KR102435727B1

KR102435727B1 - Modulator of glucose metabolism in Alzheimer's disease and screening method for the modulator

Info

Publication number: KR102435727B1
Application number: KR1020200058548A
Authority: KR
Inventors: 장근아; 김진호
Original assignee: 가천대학교 산학협력단
Priority date: 2020-05-15
Filing date: 2020-05-15
Publication date: 2022-08-23
Also published as: KR20210141195A

Abstract

본 발명은 DHED(Dehydroevodiamine) 유도체를 포함하는 뇌 내 글루코스 대사 조절제를 제공함으로써 기존에 알려지지 않은 뇌 내 글루코스 대사를 조절, 구체적으로 뇌 내 글루코스 흡수를 줄여 뇌 내 산화 스트레스를 감소시킴으로써 세포 사멸을 감소시키고 이를 통해 알츠하이머 질환의 예방 및/또는 치료할 수 있는 효과가 있고, 이를 스크리닝 하는 방법을 제공함으로써 신규한 뇌 내 글루코스 대사 조절제를 발굴할 수 있는 효과가 있다.The present invention provides an intracerebral glucose metabolism modulator comprising a DHED (Dehydroevodiamine) derivative, thereby regulating previously unknown intracerebral glucose metabolism, specifically reducing intracerebral oxidative stress by reducing intracerebral oxidative stress and reducing cell death. Through this, there is an effect of preventing and/or treating Alzheimer's disease, and by providing a screening method therefor, there is an effect of discovering a novel glucose metabolism regulator in the brain.

Description

Modulator of glucose metabolism in Alzheimer's disease and screening method for the modulator

본 발명은 DHED(Dehydroevodiamine) 유도체를 포함하는 뇌 내 글루코스 대사 조절제 및 상기 대사 조절제를 스크리닝하는 방법에 관한 것이다. The present invention relates to a brain glucose metabolism modulator comprising a DHED (Dehydroevodiamine) derivative and a method for screening the metabolic modulator.

최근 의학의 급속한 발전으로 인간의 평균수명이 늘어나고, 장노년 인구가 증가함에 따라 새로운 사회적 문제들이 부각되고 있다. 특히, 뇌졸중, 알츠하이머병 및 파킨슨병 등의 노인성 신경계 질환들은 치명적인 신경계의 기능장애로 나타나며, 현재까지는 이를 치료하기 위한 효과적인 방법이 없다.With the rapid development of medicine in recent years, the average lifespan of human beings is increasing, and as the elderly population increases, new social problems are emerging. In particular, geriatric neurological diseases such as stroke, Alzheimer's disease, and Parkinson's disease appear as fatal nervous system dysfunction, and there is no effective method for treating them until now.

특히, 노인성 신경계 질환 중 가장 흔하게 나타나고 있는 것이 알츠하이머(Alzheimer's disease, AD)이다. 알츠하이머는 치매를 일으키는 가장 흔한 퇴행성 뇌질환으로 기억력, 사고력 및 행동상의 문제를 야기하는 뇌 질환이다. 치매는 일상생활을 방해할 정도로 심각한 기억력 및 기타 지적능력의 상실을 의미하는 일반 용어로서 알츠하이머는 치매 사례의 60 내지 80%를 차지한다.In particular, Alzheimer's disease (AD) is the most common among geriatric neurological diseases. Alzheimer's is the most common degenerative brain disease that causes dementia and is a brain disease that causes problems with memory, thinking and behavior. Dementia is a general term meaning loss of memory and other intellectual abilities that is severe enough to interfere with daily life, and Alzheimer's accounts for 60 to 80% of dementia cases.

이러한 알츠하이머의 주요한 병리적 소견으로 비정상적으로 축적된 아밀로이드 베타 플라크(Amyloid beta plaque, Aβ)와 세포 내 신경원 섬유 매듭(neurofibrillary tau tangles)인 것이 알려지고, 전 세계적으로 치료제를 개발하려고 하였으나, 명확한 원인이 밝혀지지 않았고, 개발된 치료제 또한 알츠하이머의 증상 완화에 불과하고, 질병의 진행을 지연시키거나 완치시키는 것에는 미진한 상태이다. As the major pathological findings of Alzheimer's disease, abnormally accumulated amyloid beta plaques (Aβ) and intracellular neurofibrillary tau tangles are known. It has not been revealed, and the developed therapeutic agent is only for alleviating the symptoms of Alzheimer's, and it is not enough to delay the progression of the disease or cure it.

또한 알츠하이머 관련 연구로서 Aβ의 신경세포 독성의 기전을 밝히는데 연구가 집중되고 있다. Aβ와 함께 배양된 신경 세포 또는 AD 환자의 신경세포에서 전립선 아폽토시스 반응-4(Par-4), tau 단백질 키나제 1(GSK-3β, 칼세닐린 /DREAM/KChIP3 및 죽음 촉진 유전자 5(DP5)와 같은 프로 세포 사멸 유전자가 과다 발현되거나 또는 활성이 증가되는 것이 관찰되었으며, 이들의 기능을 차단시키면 Aβ에 의한 신경 사멸이 감소한다고 보고되었다(Guo, Q. et al., Nat. Med. 4:597-562, 1998; Takashima, A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:7789-7793, 1993; Jo, D.G. et al., FASEB J. 15:589-591, 2001; Imaizumi, K. et al., J. Biol. Chem. 274:7975-7981, 1999).In addition, research is focused on elucidating the mechanism of neurotoxicity of Aβ as a study related to Alzheimer's disease. Prostatic apoptotic response-4 (Par-4), tau protein kinase 1 (GSK-3β, calcenilin/DREAM/KChIP3, and death-promoting gene 5 (DP5)) in neurons cultured with Aβ or in neurons from AD patients It was observed that the same pro-apoptotic genes were overexpressed or increased in activity, and it was reported that blocking their function reduces Aβ-induced neuronal death (Guo, Q. et al., Nat. Med. 4:597). -562, 1998; Takashima, A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:7789-7793, 1993; Jo, D.G. et al., FASEB J. 15:589-591, 2001; Imaizumi, K. et al., J. Biol. Chem. 274:7975-7981, 1999).

또한 이러한 알츠하이머 질환은 뇌 내 신경 세포의 주요한 에너지원인 글루코스의 대사 수준을 변화시키는 것이 알려져 있다. 구체적으로 대뇌 피질에서 뇌 내 글루코스 주요한 트랜스포터인 GLUT1의 수준이 감소되고 이러한 알츠하이머 질환의 GLUT1의 감소에 보상적으로 GLUT2의 수준이 급격하게 증가되는 것이 알려져 있다(Szablewski L., J Alzheimers Dis. 2017;55(4):1307-1320).In addition, it is known that Alzheimer's disease changes the metabolic level of glucose, which is a major energy source of nerve cells in the brain. Specifically, it is known that the level of GLUT1, a major transporter of glucose in the brain, is decreased in the cerebral cortex, and the level of GLUT2 is rapidly increased to compensate for the decrease in GLUT1 in Alzheimer's disease (Szablewski L., J Alzheimers Dis. 2017). ;55(4):1307-1320).

또한, 대한민국 등록특허공보 제10-0203456호에서는 디하이드로에보디아민-HCl(Dehydroevodiamine-HCl, DHED-HCl)을 유효성분으로 함유하는 기억항진 및 치매 치료제에 관한 것을 개시하였고, 특히 아세틸콜린 에스터레이즈(acetylcholinesterase; AchE)의 활성을 저해함으로써 기억항진 및 치매 치료제로서 사용될 수 있음을 개시하고 있다. 또한, 본 발명자의 연구자들에 의해 확인된 바와 같이, 상기 DHED-HCl의 유도체인 카복시-디하이드로에보디아민-HCl(carboxy-dehydroevodiamine-HCl) 또한 알츠하이머 모델 마우스인 5xFAD에 투여하였을 때 치료효과가 있는 것을 확인하였다(Kang et al., Frontiers in Behavioral Neuroscience, November 2018, Vol. 12, Article 273). In addition, Republic of Korea Patent Publication No. 10-0203456 discloses a treatment for memory enhancement and dementia containing dehydroevodiamine-HCl (DHED-HCl) as an active ingredient, in particular, acetylcholine esterase ( By inhibiting the activity of acetylcholinesterase; AchE), it is disclosed that it can be used as a therapeutic agent for memory enhancement and dementia. In addition, as confirmed by the researchers of the present inventors, carboxy-dehydroevodiamine-HCl, a derivative of the DHED-HCl, also has a therapeutic effect when administered to 5xFAD, an Alzheimer's model mouse. (Kang et al., Frontiers in Behavioral Neuroscience, November 2018, Vol. 12, Article 273).

다만, 이러한 연구들에서 DHED 및 이의 유도체의 인지기능 개선의 효과는 확인하였으나, DHED의 유도체와 뇌 내 글루코스 대사의 상관관계에 대한 연구가 충분히 이루어지지 않았고, 이에 본 발명의 발명자들은 추가적인 연구를 통해 DHED 유도체가 알츠하이머 질환을 가진 뇌 내의 글루코스 대사를 조절하여 정상 수준으로 조절하여 뇌 내 글루코스 흡수를 줄여 뇌 내 산화 스트레스를 감소시킴으로써 세포 사멸을 감소시키고 이를 통해 알츠하이머 질환의 예방 및/또는 치료할 수 있는 효과가 있다는 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다. However, although the effect of improving cognitive function of DHED and its derivatives was confirmed in these studies, studies on the correlation between DHED derivatives and brain glucose metabolism were not sufficiently studied. DHED derivative regulates glucose metabolism in the brain with Alzheimer's disease to a normal level, thereby reducing intracerebral glucose uptake and reducing oxidative stress in the brain, thereby reducing cell death, thereby preventing and/or treating Alzheimer's disease It was confirmed that there is, and the present invention was completed.

본 발명은 알츠하이머 질환의 예방 또는 치료하기 위해, 뇌 내 글루코스 흡수를 줄여 뇌 내 산화 스트레스를 감소시킴으로써 세포 사멸을 감소시키는 DHED(Dehydroevodiamine) 유도체를 포함하는 뇌 내 글루코스 대사 조절제를 제공하는 것을 목적으로 한다.An object of the present invention is to provide an intracerebral glucose metabolism modulator comprising a DHED (Dehydroevodiamine) derivative that reduces apoptosis by reducing intracerebral oxidative stress by reducing intracerebral glucose uptake in order to prevent or treat Alzheimer's disease. .

또한, 상기 대사 조절제를 발굴하기 위해, DHED 유도체를 포함하는 뇌 내 글루코스 대사 조절제 스크리닝 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.In addition, an object of the present invention is to provide a method for screening a glucose metabolism modulator in the brain including a DHED derivative in order to discover the metabolic modulator.

상기한 목적을 달성하기 위하여,In order to achieve the above object,

본 발명의 일 측면에서, DHED(Dehydroevodiamine) 유도체를 포함하는 뇌 내 글루코스 대사 조절제를 제공한다. In one aspect of the present invention, there is provided a brain glucose metabolism regulator comprising a DHED (Dehydroevodiamine) derivative.

본 발명의 다른 측면에서, 알츠하이머 질환을 가진 마우스 모델에게 피검물질을 처리하는 단계;In another aspect of the present invention, processing the test material to a mouse model having Alzheimer's disease;

상기 단계의 피검물질이 처리된 알츠하이머 질환을 가진 마우스 모델의 뇌의 글루코스 대사를 측정하는 단계; 및Measuring glucose metabolism in the brain of a mouse model with Alzheimer's disease treated with the test substance of the above step; and

상기 단계의 측정 결과를 피검물질이 처리되지 않은 알츠하이머 질환을 가진 마우스 모델과 비교하여, 글루코스의 대사를 조절하는 피검물질을 선별하는 단계;를 포함하는 뇌 내 글루코스 대사 조절제 스크리닝 방법을 제공한다.Comparing the measurement result of the above step with a mouse model with Alzheimer's disease in which the test substance is not treated, selecting a test substance that regulates glucose metabolism; provides a screening method for a glucose metabolism regulator in the brain.

본 발명은 DHED(Dehydroevodiamine) 유도체를 포함하는 뇌 내 글루코스 대사 조절제를 제공함으로써 기존에 알려지지 않은 뇌 내 글루코스 대사를 조절하고, 구체적으로 뇌 내 글루코스 흡수를 줄여 뇌 내 산화 스트레스를 감소시킴으로써 세포 사멸을 감소시키고 이를 통해 알츠하이머 질환의 예방 및/또는 치료할 수 있는 효과가 있다.The present invention provides a brain glucose metabolism modulator comprising a DHED (Dehydroevodiamine) derivative, thereby regulating previously unknown intracerebral glucose metabolism, and specifically reducing intracerebral oxidative stress by reducing intracerebral oxidative stress. There is an effect that can prevent and / or treat Alzheimer's disease through this.

또한, 본 발명은 상기 DHED 유도체를 포함하는 뇌 내 글루코스 대사 조절제를 스크리닝하는 방법을 제공함으로써 신규한 뇌 내 글루코스 대사 조절제를 발굴할 수 있는 효과가 있다.In addition, the present invention has the effect of discovering a novel brain glucose metabolism regulator by providing a method for screening the brain glucose metabolism regulator containing the DHED derivative.

도 1은 대뇌 피질(cortex) 및 해마의 치상회(dentate gyrus)에서 본 발명의 DHED 발명의 DHED(Dehydroevodiamine) 유도체를 포함하는 뇌 내 글루코스 대사 조절제의 투여 여부에 따른 아밀로이드 플라크(amyloid plaque)의 변화를 확인한 도이다.
도 2는 대뇌 피질에서 본 발명의 DHED 유도체를 포함하는 뇌 내 글루코스 대사 조절제의 투여 여부에 따른 GLUT1, GLUT2, G6PD 및 HXK2 발현량을 확인한 도이다.
도 2a는 대뇌 피질에서 본 발명의 DHED 유도체를 포함하는 뇌 내 글루코스 대사 조절제의 투여 여부에 따른 GLUT1, GLUT2, G6PD 및 HXK2 발현량을 웨스턴 블랏으로 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 2b는 도 2a에서 확인되는 GLUT1의 상대적 발현량을 정량적으로 나타낸 그래프이다.
도 2c는 도 2a에서 확인되는 GLUT2의 상대적 발현량을 정량적으로 나타낸 그래프이다.
도 2d는 도 2a에서 확인되는 G6PD의 상대적 발현량을 정량적으로 나타낸 그래프이다.
도 2e는 도 2a에서 확인되는 HXK2의 상대적 발현량을 정량적으로 나타낸 그래프이다.
도 3은 대뇌 피질에서 본 발명의 DHED 유도체를 포함하는 뇌 내 글루코스 대사 조절제의 투여 여부에 따른 GLUT1, GLUT2, G6PD 및 HXK2 발현량을 확인한 도이다.
도 3a는 해마에서 본 발명의 DHED 유도체를 포함하는 뇌 내 글루코스 대사 조절제의 투여 여부에 따른 GLUT1, GLUT2, G6PD 및 HXK2 발현량을 웨스턴 블랏으로 확인한 도이다.
도 3b는 도 3a에서 확인되는 GLUT1의 상대적 발현량을 정량적으로 나타낸 그래프이다.
도 3c는 도 3a에서 확인되는 GLUT2의 상대적 발현량을 정량적으로 나타낸 그래프이다.
도 3d는 도 3a에서 확인되는 G6PD의 상대적 발현량을 정량적으로 나타낸 그래프이다.
도 3e는 도 3a에서 확인되는 HXK2의 상대적 발현량을 정량적으로 나타낸 그래프이다.
도 4는 대뇌에서 본 발명의 DHED 유도체를 포함하는 뇌 내 글루코스 대사 조절제의 투여 여부에 따른 글루코스 흡수량 변화를 확인하기 위한 [¹⁸F]FDG Micro-PET를 수행한 도이다.
도 4a는 대뇌에서 본 발명의 DHED 유도체를 포함하는 뇌 내 글루코스 대사 조절제의 투여 여부에 따른 글루코스 흡수량 변화를 확인하기 위한 [¹⁸F]FDG Micro-PET 영상 결과를 나타낸 도이다.
도 4b는 도 4a에서 확인되는 대뇌 피질 내 글루코스 흡수량을 정량적으로 나타낸 그래프이다.
도 4c는 도 4a에서 확인되는 해마 내 글루코스 흡수량을 정량적으로 나타낸 그래프이다.
도 5는 대뇌 피질에서 본 발명의 DHED 유도체를 포함하는 뇌 내 글루코스 대사 조절제의 투여 여부에 따른 SOD1 발현량을 확인한 도이다.
도 5a는 대뇌 피질에서 본 발명의 DHED 유도체를 포함하는 뇌 내 글루코스 대사 조절제의 투여 여부에 따른 SOD1 발현량을 웨스턴 블랏으로 확인한 도이다.
도 5b는 도 5a에서 확인되는 SOD1의 상대적 발현량을 정량적으로 나타낸 그래프이다.
도 6은 해마에서 본 발명의 DHED 유도체를 포함하는 뇌 내 글루코스 대사 조절제의 투여 여부에 따른 SOD1 발현량을 확인한 도이다.
도 6a는 해마에서 본 발명의 DHED 유도체를 포함하는 뇌 내 글루코스 대사 조절제의 투여 여부에 따른 SOD1 발현량을 웨스턴 블랏으로 확인한 도이다.
도 6b는 도 5a에서 확인되는 SOD1의 상대적 발현량을 정량적으로 나타낸 그래프이다.
도 7은 대뇌 피질에서 본 발명의 DHED 유도체를 포함하는 뇌 내 글루코스 대사 조절제의 투여 여부에 따른 NeuN 및 BDNF 발현량을 확인한 도이다.
도 7a는 대뇌 피질에서 본 발명의 DHED 유도체를 포함하는 뇌 내 글루코스 대사 조절제의 투여 여부에 따른 NeuN 및 BDNF 발현량을 웨스턴 블랏으로 확인한 도이다.
도 7b는 도 7a에서 확인되는 NeuN의 상대적 발현량을 정량적으로 나타낸 그래프이다.
도 7c는 도 7a에서 확인되는 BDNF의 상대적 발현량을 정량적으로 나타낸 그래프이다.
도 8은 해마에서 본 발명의 DHED 유도체를 포함하는 뇌 내 글루코스 대사 조절제의 투여 여부에 따른 NeuN 및 BDNF 발현량을 확인한 도이다.
도 8a는 해마에서 본 발명의 DHED 유도체를 포함하는 뇌 내 글루코스 대사 조절제의 투여 여부에 따른 NeuN 및 BDNF 발현량을 웨스턴 블랏으로 확인한 도이다.
도 8b는 도 8a에서 확인되는 NeuN의 상대적 발현량을 정량적으로 나타낸 그래프이다.
도 8c는 도 8a에서 확인되는 BDNF의 상대적 발현량을 정량적으로 나타낸 그래프이다.
도 9는 새로운 개체 인식 실험(Novel object recognition test)에서 WT-S, WT-DHED, 5xFAD-S 및 5xFAD-DHED의 탐사 비율(%)을 나타낸 그래프이다.
도 10은 Y-미로 실험(Y-maze test)에서 WT-S, WT-DHED, 5xFAD 및 5xFAD-DHED의 자발적 교대 정도(%)를 나타낸 그래프이다.
도 11은 수동 회피 실험(Passive avoidance test)에서 WT-S, WT-DHED, 5xFAD-S 및 5xFAD-DHED의 지연 시간(초)를 나타낸 그래프이다.1 is a cortex (cortex) and hippocampal dentate gyrus (dentate gyrus) of the present invention DHED of the present invention DHED (Dehydroevodiamine) containing the DHED (Dehydroevodiamine) derivative of the present invention, the change of amyloid plaques according to the administration of a glucose metabolism regulator in the brain is a confirmation of
2 is a diagram confirming the expression levels of GLUT1, GLUT2, G6PD and HXK2 in the cerebral cortex according to whether or not the intracerebral glucose metabolism modulator containing the DHED derivative of the present invention is administered.
Figure 2a is a diagram showing the results of confirming the expression levels of GLUT1, GLUT2, G6PD and HXK2 in the cerebral cortex according to the administration of the intracerebral glucose metabolism modulator containing the DHED derivative of the present invention by Western blot.
Figure 2b is a graph quantitatively showing the relative expression level of GLUT1 confirmed in Figure 2a.
Figure 2c is a graph quantitatively showing the relative expression level of GLUT2 confirmed in Figure 2a.
Figure 2d is a graph quantitatively showing the relative expression level of G6PD confirmed in Figure 2a.
Figure 2e is a graph quantitatively showing the relative expression level of HXK2 confirmed in Figure 2a.
3 is a diagram confirming the expression levels of GLUT1, GLUT2, G6PD and HXK2 in the cerebral cortex according to whether or not the intracerebral glucose metabolism regulator including the DHED derivative of the present invention is administered.
Figure 3a is a diagram confirming the expression levels of GLUT1, GLUT2, G6PD and HXK2 in the hippocampus according to the administration of the intracerebral glucose metabolism modulator containing the DHED derivative of the present invention by Western blot.
Figure 3b is a graph quantitatively showing the relative expression level of GLUT1 confirmed in Figure 3a.
Figure 3c is a graph quantitatively showing the relative expression level of GLUT2 confirmed in Figure 3a.
Figure 3d is a graph quantitatively showing the relative expression level of G6PD confirmed in Figure 3a.
Figure 3e is a graph quantitatively showing the relative expression level of HXK2 confirmed in Figure 3a.
FIG. 4 is a diagram illustrating [ ¹⁸ F]FDG Micro-PET for confirming changes in the amount of glucose uptake according to whether or not the intracerebral glucose metabolism regulator including the DHED derivative of the present invention is administered in the cerebrum.
Figure 4a is a diagram showing the results of [ ¹⁸ F]FDG Micro-PET imaging for confirming the change in the amount of glucose uptake according to the administration of the intracerebral glucose metabolism modulator containing the DHED derivative of the present invention in the brain.
Figure 4b is a graph quantitatively showing the amount of glucose uptake in the cerebral cortex confirmed in Figure 4a.
Figure 4c is a graph quantitatively showing the amount of glucose uptake in the hippocampus confirmed in Figure 4a.
5 is a diagram confirming the expression level of SOD1 in the cerebral cortex according to whether or not the intracerebral glucose metabolism modulator containing the DHED derivative of the present invention is administered.
Figure 5a is a diagram confirming the expression level of SOD1 in the cerebral cortex according to whether or not the intracerebral glucose metabolism regulator including the DHED derivative of the present invention is administered by Western blot.
Figure 5b is a graph quantitatively showing the relative expression level of SOD1 confirmed in Figure 5a.
6 is a diagram confirming the expression level of SOD1 in the hippocampus according to whether or not the intracerebral glucose metabolism modulator containing the DHED derivative of the present invention is administered.
Figure 6a is a diagram confirming the expression level of SOD1 in the hippocampus according to the administration of the intracerebral glucose metabolism modulator containing the DHED derivative of the present invention by Western blot.
Figure 6b is a graph quantitatively showing the relative expression level of SOD1 confirmed in Figure 5a.
7 is a diagram confirming the expression levels of NeuN and BDNF in the cerebral cortex according to whether or not the intracerebral glucose metabolism regulator including the DHED derivative of the present invention is administered.
Figure 7a is a diagram confirming the expression levels of NeuN and BDNF in the cerebral cortex according to whether or not the intracerebral glucose metabolism regulator including the DHED derivative of the present invention is administered by Western blot.
Figure 7b is a graph quantitatively showing the relative expression level of NeuN confirmed in Figure 7a.
Figure 7c is a graph quantitatively showing the relative expression level of BDNF confirmed in Figure 7a.
8 is a diagram confirming the expression levels of NeuN and BDNF in the hippocampus according to whether or not the intracerebral glucose metabolism modulator containing the DHED derivative of the present invention is administered.
Figure 8a is a diagram confirming the expression levels of NeuN and BDNF in the hippocampus according to whether or not the intracerebral glucose metabolism regulator including the DHED derivative of the present invention is administered by Western blot.
Figure 8b is a graph quantitatively showing the relative expression level of NeuN confirmed in Figure 8a.
Figure 8c is a graph quantitatively showing the relative expression level of BDNF confirmed in Figure 8a.
9 is a graph showing the exploration rates (%) of WT-S, WT-DHED, 5xFAD-S and 5xFAD-DHED in a novel object recognition test.
10 is a graph showing the degree of spontaneous alternation (%) of WT-S, WT-DHED, 5xFAD and 5xFAD-DHED in the Y-maze test.
11 is a graph showing delay times (seconds) of WT-S, WT-DHED, 5xFAD-S, and 5xFAD-DHED in a passive avoidance test.

이하에서는 본 발명을 구체적으로 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.

본 발명은 DHED(Dehydroevodiamine) 유도체를 포함하는 뇌 내 글루코스 대사 조절제에 관한 것이다.The present invention relates to an intracerebral glucose metabolism modulator comprising a DHED (Dehydroevodiamine) derivative.

본 발명에서 사용되는 용어 "DHED(Dehydroevodiamine) 유도체"는 아래의 화학식 I로 표시되는 디하이드로에보디아민(Dehydroevodiamine, 이하 DHED)의 유도체를 의미한다. The term "DHED (Dehydroevodiamine) derivative" used in the present invention refers to a derivative of dehydroevodiamine (DHED) represented by the following formula (I).

[화학식 I][Formula I]

상기 DHED는 오수유로부터 추출분리된 천연추출물이거나 또는 합성물질일 수 있다. 구체적으로 상기 오수유는 Evodia rutaecarpa Benth.로써, 콜레라균, 피부사상균의 일부 및 회충을 포함한 기생충에 대하여 실험실 조건에서(in vitro) 강한 항균활성 및 살충효과를 나타내며, 자궁수축, 혈압강하 및 체온상승 등의 효과가 있고, 습진(eczema) 또는 신경피부염(neurodematitis)의 치료에 효과가 있는 것으로 알려져 있다. 이러한 오수유로부터 추출된 상기 구조식(Ⅰ)로 표시되는 DHED는 여러 가지 생물학적 효과가 있는 것으로 보고되어 있는 바, 예를 들면 혈압강하작용[Yang H. Y. et al., Asian Pac. J. Pharmacol. 3, 191∼196(1988)], 심박수강하작용[Yang M. C. et al., Eur. J. Pharmacol. 182, 537∼542(1990)], 이온채널억제 활성[Loh S. H. et al., Br. J. Pharmacol. 106, 517∼523(1992)], 뇌혈류증진 활성[Haji. A. et al.,Nat. Prod. 57, 387∼389(1994)] 등에 효과가 있다고 알려져 있다. 또한 AChEI가 백내장, 중증근무력증 및 폐쇄성알레우수에 유효한 약물임을 밝히는 많은 임상실험이 보고된 바 있다[Millard C. B. et al., J.Neurochem. 64, 1909∼1918(1995)]. The DHED may be a natural extract extracted and separated from sewage oil or a synthetic material. Specifically, the wastewater is Evodia rutaecarpa Benth., and it exhibits strong antibacterial activity and insecticidal effect in laboratory conditions (in vitro) against cholera, a part of dermatophytes, and parasites including roundworms, uterine contraction, blood pressure lowering, body temperature rise, etc. It is known to be effective in the treatment of eczema or neurodematitis. DHED represented by the structural formula (I) extracted from such sewage oil has been reported to have various biological effects, for example, a blood pressure lowering action [Yang HY et al., Asian Pac. J. Pharmacol. 3, 191-196 (1988)], heart rate lowering action [Yang MC et al., Eur. J. Pharmacol. 182, 537-542 (1990)], ion channel inhibitory activity [Loh SH et al., Br. J. Pharmacol. 106, 517-523 (1992)], cerebral blood flow enhancing activity [Haji. A. et al., Nat. Prod. 57, 387-389 (1994)] is known to be effective. In addition, many clinical trials have been reported to reveal that AChEI is an effective drug for cataract, myasthenia gravis, and allergic obstructive [Millard CB et al., J. Neurochem. 64, 1909-1918 (1995)].

상기 오수유로부터 추출분리는 공지의 방법으로 이루어질 수 있고, 구체적으로 오수유(Evodia rutaecarpa Benth.)를 80% 메탄올로 추출한 다음, 메탄올 추출물로부터 디클로로메탄으로 다시 추출하여 분획을 수득하고, 수득한 분획을 실리카겔 크로마토그래피하여 얻은 것일 수 있다(대한민국 등록특허공보 제10-0203456호에 공보). DHED의 합성은 아래와 같은 반응식을 통해 합성되는 것일 수 있다.Extraction separation from the wastewater can be accomplished by a known method, specifically, the wastewater oil ( Evodia rutaecarpa Benth.) is extracted with 80% methanol, and then extracted again with dichloromethane from the methanol extract to obtain a fraction, and the obtained fraction is silica gel It may be obtained by chromatography (published in Korean Patent Publication No. 10-0203456). The synthesis of DHED may be synthesized through the following reaction scheme.

[반응식 1][Scheme 1]

상기 DHED 유도체는 DHED로부터 유도되는 물질들로 구체적으로 cx-DHED.HCl(Carboxy-Dehydroevodiamine.HCl) 또는 DHED.HCl(Dehydroevodiamine.HCl) 인 것일 수 있고, 구체적으로 cx-DHED.HCl(Carboxy-Dehydroevodiamine.HCl)일 수 있다. 상기 cx-DHED.HCl(Carboxy-Dehydroevodiamine.HCl)는 화학식 II, DHED.HCl(Dehydroevodiamine.HCl)는 화학식 III일 수 있다. The DHED derivative may be a substance derived from DHED, specifically cx-DHED.HCl (Carboxy-Dehydroevodiamine.HCl) or DHED.HCl (Dehydroevodiamine.HCl), and specifically cx-DHED.HCl (Carboxy-Dehydroevodiamine.HCl). .HCl). The cx-DHED.HCl (Carboxy-Dehydroevodiamine.HCl) may be represented by Formula II, and DHED.HCl (Dehydroevodiamine.HCl) may be represented by Formula III.

[화학식 II][Formula II]

[화학식 III][Formula III]

상기 cx-DHED.HCl(Carboxy-Dehydroevodiamine.HCl) 또는 DHED.HCl(Dehydroevodiamine.HCl)와 같은 DHED 유도체는 상기 화학식 I의 DHED에 비하여 용해도가 높아 생체이용율(bioavailability)이 우수한 효과가 있다. 구체적으로 종래 화학식 I의 DHED는 수용성이 낮아 약제로서 이용이 어렵고, 목적하는 혈중농도에 도달하기 어려운 문제점이 있었다. 반면 본 발명의 DHED 유도체, 특히, cx-DHED.HCl(Carboxy-Dehydroevodiamine.HCl)의 경우 DHED보다 물에 대한 용해도가 2,000배 이상 높아 생체이용율(bioavailability)이 우수하여 약제로서 이용이 용이하며, 알파 세크레타제 활성화 효과도 있어 약리효과도 보다 우수한 장점이 있다. 이러한 약리효과의 개선은 알츠하이머와 같은 뇌-혈관 장벽(Blood Brain Barrier, BBB)으로 인해 DHED 유도체의 수용성의 증가할수록 대뇌 피질이나 해마와 같이 뇌 내 목적하는 위치까지 이동이 용이해짐에 따른 것이다. The DHED derivative, such as cx-DHED.HCl (Carboxy-Dehydroevodiamine.HCl) or DHED.HCl (Dehydroevodiamine.HCl), has a higher solubility than DHED of Formula I, and thus has excellent bioavailability. Specifically, the conventional DHED of Formula I has a problem in that it is difficult to use as a drug due to low water solubility, and it is difficult to reach a desired blood concentration. On the other hand, in the case of the DHED derivative of the present invention, in particular, cx-DHED.HCl (Carboxy-Dehydroevodiamine.HCl), the solubility in water is 2,000 times higher than that of DHED, so it has excellent bioavailability and is easy to use as a drug. It also has a secretase activating effect, so it has a better pharmacological effect. The improvement of these pharmacological effects is due to the increase in the water solubility of DHED derivatives due to the blood brain barrier (BBB), such as Alzheimer's disease, as it becomes easier to move to a desired location in the brain, such as the cerebral cortex or hippocampus.

본 발명에서 사용되는 용어 "대사 조절제" 인체의 생체 대사 기작을 조절하는 물질을 의미하는 것이고, 구체적으로, 일반적으로 하나 이상의 대사 경로를 조절, 즉 조절, 촉진 또는 저해하는 작용을 하는 작용제를 지칭한다. 본 발명에서의 대사 조절제는 상기한 바와 같이 DHED 유도체를 포함하는 것으로, 구체적으로 글루코스 대사를 조절하는 대사 조절제를 의미한다. As used herein, the term "metabolic modulator" refers to a substance that modulates biological metabolic mechanisms of the human body, and specifically, generally refers to an agent that regulates one or more metabolic pathways, that is, regulates, promotes, or inhibits. . The metabolic modulator in the present invention includes a DHED derivative as described above, and specifically refers to a metabolic modulator that regulates glucose metabolism.

상기 글루코스 대사 조절제는 글루코스 대사와 관련된 글루코스 흡수, 세포 내외이동 및 세포 내 글루코스 대사를 조절하는 것일 수 있다. 구체적으로, GLUT1(Glucose transporter 1), GLUT2(Glucose transporter 2) 및 G6PD(Glucose-6-phosphate dehydrogenase)로부터 선택되는 하나 이상의 대사를 조절하는 것으로, 더욱 구체적으로 GLUT1(Glucose transporter 1) 발현의 증가, GLUT2(Glucose transporter 2) 발현의 감소 및 G6PD(Glucose-6-phosphate dehydrogenase) 발현의 감소 중 어느 하나 이상의 방식으로 글루코스 대사를 조절하는 것일 수 있다.The glucose metabolism modulator may be one that modulates glucose uptake, intracellular movement, and intracellular glucose metabolism related to glucose metabolism. Specifically, by regulating one or more metabolism selected from GLUT1 (glucose transporter 1), GLUT2 (glucose transporter 2) and G6PD (glucose-6-phosphate dehydrogenase), more specifically GLUT1 (glucose transporter 1) increase in expression, It may be to regulate glucose metabolism in any one or more ways of a decrease in GLUT2 (glucose transporter 2) expression and a decrease in G6PD (glucose-6-phosphate dehydrogenase) expression.

상기 GLUT1는 글루코스를 전달하는 세포막 수송 단백질로서 주로 태아 세포, 적혈구, 뇌에서 발현된다. GLUT1은 알츠하이머 질환에 걸린 환자의 경우, 특히 대뇌 피질 및/또는 해마에서, 정상인에 비하여 그 발현 및/또는 활성의 수준이 감소되는 것으로 알려져 있다(Szablewski L., J Alzheimers Dis. 2017;55(4):1307-1320). 그러나, 상기한 바와 같이 본 발명의 글루코스 대사 조절제를 투여할 경우 GLUT1의 발현량이 유의미하게 상승하여, 결국 감소된 GLUT1의 발현 및/또는 활성의 수준이 회복되는 것을 알 수 있다. The GLUT1 is a cell membrane transport protein that transports glucose and is mainly expressed in fetal cells, red blood cells, and brain. GLUT1 is known to have reduced levels of expression and/or activity in patients with Alzheimer's disease, particularly in the cerebral cortex and/or hippocampus, compared to normal subjects (Szablewski L., J Alzheimers Dis. 2017;55 (4) ):1307-1320). However, as described above, when the glucose metabolism modulator of the present invention is administered, the expression level of GLUT1 is significantly increased, and it can be seen that the decreased level of expression and/or activity of GLUT1 is eventually restored.

상기 GLUT2 또한 글루코스를 전달하는 세포막 수송 단백질로서 주로 간, 췌장, 장 또는 시상하부 등에서 주로 발현된다. GLUT2는 알츠하이머 질환에 걸린 환자의 경우, 특히 대뇌 피질 및/또는 해마에서, 정상인에 비하여 상기한 GLUT1의 감소에 상보적으로 그 발현 및/또는 활성의 수준이 증가하는 것으로 알려져 있다(Szablewski L., J Alzheimers Dis. 2017;55(4):1307-1320). 그러나, 상기한 바와 같이 본 발명의 글루코스 대사 조절제를 투여할 경우 GLUT2의 발현량이 유의미하게 감소하여 상승된 GLUT2의 발현 및/또는 활성의 수분이 회복되는 것을 알 수 있다.The GLUT2 is also mainly expressed in the liver, pancreas, intestine or hypothalamus as a cell membrane transport protein that delivers glucose. GLUT2 is known to increase the level of expression and/or activity in patients with Alzheimer's disease, particularly in the cerebral cortex and/or hippocampus, compared to normal subjects, which is complementary to the above-described decrease in GLUT1 (Szablewski L., J Alzheimers Dis. 2017;55(4):1307-1320). However, as described above, when the glucose metabolism modulator of the present invention is administered, it can be seen that the expression level of GLUT2 is significantly reduced, and thus the increased expression and/or activity of GLUT2 is restored.

또한, G6PD는 세포 내 단백질로서 D-글루코스-6-포스페이트(D-glucose-6-phosphate)와 NADP+를 6-phospho-D-글루코노-1,5-락톤(6-phospho-D-glucono-1,5-lactone), NADPH와 H+로 가역적 변화시킨다. 이러한 G6PD는 알츠하이머 질환에 걸린 환자의 경우, 특히 대뇌 피질 및/또는 해마에서, 정상인에 비하여 그 발현 및/또는 활성의 수준이 증가하는 것이 확인되었다. 그러나, 상기한 바와 같이 본 발명의 글루코스 대사 조절제를 투여할 경우 G6PD 발현량이 유의미하게 감소하여 상승된 G6PD의 발현 및/또는 활성의 수분이 회복되는 것을 알 수 있다.In addition, G6PD is an intracellular protein containing D-glucose-6-phosphate and NADP+ with 6-phospho-D-glucono-1,5-lactone (6-phospho-D-glucono- 1,5-lactone), NADPH and H+. It was confirmed that the level of expression and/or activity of G6PD is increased in patients with Alzheimer's disease, particularly in the cerebral cortex and/or hippocampus, compared to normal persons. However, as described above, when the glucose metabolism modulator of the present invention is administered, it can be seen that the G6PD expression level is significantly reduced, and thus the elevated G6PD expression and/or activity water is restored.

또한, HXK2(Hexokinase 2)는 글루코스를 글루코스-6-포스페이트(Glucose-6-phosphate)로 변환시키는 단백질로서 주로 근육 및 뇌에서 발현되고, 암 세포에서 발현이 증가하는 것으로 알려져 있다. In addition, HXK2 (Hexokinase 2) is a protein that converts glucose into glucose-6-phosphate, and is mainly expressed in muscle and brain, and is known to increase expression in cancer cells.

또한, 상기한 본 발명의 글루코스 대사 조절제는 뇌 내에서 작용하는 것일 수 있고, 대뇌 피질(cortex) 및 해마(hippocampus) 중 어느 하나 이상의 글루코스 대사를 조절하는 것일 수 있다. 구체적으로 실험예 2에서 확인되는 바와 같이 대뇌 피질 및 해마에서 야생형 마우스(WT)에 비하여 알츠하이머 모델 마우스(5xFAD)는 GLUT1의 발현은 감소, GLUT2 및 G6PD의 발현은 증가되는 것을 확인할 수 있다. 이러한 결과를 통해, 알츠하이머 질환에 의해 대뇌 피질에서의 글루코스 대사가 변화되는 것을 알 수 있고, 이러한 변화에 대하여 본 발명의 DHED(Dehydroevodiamine) 유도체를 포함하는 뇌 내 글루코스 대사 조절제가 투여된 마우스(5xFAD-cx-DHED)는 알츠하이머 모델 마우스(5xFAD)에 비하여, GLUT1의 발현이 증가, GLUT2 및 G6PD의 발현이 감소되어 야생형 마우스(WT) 수준으로 회복되는 것을 확인할 수 있다.In addition, the above-described glucose metabolism modulator of the present invention may act in the brain, and may regulate glucose metabolism of any one or more of the cerebral cortex and the hippocampus. Specifically, as confirmed in Experimental Example 2, the Alzheimer's model mouse (5xFAD) decreased the expression of GLUT1 and increased the expression of GLUT2 and G6PD compared to the wild-type mouse (WT) in the cerebral cortex and hippocampus. Through these results, it can be seen that the glucose metabolism in the cerebral cortex is changed by Alzheimer's disease, and for this change, the mouse (5xFAD- cx-DHED) has increased expression of GLUT1 and decreased expression of GLUT2 and G6PD, compared to Alzheimer's model mice (5xFAD), and it can be confirmed that the levels are restored to the level of wild-type mice (WT).

구체적으로, 상기 DHED 유도체는 cx-DHED.HCl(Carboxy-Dehydroevodiamine.HCl) 또는 DHED.HCl(Dehydroevodiamine.HCl)인 것일 수 있고, 더욱 구체적으로 cx-DHED.HCl(Carboxy-Dehydroevodiamine.HCl)인 것일 수 있다. Specifically, the DHED derivative may be cx-DHED.HCl (Carboxy-Dehydroevodiamine.HCl) or DHED.HCl (Dehydroevodiamine.HCl), and more specifically, cx-DHED.HCl (Carboxy-Dehydroevodiamine.HCl). can

상기 글루코스 대사 조절은 구체적으로, GLUT1, GLUT2 및 G6PD로부터 선택되는 하나 이상일 수 있고, 더욱 구체적으로, GLUT1 발현의 증가, GLUT2 발현의 감소 및 G6PD 발현의 감소로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다. Specifically, the glucose metabolism regulation may be at least one selected from GLUT1, GLUT2 and G6PD, and more specifically, may be at least one selected from an increase in GLUT1 expression, a decrease in GLUT2 expression, and a decrease in G6PD expression.

또한, 상기 글루코스 대사 조절제는 구체적으로, 뇌 내 글루코스 흡수를 줄이는 것일 수 있고, 이를 통해 뇌 내 산화 스트레스(oxidative stress)를 감소시켜 뇌 내 세포 자멸을 감소시키는 것일 수 있다. In addition, the glucose metabolism modulator may specifically reduce the absorption of glucose in the brain, thereby reducing oxidative stress in the brain, thereby reducing apoptosis in the brain.

또한, 상기 글루코스 대사 조절제는 알츠하이머 환자의 뇌 내 글루코스 대사를 조절하는 것일 수 있다. In addition, the glucose metabolism regulator may be one that regulates glucose metabolism in the brain of Alzheimer's patients.

또한, 상기 글루코스 대사 조절제는 구체적으로 대뇌 피질 및 해마 중 어느 하나 이상에 작용하는 것일 수 있다. In addition, the glucose metabolism modulator may specifically act on any one or more of the cerebral cortex and the hippocampus.

본 발명의 다른 측면은 알츠하이머 질환을 가진 마우스 모델에게 피검물질을 처리하는 단계;Another aspect of the present invention comprises the steps of treating a test material to a mouse model having Alzheimer's disease;

상기 단계의 측정 결과를 피검물질이 처리되지 않은 알츠하이머 질환을 가진 마우스 모델과 비교하여, 글루코스의 대사를 조절하는 피검물질을 선별하는 단계;를 포함하는 뇌 내 글루코스 대사 조절제 스크리닝 방법에 관한 것이다. Comparing the measurement result of the above step with a mouse model with Alzheimer's disease in which the test substance is not treated, selecting a test substance that regulates glucose metabolism; relates to a method for screening a glucose metabolism regulator in the brain.

바람직하게는, 상기 글루코스 대사를 측정하는 단계는 알츠하이머 질환을 가진 마우스 모델의 대뇌 피질 및 해마 중 어느 하나 이상의 글루코스 대사를 측정할 수 있다.Preferably, the measuring of glucose metabolism may measure glucose metabolism of any one or more of cerebral cortex and hippocampus of a mouse model with Alzheimer's disease.

구체적으로, 상기 글루코스 대사를 측정하는 단계는 GLUT1(Glucose transporter 1) 발현의 증가, GLUT2(Glucose transporter 2) 발현의 감소 및 G6PD(Glucose-6-phosphate dehydrogenase) 발현의 감소로부터 선택되는 하나 이상의 대사 조절을 측정하는 것일 수 있다.Specifically, the step of measuring the glucose metabolism is one or more metabolic regulation selected from an increase in GLUT1 (glucose transporter 1) expression, a decrease in GLUT2 (glucose transporter 2) expression, and a decrease in G6PD (glucose-6-phosphate dehydrogenase) expression. may be to measure

또한, 상기 글루코스 대사를 측정하는 단계에서 피검물질에 의한 글루코스 대사 조절은 뇌 내 글루코스 흡수를 줄이는 것일 수 있다.In addition, in the step of measuring the glucose metabolism, the control of glucose metabolism by the test substance may be to reduce the absorption of glucose in the brain.

또한, 상기 글루코스 대사를 측정하는 단계에서 피검물질에 의한 글루코스 대사 조절은 상기 피검물질에 의해 뇌 내 글루코스 흡수를 줄여 뇌 내 산화 스트레스(oxidative stress)를 감소시키는 것일 수 있다.In addition, the control of glucose metabolism by the test substance in the step of measuring the glucose metabolism may be to reduce oxidative stress in the brain by reducing the absorption of glucose in the brain by the test substance.

그 결과, 본 발명의 글루코스 대사 조절제를 통해 뇌 내 아밀로이드 플라크가 감소할 수 있고(도 1 참조), 글루코스 수송체와 관련된 GLUT1의 발현량은 증가하고, GLUT2 및 G6PD의 발현량은 감소하여(도 2 및 3 참조), 뇌 내 글루코스 대사를 조절할 수 있음을 확인할 수 있고(도 4 참조), 산화 스트레스의 간접적인 확인을 위한 SOD1의 발현량이 증가됨을 확인하고(도 5 및 6 참조), 신경세포의 변화를 위한 NeuN 및 BDNF의 발현량이 증가됨을 확인함으로써(도 7 및 8 참조), 뇌 내 산화 스트레스를 감소시켜 세포 사멸을 감소시킬 수 있음을 확인할 수 있고, 결핍된 인지 및 기억 능력을 향상시킬 수 있는 효과가 있음을 확인할 수 있다(도 9, 10 및 11 참조). 이를 통해 알츠하이머 질환의 예방 및/또는 치료할 수 있다.As a result, the amyloid plaques in the brain can be reduced through the glucose metabolism modulator of the present invention (see FIG. 1), the expression level of GLUT1 related to the glucose transporter increases, and the expression level of GLUT2 and G6PD decreases (Fig. 2 and 3), it can be confirmed that glucose metabolism can be regulated in the brain (see FIG. 4), and it is confirmed that the expression level of SOD1 for indirect confirmation of oxidative stress is increased (see FIGS. 5 and 6), and nerve cells By confirming that the expression level of NeuN and BDNF is increased for the change of (see FIGS. 7 and 8), it can be confirmed that it can reduce apoptosis by reducing oxidative stress in the brain, and it is possible to improve the deficient cognitive and memory ability. It can be confirmed that there is an effect that can be used (see FIGS. 9, 10 and 11). Through this, it is possible to prevent and/or treat Alzheimer's disease.

이하에서는 실시예 및 실험예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예 및 실험예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예 및 실험예에 의해 제한되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail through Examples and Experimental Examples. These Examples and Experimental Examples are only for explaining the present invention in more detail, and the scope of the present invention is not limited by these Examples and Experimental Examples.

<실시예 1> DHED(Dehydroevodiamine) 유도체를 포함하는 뇌 내 글루코스 대사 조절제가 투여된 마우스의 제조<Example 1> Preparation of mice administered with intracerebral glucose metabolism modulators including DHED (Dehydroevodiamine) derivatives

1-1. 실험 마우스의 준비1-1. Preparation of experimental mice

5가지의 Human APP 및 PS1 유전자(3가지 APP 유전자: Swedish mutation: K670N, M671L; Florida mutation: I716V; London mutation V717I, 두가지 PS1 유전자 M146L, L286V)를 발현하는 5xFAD 형질전환 마우스를 알츠하이머 질환 모델로서 사용하였고, 대조군으로 야생형 마우스를 사용하였다. 이들 각각 4개월령인 것을 사용하였다. 마우스의 사육은 12시간 간격으로 명/암을 조절하고, 실내온도 및 습도는 각각 상온(22±2℃), 50±10% 수준으로 유지하였으며, 물과 사료는 자유롭게 먹게 하였다(ad libitum). 모든 동물실험은 가천대학교 이길여 암 당뇨 연구원의 International Animal Care and Use Committee의 승인 하에 이루어졌다. 5xFAD transgenic mice expressing five human APP and PS1 genes (three APP genes: Swedish mutation: K670N, M671L; Florida mutation: I716V; London mutation V717I, two PS1 genes M146L, L286V) were used as Alzheimer's disease models and wild-type mice were used as controls. Each of these 4 months old was used. The breeding of mice was controlled by light/dark at intervals of 12 hours, and the room temperature and humidity were maintained at room temperature (22±2℃) and 50±10%, respectively, and water and feed were freely eaten ( ad libitum ). All animal experiments were conducted under the approval of the International Animal Care and Use Committee of the Cancer Diabetes Research Institute, Gil-Yeo Lee, Gachon University.

1-2. DHED(Dehydroevodiamine) 유도체를 포함하는 뇌 내 글루코스 대사 조절제가 투여된 마우스의 제조1-2. Preparation of mice administered with intracerebral glucose metabolism modulators including DHED (Dehydroevodiamine) derivatives

DHED(Dehydroevodiamine) 유도체로서 cx-DHED.HCl(Carboxy-Dehydroevodiamine.HCl)를 사용하였고, 상기 cx-DHED.HCl(Carboxy-Dehydroevodiamine.HCl)는 0.9% 식염수에 현탁하여 사용하였으며, 상기 실시예 1-1에서 준비한 5xFAD 형질전환 마우스에 상기 cx-DHED.HCl(Carboxy-Dehydroevodiamine.HCl) 현탁된 것을 1mg/kg의 양으로 8주간 주 5회 복강(intraperitoneal, i.p.) 투여하여 DHED 유도체를 포함하는 뇌 내 글루코스 대사 조절제가 투여된 마우스(5xFAD-cx-DHED, n=3)를 제작하였다.As a DHED (Dehydroevodiamine) derivative, cx-DHED.HCl (Carboxy-Dehydroevodiamine.HCl) was used, and the cx-DHED.HCl (Carboxy-Dehydroevodiamine.HCl) was suspended in 0.9% saline and used, in Example 1- The cx-DHED.HCl (Carboxy-Dehydroevodiamine.HCl) suspension prepared in 1 was administered intraperitoneally (intraperitoneal, i.p.) 5 times a week for 8 weeks at an amount of 1 mg/kg to the brain containing the DHED derivative. Mice (5xFAD-cx-DHED, n=3) administered with glucose metabolism modulators were prepared.

대조군으로서 0.9%의 식염수를 5xFAD-cx-DHED 마우스와 동일한 양 횟수로 투여한 야생형 마우스(WT, n=3) 및 5xFAD 형질전환 마우스(5xFAD, n=3)를 제작하였다.As a control, wild-type mice (WT, n=3) and 5xFAD transgenic mice (5xFAD, n=3) were prepared in which 0.9% saline was administered in the same amount as 5xFAD-cx-DHED mice.

<실시예 2> 대뇌 피질(cortex) 및 해마(hippocampus) 조직 준비<Example 2> Preparation of cerebral cortex (cortex) and hippocampus (hippocampus) tissue

야생형 마우스(WT), 알츠하이머 질환 모델 마우스(5xFAD) 및 DHED 유도체를 포함하는 뇌 내 글루코스 대사 조절제가 투여된 마우스(5xFAD-cx-DHED)를 Rompun 및 Zoletil로 마취(1μg/g, i.p.)하였고, 경심관류(transcardially)로 헤파린을 포함하는 차가운 식염수를 관류시켰다. 뇌는 후술되는 웨스턴 블랏을 위해 반으로 나누고 반쪽 뇌는 4% 포름알데하이드에서(4% PFA) 24시간 고정하여 파라핀으로 굳힌 후 형광 조직 염색 하였으며, 나머지 반 뇌는 급속 냉동하여 피질과 해마를 해부하였다. 해부, 급속 냉동된 피질과 해마는 웨스턴 블랏 진행을 위해 무게를 측정한 후 단백질 추출시약(RIPA buffer)을 첨가하여 추출하였다. Wild-type mice (WT), Alzheimer's disease model mice (5xFAD) and mice administered with intracerebral glucose metabolism modulators including DHED derivatives (5xFAD-cx-DHED) were anesthetized (1 μg/g, i.p.) with Rompun and Zoletil, Cold saline containing heparin was perfused transcardially. The brain was divided in half for western blot to be described later, and half of the brain was fixed in 4% formaldehyde (4% PFA) for 24 hours, fixed with paraffin, and stained with fluorescent tissue. The other half of the brain was rapidly frozen and the cortex and hippocampus were dissected. . The dissected, quick-frozen cortex and hippocampus were weighed for Western blotting, and then extracted by adding a protein extraction reagent (RIPA buffer).

<실험예 1> DHED 유도체 투여에 따른 아밀로이드 플라크(amyloid plaque) 감소 확인<Experimental Example 1> Confirmation of reduction of amyloid plaques following administration of DHED derivatives

알츠하이머 치매 동물 모델(5xFAD)에서 나타나는 아밀로이드 플라크(amyloid plaque) 및 DHED 유도체 투여에 의한 아밀로이드 플라크 감소를 확인하기 위해 야생형 마우스(WT), 알츠하이머 모델 마우스(5xFAD) 및 본 발명의 DHED 유도체를 포함하는 뇌 내 글루코스 대사 조절제가 투여된 알츠하이머 모델 마우스(5xFAD-cx-DHED) 총 3개 그룹에서 형광 조직 염색을 수행하였다. To confirm the reduction of amyloid plaques and amyloid plaques by administration of DHED derivatives and amyloid plaques in an animal model of Alzheimer's dementia (5xFAD), wild-type mice (WT), Alzheimer's model mice (5xFAD) and brains containing the DHED derivatives of the present invention Fluorescent tissue staining was performed in a total of three groups of Alzheimer's model mice (5xFAD-cx-DHED) administered with a glucose metabolism modulator.

구체적으로, 실시예 2의 파라핀으로 굳힌 조직을 마이크로톰(Microtome)으로 섹션(section)하여 슬라이드에 올린 후, 염색을 진행하였다. 아밀로이드 플라크를 검출하기 위한 티오플라빈 S(Thioflavin S) 및 신경세포 검출을 위한 NeuN(1:500)을 공동염색(Co-staining)하여 형광카메라(Nikon ECLIPSE Ts2)를 이용하여 관찰하였다. Specifically, the tissue hardened with paraffin of Example 2 was sectioned with a microtome and placed on a slide, followed by staining. Thioflavin S (Thioflavin S) for detecting amyloid plaques and NeuN (1:500) for detecting nerve cells were co-stained and observed using a fluorescence camera (Nikon ECLIPSE Ts2).

그 결과, 아밀로이드 플라크에서 발현되는 티오플라빈 S 염색은 알츠하이머 치매 동물 모델의 대뇌 피질 및 해마의 치상회(Dentate gyrus)에서 발견되었으며, 글루코스 대사 조절제가 투여된 알츠하이머 마우스(5xFAD-cx-DHED)의 대뇌 피질 및 해마의 치상회에서는 조절제가 투여되지 않은 그룹에 비해 확연한 감소를 보였다(도 1). 반면, 야생형(WT)에서는 티오플라빈 S 염색이 발현되지 않았다. 이는, 대뇌 피질 및 해마의 치상회에서 치매 유발 물질에 해당하는 아밀로이드 플라크의 발현이 DHED 유도체에 의해 억제될 수 있음을 제시한다.As a result, Thioflavin S staining expressed in amyloid plaques was found in the dentate gyrus of the cerebral cortex and hippocampus of an animal model of Alzheimer's dementia, and in Alzheimer's mice (5xFAD-cx-DHED) administered with glucose metabolism modulators. The dentate gyrus of the cerebral cortex and hippocampus showed a marked decrease compared to the group not administered with the modulator (FIG. 1). On the other hand, Thioflavin S staining was not expressed in wild type (WT). This suggests that the expression of amyloid plaques corresponding to dementia-inducing substances in the dentate gyrus of the cerebral cortex and hippocampus can be inhibited by DHED derivatives.

<실험예 2> DHED 유도체 투여에 따른 GLUT1, GLUT2, G6PD 및 HXK2 발현량 변화 확인<Experimental Example 2> Confirmation of changes in expression levels of GLUT1, GLUT2, G6PD and HXK2 according to DHED derivative administration

2-1. 대뇌 피질에서의 GLUT1, GLUT2, G6PD 및 HXK2 발현량 변화 확인2-1. Changes in GLUT1, GLUT2, G6PD and HXK2 expression levels in the cerebral cortex

대뇌 피질(cortex)에서, 글루코스 수송체와 관련된 GLUT1, GLUT2 및 G6PD의 발현량을 확인하기 위해 웨스턴 블랏을 수행하였다.In the cerebral cortex, Western blot was performed to determine the expression levels of GLUT1, GLUT2 and G6PD related to the glucose transporter.

구체적으로, 통상적인 방법에 따라, 실시예 2의 조직을 SDS-PAGE를 이용하여 분리하고, PVDF 막으로 이동시켰다. 상기 막에 GLUT1(1:1000), GLUT2(1:1000) 및 G6PD(1:1000) 단백질에 대한 1차 항체를 각각의 비율로 희석하여 첨가하였다. 여기에 HRP(horseradish peroxidase)가 결합된 2차 항체(Bio-rad, USA)를 첨가하고 반응시킨 뒤, ECL 플러스 용액(Amersham Pharmacia, Sweden)을 이용하여 단백질 밴드를 검출하였다. 검출된 밴드의 강도를 Quantity One 소프트웨어 4.6.5(BioRad, USA)를 사용하여 측정함으로써 단백질의 양을 정량하였다. 평균 발현량은 임의의 단위(arbitrary unit, AU)를 이용하여 나타내었다.Specifically, according to a conventional method, the tissue of Example 2 was separated using SDS-PAGE and transferred to a PVDF membrane. Primary antibodies against GLUT1 (1:1000), GLUT2 (1:1000) and G6PD (1:1000) proteins were diluted in respective ratios and added to the membrane. A secondary antibody (Bio-rad, USA) bound to horseradish peroxidase (HRP) was added thereto and reacted, and then the protein band was detected using ECL plus solution (Amersham Pharmacia, Sweden). The amount of protein was quantified by measuring the intensity of the detected band using Quantity One software 4.6.5 (BioRad, USA). The average expression level was expressed using an arbitrary unit (arbitrary unit, AU).

그 결과, 야생형 마우스(WT)에 비하여 알츠하이머 모델 마우스(5xFAD)는 GLUT1의 발현이 유의적으로(p<0.05) 감소(도 2b), GLUT2(p<0.001) 및 G6PD(p<0.001)의 발현은 증가되는 것으로(도 2c 및 2d), 이러한 결과를 통해 알츠하이머 질환에 의해 대뇌 피질에서의 글루코스 대사가 변화되는 것을 알 수 있었다. 이러한 변화에 대하여 본 발명의 DHED 유도체를 포함하는 뇌 내 글루코스 대사 조절제가 투여된 마우스(5xFAD-cx-DHED)는 알츠하이머 모델 마우스(5xFAD)에 비하여, GLUT1의 발현이 증가, GLUT2(p<0.001) 및 G6PD(p<0.001)의 발현이 감소되어 야생형 마우스(WT) 수준으로 회복되는 것을 확인할 수 있었다(도 2b, 2c 및 2d). 또한, 야생형 마우스(WT)의 발현량을 기준으로 알츠하이머 모델 마우스(5xFAD)는 HXK2 발현량이 유의적으로(p<0.01) 감소하였고, 본 발명의 DHED 유도체를 포함하는 뇌 내 글루코스 대사 조절제가 투여된 알츠하이머 모델 마우스(5xFAD-cx-DHED)는 HXK2의 발현량이 증가(p<0.05)됨을 확인하였다(도 2e). 이는, DHED 유도체를 포함하는 뇌 내 글루코스 대사 조절제를 투여함으로써 글루코스 수용체의 발현을 조절하여 뇌 내 글루코스 흡수를 조절하는 효과를 나타낼 수 있음을 제시한다. As a result, compared to wild-type mice (WT), Alzheimer's model mice (5xFAD) significantly (p<0.05) decreased the expression of GLUT1 (Fig. 2b), and the expression of GLUT2 (p<0.001) and G6PD (p<0.001) is increased ( FIGS. 2c and 2d ), and through these results, it was found that glucose metabolism in the cerebral cortex is changed by Alzheimer's disease. In response to these changes, mice (5xFAD-cx-DHED) administered with an intracerebral glucose metabolism modulator containing the DHED derivative of the present invention increased the expression of GLUT1, GLUT2 (p<0.001), compared to Alzheimer's model mice (5xFAD). And it was confirmed that the expression of G6PD (p<0.001) was reduced and restored to the level of wild-type mice (WT) ( FIGS. 2B , 2C and 2D ). In addition, based on the expression level of wild-type mice (WT), Alzheimer's model mice (5xFAD) significantly (p<0.01) decreased HXK2 expression levels, and intracerebral glucose metabolism modulators containing the DHED derivatives of the present invention were administered. It was confirmed that the expression level of HXK2 was increased (p<0.05) in Alzheimer's model mice (5xFAD-cx-DHED) ( FIG. 2E ). This suggests that administration of an intracerebral glucose metabolism modulator including a DHED derivative may have an effect of regulating the intracerebral glucose uptake by regulating the expression of glucose receptors.

2-2. 해마에서의 GLUT1, GLUT2, G6PD 및 HXK2 발현량 변화 확인2-2. Changes in GLUT1, GLUT2, G6PD and HXK2 expression levels in the hippocampus

해마(hippocampus)에서, 글루코스 수송체와 관련된 GLUT1, GLUT2 및 G6PD의 발현량을 확인하기 위해 웨스턴 블랏을 수행하였다. 실험 방법은 해마 조직이라는 점을 제외하고는, 실험예 2-1의 방법과 동일하게 수행하였다.In the hippocampus, Western blot was performed to confirm the expression levels of GLUT1, GLUT2 and G6PD related to the glucose transporter. The experimental method was performed in the same manner as in Experimental Example 2-1, except that the hippocampal tissue was used.

그 결과, 야생형 마우스(WT)에 비하여 알츠하이머 모델 마우스(5xFAD)는 GLUT1의 발현은 감소(도 3b), GLUT2(p<0.0001) 및 G6PD(p<0.0001)의 발현은 증가되는 것을 확인할 수 있다(도 3c 및 3d). 이러한 결과를 통해, 알츠하이머 질환에 의해 해마에서의 글루코스 대사가 변화되는 것을 알 수 있다. 이러한 변화에 대하여 본 발명의 DHED 유도체를 포함하는 뇌 내 글루코스 대사 조절제가 투여된 마우스(5xFAD-cx-DHED)는 알츠하이머 모델 마우스(5xFAD)에 비하여, GLUT1의 발현이 증가, GLUT2(p<0.0001) 및 G6PD(p<0.0001)의 발현이 감소되어 야생형 마우스(WT) 수준으로 회복되는 것을 확인할 수 있다(도 3b, 3c 및 3d) 또한, 야생형 마우스(WT)의 발현량을 기준으로 알츠하이머 모델 마우스(5xFAD)는 HXK2 발현량이 유의적으로(p<0.05) 감소하였고, 본 발명의 DHED 유도체를 포함하는 뇌 내 글루코스 대사 조절제가 투여에도 HXK2 의 발현량이 증가되지 않음을 확인할 수 있다(5xFAD-cx-DHED)(도 3e). 이는 실험예 2-1과 마찬가지로, DHED 유도체를 포함하는 뇌 내 글루코스 대사 조절제를 투여함으로써 글루코스 수용체의 발현을 조절하여 뇌 내 글루코스 흡수를 조절하는 효과를 나타낼 수 있음을 제시한다. As a result, compared to wild-type mice (WT), Alzheimer's model mice (5xFAD) decreased the expression of GLUT1 (Fig. 3b), and it was confirmed that the expression of GLUT2 (p<0.0001) and G6PD (p<0.0001) was increased ( 3c and 3d). Through these results, it can be seen that the glucose metabolism in the hippocampus is changed by Alzheimer's disease. In response to these changes, mice (5xFAD-cx-DHED) administered with an intracerebral glucose metabolism modulator containing the DHED derivative of the present invention had increased expression of GLUT1, GLUT2 (p<0.0001), compared to Alzheimer's model mice (5xFAD). And it can be confirmed that the expression of G6PD (p<0.0001) is reduced and restored to the level of the wild-type mouse (WT) (FIGS. 3b, 3c and 3d) In addition, based on the expression level of the wild-type mouse (WT), Alzheimer's model mouse ( 5xFAD) showed a significant (p<0.05) decrease in HXK2 expression, and it was confirmed that the expression level of HXK2 was not increased even when the intracerebral glucose metabolism modulator containing the DHED derivative of the present invention was administered (5xFAD-cx-DHED). ) (Fig. 3e). This suggests that, as in Experimental Example 2-1, the effect of regulating the glucose uptake in the brain by regulating the expression of glucose receptors by administering an intracerebral glucose metabolism modulator containing a DHED derivative can be obtained.

<실험예 3> DHED 유도체 투여에 따른 뇌 내 글루코스 흡수 변화 확인<Experimental Example 3> Confirmation of changes in glucose absorption in the brain according to administration of DHED derivatives

DHED 유도체 투여에 따른 뇌 내 글루코스 흡수의 변화를 확인하기 위해 양전자단층촬영(Micro-PET)을 수행하였다.Positron tomography (Micro-PET) was performed to confirm the change in glucose uptake in the brain according to the administration of the DHED derivative.

구체적으로, 야생형 마우스(WT), 알츠하이머 질환 모델 마우스(5xFAD) 및 DHED 유도체를 포함하는 뇌 내 글루코스 대사 조절제가 투여된 마우스(5xFAD-cx-DHED)를 호흡 마취(Isoflurane)하였고, 약 200uCi 농도의 [¹⁸F]FDG 추적자(tracer)를 꼬리정맥 투여하였으며 30분간 흡수(uptake)를 진행하였다. 투여 30분 후, 마우스는 양전자단층촬영 장비에서 호흡 마취 상태로 30분간 촬영을 진행하였다. 촬영이 끝난 후, 영상 결과를 얻어 PMOD 프로그램을 통해 영상 분석을 진행하였다(도 4a). Specifically, wild-type mice (WT), Alzheimer's disease model mice (5xFAD) and mice administered with intracerebral glucose metabolism modulators including DHED derivatives (5xFAD-cx-DHED) were subjected to respiratory anesthesia (Isoflurane), and at a concentration of about 200 uCi [ ¹⁸ F] FDG tracer was administered to the tail vein, and uptake was performed for 30 minutes. 30 minutes after administration, the mice were photographed for 30 minutes under respiratory anesthesia in a positron tomography device. After filming was completed, image results were obtained and image analysis was performed through the PMOD program (FIG. 4a).

그 결과, 야생형 마우스(WT)에 비하여 알츠하이머 모델 마우스(5xFAD)의 대뇌 피질 및 해마의 글루코스 흡수량이 증가하였으며(p<0.05), 이러한 결과를 통해 알츠하이머 질환에 의해 대뇌 피질 및 해마에서의 글루코스 양이 변화되는 것을 알 수 있었다. 이러한 변화에 대하여 본 발명의 DHED 유도체를 포함하는 뇌 내 글루코스 대사 조절제가 투여된 마우스(5xFAD-cx-DHED)는 알츠하이머 모델 마우스(5xFAD)에 비하여, 글루코스 흡수량이 감소되었으며(p<0.05), 알츠하이머 모델 마우스(5xFAD)에 비하여 증가하여 야생형 마우스(WT) 수준으로 회복되는 것을 확인할 수 있었다(도 4b 및 4c). 이는 실험예 2의 글루코스 수용체 발현의 변화로 뇌 내 글루코스 흡수량이 조절되는 효과가 있음을 제시한다.As a result, the amount of glucose uptake in the cerebral cortex and hippocampus of Alzheimer's model mice (5xFAD) was increased (p<0.05) compared to wild-type mice (WT), and through these results, the amount of glucose in the cerebral cortex and hippocampus due to Alzheimer's disease was increased (p<0.05). could be seen to change. In response to these changes, mice (5xFAD-cx-DHED) administered with an intracerebral glucose metabolism modulator containing the DHED derivative of the present invention had a decreased glucose absorption (p<0.05), compared to Alzheimer's model mice (5xFAD), and Alzheimer's disease It was confirmed that it was increased compared to the model mouse (5xFAD) and recovered to the level of the wild-type mouse (WT) ( FIGS. 4b and 4c ). This suggests that the change in the expression of the glucose receptor of Experimental Example 2 has the effect of regulating the amount of glucose uptake in the brain.

<실험예 4> DHED 유도체 투여에 따른 뇌 내 산화 스트레스 감소 확인<Experimental Example 4> Confirmation of reduction of oxidative stress in brain according to administration of DHED derivative

4-1. 대뇌 피질에서의 SOD1(Superoxide dismutase 1)의 발현량 확인4-1. Confirmation of expression level of SOD1 (Superoxide dismutase 1) in the cerebral cortex

대뇌 피질에서, 산화 스트레스의 간접적인 확인을 위한 초산화물 효소 SOD1(Superoxide dismutase 1)의 발현량을 확인하기 위해 웨스턴 블랏을 수행하였다. SOD1은 체내 활성산소에 의해 발생하는 산화 스트레스(oxidative stress)를 억제시켜 유해산소에 의한 해로운 영향을 억제하는데, 알츠하이머 치매 동물모델(5xFAD)에서는 SOD1이 감소되어 산화적 스트레스에 의한 뇌 내 단백질 변화 및 관련 메커니즘의 변화로 질환이 발생한다. In the cerebral cortex, Western blot was performed to determine the expression level of the superoxide enzyme SOD1 (Superoxide dismutase 1) for indirect confirmation of oxidative stress. SOD1 suppresses oxidative stress caused by free radicals in the body, thereby suppressing the harmful effects of free radicals. Diseases arise from changes in the mechanisms involved.

구체적으로, 통상적인 방법에 따라, 실시예 2의 조직을 SDS-PAGE를 이용하여 분리하고, PVDF 막으로 이동시켰다. 상기 막에 SOD1에 대한 1차 항체를 1:1000의 비율로 희석하여 첨가하였다. 여기에 HRP(horseradish peroxidase)가 결합된 2차 항체(Bio-rad, USA)를 첨가하고 반응시킨 뒤, ECL 플러스 용액(Amersham Pharmacia, Sweden)을 이용하여 단백질 밴드를 검출하였다. 검출된 밴드의 강도를 Quantity One 소프트웨어 4.6.5(BioRad, USA)를 사용하여 측정함으로써 SOD1의 양을 정량하였다. 평균 발현량은 임의의 단위(arbitrary unit, AU)를 이용하여 나타내었다.Specifically, according to a conventional method, the tissue of Example 2 was separated using SDS-PAGE and transferred to a PVDF membrane. A primary antibody against SOD1 was diluted at a ratio of 1:1000 and added to the membrane. A secondary antibody (Bio-rad, USA) bound to horseradish peroxidase (HRP) was added thereto and reacted, and then the protein band was detected using ECL plus solution (Amersham Pharmacia, Sweden). The amount of SOD1 was quantified by measuring the intensity of the detected band using Quantity One software 4.6.5 (BioRad, USA). The average expression level was expressed using an arbitrary unit (arbitrary unit, AU).

대뇌 피질 조직을 이용하여 웨스턴 블랏을 수행한 결과(도 5a), 야생형 마우스(WT)에 비하여 알츠하이머 모델 마우스(5xFAD)는 SOD1의 발현은 유의적으로 증가(p<0.05)되는 것을 확인할 수 있다(도 5b). 이러한 결과를 통해, 알츠하이머 질환에 의해 해마에서의 산화 스트레스에 대한 저항성이 약해짐을 알 수 있다. 이러한 변화에 대하여 본 발명의 DHED 유도체를 포함하는 뇌 내 글루코스 대사 조절제가 투여된 마우스(5xFAD-cx-DHED)는 알츠하이머 모델 마우스(5xFAD)에 비하여, SOD1이 유의적으로 증가하는 경향을 보였으며, 야생형 마우스(WT) 수준으로 회복되는 것을 확인할 수 있다(도 5b). 이는, DHED 유도체 투여를 통하여 알츠하이머 질환에 의한 대뇌 피질에서의 산화 스트레스를 감소시킬 수 있음을 제시한다. As a result of performing Western blot using cortical tissue (Fig. 5a), it can be seen that the expression of SOD1 is significantly increased (p<0.05) in Alzheimer's model mice (5xFAD) compared to wild-type mice (WT) (p<0.05) ( 5b). Through these results, it can be seen that the resistance to oxidative stress in the hippocampus is weakened by Alzheimer's disease. In response to these changes, mice (5xFAD-cx-DHED) administered with an intracerebral glucose metabolism modulator containing the DHED derivative of the present invention showed a significant increase in SOD1 compared to Alzheimer's model mice (5xFAD), It can be confirmed that the wild-type mouse (WT) level is restored (FIG. 5b). This suggests that oxidative stress in the cerebral cortex caused by Alzheimer's disease can be reduced through administration of a DHED derivative.

4-2. 해마에서의 SOD1 발현량 확인4-2. Confirmation of SOD1 expression level in hippocampus

해마에서, 산화 스트레스의 간접적인 확인을 위한 SOD1의 발현량을 확인하기 위해 웨스턴 블랏을 수행하였다. 실험 방법은 해마 조직이라는 점을 제외하고는, 실험예 4-1의 방법과 동일하게 수행하였다.In the hippocampus, Western blotting was performed to confirm the expression level of SOD1 for indirect confirmation of oxidative stress. The experimental method was performed in the same manner as in Experimental Example 4-1, except that the hippocampal tissue was used.

해마 조직을 이용하여 웨스턴 블랏을 수행한 결과(도 6a), 야생형 마우스(WT)에 비하여 알츠하이머 모델 마우스(5xFAD)는 SOD1의 발현은 감소되는 경향을 확인할 수 있다(도 6b). 이러한 결과를 통해, 알츠하이머 질환에 의해 해마에서의 산화 스트레스에 대한 저항성이 약해짐을 알 수 있다. 이러한 변화에 대하여 본 발명의 DHED 유도체를 포함하는 뇌 내 글루코스 대사 조절제가 투여된 마우스(5xFAD-cx-DHED)는 알츠하이머 모델 마우스(5xFAD)에 비하여, SOD1(p<0.05)가 유의적으로 증가하는 경향을 보였으며, 야생형 마우스(WT) 수준으로 회복되는 것을 확인할 수 있다(도 6b). 이는, DHED 유도체 투여를 통하여 알츠하이머 질환에 의한 해마에서의 산화 스트레스를 감소시킬 수 있음을 제시한다. As a result of performing western blot using hippocampal tissue (FIG. 6a), it can be seen that the expression of SOD1 is decreased in Alzheimer's model mice (5xFAD) compared to wild-type mice (WT) (FIG. 6b). Through these results, it can be seen that the resistance to oxidative stress in the hippocampus is weakened by Alzheimer's disease. In response to these changes, mice (5xFAD-cx-DHED) administered with an intracerebral glucose metabolism modulator containing the DHED derivative of the present invention had significantly increased SOD1 (p<0.05) compared to Alzheimer's model mice (5xFAD). It showed a trend, and it can be confirmed that it is recovered to the level of wild-type mouse (WT) (FIG. 6b). This suggests that oxidative stress in the hippocampus caused by Alzheimer's disease can be reduced through administration of a DHED derivative.

<실험예 5> DHED 유도체 투여에 따른 신경세포의 사멸 억제 및 회복 확인<Experimental Example 5> Confirmation of inhibition and recovery of neuronal cell death following administration of DHED derivatives

5-1. 대뇌 피질에서의 NeuN 및 BDNF 발현량 확인5-1. Confirmation of NeuN and BDNF Expression Levels in Cerebral Cortex

대뇌 피질에서, 신경세포의 변화를 위한 NeuN 및 BDNF의 발현량을 확인하기 위해 웨스턴 블랏을 수행하였다. In the cerebral cortex, Western blotting was performed to confirm the expression levels of NeuN and BDNF for changes in neurons.

구체적으로, 통상적인 방법에 따라, 실시예 2의 조직을 SDS-PAGE를 이용하여 분리하고, PVDF 막으로 이동시켰다. 상기 막에 NeuN(1:2000) 및 BDNF(1:2000) 단백질에 대한 1차 항체를 각각의 비율로 희석하여 첨가하였다. 여기에 HRP(horseradish peroxidase)가 결합된 2차 항체(Bio-rad, USA)를 첨가하고 반응시킨 뒤, ECL 플러스 용액(Amersham Pharmacia, Sweden)을 이용하여 단백질 밴드를 검출하였다. 검출된 밴드의 강도를 Quantity One 소프트웨어 4.6.5(BioRad, USA)를 사용하여 측정함으로써 단백질의 양을 정량하였다. 평균 발현량은 임의의 단위(arbitrary unit, AU)를 이용하여 나타내었다.Specifically, according to a conventional method, the tissue of Example 2 was separated using SDS-PAGE and transferred to a PVDF membrane. Primary antibodies against NeuN (1:2000) and BDNF (1:2000) proteins were diluted in respective ratios and added to the membrane. A secondary antibody (Bio-rad, USA) bound to horseradish peroxidase (HRP) was added thereto and reacted, and then the protein band was detected using ECL plus solution (Amersham Pharmacia, Sweden). The amount of protein was quantified by measuring the intensity of the detected band using Quantity One software 4.6.5 (BioRad, USA). The average expression level was expressed using an arbitrary unit (arbitrary unit, AU).

대뇌 피질 조직을 이용하여 웨스턴 블랏을 수행한 결과(도 7a), 야생형 마우스(WT)에 비하여 알츠하이머 모델 마우스(5xFAD)는 NeuN(p<0.001)의 발현은 유의적으로 감소하였으며(도 7b), BDNF는 차이가 없는 것을 확인할 수 있었다(도 7c). 이러한 결과를 통해, 알츠하이머 질환에 의해 대뇌 피질에서의 신경세포 사멸 발생을 알 수 있다. 이러한 변화에 대하여 본 발명의 DHED 유도체를 포함하는 뇌 내 글루코스 대사 조절제가 투여된 마우스(5xFAD-cx-DHED)는 알츠하이머 모델 마우스(5xFAD)에 비하여, NeuN의 발현이 유의적으로 증가(p<0.0001)하고, BDNF이 증가하는 경향을 보였으며, 야생형 마우스(WT) 수준으로 회복되는 것을 확인할 수 있다(도 7b 및 7c). 이는, DHED 유도체 투여를 통하여 알츠하이머 질환에 의한 대뇌 피질에서의 신경세포의 사멸을 억제할 수 있음을 제시한다. As a result of performing Western blot using cortical tissue (Fig. 7a), the expression of NeuN (p<0.001) was significantly reduced in Alzheimer's model mice (5xFAD) compared to wild-type mice (WT) (Fig. 7b), It was confirmed that there was no difference in BDNF (FIG. 7c). Through these results, it can be seen that the occurrence of neuronal cell death in the cerebral cortex caused by Alzheimer's disease. For these changes, mice (5xFAD-cx-DHED) administered with an intracerebral glucose metabolism modulator containing the DHED derivative of the present invention significantly increased the expression of NeuN (p<0.0001) compared to Alzheimer's model mice (5xFAD). ), BDNF showed a tendency to increase, and it can be confirmed that it is restored to the level of wild-type mice (WT) ( FIGS. 7b and 7c ). This suggests that the death of neurons in the cerebral cortex caused by Alzheimer's disease can be inhibited through administration of the DHED derivative.

5-2. 해마에서의 NeuN 및 BDNF 발현량 확인5-2. Confirmation of NeuN and BDNF Expression Levels in Hippocampus

해마에서, 신경세포의 변화를 위한 NeuN 및 BDNF의 발현량을 확인하기 위해 웨스턴 블랏을 수행하였다. 실험 방법은 해마 조직이라는 점을 제외하고는, 실험예 5-1의 방법과 동일하게 수행하였다.In the hippocampus, Western blot was performed to confirm the expression levels of NeuN and BDNF for neuronal changes. The experimental method was performed in the same manner as in Experimental Example 5-1, except that the hippocampal tissue was used.

해마 조직을 이용하여 웨스턴 블랏을 수행한 결과(도 8a), 야생형 마우스(WT)에 비하여 알츠하이머 모델 마우스(5xFAD)는 NeuN(p<0.001)의 발현은 유의적으로 감소하였으며(도 8b), BDNF는 차이가 없는 것을 확인할 수 있었다(도 8c). 이러한 결과를 통해, 알츠하이머 질환에 의해 해마에서의 신경세포 사멸 발생을 알 수 있다. 이러한 변화에 대하여 본 발명의 DHED 유도체를 포함하는 뇌 내 글루코스 대사 조절제가 투여된 마우스(5xFAD-cx-DHED)는 알츠하이머 모델 마우스(5xFAD)에 비하여, NeuN의 발현이 유의적으로 증가(p<0.01)하고 BDNF(p<0.05)도 유의적으로 증가하는 경향을 보였으며, 야생형 마우스(WT) 수준으로 회복되는 것을 확인할 수 있다(도 8b 및 8c). 이는, DHED 유도체 투여를 통하여 알츠하이머 질환에 의한 해마에서의 신경세포의 사멸을 억제할 수 있음을 제시한다. As a result of performing western blot using hippocampal tissue (Fig. 8a), the expression of NeuN (p<0.001) was significantly reduced in Alzheimer's model mice (5xFAD) compared to wild-type mice (WT) (Fig. 8b), BDNF was confirmed that there was no difference (Fig. 8c). Through these results, it can be seen that the occurrence of neuronal cell death in the hippocampus caused by Alzheimer's disease. For these changes, mice (5xFAD-cx-DHED) administered with an intracerebral glucose metabolism modulator containing the DHED derivative of the present invention significantly increased the expression of NeuN (p<0.01) compared to Alzheimer's model mice (5xFAD). ) and BDNF (p<0.05) also showed a significant increase, and it can be confirmed that it is restored to the level of wild-type mice (WT) ( FIGS. 8b and 8c ). This suggests that the death of neurons in the hippocampus caused by Alzheimer's disease can be inhibited through administration of the DHED derivative.

<실험예 6> DHED 유도체 투여에 따른 인지 및 기억 능력 향상 확인<Experimental Example 6> Confirmation of improvement in cognitive and memory ability following administration of DHED derivatives

cx-DHED(cx-DD)가 AD의 인지 장애에 대한 치료 효과를 갖는지 여부를 확인하기 위해, 먼저 WT-v(wild type mouse-vehicle), WT-cx-DD(wild type mouse-cx-DHED), Tg-v(transgenic mouse-vehicle) 및 Tg-cx-DD(transgenic mouse-cx-DHED)의 5xFAD 마우스 그룹(6개월 령 마우스)를 준비하고 해당 마우스 그룹으로 3가지 행동 실험(새로운 개체 인식 실험, Y-미로 실험 및 수동 회피 실험)을 수행하였다.To determine whether cx-DHED (cx-DD) has a therapeutic effect on cognitive impairment in AD, first, WT-v (wild type mouse-vehicle), WT-cx-DD (wild type mouse-cx-DHED) ), Tg-v (transgenic mouse-vehicle), and Tg-cx-DD (transgenic mouse-cx-DHED), 5xFAD mouse groups (6-month-old mice) were prepared and three behavioral experiments (new object recognition) were prepared with the corresponding mouse groups. experiments, Y-maze experiments and passive avoidance experiments) were performed.

6-1. 새로운 개체 인식 실험(Novel object recognition test) 수행6-1. Performing a novel object recognition test

인지 기억은 새로운 개체 인식 실험(Novel object recognition test, NOR) 실험을 사용하여 평가되었다. 각 마우스 그룹은 개방형 상자(가로 40cm x 세로 40cm x 높이 40cm)에서 진행되었다. 실험하는 동안, 물체에 접촉하는 시간 및 빈도와 이동 경로(거리), 속도 등의 환경 설정은 EthoVision Maze task system(Noldus Information Technology, Wageningen, the Netherlands)을 사용하여 기록되었다. Cognitive memory was assessed using the Novel object recognition test (NOR) experiment. Each group of mice was conducted in an open box (width 40cm x length 40cm x height 40cm). During the experiment, environmental settings such as time and frequency of contact with an object, movement path (distance), and speed were recorded using the EthoVision Maze task system (Noldus Information Technology, Wageningen, the Netherlands).

첫 번째 날, 훈련에서 똑같은 물체 2개에 대한 인지 정도를 측정하였다. 2일째 되는 날, 1개의 물체를 새로운 물체로 바꾸어 준 다음 테스트를 진행하였다. 각 마우스 그룹의 이동 속도가 다르지 않음에도 Tg-v 마우스(30.68±10.43)는 감소된 새로운 물체 인지 정도를 나타내었다. 또한, Tg-cx-DD 마우스(80.04±4.59)는 Tg-v 마우스(30.68±10.43)와 비교하여 새로운 물체에 대한 인지 정도가 향상됨을 나타냈다(도 9). 이러한 결과는, Tg-v 마우스와 비교하여 cx-DHED를 투여한 Tg-cx-DD 마우스에서 인지 기억이 상당히 개선되었음을 제시한다.On the first day, the recognition level of two identical objects in training was measured. On the second day, one object was replaced with a new object, and then the test was performed. Tg-v mice (30.68±10.43) showed reduced new object recognition even though the movement speed of each mouse group was not different. In addition, Tg-cx-DD mice (80.04±4.59) showed improved recognition of new objects compared to Tg-v mice (30.68±10.43) ( FIG. 9 ). These results suggest that cognitive memory is significantly improved in Tg-cx-DD mice administered with cx-DHED compared to Tg-v mice.

6-2. Y-미로 실험(Y-maze test) 수행6-2. Perform Y-maze test

Y-미로 실험(Y-maze test)은 길이 40cm, 폭 5cm, 높이 10cm인 3개의 가지(A, B, C)로 구성되어 있으며 120°의 각도에서 이루어진다. 각 마우스 그룹을 미로에 8분 동안 놓았고, 꼬리가 각 가지에 들어간 빈도를 가지마다 세었다. 동물이 가지에 들어온 횟수(A, B, C 순서)도 세어 1점(실제 변경, 실제 교대)을 부여했다. 변경 조치 수행 능력(%)의 계산 공식은 하기와 같다. The Y-maze test consists of three branches (A, B, C) with a length of 40 cm, a width of 5 cm, and a height of 10 cm, and is performed at an angle of 120°. Each group of mice was placed in the maze for 8 minutes, and the frequency with which the tail entered each branch was counted from branch to branch. The number of times an animal entered the branch (in the order of A, B, C) was also counted and given 1 point (actual change, actual shift). The formula for calculating the change action capability (%) is as follows.

변경 조치 수행 능력(%) = 실제 변경(실제 교대)/최대 변경(최대 교대)Х100(최대 변경: 총 출입 수-2).Ability to perform change actions (%) = Actual change (actual shift)/maximum change (max shift)Х100 (maximum change: total number of exits-2).

그 결과, Y-미로 실험에서 자발적인 변경 속도는 Tg-v 마우스(52.73±13.26)와 비교하여 Tg-cx-DD(80.37±5.41)에서 현저히 개선되었다(도 10). 이는, Tg-v 마우스와 대비하여 cx-DHED를 투여한 Tg-cx-DD 마우스가 공간 및 절차적인 기억 능력이 향상되었음을 제시한다.As a result, the rate of spontaneous alteration in the Y-maze experiment was significantly improved in Tg-cx-DD (80.37±5.41) compared to Tg-v mice (52.73±13.26) ( FIG. 10 ). This suggests that Tg-cx-DD mice administered cx-DHED had improved spatial and procedural memory compared to Tg-v mice.

6-3. 수동 회피 실험(Passive avoidance test) 수행6-3. Passive avoidance test

수동 회피 실험(Passive avoidance test)은 회피 학습 박스(Gemini Passive avoidance System; San Diego Instruments, SD, USA)를 사용하여 수행되었다. 수동 회피 장치(폭 42.5cm, 길이 35.5cm)는 밝고 어두운 칸막이가 있는 2개의 상자로 구성되어 있고, 조명 부분은 LED house 조명(6W)으로 전기 그리드 바닥이 장착된 어두운 챔버에 연결되었다. 각 마우스 그룹들은 첫날에 두 구획을 탐험하도록 하였고, 다음 날, 동물의 암실 입구는 발에 전기 충격(2초간 2mA)을 가하도록 하였다. 기억 검사(retention test)는 상기 실험 후 24시간 후에 수행되었고 마우스에 충격을 주지 않았다는 점을 제외하고는 절차적으로 상기 실험과 유사하였다. 기억 능력의 척도는 각 마우스 그룹이 밝은 방에 머무른 시간(단계 간 대기 시간)으로 측정하였다.Passive avoidance test was performed using an avoidance learning box (Gemini Passive avoidance System; San Diego Instruments, SD, USA). The passive avoidance device (42.5 cm wide and 35.5 cm long) consisted of two boxes with light and dark partitions, the lighting part connected to a dark chamber equipped with an electric grid floor by LED house lights (6 W). Each group of mice was allowed to explore both compartments on the first day, and the next day, the animals' darkroom entrances were subjected to an electric shock (2 mA for 2 s) to the paws. A retention test was performed 24 hours after the experiment and was procedurally similar to the experiment except that the mice were not shocked. A measure of memory ability was measured as the time each group of mice stayed in a bright room (latency between steps).

그 결과, Tg-cx-DD(239.3±11.11)의 스텝스루(step-through) 지연 시간은 Tg-v 마우스(91.2±41.86)와 비교하여 감소하였다(도 11). 이는, cx-DHED를 처리함에 따라 결핍되었던 단기 기억 능력이 회복될 수 있음을 제시한다.As a result, the step-through delay time of Tg-cx-DD (239.3±11.11) was decreased compared with that of Tg-v mice (91.2±41.86) ( FIG. 11 ). This suggests that the short-term memory ability that was deficient can be restored by treatment with cx-DHED.

Claims

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(1) processing the test substance to be analyzed in the sample isolated from the mouse with Alzheimer's disease:
(2) GLUT1 (glucose transporter 1), GLUT2 (glucose transporter 2), G6PD (glucose-6-phosphate dehydrogenase), SOD1 (superoxide dismutase 1), NeuN (neuronal nuclei) and BDNF (Brain-Derived Neurotrophic Factor) in the sample ) measuring the expression level of; and
(3) The expression levels of GLUT1, SOD1, NeuN and BDNF are increased compared to before treatment with the test material, and the expression level of GLUT2 and G6PD is reduced compared to before treatment with the test material Selecting a test material ;
A method for screening glucose metabolism modulators in the brain, comprising a.

12. The method of claim 11,
Wherein the sample is derived from the cerebral cortex and hippocampus, the method for screening glucose metabolism modulators in the brain.

12. The method of claim 11,
The test substance reduces glucose uptake in the brain, reduces oxidative stress, inhibits neuronal cell death, and improves deficient cognition and memory ability.

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