KR102450159B1 - 담즙 내 철 의존성 세포사멸 또는 프레닐화 관련 바이오마커 및 이의 용도 - Google Patents

담즙 내 철 의존성 세포사멸 또는 프레닐화 관련 바이오마커 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 담즙 내 철 의존성 세포사멸 또는 프레닐화 관련 바이오마커를 이용한 담관암 진단용 조성물 내지 이의 용도에 대한 것이다.
본 발명의 조성물은 담즙 내 철 의존성 세포사멸 또는 프레닐화 관련 바이오마커를 검출하고 그 수준이 정상 대조군 내지 암이 아닌 다른 일반적 담관 질환 보다 낮음을 확인함으로써 담관암을 진단 내지 검출할 수 있으므로, 담관암 진단용 조성물 내지 담관암 진단을 위한 정보제공 방법에 효과적으로 사용될 수 있다.

Description

담즙 내 철 의존성 세포사멸 또는 프레닐화 관련 바이오마커 및 이의 용도 {Biomarkers related to ferroptosis or prenylation in bile and uses thereof}
본 발명은 담즙 내 철 의존성 세포사멸 또는 프레닐화 관련 바이오마커를 이용한 담관암 진단용 조성물 내지 이의 용도에 대한 것이다.
담관암(Cholangiocarcinoma, CCA)은 담관에서 발생하는 악성 종양으로 간내 및 간외 CCA(iCCA 및 eCCA)로 분류된다. CCA는 희귀한 질병이나 발병률은 지난 수십 년 동안 전 세계적으로 증가하고 있으며, 외과 수술 절제 후에도 여전히 예후가 매우 나쁘다. 그러나 조기 진단, 예후 예측 및 CCA 치료 평가를 위한 바이오 마커는 매우 제한적이다. 항원 19-9 (CA 19-9) 및 암 배아 항원(CEA)의 혈청 레벨은 CCA에서 증가하나 민감도와 특이도는 불충분하여(50-80 %), eCCA와 담관 질환(benign biliary disease)의 구분은 임상 분야에서 여전히 어려운 일이다.
CCA는 담관에서 발생하는데, 담관은 간에서 시작하여 소장까지 도달하는 일련의 관이다. CCA가 발생하면, 지방을 분해하고 음식을 소화하는데 이용되는 담즙은 항상 종양 세포와 직접 접촉하므로 종양 유래 물질이 많이 있을 수 있다. 특히, eCCA에 의한 폐쇄성 황달에서는 담관 상피에 암세포의 노출이 광범위하므로 담즙에 잠재적인 바이오 마커의 농도가 증가할 수 있다. 그리고 폐쇄성 황달 치료를 위한 담즙 배액이 확보되면 담즙은 쉽게 채취할 수 있다. 따라서 담즙은 CCA의 발병 기전 분석 및 바이오 마커 탐색에 이상적일 수 있다.
이소프레노이드(Isoprenoid) 첨가로 인한 단백 후 변형(post-translational modifications, PTM)은 단백질-단백질 상호 작용과 막 관련 단백질 수송을 촉진하기 위한 생리과정으로 알려져 있다. 프레닐화는 두 종류의 이소프레노이드인 파르네실 피로포스페이트(farnesyl pyrophosphate, FPP) 또는 게라닐게라닐 피로포스페이트(geranylgeranyl pyrophosphate, GGPP)를 카르복시말단 또는 시스테인 잔기에 공유 결합함으로써 발생한다. 이러한 동적 변형 및 조절 장애는 암 및 기타 여러 질환과도 관련이 있다. Ras, Rab 및 Rac와 같이 C-말단에 CaaX 모티프를 보유하는 단백질은 세포의 성장 조절 및 발암에 중추적인 역할을 하는 프레닐화의 기질이 될 수 있다.
한편, 철은 세포의 중요한 역할을 하고 라디칼 생성에도 관여한다. 철은 종양 발생과 진행에 기여할 수 있는 반면, 과도한 철은 간암을 포함한 철 과부하 환자에게서 암이 증가한 것처럼 활성산소(ROS) 형성 및 돌연변이 유발로 이어질 수 있다. 철 의존성 세포사멸(Ferroptosis)은 철이 유도하는 산화적 형태의 세포사멸로 시스테인을 고갈시키거나 인지질 글루타티온 퍼옥시다제(glutathione peroxidase, GPX)를 억제함으로써 유발될 수 있다. 일반적으로 시스테인은 단백질을 코딩하는 아미노산 중 가장 적으며 (1 % - 2 %) 금속 결합 부위에서 흔히 발견되며, 높은 반응성과 친핵성을 가지고 있다. 최근에는 시스테인 잔기의 산화적 변형이 세포 신호 및 조절 경로와 관련된 것이 알려져 있다. 25 개의 셀레노 시스테인(seleno-cysteine) 함유 단백질 중 하나인 GPX는 철 의존성 세포사멸의 주요 상류 조절 인자로 기질로 글루타티온을 사용하며 아릴 지질 하이드로퍼옥사이드 (allylic lipid hydroperoxides)와 알코올로 분해시킨다.
대한민국 공개특허 제10-2020-0031482호는 담도암을 진단하는 방법에 대한 것으로서, 담즙 내 글라이코콜산(GCA; glycocholic acid) 또는 타우로케노디옥시콜산(TCDCA; Taurochenodeoxycholic acid) 정도를 측정하여 담관암을 진단할 수 있는 조성물 내지 방법을 개시하고 있다. 그러나 eCCA 에서 담즙 내 PTM 및 철 의존성 세포사멸의 효과는 개시된 바가 없다.
이에 본 발명자들은 암이 아닌 다른 양성 담관 질환(benign biliary disease)과 담관암을 구별하고, 담관암의 조기 진단을 위해 담즙 내 단백질의 번역 후 변형(PTM) 또는 철 의존성 세포사멸(ferroptosis)과 관련된 바이오마커를 제공하고자, GSH(reduced glutathione), 2가 철 이온(Fe2+) 또는 FNTA(farnesyl transferase/geranylgeranyl transferase type-1 subunit alpha) 의 발현 수준이 담관암 발병과 관련 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명은, 개체에서 분리된 시료에서 GSH(reduced glutathione), 2가 철 이온(Fe2+) 및 FNTA(farnesyl transferase/geranylgeranyl transferase type-1 subunit alpha) 로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 수준을 측정할 수 있는 제제를 포함하는 담관암 진단용 조성물 내지 이를 포함하는 키트를 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 개체에서 분리된 시료는 담즙(bile)인 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 담관암은 간내 담관암 또는 간외 담관암 인 것일 수 있다.
본 발명은 또한, i) 개체에서 분리된 시료에서 GSH(reduced glutathione), 2가 철 이온(Fe2+) 및 FNTA(farnesyl transferase/geranylgeranyl transferase type-1 subunit alpha) 로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 수준을 측정하는 단계; 및
ii) 대조군보다 수준이 낮으면 담관암으로 판단하는 단계;
를 포함하는 담관암 진단을 위한 정보제공 방법을 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 단계 i)의 개체에서 분리된 시료는 담즙(bile)인 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 단계 ii)의 대조군은 정상 대조군, 담관 결석환자 대조군 또는 담관 협착증환자 대조군인 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 담관암은 간내 담관암 또는 간외 담관암 인 것일 수 있다.
본 발명의 조성물은 담즙 내 철 의존성 세포사멸 또는 프레닐화와 관련된 바이오마커로서 GSH, 2가 철 이온(Fe2+) 또는 FNTA을 검출하고 그 수준이 정상 대조군 내지 암이 아닌 다른 담관 질환 보다 낮음을 확인함으로써 담관암을 진단 내지 검출할 수 있으므로, 담관암 진단용 조성물 내지 담관암 진단을 위한 정보제공 방법에 효과적으로 사용될 수 있다.
도 1은 eCCA 및 CBD 환자에서 (A) GSH 수준 및 (B) ROC 분석 결과(Ir.eta=0.432; Sens: 96.4%; Spec: 52.9%; PV+:10.0%; PV-: 22.9%; Model: Disease~GSH; Optimal Cutoff value: 150; AUC: 0.784(0.628-0.939), p<0.001) 를 나타낸다. 환자는 두 그룹에 속했으며(n=18-28/그룹), 모든 데이터는 mean ± SD를 의미한다.
도 2는 eCCA 및 CBD 환자에서 (A) 과산화물 수준 및 (B) ROC 분석 결과(Ir.eta=0.519; Sens: 100.0%; Spec: 66.7%; PV+: 0.0%; PV-: 17.6%; Model: Disease~Peroxide; Optimal Cutoff value: 530; AUC: 0.794(0.63-0.957), p<0.001)를 나타낸다. 환자는 두 그룹에 속했으며(n=18-28/그룹), 모든 데이터는 mean ± SD를 의미한다.
도 3은 eCCA 및 CBD 환자에서 (A) GPX 활성 및 (B) ROC 분석 결과(Ir.eta=0.616; Sens: 75.0%; Spec: 62.5%; PV+:41.2%; PV-: 22.2%; Model: Disease~GPX; Optimal Cutoff value: -450; AUC: 0.683(0.513-0.853), p<0.001)를 나타낸다. 환자는 두 그룹에 속했으며(n=18-28/그룹), 모든 데이터는 mean ± SD를 의미한다.
도 4는 eCCA 및 CBD 환자의 (A) [Fe+2] 레벨 변화 및 (B) ROC 분석 결과(Ir.eta=0.649; Sens: 67.9%; Spec: 75.0%; PV+: 42.9%; PV-: 17.4%; Model: Disease~Iron; Optimal Cutoff value: 26; AUC: 0.766(0.621-0.91), p<0.001)를 나타낸다. 환자는 두 그룹에 속했으며(n=18-28/그룹), 모든 데이터는 mean ± SD를 의미한다.
도 5는 CBD 환자에 대한 eCCA의 (A) FNTA 농도 및 (B) ROC 분석 결과(Ir.eta=0.598; Sens: 96.3%; Spec: 71.4%; PV+: 9.1%; PV-: 13.3%; Model: Disease~FNTA; Optimal Cutoff value: 7.2; AUC: 0.852(0.714-0.989), p<0.001)를 나타낸다. 환자는 두 그룹에 속했으며(n=18-28/그룹), 모든 데이터는 mean ± SD를 의미한다.
도 6은 CBD 환자에 대한 eCCA의 (A) 단백질 PTM의 변화정도를 나타내는 벤 다이어그램이며, (B) 증가 또는 감소된 PTM 정도를 나타낸다.
도 7은 eCCA에서 (A) 446 DEG의 홀 마크 경로 및 (B) 네트워크 분석을 나타낸다.
담즙산 (bile acid)은 측쇄에 카르복실기를 가지고 있는 스테로이드 계열로 담즙산의 대사, 특히 간외 전환은 콜레스테롤 항상성을 유지 및 조절하는 데 중요한 역할을 한다. 담즙산의 주요 기능 중 하나는 시스테인 이화 작용을 조절하고 산화 손상에 대한 민감도를 조절하여 담도 폐쇄와 같은 병태 생리적 변화로 변화된 담즙산은 항산화 방어를 담당한다. 본 발명에서 LC-MS 기반 데이터에 의하면, 단백질의 PTM이 대조군과 비교하여 eCCA에서 9 배 증가하였으며, GSH 고갈, GPX 활성 억제 및 과산화물이 감소되었다. 또한 eCCA에서 철 촉매 산화를 통해 [Fe+2] 레벨이 크게 감소하였다. 또한, eCCA에서 시스테인 변형에 의한 예측된 GO 경로와 FNTA가 발견되었다. 이 결과는 시스테인이 부족하여 GSH 고갈을 유도하고 그로인해 GPX 활성 감소 및 과산화물 축적을 유발하여 철 대사의 조절 장애 및 종양 촉진 물질의 해독 부족으로 암이 진행되었음을 나타낸다.
PTM은 단백질 구조와 기능에 영향을 미친다. 산화 환원에 민감한 단백질은 이동이 가능하므로 PTM은 산화 환원 조절과 결합하여 세포 기능에 영향을 줄 수 있다. 프레닐화는 일부 RAS 계열을 포함하여 종양전구체로 많은 발암성 단백질의 활성을 변환시킨다. 더욱이, 프레닐화는 단백질의 소수성을 증가시키고 막과의 상호 작용을 촉진한다. LC/MS 데이터(도 6)은 eCCA에서 많은 종양 단백질의 변화를 조절하는 것으로 나타났다. 본 발명자는 이러한 결과가 (1) 이황화 결합 형성으로 이어지는 시스테인 산화, (2) 시스테인 의존성 금속 보조 인자 상호 작용, (3) 단백질의 구조를 변경하는 시스테인 변형 등 여러 메커니즘에서 파생되었다고 생각하였다. 프레닐화에 의한 시스테인 변형은 GSH 또는 GPX 생성을 위한 충분한 기질을 제공하지 않아, 산화제로서의 역할을 하여 단백질 구조와 기능을 바꾸어 정상적인 신호를 변화시킨다. 이는 eCCA에서 FNTA 농도가 감소하면 시스테인 변형이 시스테인-금속 상호 작용에서 비롯되었음을 시사하였다. 또한, MYC 표적, ROS 경로, VEGFR, MTORC1 및 P53을 포함한 여러 발암 경로도 포함된다. 상기 발암 경로들은 eCCA 조직에서도 알려져 있으며, 이는 eCCA 조직에서 발현되는 발암성 단백질이 담즙에서도 확인될 수 있음을 의미한다. 따라서 담즙은 혈액보다 eCCA 진단을 위한 잠재적인 바이오 마커로 유용하며 CCA의 발병 기전 분석에 좋은 바이오 유전체가 될 수 있다.
시스테인 기능의 손상은 주로 Xc-/GSH/GPX 축의 변화로 유발되며 철 대사 및 철 의존성 세포사멸과 관련이 있다. 암의 대사 변화는 종양 진행에도 중요하다. Xc- 수송체는 글루타메이트 유출로 인한 세포 내로의 시스틴(cystine) 유입을 담당하는 Na+ 의존적 시스틴/글루타메이트 항포터이고 라디칼생성은 나트륨 펌프도 억제시킨다. 아미노산 전달 시스템인 Xc- 로 시스틴은 GSH 또는 티오레독신 환원효소 1(thioredoxin reductase 1)에 의해 시스테인으로 환원되며, 이는 GSH 생합성에 사용된다. 따라서 손상된 시스테인 기능과 감소된 시스테인 흡수는 GSH의 합성을 고갈시켜 지질 과산화물의 환원을 촉매하는 GPX가 비활성화 돤다. 이 과정은 지질 ROS 축적과 철 의존성 세포사멸 (ferroptosis)로 이어진다. 본 발명에서 GPX의 활성은 감소된 시스테인 흡수로 인해 eCCA에서 매우 감소되었다.
한편, 철 의존성 세포사멸의 관련성을 조사하기 위해 [Fe+2] 및 과산화물 레벨 변화를 확인하였다. 그 결과 철 의존성 세포사멸의 주된 요소는 철 존재 하 특정 인지질 하이드로퍼옥사이드 (phospholipid hydroperoxides)의 생성이었으며, 이는 Xc-/GSH/GPX 시스템으로 생성되므로 철 의존성 세포사멸을 초래할 수 있었다. [도 2] 내지 [도 4]는 [Fe+2] 및 과산화물 레벨 감소는 Fox 분석에 의해 Fe+2 에서 Fe+3 으로 1전자 환원됨으로써 과산화물 반응에 관여한다는 것을 나타낸다.
본 발명은 eCCA에 대한 단백질 프레닐화 및 철 의존성 세포사멸의 효과를 밝히기 위한 담즙의 유용성을 밝혔다. 또한, eCCA 조직에서 볼 수 있는 몇 가지 발암 경로도 다양하게 나타내었다. 담즙은 eCCA 조직의 발암 특성을 나타내며 조기 진단을 위한 바이오 마커 역할을 할 수 있음을 시사하였고, 담관 협착과 암의 구별이 가능하고 침습적인 조직 생검을 대체할 수 있으며 양성 질환인 CBD 염증성 질환은 CCA 뿐 아니라 정상 대조군과도 다른 특성을 가지고 있었다. CCA와 정상 대조군을 비교하는 것에 비하여 담관 협착이나 결석과 같은 질환과 CCA를 구별하는 점은 임상에서 매우 중요하다. 따라서 CCA와 염증성 질환 (CBD)과의 비교는 정상 대조군과 비교하는 것보다 매우 가치가 있다.
종합적으로, FNTA는 프레닐화된 시스테인이 대조군보다 eCCA에서 유의하게 감소되었으며 GSH, 과산화물, GPX 및 철 [Fe+2]의 수준이 대조군보다 현저하게 감소되었다. 이는 eCCA 경우, 담즙에서 시스테인 변형을 통하여 GSH 고갈로 PTM, 조절 장애 철 대사 및 GPX 조절 철 의존성 세포사멸이 그 메커니즘임을 의미하며, 액체 크로마토 그래피(LC)-질량 분석(MS) 분석결과, MYC 표적, 세포사멸(apoptosis), 지방산 대사, P53 및 mTORC1을 포함한 다양한 발암 경로도 포함되어있었다.
결론적으로, 본 발명은 담즙에서 시스테인과 철 의존성 세포사멸의 산화 환원적 변형이 담도암의 메커니즘임을 제안하였고 eCCA 조직에서 볼 수 있는 PTM과 관련된 여러 단백질 및 발암 경로도 다양하게 나타냈다. 따라서 담즙은 eCCA 진단, 특히 담관 협착과 eCCA를 구별하는 바이오 마커의 역할을 할 수 있다.
이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
1. 환자, 치료 절차 및 조직 병리학적 평가
계명 대학교 동산병원 간외 담관암 (간문부 및 원위부 담관암, eCCA 그룹) 28 명 및 담도 질환인 담관 결석(CBD, 대조군) 환자 18 명 등 총 46 명의 담즙을 채취하였다. CCA의 진단은 내시경 역행 담관 췌장 조영술 (endoscopic retrograde cholangiopancreatography, ERCP) 또는 경피 간 담즙 배액 (percutaneous transhepatic biliary drainage, PTBD)에 의한 외과적 절제술 또는 바늘 생검 에서 조직 진단을 기반으로 하였다. 또한, 다른 악성 종양이 있거나 조직 생검 상 췌장암 또는 간세포 암이 있는 환자는 제외되었고 병리학적으로 입증된 eCCA 환자 28 명이 등록되었다. eCCA 환자가 전이성 병변 없이 CCA를 분리하고 일반적인 상태가 수술에 견딜 수 있을 때 치료적 외과 수술 절제를 완료하였다. 그러나 환자가 전이성 병변이 있거나 수술 적 절제술을 거부하였을 때는 화학 방사선 요법을 시행하였다. 종양 단계는 악성 종양의 미국 공동 암 위원회 (AJCC) 분류의 제 7 판에 따라 분류되었다. 본 연구는 계명 대학교 동산의료원 기관 심의위원회 (DSMC 2018-06-054)의 승인을 받았으며 인간 유래 물질의 2차 사용을 포함하였다.
2. 담즙 수집 및 준비
담관염 또는 폐쇄성 황달(CCA의 경우)을 완화하고 CBD 결석을 제거하여 담관염을 완화하기 위해 (대조군의 경우) PTBD 처치 하 두 그룹의 담즙 샘플을 수집하였다. 두 그룹 모두 담관염을 해결한 후 PTBD 시술 후 최소 3 일 후에 담즙을 채취하였다. 채취한 담즙액을 즉시 16,000 g에서 10 분 동안 4 ℃에서 원심 분리 후 상등액 (Bile)을 수득하는 단계; 각 펠릿을 냉각된 PBS (2 배)에 재 현탁 후, 16,000g, 4 ℃에서 5 분 동안 다시 고정하여 담즙 펠렛을 얻었다. 모든 실험은 Avanti J-25I (Beckman, CA, USA)로 원심 분리하고 담즙과 펠렛은 -80 ℃에서 보관하였다. 분리 후 모든 실험에 사용하였다.
3. 화학 물질 및 시약
BIOXYTEK GSH-400 및 GPx-340 키트는 Oxis Research (Portland, OR, USA)에서 구입하였다. 철 분석 키트는 BioVision research(Mipitas, CA, USA)에서 구입 하였다. Pierce™ 정량 과산화물 분석 키트 및 Bradford 분석 키트는 Thermo Sci (Waltham, Massachusett, USA)에서 구입하였다. 파네실 트랜스퍼라제/게라닐게라닐 트랜스퍼라제 1형 서브유닛 알파(FNTA) 키트는 Aviva System biology(San Diego, CA, USA)에서 구입했다. 메타인산(MPS), 메탄올 및 기타 모든 화학 물질은 Sigma(St. Louis, MO, USA )에서 구입하였다.
4. 액체 크로마토 그래피 (LC)-질량 분석 (MS) 분석
LC/MS를 기반으로 한 접근 방식을 사용하여 두 그룹 간의 담즙 차이를 조사한 다음 다 변량 통계 분석을 수행하였다. 단백질의 상대적 강도는 서울 대학교 병원 생명 연구소의 MaxQuant 전산 플랫폼(SNUH, Seoul, Republic of Korea)과 결합된 Nano-flow LC (Thermo Fisher scientific, USA)/Quadrupole-Orbitrap MS (Q Exactive Plus MS, Thermo Fisher scientific, USA) 분석으로 정량하였다.
5. 글루타티온(GSH) 분석
GSH-400 분석 키트를 사용하여 담즙의 GSH 농도를 측정하였다. 담즙은 4 ℃에서 얼음처럼 차가운 MPA 용액에 준비되었다. 용해물을 5000×g, 4 ℃에서 10 분 동안 원심분리 하였다. 투명한 상청액 (100㎕)을 GSH 측정을 위해 분리하였다. GSH/g 단백질의 mol로 표시되는 Infinite M 200 Pro 다기능 마이크로 플레이트 판독기(TECAN, CA, USA)를 이용하여 400nm에서 흡광도를 갖는 표준으로 환원된 GSH를 사용하여 보정을 수행하였다. 단백질 농도는 BSA를 표준으로 사용하여 Bradford method(Pierce, Rockford, IL, USA)에 의해 계산되었다.
6. 철-자일레놀 오렌지(Ferrous-xylenol orange, fox) 분석
과산화물 수준은 Pierce Quantitative Peroxide Assay Kit의 지질 호환 제형을 사용하여 측정되었다. 테스트할 각 담즙 샘플에 대해 담즙 90㎕와 메탄올 중 10mM TCEP(Tris [2-carboxyethyl] phosphine) 10㎕를 각 샘플 튜브에 첨가하였다. 상온에서 20 ~ 30 분 동안 각 튜브를 배양하고 각 튜브에 900㎕의 작동 시약을 첨가하고 5-10 분 동안 4 ℃, 12,000×g에서 원심분리 후, 과산화물 측정을 위하여 상층액을 분리하였다. Infinite M 200 Pro 다기능 마이크로 플레이트 판독기(TECAN, CA, USA)에서 595 nm를 사용하여 단백질 과산화물/g의 mol 로 표시하였다. 단백질 농도는 동일한 방식으로 측정되었다.
7. GP X 분석
GPX의 활성은 GPX-340 분석 키트를 사용하여 평가되었다. GPX 반응은 혼합물에 과산화물 시약 t-Bu-OOH(tert-butyl hydroperoxide)를 첨가하여 시작하였다. NADPH의 흡광도에서 GPX의 감소는 340nm에서 측정되었다. 25 ℃에서 분당 1μmol의 NADPH를 산화시키는 효소의 양을 효소 1 단위로 정의하였다. Infinite M 200 pro multifunction microplate reader(TECAN, CA, USA)에서 340 nm에서 흡광도를 갖는 표준으로 GPX Control을 사용하여 보정을 수행했는데, 이는 소비된 NADPH/min/㎖의 μmol로 표시되었다. 단백질 농도는 이전과 동일한 방식으로 수행되었다.
8. 철 분석
[Fe+2] 레벨은 철 분석 키트를 사용하여 담즙에서 [Fe+2]를 측정하여 분석되었다. 96-웰 플레이트의 웰에 50 ㎕ 담즙을 첨가한 후 분석 완충액이 있는 100 ㎕/웰로 가져왔고, 철 환원제 없이 각 담즙에 5 ㎕ 분석 완충액을 첨가하였다. 담즙을 25 ℃에서 30 분 동안 인큐베이션 후 철 표준물질과 담즙이 들어있는 각 웰에 100 ㎕의 철 프로브를 첨가하였다. 잘 섞은 후 25 ℃에서 60 분간 배양하고 빛으로부터 보호하고 Infinite M 200 pro multifunction microplate reader (TECAN, CA, USA)의 593nm에서 흡광도를 측정하였으며, 이는 단백질 [Fe+2]/㎍ 의 nmol 로 표시되었다. 단백질 농도는 이전과 동일한 방식으로 수행되었다.
9. FNTA 검출을 위한 효소 연결 면역 흡착 분석
담즙 내 FNTA의 농도는 ELISA 키트를 사용하여 측정되었다. 간단히, 100 ㎕의 담즙(1:10 희석) 및 FNTA 표준의 2 배 연속 희석을 포획 항체로 미리 코팅된 마이크로 플레이트 웰에 분배하였다. 측정을 위하여 anti-FNTA microplate의 각 웰에 담즙 100㎕를 넣고 37 ℃에서 60 분간 배양하였다. 배양 후 담즙을 제거하고 각 웰에 100㎕의 비오틴화 된 FNTA 검출기 항체를 첨가하고 다시 37 ℃에서 60 분 동안 인큐베이션 하였다. 세척 후 37 ℃에서 30 분 동안 avidin-HRP conjugate와 함께 플레이트를 인큐베이션 하였으며, 어두운 곳에서 37 ℃에서 90㎕의 TMB 기질로 15 ~ 30 분 동안 반응 후, 50㎕의 정지 용액을 각 웰에 첨가하여 반응을 정지하였다. FNTA 농도는 표준 곡선을 기반으로 계산되었다. Infinite M 200 pro multifunction microplate reader(TECAN, Mannedorf, Switzerland)에서 흡광도 550 nm에서 표준 농도 pg/㎍ 단백질로 표현되는 FNTA를 표준으로 사용하여 검정곡선(calibration curve)을 나타내었고, 단백질 농도는 이전과 동일한 방식으로 수행되었다.
10. 통계 분석
데이터 분석은 R (https://Web-R.org)을 사용하여 수행되었다. DEG의 유전자 주석 및 기능 분석은 Metascape 웹 사이트(http://metascape.org)의 "cluster Profiler"를 사용하여 수행되었다. 개별 값의 컷오프 값은 ROC(Receiver operating characteristics) 곡선을 기반으로 측정되었다. 통계 분석 결과에 대한 연속 값은 평균 ± SD로 표현되었다. 두 그룹 간의 비교를 위해 연속 변수에는 독립 t-검정을 사용하고 범주 변수에는 χ2 검정을 사용하였다. p < 0.05는 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다. LC/MS 실행에서 얻은 원시 데이터 파일은 서울대학교병원 생명의학연구소(대한민국, 서울)의 maxquant 소프트웨어를 사용하여 분석되었다. STRING 데이터베이스는 DEG 간의 잠재적인 단백질-단백질 상호 작용을 구성하기 위해 적용되었다. 또한 MCODE(Molecular Complex Detection)를 수행하여 PPI 네트워크에서 허브 클러스터를 감지하였다.
따라서, 본 발명은 개체에서 분리된 시료에서 GSH(reduced glutathione), 2가 철 이온(Fe2+) 및 FNTA(farnesyl transferase/geranylgeranyl transferase type-1 subunit alpha) 로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 수준을 측정할 수 있는 제제를 포함하는 담관암 진단용 조성물 내지 이를 포함하는 키트를 제공할 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 개체에서 분리된 시료는 담즙(bile)인 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 담관암은 간내 담관암 또는 간외 담관암 인 것일 수 있다.
상기 키트는 통상적으로 유전자, 단백질 또는 이온 수준을 검출하는데 포함될 수 있는 조성물, 용액 또는 장치로 구성될 수 있다.
본 발명은 또한, i) 개체에서 분리된 시료에서 GSH(reduced glutathione), 2가 철 이온(Fe2+) 및 FNTA(farnesyl transferase/geranylgeranyl transferase type-1 subunit alpha) 로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 수준을 측정하는 단계; 및
ii) 대조군보다 수준이 낮으면 담관암으로 판단하는 단계;
를 포함하는 담관암 진단을 위한 정보제공 방법을 제공할 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 단계 i)의 개체에서 분리된 시료는 담즙(bile)인 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 단계 ii)의 대조군은 정상 대조군, 담관 결석환자 대조군 또는 담관 협착증환자 대조군인 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 담관암은 간내 담관암 또는 간외 담관암 인 것일 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 제한되는 것으로 해석하지 않는 것은 해당 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명한 것이다.
환자의 특성
환자는 29 명의 남성과 17 명의 여성으로 구성되었다. 중간 연령은 76 세였으며 범위는 50 ~ 92 세였다. eCCA와 대조군 사이의 성별과 연령은 통계적으로 다르지 않았다(표 1). eCCA(N=28) 환자 중 15 명은 간문부 담관암(perihilar CCA) 환자이고, 13 명은 원위부 담관암(distal bil duct cancer) 환자였다. 6 명의 환자는 치료적 외과수술 절제술을 받았으며 12 명의 환자는 일시적 화학 방사선 요법 또는 보존적 치료를 받았다.
질병 CBD 결석
(N=18) 		CCA
(N=28) 		P
나이 71.8 ± 13.6 74.6 ± 9.1 0.407
성별 0.301
여성 5 (37.0%) 12 (42.9%)
남성 13 (63.0%) 16 (57.1%)
AJCC 단계 I 2
II 10
III 10
IV 6
담즙 수득 방법 PTBD 26
수술(수술 중) 2
CBD 환자에 대한 eCCA의 GSH 고갈
eCCA에서 Xc- / GSH / GPX 축 관여를 확인하기 위해 각 그룹에서 평균 GSH 수준을 정리하고, 추가 테스트로 ROC 분석을 사용하였다.
그 결과, [도 1] 에서 나타나는 바와 같이 대조군과 비교하여 eCCA군에서 GSH 수준의 현저한 감소(56.4 ± 44.5 대 208.5 ± 200.9 mol/mg 단백질, p=0.001)가 관찰되었다 (도 1A). 곡선 아래 면적(AUC)은 0.784 였으며, 최적 컷오프 값은 150 mol/mg 단백질(민감도 96.4 % 및 특이도 62.9 %) 이었다 (도 1B). 이는 GPX의 기질로 사용된 GSH가 대조군보다 eCCA군에서 충분히 합성 및 조절되지 않았음을 시사하였다.
eCCA 및 CBD 환자에서 과산화물 수준 및 GP X 활성 효과
본 발명자들은 기질인 과산화물의 감소정도를 알아보기 위해 자일레놀 오렌지(xylenol orange) 존재하 철이 산화되어 생산되는 과산화물을 검출하였다. 과산화물은 산성 pH에서 Fe2+ 를 Fe3+ 로 변환시킨다. eCCA환자는 지질과 금속이 있다면과산화효소는 이 반응을 유도함으로써 과산화물은 감소한다.
그 결과, [도 2] 및 [도 3]에서 나타나는 바와 같이 과산화물 정도는 대조군보다 eCCA군에서 더욱 감소하였으며. 평균 eCCA와 대조군에서 각각 345.3 ± 132.7 및 651.8 ± 316.2 mol/mg 단백질이었다(p=0.001, 도 2A). ROC 분석에 따르면 AUC는 0.794 였다. 최적 컷오프 값은 530 mol/mg 단백질로 민감도는 100 % 이고 특이도는 66.7 % 이다(도 2B). 또한, GPX 활성정도는 담즙에서 GPX의 tBuOOH 환원 활성과 반응하는 NADPH 산화 속도를 모니터링 함으로써 확인하였으며 기질로 tBuOOH (tert-butyl hydroperoxide)를 사용하였다. 그 결과, GPX 활성은 억제되었으며 대조군보다 eCCA군에서는 NADPH 산화를 감소시켰다. GPX의 활성은 대조군보다 eCCA군에서 보다 유의하게 감소하였다 (p=0.033). 평균, eCCA군과 대조군에서 각각 109.7 ± 1584 및 44.6 ± 1770 U/mg 단백질이었다 (도 3A). AUC는 0.683이었고 최적 컷오프 값은 -405 U/mg 단백질이고 민감도는 75.0 % 이고 특이도는 62.5 % 이었다 (도 3B). 이러한 데이터는 GSH 고갈로 인한 GPX 활성 감소 및 NADPH 산화 속도 감소가 철 대사의 조절 장애를 유발하였고 종양 촉진 물질의 해독이 불충분함으로써 암이 더욱 진행되었음을 나타낸다.
eCCA 및 CBD 환자에서 [Fe +2 ] 레벨의 비교 분석
산화 환원은 전자 전달 반응으로, 철 산화 환원 반응은 Fenton 반응을 통해 하이드록실 라디칼(OH-) 및 ROS를 생성하고 철 의존성 세포사멸 (Ferroptosis)은 철의 변화가 이 과정의 핵심이다.
[도 4]에서 나타나는 바와 같이 [Fe+2] 수준은 대조군보다 eCCA군에서 유의하게 감소하였다(p = 0.002). 평균, eCCA군과 대조군에서 각각 20.0 ± 13.1 및 33.6 ± 14.2 mol/ng 단백질이었다(도 4A). eCCA군의 [Fe+2] 수준은 대조군보다 거의 절반으로 감소하였다. ROC 분석을 통해 AUC는 0.766 이었으며 최적의 컷오프 값은 26 mol/ng 단백질이며 민감도는 67.9 %, 특이도는 76.5 % 였다(도 4B). 이는 eCCA 동안 철의 산화가 증가하는 것을 나타내었다.
CBD 환자에 대한 eCCA의 FNTA 농도 조절
시스테인은 특정 기능 또는 조절을 담당하는 프레닐화 공유 변형을 가져올 수 있다. eCCA에서 변형된 FNTA 농도는 종양 형성에 중요하며, 시스테인 변화 정도는 FNTA와 관련성이 있다.
[도 5] 에서 나타나는 바와 같이 FNTA 농도는 대조군(p=0.002)보다 eCCA군에서 약 반으로 감소하였다(도 5A). 평균, eCCA군와 대조군에서 각각 4.5 ± 2.5 및 9.8 ± 4.8 pg/ng 단백질이었다. ROC 분석에 따르면 AUC는 0.852 였으며 최적 컷오프 값은 7.2 pg/ng 단백질 (민감도 96.3 %, 특이도 71.4. %)이었다 (도 5B). 이는 담즙 내 지질 프레닐화에 의한 시스테인 변화로 인해 발생하였을 수 있으며 검증된 FNTA 농도는 eCCA군에서 유효한 바이오 마커로 제안될 수 있음을 나타낸다.
eCCA에서 DEG에 따른 PTM 및 예후 경로 및 PPI MCODE의 변화
본 발명자들은 LC/MS를 사용하여 특정 PTM을 경유하는 네트워크를 검토하였다. 전체적으로 eCCA군에서 대조군보다 많은 종류의 다른 종양 단백질이 확인되었으며, eCCA의 전체 단백질(1552) 중 up/down된 단백질은 각각 1045 와 507이었다 (도 6). 스펙트럼에서 나타낸 것처럼 프레닐화, 아세틸화, 인산화, 메틸화, 유비퀴틴화, 분해를 포함하여 두 그룹간 약 9 배의 변화가 있었다 (도 6). 또한, 그 역할은 eCCA에서 driving, shuttle (전사, 아세틸화), carrier(운송, SLC), mediator (CEA-CAM) 및 passenger 에 대한 조절자 (스캐폴드)로 분류되었다. [도 6]에서 나타나듯이 eCCA군에는 다양한 종양 단백질이 포함 되어있는 반면, 대조군에서는 뮤신 유사 단백질 및 IgG 단백질과 같은 일반적인 단백질이 확인되었다(도 6A). 동시에, DEG 간의 상호 작용은 통계적으로 증가된 용어(유전자 세트 표시), 누적 초기하 p값 및 증가 인자들을 계산하여 필터링에 사용했다. 나머지 중요한 용어는 유전자 구성원 간의 카파 통계적 유사성을 기반으로 트리로 계층적으로 클러스터링 되었다 (NCI DAVID 사이트에서 사용되는 것과 유사)(도 7A). 또한 메타 스케이프 데이터 포털을 통하여 용어 간의 관련성을 확인하기 위해 네트워크를 수행하였으며 경로와 관련된 용어가 네트워크의 중심에 있음을 확인하였다 (도 7B). 그리고 STRING 데이터 포털을 사용하여 PPI 네트워크를 수행하였다. 이러한 분석으로 MYC 표적, 세포 사멸, 지방산 대사 및 P53 경로를 포함한 여러 발암 경로가 eCCA에서 증가되었음도 확인하였다 (도 7).

Claims (8)

  1. 개체에서 분리된 담즙(bile)에서 GSH(reduced glutathione), 2가 철 이온(Fe2+) 및 FNTA(farnesyl transferase/geranylgeranyl transferase type-1 subunit alpha) 의 수준을 측정할 수 있는 제제를 모두 포함하는 담관암 진단용 조성물.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서, 상기 담관암은 간내 담관암 또는 간외 담관암 인 것을 특징으로 하는 조성물.
  4. 제1항의 조성물을 포함하는 담관암 진단용 키트.
  5. i) 개체에서 분리된 담즙(bile) 에서 GSH(reduced glutathione), 2가 철 이온(Fe2+) 및 FNTA(farnesyl transferase/geranylgeranyl transferase type-1 subunit alpha) 의 수준을 모두 측정하는 단계; 및
    ii) 대조군보다 수준이 낮으면 담관암으로 판단하는 단계;
    를 포함하는 담관암 진단을 위한 정보제공 방법.
  6. 삭제
  7. 제5항에 있어서, 상기 단계 ii)의 대조군은 정상 대조군, 담관 결석환자 대조군 또는 담관 협착증환자 대조군인 것을 특징으로 하는 정보제공 방법.
  8. 제5항에 있어서, 상기 담관암은 간내 담관암 또는 간외 담관암 인 것을 특징으로 하는 정보제공 방법.
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