KR102461227B1 - 프로키네티신 2 효능제 및 길항제를 이용한 24시간 주기 및 일주기 리듬 장애를 치료하기 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

프로키네티신 2 효능제 및 길항제를 이용한 24시간 주기 및 일주기 리듬 장애를 치료하기 위한 조성물 및 방법 Download PDF

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Abstract

대안적 실시양태에서, 포유동물 또는 인간에게 프로키네티신 2 (PK2) 발현 또는 활성, 및/또는 PKR2 (PK2 수용체), 바소프레신 수용체 (VR), 및/또는 멜라토닌 수용체 (MR) 발현 또는 활성을 변형시킬 수 있는 화합물 또는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 포유동물에서 24시간 주기 리듬 또는 타이밍을 변형시키기 위한, 인간 24시간 주기 조절 체계 변경에 기인한 정신과적 병태 또는 증상을 치료하기 위한, 포유동물에서 수면 문제를 치료하기 위한, 또는 수면 또는 활동 억제를 유도하기 위한, 또는 각성 또는 기상 반응을 유발하기 위한 방법을 제공한다.

Description

프로키네티신 2 효능제 및 길항제를 이용한 24시간 주기 및 일주기 리듬 장애를 치료하기 위한 조성물 및 방법
연방 정부 지원 연구에 관한 진술
본 발명은 NIH, DHHS가 수여하는 보조금 번호 DK91916 하에 정부 지원으로 이루어졌다. 정부는 본 발명에서 특정 권리를 가진다.
기술 분야
본 발명은 일반적으로 신경생물학 및 광생물학, 및 일주기 리듬 (diurnal rhythm)에 의존하는 포유동물의 행동에 관한 것이다. 대안적 실시양태에서, 포유동물 또는 인간에게 프로키네티신 2 (PK2) 발현 또는 활성, 및/또는 PKR2 (PK2 수용체), 바소프레신 수용체 (VR), 및/또는 멜라토닌 수용체 (MR) 발현 또는 활성을 변형시킬 수 있는 화합물 또는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 포유동물에서 24시간 주기 리듬 (circadian rhythmicity) 또는 타이밍을 변형시키기 위한, 인간 24시간 주기 조절 체계 변경에 기인한 정신과적 병태 또는 증상을 치료하기 위한, 포유동물에서 수면 문제를 치료하기 위한, 또는 수면 또는 활동 억제를 유도하기 위한, 또는 각성 또는 기상 반응을 유발하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 대안적 실시양태에서, PK2 효능제 또는 프로키네티신 2 (PK2), PKR2 (PK2 수용체), VR 활성, 및/또는 MR 활성을 증가시키거나, 또는 활성화시키는 화합물, 또는 조성물 투여는 포유동물에 의한 각성 또는 기상 반응을 유발하거나, 또는 일으키고, PK2 길항제 또는 프로키네티신 2 (PK2), PKR2 (PK2 수용체), VR 활성, 및/또는 MR 활성을 감소시키거나, 또는 비활성화시키는 화합물 또는 조성물 투여는 포유동물에서의 활동 억제 및 수면 유도를 유발하거나, 또는 일으킨다.
인구 중 약 2%가 수면 또는 기분 증상을 동반하는 일부 형태의 24시간 주기 리듬 장애를 앓고 있다. 24시간 주기 리듬 수면 장애의 다른 예로는, 외부 환경과 관련하여 내부 24시간 주기 시스템의 조절장애와 연관이 있는 시차증 및 교대 근무자 증후군을 포함한다. 24시간 주기 리듬 수면 장애의 또 다른 예로는, 초저녁에 잠을 자고, 매우 이른 아침에 일어나는 것 (대략 2-5am)을 특징으로 하는 전진성 수면 위상 장애 (ASPD)가 있다. 수면 문제는 일반 대중, 특히, 노인에서 흔한 것이다. 다수의 노인들이 ASPD와 유사한 일부 증상과 함께, 매우 이른 아침에 일어난다고 보고되고 있다.
24시간 주기 리듬 또는 타이밍 장애는 수면 증상 이외에도 기분에도 지대한 영향을 미친다. 현재, 정신과적 장애에서 높은 유병률의 24시간 주기 이상은 정신과적 증상의 결과일 뿐만 아니라, 24시간 주기 조절 체계 변경에 기인하는 것으로 알려져 있다. 계절성 정서 장애에 대한 전형적인 치료법으로는 항우울제 약물 요법 및 광선 요법을 포함한다. 계절성 정서 장애용의 항우울제의 효과에 관한 증거는 제한되어 있다. 광선 요법, 특히, 청색 광을 이용한 광선 요법은 계절성 정서 장애에 효과적인 것으로 보인다. 그러나, 광선 요법은 번거롭고, 시간이 많이 소요되고, 만성 또는 재발성 장애, 예컨대, 계절성 정서 장애를 앓는 대부분의 대상체를 위한 표준 요법이 되지는 못한다.
모든 종의 포유동물의 경우, 시교차상핵 (SCN)은 마스터 24시간 주기 시계를 내장하고 있는 것으로 간주되고 있다. 상기 주장을 뒷받침하는 증거는 야행성 포유동물, 예컨대, 마우스 및 래트에 대해서는 엄청나게 강력한 증거가 된다. 그러나, SCN이 24시간 주기 각성 상태 수준 조절을 위한 마스터 시계를 내장하고 있다는 동일한 주장도 인간을 비롯한, 일주기성 동물의 경우, 실제로는 제한된 입증 증거를 가진다. 일주기성 동물의 경우, SCN의 각성 상태 또는 각성 촉진으로 해석되는, 다람쥐 원숭이에서의 SCN 병변에 의한 수면 증가에 관하여 잘 인용된 논문 (문헌 [Edgar et al., 1993])은 망막시상하부로에 대해 동시 발생한 병변에 기인하는 것일 수 있다. 따라서, SCN 이외의 다른 부위도 일주기성 동물, 예컨대, 인간을 비롯한 영장류를 위한 각성 상태 수준을 조절하는 중요한 24시간 주기 시계(들)를 내장할 수 있다.
대안적 실시양태에서, 프로키네티신 2 효능제 및 길항제를 이용한, 포유동물에서 24시간 주기 리듬 또는 타이밍을 변형시키기 위한, 및 24시간 주기 및 일주기 리듬 장애를 치료, 호전 또는 예방하기 위한 조성물, 제조 생성물 및 방법을 제공한다.
대안적 실시양태에서, 표 1에 기술된 구조를 가지는 화합물, 그의 등가물, 그의 입체이성질체, 그의 유사체, 그의 제약상 허용되는 염, 또는 그의 생체등배전자체(bioisostere)가 PK2 길항제, 또는 프로키네티신 2 (PK2)의 활성을 감소시키거나, 또는 프로키네티신 2 (PK2)를 비활성화시키거나, 또는 PK2 수용체 길항제로서 작용할 수 있는 화합물 또는 조성물로서 작용하는 것인, 표 1에 기술된 구조를 가지는 화합물, 또는 그의 등가물, 또는 그의 입체이성질체, 또는 그의 유사체, 또는 그의 제약상 허용되는 염, 또는 그의 생체등배전자체를 제공한다.
대안적 실시양태에서, 본원에 제공된 화합물 또는 조성물을 포함하는 제제로서, 여기서, 임의로, 제제는 고체, 반고체, 액체, 에어로졸, 분제, 또는 에멀젼 제제인 것인 제제를 제공한다.
대안적 실시양태에서, 본원에 제공된 화합물 또는 조성물을 포함하는 제약 조성물로서, 여기서, 임의로, 제약 조성물은 장관 또는 비경구 투여용으로 제제화되고, 임의로, 화합물은 생체내 투여용으로; 또는 장관 또는 비경구 투여용으로, 또는 연고, 정제, 환제, 캡슐제, 겔제, 겔탭(geltab), 액제, 로션, 에어로졸 또는 임플란트로서 제제화되고, 임의로, 화합물이 나노입자 또는 나노지질입자로서 제제화되는 것인, 제약 조성물을 제공한다.
대안적 실시양태에서,
(a) (1) 프로키네티신 2 (PK2) 활성을 변형시키기 위한,
(2) PKR2 (PK2 수용체) 활성을 변형시키기 위한,
(3) 임의로, 바소프레신 수용체 (VR)는 V1a 또는 V1b 타입 VR인 것인, VR 활성을 변형시키기 위한, 또는
(4) 멜라토닌 수용체 (MR) 활성을 변형시키기 위한 효능제 또는 길항제로서 작용할 수 있는 화합물 또는 조성물을 제공하는 단계; 및
(b) 그를 필요로 하는 포유동물 또는 인간에게 (a)의 화합물 또는 조성물 중 하나 또는 그의 임의 조합을 투여하는 단계를 포함하고,
여기서, 임의로, 조합은 PKR2 및 VR; PKR2 및 MR; PKR2 및 PK2; VR 및 PK2; MR 및 PK2; MR 및 VR; 또는 PKR2, VR 및 MR의 효능제 또는 길항제를 포함하고,
임의로, 프로키네티신 (PK2) 수용체 길항제는 USPN 8,722,896에 기술된 화합물, 또는 화학식 1에 기술된 구조를 가지는 화합물, 또는 본원에 제공된 화합물; 또는 미국 특허 출원 공개 번호 2015/0111922; 또는 미국 특허 출원 공개 번호 2014/0038968; 또는 USPN 7,855,201 (또는 WO2007067511, PCT/US2006/046330)에 기술된 화합물이고,
임의로, 멜라토닌 수용체 (MR) 길항제는 USPN 8,907,126, 또는 WO/2014/103998에 기술된 화합물이고,
임의로, 바소프레신 수용체 (VR) 길항제는 US 2016-0221944 A1, US 2015-0073032 A1, 또는 WO/2015/036160에 기술된 화합물이고,
여기서, PK2 효능제 또는 프로키네티신 2 (PK2) 또는 PKR2 (PK2 수용체)를 증가시키거나, 또는 활성화시킬 수 있는 화합물 또는 조성물 투여는 인간 또는 포유동물에 의한 각성 또는 기상 반응을 유발하거나, 또는 일으키고,
여기서, VR 효능제 또는 VR 활성을 증가시키거나, 또는 활성화시킬 수 있는 화합물 또는 조성물 투여는 인간 또는 포유동물에 의한 각성 또는 기상 반응을 유발하거나, 또는 일으키고,
여기서, MR 효능제 또는 MR 활성을 증가시키거나, 또는 활성화시킬 수 있는 화합물 또는 조성물 투여는 인간 또는 포유동물에 의한 각성 또는 기상 반응을 유발하거나, 또는 일으키고,
PK2 길항제 또는 프로키네티신 2 (PK2) 또는 PKR2 (PK2 수용체)를 감소시키거나, 또는 비활성화시킬 수 있는 화합물 또는 조성물 투여는 인간 또는 포유동물에서 활동 억제 및 수면 유도를 유발하거나, 또는 일으키고,
VR 길항제 또는 VR 활성을 감소시키거나, 또는 비활성화시킬 수 있는 화합물 또는 조성물 투여는 인간 또는 포유동물에서 활동 억제 및 수면 유도를 유발하거나, 또는 일으키고,
MR 길항제 또는 MR 활성을 감소시키거나, 또는 비활성화시킬 수 있는 화합물 또는 조성물 투여는 인간 또는 포유동물에서 활동 억제 및 수면 유도를 유발하거나, 또는 일으키고,
길항제 또는 프로키네티신 2 (PK2), PKR2 (PK2 수용체), VR 활성, 및/또는 MR 활성을 감소시키거나, 또는 비활성화시킬 수 있는 화합물 또는 조성물 투여는
- 24시간 주기 리듬 조절과 연관된 신경정신과적 장애 치료 또는 호전,
- 광선공포증 치료 또는 호전, 또는
- 주의력 결핍/과잉 행동 장애 (ADHD) 치료 또는 호전,
- 급성 또는 만성 통증의 증상 치료, 예방 또는 호전,
- 임의로, 암이 교모세포종 또는 췌장암인 것인, 암 치료, 예방 또는 호전,
- 임의로, 염증성 질환이 건선 또는 관절염인 것인, 염증성 질환 치료, 예방 또는 호전을 유발하거나, 또는 일으키는 것인,
- 포유동물에서 24시간 주기 리듬 또는 타이밍을 변형시키기 위한,
- 인간 24시간 주기 조절 체계 변경에 기인하거나, 또는 인간 24시간 주기 조절 체계에서의 기능 장애 또는 유전적 결함에 의해 유발되거나, 또는 인간 24시간 주기 조절 체계의 비야생형 패턴 또는 인간 24시간 주기 조절 체계에서의 바이오피드백 기전의 비야생형 패턴에 의해 유발된 정신과적 병태 또는 증상을 치료 또는 호전시키기 위한,
- 24시간 주기 리듬 조절과 연관된 신경정신과적 장애를 치료 또는 호전시키기 위한,
- 포유동물에서 수면 문제 또는 수면 장애를 치료 또는 호전시키기 위한,
- 수면 또는 활동 억제를 유도하거나, 또는 각성 또는 기상 반응을 유발하기 위한,
- 광선공포증을 치료 또는 호전시키기 위한, 또는
- 주의력 결핍/과잉 행동 장애 (ADHD)를 치료 또는 호전시키기 위한,
- 급성 또는 만성 통증의 증상을 치료, 예방 또는 호전시키기 위한,
- 임의로, 암이 교모세포종 또는 췌장암인 것인, 암을 치료, 예방 또는 호전시키기 위한,
- 임의로, 염증성 질환이 건선 또는 관절염인 것인, 염증성 질환을 치료, 예방 또는 호전시키기 위한 방법을 제공한다.
대안적 실시양태에서, 24시간 주기 리듬 조절과 연관된 신경정신과적 장애는 기분 장애; 우울증; 시차증; 교대 근무자 증후군; 전진성 수면 위상 장애 (ASPD); 계절성 정서 장애 (SAD); 가족성 전진성 수면 위상 증후군; 지연성 수면 위상 타입의 24시간 주기 리듬 수면 장애, 불규칙한 수면-각성 타입 또는 비-24시간 수면-각성 타입이다.
대안적 실시양태에서, 화합물 또는 조성물은 제약 조성물로서 제제화되고, 임의로, 장관 또는 비경구 투여용으로 제제화되고, 임의로, 생체내 투여용으로, 또는 경구, 점막 또는 비내 투여용으로 제제화되고, 임의로, 연고, 정제, 환제, 캡슐제, 겔제, 연고, 겔탭, 시럽제, 슬러리, 현탁제, 액제, 로션, 에어로졸 또는 임플란트로서 제제화되고, 임의로, 화합물은 입자, 리포솜, 나노입자 또는 나노지질입자로서 제제화된다.
대안적 실시양태에서, 화합물 또는 조성물은 주사용으로, 임의로, 피하 (IC), 근육내 (IM), 정맥내 (IV) 및/또는 진피내 주사 또는 주입용으로 제제화된다. 대안적 실시양태에서, 화합물 또는 조성물은 국소 또는 점막 투여용으로 제제화되고, 임의로 겔제, 국소제, 연고, 스프레이, 점안제 또는 연고로서 제제화된다. 대안적 실시양태에서, 조성물, 화합물, 또는 제제는 경구적으로, 비경구적으로, 흡입용 스프레이에 의해, 비강으로, 국소적으로, 경막내로, 경막내로, 대뇌내로, 경막외로, 두개내로 또는 직장으로 투여된다.
대안적 실시양태에서, 효능제 또는 길항제 조성물 또는 화합물은 프로키네티신 2 (PK2), PKR2 (PK2 수용체), 바소프레신 수용체 (VR), 또는 멜라토닌 수용체 (MR)에 특이적으로 결합하고, PK2, PKR2, VR 또는 MR 활성 또는 발현을 억제시키거나, 또는 PK2, PKR2, VR 또는 MR 활성 또는 발현을 증가 또는 지속시키는 항체이다.
대안적 실시양태에서, 효능제 또는 길항제 조성물 또는 화합물은 프로키네티신 2 (PK2), PKR2 (PK2 수용체), 바소프레신 수용체 (VR), 또는 멜라토닌 수용체 (MR) 유전자 또는 전사체에 특이적으로 결합하고/거나, PK2, PKR2, VR 또는 MR 활성 또는 발현을 억제시키거나, 또는 PK2, PKR2, VR 또는 MR 활성 또는 발현을 증가 또는 지속시키는 핵산이고, 임의로, 길항제는 억제성 핵산이고, 여기서, 임의로, 억제성 핵산은 siRNA 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드이다.
대안적 실시양태에서, 여기서, 효능제 또는 길항제 조성물 또는 화합물은 프로키네티신 2 (PK2), PKR2 (PK2 수용체), 바소프레신 수용체 (VR), 또는 멜라토닌 수용체 (MR) 유전자 또는 전사체에 특이적으로 결합하고/거나, PK2, PKR2, VR 또는 MR 활성 또는 발현을 억제시키거나, 또는 PK2, PKR2, VR 또는 MR 활성 또는 발현을 증가 또는 지속시키는 소분자, 단백질, 펩티드, 탄수화물 또는 지질이다.
대안적 실시양태에서,
- 포유동물에서 24시간 주기 리듬 또는 타이밍을 변형시키기 위한,
- 인간 24시간 주기 조절 체계 변경에 기인하거나, 또는 인간 24시간 주기 조절 체계에서의 기능 장애 또는 유전적 결함에 의해 유발되거나, 또는 인간 24시간 주기 조절 체계의 비야생형 패턴 또는 인간 24시간 주기 조절 체계에서의 바이오피드백 기전의 비야생형 패턴에 의해 유발된 정신과적 병태 또는 증상을 치료 또는 호전시키기 위한,
- 24시간 주기 리듬 조절과 연관된 신경정신과적 장애를 치료 또는 호전시키기 위한,
- 포유동물에서 수면 문제 또는 수면 장애를 치료 또는 호전시키기 위한,
- 수면 또는 활동 억제를 유도하거나, 또는 각성 또는 기상 반응을 유발하기 위한,
- 광선공포증을 치료 또는 호전시키기 위한, 또는
- 주의력 결핍/과잉 행동 장애 (ADHD)를 치료 또는 호전시키기 위한,
- 급성 또는 만성 통증의 증상을 치료, 예방 또는 호전시키기 위한,
- 임의로, 암이 교모세포종 또는 췌장암인 것인, 암을 치료, 예방 또는 호전시키기 위한,
- 임의로, 염증성 질환이 건선 또는 관절염인 것인, 염증성 질환을 치료, 예방 또는 호전시키기 위한 치료적 조합으로서,
여기서, 치료적 조합은 2개 이상의 화합물 또는 조성물을 포함하고, 여기서, 2개 이상의 화합물 또는 조성물은
(1) 프로키네티신 2 (PK2) 활성을 변형시키거나,
(2) PKR2 (PK2 수용체)를 변형시키거나,
(3) 임의로, 바소프레신 수용체 (VR)는 V1a 또는 V1b 타입 VR인 것인, VR 활성을 변형시키거나, 또는
(4) 멜라토닌 수용체 (MR) 활성을 변형시키는 것 중 적어도 하나를 수행할 수 있고;
여기서, 임의로, 조합은 PKR2 및 VR; PKR2 및 MR; PKR2 및 PK2; VR 및 PK2; MR 및 PK2; 또는 PKR2, VR 및 MR의 효능제 또는 길항제를 포함하고,
임의로, 프로키네티신 (PK2) 수용체 길항제는 USPN 8,722,896에 기술된 화합물, 또는 화학식 1에 기술된 구조를 가지는 화합물, 또는 본원에 제공된 화합물; 또는 미국 특허 출원 공개 번호 2015/0111922; 또는 미국 특허 출원 공개 번호 2014/0038968; 또는 USPN 7,855,201 (또는 WO2007067511, PCT/US2006/046330)에 기술된 화합물이고,
임의로, 멜라토닌 수용체 (MR) 길항제는 USPN 8,907,126, 또는 WO/2014/103998에 기술된 화합물이고,
임의로, 바소프레신 수용체 (VR) 길항제는 US 2016-0221944 A1, US 2015-0073032 A1, 또는 WO/2015/036160에 기술된 화합물인 것인, 치료적 조합을 제공한다.
대안적 실시양태에서, 본원에 제공된 조성물, 본원에 제공된 제제, 본원에 제공된 제약 조성물, 본원에 제공된 치료적 조합, 또는 화합물 또는 조성물은
(1) 프로키네티신 2 (PK2) 활성을 변형시키거나,
(2) PKR2 (PK2 수용체)를 변형시키거나,
(3) 임의로, 바소프레신 수용체 (VR)는 V1a 또는 V1b 타입 VR인 것인, VR 활성을 변형시키거나, 또는
(4) 멜라토닌 수용체 (MR) 활성을 변형시키는 것 중 적어도 하나를 수행할 수 있고;
여기서, 임의로, 조합은 PKR2 및 VR; PKR2 및 MR; PKR2 및 PK2; VR 및 PK2; MR 및 PK2; 또는 PKR2, VR 및 MR의 효능제 또는 길항제를 포함하고,
임의로, 프로키네티신 (PK2) 수용체 길항제는 USPN 8,722,896에 기술된 화합물, 또는 화학식 1에 기술된 구조를 가지는 화합물, 또는 본원에 제공된 화합물; 또는 미국 특허 출원 공개 번호 2015/0111922; 또는 미국 특허 출원 공개 번호 2014/0038968; 또는 USPN 7,855,201 (또는 WO2007067511, PCT/US2006/046330)에 기술된 화합물이고,
임의로, 멜라토닌 수용체 (MR) 길항제는 USPN 8,907,126, 또는 WO/2014/103998에 기술된 화합물이고,
임의로, 바소프레신 수용체 (VR) 길항제는 US 2016-0221944 A1, US 2015-0073032 A1, 또는 WO/2015/036160에 기술된 화합물인 것인,
본원에 제공된 조성물, 본원에 제공된 제제, 본원에 제공된 제약 조성물, 본원에 제공된 치료적 조합, 또는 화합물 또는 조성물을 포함하는 키트를 제공한다.
대안적 실시양태에서, 본원에 제공된 조성물, 본원에 제공된 제제, 본원에 제공된 제약 조성물, 본원에 제공된 치료적 조합, 또는 화합물 또는 조성물은
(1) 프로키네티신 2 (PK2) 활성을 변형시키거나,
(2) PKR2 (PK2 수용체)를 변형시키거나,
(3) 임의로, 바소프레신 수용체 (VR)는 V1a 또는 V1b 타입 VR인 것인, VR 활성을 변형시키거나, 또는
(4) 멜라토닌 수용체 (MR) 활성을 변형시키는 것 중 적어도 하나를 수행할 수 있고;
여기서, 임의로, 조합은 PKR2 및 VR; PKR2 및 MR; PKR2 및 PK2; VR 및 PK2; MR 및 PK2; 또는 PKR2, VR 및 MR의 효능제 또는 길항제를 포함하고,
임의로, 프로키네티신 (PK2) 수용체 길항제는 USPN 8,722,896에 기술된 화합물, 또는 화학식 1에 기술된 구조를 가지는 화합물, 또는 본원에 제공된 화합물; 또는 미국 특허 출원 공개 번호 2015/0111922; 또는 미국 특허 출원 공개 번호 2014/0038968; 또는 USPN 7,855,201 (또는 WO2007067511, PCT/US2006/046330)에 기술된 화합물이고,
임의로, 멜라토닌 수용체 (MR) 길항제는 USPN 8,907,126, 또는 WO/2014/103998에 기술된 화합물이고,
임의로, 바소프레신 수용체 (VR) 길항제는 US 2016-0221944 A1, US 2015-0073032 A1, 또는 WO/2015/036160에 기술된 화합물이고,
임의로, 제조 생성물은 키트, 펌프, 장치, 피하 주입 장치, 연속 피하 주입 장치, 주입 펜, 니들, 저장소, 앰플, 바이알, 시린지, 카트리지, 펜, 1회용 펜 또는 제트 주사기, 사전충전된 펜 또는 시린지 또는 카트리지, 카트리지 또는 1회용 펜 또는 제트 주사기, 2 챔버 또는 다중 챔버 펌프인 것인,
본원에 제공된 조성물, 본원에 제공된 제제, 본원에 제공된 제약 조성물, 본원에 제공된 치료적 조합, 또는 화합물 또는 조성물을 포함하는 제조 생성물을 제공한다.
대안적 실시양태에서, 본원에 제공된 제제, 본원에 제공된 제약 조성물, 본원에 제공된 치료적 조합, 또는 화합물 또는 조성물은 의약 제조에서
(1) 프로키네티신 2 (PK2) 활성을 변형시키거나,
(2) PKR2 (PK2 수용체)를 변형시키거나,
(3) 임의로, 바소프레신 수용체 (VR)는 V1a 또는 V1b 타입 VR인 것인, VR 활성을 변형시키거나, 또는
(4) 멜라토닌 수용체 (MR) 활성을 변형시키는 것 중 적어도 하나를 수행할 수 있고;
임의로, 용도는
- 포유동물에서 24시간 주기 리듬 또는 타이밍을 변형시키기 위한 것,
- 인간 24시간 주기 조절 체계 변경에 기인하거나, 또는 인간 24시간 주기 조절 체계에서의 기능 장애 또는 유전적 결함에 의해 유발되거나, 또는 인간 24시간 주기 조절 체계의 비야생형 패턴 또는 인간 24시간 주기 조절 체계에서의 바이오피드백 기전의 비야생형 패턴에 의해 유발된 정신과적 병태 또는 증상을 치료 또는 호전시키기 위한 것,
- 24시간 주기 리듬 조절과 연관된 신경정신과적 장애를 치료 또는 호전시키기 위한 것,
- 포유동물에서 수면 문제 또는 수면 장애를 치료 또는 호전시키기 위한 것,
- 수면 또는 활동 억제를 유도하거나, 또는 각성 또는 기상 반응을 유발하기 위한 것,
- 광선공포증을 치료 또는 호전시키기 위한 것, 또는
- 주의력 결핍/과잉 행동 장애 (ADHD)를 치료 또는 호전시키기 위한 것,
- 급성 또는 만성 통증의 증상을 치료, 예방 또는 호전시키기 위한 것,
- 임의로, 암이 교모세포종 또는 췌장암인 것인, 암을 치료, 예방 또는 호전시키기 위한 것,
- 임의로, 염증성 질환이 건선 또는 관절염인 것인 염증성 질환을 치료, 예방 또는 호전시키기 위한 것인, 본원에 제공된 제제, 본원에 제공된 제약 조성물, 본원에 제공된 치료적 조합, 또는 화합물 또는 조성물의 용도를 제공한다.
대안적 실시양태에서, 의약으로서 사용하기 위한 화합물, 제제, 제조 생성물 또는 조성물로서,
임의로, 의약은
- 포유동물에서 24시간 주기 리듬 또는 타이밍을 변형시키기 위해,
- 인간 24시간 주기 조절 체계 변경에 기인하거나, 또는 인간 24시간 주기 조절 체계에서의 기능 장애 또는 유전적 결함에 의해 유발되거나, 또는 인간 24시간 주기 조절 체계의 비야생형 패턴 또는 인간 24시간 주기 조절 체계에서의 바이오피드백 기전의 비야생형 패턴에 의해 유발된 정신과적 병태 또는 증상을 치료 또는 호전시키기 위해,
- 24시간 주기 리듬 조절과 연관된 신경정신과적 장애를 치료 또는 호전시키기 위해,
- 포유동물에서 수면 문제 또는 수면 장애를 치료 또는 호전시키기 위해,
- 수면 또는 활동 억제를 유도하거나, 또는 각성 또는 기상 반응을 유발하기 위해,
- 광선공포증을 치료 또는 호전시키기 위해, 또는
- 주의력 결핍/과잉 행동 장애 (ADHD)를 치료 또는 호전시키기 위해,
- 급성 또는 만성 통증의 증상을 치료, 예방 또는 호전시키기 위해,
- 임의로, 암이 교모세포종 또는 췌장암인 것인, 암을 치료, 예방 또는 호전시키기 위해,
- 임의로, 염증성 질환이 건선 또는 관절염인 것인 염증성 질환을 치료, 예방 또는 호전시키기 위해 사용되고,
화합물, 제제, 제조 생성물 또는 조성물은,
(1) 프로키네티신 2 (PK2) 활성을 변형시키거나,
(2) PKR2 (PK2 수용체)를 변형시키거나,
(3) 임의로, 바소프레신 수용체 (VR)는 V1a 또는 V1b 타입 VR인 것인, VR 활성을 변형시키거나, 또는
(4) 멜라토닌 수용체 (MR) 활성을 변형시키는 것 중 적어도 하나를 수행할 수 있는 본원에 제공된 조성물, 본원에 제공된 제제, 본원에 제공된 제약 조성물, 본원에 제공된 치료적 조합, 또는 화합물 또는 조성물,
또는 본원에 제공된 키트, 또는 본원에 제공된 제조 생성물을 포함하는 것인, 화합물, 제제, 제조 생성물 또는 조성물을 제공한다.
본 발명의 하나 이상의 예시적인 실시양태에 관한 상세한 설명은 첨부된 도면 및 하기 설명에서 기술된다. 본 발명의 다른 특징, 목적, 및 이점은 설명 및 도면으로부터, 및 특허청구범위로부터 자명해질 것이다.
본원에서 인용된 모든 공개 문헌, 특허, 특허 출원은 명백하게 모든 목적을 위해 본원에서 참조로 포함된다.
본원에 기술된 도면은 본원에 제공된 예시적인 실시양태를 예시하는 것이고, 본 특허청구범위에 의해 포함되는 본 발명의 범주를 제한하고자 하는 것이 아니다.
도 1a-b는 PK2-/- 마우스에서의 광 펄스가 운동 활동 및 각성 수준에 미치는 억제 효과를 조사한 연구로부터 얻은 데이터를 그래프로 도시한 것이고: 하기 실시예 1에 상세하게 기술된 바와 같이, 도 1a는 광 노출 또는 암기 노출의 함수로서의 활동 계수를 보여주는 것으로서, 암기 중간 무렵에 (ZT16-ZT18.5로 명시) 광 펄스 (150 lux)를 야생형 마우스에 투여하였을 때, 운동 활동은 유의적으로 억제되었고, 그에 반해, PK2-/- 마우스의 경우, 광 펄스에 의한 운동 활동의 억제는 단지 미미하게 나타난 것으로 관찰되었고; 도 1b는 광 노출 또는 암기 노출의 함수로서의 각성 시간 (분)을 보여주는 것으로서, EEG/EMG 기록 결과, 광 펄스는 야생형 마우스, 또는 PK2-/- 마우스에서 각성 상태를 억제시킨 것으로 나타났다
도 2a-b는 암기 노출 및 약광 노출의 함수로서 활동 계수 및 각성 상태 시간을 비교한 연구로부터 얻은 데이터를 그래프로 도시한 것이다. 하기 실시예 1에 상세하게 기술된 바와 같이, PK2-/- 마우스의 경우, 약광하에서 및 암기하에서 각성 상태 시간은 매우 유사하였고, 이는 PK2 신호전달 부재하에서는 약광에 의한 각성 억제가 단지 미미하게만 이루어진다는 것을 시사하는 것이다. 하기 실시예 1에 상세하게 기술된 바와 같이, 야생형 마우스의 경우, 상기 4시간의 약광 기간 동안의 활동 계수 및 깨어있는 상태로 유지된 기간은 암기하에서보다 훨씬 더 감소되었고, 이를 통해 약광의 강력한 수면 유도 효과가 밝혀졌다.
도 3a-d는 ipRGC 중에서의 PK2의 발현에 대해 연구한 것인, PK2를 발현하는 망막 신경절 세포의 영상을 도시한 것이다: 하기 실시예 1에 상세하게 기술된 바와 같이, 도 3a는 PK2가 일부 망막 신경절 세포에서 강력하게 발현된다는 것을 보여주는 것이고, 추가의 공동 면역염색 연구를 통해 모든 OPN4 양성 망막 신경절 세포가 PK2를 발현하는 것으로 나타났고 (도 3b); 도 3c는 (DNA를 염색하는) 훽스트(Hoechst) 염색의 영상을 보여주는 것이고, 도 3d는 도 3a-c의 병합된 영상이다.
도 4a-d는 일주기성 원숭이의 망막 신경절 세포의 영상을 도시한 것이다: 하기 실시예 1에 상세하게 기술된 바와 같이, 도 4a는 원숭이 ipRGC에서의 PK2 염색을 보여주는 것이고; 도 4b는 동일한 망막 신경절 세포에서의 OPN4 염색을 보여주는 것이고; 도 4c는 망막 신경절 세포에서의 훽스트 염색을 보여주는 것이고; 도 4d는 PK2가 원숭이 ipRGC에서 OPN4와 함께 공동 발현된다는 것을 보여주는 도 4a-c의 병합된 영상이다.
도 5a-d는 마우스 뇌 및 원숭이 뇌에서의 PKR2 발현 영상을 도시한 것이고: 하기 실시예 1에 상세하게 기술된 바와 같이, 도 5a는 PKR2 염색을 보여주는 것이고, 이는 PKR2가 오직 등쪽 SCN에서만 발현되고, 원숭이 뇌의 복부 SCN에서는 검출되지 않음을 나타내고; 도 5b는 PKR2 염색을 보여주는 것이고, 이는 PKR2가, 마우스 뇌의 SCN의 복부 및 등쪽 구획, 둘 모두를 포함하는 전체 SCN에서 발현된다는 것을 나타내고: 도 5c는 PKR2 염색을 보여주는 것이고, 이는 PKR2가 원숭이 뇌에서 SC의 표피 층에서 강건하게 발현되었다는 것을 나타내고; 도 5d는 PKR2 염색을 보여주는 것이고, 이는 PKR2 발현이 마우스 뇌의 SC에서 검출되지 않았다는 것을 나타낸다.
도 6a-c는 마우스 및 원숭이에서 합성 PK2 길항제인 PKRA83이 각성 수준에 미치는 효과에 관하여 조사한 연구로부터 얻은 데이터를 그래프로 도시한 것이고: 하기 실시예 1에 상세하게 기술된 바와 같이, 도 6a 및 도 6b는 PKRA83 투여가 마우스에서 운동 활동 (도 6a) 및 각성 상태 (도 6b)를 유의적으로 증가시켰다는 것을 보여주는 데이터를 도시한 것이고; 도 6c는 원숭이에서의 PK2 길항제 투여는 수면 시간을 유의적으로 증가시켰다는 것을 보여주는 데이터를 도시한 것이다.
도 7a-b는 마우스 망막의 망막 신경절 세포에서의 PK2의 발현을 보여주는 영상을 도시한 것이고: 하기 실시예 1에 상세하게 기술된 바와 같이, 도 7a에는 하나는 변성되지 않은 것이고, 하나는 변성된 것인, 두 PK2 양성 망막 신경절 세포의 예가 화살표 표시로 제시되어 있고; 도 7b에는 하나는 강하게 염색되고, 하나는 좀 더 작게 염색된, 두 PK2 양성 망막 신경절 세포의 예가 화살표 표시로 제시되어 있다.
도 8은 하기 실시예 1에 상세하게 기술된 바와 같이, 뇌 표적 상에서의 ipRGC의 PK2 신호전달에 의한 차별적 각성 조절을 보여주는 다이어그램을 도시한 것이다.
도 9a-b는 망막의 외핵층에서의 PK2 발현이 연속된 암기 동안 증가된 것으로 나타났다는 것을 보여주는 영상을 도시한 것이고, 여기서, 하기 실시예 1에 상세하게 기술된 바와 같이, 영상은 ZT4(도 9a)와 비교하여 CT4(도 9b)에 망막의 외핵층에서의 PK2의 상향조절을 보여주는 것이고, PK2 면역염색이 제시되어 있고; 박스로 표시된 영역은 마우스 망막의 외부 분절을 나타내는 것이고; 핵 대조염색은 청색으로 제시되어 있다.
도 10a-b는 ipRGC에서의 PK2의 시계에 의존하는 방식의 진동적 발현을 그래프로 도시한 것이고: 하기 실시예 1에 상세하게 기술된 바와 같이, 도 10a는 평균 ± SEM로 정량화되고, 제시된, PK2의 면역형광 강도 데이터 및 상응하는 영상을 도시한 것이고; 도 10b는 Bmal1 결핍 마우스 (BMAL KO)의 ipRGC에서의 PK2 수준은 일관되게 낮았고, 겉보기 PK2 진동은 나타나지 않았다는 것을 보여주는 데이터 및 상응하는 영상을 도시한 것이고; 칼럼 상의 인서트는 ipRGC (녹색)의 PK2 면역염색의 대표적인 영상을 보여주는 것이고, 핵 대조염색은 청색으로 제시되어 있다.
도 11a-d는 PK2 수용체인 PKR2가 특정 망막 신경절 세포에서 발현된다는 것을 보여주는 계내 하이브리드화의 영상을 도시한 것이고: 하기 실시예 2에 상세하게 기술된 바와 같이, 도 11a는 망막 신경절 세포층에서의 PKR2 신호를 보여주는 것이고; 도 11b는 도 11a의 박스로 표시된 영역의 더 높은 고배율의 영상을 보여주는 것이고; 도 11b에서, PKR2 양성인 개별 망막 신경절 세포가 뚜렷이 보이고; 도 11c 및 도 11d는 각각 도 11a 및 도 11b에 상응하는, 눈 절편의 니슬(Nissl) 염색을 보여주는 것이다.
도 12는 PK2-결핍 (PK2-/-) 마우스에서 각성 수준은 늦은 밤 동안 증가되되었다는 것을 보여주는 데이터를 그래프로 도시한 것이고, 하기 실시예 2에 상세하게 기술된 바와 같이, 이는 PK2-/- 마우스에서 늦은 밤 기간 (ZT20-ZT24) 동안 각성 상태가 증가되었음을 보여주는 것이다.
도 13은, 하기 실시예 2에 상세하게 기술된 바와 같이, PK2 길항제 (PKRA)의 안구 국소 전달이 (길항제를 받지 않은) 대조군 마우스 대비 PKRA를 투여받은 마우스의 운동 활동을 증가시켰다는 것을 보여주는 데이터를 그래프로 도시한 것이다.
도 14는, 하기 실시예 2에 상세하게 기술된 바와 같이, PK2 길항제 (PKRA)가 (길항제를 받지 않은) 대조군 마우스 대비 마우스의 각성 수준에 미치는 효과를 보여주는 데이터를 그래프로 도시한 것이다.
도 15는, 하기 실시예 2에 상세하게 기술된 바와 같이, PK2 길항제 (PKRA83)가 (길항제를 받지 않은) 대조군 대비 원숭이의 수면에 미치는 효과를 보여주는 데이터를 그래프로 도시한 것이다.
도 16은, 하기 실시예 2에 상세하게 기술된 바와 같이, ipRGC의 분자 기계, 커플링 및 전략적 위치, 및 야행성 및 일주기성 포유동물에서 각성 수준 조절을 위해 중요한 뇌와의 그의 관계를 보여주는 다이어그램을 도시한 것이다.
도 17은, 하기 실시예 2에 상세하게 기술된 바와 같이, CT4에 망막의 외핵층에서의 바소프레신 (AVP)의 상향조절을 보여주는 영상을 도시한 것이고, 여기서, 좌측 상단 패널은 PK2 염색을 보여주는 것이고, 우측 상단 패널은 AVP 염색을 보여주는 것이고, 좌측 하단 패널은 훽스트 염색을 보여주는 것이고, 우측 하단 영상은 다른 3개 패널의 병합 영상이다.
도 18은 바소프레신 (AVP) 또한 ipRGC에서 발현된다는 것을 도시한 것이고, 여기서, 좌측 상단 패널은 PK2 염색을 보여주는 것이고, 우측 상단 패널은 AVP 염색을 보여주는 것이고, 좌측 하단 패널은 훽스트 염색을 보여주는 것이고, 우측 하단 영상은 다른 3개 패널의 병합 영상이다.
도 19는, 하기 실시예 2에 상세하게 기술된 바와 같이, PK2 수용체 길항제의 비강 적용이 원숭이에서 수면을 촉진시켰다는 것을 보여주는, 대조군 (길항제 부재) 대비 PKRA를 투여받은 원숭이에서의 수면 시간에 관한 데이터를 그래프로 도시한 것이다.
다양한 도면에서 유사 참조 기호는 유사 요소를 나타낸다.
대안적 실시양태에서, 포유동물 또는 인간에게 프로키네티신 2 (PK2) 활성을 변형시킬 수 있는 화합물 또는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 포유동물에서 24시간 주기 리듬 또는 타이밍을 변형시키기 위한, 인간 24시간 주기 조절 체계 변경에 기인한 정신과적 병태 또는 증상을 치료하기 위한, 포유동물에서 수면 문제를 치료하기 위한, 또는 수면 또는 활동 억제를 유도하기 위한, 또는 각성 또는 기상 반응을 유발하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 본 발명은 어느 특정 작용 기전에 의해 제한되는 것은 아니지만, 예컨대, 특정 중추 신경계 장애, 예컨대, 수면, 기분 장애, 및 24시간 주기 리듬 조절과 연관된 다른 신경정신과적 장애 치료를 위한, 내재적 감광성 망막 신경절 세포에서 발현되는 수용체의 활성 또는 활성화, 또는 상기 수용체의 수용체 신호전달의 억제 또는 활성화의 결과를 표적화하고, 변형시키는 조성물 및 방법을 제공한다.
본원에서는 PK2가 내재적 감광성 망막 신경절 세포 (ipRGC)와 커플링되고, 이는 또한 각성 수준 및 수면/각성 주기 조절을 위해 ipRGC의 뇌 표적으로 신호를 전달한다는 것을 최초로 기술한다. ipRGC의 분자 기계 및 전략적 위치를 통해 ipRGC는 24시간 주기 시계 정보 및 환경상 명/암 조건을 통합시킬 수 있다. ipRGC는, 특히, 인간을 비롯한 일주기성 포유동물의 경우에 각성 수준 및 수면 각성 주기 조절을 위해 중요한, 뇌 중심부, 예컨대, 상구로 투사된다. 본원에서 제공하는 바와 같이, ipRGC, 구체적으로, ipRGC에서 발현되는 수용체의 약리학적 표적화가 관련된 중추 신경계 장애, 특히, 수면 및 기분 장애, 예컨대, 계절성 정서 장애, 및 양극성 장애 치료를 위한 수단을 제공한다.
본원에서는 본원에 기술된 바와 같이, 프로키네티신 2 (PK2) 신호전달 조절에 의해 변형될 수 있는 활성을 가지는 내재적 감광성 망막 신경절 세포 (ipRGC)가 각성 상태 및 수면 조절을 위해 일주기성 포유동물에서 24시간 주기 리듬 조절을 위해 중요하다는 것을 보여주는 데이터를 최초로 기술한다. 본원에서는 각성 상태 및 수면 조절을 위해 ipRGC의 PK2 신호전달을 조절하기 위한 방법을 제공한다.
본 발명자들은 내재적 감광성 망막 신경절 세포 (ipRGC)가 주변 명암 조건하에서 일주기성 동물을 위한 마스터 24시간 주기 시계 중 하나를 내장하고 있다는 것을 발견하였다. 특히, 본 발명자들은 시계 출력 분자인 프로키네티신 2 (PK2)가 마우스 (도 3) 및 원숭이 (도 4)의 ipRGC에서 발현된다는 것을 밝혀내었다. ipRGC는 차광 및 광 동조화를 매개하는 광 채널이다. ipRGC는 그 자신의 광색소를 통해 광을 직접 감지하고, 망막의 외부 분절 중의 고전적 광수용체를 통해 간접적으로 감지한다. ipRGC로부터의 PK2 신호전달은 시교차상핵 (복부 SCN)의 망막수용 구획에 작용하고, 이는 또한 중뇌의 상구 (SC)에 작용한다. 마우스 뇌에서, PKR2 (PK2 수용체)는 망막수용 SCN에서 강건하게 발현되지만, 본질적으로 SC에는 존재하지 않고, 따라서, PK2 신호전달은 주로 ipRGC-SCN 경로를 통해 이동한다. 그에 반해, PKR2는 원숭이 뇌의 망막수용 복부 SCN에서는 발현되지 않지만, SC의 망막수용 표피층에서는 강력하게 발현된다. 따라서, 원숭이에서의 ipRGC의 PK2 신호전달은 ipRGC-SC 경로를 통해 이동한다. 전반적으로, PK2 신호전달은 일주기성 원숭이에 대해서는 각성 수준에 대해 자극성을 띠고, 야행성 마우스에 대해서는 억제성을 띤다 (도 8, 하기 실시예 1 참조).
ipRGC-SC 경로는 측면 후부/시상베게 시상 루트를 통해 전송되는 피질 영역으로의 투사를 통해, 또는 뇌간 망상 활성화계를 통해 각성 수준을 조절한다. ipRGC-SC 경로의 PK2 신호전달은 가능하게는 야행성 마우스 및 일주기성 원숭이, 둘 모두의 각성 수준에 대해 자극성을 띨 수 있다. 광에 의한 ipRGC-SC 경로의 각성 자극은 가능하게는 야행성 동물, 예컨대, 래트 및 마우스에서는 상대적으로 작을 수 있다 (단기간, 그러나, 지속되지 않음). 이는 마우스의 뇌의 SC에서는 PKR2 (PK2 수용체)가 발현되지 않는다는 것과 일관된 것이다. SC, 시상의 측면 양성/시상베게 복합체 및 결합된 피질의 전반적인 크기는 모두 야행성 포유동물, 예컨대, 마우스와 비교하여 일주기성 포유동물, 예컨대, 영장류에서 유의적으로 확장 및 확대되어 있다는 점에 주의한다. SCN (복부 및 등쪽, 둘 모두)에서의 PK2 경로는 가능하게는 각성 중심부, 예컨대, 시상하부의 복측면 시각전핵, 측면 시상하부, 청반으로 직접 또는 간접적으로 투사된다. ipRGC-SCN 경로의, PKR2 (PK2 수용체)를 포함하는 PK2 신호전달 경로는 야행성 마우스의 각성 수준에 대해서는 명백하게 억제성을 띤다. 본 발명자들의 발견을 통해 포유동물의 일주기성/야행성 결정은 그의 뇌 표적 상으로의 ipRGC의 차별적인 신호전달에 의해 매개된다는 것이 밝혀졌다. 원숭이 SCN에서의 PK2는 마우스의 것과 동일한 위상에서 진동하는 것으로 알려져 있다 (문헌 [Burton et al., 2016]).
제조 생성물 및 키트
(1) 프로키네티신 2 (PK2) 활성을 변형시키거나, (2) PKR2 (PK2 수용체)를 변형시키거나, (3) 임의로, 바소프레신 수용체 (VR)는 V1a 또는 V1b 타입 VR인 것인, VR 활성을 변형시키거나, 또는 (4) 멜라토닌 수용체 (MR) 활성을 변형시키기 위한, 본원에 제공된 치료적 조합, 또는 본원에 제공된 화합물 또는 조성물, 예컨대, 제약 조성물을 포함하는 제조 생성물 및 키트로서, 여기서, 임의로, 조합은 PKR2 및 VR; PKR2 및 MR; PKR2 및 PK2; VR 및 PK2; MR 및 PK2; 또는 PKR2, VR 및 MR의 효능제 또는 길항제를 포함하는 것인, 제조 생성물 및 키트를 제공한다.
대안적 실시양태에서, 키트는 본원에 제공된 방법을 실행하기 위한 사용 설명서를 추가로 포함한다.
본 발명은 본원에 기술된 실시예를 참고로 하여 추가로 기술되겠지만; 그러나, 본 발명은 그러한 실시예로 제한되는 것은 아님을 이해하여야 한다.
실시예
실시예 1: 포유동물의 일주기성 및 야행성 결정을 위한 신규한 신경 및 분자 기전
본 실시예는 본원에 제공된 방법이 포유동물에서 24시간 주기 리듬 또는 타이밍을 변형시키기는 데, 인간 24시간 주기 조절 체계 변경에 기인한 정신과적 병태 또는 증상을 치료하는 데, 포유동물에서 수면 문제를 치료하는 데, 또는 수면 또는 활동 억제를 유도하는 데, 또는 각성 또는 기상 반응을 유발하는 데 효과적이라는 것을 입증한다. 본원에서는 포유동물의 일주기성 및 야행성 결정을 위한 신규한 신경 및 분자 기전을 최초로 기술한다. 여기서, 본 발명자들은, 앞서 시교차상 24시간 주기 시계의 출력 분자인 것으로 밝혀진 프로키네티신 2 (PK2)가 내재적 감광성 망막 신경절 세포에서 발현되고, PK2 신호전달은 마우스에서의 광에 의한 활동 및 각성 억제에 요구된다는 것을 입증한다. 야행성 마우스와 일주기성 원숭이 사이에서, PK2에 대한 신호전달 수용체는 내재적 감광성 망막 신경절 세포의 뇌 투사 표적인 망막수용 시교차상핵 및 상구에서 차별적으로 발현되는 것으로 보인다. 선택적 길항제로 차단한 결과, PK2 신호전달은 각각 야행성 마우스 및 일주기성 원숭이에서의 각성 수준에 대하여 억제성 및 자극성 효과를 나타내는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 포유동물의 일주기성 또는 야행성은 내재적 감광성 망막 신경절 세포로부터의 그의 망막수용 뇌 표적 상으로의 PK2의 차별적인 신호전달에 의해 결정된다.
본 실시예에서, 본 발명자들은, 앞서 중요한 SCN 생산 신호인 것으로 밝혀진 분자인 PK2가 내재적 감광성 망막 신경절 세포 (ipRGC)에서 멜라놉신 (OPN4)과 함께 공동 발현된다고 밝혔다. 본 발명자들은 마우스에서의 지속적인 광 유도성 활동 억제 및 수면 유도를 위해서는 PK2 신호전달이 요구된다는 것을 추가로 밝혔다. PK2 길항제로 차단한 결과, PK2 신호전달은 야행성 마우스 및 일주기성 원숭이에서의 각성 수준에 대하여 반대 효과를 미치는 것으로 나타났다. 야행성 마우스와 일주기성 원숭이 사이의 ipRGC의 망막수용 뇌 표적에서의 PK2 신호전달 수용체의 차별적 발현에 관한 관찰 결과와 조합해 보면, 포유동물의 일주기/야행성 결정은 가능하게는, SCN 시계 상류의, 망막-뇌 입력 경로 사이에서 이루어진다.
결과
1. 마우스에서의 운동 활동 및 각성의 지속적인 광 유도성 억제를 위해서는 PK2 신호전달이 요구된다.
PK2 (PK2-/-) 또는 그의 수용체 (PKR2) 유전자가 결핍된 마우스는 일정한 어두운 조건하에서 운동 활동의 감소된 24시간 주기 리듬을 가졌다29 , 30. 본 발명자들은 PK2-/- 마우스가 또한 명/암 (LD) 주기하에서 증가된 주간 운동 활동을 보였다는 것을 관찰하였는데, 이는 명기 동안 PK2-/- 마우스에서 각성 상태는 증가되었다는 이전 관찰 결과와 일관된 것이다31. 이러한 관찰 결과는 광 억제 효과가 PK2 신호전달의 부재하에서는 비정상적이라는 것을 제안하였다. 이에, 본 발명자들은 PK2-/- 마우스에서 광 펄스가 운동 활동 및 각성 수준에 미치는 억제 효과에 관하여 연구하였다. 암기 중간 무렵에 (ZT16-ZT18.5) 광 펄스 (150 lux)를 야생형 마우스에 투여하였을 때, 운동 활동은 유의적으로 억제되었다 (도 1a). 그에 반해, PK2-/- 마우스의 경우, 광 펄스에 의한 운동 활동의 억제는 단지 미미하게 나타난 것으로 관찰되었다 (도 1a 및 인서트). 예상대로, EEG/EMG 기록 결과, 광 펄스는 야생형 마우스에서 각성 상태를 억제시킨 것으로 나타났다 (도 1b 및 인서트). PK2-/- 마우스의 경우, 광이 각성 상태에 미치는 억제는 처음 30 min 동안에만 유의적이었다 (도 1b). 따라서, 광은 PK2-/- 마우스에서는 각성 상태를 계속해서 억제시킬 수 있지만, 억제 효과는 유지되지 않았다.
본 발명자들은 약광을 이용하여 광이 운동 활동 및 각성 수준에 미치는 억제 효과를 조사하였다. ZT12에서의 대략 150 lux의 규칙적 조명 조건 종료 직전, 광도를 ZT12-ZT16에 상응하는 4시간의 기간 동안 ~30 lux까지 약광으로 만들었다. 이러한 감소된 조명은 연속적으로 야생형 마우스의 운동 활동을 억제시켰다 (도 2a 및 인서트). 그에 반해, PK2-/- 마우스는 광도 감소에 대한 반응으로 매우 강건한 운동 활동을 보였으며, 암기하에서의 것과 매우 유사한 활동 수준을 달성하였다 (도 2a). 이러한 관찰 결과는 늦은 낮 시간 동안의 활동을 위한 높은 항상성 추동시, 약광은 PK2-/- 마우스에서 더 이상 운동 활동을 현저하게 억제시킬 수 없는 것으로 나타났다. EEG/EMG 기록을 통해 상응하는 각성 수준이 상기와 같은 약광 처리에 의해 영향을 받았다는 것을 확인할 수 있었다. 야생형 마우스의 경우, 상기 4시간의 약광 기간 동안 깨어있는 상태로 유지된 기간은 암기하에서보다 훨씬 더 감소되었고, 이를 통해 약광의 강력한 수면 유도 효과가 밝혀졌다 (도 2a). PK2-/- 마우스의 경우, 약광하에서 및 암기하에서의 각성 상태 시간은 매우 유사하였고, 이는 PK2 신호전달 부재하에서는 약광에 의한 각성 억제가 단지 미미하게만 이루어진다는 것을 시사하는 것이다 (도 2b).
2. 내재적 감광성 망막 신경절 세포에서의 PK2의 발현
PK2-/- 마우스에서의 광이 각성 수준 및 운동 활동에 미치는 억제 효과가 감소되었다는 것은, ipRGC가 운동 활동 억제 및 수면 유도를 비롯한, 광의 비시각적 기능의 중추 전달을 위한 광 채널로서의 밝혀졌는 바, PK2 신호전달이 ipRGC-뇌 신경 경로에 관여할 가능성이 있다는 것을 나타낸다22 , 23, 24, 25, 32, 33. 이에, 본 발명자들은 ipRGC에서의 PK2 발현의 가능성에 관하여 연구하였다. 도 3a 및 도 7에 제시된 바와 같이, PK2는 일부 망막 신경절 세포에서 강력하게 발현된다. 추가의 공동 면역염색 연구를 통해 모든 OPN4 양성 망막 신경절 세포가 PK2를 발현하는 것으로 나타났다 (28개의 세포 중 28개, 도 3). ipRGC에서의 대략 100%의 PK2 및 OPN4의 공동 발현은 ipRGC의 PK2가 SCN 및 뇌의 다른 비시각적 광 기능 영역, 예컨대, 상구로 투사된다는 것을 나타내었다34 , 35, 36.
3. 야행성 마우스와 일주기성 원숭이 사이의 내재적 감광성 망막 신경절 세포의 뇌 표적에서의 PK2 수용체의 차별적 발현
야행성 마우스와 같이, PK2 발현은 또한 일주기성 원숭이의 망막 신경절 세포에서 검출되었다 (도 4a). PK2는 원숭이 ipRGC에서 OPN4와 공동 발현되며, 이 또한 마우스의 것과 일치하는 것이다 (도 4b/d). 뇌 PK2 수용체인 PKR2의 SCN 구획에서의 차별적인 발현이 야행성 마우스 및 일주기성 원숭이에서 관찰되었다는 점이 중요하다. 마우스 뇌에서, PKR2는 SCN의 복부 및 등족 구획, 둘 모두를 포함하는 전체 SCN에서 발현된다 (도 5b)6, 37. 복부 SCN은 망막수용 구획이라는 것, 즉, 차광 및 24시간 주기 시계 동조화를 위해 망막 입력을 수용하는 것으로 나타났다9 , 38. 마우스의 망막수용 SCN에서의 PKR2의 발현은 마우스 복부 SCN이 ipRGC로의 PK2 신호에 반응할 가능성이 있다는 것을 나타낸다. 본 발명자들의 이전의 전기생리학적 연구를 통해 PK2는 PKR2를 발현하는 뉴런의 전기 활동을 증가시킨다는 것이 밝혀졌다39, 40. 원숭이 뇌에서, PKR2는 오직 등쪽 SCN에서만 발현되고, 복부 SCN에서는 검출되지 않는다 (도 5a). 야행성 동물과 같이, 복부 SCN은 SCN 시계의 망막수용 구획인 것으로 밝혀졌다38 , 41. 복부 SCN에서의 PKR2 발현 부재는 원숭이 SCN이 ipRGC로부터의 PK2 신호에 대해 반응하지 못한다는 것을 나타낸다. 마우스와 원숭이 뇌 사이의 상이한 PKR2 발현은 ipRGC의 또 다른 중요한 비시각적 뇌 표적인 상구 (SC)에서도 또한 관찰되었다34 , 35, 36. 도 5c에 제시된 바와 같이, PKR2는 원숭이 뇌 중 SC의 표피 층에서 강건하게 발현되었다. SC의 표피 층은 ipRGC를 비롯한, 망막 신경절 세포로부터의 입력을 수용하는 것으로 공지되어 있다34 , 35, 36. 그에 반해, 마우스 뇌의 SC에서는 PKR2 발현이 검출되지 않았으며 (도 5d), 이는 마우스에는 ipRGC-SC를 통한 PK2 신호전달이 존재하지 않는다는 것을 시사하는 것이다.
4. 야행성 마우스 및 일주기성 원숭이에서의 PK2 차폐가 각성 수준에 미치는 반대 효과
이어서, 본 발명자들은 마우스 및 원숭이에서 합성 PK2 길항제인 PKRA83이 각성 수준에 미치는 효과에 관하여 연구하였다. 도 6a 및 6b에 제시된 바와 같이, PKRA83 투여는 마우스에서는 운동 활동 및 각성 상태를 증가시켰다. 상기 결과는 PK2-/- 마우스에서 각성 상태가 증가되었다는 이전 관찰 결과와 일관된 것이다31. 따라서, 야행성 마우스의 경우, PK2 신호는 각성 수준에 대하여 전반적으로 억제성을 띤다. 그에 반해, 원숭이에서의 PK2 길항제 투여는 수면 시간을 유의적으로 증가시켰고 (>70분), 이는 PK2 신호가 일주기성 원숭이에서는 각성 수준에 대하여 자극성을 띤다는 것을 시사하는 것이다.
결론
본 발명자들은 PK2는 중추 투사 ipRGC에서 발현된다는 것을 밝혀내었다. ipRGC가 광의 비시각적 기능의 중추 전달을 위한 유일의 광 채널인 바, PK2-/- 마우스에서 지속적인 광 유도성 활동 억제 및 수면 유도가 존재하지 않는다는 것은 ipRGC의 PK2 신호전달이 야행성 마우스에서 광이 각성 조절에 미치는 효과를 전달하는 데 중요하다는 것을 나타낸다. PK2 길항제 투여를 통해 PK2 신호전달을 차단함으로써 PK2 신호가 각성 수준에 대하여 반대 효과: 야행성 마우스의 경우, 억제성이고, 일주기성 원숭이인 경우, 자극성인 효과를 미친다는 것이 입증되었다. 종합해 보면, 상기 결과들은 야행성 및 일주기성 분기 기전은 ipRGC의 그의 뇌 표적 상에서의 차별적인 PK2 신호전달에 있다는 것을 입증한다 (도 8).
ipRGC의 PK2 신호전달은 ipRGC의 뇌 표적, 특히, SCN 및 SC에 작용함으로써 각성 수준을 조절할 가능성이 있다. 이어서, SCN의 망막수용 구획 및 SC의 망막수용 표피 층에서 PK2 수용체 (PKR2)의 차별적인 발현은 야행성 마우스와 일주기성 원숭이 사이에서 광이 각성 수준에 미치는 반대 효과의 기초가 된다. 마우스 뇌에서, PKR2는 망막수용 SCN에서는 강건하게 발현되지만, SC에는 존재하지 않고, 따라서, 야행성 마우스에서 ipRGC의 PK2 신호전달은 각성 억제성 ipRGC-SCN 경로를 통해 이동한다. 그에 반해, PKR2는 원숭이 뇌의 망막수용 복부 SCN에서는 발현되지 않지만, SC의 망막수용 표피 층에서는 강력하게 발현되고, 따라서, 일주기성 원숭이에서 ipRGC-SC 경로가 지배적이다.
ipRGC-SC 경로의 PK2 신호전달은 각성 수준에 대하여 자극성을 띨 가능성이 있다. SC는 앞서 광 유도성 각성, 또는 각성 증가와 밀접한 관계가 있는 다른 뇌의 더 높은 고위 기능, 예컨대, 주의력을 위해 중요한 핵심부인 것으로 나타났다42 , 43, 44, 45. SC는 시상의 측면 후부/시상베게 복합체를 통해 경로를 거쳐 전송되는 피질로의 상행 투사를 통하여 광 유도 각성을 매개할 수 있다46 , 47. 대안적으로, SC는 상행 활성화 시스템의 중요한 성분인 중뇌의 망상체로의 하행 투사를 통하여 각성을 촉진시킬 수 있다42 , 43, 44, 45. 원숭이에서, SC의 양측 병변은 광에 대한 반응을 비롯한, 각성 수준에 대폭적인 영햐을 미치는 것으로 나타났다42. 래트에서의 병변 연구 결과, SC는 섬광에 대한 반응으로 EEG 비동기화 (각성)에 중요한 것으로 밝혀졌다43. 상기 래트 병변 연구는 야행성 동물에서 ipRGC-SC 경로가 적어도 짧게 섬광에 대한 반응으로 각성 수준에 대하여 자극성을 띨 수 있다는 것을 제안한다. 전반적으로, 억제성 ipRGC-SCN 경로가 지배적인 바, 광은 야행성 동물의 각성 수준에 대해 억제성을 띤다. 야행성 동물과 비교하여, 일주기성 포유동물 종, 예컨대, 영장류에서 SC, 시상의 측면 후부/시상베게 복합체, 및 회합된 피질의 전체 크기는 모두 확장 및 확대되어 있다는 것은 널리 공지되어 있다48 , 49. 포유동물 종이 야행성이 되는 것을 시작한 것으로 간주된 바와 같이50, 포유동물의 일주기성은 각성 자극성 망막-SC 경로의 증진 및 각성 억제성 망막-SCN 경로의 동시 감소를 통해 진화될 수 있다. 이러한 모델은 야행성/일주기성 결정은 SCN 24시간 주기 시계의 상류에 있고, 이에, SCN 시계 하류의 분기성 신호전달은 필요하지 않을 수 있다는 것을 나타낸다.
방법
동물: PK2-/- 마우스 및 혼합된 유전적 배경의 그의 한배 새끼 야생형 대조군을 기술된 바와 같이 생성하였다29 , 31. 마우스를 리보(libo)에서 먹이를 주고, 7:00 a.m. (차이트게버 시간(Zeitgeber Time) ZT0, 명기 ZT0-ZT12)에 점등하고 (대략 150 lux의 백색광), 7:00 p.m. (ZT12, 암기 ZT12-ZT0)에 소등하면서, 규칙적인 명/암 주기로 하우징하였다. 모든 동물 방법은 적절한 실험 동물 운영 위원회(institutional animal use committee)의 승인을 받았다.
마우스에서의 운동 활동 측정 및 분석: 운동 활동 모니터링을 기술된 바와 같이 수행하였다29. 간략하면, 마우스를 운동 활동의 모니터링을 위한 적외선 빔이 장착된 케이지를 이용하여 개별적으로 하우징하였다 (어쿠스캔 인스트루먼트 인크.(AccuScan Instrument Inc.: 미국 오하이오주 콜럼버스)). 마우스를 규칙적인 12h 명기 (대략 150 lux의 백색광): 12h 암기 주기로 하우징하였다. 운동 활동을 10 min 간격당 계수로서 기록하였고, 30 또는 60 min 핀으로 분석하였다. 광 펄스 또는 약광을 명시된 강도로 투여하였다.
마우스에서의 각성 수준 측전 및 분석: 뇌파 검사 (EEG) 및 근전도 (EMG) 신호 기록용 전극을 기술된 바와 같이 이식하였다29 , 31. EEG/EMG 신호를 수집하기 위해 테더/커뮤니케이터 시스템 (플라스틱스 원(Plastics One: 미국 버지니아주 로아노크))의 스위블 시스템에 연결시켰다. 그래스 모델 78(Grass Model 78)™ (그래스 인스트루먼츠(Grass Instruments: 미국 로드아일랜드주 웨스트 워윅))을 사용하여 EEG/EMG 신호를 증폭시키고, 여과한 후 (EEG: 0.3-100 Hz, EMG: 30-300 Hz), 128 Hz인 샘플링률로 디지털화하고, 컴퓨터에 저장하였다. 수면 데이터를 수집한 후, 기술된 바와 같이 슬립사인(SleepSign)™ 소프트웨어 수면 점수 체계 (키세이 콤테크 아메리카(Kissei Comtec America: 미국 캘리포니아주 어바인))를 이용하여 EEG/EMG 기록을 점수화하였다31. 마우스를 규칙적인 12시간 (hr) 명기/12시간 암기 주기로 하우징하였다. 광 펄스 또는 약광을 명시된 강도로 투여하였다.
계내 하이브리드화: 기술된 것과 유사한 방식으로 계내 하이브리드화 방법을 수행하였다6,7. -20℃에서 조직 절편을 절단한 후, 이어서, 4% 파라포름알데히드로 고정시킨 후, 0.1 M 포스페이트 완충제로 3회 세척하고, 대기 건조시키고, 사용할 때까지 -20℃에서 보관하였다. 계내 하이브리드화를 위해, 절편을 실온에서 건조시킨 후, 프로테이나제 K (1 ㎍/ml)로 미리 처리하였다. 이어서, 절편을 대기 건조시키고, 60℃에서 18시간 동안 인큐베이션시킴으로써 S35-표지된 리보프로브와 하이브리드화시켰다. 하이브리드화 후, 염도 세척 및 고 엄격도 (68℃) 세척을 감소시켜 가면서, 조직 절편을 RNase (20 ㎍/ml) (시그마-알드리치(Sigma-Aldrich: 미국 미주리주 세인트루이스))로 처리하였다. 탈수 및 대기 건조 후, 조직 절편을 코닥 바이오맥스(Kodak Biomax)™ 필름에 노출시켰다. 영상 분석 시스템 (MCID, 이미징 리서치(Imaging Research: 캐나다 온타리오주)를 사용하여 영상을 포착하였다.
면역조직화학법: 선행 공개 문헌에 따라 면역조직화학법을 수행하였다51 , 52. 망막 절편을 코팅된 유리 슬라이드 상에 탑재하였다. 절편을 20분 동안 PBS 중에서 재수화시킨 후, 2% BSA, 0.5% 트윈-20 및 0.05% 트리톤-X 100을 함유하는 차단 완충제 중에서 1시간 동안 침지시켰다. PK2에 대한 1차 항체 (햄스터 단일클론 항체, 1:200, 로슈 인크.(Roche Inc.)) 또는 OPN4에 대한 1차 항체 (친화성 정제된 토끼 다중클론 항체, 1:200, 밀리포어, 인크.(Millipore Inc.))를 4℃에서 밤새도록 절편에 첨가하였다. 0.5% 트윈-20을 함유하는 PBS로 슬라이드를 각각 5분 동안 5회에 걸쳐 세척하였다. 이어서, 항-토끼 또는 항-햄스터 2차 항체 (알렉사 플루오르(Alexa Fluor) 488 또는 555, 1:2000; 인비트로겐 인크.(Invitrogen Inc.))를 적용시킨 후, 10 ㎍/ml 훽스트 33342™ (인비트로겐 인크.)와 함께 실온에서 5분 동안 인큐베이션시켜 핵을 염색시켰다. 니콘(Nikon) 도립 형광 현미경 (모델 TE-2000U™; 니콘 인크.(Nikon Inc.: 일본 도쿄)) 하에서 절편을 관찰하였다. SPOT 디지털 카메라 (다이어그노스틱 인스트루먼츠, 인크.(Diagnostic Instruments, Inc.: 미국 미시간주 스털링하이츠))로 영상을 포착하였다. DAB (3,3'-디아미노벤지딘) 면역염색을 위해, 절편을 항-PK2 항체 (햄스터 단일클론 항체, 1:500 희석) 항체와 인큐베이션시킨 후, 비오티닐화된 항-햄스터 2차 항체와 인큐베이션시켰다. 표준 ABC 방법에 따라 DAB 면역염색의 발색 현상을 수행하였다52.
마우스 및 원숭이에서 PK2 길항제가 활동 또는 각성 수준에 미치는 효과를 조사하는 약리학적 실험:
기술된 것과 유사한 방식으로 PK2 길항제 (PKRA83)를 제조하였다53. PKRA83 (40 mg/kg)을 ZT6에 마우스에게 복강내로 투여하였다. PKRA83 (10 mg/kg)을 ZT10에 원숭이에게 근육내로 투여하였다. 약리학적 실험을 위해, 동물을 비히클 또는 길항제로 처리한 후, 1주 후, 교차로 바꿔서 반대로 처리하여 쌍별 대조군을 형성하였다.
PK2-/- 마우스에 대하여 기술된 바와 같이 PK2 길항제 또는 대조군으로 처리된 마우스의 수면 및 활동 데이터를 획득하고, 분석하였다. 원숭이 수면 연구를 위해, 청장년기의 원숭이 (마카카 파스키쿨라리스(Macaca fascicularis))를 표준 명기 (백생광 ~250 lux) 및 암기 주기하에 하우징하였다. 원숭이에서의 각성 수준의 측정 및 분석은 하기와 같이 수행하였다. 앞서 인간 대상체54 , 55, 56, 57에 대해 및 비인간 영장류58에 대하여 기술된 것과 유사한 착용식 무선 수면 추적 장치를 사용하였다. 상기 무선 시스템을 통해, 원숭이를 최소로 방해하면서 장시간 동안 보행 환경에 대한 원숭이의 수면/각성 상태를 원격으로 모니터링할 수 있었다. 적외선 비디오 카메라의 동시 기록을 이용하여 무선 수면 추적 장치로부터 수득된 수면 데이터를 확인하였다. 원숭이와의 물리적 접촉 없이, 동물 케이지로부터 약 10 미터 거리에 설치된 이동 전화를 사용하여 매일 수면 추적 장치의 수면 데이터를 검색하였다. 이전 연구에서는 수면 추적 장치, 비디오 카메라에 의해 수득된 수면 데이터와 EEG/EMG 방법에 의해 수득된 고전적 수면/각성 데이터가 매우 일치하는 것으로 나타났다54, 57, 59.
통계: 24시간 이내 리듬에 기인하는 데이터 변동의 영향을 감소시키기 위해, 마우스 운동 활동 및 EEG/EMG 측정을 2회 수행하였고, 이들 두 측정값의 평균 값을 통계 분석에서 사용하였다. 그래프패드 프리즘 소프트웨어 버전 5.0(GraphPad Prism Software Version 5.0)™ (미국 캘리포니아주 샌디에고)을 사용하여 일원 또는 이원 ANOVA로, 이어서, 적절한 사후 검정으로 통계 분석을 수행하였다.
도면 설명
도 1a. 광 펄스가 운동 활동 및 각성 수준에 미치는 효과. 흰색 막대는 ZT16-ZT18.5 (2.5 hrs) 동안 WT (N=6) 및 PK2-/- 마우스 (N=7)에게 투여된 광 펄스 (150 lux)를 나타낸다. 분석 빈 크기는 30 min이었고, 값은 평균 ± sem이다. a. 광 펄스가 WT 마우스에서 운동 활동을 유의적으로 억제시켰다 (P<0.01, 이원 ANOVA, *, P<0.05, **, P<0.01, 본페로니 사후 검정에 의함). 광 펄스가 PK2-/- 마우스의 운동 활동에 미치는 효과는 유의적이지 않았다 (P>0.05, 이원 ANOVA). 인서트는 전체 2.5 hrs 동안의 운동 활동을 나타낸다 (*, P<0.05, 쌍별 t 검정).
도 1b. 광 펄스는 WT 마우스에서 각성 시간을 유의적으로 감소시켰다 (P<0.0001, 이원 ANOVA, *, P<0.05, **, P<0.01, ***, P<0.001, 본페로니 사후 검정에 의함). 광 펄스가 PK2-/- 마우스의 각성 수준에 미치는 억제 효과는 처음 30 min 동안에만 유의적이었다 (P<0.05, 이원 ANOVA, **, P<0.01, 본페로니 사후 검정에 의함). 인서트는 전체 2.5 hrs 동안의 각성 시간 (분)을 나타낸다 (***, P<0.001, 쌍별 t 검정). PK2-/- 마우스의 경우, 전체 2.5 hrs 동안 광 펄스가 각성 수준에 미치는 억제 효과는 유의적이지 않았다 (P>0.05, 쌍별 t 검정).
도 2a. 약광이 운동 활동 및 각성 수준에 미치는 효과. 회색 막대는 ZT12-ZT16 동안 WT (N=6) 및 PK2-/- 마우스 (N=7)에게 투여된 4시간 동안의 약광 (30 lux)을 나타낸다. a. 암기와 비교하여, 약광은 WT 마우스에서 운동 활동을 유의적으로 감소시켰다 (P<0.0001, 이원 ANOVA, *, P<0.05, **, P<0.01, ***, P<0.001 본페로니 사후 검정에 의함). PK2-/- 마우스의 경우, 약광이 운동 활동에 미치는 억제 효과는 유의적이지 않았다 (P>0.05, 이원 ANOVA). 인서트는 전체 4시간 동안의 운동 활동을 나타낸다 (**, P<0.01, 쌍별 t 검정).
도 2b. 암기와 비교하여, 약광은 WT 마우스에서 각성 수준을 유의적으로 감소시켰다 (P<0.0001, 이원 ANOVA, *, P<0.05, **, P<0.01, ***, P<0.001, 본페로니 사후 검정에 의함). 약광이 PK2-/- 마우스의 각성 수준에 미치는 억제 효과는 처음 30 min 동안에만 유의적이었다 (P<0.05, 이원 ANOVA, **, P<0.01, 본페로니 사후 검정에 의함).
도 3. 마우스 망막의 망막 신경절 세포에서의 PK2 및 OPN4의 공동 발현. PK2 면역염색은 녹색으로 제시되어 있는 반면 (a), OPN4 형광성 면역표지는 적색으로 제시되어 있다 (b). 핵 대조염색은 청색으로 제시되어 있다 (c). 망막 신경절 세포에서의 PK2 및 OPN4의 공동 발현이 뚜렷이 보인다 (d). PK2 및 OPN4에 의해 강하게 면역염색된 2개의 세포가 제시되어 있다. 스케일 막대, 40 ㎛.
도 4. 원숭이 망막의 망막 신경절 세포에서의 PK2 및 OPN4의 공동 발현. PK2 면역표지는 녹색으로 제시되어 있는 반면 (a), OPN4 형광성 면역표지는 적색으로 제시되어 있다 (b). 핵 대조염색은 청색으로 제시되어 있다 (c). 망막 신경절 세포에서의 PK2 및 OPN4의 공동 발현이 뚜렷이 보인다 (d). 인서트는 대표적인 양성 세포의 더 높은 고배율의 영상을 나타낸다. 스케일 막대, 20 ㎛.
도 5. 마우스 및 원숭이 뇌의 망막수용 표적에서의 PKR2 mRNA의 차별적인 발현. a. 원숭이 뇌의 복부 시교차상핵 (SCN)이 아닌, SCN의 등쪽 구획에서의 PKR2 mRNA 검출. b. 마우스 뇌의 전체 SCN (복부 및 등쪽 구획 모두)에서의 PKR2 mRNA 검출. c. 원숭이 뇌의 상구 (SC)의 표피 층에서의 PKR2 mRNA 검출. d. 마우스 뇌의 SC에서의 PKR2 mRNA 부재. 마우스 및 원숭이 뇌, 둘 모두에서 등쪽 솔기핵 (DR)에서는 PKR2 발현이 있다는 점에 주의한다. 스케일 막대, 1 mm.
도 6. PK2 길항제 PKRA83이 마우스 및 원숭이에서의 운동 활동 및 각성 수준에 미치는 차별적 효과. a. PKRA83은 마우스의 운동 활동을 유의적으로 증가시켰다 (N=16, P<0.05, 이원 ANOVA, *, P<0.05, 본페로니 사후 검정에 의함). b. PKRA83은 마우스의 각성 시간을 유의적으로 증가시켰다 (N=6, 이원 ANOVA, *, P<0.05, 본페로니 사후 검정에 의함). a 및 b의 인서트는 각각 6시간의 낮 기간 동안 운동 활동 및 각성 시간(분)을 증가시켰다는 것을 나타낸다 (**, P<0.01, 쌍별 t 검정). c. PKRA83은 원숭이의 수면 시간을 유의적으로 증가시켰다 (N=9, *, P<0.05, 쌍별 t 검정).
도 7. 마우스 망막의 망막 신경절 세포에서의 PK2 발현. PK2 면역표지를 DAB (3,3'-디아미노벤지딘)로 현상시켰다. a. 하나는 변성되지 않은 것이고, 하나는 변성된 것인, 두 PK2 양성 망막 신경절 세포의 예가 화살표 표시로 제시되어 있다. b. 헤마톡실린 대조염색을 이용한 PK2 DAB 면역염색. 하나는 강하게 염색되고, 하나는 좀 더 작게 염색된, 두 PK2 양성 망막 신경절 세포의 예가 화살표 표시로 제시되어 있다. 스케일 막대, 20 ㎛.
도 8. 뇌 표적 상에서의 ipRGC의 PK2 신호전달에 의한 차별적인 각성 조절을 보여주는 다이어그램. PK2는, 광의 중추 비시각적 기능을 전달하는 유일의 광 채널인 ipRGC에서 발현된다. 전반적으로, 길항제 차단 및 PK2 결핍에 의해 제시된 바와 같이, PK2 신호전달은 일주기성 원숭이의 경우, 자극성을 띠고, 야생성 마우스의 경우, 억제성을 띤다. 망막수용 복부 SCN, 및 SC의 표피 층에서의 PKR2의 차별적인 발현은 ipRGC의 PK2 신호전달이 마우스 및 원숭이에서 각각 ipRGC-SCN 및 ipRGC-SC 경로를 통해 이동한다는 것을 시사한다. 야행성 동물인 경우, 광에 의한 ipRGC-SC 경로를 통해 이루어지는 각성 자극은 작으며 (일시적, 지속되지 않음), 이는 마우스 뇌의 SC에서의 PKR2의 부재와 일관되는 것이다. ipRGCSCN 경로의 PK2 신호전달은, 비록 일주기성 동물에 대해서는 억제성을 띠는지 또는 자극성을 띠는지 여부가 불분명하지만, 야행성 마우스 경우에는 명백하게 억제성을 띤다. 사실상, 마스터 24시간 주기 시계로서 SCN에 대한 입증 증거가 야행성 포유동물에 대해서는 엄청나게 강력한 증거가 되지만, 상기 주장은 실제로는 일주기성 동물의 경우에는 제한된 입증 증거를 가진다. 일주기성 동물의 경우, SCN의 각성 촉진으로 해석되는, 다람쥐 원숭이에서의 SCN 병변에 의한 수면 증가에 관하여 잘 인용된 논문은 망막시상하부로에 대해 동시 발생한 병변으로 설명될 수 있다. 본 발명자들의 모델은 포유동물의 일주기/야행성 결정은 ipRGC의 그의 뇌 표적 상에서의 차별적인 PK2 신호전달에 의해 매개되고, 따라서, SCN 하류의 분기성 신호전달 기전은 필요하지 않을 수 있다는 것을 나타낸다.
실시예 2: PK2는 ipRGC에서 뇌로의 연결을 위한 신호 분자로서 작용한다.
본 실시예는 PK2가 포유동물의 경우, 각성 상태 및 수면을 조절하기 위해 ipRGC에서 24시간 주기 시계에 대한 출력 분자로서 작용하고, PK2 길항제는 수면을 유도하거나, 또는 촉진시킨다는 것을 보여주는 연구를 기술한다.
망막에서 24시간 주기 시계는 대개 국소 생리 및 기능, 예컨대, 망막전위도 진폭 및 광수용체 외부 분절 디스크의 포식작용을 조절하는 것으로 여겨져 왔다. 본 발명자들의 관찰 결과를 통해 PK2는 포유동물의 경우, 각성 상태 및 수면을 조절하기 위해 ipRGC에서 24시간 주기 시계에 대한 출력 분자로서 작용한다는 것이 밝혀졌다.
망막의 외핵층에서의 PK2 발현은 연속된 암기 동안 증가된 것으로 나타났다. 도 9에 제시된 바와 같이, 망막의 외핵층에서의 PK2 발현은 ZT4보다 CT4에 훨씬 더 높다. 세포를 계수한 결과, ZT4에 PK2 양성인 광수용체의 백분율(%)은 대략 0.1%인 것으로 나타났다. ACT4에 PK2 양성 광수용체의 백분율(%)은 대략 2%까지 증가하였고, 이는 PK2 양성 세포가 가능하게는 원추 세포라는 것을 시사하는 것이다. 도 9는 ZT4 (패널 a)와 비교하여 CT4 (패널 b)에 망막의 외핵층에서의 PK2의 상향조절을 보여주는 영상을 도시한 것이고: 도 9에는 ZT4 (패널 a)와 비교하여 CT4 (패널 b)에 망막의 외핵층에서의 PK2의 상향조절이 도시되어 있고; PK2 면역염색이 제시되어 있고; 박스로 표시된 영역은 마우스 망막의 외부 분절을 나타내는 것이고; 핵 대조염색은 청색으로 제시되어 있고; ZT4 (패널 a)와 비교하여 CT423(패널 b)에 PK2의 상향조절이 뚜렷이 보인다. 포유동물의 망막의 외핵층에서의 PK2의 상향조절은 암기 동안의 광수용체의 증가된 신경 활동과 연관이 있을 수 있다.
ipRGC에서의 PK2 발현은 추가로 명암 조건하에 Bmal1에 의존하는 방식으로 진동하는 것으로 나타났다 (도 10). 야생형 마우스에서, ipRGC에서의 최고 및 최저 PK2 수준은 각각 대략 ZT4 및 ZT20에서 나타났다. 그에 반해, Bmal1 결핍 마우스의 ipRGC에서의 PK2 수준은 계속해서 낮게 나타났고, 겉보기 PK2 진동은 관찰되지 않았다. 각각 대략 ZT4 및 대략 ZT20에서의 최고 및 최저 타이밍을 포함하는, ipRGC에서의 PK2 수준의 진동 위상은 SCN 시계에서 관찰되는 PK2 진동과 매우 유사하고, 이는 동일한 분자 진동자에 의해 조절된다는 것을 시사하는 것이다. 종합해 보면, 상기 결과는 ipRGC에서의 PK2의 진동적 발현은 시계에 의존하는 프로세스라는 것을 시사한다.
계내 하이브리드화는 PK2 수용체인 PKR2가 특정 망막 신경절 세포에서 발현된다는 것을 보여준다 (도 11). PKR2 발현은 양극 세포가 아닌, 망막 신경절 세포에서만 오직 검출된다. 망막 신경절 세포의 층 중의 상기 PKR2 양성 세포의 존재비 및 직경 특징은 이들 PKR2 양성 세포가 ipRGC라는 것을 나타낸다. 도 11은 특정 망막 신경절 세포에서의 PKR2 발현을 보여주는 영상을 도시한 것이고; 도 11에는 특정 망막 신경절 세포에서의 PKR2 발현이 도시되어 있고; PKR2 mRNA는 계내 하이브리드화에 의해 검출되고; 패널 a는 망막 신경절 세포층에서의 PKR2 신호를 보여주는 것이고; 박스로 표시된 영역의 더 높은 고배율의 영상이 패널 b에 제시되어 있고; 패널 b에서, PKR2 양성인 개별 망막 신경절 세포가 뚜렷이 보이고; 패널 c 및 d는 각각 패널 a 및 b에 상응하는, 눈 절편의 니슬 염색을 보여주는 것이다.
도 12에 제시된 바와 같이, PK2-결핍 (PK2-/-) 마우스에서 각성 수준은 늦은 밤 동안, 특히 ZT20-ZT24 사이에 (점등 전 4시간 동안) 증가되었다. 따라서, PK2 신호는 상기 마우스에서 상기 기간 동안 각성 수준을 억제시킨다. 도 12는 PK2-/- 마우스에서 늦은 밤 기간 (ZT20-ZT24) 동안 각성 상태가 증가되었다는 것을 보여주는 데이터를 그래프로 도시한 것이다.
야생형 마우스에서 PK2 길항제가 운동 활동에 미치는 효과를 시험하였다. 도 13에 제시된 바와 같이, 늦은 밤 동안 안구 국소 적용을 통해 전달된 PK2 길항제는 상기 마우스에서 운동 활동을 증가시켰고, 이로써, 각성 상태 수준을 증가시켰다. 도 13은 PK2 길항제의 안구 국소 전달이 마우스의 운동 활동을 증가시켰다는 것을 보여주는 데이터를 그래프로 도시한 것이다.
도 14는 PK2 길항제 (PKRA)가 마우스의 각성 수준에 미치는 효과를 보여주는 데이터를 그래프로 도시한 것이고: 낮 시간에의 PK2 길항제의 안구 국소 적용이 마우스의 깨어있는 시간을 유의적으로 증가시켰다 (*, P<0.05, 쌍별 t 검정).
PK2 신호전달이 각성 수준에 미치는 효과는 야행성 포유동물과 비교하여 일주기성 포유동물에서는 그 반대인 바, PK2 신호전달은 일주기성 대상체, 예컨대, 원숭이 또는 인간에서는 각성 상태를 자극시킨다. PK2 길항제가 마우스에서 각성 상태를 증가시키는 것으로 나타났는 바 (도 14), 동일한 PK2 길항제는 예컨대, 원숭이와 같은 일주기성 대상체에서는 각성 상태를 억제시킬 것으로, 즉, 수면을 촉진시킬 것으로 예측된다. 도 14는 PK2 길항제 ((3R)-1-(4-플루오로-3-메톡시벤질)-N-(9-클로로-3,4-디히드로-2H-1,5-벤조디옥세핀-7-일메틸)-N-이소부틸피롤리딘-3-카복스아미드, 소위 "PKRA83"으로 칭함)가 마우스의 각성 수준에 미치는 효과를 그래포로 도시한 것이다. PK2 길항제의 안구 국소 적용이 마우스의 깨어있는 시간을 유의적으로 증가시켰다 (*, P<0.05, 쌍별 t 검정).
본 발명자들은 안구 국소 전달을 통해 원숭이에서의 각성 수준에 PK2 길항제가 미치는 효과를 시험하였다. 도 15에 제시된 바와 같이, PK2 길항제의 국소 적용은 원숭이에서 수면을 촉진시킨다. 도 15는 PK2 길항제 (PKRA83)가 원숭이의 수면에 미치는 효과를 보여주는 데이터를 그래프로 도시한 것이다. PK2 길항제의 안구 국소 적용이 원숭이의 수면 시간을 유의적으로 증가시켰다 (*, P<0.05, 쌍별 t 검정).
ipRGC는 PKR2를 발현하고, 이는 또한 늦은 밤부터 낮 전 기간에 PK2를 발현하는 바, PK2는 또한 ipRGC의 수상돌기 또는 측부 축삭으로부터 방출되어 이웃 ipRGC 상의 PKR2 수용체를 활성화시킬 가능성이 있으며, 즉, PK2는 ipRGC의 신경 활동과 커플을 이룬다. 따라서, 본원에서 제공하는 바와 같이, 망막에서의 PK2 신호전달을 차단하는 방법은 예컨대, PK2 신호의 전진성 위상을 가질 것으로 예측되는 전진성 수면 위상 장애와 같은 질환 병태에 대하여 수면 촉진성을 띨 것이다.
도 16에 개략적으로 도시된 바와 같이, 본원에 제공된 데이터는 PK2 신호전달이 ipRGC의 24시간 주기 시계와 커플을 이룬 후, 이어서, 각성 수준 조절을 위해 ipRGC의 뇌 표적으로 커플링된다는 것을 최초로 입증한다. 도 16은 다이어그램으로서 ipRGC의 전략적 위치를 개략적으로 도시한 것이다. ipRGC는 명/암 및 시계 정보를 통합시킨다. PK2는 ipRGC의 커플링, 및 야행성 및 일주기성 포유동물에서 각성 수준 조절을 위해 중요한 뇌 중심부로의 ipRGC의 신경 투사를 위하여 신호를 보낸다.
ipRGC의 분자 기계 및 전략적 위치를 통해 ipRGC는 24시간 주기 시계 정보 및 환경상 명/암 조건을 통합시킬 수 있다. 추가로, ipRGC는 각성 수준 및 수면 각성 주기 조절을 위해 중요한, 뇌 중심부, 예컨대, 상구로 투사된다. 따라서, ipRGC, 및 대안적 실시양태에서, ipRGC에서 발현되는 수용체를 약리학적으로 표적화하는 본원에서 제공되는 방법은 예컨대, 광선공포증, 수면 및 기분 장애, 계절성 정서 장애, 및 양극성 장애를 비롯한, ipRGC 조절 및 관련된 중추 신경계 장애를 치료, 호전 또는 예방하는 데 사용될 수 있다.
광선공포증은 망막에서의 광수용체의 과도한 자극, 또는 시신경으로의 과도한 전기 임펄스, 또는 뇌에서의 과도한 반응에 의해 유발될 수 있다. PK2가 광의 비시각적 기능을 뇌로 전달하는 데 관여하기 때문에, PK2 길항제를 통해 PK2 신호를 경감시키는 것이 뇌로의 광 신호를 감소시킬 것이다. 따라서, PK2 길항제 투여가 가능하게는 광선공포증 증상을 호전, 치료 또는 예방하는 데 유용할 수 있다.
PK2와 같이, CT4에 망막의 외핵층에서의 바소프레신 (AVP)의 상향조절을 도시하는 것인 도 17의 영상에 도시되어 있는 바와 같이, 본 발명자들은 망막의 외핵층에서의 바소프레신 (AVP) 또한 연속된 암기 동안 상향조절된다는 것을 밝혀내었다. ipRGC에서의 바소프레신 (AVP)과 PK2의 공동 국재화를 도시하는 것인 도 18의 영상에 도시되어 있는 바와 같이, PK2와 같이, 바소프레신 또한 ipRGC에서 발현된다. 따라서, ipRGC의 커플링, 및 이어서, ipRGC의 중요한 뇌 표적으로의 것을 위한 PK2 및 바소프레신의 신호전달은 병렬로 이루어지는 것으로 보인다. 그러므로, ipRGC에서 발현되는 바소프레신 수용체의 약리학적 조작 또한 관련된 중추 신경계 장애, 특히, 수면 및 기분 장애 (계절성 정서 장애, 및 양극성 장애)를 치료하는 데 유용할 것이다.
본 발명자들은 PK2 수용체 길항제의 비강 적용 또한 원숭이에서 수면을 촉진시켰다고 밝혔다 (도 19). 상기와 같은 국소 경로로 전달된 PK2 수용체 길항제는 뇌에 도달하여, ipRGC로부터의 PK2 투사에 의해 신경 자극을 받는 중요한 핵심부, 예컨대, 상구에서 PK2 수용체를 차단할 수 있는 가능성이 있다. 도 19는 PK2 길항제 (PKRA)가 원숭이의 수면에 미치는 효과를 보여주는 데이터를 그래프로 도시한 것이고; PK2 수용체 길항제의 비강 국소 적용이 원숭이의 수면 시간을 유의적으로 증가시켰다 (*, P<0.05, 쌍별 t 검정).
실시예 3: 포유동물의 일주기 및 야행성 질환 및 관련된 병태 치료용, 및 다른 중요한 인간 장애, 예컨대, 통증, 암, 건선 및 관절염 치료용 조성물
본 실시예는 본원에 기술된 방법 및 조성물을 실시하는 데 사용될 수 있는 프로키네티신 길항체 합성 및 제제화를 기술한다.
대안적 실시양태에서, 본원에 기술된 방법을 실시하는 데 사용되는 화합물은 흥미로운 가용성 및 약리학적 프로파일을 가지는 아미드 유도체이다. 특히, 본원에서는 지질 제제 및 그를 포함하는 주사용 데포 제제(들)를 비롯한, 프로키네티신 길항제 또는 그의 프로드럭을 제공한다. 상기 유도체 및 그의 장시간 작용 제제(들)는 예컨대, 포유동물에서 24시간 주기 타이밍을 변형시키는 데, 인간 24시간 주기 조절 체계 변경에 기인한 정신과적 병태 또는 증상을 치료하는 데, 포유동물에서 수면 문제를 치료하는 데, 또는 수면 또는 활동 억제를 유도하는 데, 또는 각성 또는 기상 반응을 유발하는 데, 및 임의로는 또한 특정 인간 질환, 예컨대, 암을 치료하는 데 적합하고, 이는 본원에 기술된 방법 및 조성물을 실시하는 데 사용될 수 있다.
대안적 실시양태에서, 본원에 기술된 방법을 실시하는 데 사용되는 화합물, 특히, PK2 (프로키네티신) 수용체 길항제는 아미드 유도체 및 하기 화학식 1에 따른 구조를 가지는 화합물이다 (예컨대, USPN 8,722,896 참조):
Figure 112018109568989-pct00001
상기 식에서, R1은 임의로 치환된 아릴, 임의로 치환된 헤테로아릴, 또는 융합된 헤테로사이클릭 고리를 가지는 임의로 치환된 아릴이고; X 및 Y는 독립적으로 저급 알킬이고; Q는 NH 또는 NR6이고, 여기서, R6은 저급 알킬이고; Z는 CH2 또는 CHR7이고, 여기서, R7은 저급 알킬이거나; 또는 Q 및 Z는 서로 공유적으로 커플링되어 헤테로사이클릭 4- 내지 6-원 고리를 형성하고, 여기서, Q는 N이고, Z는 CH이고; R2는 저급 알킬렌이고; R3은 H, 저급 알킬, 또는 알크아릴이고; A는 N 또는 C이고; W는 H, 또는 할로겐이거나, 또는 A가 N인 경우, W는 존재하지 않고; R4 및 R5는 독립적으로 알콕시이거나, 또는 서로 공유적으로 커플링되어, 적어도 하나의 산소 원자를 가지는 임의로 치환된 헤테로사이클릭 6- 또는 7-원 고리를 형성한다.
대안적 실시양태에서, R1은 임의로 치환된 페닐, 임의로 치환된 인돌릴, 또는 임의로 치환된 인돌리닐이고/거나, X 및 Y는 CH2이다. 임의로, X 및 Y는 서로 공유적으로 커플링되어 피롤리딘 고리, 피페리딘 고리, 피페라진 고리, 티오모르폴린 고리, 또는 모르폴린 고리를 형성한다. 본 발명의 주제로 제한하는 것은 아니지만, 임의로 R3은 임의로 분지형 저급 알킬이고/거나, R4, R5, W, 및 R4, R5, 및 W가 공유적으로 커플링되는 페닐 고리는 임의로 할로겐화된 벤조디옥세핀 고리를 형성한다. 가장 전형적으로는, R2는 CH2이고/거나, W는 Cl 또는 F이다.
프로키네티신 길항제의 다수의 잠재적인 임상적 적응증은 만성 질환이기 때문에, 장기간 동안의 PK 수용체의 장시간 억제가 매우 바람직하다. 따라서, 장시간 작용 프로키네티신 길항제가 상기 인간 장애를 치료하는 유용할 수 있다. 장시간 작용 프로드럭 또는 장시간 작용 제형의 약물이 대안적 해결안이 될 수 있다. 장시간 작용 길항제, 또는 지속 방출형 제제는 한 번에 수일 또는 수주 동안 환자 시스템 내에서 치료적 수준으로 유지될 수 있다.
대안적 실시양태에서, 화학식 I, 또는 하기 표 1에 따른 화합물, 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는, 포유동물에서 24시간 주기 타이밍을 변형시키기 위한, 인간 24시간 주기 조절 체계 변경에 기인한 정신과적 병태 또는 증상을 치료하기 위한, 포유동물에서 수면 문제를 치료하기 위한, 또는 수면 또는 활동 억제를 유도하기 위한, 또는 각성 또는 기상 반응을 유발하기 위한, 및 임의로는 또한 암을 치료하기 위한 제약 조성물을 제공한다. 대안적 실시양태에서, 화합물은 경구 투여용의 제형 단위 중에 암, 예컨대, 종양과 연관 이상을 치료 또는 예방하는 데 효과적인 양으로 존재한다. 대안적 실시양태에서, 포유동물에서 24시간 주기 타이밍을 변형시키기 위한, 인간 24시간 주기 조절 체계 변경에 기인한 정신과적 병태 또는 증상을 치료하기 위한, 포유동물에서 수면 문제를 치료하기 위한, 또는 수면 또는 활동 억제를 유도하기 위한, 또는 각성 또는 기상 반응을 유발하기 위한, 및 임의로는 또한 암을 치료하기 위한 의약 제조에서 화학식 I에 따른 화합물의 용도이다.
대안적 실시양태에서, 긴 반감기 및/또는 증가된 분포 부피, 만성 인간 질환을 치료하는 데 이상적인 약동학적 파라미터를 가지는 아미드 유도체를 제공한다. 대안적 실시양태에서, 아미드 PK 길항제, 및 지속된 기간 동안에 걸쳐 인간 질환을 치료하는 데 효과적인 농도로 약물을 전달하는 제제를 제공한다.
대안적 실시양태에서, 프로키네티신 길항제의 데포 전달을 위한 조성물 및 방법을 제공한다.
대안적 실시양태에서, (3R)-1-(벤즈이미다졸-4-일메틸)-N-(9-클로로-3,4-디히드로-2H-1,5-벤조디옥세핀-7-일메틸)-N-이소부틸피롤리딘-3-카복스아미드를 제공한다:
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대안적 실시양태에서, 합성은 하기 단계를 포함한다:
단계 1. 1H-벤조이미다졸-4-카르복실산. 2,3-디아미노벤조산 (7 g)을 트리에틸 오르토포르메이트 (100 ml) 중에 현탁시키고, 교반하면서, 밤새도록 130℃까지 가열하였다. 실온으로 냉각시킨 후, 이어서, 디에틸 에테르(300ml)를 첨가하고, 생성된 침전물을 여과하였다. 건조 후, 7.3 g의 고체 분말 1H-벤조이미다졸-4-카르복실산 (M+1=163.1)을 수득하였다.
단계 2. (1H-벤조이미다졸-4-일)메탄올. 1H-벤조이미다졸-4-카르복실산 (7.3 g)을 350 ml의 테트라히드로푸란 중에 현탁시키고, 드라이아이스-아세톤 배쓰로 냉각시켰다. 수소화알루미늄리튬 (4 M, 21 ml)을 천천히 첨가하였다. 반응물을 교반하고, 밤새도록 실온까지 가온시켰다. 반응물을 5 ml 메탄올을 이용하여 ??칭하고, 800 ml의 20% 메탄올 및 80% 에틸 아세테이트를 이용하여 추출하였다. 여과 후, 고체를 폐기하였다. 감압하에 여액을 증발시켜 7 g 조 (1H-벤조이미다졸-4-일)메탄올 (M+1=149.1)을 수득하였고, 이는 다음 단계에서 사용하였다.
단계 3. 1H-벤조이미다졸-4-카르브알데히드. 7 g (1H-벤조이미다졸-4-일)메탄올을 350 ml의 디메틸 술폭시드 중에 용해시켰다. 36 ml의 디이소프로필에틸아민 및 33 g의 술푸르트리옥시드 피리딘 복합체를 첨가하였다. 반응물을 밤새도록 교반하였다. 800 ml의 물을 첨가하고, 400 ml의 에틸 아세테이트를 이용하여 혼합물을 5회에 걸쳐 추출하였다. 유기층을 염수로 세척하고, 황산나트륨으로 건조시키고, 증발시켰다. 플래쉬 크로마토그래피 (100% 에틸 아세테이트)를 통해 노란 빛깔의 분말 1H-벤조이미다졸-4-카르브알데히드 (M+1=147.1)를 수득하였다
단계 4. (3R)-1-(벤즈이미다졸-4-일메틸)-N-(9-클로로-3,4-디히드로-2H-1,5- 벤조디옥세핀-7-일메틸)-N-이소부틸피롤리딘-3-카복스아미드. 기술된 바와 같이 (3R)-N-(9-클로로-3,4-디히드로-2H-1,5-벤조디옥세핀-7-일메틸)-N-이소부틸 피롤리딘-3-카복스아미드를 제조하였다. 디클로로메탄 (150 ml) 중 (3R)-N-(9-클로로-3,4-디히드로-2H-1,5-벤조디옥세핀-7-일메틸)-N-이소부틸 피롤리딘-3-카복스아미드 (3,800 mg, WO/2010/077976에 기술된 바와 같이 제조), 1H-벤조이미다졸-4-카르브알데히드 (1,550 mg), 빙초산 (4.7 ml), 및 소듐 트리아세톡시보로히드리드 (3.0 g)의 혼합물을 밤새도록 교반하였다. aq. K2CO3 (2 N, 1,200 mL)을 첨가한 후, 100 ml의 에틸 아세테이트를 사용하여 혼합물을 3회에 걸쳐 추출하였다. 유기층을 혼합하고, 염수 (500 ml)로 세척하고, 무수 황산나트륨 상에서 건조시키고, 농축시켰다. 실리카 (헥산 중 100% 에틸 아세테이트) 상에서 플래쉬 크로마토그래피를 통해 잔류물을 정제하여 수지로서 (3R)-1-(벤즈이미다졸-4-일메틸)-N-(9-클로로-3,4-디히드로-2H-1,5-벤조디옥세핀-7-일메틸)-N-이소부틸피롤리딘-3-카복스아미드를 수득하였다:
Figure 112018109568989-pct00003
대안적 실시양태에서, (3R)-1-(벤즈이미다졸-4-일메틸)-N-(9-클로로-3,4-디히드로-2H-1,5-벤조디옥세핀-7-일메틸)-N-이소부틸피롤리딘-3-카복스아미드 히드로클로라이드 염을 제공한다:
Figure 112018109568989-pct00004
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대안적 실시양태에서, 합성은 하기 단계를 포함한다:
단계 1. 1,77 g의 (3R)-1-(벤즈이미다졸-4-일메틸)-N-(9-클로로-3,4-디히드로-2H-1,5-벤조디옥세핀-7-일메틸)-N-이소부틸피롤리딘-3-카복스아미드를 20 ml 디클로로메탄 중에 용해시켰다. 1,4-디옥산 중 4 M 히드로클로라이드를 첨가하고, 실온에서 4 hr 동안 교반하였다. 혼합물을 감압하에서 증발시켜 (3R)-1-(벤즈이미다졸-4-일메틸)-N-(9-클로로-3,4-디히드로-2H-1,5-벤조디옥세핀-7-일메틸)-N-이소부틸피롤리딘-3-카복스아미드 히드로클로라이드 염을 수득하였다. 융점, 120-122℃.
대안적 실시양태에서, (-)-(2R)-2-메틸-3-(벤즈이미다졸-4-일메틸아미노)-N-(9-클로로-3,4-디히드로-2H-1,5-벤조디옥세핀-7-일메틸)-N-이소부틸프로판아미드를 제공한다:
Figure 112018109568989-pct00005
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(WO/2010/077976)에 기술된 바와 같이 제조된 (-)-(2R)-2-메틸-3-아미노-N-(9-클로로-3,4-디히드로-2H-1,5-벤조디옥세핀-7-일메틸)-N-이소부틸프로판아미드를 사용하여, (-)-(2R)-2-메틸-3-(벤즈이미다졸-4-일메틸아미노)-N-(9-클로로-3,4-디히드로-2H-1,5-벤조디옥세핀-7-일메틸)-N-이소부틸프로판아미드를 상기 기술된 바와 같이 제조하였다.
선택된 생물학적 실험 실시예
시험관내 Ca 2 + 동원 검정법
칼슘 동원에 대한 에쿼린 기반 발광 검정법을 사용하여 세포내 Ca2 + 동원을 측정하였다 (문헌 [Bullock et al., Mol Pharmacol 65, 582-588, 2004]). 발광단백질 에쿼린 및 재조합 PKR1 또는 PKR2를 안정적으로 발현하는 PKR1 또는 PKR2 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포를 상기 방법에 의해 시험하였다. 간략하면, 37℃에서 2시간 동안 8 μM의 코엘렌테라진 cp를 함유하는 옵티-MEM™ (인비트로겐(Invitrogen)) 중에 세포를 충전시켰다. 짧게 트립신 처리하여 세포를 분리시키고, 행크스 균형 염 용액(Hank's Balanced Salt Solution: HBSS) + 10 mM HEPES (pH 7.5) 0.1% BSA 중에 약 5 x 105개의 세포/ml로 유지시켰다. 버솔드(Berthold) 루미노미터를 사용하여 발광을 측정하였다.
모든 화합물을 HBSS + 10 mM HEPES (pH 7.5) 및 0.1% BSA 중에 희석시켰다. 효능제 활성을 시험하기 위해, 20 ㎕의 화합물을 튜브 내로 100 ㎕의 세포에 주사하였다. 길항제 검정법을 위해, 80 ㎕의 세포를 튜브에서 20 ㎕의 상이한 농도의 길항제와 함께 실온에서 20분 동안 인큐베이션시킨 후, 100 ㎕의 재조합 PK2를 주사하였다. 검정법으로부터 수득된 IC50을 공식: IC50/(1+[PK2]/EC50PK2)를 사용하여 Ki 값으로 변환시켰다.
일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 특정 실시양태를 기술하고, 주장하기 위해 사용된, 예컨대, 농도, 반응 조건 등과 같이 성분, 특성의 정량을 표시하는 수치는 일부 경우에는 "약"이라는 용어로 수식되는 것으로 이해하여야 한다. 따라서, 일부 실시양태에서, 기재된 설명 및 첨부된 특허청구범위에 기술된 수치 파라미터는 특정 실시양태에 의해 수득하고자 하는 원하는 특성에 따라 달라질 수 있는 근사치이다. 일부 실시양태에서, 수치 파라미터는 기록된 유효 숫자 자리수를 고려하여 및 통상의 반올림 기술을 적용시켜 해석되어야 한다. 본원에서 제공된 일부 실시양태의 광범위한 범주를 기술하는 수치 범위 및 파라미터가 근사치임에도 불구하고, 구체적인 예에서 기술된 수치 값은 실행가능한한 정확하게 기록된다. 본원에서 제공된 일부 실시양태에서 제시된 수치 값은 필연적으로 그의 각 시험 측정에서 발견되는 표준 편차로부터 생성되는 특정 오차를 포함할 수 있다.
본원의 설명에서 및 하기 특허청구범위 전역에 걸쳐 사용되는 바, "하나"("a," "an") 및 "그"라는 의미는 문맥상 명백하게 달리 명시되지 않는 한, 복수 개의 지시 대상을 포함한다. 또한, 본원의 설명에서 사용되는 바, "~에서"라는 의미는 문맥상 명백하게 달리 명시되지 않는 한, "~에서" 및 "~ 상에서"라는 것을 포함한다.
본원에서 값을 범위로 열거한 것은 단지 상기 범위 내에 포함된 각각의 개별 값을 개별적으로 지칭하는 약기 방법으로서의 역할을 하는 것으로 의도된다. 본원에서 달리 명시되지 않는 한, 각각의 개별 값은 마치 그가 본원에서 개별적으로 언급된 것과 같이 본 명세서에 포함된다. 본원에서 기술된 모든 방법은 본원에서 달리 명시되지 않는 한, 또는 문맥상 명백하게 모순되지 않는 한, 임의의 적합한 순서로 수행될 수 있다. 본원의 특정 실시양태와 관련하여 제공되는 임의의 모든 예, 또는 예시적인 표현 (예컨대, "예컨대")를 사용하는 것은 단지 본원에 제공된 실시양태를 더욱 명확하게 하기 위한 것으로 의도되며, 다르게는 청구되는 본 발명의 범주를 제한하는 것이 아니다. 본 명세서에서 어떤 표현도 본 발명의 실행에 필수적인 임의의 비청구 요소를 나타내는 것으로 해석되지 않아야 한다.
본원에 개시된 대안적 요소 또는 요소들의 그룹화는 제한적인 것으로 해석되지 않아야 한다. 각각의 군 구성원은 개별적으로, 또는 상기 군의 다른 구성원들 또는 본원에서 발견되는 다른 요소와의 임의 조합으로 지칭될 수 있고, 청구될 수 있다. 군의 하나 이상의 구성원은 편의상 및/또는 특허성이라는 이유로 군에 포함될 수 있거나, 또는 군으로부터 삭제될 수 있다. 임의로 상기와 같이 포함 또는 삭제될 경우, 명세서는 본원에서 변형되고, 이로써, 첨부된 특허청구범위에서 사용된 모든 마쿠쉬 군의 기재된 기술내용을 이해하는 군을 함유하는 것으로 간주된다.
본원에서 사용되는 바, 그리고, 문맥상 달리 명시되지 않는 한, "~에 커플링된"이라는 용어는 직접적인 커플링 (두 요소가 서로 접촉하여 커플링된 경우), 및 간접적인 커플링 (적어도 하나의 추가 요소가 두 요소 사이에 위치하는 경우), 둘 모두를 포함하는 것으로 의도된다. 그러므로, "~에 커플링된" 및 "~와 커플링된"이라는 용어는 동의어로 사용된다.
표 1
대안적 실시양태에서, 각각이 본원에 제공된 바와 같은 방법을 실시하는 데 사용될 수 있는 것인, 본원에서 제공되는 신규한 화합물이 표 1에 열거되어 있다. 이들 화합물은, 사용된 출발 물질, 반응물 또는 조건을 달리하여 상기 방법을 사용함으로써 제조되었다. 필수 반응물은 상업적으로 이용가능하거나, 문헌에 기술되어 있거나, 또는 당업자에 의해 쉽게 합성되었다.
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고려되는 화합물의 생물학적 활성에 관한 본 발명자들의 발견에 기초하여, 일반적으로, 본원에서 제공된 화합물은 포유동물에서 24시간 주기 리듬 또는 타이밍을 변형시키기 위해, 인간 24시간 주기 조절 체계 변경에 기인한 정신과적 병태 또는 증상을 치료하기 위해, 포유동물에서 수면 문제를 치료하기 위해, 또는 수면 또는 활동 억제를 유도하기 위해, 또는 각성 또는 기상 반응을 유발하기 위해, 및 임의로는 또한 각종 암을 치료하기 위해 제제화될 수 있는 것으로 고려된다. 대안적 실시양태에서, 본원에 기술된 화합물을 포함하는 제약 조성물로서, 여기서, 상기 화합물은 포유동물에서 24시간 주기 리듬 또는 타이밍을 변형시키는 데, 인간 24시간 주기 조절 체계 변경에 기인한 정신과적 병태 또는 증상을 치료하는 데, 포유동물에서 수면 문제를 치료하는 데, 또는 수면 또는 활동 억제를 유도하는 데, 또는 각성 또는 기상 반응을 유발하는 데, 및 임의로는 또한 각종 유형의 암을 치료하는 데 효과적이고, 여기서, 고려되는 제약 조성물은 치료학상 유효량의 고려되는 화합물 (또는 그의 제약상 허용되는 염, 수화물, 또는 프로드럭), 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 것인, 제약 조성물을 제공한다. 예를 들어, 한 측면에서, 조성물은 신경교종, 췌장암 또는 다른 종양 치료용으로 제제화된다.
대안적 실시양태에서, 하나 이상의 비독성 제약상 허용되는 담체로 제제화된 조성물을 제공한다. 대안적 실시양태에서, 고체, 반고체, 또는 액체 형태로 경구 투여용으로, 또는 비경구 주사용으로 제제화된 제약 조성물을 제공한다. 대안적 실시양태에서, 상기 제약 조성물은 경구적으로, 직장으로, 비경구적으로, 복강내로, 질내로 또는 국소적으로 투여되는 것을 비롯한, 다양한 경로를 사용하여 인간 및 다른 동물에게 투여될 수 있다.
대안적 실시양태에서, 예컨대, 제약상 허용되는 멸균 수성 또는 비수성 용액, 분산액, 에멀젼, 또는 현탁액 뿐만 아니라, 사용 전에 멸균 주사용 용액 또는 현탁액으로 재구성되는 멸균 분말을 포함하는 주사용 제약 조성물을 제공한다. 적합한 수성 및 비수성 담체, 희석제, 용매 또는 비히클의 예로는 물, 에탄올, 폴리올 (예컨대, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 그의 적합한 혼합물, 오일, 주사용 유기 에스테르 (예컨대, 에틸 올레이트)를 포함한다. 대안적 실시양태에서, 보존제, 습윤화제, 유화제 및/또는 분산제를 비롯한, 각종의 불활성 성분을 포함하거나, 함유하는 조성물을 제공한다. 항박테리아제 및/또는 항진균제 (예컨대, 파라벤, 페놀 소르브산, 클로로부탄올 등)를 포함함으로써 확실하게 멸균성을 보장할 수 있다. 적절할 경우, 삼투압적 활성제 (예컨대, 당, 염화나트륨 등)가 포함될 수 있다.
대안적 실시양태에서, 경구 투여용으로서 고체 또는 반고체 제형으로 제제화된 조성물을 제공하고, 그러므로, 이는 연고, 캡슐제, 정제, 환제, 분제 및 과립제일 수 있다. 대안적 실시양태에서, 고체 또는 반고체 제형인 경우, 고려되는 화합물을 제약상 허용되는 부형제 또는 담체 (예컨대, 시트르산 나트륨 또는 인산이칼슘), 충전제 또는 증량제 (예컨대, 전분, 락토스, 수크로스, 글루코스, 만닛톨, 또는 규산), 결합제 (예컨대, 카르복시메틸셀룰로스, 알기네이트, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈, 수크로스 등), 보습제 (예컨대, 글리세롤), 붕해제 (예컨대, 아가-아가, 탄산칼슘, 감자 또는 타피오카 전분, 알긴산, 특정 실리케이트, 또는 탄산나트륨), 용해 지연제 (예컨대, 파라핀), 흡수 촉진제 (예컨대, 4급 암모늄 화합물) 습윤화제 (예컨대, 세틸 알콜 및 글리세롤 모노스테아레이트), 및 흡착제 (예컨대, 카올린, 또는 벤토나이트 점토), 및 윤활제 (예컨대, 활석, 스테아르산칼슘, 스테아르산마그네슘, 고체 폴리에틸렌 글리콜, 소듐 라우릴 술페이트) 중 적어도 하나와 혼합한다.
대안적 실시양태에서, 유사한 유형의 고체 또는 반고체 조성물 또한 락토스 또는 유당 뿐만 아니라, 고분자량 폴리에틸렌 글리콜 등과 같은 부형제를 사용하는 연질 및 경질 충진된 젤라틴 캡슐제로서 충전제로서 사용될 수 있다. 고체 또는 반고체 제형의 정제, 당의정, 캡슐제, 환제 및 과립제는 제약 제제화 분야에 널리 공지된 장용 코팅제 및 다른 코팅제와 같은 코팅제 및 쉘을 이용하여 제조될 수 있다. 대안적 실시양태에서, 장관 중 오직 특정 부분에서만, 또는 대안적으로, 임의로 지연된 방식으로 활성 성분(들)을 방출하도록 제제화된 조성물을 제공한다. 사용될 수 있는 포매 조성물의 예로는 중합체 물질 및 왁스를 포함한다. 대안적 실시양태에서, 적절할 경우, 상기 언급된 부형제 중 하나 이상의 것을 포함하는, 미세캡슐화된 형태의 화합물을 제공한다.
대안적 실시양태에서, 제약상 허용되는 에멀젼, 액제, 현탁제, 시럽제 및 엘릭시르를 비롯한, 경구 투여용 액체 제형을 제공한다. 활성 화합물 이외에도, 액체 제형은 당업계에서 보편적으로 사용되는 불활성 희석제 (예컨대, 물, 또는 다른 용매, 안정화제), 유화제 (예컨대, 에틸 알콜, 이소프로필 알콜, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알콜, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸렌 글리콜, 디메틸 포름아미드), 오일 (및 특히 면실유, 땅콩유, 옥수수유, 배아유, 올리브유, 피마자유, 및 참깨유), 글리세롤, 테트라히드로푸르푸릴 알콜, 폴리에틸렌 글리콜 및 소르비탄의 지방산 에스테르, 및 그의 혼합물을 함유할 수 있다. 불활성 희석제 이외에도, 경구용 조성물은 애주번트, 예컨대, 습윤화제, 유화제, 및 현탁화제, 감미제, 향미제, 및 방향제 또한 포함할 수 있다.
대안적 실시양태에서, 실온에서 고체 또는 반고체이지만, 체온에서는 액체이고, 그러므로, 직장 또는 질강에서 용융되고, 활성 화합물을 방출할 수 있는, 적합한 비자극성 부형제 또는 담체, 예컨대, 코코아 버터, 폴리에틸렌 글리콜 또는 좌제용 왁스와 함께 본원에서 제공된 화합물을 혼합함으로써 제조될 수 있는 직장 또는 질 투여용 조성물, 예컨대, 좌제를 제공한다.
대안적 실시양태에서, 단일 층판상, 올리고층판상, 또는 다중 층판상일 수 있는, 리포솜 형태로 투여되는 화합물을 제공한다. 리포솜 형태의, 고려되는 조성물은 안정제, 보존제, 부형제 등을 추가로 함유할 수 있다. 대안적 실시양태에서, 천연 및 합성인 것, 둘 모두인, 인지질 및 포스파티딜 콜린 (레시틴)을 비롯한, 리포솜 형성을 위한 지질을 제공한다. 리포솜 형성 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Prescott, Ed., Methods in Cell Biology, Volume XIV, Academic Press, New York, N.Y. (1976), p. 33 et seq]를 참조한다.
특정 환자, 조성물 및 투여 모드에 대하여 원하는 치료적 반응을 달성하는 데 효과적인 양으로 고려되는 화합물(들)을 수득하기 위해 본원에 제공된 제약 조성물 중의 화합물의 실제 투여량 수준은 달라질 수 있다. 따라서, 선택된 투여량 수준은 특정 화합물의 활성, 투여 경로, 치료되는 병태의 중증도, 및 치료받는 환자의 병태 및 이전 병력을 비롯한, 다양한 인자에 의존할 것이다. 그러나, 화합물의 용량을 원하는 치료적 효과를 달성하기 위해 요구되는 수준보다 더 낮은 수준으로 출발하여, 원하는 효과를 달성할 때까지 투여량을 점진적으로 증가시키는 것은 당업계의 기술 범위 내에 있다. 대안적 실시양태에서, 1일 체중 1 kg당 약 0.01 mg 내지 약 500 mg, 또는 약 0.5 mg 내지 약 50 mg의 투여량 수준으로 고려된 화합물을 포유동물 환자에게 경구적으로 투여하는 것을 제공한다. 원하는 경우, 유효 1일 용량은 투여 목적을 위해 다회 용량으로, 예컨대, 1일 2회 내지 4회의 분리 용량으로 분할될 수 있다.
대안적 실시양태에서, 추가의 제약상 활성인 화합물을 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 대안적 실시양태에서, 추가의 제약상 활성인 화합물은 동일한 제약 조성물에 포함될 수 있거나, 또는 별개로 투여될 수 있고, 당업계의 숙련가는 추가의 제약상 활성인 화합물의 적합한 투여를 위한 스케줄 및 경로를 쉽게 결정하게 될 것이다. 대안적 실시양태에서, 고려되는 화합물의 대사산물 및/또는 프로드럭 형태 또한 포함할 수 있고, 모든 화합물은 라세믹 혼합물 또는 입체화학적으로 순수한 (또는 부분적으로 정제된) 형태일 수 있는 조성물을 제공한다.
참조문헌 - 실시예 1
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이미 기술된 것 이외에도 다수의 더 많은 변형이 본원의 본 발명의 개념으로부터 벗어남 없이 이루어질 수 있다는 것은 당업자에게 자명하여야 한다. 그러므로, 본 발명의 주제는 첨부된 특허청구범위를 제외하면, 한정되지 않아야 한다. 더욱이, 명세서 및 특허청구범위, 둘 모두를 해석할 때, 모든 용어는 문맥과 일관되게 가능한 가장 광범위한 방식으로 해석되어야 한다. "포함하다" 및 "포함하는"이라는 용어는 비배제적 방식으로 요소, 성분, 또는 단계를 지칭하는 것으로 해석되어야 하고, 이는 언급된 요소, 성분, 또는 단계가 존재할 수 있거나, 또는 사용되거나, 또는 명백하게 언급되지 않는 다른 요소, 성분, 또는 단계와 함께 조합될 수 있다는 것을 나타낸다. 명세서 특허청구범위가 A, B, C .... 및 N으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것 중 적어도 하나를 지칭할 경우, A + N, 또는 B + N 등이 아닌, 군으로부터 오직 단 하나의 효소를 필요로 하는 것으로 해석되어야 한다.
본 발명의 실시양태 다수가 기술되어 있다. 그럼에도 불구하고, 본원에 기술된 바와 같은 실시양태의 정신 및 범주로부터 벗어남 없이 다양한 변형이 이루어질 수 있다는 것을 이해하여야 한다. 따라서, 다른 실시양태도 하기 특허청구범위의 범주 내에 포함된다.

Claims (17)

  1. 화합물 (3R)-1-(4-플루오로-3-메톡시벤질)-N-(9-클로로-3,4-디히드로-2H-1,5-벤조디옥세핀-7-일메틸)-N-이소부틸피롤리딘-3-카복스아미드, 또는 그의 입체이성질체, 또는 그의 제약상 허용되는 염을 포함하는,
    포유동물에서 24시간 주기 리듬 또는 타이밍의 변형을 위한 약제학적 조성물로서,
    여기서, 상기 조성물이 점안제 또는 안연고로 제형화되고,
    24시간 주기 리듬 또는 타이밍의 변형이
    a. 기분 장애; 우울증; 시차증; 교대 근무자 증후군; 전진성 수면 위상 장애 (ASPD); 계절성 정서 장애 (SAD); 가족성 전진성 수면 위상 증후군; 및 지연성 수면 위상 타입, 불규칙한 수면-각성 타입 또는 비-24시간 수면-각성 타입의 24시간 주기 리듬 수면 장애로부터 선택되는, 24시간 주기 리듬 조절과 연관된 신경정신과적 장애의 치료 또는 호전, 또는
    b. 포유동물에서 수면 문제 또는 수면 장애의 치료 또는 호전
    을 포함하는, 약제학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서, (i) PKR2 (프로키네티신 2 (PK2) 수용체) 활성을 변형시키는 화합물, 또는 PKR2 (PK2 수용체) 효능제 또는 길항제; (ii) 바소프레신 수용체 (VR) 활성을 변형시키는 화합물, 또는 바소프레신 수용체 (VR) 효능제 또는 길항제; 및 (iii) 멜라토닌 수용체 (MR) 활성을 변형시키는 화합물, 또는 멜라토닌 수용체 (MR) 효능제 또는 길항제; 중 하나 이상을 추가로 포함하고,
    여기서,
    a. 상기 PKR2 활성을 변형시키는 화합물, 또는 PKR2 효능제 또는 길항제가
    PKR2에 특이적으로 결합하고, PKR2 활성 또는 발현을 억제시키거나, 또는 PKR2 활성 또는 발현을 증가 또는 지속시키는 항체이거나; PKR2 유전자 또는 전사체에 특이적으로 결합하고/거나, PKR2 활성 또는 발현을 억제시키거나, 또는 PKR2 활성 또는 발현을 증가 또는 지속시키는 핵산이거나; PKR2 유전자 또는 전사체에 특이적으로 결합하고/거나, PKR2 활성 또는 발현을 억제시키거나, 또는 PKR2 활성 또는 발현을 증가 또는 지속시키는 소분자, 단백질, 펩티드, 탄수화물 또는 지질이거나; 또는
    상기 PKR2 길항제가 PKR2에 대한 억제성 핵산, siRNA 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드이고,
    b. 상기 VR 활성을 변형시키는 화합물, 또는 VR 효능제 또는 길항제가
    VR에 특이적으로 결합하고, VR 활성 또는 발현을 억제시키거나, 또는 VR 활성 또는 발현을 증가 또는 지속시키는 항체이거나; VR 유전자 또는 전사체에 특이적으로 결합하고/거나, VR 활성 또는 발현을 억제시키거나, 또는 VR 활성 또는 발현을 증가 또는 지속시키는 핵산이거나; VR 유전자 또는 전사체에 특이적으로 결합하고/거나, VR 활성 또는 발현을 억제시키거나, 또는 VR 활성 또는 발현을 증가 또는 지속시키는 소분자, 단백질, 펩티드, 탄수화물 또는 지질이거나; 또는
    상기 VR 길항제가 VR에 대한 억제성 핵산, siRNA 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드이고,
    c. 상기 MR 활성을 변형시키는 화합물, 또는 MR 효능제 또는 길항제가
    MR에 특이적으로 결합하고, MR 활성 또는 발현을 억제시키거나, 또는 MR 활성 또는 발현을 증가 또는 지속시키는 항체이거나; MR 유전자 또는 전사체에 특이적으로 결합하고/거나, MR 활성 또는 발현을 억제시키거나, 또는 MR 활성 또는 발현을 증가 또는 지속시키는 핵산이거나; MR 유전자 또는 전사체에 특이적으로 결합하고/거나, MR 활성 또는 발현을 억제시키거나, 또는 MR 활성 또는 발현을 증가 또는 지속시키는 소분자, 단백질, 펩티드, 탄수화물 또는 지질이거나; 또는
    상기 MR 길항제가 MR에 대한 억제성 핵산, siRNA 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드인, 약제학적 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 바소프레신 수용체가 VR1a 또는 VR1b 타입인, 약제학적 조성물.
  4. 제2항에 있어서, a) PKR2 및 VR의 효능제 또는 길항제; b) PKR2 및 MR의 효능제 또는 길항제; c) PKR2의 효능제 또는 길항제; d) VR의 효능제 또는 길항제; e) MR의 효능제 또는 길항제; f) MR 및 VR의 효능제 또는 길항제; 또는 g) PKR2, VR 및 MR의 효능제 또는 길항제를 포함하는, 약제학적 조성물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 반고체, 액체, 나노입자, 나노지질입자 또는 에멀젼의 형태인 것인, 약제학적 조성물.
  6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 약제학적 조성물을 포함하는 키트.
  7. 하기를 포함하는 제조 생성물 (product of manufacture):
    제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 약제학적 조성물; 및
    펌프, 장치, 주입 펜, 니들, 저장소, 앰플, 바이알, 시린지, 카트리지, 펜, 1회용 펜 또는 제트 주사기, 사전충전된 펜 또는 시린지 또는 카트리지, 카트리지 또는 1회용 펜 또는 제트 주사기, 2 챔버 또는 다중 챔버 펌프로부터 선택된 어느 하나.
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