, 제 2 유출구 포트가 고농축 세포의 작은 유동을 포착하는데 사용될 수 있는 것이 고려되고, 이때 상기 고농축 세포가 폐기 (세포 배출)될 수 있거나, 또는 또한 다시 바이오리액터로 되돌려 보내질 수 있다.
이제, 도 10을 참조하면, 디바이스의 전방 벽 (975)은 직사각형 공간 (960)을 가지며, 디바이스의 후방 벽 (978)은 직사각형 공간 (962)을 가진다. 하나의 트랜스듀서 및 하나의 반사기가 이들 2 개의 직사각형 공간 (960/962)에 어느 배향으로 위치될 수 있거나, 또는 2 개의 트랜스듀서가 2 개의 직사각형 공간에 위치될 수 있음이 고려된다. 유입구 포트 (910) 및 유출구 포트 (930) 둘 다 도면에서 볼 수 있다. 유입구 포트 (910)는 디바이스의 전방 측면 상에 위치되고, 유출구 포트 (930)는 디바이스의 후방 측면 상에 위치된다 (비록 이는 원한다면 뒤바뀌어질 수 있지만). 정화 유동 경로 (953)는 트랜스듀서 위에 위치한다. 본 명세서에 도시되지는 않았지만, 도 4와 유사한 장착 부재가 디바이스의 제 2 측면 (914)에 부착될 수 있다.
이제는, 음향 필터링 디바이스에 사용된 초음파 트랜스듀서(들)를 더 자세히 설명하는 것이 도움이 될 수 있다. 도 11은 종래의 초음파 트랜스듀서의 단면도이다. 이 트랜스듀서는 바닥 말단부에서의 마모 플레이트 (50), 에폭시 층 (52), 세라믹 압전 요소 (54) (예컨대, (PZT) (Lead Zirconate Titanate)로 제조됨), 에폭시 층 (56) 및 백킹 층 (58)을 가진다. 세라믹 압전 요소의 한 측면은 전극: 양극 (61) 및 음극 (63)이 위치한다. 에폭시 층 (56)은 백킹 층 (58)을 압전 요소 (54)에 부착한다. 전체 조립체는 예를 들어 알루미늄으로 제조될 수 있는 하우징 (60) 내에 수용된다. 하우징은 접지 전극으로 사용된다. 전기 어댑터 (62)는 와이어들이 하우징을 통과하여 압전 요소 (54)에 부착되는 리드들 (미도시)에 연결되도록 하는 연결부를 제공한다. 통상적으로, 백킹 층은 댐핑을 부가하고 광범위의 주파수에 걸쳐 균일한 변위로 광대역 트랜스듀서를 생성하도록 설계되고, 압전 요소의 특정 진동 고유 모드의 여기를 억제하도록 설계된다. 마모 플레이트는 일반적으로 트랜스듀서가 방사하는 배지의 특성 임피던스를 보다 잘 맞추기 위해 임피던스 트랜스포머로 설계된다.
도 12는 본 개시 내용의 음향 필터링 디바이스에 사용되는, 본 개시 내용의 초음파 트랜스듀서 (81)의 단면도이다. 트랜스듀서 (81)는 정사각형으로 형성되고, 알루미늄 하우징 (82)을 가진다. 알루미늄 하우징은 상부 말단부 및 바닥 말단부를 가진다. 트랜스듀서 하우징은 또한 플라스틱, 이를테면 의료 등급 HDPE 또는 다른 금속으로 구성될 수 있다. 압전 요소는 페로브스카이트 세라믹 (perovskite ceramic)의 덩이로, 큰 2가 금속 이온, 보통 납 또는 바륨, 및 O2-이온의 격자에 작은 4가 금속 이온, 보통 티타늄 또는 지르코늄으로 각각 구성된다. 예를 들어, PZT (lead zirconate titanate) 압전 요소 (86)는 트랜스듀서의 바닥 말단부를 정의하고, 하우징의 바닥 말단부의 외부로부터 노출된다. 압전 요소는 압전 요소와 하우징 사이에 위치된, 작은 탄성 층 (98), 예컨대, 에폭시, 실리콘 또는 유사한 물질로 그 주변 상에 지지된다. 달리 말하면 어떠한 마모 플레이트 또는 백킹 물질도 존재하지 않는다. 그러나, 일부 실시예에서, 음향 정재파가 생성되는 유체로부터 압전 요소를 분리시키는 플라스틱 또는 다른 물질의 층이 있다. 압전 요소/결정체는 외부 표면 (노출됨)뿐만 아니라 내부 표면도 가진다.
스크류 (88)는 하우징의 알루미늄 상부 플레이트 (82a)를 나사산을 통해 하우징의 몸체 (82b)에 부착시킨다. 상부 플레이트는 트랜스듀서에 전력을 공급하기 위한 커넥터 (84)를 포함한다. PZT 압전 요소 (86)의 상부 표면은 절연 물질 (94)에 의해 분리된 양극 (90) 및 음극 (92)에 연결된다. 전극은 은 또는 니켈과 같은 임의의 전도성 물질로 제조될 수 있다. 압전 요소 상의 전극을 통해 PZT 압전 요소 (86)에 전력이 공급된다. 압전 요소 (86)가 어떠한 백킹 층 또는 에폭시 층도 가지지 않음을 유의한다. 달리 말하면, 알루미늄 상부 플레이트 (82a)와 압전 요소 (86) 사이의 트랜스듀서 내에 내부 볼륨 또는 에어 갭 (87)이 있다 (즉, 에어 갭이 완전히 비어 있음). 최소 백킹 (58) 및/또는 마모 플레이트 (50)는 도 13에 도시된 바와 같이 일부 실시예에서 제공될 수 있다.
트랜스듀서 설계는 시스템 성능에 영향을 미칠 수 있다. 통상적인 트랜스듀서는 백킹 층 및 마모 플레이트에 결합된 세라믹 압전 요소를 갖는 적층 구조이다. 트랜스듀서가 정재파에 의해 나타나는 높은 기계적 임피던스의 부하가 걸리기 때문에, 마모 플레이트에 대한 종래의 설계 가이드라인, 예컨대, 정재파 응용을 위한 반 파장 두께 또는 방사 응용을 위한 1/4 파장 두께, 및 제조 방법은 적절하지 않을 수 있다. 오히려, 본 개시 내용의 일 실시예에서, 트랜스듀서에는 어떠한 마모 플레이트 또는 백킹도 없기 때문에, 압전 요소가 높은 Q-계수를 갖는 고유 모드들 중 하나에서 또는 다수의 고유 모드의 조합으로 진동할 수 있도록 한다. 진동하는 세라믹 압전 요소/디스크는 유체 세포를 통해 유동하는 유체에 직접 노출된다.
백킹을 제거하는 것 (예컨대, 공기가 후면에 있도록 압전 소자를 제조)은 또한, 세라믹 압전 요소가 작은 감쇠 (예컨대, 고차 모드 변위)로 고차 모드들의 진동에서 진동하는 것을 허용한다. 백킹을 갖는 압전 요소를 가진 트랜스듀서에서, 압전 요소는 피스톤처럼 보다 균일한 변위로 진동한다. 백킹을 제거하는 것은 압전 요소가 비-균일 변위 모드로 진동하는 것을 허용한다. 압전 요소의 차수 모드 형상이 높아질 수 있도록, 압력 요소는 노드 라인을 보다 많이 가진다. 압전 요소의 고차 모드 변위는 보다 많은 포획 라인을 생성하지만, 노드에 대한 포획 라인의 상관관계는 반드시 일대일이 될 필요가 없으며, 그리고 보다 높은 주파수에서 압전 요소를 구동하는 것은 반드시 보다 많은 포획 라인들을 생성할 필요가 없을 것이다.
본 개시 내용의 음향 필터링 디바이스의 일부 실시예에서, 압전 요소는 압전 요소의 Q-계수에 최소한 영향 (예컨대, 5 % 미만)을 미치는 백킹을 가질 수 있는 것이 고려된다. 백킹은 실질적으로 음향적인 투명 물질, 이를테면 발사 목재, 발포체 또는 코르크로 제조될 수 있고, 이는 압젼 요소가 고차 모드 형상으로 진동하는 것을 허용하고, 고 Q-계수를 유지하면서 압전 요소에 대한 일부 기계적 지지를 여전히 제공한다. 백킹 층은 고체일 수 있거나, 또는 상기 층을 통해 홀을 가진 격자일 수 있고, 그 결과 상기 격자는 특정 고차 진동 모드로 진동하는 압전 소자의 노드를 따르고, 노드 위치에서 지지를 제공하면서 압전 요소의 나머지가 자유롭게 진동하는 것을 허용한다. 격자 작업 또는 음향적인 투명 물질의 목적은 압전 요소의 Q-계수를 낮추거나 특정 모드 형상의 여기를 간섭함 없이 지지를 제공하는 것에 있다.
압전 요소를 유체와 직접 접촉시키면 에폭시 층 및 마모 플레이트의 댐핑 및 에너지 흡수 효과를 피함으로써 높은 Q-계수에도 기여한다. 트랜스듀서(들)의 다른 실시예는 숙주 유체와 접촉하는 납을 함유하는 PZT를 방지하기 위해 마모 플레이트 또는 마모 표면을 가질 수 있다. 이는 예를 들어 혈액 분리, 생물 약제 관류 또는 포유동물 세포의 유가식 여과와 같은 생물학적 응용에서 바람직할 수 있다. 그러한 응용은 크롬, 전해 니켈 또는 무전해 니켈과 같은 마모 층을 사용할 수 있다. 화학 기상 증착은 또한 폴리 (p-크실릴렌) (예컨대, 파릴렌) 또는 다른 폴리머의 층을 도포하는데 사용될 수 있다. 실리콘 또는 폴리우레탄과 같은 유기 및 생체 적합 코팅도 마모 표면으로 사용할 수 있다.
일부 실시예에서, 오일/물 에멀전 분열 및 다른 것, 이를테면 관류와 같은 응용의 경우, 초음파 트랜스듀서는 공칭 2 MHz 공진 주파수를 가진다. 각 트랜스듀서는 3 GPM 유속에서 액적 포획을 위해 약 28 W의 전력을 소비할 수 있다. 이는 0.25 kW hr/m3의 에너지 비용으로 해석된다. 이는 이러한 기술의 에너지 비용이 매우 낮다는 것을 나타낸다. 바람직하게는, 각각의 트랜스듀서는 자체 증폭기에 의해 전력이 공급되고 제어된다. 다른 실시예에서, 초음파 트랜스듀서는 예를 들어 1"x1" 치수를 갖는 정사각형 압전 요소를 사용한다. 대안적으로, 초음파 트랜스듀서는 예를 들어 1"x2.5" 치수를 갖는 직사각형 압전 요소를 사용할 수 있다. 트랜스듀서당 전력 손실은 충분한 음향 포획력을 얻기 위해 1"x1" 트랜스듀서 단면적당 및 음향 정재파 너비 (span) (인치)당 10W였다. 중간 스케일 시스템의 4" 너비인 경우, 각각의 1"x1" 정사각형 트랜스듀서는 40W를 소비하다. 1"x2.5" 큰 직사각형 트랜스듀서는 중간 스케일 시스템에서 100W를 사용하다. 3 개의 1"x1" 정사각형 트랜스듀서 어레이는 총 120W를 소모할 것이고, 2 개의 1"x2.5" 트랜스듀서 어레이는 약 200W를 소비할 것이다. 근접 이격된 트랜스듀서의 어레이는 기술의 대체 잠재력 실시예를 나타낸다. 트랜스듀서의 크기, 형상, 수 및 위치는 원하는 다-차원 음향 정재파 패턴을 생성하기 위해 원하는 대로 변화될 수 있다.
트랜스듀서의 크기, 형상 및 두께는 상이한 여기 주파수에서 트랜스듀서의 변위를 결정하며, 이로 인해 분리 효율에 영향을 준다. 통상적으로, 트랜스듀서는 두께 공진 주파수 (반 파장) 근처의 주파수에서 동작한다. 트랜스듀서 변위의 구배는 통상적으로 세포/생체분자에 대한 더 많은 포획 위치를 초래한다. 고차 모드의 변위는 모든 방향에서 음향 필드의 강한 구배를 갖는 3 차원 음향 정재파를 생성함으로써, 모든 방향으로 균등하게 강한 음향 방사력을 생성하여 다수의 포획 라인으로 안내하며, 포획 라인의 수는 트랜스듀서의 특정 모드 형상과 상호관련된다.
음향 포획력 및 분리 효율에 대한 트랜스듀서 변위 프로파일의 영향을 조사하기 위해 실험은 1"x1" 정사각형 트랜스듀서를 사용하여 10 회 반복되었고, 여기 주파수를 제외한 모든 조건을 동일하게 했다. 도 14에서 원형 번호 1-9 및 문자 A로 표시된 10 개의 연이은 음향 공진 주파수가 여기 주파수로 사용되었다. 조건은 30 분의 실험 기간, 대략 5-미크론 SAE-30 오일 액적의 1000 ppm 오일 농도, 500 ml/min의 유속 및 20W의 인가된 전력이었다. 오일이 물보다 밀도가 낮기 때문에 오일 액적이 사용되었으며, 음향 영동을 사용하여 물로부터 분리될 수 있다.
도 14는 2.2 MHz 트랜스듀서 공진 부근에서 주파수의 함수로 정사각향 트랜스듀서의 측정된 전기 임피던스 진폭을 보여준다. 트랜스듀서 전기 임피던스의 최소값은 물 기둥의 음향 공진에 해당하며 동작을 위한 잠재적인 주파수를 나타낸다. 추가 공진은 다-차원 정재파가 여기되는 다른 주파수에서 존재한다. 수치 모델링은 트랜스듀서 변위 프로파일이 이러한 음향 공진 주파수에서 크게 변화하여 음향 정재파 및 그에 따른 포획력에 직접적인 영향을 미친다는 것을 나타낸다. 트랜스듀서가 그의 두께 공진 근처에서 동작하기 때문에, 전극 표면의 변위는 본질적으로 위상이 다르다 (out of phase). 트랜스듀서 전극의 통상적인 변위는 균일하지 않으며 여기 주파수에 따라 변화한다. 예를 들어, 포획된 오일 액적의 단일 라인을 갖는 하나의 여기 주파수에서, 변위는 전극의 중앙에서 단일 최대 값을 가지며 트랜스듀서 에지 근처에서 최소값을 가진다. 또 다른 여기 주파수에서, 트랜스듀서 프로파일은 오일 액적의 다수의 포획된 라인으로 안내된 다수의 최대 값을 가진다. 고 차수 트랜스듀서 변위 패턴은 포착된 오일 액적에 대해 더 높은 포획력 및 다수의 안정된 포획 라인을 초래한다.
오일-물 에멀전이 트랜스듀서에 의해 통과함에 따라, 오일 액적의 포획 라인이 관찰되고 특성화되었다. 이 특성화는 도 14에서 확인된 10 개의 공진 주파수 중 7 개에 대해, 도 15에서 도시된 바와 같이, 유체 채널에 걸친 포획 라인들의 수의 관찰 및 패턴을 수반한다. 트랜스듀서의 상이한 변위 프로파일은 정재파에서 상이한 (더 많은) 포획 라인을 생성할 수 있고, 이때 일반적으로 변위 프로파일에서 구배가 많을수록, 포획력이 높아지고 포획 라인도 많이 생성된다.
도 16은 9 개의 포착 라인 패턴과 일치하는 압력 필드를 도시하는 수치 모델이다. 수치 모델은 2 차원 모델이고; 그러므로 오직 3 개의 포획 라인이 관찰된다. 페이지 평면에 수직인 제 3 차원에는 2 개 초과 세트의 3 개의 포획 라인이 존재한다.
균일한 변위를 가진 피스톤으로서 결정체가 효과적으로 움직이는 진동의 형태와 대조적으로, 트랜스듀서를 더 높은 차수 모드 형상으로 구동시킴으로써, 트랜스듀서에 의해 생성된 음향 방사력의 측 방향 힘이 증가될 수 있다. 음향 압력은 트랜스듀서의 구동 전압에 비례하다. 전력은 전압의 제곱에 비례하다. 트랜스듀서는 통상적으로 z-축에서의 전기장 및 z-축에서의 1 차 변위를 갖는 얇은 압전 플레이트이다. 트랜스듀서는 통상적으로 공기에 의해 일 측면 (즉, 트랜스듀서 내의 에어 갭) 상에, 그리고 새포 배양 배지의 유체 매질에 의해 타 측면 상에 결합된다. 상기 플레이트에서 생성되는 파의 유형을 복합 파 (composite waves)라고 한다. 압전 플레이트의 복합 파의 하위 세트는 누설 대칭 (leaky symmetric) (압축 또는 신축이라고도 지칭됨) Lamb 파와 유사하다. 플레이트의 압전 특성은 통상적으로 대칭 Lamb 파의 여기를 초래한다. 상기 파가 물 층 내로 방사되기 때문에 상기 파는 누설되어 물 층(water layer)에 음향 정재파가 생성된다. Lamb 파는 그의 표면 상에 응력이 없는 상태로 무한한 범위를 가진 얇은 플레이트에 존재한다. 이 실시예의 트랜스듀서가 본질적으로 유한하기 때문에, 실제 모드 변위는 보다 복잡하다.
도 17은 플레이트의 두께에 걸친 평면 내 (in-plane) 변위 (x-변위) 및 평면 외 (out-of-plane) 변위 (y-변위)의 통상적인 변화를 도시하고, 평면 내 변위는 플레이트의 두께에 걸쳐 짝수 함수이고, 평면 외 변위는 홀수 함수이다. 플레이트의 유한 크기 때문에, 변위 성분은 플레이트의 폭 및 길이에 걸쳐 변화한다. 일반적으로, (m, n) 모드는, 폭 방향의 트랜스듀서 변위의 m 파동 (undulations) 및 길이 방향의 n 파동이 있는 트랜스듀서의 변위 모드이고 이때 두께 변화는 도 17에 기술된 것과 같다. m 및 n의 최대 수는 결정체의 치수 및 여기 주파수의 함수이다. 형태 (m, n)가 아닌 추가적인 3 차원 모드가 존재한다.
트랜스듀서는 압전 요소가 일반 식 (m, n)의 더 높은 차수 모드로 진동하도록 구동되며, 여기서 m 및 n은 독립적으로 1 이상이다. 일반적으로 트랜스듀서는 (2,2)보다 높은 차수 모드로 진동할 것이다. 더 높은 차수 모드는 더 많은 노드와 앤티노드 (antinodes)를 생성하여 물 층에 3 차원 정재파를 초래할 것이며, 이는 정재파의 방향뿐만 아니라 측 방향의 모든 방향으로 음향 필드에서 강력한 구배를 특징으로 한다. 결과적으로, 음향 구배는 측 방향에서 보다 강한 포획력을 초래한다.
실시예에서, 트랜스듀서를 구동하는 전압 신호는 정현파, 정사각형, 톱니파, 펄스 또는 삼각형 파형을 가질 수 있으며; 500 kHz 내지 10 MHz의 주파수를 가진다. 전압 신호는 임의의 원하는 파형을 생성하는 펄스 폭 변조로 구동할 수 있다. 전압 신호는 또한 스트리밍을 제거하기 위해 진폭 또는 주파수 변조 시작/정지 능력을 가질 수 있다.
트랜스듀서는 정재파 방향과 수직한 방향으로, 그리고 정재파 방향으로 동일한 자릿수의 음향 방사력을 생성하는 압력 필드를 생성하는 데 사용된다. 힘이 대략 동일한 자릿수일 시에 0.1 미크론 내지 300 미크론 크기의 입자가 "포착 라인"을 향해 보다 효과적으로 이동될 것이고, 그 결과 입자는 압력 필드를 통과하지 않고, 필터링 디바이스의 수집 포트를 통해 연속적으로 빠져나갈 것이다. 대신에, 입자는 바이오리액터로 다시 재순환되도록 음향 챔버 내에 남아있을 것이다.
하기 예시는 본 개시 내용의 디바이스, 구성 요소 및 방법을 도시하기 위해 제공된다. 예시는 단지 예시적인 것일 뿐이며, 본 명세서에 기재된 물질, 조건 또는 과정 파라미터에 개시 내용을 제한하려는 것은 아니다.
예시
예시 1
도 18은 전술한 바와 같은 음향 관류 디바이스에 대한 실험 셋업을 도시한다. 이 음향 관류 디바이스는, 바닥 벽이 만곡되지 않고 오히려 제 1 말단부로부터 수평으로 이어지고 그 후에 유출구 포트에 대해 직접 경사진 것을 제외하고는 도 5에 도시된 것과 매우 유사하다. 튜브는 유입구 포트, 유출구 포트 및 2 개의 수집 포트에 연결된다. 또한 펌프가 유출구 포트에 눈에 띄게 유체 연결된다.
도 19는 도 5에 도시된 실시예와 유사한, 본 개시 내용의 또 다른 음향 관류 디바이스의 도면으로, 이때 상기 음향 관류 디바이스는 2 개의 초음파 트랜스듀서, 및 디바이스의 바닥 말단부에서의 유입구 포트로부터 유출구 포트로 안내되는 오목한 바닥 벽을 가진다. 유체 매질을 함유한 세포는 또한 디바이스에 존재한다. 이러한 도면에서 전술한 바와 같이, 반사기와 제 1 및 제 2 트랜스듀서 사이의 수집 존에서 음향 정재파가 생성된다. 이에 의해 생성된 음향 필드는 파 및 도면 부호 1664로 표시된다. 유입구 포트로부터 유출구 포트로 디바이스를 통과하는 유체 매질의 유동 패턴은 디바이스 내로의 유체 유동의 방향을 나타내는 화살표 (참조 번호 1610), 및 유출구 포트를 향해 디바이스를 통한 유체 유동의 방향을 표시하는 화살표 (참조 번호 1630)로 도시된다. 마지막으로, 제 1 및 제 2 수집 포트를 통한 디바이스 외부의 원하는 생성물의 일반적인 유동 패턴은 유동의 방향을 나타내는 화살표 (참조 번호 1670)로 도시된다.
음향 영동 분리는 도 19의 음향 관류 디바이스 및 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포의 상이한 라인에 대한 본 개시 내용의 분리 방법을 사용하여 테스트되었다. 도 20-28은 Beckman Coulter Cell Viability Analyzer를 사용하여, 상이한 파라미터를 변화시켜 상이한 값을 측정하는 다양한 테스트 결과를 도시한다.
음향 필터링 디바이스로 관류 유속은 약 2 mL/min 내지 약 10 mL/min이었고, 유속은 2.7 L 작업 볼륨 바이오리액터에 대해 약 1 VVD 내지 약 5 VVD이었다. VVD는 "1 일 베슬 볼륨 (vessel volume per day)" 또는 하루에 음향 필터링 디바이스를 통해 바이오리액터 베슬의 볼륨이 몇 번 순환되는지를 나타낸다. 관류 유속 (Qp)은 관류 포트를 통해 수집되었다. 이와 달리, 공급물 유속 (Qf)은 약 40 mL/min 내지 약 200 mL/min이었다.
공급 용액은 50 × 106 cells/mL의 시작 CHO 세포 밀도를 가졌다. 리액터 크기는 2.7 L이었고 숙주 유체의 공급물 볼륨은 1.5 L였다. 총 2.7L 용량의 리액터에서 VVD 및 유동 분할 (flow split)을 변화시키는 효과를 연구하기 위해 7 회의 일련의 테스트 (T1-T7)가 수행되었다. 테스트에 대한 파라미터는 아래 표 1에 도시된다.
그 결과는 도 20에 도시된 바와 같이, 유속에 관계없이 45V의 DC 전압에서 89-93 % 사이의 세포 정화 효율을 포함했다. T1에 대한 DC 전압은 60V로 고정된 반면, T2-T7 테스트의 경우 DC 전압이 45V의 고정된 양으로 감소되었음을 유의한다. 트랜스듀서 전압 진폭은 이들 값의 절반이다.
그 결과는 도 21에 도시된 바와 같이 공급물에 비해 90-94 %의 관류 액 탁도 감소를 추가로 포함하였다. 이러한 도면은 공급물, 재순환된 유체 (Qc) 및 관류 액 (Qp)의 탁도를 도시한다. 공급물은 유입구 포트로 유입되고, 재순환된 유체는 유출구 포트를 빠져나와 재순환되었으며, 관류 액은 음향 필터링 디바이스의 관류 포트를 빠져나갔다. 테스트 T1 및 T2에 대한 탁도 측정은 하드웨어 오류를 초래하므로, 유속에 관계없이, 공급물 스트림에 관련된 관류 스트림에서 6-10 % 탁도와 동일시된 T3-T7 테스트만 표시된다는 점을 유의한다.
도 22는 Beckman Coulter Cell Viability Analyzer에 의해 생산되었고, 모든 테스트에 걸쳐 79-84% 범위의 제어로 계측기 오류 (± 6 %) 내에 있는 각 유속에 대한 세포 생존력을 나타내었다.
추가 테스트는 "CHO Line A"로 표시된 용액을 사용하여 수행되었다. 상기 용액은 50×106 cells/mL의 시작 세포 밀도, 2,400 NTU의 탁도, 및 약 80 %의 세포 생존력을 가졌다. 용액은 2.7L의 리액터 크기를 가진 시스템에서 본 개시 내용의 디바이스를 사용하여 분리되었다. 공급물 유체의 볼륨은 1.5L 내지 2.0L였다. 관류 유속은 2 mL/min 내지 10 mL/min 또는 1 내지 5 VVD였다. 2.7L 볼륨의 리액터에서 음향 여과 성능에 대한 VVD 및 유동 분할을 변화시키는 효과를 연구하기 위해 일련의 6 회의 테스트가 수행되었다. 테스트의 파라미터는 아래 표 2에 도시된다.
도 23은 공급물 유속, 재순환 유속 및 관류 유속의 측정된 총 세포 밀도를 도시한다. 테스트를 위한 바이오리액터 세포 보유율은 대략 90 %의 관류 효율을 보여준다. 도 24는 테스트를 통해 측정된 세포 생존률을 보여주며 테스트에서 생존력에 큰 변화가 없음을 보여준다.
다음으로 "CHO Line B"로 표시된 용액을 사용하여 추가 테스트가 수행되었다. 용액은 75×106 cells/mL의 시작 세포 밀도, 2,300 NTU의 탁도, 및 약80 %의 세포 생존력을 가졌다. 용액은 2.7L의 리액터 크기를 가진 시스템에서 본 개시 내용의 디바이스를 사용하여 분리되었다. 4 회의 테스트가 수행되었다 (T1-T4). 테스트 중 2 회 (T1, T3)는 단일 트랜스듀서를 가진 디바이스를 사용했다. 다른 2 회 테스트 (T2, T4)는 두 개의 트랜스듀서를 직렬로 가진 디바이스를 사용했다 (그 결과 유체는 양측 정재파를 통과했다). 테스트의 파라미터는 아래 표 3에 도시된다.
도 25는 공급물, 재순환 및 관류 유동의 측정된 총 세포 밀도를 도시한다. 테스트를 위한 바이오리액터 세포 보유율은 90 % 초과의 관류 효율을 보여준다. 이 결과는 단일 트랜스듀서 보다 오히려 두 개의 트랜스듀서를 사용할 시에 대략 3-5 % 초과 효율성을 추가로 입증했다. 도 26은 테스트를 통해 측정된 세포 생존력을 보여주며 테스트에서 생존력에 큰 변화가 없음을 보여준다. 실제로 VVD가 낮은 상태에서 동작하면 배지 비용 절감과 같은 다수의 이점이 있다.
생물학적 적용에서, 시스템의 모든 부분 (즉, 바이오리액터, 음향 필터링 디바이스, 유체 연결 튜브 등)는 서로 분리되어 폐기될 수 있다는 것이 고려된다. 원심 분리기 및 필터를 피함으로써 세포의 생존력을 저하시킴 없이, CHO 세포를 보다 양호하게 분리할 수 있다. 트랜스듀서는 또한 CHO 세포의 응집으로 인한 막힘을 방지하거나 제거하기 위해 급격한 압력 변화를 생성하도록 구동될 수 있다. 트랜스듀서의 주파수는 또한 주어진 전력에 대해 최적의 효과를 얻기 위해 변화될 수 있다.
예시 2
도 27은 도 8에 도시된 것과 유사한 음향 관류 디바이스에 대한 또 다른 실험 셋업을 도시한다. 튜브는 유입구 포트, 유출구 포트 및 수집 포트에 연결된다.
상기 디바이스는 40V 피크 대 피크 (peak to peak)의 트랜스듀서 전압, 15-30mL/min의 관류 유속, 및 2L/min의 재순환 유속으로 테스트되었다. 샘플을 45-60 분마다 채취하여 세포 보유율을 결정하였다. 도 28은 결과를 보여준다. y-축은 백분율로 나타낸 보유치다 (출력 세포 수를 입력 또는 바이오리액터/배양물 세포 수와 비교하여 계산함). x-축은 인가 DC 전압 (V) 및 관류 또는 채취, 유속 (mL/min) 모두를 나타낸다; V 및 mL/min에 대한 수치 값의 범위가 동일하다는 것은 단지 우연한 일치이다. 세포 보유 효율은 최대 20 mL/min로 관류 유속에 대해 95 % 초과를 유지하였고, 약 25 mL/min까지 90 % 초과를 유지하였다. 도 33은 시동 또는 세포 정착 모드 (좌측) 및 정상 상태 세포 보유 모드 (우측)에서 디바이스를 보여주는 합성 사진이다.
다음으로, 어떤 요인이 세포 보유에 영향을 미치는지를 결정하기 위한 실험이 수행되었다. 관류 유속은 트랜스듀서 전압과 같이 다양했다. 관류 유속이 변화될 시, 트랜스듀서 전압은 40V 피크 대 피크로 유지되었고 재순환 유속은 2 L/min으로 유지되었다. 트랜스듀서 전압이 변화될 시에, 관류 유속은 20 mL/min으로 유지되었고 재순환 유속은 2 L/분으로 유지되었다. 결과는 이 특정 실시예에서 약 15 mL/min 내지 약 28 mL/min의 관류 유속이 최적이며 약 15V 피크 대 피크 내지 약 28V 피크 대 피크의 트랜스듀서 전압이 최적이라는 것을 나타낸다.
음향 관류 디바이스가 제공하는 추가 기능성에 대한 더 나은 이해는, 디바이스에 들어와서 상기 디바이스로부터 채취되는 관찰 세포 샘플을 검사함으로써 증명될 수 있다. 도 29a는 공급물 부유액, 여기서 대략 56 백만 cells/mL을 갖는 생존 세포 배양물 집단의 (Vi-Cell 세포 계수기로부터의) 현미경 이미지이다. 여러 개의 크고 둥근 건강한 세포가 관찰될 수 있다. 도 29b는 상기 집단의 세포 직경 분포를 나타내는 히스토그램이다. 직경 분포는 약 11 미크론 및 약 23 미크론의 값 주변의 강한 2 가지 모드로 나타난다. 이 2 가지 모드는 더 작은 잔해 및 비-생존 세포, 그리고 더 큰 생존 세포와 대략적으로 일치한다. 이 샘플은 특히 "더러운 (dirty)" 세포 집단의 샘플이라는 점에 유의해야 하다. 일반적으로 생산 세포 라인은 훨씬 깨끗하며 대략 11 미크론에서의 피크는 훨씬 작거나, 심지어 존재하지 않을 수도 있다.
도 30a는 음향 관류 디바이스로부터 채취된 유동의 시점의 (Vi-Cell 세포 계수기로부터의) 또 다른 현미경 이미지이다. 이 이미지에서 도 29a와는 대조적으로 밝고 큰 세포는 거의 관찰되지 않았다. 오히려 이미지는 더 작고 더 어두운 입자 또는 잔해로 채워졌다. 이 경우 실험 조건은 4 mL/min의 관류 속도 및 30 V의 DC 입력 전압으로 2 L/min의 재순환 속도이었다. 이러한 정성적인 관찰 (qualitative observation)은 관류 액의 직경 분포를 도시한 도 30b의 히스토그램에 의해 확인된다. 도 30b를 보면, 입자 분포는 이제 단일 모드이며, 피크는 대략 9 미크론이다. 이는 더 큰 생존 세포가 포획 및 보유되거나, 그렇지 않으면 관류액에서 대체로 빠져나갈 수 없는 것을 나타낸다. 작은 세포만이 서브미크론 내지 미크론 크기의 세포 잔해, 미립자 및 세포 단편과 함께 통과한다.
이 디바이스로 컴퓨터 유체 역학 (computational fluid dynamics, CFD) 모델을 만들었다. 도 31은 500 초 후 디바이스 내의 속도 분포를 보여준다. 단위는 미터/초 (m/s)이다. 예상대로 최고 속도가 유입구 포트로부터 유출구 포트로 하부 방향으로 안내되는 채널에서 발견된다. 속도는 유체 세포에서 그리고 수집 포트를 통해 빠져나갈 시에 거의 0이다. 이는 다음의 두 가지 이유 때문에 중요하다: 음향 필드가 더 낮고 보다 균일한 속도의 유동에서 더 효과적이며, 바이오-매뉴팩처링에 사용되는 세포가 유동 및 유도 전단 속도 (induced shear rate)에 민감하기 때문이다.
도 32는 이 실시예의 여러 양태를 도시한 다이어그램이다. 유체는 유입구 포트 (710)를 통해 디바이스로 흐르고 (화살표 780), 음향 에지 (783) 위의 음향 챔버 내로 흐른다. 음향 챔버 아래의 유체 볼륨 (750)은 화살표 (782)로 표시된 접선 방향의 유동 경로를 포함한다. 상대적으로 많은 양의 생존 세포를 갖는 유체는 화살표 (781)로 표시된 바와 같이 유출구 포트 (730)를 통해 배출될 것이다. 정재파에 의해 생성된 음향 에지 효과는 참조 번호 (783)로 표시되고, 큰 세포를, 음향 정재파 필드 (784)를 통과할 수 있는 더 작은 세포 단편, 입자 잔해, 원하는 생체분자 등으로부터 분리시킨다. 이 채취 유동 스트림 (785)은 그 후에 채취 포트 (770)를 통해 빠져나간다. 접선 방향의 유동 경로는 유입구 유동 경로의 일부이며, 음향 정재파에 의해 생성된 음향 에지 (783) 아래에 위치된다. 접선 방향의 유동 경로는 중력 효과로 인해 음향 정재파 필드 (784)로부터 떨어지는 세포의 무리 및 음향 에지 효과에 의해 보유되는 세포 둘 다를 전달할 것이다.
예시 3
음향 관류 디바이스의 동작을 설명하는 또 다른 방식은 수치 연구의 결과를 보고 이해할 수 있다. 수치 연구에서, 효과적인 음향 속성 (즉, 사운드 속도 및 밀도)이 다른 두 가지 유체는 수치 시뮬레이션 소프트웨어인 COMSOL에서 이들 사이의 계면으로 모델링되었다. 음향 필드가 계산되어 유체 속도의 방향으로 입자에 작용하는 측 방향 방사력이 Gorkov 식을 사용하여 계산된다.
도 34는 압전 트랜스듀서, 강철 반사기, 알루미늄 하우징 및 두 유체를 사용하여 시뮬레이션의 기하학을 도시한다: 제 1 유체는 음향 필드 내의 물이고, 제 2 유체는 음향 필드 외부의 수용액 내의 15 % 농도의 CHO 세포이고, 제 2 유체는 물 유체보다 높은 밀도 및 높은 사운드 속도를 가진다.
두 유체는 도 34의 모델에서 실선으로 표시된 것처럼 분리되었다. 이러한 셋업에서, 시스템을 통한 유체 속도는 좌측으로부터 우측으로 수평 방향이었다. 그러므로, 보유 디바이스로서 작용하기 위해, 음향 필드는 음의 x-방향 (즉, 유체 속도의 반대 방향)으로 작용하는 세포에 힘을 생성할 필요가 있다. 물은 1000 kg/m3의 유체 밀도 및 1500m/s의 사운드 속도로 모델링되었다. CHO 세포는 1050 kg/m3의 밀도 및 1550 m/s의 사운드 속도를 갖는 것으로 모델링되었다. 압전 물질의 완전 압전 시뮬레이션, 두 유체의 음향 시뮬레이션 및 강철 및 알루미늄 바디에서의 선형 탄성 시뮬레이션을 포함한 결합형 다중 물리 수치 시뮬레이션은 다양한 여기 주파수에서 수행되었다. 트랜스듀서는 40V의 피크 전압에서 구동되었다.
도 35a 내지 35c는 2.218 MHz, 2.2465 MHz 및 2.3055 MHz의 동작 주파수에서 모델의 압전 물질, 알루미늄 하우징 및 강철 반사기의 변위 및 두 유체 내의 음향 압력을 도시한다. 측 방향 방사력 (즉, 유체 유동의 방향으로 수평)은 트랜스듀서에 의해 소비된 실제 전력과 함께 두 유체 사이의 계면에서 계산되었다. 트랜스듀서 및 강철의 구조적 변위는 유체의 음향 압력과 함께 도시된다.
도 36은 부유된 CHO 세포에 작용하는 주파수에 대하여 전력에 의해 표준화된 측 방향 방사력 (N/W) 및 측면 방사력 (N)을 도시한다. 이 그래프에서 나타난 바와 같이, 공진 주파수 (즉, 국부 최대 전력)에서, 계면 상에서의 평균 측 방향 방사력은 음의 값을 가지며, 음의-x 방향임을 의미한다. 그 결과 음향 벽 효과 또는 음향 에지 효과가 생성된다. 즉, 음향 필드의 에지는 부유 입자 상에 강한 측 방향 힘을 가하여 더 큰 입자가 음향 필드로 들어가는 것을 방지하고 제 1 유체만 (즉, 원하는 생성물과 같은 더 작은 입자만을 함유하고 전체 세포를 배제하는 유체)을 음향 필드에 진입함으로써 음향 관류 세포 보유 디바이스를 생성하는 것을 허용한다. 이러한 방식으로, 정화된 유체만이 빠져나갈 수 있고, 세포는 방사력에 의해 억제된다. 이 힘은 절대 양이지 않고, 이는 계면에서 항상 세포를 억제하여 이를 음향 에지에서 빠져나가지 않도록 하는 것을 의미한다. 전력 곡선의 다수의 피크는 동작의 평면 공진 모드 및 다-차원 모드를 포함한 다수의 동작 모드의 존재를 보여주며, 평면 및 다-차원 정재파의 활용 등을 통해 이러한 동작 유형이 생성될 수 있음을 나타낸다. 1"x1" 치수를 가진 시스템에서, 30 kHz마다 평면 공진이 존재한다. 그래프는 다-차원 모드의 존재를 나타내는 추가 피크의 증거를 보여준다. 단위 전력당, 이러한 모드는 평면 공진 모드와 동등하거나 훨씬 더 효과적일 수 있다. 전술한 바와 같이, 음향 방사력에 의해 저지된 세포는 그 후에 유동 필드 (즉, 계면 아래의 재순환 유동)의 스크러빙 모션에 의해 픽업될 수 있으며, 그리고 이들이 영양 및 산소를 받아 전반적인 세포 배양물의 생산을 유지하는 것을 확보하기 위해 바이오리액터로 연속적으로 되돌아갈 수 있다.
예시 4
도 37 및 도 38은 도 9에 도시된 것과 유사한 음향 관류 디바이스에 대한 또 다른 실험 셋업을 도시한다. 튜브는 유입구 포트, 유출구 포트, 수집 포트, 및 2 차 유출구 포트 (유동 집중 세포를 위함)에 연결된다. 화살표는 유체 유동을 설명하기 위해 포함된다. 화살표는 유입구 포트 내로의 유동; 유출구 포트 외부로의 유동; 디바이스의 상부 외부로의 관류액 유동 및 디바이스의 바닥 외부로의 농축물 유동을 나타낸다. 유입구 포트를 통한 유출구 포트로의 유동은 재순환 유속이다. 디바이스 상부 외부로의 관류액 유동은 세포에 고갈된 정화 유체를 함유하고 원하는 생성물을 함유하는 관류 유속이다. 디바이스의 바닥 외부로의 농축물 유동은 농축된 세포 유동이다. 농축된 세포 유동은 세포 배출 동작에 사용될 수 있거나, 또는 원한다면 세포는 바이오리액터로 되돌아 갈 수 있다.
디바이스는 40V 피크 대 피크의 트랜스듀서 전압, 1-10m L/min의 관류 유속 (상부 외부로), 0.75-1 L/min의 재순환 유속, 및 15 mL/min의 농축물 유속 (바닥 외부로)에서 테스트되었다. 세포 보유율은 상이한 관류 유속에 대해 결정되었다. 도 39는 결과를 보여준다. y-축은 100 % 보유를 나타내는 1.00의 보유치이다. 세포 보유 효율은 최대 7 mL/min의 관류 유속에 대해 98 % 초과를 유지했으며 단지 10 mL/min에서 90 % 미만이었다.
본 개시 내용은 예시적인 실시예들을 참조하여 기술되었다. 명백하게, 상기의 상세한 설명을 읽고 이해할 시에 다른 것에 대해 수정 및 대안이 일어날 것이다. 본 개시 내용은 첨부된 청구 범위 또는 그 균등물의 권리 범위 내에 있는 한에, 모든 그러한 수정 및 대안을 포함하는 것으로 해석되어야 한다.
Claims (30)
- 음향 관류 디바이스에 있어서,
음향 챔버; 유입구 포트, 상기 유입구 포트로부터 상기 음향 챔버로 안내되는 유입구 유동 경로;
유체 및 세포 혼합물을 재순환시키고 상기 음향 챔버 아래에 위치된 유출구 포트;
상기 유체 및 세포 혼합물로부터 채취 유체를 수집하고 상기 음향 챔버 위에 위치된 하나 이상의 수집 포트; 및
적어도 하나의 초음파 트랜스듀서 및 상기 적어도 하나의 초음파 트랜스듀서에 대향하는 적어도 하나의 반사기;를 포함하며,
상기 적어도 하나의 초음파 트랜스듀서는 상기 음향 챔버로부터 상기 적어도 하나의 수집 포트로 안내되는 수집 유동 경로에 걸쳐 다-차원 음향 정재파를 생성하기 위해 구동되도록 구성된 압전 물질;을 포함하는, 음향 관류 디바이스. - 삭제
- 청구항 1에 있어서,
상기 유입구 유동 경로는 상기 음향 정재파에 의해 생성된 음향 필드 아래에서 접선 방향의 유동 경로 (tangential flow path)를 생성하는 형상을 가지는, 음향 관류 디바이스. - 청구항 1에 있어서,
세포 상의 압력 상승 및 음향 방사력은 상기 음향 정재파를 통과하는 유체를 정화시키기 위해, 상기 음향 정재파의 에지에서 생성되는, 음향 관류 디바이스. - 청구항 1에 있어서,
상기 적어도 하나의 초음파 트랜스듀서는 상기 디바이스의 후방 벽 또는 전방 벽에 장착되는, 음향 관류 디바이스. - 청구항 1에 있어서,
상기 적어도 하나의 반사기는 투명 물질로 이루어지는, 음향 관류 디바이스. - 청구항 1에 있어서,
상기 유출구 포트는 상기 유입구 포트 아래에 있는, 음향 관류 디바이스. - 청구항 1에 있어서,
상기 수집 유동 경로의 다수의 측면 상에 위치된 총 2 개 이상의 초음파 트랜스듀서를 가지는, 음향 관류 디바이스. - 청구항 8에 있어서,
상기 적어도 하나의 반사기는 상기 2 개 이상의 초음파 트랜스듀서 사이에 위치되는, 음향 관류 디바이스. - 청구항 8에 있어서,
상기 2 개 이상의 초음파 트랜스듀서는 상기 수집 유동 경로 내에 있고, 상기 적어도 하나의 반사기는 상기 디바이스의 벽 내의 2 개 이상의 초음파 트랜스듀서에 대향하는, 음향 관류 디바이스. - 청구항 1에 있어서,
상기 적어도 하나의 트랜스듀서는 어레이인, 음향 관류 디바이스. - 청구항 1에 있어서,
상기 음향 정재파는, 동일한 자릿수 (same order of magnitude)를 가진 축 방향 힘 성분 및 측 방향 힘 성분을 가진 음향 방사력을 초래하는, 음향 관류 디바이스. - 청구항 1에 있어서,
상기 디바이스의 상부 말단부 상에서 서로 이격된 2 개 이상의 수집 포트를 가지는, 음향 관류 디바이스. - 청구항 1에 있어서,
상기 채취 유체가 제 2 음향 정재파를 통과하는 2 차 유동 챔버를 더 포함하며, 상기 제 2 음향 정재파는 상기 채취 유체를 더 정화시키기 위해 제 1 초음파 음향 정재파보다 높은 주파수를 가지는, 음향 관류 디바이스. - 청구항 1에 있어서,
평면 음향 정재파 및 상기 다-차원 음향 정재파 둘 다는 상기 수집 유동 경로에 걸쳐 생성되는, 음향 관류 디바이스. - 유체 매질로부터 생물학적 세포를 분리하는 방법에 있어서,
상기 생물학적 세포를 함유하는 유체 매질을 음향 관류 디바이스를 통해 유동시키는 단계 - 상기 디바이스는,
음향 챔버;
유입구 포트, 상기 유입구 포트로부터 상기 음향 챔버로 안내하는 유입구 유동 경로;
상기 유체 매질 및 상기 생물학적 세포를 재순환시키고 상기 음향 챔버 아래에 위치된 유출구 포트;
채취 유체를 수집하고 상기 음향 챔버 위에 위치된 적어도 하나의 수집 포트; 및
상기 적어도 하나의 수집 포트 아래에 있는 적어도 하나의 초음파 트랜스듀서, 및 상기 적어도 하나의 초음파 트랜스듀서에 대향하는 적어도 하나의 반사기를 포함하고, 상기 적어도 하나의 초음파 트랜스듀서는 상기 음향 챔버로부터 상기 적어도 하나의 수집 포트로 안내되는 수집 유동 경로에 걸쳐 다-차원 음향 정재파를 생성하기 위해 구동되도록 구성된 압전 물질을 포함함;
상기 다-차원 음향 정재파를 생성하기 위해 상기 적어도 하나의 초음파 트랜스듀서를 구동하는 단계; 및
상기 유출구 포트로부터 세포에 풍부한 유체를 수집하고, 적어도 하나의 수집 포트로부터, 세포에 고갈된 채취 유체를 수집하는 단계;를 포함하는, 유체 매질로부터의 생물학적 세포 분리 방법. - 청구항 16에 있어서,
상기 유출구 포트는 상기 유입구 포트 아래에 있는, 유체 매질로부터의 생물학적 세포 분리 방법. - 청구항 16에 있어서,
상기 수집 유동 경로를 통한 유속은 상기 유입구 유동 경로를 통한 유속보다 적어도 한 자릿수가 작은, 유체 매질로부터의 생물학적 세포 분리 방법. - 청구항 16에 있어서,
상기 유입구 유동 경로는 상기 유입구 포트로부터 상기 유출구 포트를 향해 하부 방향으로 안내되고, 그 후에, 상기 음향 챔버를 향해 상부 방향으로 안내되어, 상기 적어도 하나의 음향 정재파에 국부적으로 접선 방향을 따라 움직이는 재순환 유체 스트림을 생성하는, 유체 매질로부터의 생물학적 세포 분리 방법. - 제 19 항에있어서,
상기 재순환 유체 스트림은 상기 음향 정재파의 에지 영역으로부터 끊임없이 떨어지는 세포를 이송시키는, 유체 매질로부터의 생물학적 세포 분리 방법. - 청구항 16에 있어서,
세포 상의 압력 상승 및 음향 방사력은 상기 음향 정재파를 통과하는 유체를 정화시키기 위해 상기 음향 정재파의 에지에서 생성되는, 유체 매질로부터의 생물학적 세포 분리 방법. - 청구항 16에 있어서,
상기 유입구 포트를 통해 상기 디바이스로 들어가는 유체 매질의 유속은 분당 1 리터이며, 그리고 상기 적어도 하나의 수집 포트를 통해 상기 디바이스를 빠져나가는, 세포에 고갈된 채취 유체의 유속은 분당 10 밀리미터인, 유체 매질로부터의 생물학적 세포 분리 방법. - 청구항 16에 있어서,
상기 채취 유체가 제 2 음향 정재파를 통과하는 2 차 유동 챔버를 더 포함하고, 상기 제 2 음향 정재파는 상기 채취 유체를 더 정화시키기 위해 제 1 초음파 음향 정재파보다 높은 주파수를 가지는, 유체 매질로부터의 생물학적 세포 분리 방법. - 유동 디바이스에 있어서,
(i) 1 차 유체 및 세포를 함유하는 유동 혼합물을 수용하며; 그리고 (ii) 제 1 음향 정재파를 사용하여, 상기 유동 혼합물로부터, 세포에 고갈된 채취 유체 스트림을 상기 제 1 음향 정재파 위에서 연속적으로 배출함으로써, 상기 유동 혼합물의 세포 농도를 변화시키고, 상기 유동 혼합물로부터 세포에 풍부한 재순환 유체 스트림을 상기 제 1 음향 정재파 아래에서 연속적으로 배출하도록 구성되는, 유동 디바이스. - 청구항 24에 있어서,
상기 제 1 음향 정재파는 평면 음향 정재파 또는 다-차원 음향 정재파이거나, 또는 평면 파 및 다-차원 음향 정재파 둘 다는 상기 채취 유체 스트림을 얻기 위해 유동 경로에 걸쳐 생성되는, 유동 디바이스. - 청구항 24에 있어서,
세포 상의 압력 상승 및 음향 방사력은 상기 정재파를 통과하는 유동 혼합물을 정화시키기 위해 상기 제 1 음향 정재파의 에지에서 생성되는, 유동 디바이스. - 청구항 24에 있어서,
상기 세포에 고갈된 채취 유체 스트림이 제 2 음향 정재파를 통과하는 2 차 유동 챔버를 더 포함하고, 상기 제 2 음향 정재파는 상기 제 1 음향 정재파보다 높은 주파수를 가지는, 유동 디바이스. - 유동 디바이스에 있어서,
1 차 유체 및 세포의 유동 혼합물을 수용하는 적어도 하나의 유입구;
제 1 초음파 다-차원 음향 정재파를 생성하고, 상기 제 1 초음파 다-차원 음향 정재파의 에지에서 생성된 세포 상의 압력 상승 및 음향 방사력을 사용하여 상기 유동 혼합물을 1 차 고 세포 농도 유체 스트림 (primary high cell concentration) 및 2 차 채취 유체 스트림으로 분리시키는 초음파 트랜스듀서;
상기 제 1 초음파 다-차원 음향 정재파 아래에 위치된, 상기 1 차 고 세포 농도 유체 스트림을 위한 유출구 포트;
농축 유체 및 세포 혼합물을 추출하는 배출 포트; 및
상기 제 1 초음파 다-차원 음향 정재파 위에 위치된, 상기 2 차 채취 유체 스트림을 위한 적어도 하나의 수집 포트;를 포함하는, 유동 디바이스. - 청구항 28에 있어서,
상기 2 차 채취 유체 스트림이 제 2 음향 정재파를 통과하는 2 차 유동 챔버를 더 포함하고, 상기 제 2 음향 정재파는 상기 제 1 초음파 다-차원 음향 정재파보다 높은 주파수를 가지는, 유동 디바이스. - 청구항 29에 있어서,
상기 2 차 유동 챔버는 10 미크론 이하의 크기를 가진 포획 및 응집된 물질에 의해 상기 2 차 채취 유체 스트림을 더 정화시키기 위해 이용되고, 그 결과, 상기 응집된 물질은 상기 2 차 채취 유체 스트림으로부터 중력으로 인해 분리되는, 유동 디바이스.
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