KR102458709B1 - Composition for intraperitoneal administration for the prevention or treatment of ovarian cancer - Google Patents
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Abstract
본 발명은 복강 내 투여를 통해 난소암 치료 또는 재발 방지를 위한 약학 조성물에 관한 것으로, 종래 항암제(Doxorubicin)에 비해 지속적이고, 우수한 난소암 치료 효능을 기대할 수 있다.
특히, 본 발명에 따른 복강 내 투여용 조성물은 정확한 투여경로와 용량의 제어를 통해 종래 항암제 대비 우수한 난소암 축적 효율 및 선택성을 가지며, 동량의 항암제와 달리 정상 조직에 대한 독성을 거의 나타내지 않는다.The present invention relates to a pharmaceutical composition for the treatment or prevention of recurrence of ovarian cancer through intraperitoneal administration, and can be expected to have sustained and excellent ovarian cancer treatment efficacy compared to conventional anticancer drugs (Doxorubicin).
In particular, the composition for intraperitoneal administration according to the present invention has excellent ovarian cancer accumulation efficiency and selectivity compared to conventional anticancer drugs through precise administration route and dose control, and shows little toxicity to normal tissues unlike the same amount of anticancer drugs.
Description
본 발명은 종양 특이적 항암제 전구체 나노입자를 유효성분으로 하는 복강 내 투여를 통해 난소암 예방 또는 치료를 위한 약학 조성물에 관한 것이다.The present invention relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating ovarian cancer through intraperitoneal administration using tumor-specific anticancer drug precursor nanoparticles as an active ingredient.
난소암은 모든 부인과 암 중에서 가장 높은 사망률을 나타내는 암에 해당하며, 최근 생활양식이 서구화되고 노령인구가 증가함에 따라 그 빈도가 증가하고 있다. 난소암의 경우 초기에는 뚜렷한 증상이 나타나지 않으므로 약 70% 이상의 환자가 3기 이상인 진행성 난소암으로 최초 발견되며 약 75% 이상의 환자에서 최초 치료 후 2년 내 재발 및 전이가 일어나는 것으로 보고되어 있다.Ovarian cancer is the cancer with the highest mortality among all gynecological cancers, and its frequency is increasing as lifestyles are westernized and the elderly population increases. In the case of ovarian cancer, since there are no clear symptoms in the early stages, it is reported that more than 70% of patients are initially detected as
난소암으로 확인된 시점에는 이미 대부분 암이 많이 진행되어 복강 내외로 전이가 일어난 경우가 많다. 또한, 난소는 골반 내를 자유롭게 이동하기 때문에, 다른 암종에 비해서 자궁, 난소, 맹장, 대망 등 여러 부위로 전이가 쉽고 빠르게 진행된다고 알려져 있다.By the time ovarian cancer is confirmed, most of the cancers have already progressed and have metastasized inside and outside the abdominal cavity. In addition, since the ovaries move freely in the pelvis, it is known that metastasis to various sites such as the uterus, ovaries, appendix, and omentum is easier and faster than other carcinomas.
난소암을 치료하기 위해서 수술요법, 항암화학요법, 방사선요법과 더불어 면역요법을 이용한 다양한 시도가 이루어지고 있다. 난소암의 기본적인 치료방법은 수술로 종양을 최대한 제거하고, 항암제를 복강 내에 투여하는 방법이 주로 사용되고 있다. 상기 방법에는 임상에서 난소암에 사용되는 대표적인 항암제인 Paclitaxel, Cisplatin, Doxorubicin과 같은 항암제가 사용되는데, 이는 종양 선택성이 없어 난소암 조직뿐만 아니라, 난소암 주변의 정상조직에도 독성을 나타내어 치료 후 심각한 부작용을 나타낸다. 즉 난소암을 치료하기 위한 다양한 치료 물질들이 개발되지만, 실제 임상에서 효과를 기대할 수 없거나, 부작용으로 인해 장기간 치료가 어려운 등의 문제가 발견되고 있다.In order to treat ovarian cancer, various attempts have been made using immunotherapy along with surgery, chemotherapy, and radiation therapy. The basic treatment method for ovarian cancer is to remove the tumor as much as possible through surgery and to administer anticancer drugs into the abdominal cavity. In this method, anticancer drugs such as Paclitaxel, Cisplatin, and Doxorubicin, which are representative anticancer drugs used for ovarian cancer in clinical practice, are used. indicates That is, various therapeutic substances for treating ovarian cancer have been developed, but problems such as that the effect cannot be expected in actual clinical practice or that long-term treatment is difficult due to side effects have been found.
특히, 난소암은 다른 암과는 다른 특이적 성질을 가지고 있어, 다른 암에서 효과를 나타내는 항암제를 처리하더라도 암세포 사멸이 효과적으로 유도되지 않으며, 다양한 항암제에 대한 저항성을 갖고 있는 것으로 알려져 있다.In particular, it is known that ovarian cancer has specific properties different from other cancers, and thus cancer cell death is not effectively induced even when an anticancer agent that is effective in other cancers is treated, and has resistance to various anticancer agents.
따라서, 정상조직에 대한 독성을 최소화하고 난소암을 선택적으로 사멸시킬 수 있는 새로운 치료법의 개발이 절실히 요구되고 있는 실정이다.Therefore, there is an urgent need to develop a new treatment method capable of minimizing toxicity to normal tissues and selectively killing ovarian cancer.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로, 본 발명의 목적은 난소암 예방 또는 치료를 위한 복강 내 투여용 약학 조성물에 관한 것이다.The present invention has been devised to solve the above problems, and an object of the present invention relates to a pharmaceutical composition for intraperitoneal administration for the prevention or treatment of ovarian cancer.
본 발명은 상기 목적을 이루기 위하여, a) 서열번호 1로 표시되는 양친매성 펩타이드의 일 말단에 항암제가 결합된 약물복합체; b) 폴록사머; 및 c) 생리식염수;를 유효성분으로 포함하는 난소암 예방 또는 치료를 위한 복강 내 투여용 약학 조성물에 관한 것이다.In order to achieve the above object, the present invention provides: a) a drug complex in which an anticancer agent is bound to one end of the amphipathic peptide represented by SEQ ID NO: 1; b) poloxamers; And c) physiological saline; relates to a pharmaceutical composition for intraperitoneal administration for the prevention or treatment of ovarian cancer comprising as an active ingredient.
상기 폴록사머는 폴록사머 188, 폴록사머 237, 폴록사머 338 및 폴록사머 407로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.The poloxamer may be at least one selected from the group consisting of poloxamer 188, poloxamer 237, poloxamer 338, and poloxamer 407.
상기 약학 조성물은, 상기 (a) 약물복합체 100 중량부에 대하여, (b) 폴록사머 10 내지 60 중량부를 함유하고 있는 것일 수 있다.The pharmaceutical composition may contain 10 to 60 parts by weight of (b) poloxamer based on 100 parts by weight of the (a) drug complex.
상기 약학 조성물은, 상기 (a) 약물복합체 100 중량부에 대하여, (c) 생리식염수 0.1 내지 1 중량부를 함유하는 것일 수 있다.The pharmaceutical composition may contain 0.1 to 1 part by weight of (c) physiological saline based on 100 parts by weight of the (a) drug complex.
상기 약학 조성물은 3일 1회 투여하되, 단위 kg당 (a) 약물복합체가 40 내지 60 mg 투여되도록 포함하는 것일 수 있다.The pharmaceutical composition may be administered once every 3 days, and may include 40 to 60 mg of (a) drug complex administered per unit kg.
상기 약학 조성물은 복강 주사로 투여되는 것일 수 있다.The pharmaceutical composition may be administered by intraperitoneal injection.
본 발명에 따른 복강 내 투여용 약학 조성물은 종래 항암제(Doxorubicin)에 비해 지속적이고, 우수한 난소암 치료 효능을 기대할 수 있다.The pharmaceutical composition for intraperitoneal administration according to the present invention can be expected to have sustained and excellent ovarian cancer treatment efficacy compared to conventional anticancer drugs (Doxorubicin).
또한, 펩타이드와 항암제가 결합한 약물복합체를 바로 주입하는 것보다 난소암에 대한 선택성이 우수하므로, 별도의 담체나 전달체를 처리하지 않고 주사 제형으로 바로 제조 및 사용할 수 있어, 항암제, 담체 및 전달체로 인한 치료 후 부작용이 없다.In addition, since the selectivity for ovarian cancer is superior to that of directly injecting the drug complex in which the peptide and the anticancer agent are combined, it can be directly manufactured and used as an injection formulation without treatment with a separate carrier or carrier. There are no side effects after treatment.
특히, 본 발명에 따른 복강 내 투여용 조성물은 정확한 투여경로와 용량의 제어를 통해 종래 항암제 대비 우수한 난소암 축적 효율 및 선택성을 가지며, 동량의 항암제와 달리 정상 조직에 대한 독성을 거의 나타내지 않는다.In particular, the composition for intraperitoneal administration according to the present invention has excellent ovarian cancer accumulation efficiency and selectivity compared to conventional anticancer drugs through precise administration route and dose control, and shows little toxicity to normal tissues unlike the same amount of anticancer drugs.
도 1은 제1실험군과 비교군으로부터, 시간에 따라 채취한 각 장기(간, 폐, 심장, 비장, 신장, 장(intestine), 혈장(plasma) 및 복수(ascties))의 약동학/약력학(PK/PD)을 평가한 결과이다.
도 2a는 실험예 1로부터 제조된 제1실험군(복강 내 투여용 조성물)과 비교군(독소루비신)을 투여한 후, 시간에 따라 IVIS 장비로 측정하여 나타낸 이미지이다.
도 2b는 실험예 1로부터 제조된 제1실험군(복강 내 투여용 조성물)과 비교군(독소루비신)을 투여한 뒤 6 시간이 지난 후의 모습(좌측), IVIS 장비로 측정하여 나타낸 이미지(우측)이다.
도 2c는 실험예 1로부터 제조된 제1실험군(복강 내 투여용 조성물)과 비교군(독소루비신)을 투여한 6 시간이 지난 후, 각 장기(간, 폐, 비장, 신장, 심장) 및 암 조직을 적출하여 IVIS 장비로 측정하여 나타낸 이미지이다.
도 3a는 대조군, 제1실험군 및 비교군을 투여한 후, 20일째 종양 조직의 모습을 촬영한 사진이다.
도 3b는 대조군, 제1실험군(1xFDOX), 제2실험군(2xFDOX) 및 비교군(DOX) 투여 후, 20일째에 종양 무게를 측정한 그래프이다.* p<0.01, ** p<0.001.
도 3c는 대조군, 제1실험군 및 비교군 투여 후, 20일 째 종양 조직의 조직형태학적 변화에 미치는 영향을 조사한 헤마톡실린 및 에오신(H&E)과 Annexin V 염색 결과이다.
도 4a는 대조군, 제1실험군 및 비교군 투여 후, 20일 째 각 주요조직(폐 조직, 비장 조직 및 심장 조직)의 조직형태학적 변화에 미치는 영향을 조사한 헤마톡실린 및 에오신(H&E)과 Annexin V 염색 결과이다.
도 4b는 대조군, 제1실험군 및 비교군 투여 후, 20일째 각 주요조직(간 조직, 폐 조직, 비장 조직, 신장 조직, 장(intestine) 조직 및 심장 조직)의 무게를 측정한 그래프이다.
도 4c는 투여기간에 따른 대조군, 제1실험군 및 비교군의 치료 20일 동안 체중을 측정한 그래프이다. * p<0.01, ** p<0.001.
도 4d는 대조군, 제1실험군 및 비교군 투여 후, 투여 기간에 따른 생존율을 평가한 그래프이다.
도 4e는 대조군, 제1실험군 및 비교군 투여 후, 20일째 채취한 혈액으로부터 혈액검사를 측정하여 나타낸 그래프이다.1 shows the pharmacokinetics/pharmacodynamics (PK) of each organ (liver, lung, heart, spleen, kidney, intestine, plasma and ascites) collected over time from the first experimental group and control group. /PD) was evaluated.
Figure 2a is an image showing the time after administration of the first experimental group (composition for intraperitoneal administration) and the comparative group (doxorubicin) prepared in Experimental Example 1, measured with an IVIS device over time.
Figure 2b is the first experimental group (composition for intraperitoneal administration) prepared in Experimental Example 1 and the comparative group (doxorubicin) 6 hours after administration (left), an image measured with IVIS equipment (right) .
Figure 2c shows each organ (liver, lung, spleen, kidney, heart) and cancer tissue after 6 hours of administration of the first experimental group (composition for intraperitoneal administration) and the comparative group (doxorubicin) prepared in Experimental Example 1; It is an image that was extracted and measured with IVIS equipment.
Figure 3a is a photograph of the appearance of the tumor tissue on the 20th day after administration of the control group, the first experimental group, and the comparative group.
3b is a graph showing tumor weights measured on
FIG. 3c is a result of hematoxylin and eosin (H&E) and Annexin V staining of the control group, the first experimental group, and the comparative group, which was examined for the effect on the histomorphological change of the tumor tissue on the 20th day after administration.
Figure 4a is hematoxylin and eosin (H&E) and Annexin examined the effect on histomorphological changes of each major tissue (lung tissue, spleen tissue and heart tissue) on the 20th day after administration of the control group, the first experimental group and the comparative group V staining result.
4B is a graph showing the weight of each major tissue (liver tissue, lung tissue, spleen tissue, kidney tissue, intestinal tissue, and heart tissue) on the 20th day after administration of the control group, the first experimental group, and the comparative group.
Figure 4c is a graph of body weight measurement during 20 days of treatment in the control group, the first experimental group, and the comparative group according to the administration period. *p<0.01, **p<0.001.
4D is a graph evaluating the survival rate according to the administration period after administration of the control group, the first experimental group and the comparative group.
Figure 4e is a graph showing the measurement of blood tests from the blood collected on the 20th day after administration of the control group, the first experimental group and the comparative group.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.
앞서 서술한 바와 같이, 최근 임상에서 난소암 치료를 위해 가장 많이 사용되는 화학 요법제는 독소루비신, 파클리탁셀, 시스플라틴이지만, 이들 치료제는 종양 선택성이 매우 낮아 심각한 부작용을 나타낸다는 단점을 가지며, 치료 효과를 높이기 위해 많은 양을 사용하는 경우에는 난소와 인접한 장기인 자궁, 난소, 맹장, 대망 등에 독성을 나타내어 심각한 부작용으로 이어질 수 있다.As described above, the most frequently used chemotherapeutic agents for the treatment of ovarian cancer in recent clinical trials are doxorubicin, paclitaxel, and cisplatin, but these therapeutic agents have very low tumor selectivity and have serious side effects. If a large amount is used for harm, it can be toxic to the organs adjacent to the ovaries, such as the uterus, ovaries, appendix, and omentum, and lead to serious side effects.
따라서 본 발명은 상술한 문제들은 해결하면서, 기존 항암제 대비 월등히 독성이 감소하면서 난소암 특이적 축적 효율은 우수한 복강 내 투여용 조성물을 제시하고자 한다.Therefore, the present invention aims to present a composition for intraperitoneal administration that has excellent ovarian cancer-specific accumulation efficiency while remarkably reducing toxicity compared to existing anticancer drugs while solving the above problems.
본 발명은 a) 서열번호 1로 표시되는 양친매성 펩타이드의 일 말단에 항암제가 결합된 약물복합체; b) 폴록사머; 및 c) 생리식염수;를 유효성분으로 포함하는 난소암 예방 또는 치료를 위한 복강 내 투여용 약학 조성물에 관한 것이다.The present invention relates to a) a drug complex in which an anticancer agent is bound to one end of the amphipathic peptide represented by SEQ ID NO: 1; b) poloxamers; And c) physiological saline; relates to a pharmaceutical composition for intraperitoneal administration for the prevention or treatment of ovarian cancer comprising as an active ingredient.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 복강 내 투여용 조성물은 (a) 서열번호 1로 표시되는 양친매성 펩타이드의 일 말단에 항암제인 독소루비신이 결합된 약물복합체와 (b) 폴록사머를 포함하는 약학성분을 혼합하여 (c) 생리식염수로 제제화하여 비경구적인 방법으로 투여하기 위한 것일 수 있다.According to one embodiment of the present invention, the composition for intraperitoneal administration is (a) a drug complex in which an anticancer drug doxorubicin is bound to one end of the amphipathic peptide represented by SEQ ID NO: 1, and (b) a pharmaceutical comprising a poloxamer It may be for parenteral administration by mixing the components (c) with physiological saline solution.
또한 본 발명은 유효성분으로 서열번호 1로 표시되는 양친매성 펩타이드의 일 말단에 항암제가 결합된 약물복합체, 폴록사머 및 생리식염수를 유효량 포함하는 약학성분을 포함하는 난소암 예방 또는 치료를 위한 키트를 제공할 수 있다.In addition, the present invention provides a kit for preventing or treating ovarian cancer, comprising a pharmaceutical ingredient comprising an effective amount of a drug complex, poloxamer and physiological saline in which an anticancer agent is bound to one end of the amphipathic peptide represented by SEQ ID NO: 1 as an active ingredient. can provide
본 발명은 a) 서열번호 1로 표시되는 양친매성 펩타이드의 일 말단에 항암제가 결합된 약물복합체; b) 폴록사머; 및 c) 생리식염수;를 포함하는 약학성분을 복강 내 투여함으로써, 기존 항암제 사용에서는 얻을 수 없는 현저히 향상된 난소암에 대한 특이적 암효과를 기대할 수 있다.The present invention relates to a) a drug complex in which an anticancer agent is bound to one end of the amphipathic peptide represented by SEQ ID NO: 1; b) poloxamers; And c) physiological saline; by intraperitoneally administering a pharmaceutical component comprising a, a remarkably improved specific cancer effect against ovarian cancer that cannot be obtained using conventional anticancer drugs can be expected.
또한, 상기 복강 내 투여용 약학 조성물은 난소암에 대해서만 특이적으로 독성을 가지기 때문에, 정상조직에 대해서는 전혀 세포 독성을 유발하지 않는다는 점에서 매우 안정적이다.In addition, since the pharmaceutical composition for intraperitoneal administration has specific toxicity only for ovarian cancer, it is very stable in that it does not cause any cytotoxicity to normal tissues.
본 명세서에서 용어 "펩타이드"란 펩타이드 결합에 의해 아미노산 잔기들이 서로 결합되어 형성된 선형의 분자를 의미한다.As used herein, the term “peptide” refers to a linear molecule formed by bonding amino acid residues to each other by peptide bonds.
참고로, 대표적인 아미노산과 각각의 약어는, 알라닌(Ala, A), 이소류신(Ile, I), 류신(Leu, L), 메티오닌(Met, M), 페닐알라닌(Phe, F), 프롤린(Pro, P), 트립토판(Trp, W), 발린(Val, V), 아스파라긴(Asn, N), 시스테인(Cys, C), 글루타민(Gln, Q), 글리신(Gly, G), 세린(Ser, S), 트레오닌(Thr, T), 티로신(Try, Y), 아스파르트산(Asp, D), 글루탐산(Glu, E), 아르기닌(Arg, R), 히스티딘(His, H), 리신(Lys, K)과 같다.For reference, representative amino acids and their abbreviations are alanine (Ala, A), isoleucine (Ile, I), leucine (Leu, L), methionine (Met, M), phenylalanine (Phe, F), proline (Pro, P), tryptophan (Trp, W), valine (Val, V), asparagine (Asn, N), cysteine (Cys, C), glutamine (Gln, Q), glycine (Gly, G), serine (Ser, S) ), threonine (Thr, T), tyrosine (Try, Y), aspartic acid (Asp, D), glutamic acid (Glu, E), arginine (Arg, R), histidine (His, H), lysine (Lys, K) ) is the same as
본 발명에 따른 약물복합체는 카텝신 B 효소에 의해 특이적으로 분해되는 양친매성 펩타이드와 항암제가 결합된 것으로, 상기 양친매성 펩타이드와 항암제 사이의 상호작용에 의해, 카텝신 B 효소에 의해 분해될 경우, 분해된 양친매성 펩타이드와 이의 일부가 결합된 항암제가 생성되고, 이는 종양세포에 대해 우수한 약물 효과를 나타내는데 유용하게 적용될 수 있다.The drug complex according to the present invention is a combination of an amphiphilic peptide specifically degraded by cathepsin B enzyme and an anticancer agent, and when decomposed by cathepsin B enzyme by interaction between the amphiphilic peptide and an anticancer agent , an anticancer agent in which the decomposed amphiphilic peptide and a part thereof are bound is produced, which can be usefully applied to show excellent drug effects on tumor cells.
상기 양친매성 펩타이드는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.The amphiphilic peptide may consist of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
또한, 상기 약물복합체는 용액상에서 자기조립을 통해 구형의 입자로 존재하나, 그 크기가 균일하지 않고, 생체 내에서 다소 불안정하므로, 폴록사머를 혼합하여 생체 내 안정성을 확보함과 동시에 정확한 약물용량으로 투여할 수 있다는 장점이 있다.In addition, the drug complex exists as spherical particles through self-assembly in the solution phase, but the size is not uniform and is somewhat unstable in vivo. The advantage is that it can be administered.
상기 카텝신 B 효소는 정상세포에서는 발현이 제한되면서 종양세포에서는 특이적으로 발현되는 것으로써, 특히 전이암에서 특이적으로 발현되나, 본 발명의 약학조성물은 복강 내 투여하는 것으로써, 암 중에서 난소암 예방 또는 치료에 대해서 효과를 나타내나, 가장 바람직하게는 전이 난소암의 난소암 예방 또는 치료에 효과를 나타낸다 할 수 있다.The cathepsin B enzyme is specifically expressed in tumor cells with limited expression in normal cells, and is specifically expressed in metastatic cancer, but the pharmaceutical composition of the present invention is intraperitoneally administered, and ovarian cancer in cancer Although it has an effect on preventing or treating cancer, it can be said that it is most preferably effective in preventing or treating metastatic ovarian cancer.
상기 항암제는 택솔, 벤다무스틴, 부설판, 카무스틴, 클로람부실, 시클로포스파미드, 다카바진, 아드리아마이신, 다우노마이신(daunomycin), 이포스파미드, 멜팔란, 프로카바진, 스트렙토조신, 테모졸로미드, 아스파라기나제, 카페시타빈, 시타라빈, 5-플루오로우라실, 플루다라빈, 젬시타빈, 메토트렉세이트, 페메트렉세드, 랄티트렉세드, 액티노마이신-D, 블레오마이신, 다우노루비신, 독소루비신, 페길화 리포좀 독소루비신, 에피루비신, 이다루비신, 미토마이신, 미토잔트론, 에토포시드, 도세탁셀, 이리노테칸, 파클리탁셀, 토포테칸, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 비노렐빈, 카보플라틴, 시스플라틴, 옥살리플라틴, 알렘투자맙, 비씨지, 베바시주맙, 세툭시맙, 데노수맙, 엘로티닙, 게피티닙, 이마티닙, 인터페론, 이필리무맙, 라파티닙, 파니투무맙, 리툭시맙, 수니티닙, 소라페닙, 템시롤리무스, 트라스투주맙, 클로드로네이트, 이반드론산, 파미드로네이트 및 졸레드론산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있고, 바람직하게는 독소루비신일 수 있다.The anticancer agent is taxol, bendamustine, busulfan, carmustine, chlorambucil, cyclophosphamide, dacarbazine, adriamycin, daunomycin, ifosfamide, melphalan, procarbazine, streptozocin , temozolomide, asparaginase, capecitabine, cytarabine, 5-fluorouracil, fludarabine, gemcitabine, methotrexate, pemetrexed, raltitrexed, actinomycin-D, bleomycin, daunoru Bicin, doxorubicin, pegylated liposomal doxorubicin, epirubicin, idarubicin, mitomycin, mitoxantrone, etoposide, docetaxel, irinotecan, paclitaxel, topotecan, vinblastine, vincristine, vinorelbine, carboplatin , cisplatin, oxaliplatin, alemtuzumab, BCG, bevacizumab, cetuximab, denosumab, erlotinib, gefitinib, imatinib, interferon, ipilimumab, lapatinib, panitumumab, rituximab, su It may be any one selected from the group consisting of nitinib, sorafenib, temsirolimus, trastuzumab, clodronate, ibandronic acid, pamidronate and zoledronic acid, preferably doxorubicin.
본 발명에서, 상기 약물복합체는 바람직하게 하기 구조식 1로 표시될 수 있다.In the present invention, the drug complex may preferably be represented by the following
[구조식 1][Structural Formula 1]
상기 폴록사머(poloxamer)는 소수성의 프로필렌옥사이드를 중심으로 양 끝에 친수성의 에틸렌옥사이드가 결합된 비이온성의 트리블록공중합체로서, 온도 민감성의 특징을 갖고 있어, 농도와 온도에 따라 졸(sol)과 젤(gel)의 변환이 가능하고, 폴리옥시프로필렌 및 폴리옥시에틸렌의 비율에 따라 폴록사머의 성질이 달라진다. The poloxamer is a nonionic triblock copolymer in which hydrophilic ethylene oxide is bonded to both ends with a hydrophobic propylene oxide as the center, and has temperature sensitivity, Conversion of a gel is possible, and the properties of the poloxamer vary according to the ratio of polyoxypropylene and polyoxyethylene.
본 발명의 상기 플록사머는 100 내지 20,000 Da의 평균 분자량을 갖는 것일 수 있다. The floxamer of the present invention may have an average molecular weight of 100 to 20,000 Da.
상기 폴록사머 188, 폴록사머 237, 폴록사머 338 및 폴록사머 407로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있고, 바람직하게는 폴록사머 188일 수 있다.It may be any one or more selected from the group consisting of poloxamer 188, poloxamer 237, poloxamer 338, and poloxamer 407, preferably poloxamer 188.
상기 약학 조성물은, 상기 약물복합체 100 중량부에 대하여, 폴록사머 10 내지 50 중량부 포함하는 것일 수 있고, 바람직하게는 폴록사머 30 내지 50 중량부일 수 있으며, 보다 바람직하게는 40 내지 45 중량부일 수 있다.The pharmaceutical composition may include 10 to 50 parts by weight of poloxamer based on 100 parts by weight of the drug complex, preferably 30 to 50 parts by weight of poloxamer, and more preferably 40 to 45 parts by weight. have.
상기 약학 조성물은, 상기 약물복합체 100 중량부에 대하여, 용해도를 높이거나 안정화시키기 위해 별도의 첨가물없이 생리식염수를 0.1 내지 1 중량부 포함할 수 있고, 바람직하게는 생리식염수를 0.3 내지 0.6 중량부를 포함하는 것일 수 있다.The pharmaceutical composition, with respect to 100 parts by weight of the drug complex, may contain 0.1 to 1 parts by weight of physiological saline without a separate additive to increase or stabilize solubility, preferably 0.3 to 0.6 parts by weight of physiological saline. may be doing
상기 약물복합체와 폴록사머 및 생리식염수는 상기 중합비로 혼합하여 제형화된 복강 내 투여용 약학 조성물로써, 상기 조성물은 평균 직경 80 내지 200 nm의 구형 입자 형태의 에멀젼 제형이 형성된 것일 수 있다. 이때 분산도는 0.2 미만인 것이 바람직하다. 만약 상기 폴록사머 대신 다른 첨가제가 사용되거나, 상기 중량비를 범위를 벗어나 혼합할 경우에는, 평균 직경 80 내지 200 nm, 분산도 0.2 미만인 구형 입자 형태의 에멀젼 제형을 얻을 수 없게 될 수 있다.The drug complex, poloxamer, and physiological saline are mixed at the polymerization ratio to form a pharmaceutical composition for intraperitoneal administration, and the composition may have an emulsion formulation in the form of spherical particles having an average diameter of 80 to 200 nm. In this case, the dispersion is preferably less than 0.2. If other additives are used instead of the poloxamer, or if the weight ratio is mixed out of the range, it may not be possible to obtain an emulsion formulation in the form of spherical particles having an average diameter of 80 to 200 nm and a dispersion of less than 0.2.
상기 약학 조성물의 제형이 평균 직경 80 nm 미만일 경우에는 (a) 약물복합체가 안정적이지 못해 생체 내에서 쉽게 분해되는 문제가 발생할 수 있고, 분산도가 0.2 이상일 경우에는 균일하지 못하기 때문에 정확하게 약물용량을 제어할 수 없어지는 문제가 발생할 수 있다.If the dosage form of the pharmaceutical composition has an average diameter of less than 80 nm, (a) the drug complex is not stable and may be easily decomposed in vivo. Problems can arise that are out of control.
상기 약학 조성물은 생체 내에서는 매우 안정적으로 존재하다가 종양세포의 카텝신 B 효소 존재 하에서, (a) 약물복합체의 양친매성 펩타이드가 분해되어, 상기 약물복합체 나노입자 코어 부분에 위치하던 상기 항암제가 방출되는 것이다.The pharmaceutical composition is very stable in vivo, and in the presence of cathepsin B enzyme of tumor cells, (a) the amphiphilic peptide of the drug complex is decomposed, and the anticancer agent located in the drug complex nanoparticle core part is released will be.
본 발명에서 '난소암'은 내성 난소암, 재발 난소암 및 전이 난소암을 포함하는 것일 수 있다. 상기 전이 난소암이란, 난소암세포가 원발 장기를 떠나 다른 장기로 이동하여 증식되어 발생된 암을 의미한다. 바람직하게는 난소암에서 암세포가 주위 장기로 침습하거나, 혈관이나 림프관을 따라 다른 장기로 전이된 것을 의미할 수 있으나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.In the present invention, 'ovarian cancer' may include resistant ovarian cancer, recurrent ovarian cancer, and metastatic ovarian cancer. The metastatic ovarian cancer refers to cancer generated by ovarian cancer cells moving from a primary organ to another organ and proliferating. Preferably, it may mean that cancer cells invade into surrounding organs in ovarian cancer or metastasize to other organs along blood vessels or lymphatic vessels, but is not particularly limited thereto.
본 발명에서 재발 난소암이란, 최초 난소암 발생 후 치료로 인해 완치 판정을 받은 후, 난소에 다시 암이 발생한 경우를 의미한다. In the present invention, recurrent ovarian cancer refers to a case in which cancer reoccurs in the ovary after the initial ovarian cancer is diagnosed and cured due to treatment.
본 발명에서 내성 난소암이란, 방사선 치료법과 같은 암 치료요법 또는 암 치료용 약물, 특히 항암제 치료에 대하여 극히 낮은 감수성을 나타내어, 상기 치료법에 의해 증세가 호전, 완화, 경감 또는 치료 증상을 나타내지 않는 암을 의미한다. 상기 내성 난소암은 특정한 치료법에 대하여 처음부터 내성을 갖는 것일 수 있고, 최초에는 내성을 나타내지 않았으나, 긴 시간의 치료로 인하여 난소암 세포 내의 유전자 변이 등에 의하여 동일한 치료에 대해 더 이상 감수성을 나타내지 않게되어 발생할 수도 있다.In the present invention, resistant ovarian cancer is a cancer that exhibits extremely low sensitivity to cancer therapy such as radiation therapy or a drug for cancer treatment, in particular, an anticancer drug, and does not show improvement, alleviation, alleviation, or treatment symptoms by the therapy. means The resistant ovarian cancer may be resistant to a specific treatment from the beginning, and did not show resistance at first, but due to long-term treatment, it no longer exhibits sensitivity to the same treatment due to genetic mutation in ovarian cancer cells. may occur.
본 발명에서 예방은 약학 조성물의 투여에 의한 난소암 질환을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 말한다.In the present invention, prevention refers to any action that suppresses or delays the onset of ovarian cancer disease by administration of the pharmaceutical composition.
본 발명에서 치료는 약학 조성물의 투여에 의해 난소암 질환의 증세가 호전되거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 말한다.In the present invention, treatment refers to any action that improves or beneficially changes the symptoms of ovarian cancer disease by administration of the pharmaceutical composition.
본 발명의 약학 조성물의 투여형태는 주사에 의한 복강내 투여경로인 것을 특징으로 한다.The dosage form of the pharmaceutical composition of the present invention is characterized in that it is an intraperitoneal route of administration by injection.
본 발명에서 복강 투여 또는 복강 내 투여는 복강 내로의 주사를 말한다. 본 발명의 약학 조성물을 복강 투여하면 전신 방출이 거의 없고, 난소암에 대해 특이적 항암 효과를 선택적으로 제한할 수 있다.In the present invention, intraperitoneal administration or intraperitoneal administration refers to injection into the abdominal cavity. When the pharmaceutical composition of the present invention is administered intraperitoneally, there is almost no systemic release, and it is possible to selectively limit the specific anticancer effect on ovarian cancer.
본 발명의 약학 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있다. 상기 약제학적으로 유효한 양은 "치료 유효량" 및 "예방 유효량"을 포함한다. 용어 "치료 유효량"은 약물 또는 치료제가 단독으로 또는 다른 치료제와 조합되어 사용되는 경우에, 질환 증상의 중증도 감소, 질환 증상이 없는 기간의 빈도 및 지속기간의 증가, 또는 질환 고통으로 인한 손상 또는 장애의 방지를 나타낼 수 있는 약물의 임의의 양을 의미한다. 용어 "예방 유효량"은 난소암 발생 위험이 있는 개체 또는 난소암 전이 또는 재발로 인해 고통받을 위험이 있는 개체에서 난소암의 발생, 전이 또는 재발을 억제하는 약물의 임의의 양을 의미한다. 유효량의 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소 등에 따라 결정될 수 있다.The pharmaceutical composition of the present invention may be administered in a pharmaceutically effective amount. The pharmaceutically effective amount includes a “therapeutically effective amount” and a “prophylactically effective amount”. The term "therapeutically effective amount" refers to a decrease in the severity of disease symptoms, an increase in the frequency and duration of disease symptom-free periods, or damage or disability resulting from disease affliction, when the drug or therapeutic agent is used alone or in combination with other therapeutic agents. Any amount of drug that can exhibit the prevention of The term "prophylactically effective amount" means any amount of a drug that inhibits the development, metastasis or recurrence of ovarian cancer in an individual at risk of developing ovarian cancer or at risk of suffering from ovarian cancer metastasis or recurrence. The level of the effective amount depends on the subject type and severity, age, sex, drug activity, drug sensitivity, administration time, administration route and excretion rate, duration of treatment, factors including concurrent drugs, and other factors well known in the medical field. can be determined accordingly.
본 발명의 약학 조성물은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으며, 구체적으로 난소암을 갖는 개체의 질환 발병 정도에 따라 본 발명의 약학 조성물을 1회 또는 수회로 나누어 바람직한 투여간격, 예컨대 3일 간격으로 투여할 수 있다.The pharmaceutical composition of the present invention may vary depending on the age, sex, and weight of the patient, and specifically, the pharmaceutical composition of the present invention is divided once or several times according to the degree of disease onset of an individual having ovarian cancer at a preferred administration interval, such as 3 It can be administered at daily intervals.
본 발명의 약학 조성물이 복강을 통해 그 효과를 나타냄에 있어, 최적의 용량은 투여되는 개체의 단위 무게(1 kg) 기준으로, (a) 약물복합체가 1 내지 1000 mg 포함되는 것이며, 가장 바람직하게는 40 내지 60 mg임을 확인하였다. 상기 용량보다 적은 경우 약물의 효과를 기대하기 어려우며, 상기 용량보다 많은 경우에는 약물의 과잉투여로 인한 비특이적인 부작용 또는 치료 효눙의 감소가 나타나는 문제가 있다. In showing the effect of the pharmaceutical composition of the present invention through the abdominal cavity, the optimal dose is based on the unit weight (1 kg) of the administered subject, (a) that contains 1 to 1000 mg of the drug complex, most preferably was confirmed to be 40 to 60 mg. When it is less than the above dose, it is difficult to expect the effect of the drug, and when it is larger than the above dose, there is a problem in that non-specific side effects or a decrease in therapeutic efficacy due to overdose of the drug appear.
동물실험결과에 따르면, (a) 서열번호 1로 표시되는 양친매성 펩타이드의 일 말단에 항암제인 독소루비신이 결합된 약물복합체와 (b) 폴록사머 및 (c) 생리식염수를 혼합한 제제를 준비하고, 이를 동물모델에 복강 내 주사를 통해 투여되었을 때, 난소암에 대한 특이적 축적효율과 다른 조직에 대한 부작용을 최소화하는 것을 확인하였다.According to the animal test results, (a) a drug complex in which the anticancer drug doxorubicin is bound to one end of the amphipathic peptide represented by SEQ ID NO: 1, (b) poloxamer, and (c) a preparation of a mixture of physiological saline was prepared, When it was administered to an animal model through intraperitoneal injection, it was confirmed that the specific accumulation efficiency for ovarian cancer and side effects on other tissues were minimized.
또한, 본 발명의 약학 조성물이 투여될 때, 난소암에 대한 항암효과를 나타내기 위해서는, 단위 무게(1 kg) 기준으로, (a) 약물복합체를 1 내지 1000 mg 포함하는 것이 바람직하며, 2 배 이상의 항암효과를 얻기 위해서는 40 내지 60 mg 포함되는 조성물을, 3일 간격으로 투여하는 것이 가장 바람직하다.In addition, when the pharmaceutical composition of the present invention is administered, in order to exhibit an anticancer effect on ovarian cancer, it is preferable to include (a) 1 to 1000 mg of the drug complex on a unit weight (1 kg) basis, and 2 times In order to obtain the above anticancer effect, it is most preferable to administer the composition containing 40 to 60 mg every 3 days.
또한 본 발명의 약학 조성물은 개별 치료제로 투여되거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있다. 다른 치료제와 병용하여 투여되는 경우, 본 발명의 약학 조성물과 다른 치료제는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 상기 다른 치료제는 암 퇴행을 촉진하거나 또는 추가로 종양 성장을 방지하는 화합물, 단백질 등의 약물일 수 있으며, 또한 방사선 치료 등 약물 요법 이외의 기타 항암 요법을 모두 포함한다.In addition, the pharmaceutical composition of the present invention may be administered as an individual therapeutic agent or in combination with other therapeutic agents. When administered in combination with another therapeutic agent, the pharmaceutical composition of the present invention and the other therapeutic agent may be administered sequentially or simultaneously. The other therapeutic agent may be a drug such as a compound or protein that promotes cancer regression or further prevents tumor growth, and includes all other anti-cancer therapies other than drug therapy, such as radiation therapy.
본 발명의 또 다른 양태는 난소암을 갖는 개체에 복강 내 투여용 약학 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 난소암 예방 또는 치료 방법을 제공한다.Another aspect of the present invention provides a method for preventing or treating ovarian cancer, comprising administering a pharmaceutical composition for intraperitoneal administration to an individual having ovarian cancer.
상기 복강 내 투여용 약학 조성물은 a) 서열번호 1로 표시되는 양친매성 펩타이드의 일 말단에 항암제가 결합된 약물복합체; b) 폴록사머 188; 및 c) 생리식염수;를 유효성분으로 포함하는 것일 수 있다.The pharmaceutical composition for intraperitoneal administration includes: a) a drug complex in which an anticancer agent is bound to one end of the amphiphilic peptide represented by SEQ ID NO: 1; b) poloxamer 188; and c) physiological saline; may be included as an active ingredient.
본 발명에 따른 난소암 예방 또는 치료 방법에서 각 용어는 특별히 언급하지 않는 한, 상기 복강 내 투여용 약학 조성물에서 상기한 바와 동일한 의미를 갖는다.In the method for preventing or treating ovarian cancer according to the present invention, each term has the same meaning as described above in the pharmaceutical composition for intraperitoneal administration unless otherwise specified.
본 발명에서 용어 "개체"는 임의의 인간 또는 비인간 동물을 포함한다. 용어 "비인간 동물"은 척추동물, 예컨대 비인간 영장류, 양, 개, 및 설치류, 예컨대 마우스, 래트 및 기니 피그일 수 있다. 상기 개체는 바람직하게 인간일 수 있다. 용어 "개체"는 본 명세서에서 "대상체" 및 "환자"와 상호교환적으로 사용 가능하다.As used herein, the term "individual" includes any human or non-human animal. The term "non-human animal" can be a vertebrate, such as non-human primates, sheep, dogs, and rodents, such as mice, rats and guinea pigs. The subject may preferably be a human. The term “subject” is used interchangeably herein with “subject” and “patient”.
상기 난소암 치료는 예를 들면 비치료 개체에 비해 종양 성장을 약 10% 이상, 약 20% 이상, 약 40% 이상, 약 60% 이상, 또는 약 80% 이상 억제하는 것일 수 있다.The ovarian cancer treatment may be, for example, inhibiting tumor growth by about 10% or more, about 20% or more, about 40% or more, about 60% or more, or about 80% or more compared to an untreated individual.
또한, 본 발명의 투여방법은, 난소암에 대한 항암효과를 나타내기 위해, 단위 무게(1 kg) 기준으로, (a) 약물복합체를 1 내지 1000 mg 포함하는 약학 조성물을 투여하는 것이 바람직하며, 2 배 이상의 항암효과를 얻기 위해서는 (a) 약물복합체가 40 내지 60 mg 포함되는 약학 조성물을, 3일 간격으로 투여하는 것이 가장 바람직하다.In addition, the administration method of the present invention, in order to exhibit an anticancer effect on ovarian cancer, based on a unit weight (1 kg), (a) it is preferable to administer a pharmaceutical composition comprising 1 to 1000 mg of the drug complex, In order to obtain a two-fold or more anticancer effect, it is most preferable to administer (a) a pharmaceutical composition containing 40 to 60 mg of the drug complex every 3 days.
본 발명의 약학 조성물의 투여형태는 주사에 의한 복강내 투여경로인 것을 특징으로 한다.The dosage form of the pharmaceutical composition of the present invention is characterized in that it is an intraperitoneal route of administration by injection.
본 발명에서 복강 투여 또는 복강 내 투여는 복강 내로의 주사를 말한다. 본 발명의 약학 조성물을 복강 투여하면 전신 방출이 거의 없고, 난소암에 대해 특이적 항암 효과를 선택적으로 제한할 수 있다.In the present invention, intraperitoneal administration or intraperitoneal administration refers to injection into the abdominal cavity. When the pharmaceutical composition of the present invention is administered intraperitoneally, there is almost no systemic release, and it is possible to selectively limit the specific anticancer effect on ovarian cancer.
이하에서 실시예 등을 통해 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 하며, 다만 이하에 실시예 등에 의해 본 발명의 범위와 내용이 축소되거나 제한되어 해석될 수 없다. 또한, 이하의 실시예를 포함한 본 발명의 개시 내용에 기초한다면, 구체적으로 실험 결과가 제시되지 않은 본 발명을 통상의 기술자가 용이하게 실시할 수 있음은 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속하는 것도 당연하다. Hereinafter, the present invention will be described in more detail by way of Examples and the like, but the scope and content of the present invention may not be construed as being reduced or limited by the Examples below. In addition, based on the disclosure of the present invention including the following examples, it is clear that a person skilled in the art can easily practice the present invention for which no specific experimental results are presented, and such modifications and variations are included in the attached patent. It goes without saying that they fall within the scope of the claims.
또한 이하에서 제시되는 실험 결과는 상기 실시예 및 비교예의 대표적인 실험 결과만을 기재한 것이며, 아래에서 명시적으로 제시하지 않은 본 발명의 여러 구현예의 각각의 효과는 해당 부분에서 구체적으로 기재하도록 한다In addition, the experimental results presented below describe only the representative experimental results of the Examples and Comparative Examples, and the effects of each of the various embodiments of the present invention that are not explicitly presented below will be described in detail in the corresponding part.
실시예 1. 종양 특이적 항암제 전구체 나노입자(FRRG-DOX)(약물복합체) 합성Example 1. Synthesis of tumor-specific anticancer drug precursor nanoparticles (FRRG-DOX) (drug complex)
1) 실험재료1) Experimental materials
Trt-Cl 수지와 모든 Fmoc 아미노산은 GL Biochem(Shanghai, China)로부터 구입하였다. 커플링 시약(coupling reagent)과 cleavage cocktail 시약은 Sigma Aldrich에서 구입하였으며, 이외 다른 용매들은 대정 화학(Daejung Chemical, Korea)에서 구입하였다.Trt-Cl resin and all Fmoc amino acids were purchased from GL Biochem (Shanghai, China). Coupling reagent and cleavage cocktail reagent were purchased from Sigma Aldrich, and other solvents were purchased from Daejung Chemical, Korea.
2) 양친매성 펩타이드(FRRG) 합성2) Amphiphilic peptide (FRRG) synthesis
각 펩타이드는 일방적인 Fmoc SPPS(고상 펩타이드 합성; Solid phase peptide synthesis)에 따라 합성하였고, 이때 ASP48S(Peptron, Inc., Korea)의 펩티드 합성기를 이용하여 합성하고자 하는 아미노산 서열(FRRG(서열번호 1))을 합성하였다. 합성과정에서 표준 아미노산 보호기(fmoc)를 사용하였다.Each peptide was synthesized according to unilateral Fmoc SPPS (solid phase peptide synthesis), and at this time, the amino acid sequence to be synthesized (FRRG (SEQ ID NO: 1) using the peptide synthesizer of ASP48S (Peptron, Inc., Korea)) ) was synthesized. A standard amino acid protecting group (fmoc) was used in the synthesis process.
구체적으로 상기 Fmoc 보호기를 제거하기 위하여, 10 분 동안 2차례에 걸쳐 20% piperidine를 포함하는 DMF로 rocking하였고, DMF 용매 하에서, Fmoc 아미노산(8 eq), HOBT(8 eq), HBTU(8 eq), DIPEA(16 eq)를 사용하여 2 시간 동안 커플링(coupling)을 수행하였다. 각 단계에서 레진을 DMF와 메탄올로 2 차례에 걸쳐 세척한다.Specifically, in order to remove the Fmoc protecting group, rocking was performed with DMF containing 20% piperidine twice for 10 minutes, and in a DMF solvent, Fmoc amino acids (8 eq), HOBT (8 eq), HBTU (8 eq) , DIPEA (16 eq) was used for coupling (coupling) for 2 hours. In each step, the resin is washed twice with DMF and methanol.
설계된 시퀀스의 펩타이드가 완성된 후, crude 펩타이드를 레진으로부터 분리하기 위하여, TFA/EDT/Thioanisole/TIS/DW 용액(90/2.5/2.5/2.5/2.5 Volume)으로 2 시간동안 반응시켰다. 상기 용액을 차가운 에테르(Ether)로 침전시키고, 원심분리하여 펠렛(pellet)을 분리하였다. 이를 증발 과정을 통해 분말형태로 수득하였다.After the peptide of the designed sequence was completed, in order to isolate the crude peptide from the resin, it was reacted with TFA/EDT/Thioanisole/TIS/DW solution (90/2.5/2.5/2.5/2.5 Volume) for 2 hours. The solution was precipitated with cold ether and centrifuged to separate pellets. This was obtained in the form of a powder through the evaporation process.
상기 수득한 crude 펩타이드를 증류수에 용해하고, Vydac Everest C18 컬럼(250 ㎜×22 ㎜, 10 ㎛, USA)를 사용한 역상 HPLC(Shimadzu prominence HPLC, Japan)으로 정제하였다. 이때 용리(elution)는 0.1%(v/v) 트리플루오로아세트산(trifluoroacetic acid)를 함유하는 물-아세토니트릴 선형 구배 용리액(water-acetonitrile linear gradient)(10~75%(v/v) of acetonitrile)으로 수행하였다. 정제한 펩타이드의 분자량(molercular weights)은 LC/MS(Shimadzu LC/MS-2020 series, Japan)을 사용하여 확인하였고, FDT12012(Operon, Korea)을 사용하여 동결건조하였다.The obtained crude peptide was dissolved in distilled water, and purified by reverse-phase HPLC (Shimadzu prominence HPLC, Japan) using a Vydac Everest C18 column (250 mm×22 mm, 10 μm, USA). At this time, the elution is a water-acetonitrile linear gradient containing 0.1% (v/v) trifluoroacetic acid (10-75% (v/v) of acetonitrile). ) was performed. The molecular weights of the purified peptides were confirmed using LC/MS (Shimadzu LC/MS-2020 series, Japan), and freeze-dried using FDT12012 (Operon, Korea).
3) FRRG-DOX 약물복합체 합성3) Synthesis of FRRG-DOX drug complex
상기 단계를 통해 제조된 FRRG의 양친매성 펩타이드를 각각 물에 녹이고, 독소루비신(doxorubicin)을 첨가한 후, 상온에서 24 시간동안 교반하였다. 얻어진 펩타이드를 역상 HPLC(물-아세토나이트릴, 0.1% TFA)로 정제하였다. Each of the amphiphilic peptides of FRRG prepared through the above steps was dissolved in water, and doxorubicin was added thereto, followed by stirring at room temperature for 24 hours. The obtained peptide was purified by reverse-phase HPLC (water-acetonitrile, 0.1% TFA).
독소루비신(doxorubicin), FRRG 펩타이드 및 이들이 결합하여 형성된 약물복합체(FRRG-DOX)의 화학적 구조를 분석하기 위하여, DMSO-d6에 용해하고 600 MHz 1H-NMR(DD 2600 MHz FT NMR, Agilent Technologies, USA)로 특징 피크를 확인하였다. FRRG-DX와 G-DOX(FRRG-DOX로부터 절단된 펩타이드 단편)의 분자량은 MALDI(matrix-assisted laser desorption/ionization)(AB Sciex TOF/TOF 5800 System, USA)(with cyano-4-hydroycinnamic acid matrix)로 분석하였다.In order to analyze the chemical structure of doxorubicin, FRRG peptide and the drug complex (FRRG-DOX) formed by combining them, it was dissolved in DMSO-d6 and 600 MHz 1 H-NMR (DD 2600 MHz FT NMR, Agilent Technologies, USA) ) to confirm the characteristic peak. The molecular weights of FRRG-DX and G-DOX (peptide fragments cleaved from FRRG-DOX) were determined by matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI) (AB Sciex TOF/TOF 5800 System, USA) (with cyano-4-hydroycinnamic acid matrix). ) was analyzed.
실시예 2. 복강 내 투여용 조성물(FDOX)Example 2. Composition for intraperitoneal administration (FDOX)
상기 실시예 1을 통해 합성된 약물복합체(FRRG-DOX)의 생체 내 안정성을 향상시키 위하여 수용액 상에서 상기 약물복합체와 폴록사머 188(poloxamer-188, Pluronic F68)을 혼합(simple mixing)하여 제형화하였다. 상기 약물복합체는 수용액 내에서 자기조립을 통해 구형의 나노입자를 형성하나, 생체 내에서 불안정하므로 폴록사머 188을 통해 고분자 기반 나노 제형화하였다.In order to improve the in vivo stability of the drug complex (FRRG-DOX) synthesized in Example 1, the drug complex and poloxamer 188 (poloxamer-188, Pluronic F68) in an aqueous solution were mixed (simple mixing) and formulated. . The drug complex forms spherical nanoparticles through self-assembly in an aqueous solution, but is unstable in vivo, so a polymer-based nano-formulation was performed using poloxamer 188.
구체적으로 상기 FRRG-DOX 약물복합체(21 mg; 독소루비신 함량: 10.2 mg)와 폴록사머 188(9 mg)을 3차 증류수 5 ㎖에 각각 분산시킨 후, FRRG-DOX를 분산시킨 수용액에 폴록사머 188을 분산시킨 수용액을 천천히 떨어뜨린 뒤, 4시간 교반 후 동결건조하여 붉은색 분말의 제형화된 제제(FDOX)를 수득하였다. 상기 제제는 투여하기 전까지 분말상태로 보관하고, 투여 직전에 제제 30 mg(약물복합체 21 mg+폴록사머 9 mg)을 생리식염수 0.1 ㎖에 분산시켜 복강 내 투여용 조성물로 제조한 다음 사용하였다. 분명한 구분을 위해 이를 "FDOX"라고 표기하였다.Specifically, after dispersing the FRRG-DOX drug complex (21 mg; doxorubicin content: 10.2 mg) and poloxamer 188 (9 mg) in 5 ml of tertiary distilled water, respectively, poloxamer 188 was added to an aqueous solution in which FRRG-DOX was dispersed. After the dispersed aqueous solution was slowly dropped, stirred for 4 hours and then freeze-dried to obtain a red powdery formulation (FDOX). The formulation was stored in a powder state until administration, and 30 mg of the formulation (drug complex 21 mg + poloxamer 9 mg) was dispersed in 0.1 ml of physiological saline immediately before administration to prepare a composition for intraperitoneal administration and then used. It is denoted as "FDOX" for clear distinction.
실험예 1. 복강 내 투여용 조성물(FDOX)의 생체 내 약력학/약동학(PK/PD) 평가Experimental Example 1. In vivo pharmacodynamics/pharmacokinetics (PK/PD) evaluation of compositions for intraperitoneal administration (FDOX)
종양 특이적 항암제 전구체 나노입자를 복강 내 투여용 조성물(FDOX)(실시예 2)로 제형화한 후, 이에 대한 생체 내 약력학/약동학(PK/PD) 평가를 수행하고자 하였다. 우선, Nara Bio(경기도, 한국)에서 구입한 흉선 누드 마우스(6 주령, 20 - 25 g, 수컷)(Balb/c nu/nu)를 이용하여 수행하였다. 상기 실험동물은 실험 전 약 1주간 표준먹이와 물을 자유롭게 공급하였고, 25 ℃ 무균 clean room에서 사육하였다. 모두 건강한 상태에서 동물실험에 적용하였다.After the tumor-specific anticancer drug precursor nanoparticles were formulated as a composition for intraperitoneal administration (FDOX) (Example 2), an in vivo pharmacodynamic/pharmacokinetic (PK/PD) evaluation thereof was attempted. First, thymic nude mice (6 weeks old, 20 - 25 g, male) (Balb/c nu/nu) purchased from Nara Bio (Gyeonggi-do, Korea) were used. The experimental animals were supplied with standard food and water freely for about 1 week before the experiment, and were reared in a sterile clean room at 25 ℃. All were applied to animal experiments in a healthy state.
상기 실험동물에 1 × 106 개의 HeyA8 난소암 세포를 복강 내에 접종하여 난소암 동물모델을 제작하였다. 난소암 세포를 이식하고 14일이 경과한 후 실험을 진행하였다.The experimental animals were inoculated with 1 × 10 6 HeyA8 ovarian cancer cells intraperitoneally to prepare an ovarian cancer animal model. After 14 days of transplantation of ovarian cancer cells, the experiment was performed.
상기한 바와 같이 제작된 난소암 동물모델을 2개의 그룹으로 나누어 실시예 2로부터 제조된 복강 내 투여용 조성물(FDOX) 또는 독소루비신을 복강 내 투여하도록 준비하였다.The ovarian cancer animal model prepared as described above was divided into two groups, and the composition for intraperitoneal administration (FDOX) or doxorubicin prepared in Example 2 was prepared for intraperitoneal administration.
구체적으로 제1실험군은 난소암 동물모델에 실시예 2로부터 제조된 복강 내 투여용 조성물(FDOX) 20.1 mg/kg(독소루비신 기준 6.4 mg/kg)을 복강 내에 3일마다 주사하였고, 비교군은 독소루비신 6.4 mg/kg을 생리식염수 0.1 ㎖에 분신시킨 용액을 복강 내에 3일마다 주사하였다. 투여 시점부터 0, 1, 2, 3, 6, 9, 24, 48 시간 후에 동물모델로부터 각 장기(간, 폐, 심장, 비장, 신장, 장(intestine), 혈장(plasma) 및 복수(ascties))를 채취한 뒤 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)를 이용하여, 각 장기 내에 존재하는 항암제의 농도를 검출하여 도 1에 나타내었다. 도 1의 결과를 기반으로 Origin 2020 소프트웨어를 이용하여 각 장기의 Area Under(the) Curve를 산출하여 하기 표 1에 정리하였다. *<0.05, **<0.01, ***<0.001 (compared to control group given DOX)Specifically, the first experimental group was intraperitoneally injected with the composition for intraperitoneal administration (FDOX) 20.1 mg/kg (based on doxorubicin 6.4 mg/kg) prepared from Example 2 in an animal model of ovarian cancer every 3 days, and the comparative group was doxorubicin A solution of 6.4 mg/kg in 0.1 ml of physiological saline was intraperitoneally injected every 3 days. After 0, 1, 2, 3, 6, 9, 24, and 48 hours from the time of administration, each organ (liver, lung, heart, spleen, kidney, intestine), plasma and ascites (ascties) from the animal model ) was collected and then using high performance liquid chromatography (HPLC), the concentration of the anticancer agent present in each organ was detected and shown in FIG. 1 . Based on the results of FIG. 1, the Area Under(the) Curve of each organ was calculated using Origin 2020 software and summarized in Table 1 below. *<0.05, **<0.01, ***<0.001 (compared to control group given DOX)
도 1 및 표 1에 나타난 바와 같이, 실시예 2의 복강 투여용 조성물은 종래 항암제에 비해 종양세포 외에 다른 장기에 축적이 현저히 낮음을 알 수 있다(약 1.5~2배). 실시예 2의 복강 투여용 조성물은 혈액과 복수 내에 존재하고, 이외 주변 장기로는 거의 축적되지 않음을 확인하였다.As shown in Figure 1 and Table 1, it can be seen that the composition for intraperitoneal administration of Example 2 has a significantly lower accumulation in organs other than tumor cells compared to the conventional anticancer agent (about 1.5 to 2 times). It was confirmed that the composition for intraperitoneal administration of Example 2 is present in blood and ascites, and hardly accumulates in other surrounding organs.
실험예 2. 복강 내 투여용 조성물(FDOX)의 종양 축적 효율 평가Experimental Example 2. Evaluation of tumor accumulation efficiency of composition for intraperitoneal administration (FDOX)
상기 실험예 1과 동일한 방법으로 제1실험군(복강 내 투여용 조성물 20.1 mg/kg; 독소루비신 기준 6.4 mg/kg)과 비교군(독소루비신 6.4 mg/kg)을 제조하고 투여한 후, 1 시간, 3 시간, 6 시간마다 각각의 제1실험군과 비교군을 마취하고 희생시킨 다음, 배 부위 피부를 제거하고 생체 형광 분석장치(IVIS)를 이용하여 실시예 2의 복강내 투여용 조성물과 종래 독소루비신의 축적 정도를 평가하였다.The first experimental group (intraperitoneal composition 20.1 mg/kg; doxorubicin standard 6.4 mg/kg) and the comparative group (doxorubicin 6.4 mg/kg) were prepared and administered in the same manner as in Experimental Example 1, 1 hour, 3 After anesthetizing and sacrificing each of the first experimental group and the control group every 6 hours, the abdominal skin was removed and the composition for intraperitoneal administration of Example 2 and conventional doxorubicin were accumulated using a biofluorescence analyzer (IVIS). The degree was evaluated.
도 2a는 실험예 1로부터 제조된 제1실험군(복강 내 투여용 조성물)과 비교군(독소루비신)을 투여한 후, 시간에 따라 IVIS 장비로 측정하여 나타낸 이미지이고, 도 2b는 실험예 1로부터 제조된 제1실험군(복강 내 투여용 조성물)과 비교군(독소루비신)을 투여한 뒤 6 시간이 지난 후의 모습(좌측), IVIS 장비로 측정하여 나타낸 이미지(우측)이며, 도 2c는 실험예 1로부터 제조된 제1실험군(복강 내 투여용 조성물)과 비교군(독소루비신)을 투여한 6 시간이 지난 후, 각 장기(간, 폐, 비장, 신장, 심장) 및 암 조직을 적출하여 IVIS 장비로 측정하여 나타낸 이미지이다.Figure 2a is an image showing the first experimental group (composition for intraperitoneal administration) and the comparative group (doxorubicin) prepared in Experimental Example 1, measured with an IVIS device over time after administration, and Figure 2b is prepared in Experimental Example 1 The first experimental group (composition for intraperitoneal administration) and the comparative group (doxorubicin) were administered 6 hours later (left), and an image measured with IVIS equipment (right), and FIG. 2c is from Experimental Example 1. After 6 hours of administration of the prepared first experimental group (composition for intraperitoneal administration) and control group (doxorubicin), each organ (liver, lung, spleen, kidney, heart) and cancer tissue were extracted and measured with IVIS equipment is the image shown.
도 2에 나타난 바와 같이, 복강 내 난소암의 위치를 확인하기 위하여 실험예 1로부터 제조된 제1실험군(복강 내 투여용 조성물)과 비교군(독소루비신)의 배 부위 피부를 제거한 뒤, IVIS 장비를 이용해 촬영하였다. 그 결과 실험예 1로부터 제조된 제1실험군은 복강 내 투여용 조성물이 특이적으로 암 조직에 다량 축적됨을 확인하였다. 비교군의 경우, 6시간이 지나도 독소루비신이 암조직에서 전혀 확인되지 않음을 알 수 있다.As shown in FIG. 2 , after removing the skin of the belly region of the first experimental group (composition for intraperitoneal administration) and the comparative group (doxorubicin) prepared in Experimental Example 1 to confirm the location of ovarian cancer in the abdominal cavity, the IVIS equipment was removed. was filmed using As a result, in the first experimental group prepared from Experimental Example 1, it was confirmed that the composition for intraperitoneal administration was specifically accumulated in a large amount in cancer tissues. In the case of the control group, it can be seen that doxorubicin was not confirmed at all in the cancer tissue even after 6 hours.
실험예 3. 복강 내 투여용 조성물(FDOX)의 생체 내 난소암 치료 효능 평가Experimental Example 3. Evaluation of the in vivo ovarian cancer treatment efficacy of the composition for intraperitoneal administration (FDOX)
상기 실험예 1과 동일한 방법으로 난소암 동물모델을 제작하였고, 난소암 세포를 이식하고, 14일이 경과한 후 실험을 진행하였다.An animal model of ovarian cancer was prepared in the same manner as in Experimental Example 1, and ovarian cancer cells were transplanted, and the experiment was conducted after 14 days had elapsed.
난소암 동물모델을 3개의 그룹으로 나누어 실시예 2로부터 제조된 복강 내 투여용 조성물(FDOX) 또는 독소루비신을 복강 내 투여하도록 준비하였다. 제1실험군은 난소암 동물모델에 실시예 2로부터 제조된 복강 내 투여용 조성물(FDOX) 20.1 mg/kg(독소루비신 기준 6.4 mg/kg)을 생리식염수 0.1 ㎖에 분산시킨 용액을 복강 내에 3일 마다 20일 동안 주사하였고 제2실험군은 난소암 동물모델에 복강 내 투여용 조성물을 40.2 mg/kg(독소루비신 기준 12.8 mg/kg)을 생리식염수 0.1 ㎖에 분산시킨 용액을 복강 내에 3일 마다 20일 동안 주사하였고, 비교군은 독소루비신(6.4 mg/kg)을 생리식염수 0.1 ㎖에 분산시킨 용액을 복강 내에 3일 마다 20일 동안 주사하였다. 대조군(control)으로는 생리식염수 0.1 ㎖을 복강 내에 3일 마다 20일 동안 주사한 난소암 동물모델을 사용하였다.The ovarian cancer animal model was divided into three groups and the composition for intraperitoneal administration (FDOX) or doxorubicin prepared in Example 2 was prepared for intraperitoneal administration. In the first experimental group, a solution obtained by dispersing 20.1 mg/kg of the composition for intraperitoneal administration (FDOX) prepared in Example 2 (6.4 mg/kg based on doxorubicin) in 0.1 ml of physiological saline was intraperitoneally every 3 days in an ovarian cancer animal model. It was injected for 20 days, and the second experimental group was administered a solution of 40.2 mg/kg (doxorubicin standard 12.8 mg/kg) of a composition for intraperitoneal administration in an animal model of ovarian cancer dispersed in 0.1 ml of physiological saline intraperitoneally every 3 days for 20 days. In the control group, a solution of doxorubicin (6.4 mg/kg) dispersed in 0.1 ml of physiological saline was intraperitoneally injected every 3 days for 20 days. As a control, an ovarian cancer animal model in which 0.1 ml of physiological saline was injected intraperitoneally every 3 days for 20 days was used.
투여 20일이 지난 후, 실험군과 비교군의 난소암 동물모델을 안락사하여 복강 내 난소암 조직을 수득하였다. 적출한 난소암 조직은 크기와 무게를 저울로 측정하였다. 또한 각 군으로부터 얻은 난소암 조직을 파라핀 블록 및 10 ㎛ 두께의 조직 슬라이드를 만든 후, 상기 조직 슬라이드를 이용하여 헤마톡실린 및 에오신(H&E)과 Annexin V로 염색하고, 현미경으로 측정하였다.After 20 days of administration, ovarian cancer animal models of the experimental group and the control group were euthanized to obtain intraperitoneal ovarian cancer tissues. The size and weight of the extracted ovarian cancer tissues were measured with a scale. In addition, ovarian cancer tissues obtained from each group were prepared with a paraffin block and a tissue slide with a thickness of 10 μm, and then stained with hematoxylin and eosin (H&E) and Annexin V using the tissue slide, and measured under a microscope.
도 3a는 대조군, 제1실험군 및 비교군을 투여한 후, 20일째 종양 조직의 모습을 촬영한 사진이고, 이에 따르면 제1실험군 및 비교군의 종양 조직 부피가 가장 작은 것을 확인하였다. 다만 비교군의 경우 종양조직 외에 다른 장기의 색 역시 좋지 않았으나, 제1실험군은 종양조직의 부피가 작음에도 다른 장기의 빛이 건강한 선홍빛을 띄고 있음을 확인하였다.Figure 3a is a photograph of the tumor tissue on the 20th day after administration of the control group, the first experimental group, and the comparative group, and according to this, it was confirmed that the tumor tissue volume of the first experimental group and the comparative group was the smallest. However, in the case of the comparison group, the color of organs other than the tumor tissue was also not good, but it was confirmed that the light of other organs in the first experimental group had a healthy bright red color even though the volume of the tumor tissue was small.
도 3b는 대조군, 제1실험군(1xFDOX), 제2실험군(2xFDOX) 및 비교군(DOX) 투여 후, 20일째에 종양 무게를 측정한 그래프로(* p<0.01, ** p<0.001), 이에 따르면 제1실험군에서의 종양 무게가 가장 작은 것을 확인하였다. 3b is a graph showing tumor weights measured on the 20th day after administration of the control group, the first experimental group (1xFDOX), the second experimental group (2xFDOX) and the control group (DOX) (* p<0.01, ** p<0.001); According to this, it was confirmed that the tumor weight in the first experimental group was the smallest.
도 3c는 대조군, 제1실험군 및 비교군 투여 후, 20일 째 종양 조직의 조직형태학적 변화에 미치는 영향을 조사한 헤마톡실린 및 에오신(H&E)과 Annexin V 염색 결과로, 이에 따르면 제1실험군 및 비교군의 경우 종양 세포 사멸이 유의하게 유도됨을 확인하였다.Figure 3c shows the results of hematoxylin and eosin (H&E) and Annexin V staining results for examining the effect on the histomorphological change of the tumor tissue on the 20th day after administration of the control group, the first experimental group and the comparative group. According to this, the first experimental group and In the case of the control group, it was confirmed that tumor cell death was significantly induced.
실험예 4. 복강 내 투여용 조성물(FDOX)의 생체 내 독성 평가Experimental Example 4. In vivo toxicity evaluation of the composition for intraperitoneal administration (FDOX)
상기 실험예 1과 동일한 방법으로 난소암 동물모델을 제작하였고, 난소암 세포를 이식하고, 14일이 경과한 후 실험을 진행하였다.An animal model of ovarian cancer was prepared in the same manner as in Experimental Example 1, and ovarian cancer cells were transplanted, and the experiment was conducted after 14 days had elapsed.
난소암 동물모델을 2개의 그룹으로 나누어 실시예 2로부터 제조된 복강 내 투여용 조성물(FDOX) 또는 독소루비신을 복강 내 투여하도록 준비하였다. 제1실험군은 난소암 동물모델에 실시예 2로부터 제조된 복강 내 투여용 조성물(FDOX) 20.1 mg/kg(독소루비신 기준 6.4 mg/kg)을 생리식염수 0.1 ㎖에 분산시킨 용액을 복강 내에 3일 마다 20일 동안 주사하였고, 비교군은 독소루비신(6.4 mg/kg)을 생리식염수 0.1 ㎖에 분산시킨 용액을 복강 내에 3일 마다 20일 동안 주사하였다. 대조군(control)으로는 생리식염수 0.1 ㎖을 복강 내에 3일 마다 20일 동안 주사한 난소암 동물모델을 사용하였다.The ovarian cancer animal model was divided into two groups, and the composition for intraperitoneal administration (FDOX) or doxorubicin prepared in Example 2 was prepared for intraperitoneal administration. In the first experimental group, a solution in which 20.1 mg/kg of the composition for intraperitoneal administration (FDOX) prepared in Example 2 (doxorubicin standard 6.4 mg/kg) was dispersed in 0.1 ml of physiological saline was administered to the ovarian cancer animal model every 3 days. The injection was carried out for 20 days, and the control group was injected with a solution of doxorubicin (6.4 mg/kg) dispersed in 0.1 ml of physiological saline intraperitoneally every 3 days for 20 days. As a control, an animal model of ovarian cancer in which 0.1 ml of physiological saline was injected intraperitoneally every 3 days for 20 days was used.
투여 20일이 지난 후, 제1실험군과 비교군의 난소암 동물모델을 안락사하여 간 조직, 폐 조직, 비장 조직, 신장 조직, 장(intestine) 조직 및 심장 조직을 수득하였다. 적출한 각 조직의 무게를 저울로 측정하였다(도 4b). 또한 각 군으로부터 얻은 주요조직(폐 조직, 비장 조직 및 심장 조직)을 파라핀 블록 및 10 ㎛ 두께의 조직 슬라이드를 만든 후, 상기 조직 슬라이드를 이용하여 헤마톡실린 및 에오신(H&E)과 Annexin V로 염색하고, 현미경으로 측정하였다(도 4a). 또한 대조군, 제1실험군 및 비교군 제조 후, 실험 동안 각 개체의 체중을 2일 마다 측정하였다(도 4c).After 20 days of administration, animal models of ovarian cancer in the first experimental group and control group were euthanized to obtain liver tissue, lung tissue, spleen tissue, kidney tissue, intestinal tissue, and heart tissue. The weight of each extracted tissue was measured with a scale (FIG. 4b). In addition, the major tissues (lung tissue, spleen tissue, and heart tissue) obtained from each group were prepared with a paraffin block and a tissue slide with a thickness of 10 μm, and then stained with hematoxylin and eosin (H&E) and Annexin V using the tissue slide. and measured under a microscope (FIG. 4a). In addition, after preparation of the control group, the first experimental group and the comparative group, the body weight of each individual was measured every 2 days during the experiment (FIG. 4c).
생존율 평가로, 총 2주간의 실험기간 중 2일 마다 대조군, 제1실험군 및 비교군을 관찰하여, 사망한 개체와 생존한 개체를 기록하고, 이의 비율을 기록하여 평가하였다(도 4d).As a survival rate evaluation, the control group, the first experimental group, and the comparative group were observed every 2 days during the total of 2 weeks of the experiment, and the dead and surviving individuals were recorded, and the ratio thereof was recorded and evaluated (FIG. 4d).
혈액학적 분석(Blood examination)은, 대조군, 제1실험군 및 비교군 제조 후, 20일째 혈액을 채취한 다음, 전혈구검사(CBC; WBCB, LYM, HCT, MCV, MCHC, MPV, NEUT, PLT), 혈청화학검사(BUN, ALT, AST, ALP, Albumin), 혈당(glucose), 혈중 단백질(Total protein), 중성지방(TG), 콜레스테롤(cholesterol) 분석을 실시하여 이상 유무를 체크하였다.For hematological analysis (Blood examination), blood was collected on the 20th day after preparation of the control group, the first experimental group and the comparative group, and then a complete blood count (CBC; WBCB, LYM, HCT, MCV, MCHC, MPV, NEUT, PLT) , serum chemical tests (BUN, ALT, AST, ALP, Albumin), glucose, total protein, triglyceride (TG), and cholesterol were analyzed to check for abnormalities.
도 4a는 대조군, 제1실험군 및 비교군 투여 후, 20일 째 각 주요조직(폐 조직, 비장 조직 및 심장 조직)의 조직형태학적 변화에 미치는 영향을 조사한 헤마톡실린 및 에오신(H&E)과 Annexin V 염색 결과로, 이에 따르면 비교군은 폐 조직, 비장 조직 및 심장 조직에서 세포 사멸이 관찰되었다. 이에 반해 제1실험군은 폐 조직, 비장 조직 및 심장 조직에서 세포 사멸이 전혀 관찰되지 않았다.Figure 4a is hematoxylin and eosin (H&E) and Annexin examined the effect on histomorphological changes of each major tissue (lung tissue, spleen tissue and heart tissue) on the 20th day after administration of the control group, the first experimental group and the comparative group As a result of V staining, according to this, in the control group, apoptosis was observed in lung tissue, spleen tissue and heart tissue. In contrast, in the first experimental group, no apoptosis was observed in lung tissue, spleen tissue, and heart tissue.
도 4b는 대조군, 제1실험군 및 비교군 투여 후, 20일째 각 주요조직(간 조직, 폐 조직, 비장 조직, 신장 조직, 장(intestine) 조직 및 심장 조직)의 무게를 측정한 그래프로, 이에 따르면 비교군은 다른 장기조직에서 대조군보다 무게가 크게 감소하였다(특히, 간 조직과 장 조직). 반면, 제1실험군은 종양 조직을 제외한 다른 조직(간, 폐, 비장, 신장, 심장, 장)의 무게가 대조군과 차이가 없었다.Figure 4b is a graph measuring the weight of each major tissue (liver tissue, lung tissue, spleen tissue, kidney tissue, intestinal tissue, and heart tissue) on the 20th day after administration of the control group, the first experimental group, and the comparative group. According to the results, the weight of the control group was significantly reduced compared to the control group in other organ tissues (especially liver and intestinal tissues). On the other hand, in the first experimental group, the weight of other tissues (liver, lung, spleen, kidney, heart, intestine) except for the tumor tissue did not differ from the control group.
도 4c는 투여기간에 따른 대조군, 제1실험군 및 비교군의 치료 20일동안 체중을 측정한 그래프(* p<0.01, ** p<0.001)로, 비교군의 체중은 2일이 지난후부터 급격히 감소하였다. 제1실험군은 대조군과 체중 차이가 없음을 확인하였다.Figure 4c is a graph (* p<0.01, ** p <0.001) of the control group, the first experimental group, and the comparison group according to the administration period measured for 20 days of treatment, the body weight of the control group rapidly after 2 days decreased. It was confirmed that the first experimental group had no weight difference with the control group.
도 4d는 대조군, 제1실험군 및 비교군 투여 후, 투여 기간에 따른 생존율을 평가한 그래프로, 이에 따르면 비교군은 10일부터 급격하게 사망률이 증가하여, 14일째에는 생존율이 0%였다. 이에 반해 제1실험군은 대조군과 생존율에 별 차이가 없음을 확인하였다(생존율 100%). 또한 제1실험군은 기력저하, 과민반응, 소화기 부작용 등의 약물 부작용도 관찰되지 않았다.4d is a graph evaluating the survival rate according to the administration period after administration of the control group, the first experimental group and the comparative group. According to this, the comparison group rapidly increased the mortality rate from the 10th day, and the survival rate was 0% on the 14th day. On the other hand, it was confirmed that the first experimental group had no significant difference in survival rate from the control group (
도 4e는 대조군, 제1실험군 및 비교군 투여 후, 20일째 채취한 혈액으로부터 혈액검사를 측정하여 나타낸 그래프로, 이에 따르면 제1실험군은 대조군과 유사한 정도로, 특이할만한 변화는 관찰되지 않았고, 모든 수치는 참고범위 내에 존재하는 것으로 확인되었다. 다만 비교군의 경우 대조군과 비교하여 혈액학적 지표가 크게 변화한 것으로 확인되었다.4e is a graph showing the measurement of blood tests from blood collected on the 20th day after administration of the control group, the first experimental group, and the comparative group. According to this, the first experimental group was similar to the control group, no specific change was observed, and all values was confirmed to exist within the reference range. However, in the case of the control group, it was confirmed that the hematological index changed significantly compared to the control group.
실험예 5. 투여경로에 따른 복강 내 투여용 조성물(FDOX)의 효과Experimental Example 5. Effects of the composition for intraperitoneal administration (FDOX) according to the route of administration
상기 실험예 1과 동일한 방법으로 난소암 동물모델을 제작하였고, 난소암 세포를 이식하고, 14일이 경과한 후 실험을 진행하였다.An animal model of ovarian cancer was prepared in the same manner as in Experimental Example 1, and ovarian cancer cells were transplanted, and the experiment was conducted after 14 days had elapsed.
난소암 동물모델을 3개의 그룹으로 나누어 실시예 2로부터 제조된 복강 내 투여용 조성물(FDOX)을 정맥 및 복강 내 경로로 투여하도록 준비하였다. 제1실험군은 난소암 동물모델에 실시예 2로부터 제조된 복강 내 투여용 조성물 20.1 mg/kg(독소루비신 기준 6.4 mg/kg)을 복강 내에 3일 마다 20일 동안 주사하였고, 제1비교군은 복강 내 투여용 조성물(FDOX; 독소루비신 기준 6.4 mg/kg)을 정맥 투여로 3일 마다 20일 동안 투여하였다. 대조군(control)으로는 생리식염수 0.1 ㎖을 복강 내에 3일 마다 20일 동안 주사한 난소암 동물모델을 사용하였다.The ovarian cancer animal model was divided into three groups and the composition for intraperitoneal administration (FDOX) prepared in Example 2 was prepared to be administered by intravenous and intraperitoneal routes. In the first experimental group, 20.1 mg/kg of the composition for intraperitoneal administration prepared in Example 2 (doxorubicin standard 6.4 mg/kg) was injected into the ovarian cancer animal model every 3 days for 20 days, and the first comparison group was intraperitoneally The composition for internal administration (FDOX; 6.4 mg/kg based on doxorubicin) was administered by intravenous administration every 3 days for 20 days. As a control, an ovarian cancer animal model in which 0.1 ml of physiological saline was injected intraperitoneally every 3 days for 20 days was used.
투여 20일이 지난 후, 제1실험군, 제1비교군 및 대조군의 난소암 동물모델을 안락사하여 난소암 조직, 간 조직, 폐 조직, 신장 조직을 수득하였다. 적출한 각 조직의 무게를 저울로 측정하여, 평균값을 표 2에 나타내었다(표 2).After 20 days of administration, animal models of ovarian cancer in the first experimental group, first comparison group, and control group were euthanized to obtain ovarian cancer tissue, liver tissue, lung tissue, and kidney tissue. The weight of each extracted tissue was measured with a balance, and the average value is shown in Table 2 (Table 2).
(정맥)1st comparison group
(vein)
(복강)1st experimental group
(abdominal cavity)
표 2에 나타난 바와 같이, 복강 내 주사를 통해 투여되었을 때, 난소암에 대한 우수한 치료 효과를 얻을 수 있고, 다른 조직에 대한 부작용을 최소화할 수 있음을 확인하였다.As shown in Table 2, when administered through intraperitoneal injection, it was confirmed that an excellent therapeutic effect on ovarian cancer can be obtained and side effects on other tissues can be minimized.
<110> KOREA INSTITUTE OF SCIENCE AND TECHNOLOGY SAMSUNG LIFE PUBLIC WELFARE FOUNDATION <120> Composition for intraperitoneal administration for the prevention or treatment of ovarian cancer <130> HPC9632 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amphipathic peptide <400> 1 Phe Arg Arg Gly 1 <110> KOREA INSTITUTE OF SCIENCE AND TECHNOLOGY SAMSUNG LIFE PUBLIC WELFARE FOUNDATION <120> Composition for intraperitoneal administration for the prevention or treatment of ovarian cancer <130> HPC9632 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amphipathic peptide <400> 1 Phe Arg Arg Gly One
Claims (6)
상기 약학 조성물은 a) 서열번호 1로 표시되는 양친매성 펩타이드의 일 말단에 항암제가 결합된 약물복합체; b) 폴록사머; 및 c) 생리식염수;로 이루어지고,
상기 (a) 약물복합체 100 중량부에 대하여, (b) 폴록사머 40 내지 45 중량부 및 (c) 생리식염수 0.3 내지 0.6 중량부 함유하며,
상기 폴록사머는 폴록사머 188, 폴록사머 237, 폴록사머 338 및 폴록사머 407로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상이며,
상기 약학 조성물은 복강 내 주사되어 투여되며, 1회 투여시 개체의 단위 무게(kg) 기준으로 (a) 약물복합체가 1 mg 내지 1000 mg 포함되도록 투여되는 것을 특징으로 하는 난소암 예방 또는 치료를 위한 복강 내 투여용 약학 조성물.It relates to a pharmaceutical composition for intraperitoneal administration for the prevention or treatment of ovarian cancer,
The pharmaceutical composition comprises: a) a drug complex in which an anticancer agent is bound to one end of the amphiphilic peptide represented by SEQ ID NO: 1; b) poloxamers; and c) physiological saline;
Based on 100 parts by weight of the (a) drug complex, (b) 40 to 45 parts by weight of poloxamer and (c) 0.3 to 0.6 parts by weight of physiological saline,
The poloxamer is any one or more selected from the group consisting of poloxamer 188, poloxamer 237, poloxamer 338 and poloxamer 407,
The pharmaceutical composition is administered by intraperitoneal injection, and (a) the drug complex is administered so as to contain 1 mg to 1000 mg based on the unit weight (kg) of the individual when administered once for the prevention or treatment of ovarian cancer A pharmaceutical composition for intraperitoneal administration.
상기 약학 조성물은 3일 1회 투여하되, 단위 kg당 (a) 약물복합체가 40 내지 60 mg 투여되도록 포함하는 것을 특징으로 하는 난소암 예방 또는 치료를 위한 복강 내 투여용 약학 조성물.According to claim 1,
The pharmaceutical composition is administered once a day for 3 days, and (a) a pharmaceutical composition for intraperitoneal administration for the prevention or treatment of ovarian cancer, characterized in that it comprises 40 to 60 mg of the drug complex administered per kg.
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Jinseong Kim et al., Journal of Controlled Release, 2021, vol.330, pp.920-932(2020.11.02. 온라인 공개) |
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