KR102432156B1 - 화학물질을 포함하는 어류의 성 성숙 제어용 조성물 및 이를 이용한 어류의 성 성숙 제어방법 - Google Patents

화학물질을 포함하는 어류의 성 성숙 제어용 조성물 및 이를 이용한 어류의 성 성숙 제어방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 화학물질을 포함하는 어류의 성 성숙 제어용 조성물 및 이를 이용한 어류의 성 성숙 제어방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 엑스메스탄(Exemestane), 아나스트로졸(Anastrozole), 타목시펜(Tamoxifen) 및 도파민으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 화학물질을 포함하는 어류의 성 성숙 제어용 조성물 및 이를 이용한 어류의 성 성숙 제어방법에 관한 것이다.
본 발명에 의하면, 어류의 생식 세포의 발달과 성 성숙을 효과적으로 억제하므로 상품가치가 높은 어류를 생산하여 양식사업에 활용될 수 있으며, 어류의 자연적인 성 성숙으로 인한 양식 어류의 체성장 둔화 및 상업적 가치 하락을 효과적으로 방지할 수 있다.

Description

화학물질을 포함하는 어류의 성 성숙 제어용 조성물 및 이를 이용한 어류의 성 성숙 제어방법{Composition comprising chemical material for inhibiting gonadal maturation in fishes and method for inhibiting gonadal maturation in fishes using the same}
본 발명은 화학물질을 포함하는 어류의 성 성숙 제어용 조성물 및 이를 이용한 어류의 성 성숙 제어방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 엑스메스탄(Exemestane), 아나스트로졸(Anastrozole), 타목시펜(Tamoxifen) 및 도파민으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 화학물질을 포함하는 어류의 성 성숙 제어용 조성물 및 이를 이용한 어류의 성 성숙 제어방법에 관한 것이다.
우리나라의 어류 양식업은 산업발달과 더불어 지속적으로 증가하였으나, 2001년 이후 급속한 어류 생산량 증가는 과잉공급으로 이어져 어가의 하락, 양식비용 증가, 생산량 둔화의 결과를 가져왔다. 양식하는 어류들은 일반적으로 암컷이 수컷보다 성장이 빠르고, 수컷은 상품크기에 이르기 전에 성적으로 성숙하는 경향이 있다. 따라서 암컷만을 양식하는 것이 양식 생산량을 향상시키고 일정한 상품크기를 생산하여 경제성을 높일 수 있기 때문에 암컷만을 양식할 수 있는 기술들이 많이 개발되어왔다. 우리나라에서 가장 많이 양식하고 있는 넙치의 경우에도 암컷은 2년생부터 성적으로 성숙하여 생식소가 발달하게 되고 이에 따른 에너지 소비와 체력이 저하되어, 2년생 이후부터는 생존율이 급격하게 떨어지는바 대부분 1년~1.5년간 양식하여 1kg 이하 크기의 넙치들을 생산하고 있다. 따라서 일정한 크기의 상품들이 대량 출하되기 때문에 가격경쟁력은 악화되는 문제점이 있다. 더불어 양식 넙치를 상품가치가 높은 체중 2~3 kg 내외의 넙치로 체성장시킬 경우, 수조 내 자연적인 성 성숙으로 인해 체성장이 저해받아 상품가치가 떨어질 뿐만 아니라 건강관리가 어려워 질병이 발생할 수 있으므로, 넙치의 성 성숙은 양식산업에 여러가지 문제점을 일으키는 것으로 알려져 있다.
현재까지는 환경적 요인이 어류의 성장 및 성숙에 영향을 미친다고 알려져 있으며, 다양한 환경적 요인들 중 특히 빛은 파장, 세기, 광주기의 특징을 포함하고, 어류의 생리적 기능에 막대한 영향을 미치는 주요한 환경적 요인으로 알려져 있다. 광 환경 조건에서 어류의 성장은 매우 필수적인 생물학적 과정으로, 어류의 먹이 섭취능, 항상성 유지능, 대사 조절능 및 환경 스트레스에 의한 영향을 파악할 수 있는 지표가 될 수 있다. 이러한 빛의 일주기를 이용한 어류의 성 성숙 조절 기술은 상당 부분 밝혀졌지만, 화학적인 요소를 이용하여 어류의 성 성숙을 억제하는 기술은 상대적으로 거의 밝혀지지 않았다.
아울러 어류 생식소의 성숙 촉진에 대해서는 기초적인 생리생태학적 연구에서부터 산업응용에 이르기까지 상당히 많은 연구들이 이루어져왔다. 그러나 어류의 성 성숙 제어에 대한 연구는 일부 어류를 대상으로 기초적인 생리생태학적 연구만이 있었을 뿐 이를 산업에 이용하여 생산성을 높이기 성 성숙 제어를 위한 화학물질의 탐색이나 이와 관련된 연구는 거의 이루어지지 않는 실정이다. 따라서, 어류의 양식에 유용하게 활용될 수 있는 성 성숙 제어 조성물 확보와 성 성숙 제어방법은 당 분야에 있어서 계속적으로 요구되고 있다.
대한민국 등록특허공보 제10-1211315호
본 발명은 엑스메스탄(Exemestane), 아나스트로졸(Anastrozole), 타목시펜(Tamoxifen) 및 도파민으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 화학물질을 포함하는 어류의 성 성숙 제어용 조성물의 제공을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 엑스메스탄, 아나스트로졸, 타목시펜 및 도파민으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 화학물질을 주입하는 단계를 포함하는 어류의 성 성숙 제어방법의 제공을 목적으로 한다.
본 발명은 상기의 목적을 달성하기 위하여, 엑스메스탄, 아나스트로졸, 타목시펜 및 도파민으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 화학물질 포함하는 어류의 성 성숙 제어용 조성물의 제공한다.
또한, 본 발명은 어류의 생식 세포의 성숙을 지연시키는 것임을 특징으로 하는 어류의 성 성숙 제어용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 어류의 사료 조성물인 것임을 특징으로 하는 어류의 성 성숙 제어용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 엑스메스탄, 아나스트로졸, 타목시펜 및 도파민으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 화학물질을 주입하는 단계를 포함하는 어류의 성 성숙 제어방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 어류의 생식 세포의 성숙을 지연시키는 것임을 특징으로 하는 어류의 성 성숙 제어방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 주입은 복강 투여 또는 사료 내 첨가하여 공급하는하는 것임을 특징으로 하는 어류의 성 성숙 제어방법을 제공한다.
본 발명에 의하면, 어류의 생식 세포의 발달과 성 성숙을 효과적으로 제어하므로 상품가치가 높은 어류를 생산하여 양식사업에 활용될 수 있으며, 어류의 자연적인 성 성숙으로 인한 양식 어류의 체성장 둔화 및 상업적 가치 하락을 효과적으로 방지할 수 있다.
도 1은 타목시펜(Tam)의 투여에 따른 배양 간세포에서의 비텔로제닌(VTG) 및 E2 수용체(ER)의 유전자 발현변화를 나타낸 것이다. 1은 대조군, 2는 E2(2 Х 10-7M), 3은 E2(2 Х 10-7 M) 및 Tam(2 Х 10-7M) 혼합, 4는 Tam(2 Х 10-7M), 5는 Tam(2 Х 10-8M), 6은 Tam(2 Х 10-9M)의 조건으로 투여한 것이다.
도 2는 넙치의 배양 간세포에 대한 아나스트로졸(Ana)의 농도별 투여에 따른 VTG(A) 및 ER(B)의 유전자 발현변화를 나타낸 것이다.
도 3은 넙치의 배양 간세포에 대한 엑스메스탄(Exe)의 농도별 투여에 따른 VTG(A) 및 ER(B)의 유전자 발현변화를 나타낸 것이다.
도 4는 배양 뇌하수체 및 시상하부 세포에서의 도파민(Da)의 농도별 투여에 따른 GnRH(A), Gth(B) 및 ER(C)의 유전자 발현변화를 나타낸 것이다.
도 5는 넙치의 성 성숙 시기에 Tam 투여에 따른 VTG(A)와 ER(B)의 유전자발현변화를 나타낸 것이다.
도 6A는 Tam 복강 투여 후 간에서의 VTG 유전자 발현을 나타낸 것이고, 도 6B는 Tam 복강 투여 후 간에서 ER 유전자 발현을 나타낸 것이며, 도 6C는 Tam 복강 투여 후 생식소에서의 ER 유전자 발현을 나타낸 것이다.
도 7은 Exe의 복강 투여 후, 간에서의 VTG(A) 및 ER(B)의 유전자 발현변화를 나타낸 것이고, 도 8는 Exe의 복강 투여 후, 생식소의 조직학적 변화를 나타낸 것이다.
도 9는 Ana(A) 및 Exe(B) 주사 후 간에서의 VTG의 유전자 발현변화를 나타낸 것이고, 도 10은 Ana(A) 및 Exe(B) 주사 후 간에서의 ER의 유전자 발현변화를 나타낸 것이며, 도 11은 Ana(A) 및 Exe(B) 주사 후 생식소에서의 ER의 발현변화를 나타낸 것이다.
도 12는 미성숙 암컷 넙치 뇌하수체에서의 Da 투여 후, GnRH 발현(A), GtH발현(B), 그리고 미성숙 암컷 넙치에 Da 주사 후 생식소에서 ER의 발현(C)을 나타낸 것이다.
도 13은 Exe(A), Ana(B), Tam(C) 및 Da(D) 투여군의 생식소 중량 지수 결과를 나타낸 것이다.
도 14 및 도 15는 성 성숙 억제 물질의 투여에 따른 생식소의 조직학적 변화를 나타낸 것이다. 도 14(A)는 Exe, 도 14(B)는 Tam, 도 15(A)는 Ana, 도 15(B)는 Da 투여군의 유전자 발현변화를 나타낸 것이다.
a: 대조군 (6일차), b: estradiol 17
Figure 112020049844612-pat00001
(E2) (6일차), c: E2+억제물질 (3일차), d: 억제물질 (3일차), e: E2→억제물질(6일차), f: E2→억제물질(6일차), g: 억제물질(6 days), OC(oocyte): 난모세포, SC(spermatocyte): 세포, SG(spermatogonia): 정원세포
도 16은 사료 내 Ana 및 Exe 첨가 급이에 따른 간에서의 ER(A) 및 VTG(C) 발현과 생식소에서의 ER(B)의 발현을 나타낸 것이며, 도 17은 사료 내 Tam 및 Da 첨가 급이에 따른 간에서의 ER(A) 및 VTG(C) 발현과 생식소에서의 ER(B)의 발현을 나타낸 것이다.
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법 및 이하에 기술하는 실험 방법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명은 어류의 성 성숙을 제어하기 위한 화학물질을 개발하고자 노력한 결과, 엑스메스탄(Exemestane), 아나스트로졸(Anastrozole), 타목시펜(Tamoxifen) 및 도파민으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 화학물질을 포함하는 조성물은 간과 생식소에서 비텔로제닌(vitellogenin)과 E2 수용체(17β-estradiol receptor, ER) 유전자 발현을 감소시키고, 생식소 중량 지수를 감소시키며, 생식소 발달을 저지시킴을 확인하였다.
본 발명은 일 관점에서, 엑스메스탄, 아나스트로졸, 타목시펜 및 도파민으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 화학물질을 포함하는 어류의 성 성숙 제어용 조성물에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 다른 관점에서, 엑스메스탄, 아나스트로졸, 타목시펜 및 도파민으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 화학물질을 주입하는 단계를 포함하는 어류의 성 성숙 제어방법에 관한 것이다.
어류의 성 성숙 및 성 발달은 시상하부-뇌하수체-생식소 축을 중심으로 생식선 자극 호르몬-방출 호르몬(Gonadotropin-releasing hormone, GnRH), 생식선 자극 호르몬(Gonadotropic hormone, GtH)과 스테로이드 호르몬 이외에 신경내분비물질, 생식소 호르몬과 같은 다양한 성 호르몬에 의해 조절된다.
에스트로겐(estrogen)은 번식에 필수적인 스테로이드 호르몬으로, 성 성숙과 난 형성, 난황 형성 및 정소 발달을 포함한 성 분화에도 중요한 역할을 수행하는 호르몬으로 알려져 있다. 에스트로겐은 에스트론(estrone, E1), 17β-에스트라디올(17β-estradiol, E2) 및 에스트리올(estriol, E3)로 분류되며, 본 발명의 일 실시예에서는 17β-에스트라디올 수용체(E2 receptor, ER)의 유전자 발현변화를 분석하였다.
본 발명의 비텔로제닌(vitellogenin)은 간에서 유도되며, ER 관련 경로에 의해 에스트로겐과 반응하는 난황 전구 단백질이다. 큰입우럭과 대서양 연어에서 ERα와 함께 간에서 높은 비텔로제닌 mRNA의 발현량이 관찰되어 ER과 비텔로제닌 사이의 높은 상관 관계가 있음을 바탕으로, 본 발명에서는 화학물질 투여 후, 비텔로제닌 및 ER 유전자 발현변화를 분석하였다.
구체적으로 본 발명의 일 실시예에서는 어류에 화학물질, 구체적으로 엑스메스탄, 아나스트로졸, 타목시펜, 도파민을 투여한 후, 간과 생식소에서 비텔로제닌과 E2 수용체 유전자 발현을 분석하였다.
본 발명은 성 성숙을 제어하기 위해 넙치(Paralichthys olivaceus)에 화학물질을 투여하였으며, 상기 화학물질로 도파민(dopamine, Da), 엑스메스탄(exemestane, Exa), 아나스트로졸(anastrozole, Ana) 및 타목시펜(Tamoxifen, Tam)을 사용하였다.
상기 엑스메스탄(Exemestane)은 스테로이드성 아로마타제 억제제의 일종으로 유방암 치료제로 사용되고 있는 약물이며, 본 발명의 일 실시예에서는 어류의 성 성숙을 제어하기 위한 용도로 미성숙 및 성숙 넙치에 엑스메스탄을 투여하였다.
상기 아나스트로졸(Anastrozole)은 비스테로이드성 아로마타제 억제제의 일종으로 다른 유방암 치료제와 함께 사용되는 유방암 치료제이며, 특히 호르몬수용체 양성 유방암의 치료제로 사용되고 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 어류의 성 성숙을 제어하기 위한 용도로 미성숙 및 성숙 넙치에 아나스트로졸을 투여하였다.
상기 타목시펜(Tamoxifen)은 17β-에스트라디올(E2) 억제제의 일종으로 유방암을 예방하고 치료하기 위한 약물이며, 알브라이트 증후군에도 사용되고 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 어류의 성 성숙을 제어하기 위한 용도로 미성숙 및 성숙 넙치에 타목시펜을 투여하였다.
상기 도파민은 신경 전달물질을 유리시키고 GnRH에서 GtH로 분비를 억제하는 물질로 알려져 있는데, 본 발명의 일 실시예에서는 어류의 성 성숙을 제어하기 위한 용도로 미성숙 및 성숙 넙치에 도파민을 투여하였다.
본 발명의 일 실시예에서는 어류 중 넙치를 이용하여 성 성숙 제어 정도를 관찰하였으나, 어류의 종류는 넙치에 한정되지 아니한다.
본 발명의 어류의 성 성숙 억제 조성물은 어류의 성 성숙, 어류의 생식소의 발달을 억제하는 효과를 갖는 조성물을 의미하는 것으로서, 구체적으로 미성숙한 암컷 어류의 성숙 초기의 난모세포의 성숙을 억제하는 것뿐 아니라 성숙 중의 어류에 대해서는 난모 세포들이 난황을 형성하는 것을 억제하는 것, 성숙 후 어류의 경우에는 산란양을 감소시키는 것을 모두 포함한다. 본 발명에서는 생식소의 성숙 정도는 생식소에 대한 조직학적 조사와 생식소 중량 지수(Gonadosomatic index, GSI)를 측정하여 평가하였다.
본 발명의 일 실시예에서 화학물질의 성 성숙 제어 효과를 나타내는지 확인하기 위하여, 넙치에 복강 투여하거나 사료 내 첨가하여 공급하였으며, 이를 통틀어 "주입"이라고 명하였다.
본 발명의 조성물은 어류가 사료 등과 함께 섭취할 수 있도록 사료 등에 흡착 또는 혼합된 형태로 제공될 수 있으며, 또는 어류의 사료 조성물을 구성할 수 있다. 이때, 사료 조성물은 통상 어류의 사료로서 시판되고 있는 제형으로 제조될 수 있다. 사료 조성물의 경우, 사료 중 화학물질의 함량은 전체 사료 중량의 5 내지 7 중량%일 수 있다. 그러나, 이에 한정되지 아니하며 사료 조성물의 식이양은 어류의 체중, 건강상태, 크기 등에 따라 그 범위가 다양할 수 있으며, 본 기술분야의 통상의 전문가가 용이하게 결정할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
[재료 및 방법]
1. 재료
체중 300~350g의 미성숙 넙치(Paralichthys olivaceus)를 양식장에서 구입하여 사용하였다. 화학물질은 생식선 자극 호르몬-방출 호르몬(Gonadotropin-releasing hormone, GnRH) 억제제인 도파민(dopamine, Da), 스테로이드성 아로마타제 억제제(aromatase inhibitor)인 엑스메스탄(exemestane, Exa), 비스테로이드성 아로마타제 억제제인 아나스트로졸(anastrozole, Ana) 및 17β-에스트라디올(E2) 억제제인 타목시펜(Tamoxifen, Tam) 총 4종을 사용하였다. 호르몬 처리 3일 후, 6일 후에 페녹시에탄올(phenoxyethanol)로 마취하여 간을 추출 한 후, -70℃ deep freezer에 보관하였다.
2. 실험조건
각각의 화학물질은 DMSO에 녹여 단독 또는 혼합하여 5㎍/g의 농도로 복강에 1차(1일차), 2차(3일차) 투여하였으며, 대조군은 DMSO 투여군으로 하였다. 실험조건은 대조군(미성숙어), E2 투여군(성숙시기의 조건), E2 및 화학물질 투여군(성숙시기의 화학물질 투여조건), 화학물질 투여군(미성숙시기에서의 성 억제 조건)으로 설정하였다. 화학물질 투여 후, 성 성숙 지표로 확인할 수 있는 난황단백질인 비텔로제닌(vitellogenin, VTG)과 E2 수용체(17β-estradiol receptor, ER) 유전자 발현변화를 조사하였다. 또한, Da 투여군에서는 생식선 자극 호르몬-방출 호르몬(Gonadotropin-releasing hormone, GnRH)과 생식선 자극 호르몬(Gonadotropic hormone, GtH)의 유전자 발현변화를 조사하였다.
3. Real time PCR
Real time PCR을 위해 in vivo에서 화학물질 투여 3일후, 6일후, 간과 생식소를 추출하여 Trizol을 이용하여 total RNA를 추출 후, 실험 전까지 -70℃ deep freezer에 보관하였다. cDNA 합성은 TaKaRa 사의 cDNA 합성키트를 사용하여 합성하였다. 간에서 추출한 total RNA를 사용하여 합성한 cDNA를 템플릿(template)으로 사용하였다. 프라이머 서열은 하기 표 1에 나타내었다.
Forward
(5'- 3')		 Reverse
(5'- 3')
비텔로제닌(VTG) CACAGACTGGGCAGACCATA AGCAAAATGCGGAGCTGTAT
E2 수용체(ER) TGGCTGAGATCTTCGACATGC TGTCCTGAACTGGCTGAAGA
베타액틴(Beta actin) TGAACCCTAAAGCCAACAGGGAGA TGATGCTGTTGTAGGTGGTCTCGT
Real time PCR 조건은 95℃에서 3분간 pre denaturation 후 총 40사이클로 95℃에서 10초, 58℃에서 30초로 반응시킨 후, 95℃에서 10초 반응시켰으며, melting curve를 수행하였다.
4. 조직분석 방법
생식소의 조직학적 관찰을 위하여, in vivo에서 화학물질 투여 3일후, 6일후, 넙치의 전장과 체중을 측정 후 생식소 중량 지수(gonadosomatic index, GSI)를 측정하였다. 생식소 중량 지수는 생식소를 포함한 체중 및 적출된 생식소의 중량을 측정하여 분석하였으며, 하기 수학식 1을 이용하여 산출하였다.
Figure 112020049844612-pat00002
그 후, 생식소를 절개하여 Bouin's solution에 24시간 고정하였다. 생식소 조직은 파라핀 절편법에 의해 5-6um의 두께로 절편하여 한센 헤마토실린(haematoxylin)과 0.5% 에오신(eoxin)으로 비교 염색하여 조직표본을 만들었다. 제작된 조직표본은 생물현미경으로 관찰하였다.
[실시예 1] 배양 간세포를 이용한 화학물질 투여농도 평가
1. 타목시펜(Tam) 투여 농도에 따른 유전자 발현 분석
도 1은 타목시펜(Tam)의 투여에 따른 배양 간세포에서의 비텔로제닌(VTG) 및 E2 수용체(ER)의 유전자 발현변화를 나타낸 것이다. 1은 대조군, 2는 E2(2 × 10-7M), 3은 E2(2 × 10-7 M) 및 Tam(2 × 10-7M) 혼합, 4는 Tam(2 × 10-7M), 5는 Tam(2 × 10-8M), 6은 Tam(2 × 10-9M)의 조건으로 투여한 것이다.
도 1을 살펴보면, Tam 투여 농도에 따른 VTG 및 ER 유전자는 2Х10-7M, 2Х10-8M 및 2Х10-9M 농도에서 모두 감소하였으나, 2Х10-9M 농도에서는 대조군과 비교하였을 때 거의 변화가 없음을 확인할 수 있다. ER 유전자 발현은 VTG와 유사한 패턴을 나타냈으며, 2Х10-7M 의 농도에서 가장 많이 감소하였다.
이러한 결과를 통해, Tam의 작용은 에스트로겐 수용체에 결합하여 테스토스테론의 분비를 증가시키는 것으로, 혼합 투여군 및 타목시펜 단독 투여군 모두 억제되는 것으로 예측되었다. 따라서, 배양 간세포에서 Tam의 작용이 ER 및 VTG 생성 억제에 큰 효과가 있음을 확인할 수 있다.
2. 아나스트로졸(Ana) 투여 농도에 따른 유전자 발현 분석
도 2는 넙치의 배양 간세포에 대한 아나스트로졸의 농도별 투여에 따른 VTG(A) 및 ER(B)의 유전자 발현변화를 나타낸 것이다.
도 2를 살펴보면, 농도에 따른 VTG 유전자는 2×10-7M, 2×10-8M 및 2×10-9M 농도에서 모두 감소하였으나, 2×10-9M 농도에서는 대조군과 비교하였을 때 거의 변화가 없음을 확인할 수 있다. ER 유전자 역시 VTG과 유사한 패턴을 나타냈으며, 2×10-7M의 농도에서 가장 많이 감소하였다.
이러한 결과를 통해, Ana의 작용은 에스트로겐 합성을 억제하는 것으로 혼합 투여군 및 Ana의 단독 투여군 모두 억제되는 것으로 예측되었다. 따라서, 배양 간세포에서 Ana의 작용이 ER 및 VTG 생성 억제에 큰 효과가 있음을 확인할 수 있다.
3. 엑스메스탄(Exe) 투여 농도에 따른 유전자 발현 분석
도 3은 넙치의 배양 간세포에 대한 Exe의 농도별 투여에 따른 VTG(A) 및 ER(B)의 유전자 발현변화를 나타낸 것이다.
도 3을 살펴보면, 농도에 따른 VTG 및 ER 유전자는 Ana과 유사한 결과를 나타내었으며, Ana와 역시 2×10-7M의 농도에서 발현이 가장 많이 감소하였다.
이러한 결과를 통해, 따라서, 배양 간세포에서 Exe의 작용이 ER 및 VTG 생성 억제에 큰 효과가 있음을 확인할 수 있다. 또한, Exe는 스테로이드 계열의 아로마타제 억제제(aromatase inhibitor)로 비스테로이드 계열의 Ana와 비교하였을 때, Exe는 VTG 및 ER mRNA 억제에 보다 탁월한 것을 확인할 수 있다.
4. 도파민(Da) 투여 농도에 따른 유전자 발현 분석
도 4는 배양 뇌하수체 및 시상하부 세포에서의 Da의 농도별 투여에 따른 GnRH(A), Gth(B) 및 ER(C)의 유전자 발현변화를 나타낸 것이다.
도 4를 살펴보면, GnRH, GtH 및 ER 유전자는 농도에 따라 각기 다른 발현량을 나타내었다. GnRH는 2×10-8M의 농도에서 가장 많이 감소하였고, GtH 역시 2×10-8M의 농도에서 가장 낮은 발현량을 나타내었으나, 2×10-7M에서는 유의적인 차이를 나타내지 않았다. GnRH와 GtH는 2×10-9M의 농도에서는 대조군과 큰 차이를 나타내지 않았다. ER은 아로마타제 억제제 및 항에스트로겐(anti-estrogen)의 결과와 유사하게 2×10+M에서 가장 낮은 발현량을 나타내었다. 또한, 2×10-8M의 농도에서 GnRH가 가장 낮은 발현을 나타내었으나, GtH는 2×10-7M 투여군에서 큰 변화는 없었고, ER의 경우에는 2×10-7M 투여군에서 가장 낮은 발현량을 나타내었다.
이러한 결과를 통해, Da는 GnRH의 발현 자체를 강하게 억제하는 효과가 있으며, ER의 발현 정도를 억제하는 효과도 동시에 가지는 것을 확인할 수 있다.
[실시예 2] 화학물질 투여에 따른 성 성숙 변화 분석
1. 타목시펜(Tam)의 성 성숙 억제 효과
(1) 성숙 암컷에서의 성 성숙 억제 효과
도 5는 넙치의 성 성숙 시기에 Tam의 투여에 따른 VTG(A)와 ER(B)의 유전자 발현변화를 나타낸 것이다.
도 5를 살펴보면, E2와 Tam을 혼합 및 단독으로 무게 당 5㎍을 복강 투여하여 간에서 VTG 유전자 발현을 분석한 결과, 대조군 및 E2 단독 투여군에서는 발현이 증가되었으나, Tam의 단독 투여군 및 E2의 혼합 투여군에서는 발현이 감소되었다. 간에서 ER의 유전자 발현을 분석한 결과, VTG와 마찬가지로 대조군 및 E2 단독 투여군에서는 발현이 증가되었으나, Tam의 단독 투여군 및 E2의 혼합 투여군에서는 발현이 감소되었다.
이를 통해, 생체 내 Tam 투여에 의해 E2 수용체인 ER의 합성을 억제할 뿐만이 아니라 ER과 E2의 결합을 방해하여 VTG 합성을 억제함으로써 암컷의 성 성숙을 억제할 것으로 예측하였다.
(2) 미성숙 암컷에서의 성 성숙 억제 효과
도 6A는 Tam 복강 투여 후 간에서의 VTG 유전자 발현을 나타낸 것이고, 도 6B는 Tam 복강 투여 후 간에서 ER 유전자 발현을 나타낸 것이며, 도 6C는 Tam 복강 투여 후 생식소에서의 ER 유전자 발현을 나타낸 것이다.
미성숙 암컷을 이용한 실험에 있어서도 Tam은 VTG 유전자 발현의 감소를 나타내었으나, 성숙 암컷 단계 정도의 감소는 나타내지 않았다(도 6A). 이는 미성숙 단계에서는 ER 수용체를 만들어 작용하는 과정에 있어서 그 감도가 성숙 시기에 비해 떨어지기 때문이라고 추정하였다. 또한, 미성숙 암컷 넙치에 Tam을 복강 투여한 결과, 간에서 ER 유전자 발현 또한 감소시키는 것으로 나타났다(도 6B). 이를 통해, Tam의 복강 투여는 간에서의 ER 생성 억제 및 E2와의 경쟁적 저해를 초래하여 암컷의 성 성숙을 억제 시키는 것으로 예측하였다.
일반적으로 생식소에서 생성되는 E2는 negative feed back 작용을 가지는 것으로 알려져 있기 때문에 생식소에서의 ER 발현을 확인하였다. 그 결과, Tam에 의해 간에서 나타난 정도보다 그 작용이 약하긴 하였으나, ER 유전자 발현을 억제시키는 것으로 나타났다(도 6C). 따라서 Tam의 넙치의 각 세포에 존재하는 ER의 생성을 주로 억제하는 효과를 나타내는 것으로 예측하였다.
2. 아로마타제 억제제(Exe, Ana)의 성 성숙 억제 효과
(1) 성숙 암컷에서의 성 성숙 억제 효과
도 7은 Exe의 복강 투여 후, 간에서의 VTG(A) 및 ER(B)의 유전자 발현변화를 나타낸 것이고, 도 8은 Exe의 복강 투여 후, 생식소 조직학적 관찰을 나타낸 것이다.
E2와 Exe의 혼합 투여군 및 단독 투여군 모두 개체당 5㎍을 복강 투여하여 간에서 VTG 유전자 발현 분석 결과, 대조군 및 E2 단독 투여군에서 증가를 나타냈으나, Exe의 단독 투여군 및 E2의 혼합 투여군에서는 감소를 나타내었다(도 7A). 또한, Exe는 VTG와 ER 모두 시간이 경과함에 따라 발현량이 감소하는 것을 확인하였으며, Exe 단독 투여군에서는 전혀 발현되지 않아 성 성숙 억제 효과가 매우 높은 것으로 나타났다(도 7B).
또한, Exe 투여에 의한 생식소의 발달 정도를 분석한 결과, 대조군과 E2에서는 투여군에서는 성 성숙이 진행되는 것으로 관찰된 반면, 혼합 투여군 및 단독 투여군에서는 성 성숙 진행이 더 이상 진행되지 않는 것으로 나타났다(도 8).
(2) 성숙 암컷에서의 성 성숙 억제 효과
도 9는 Ana(A) 및 Exe(B) 주사 후 간에서의 VTG 유전자 발현변화를 나타낸 것이고, 도 10은 Ana(A) 및 Exe(B) 주사 후 간에서의 ER의 발현변화를 나타낸 것이며, 도 11은 Ana(A) 및 Exe(B) 주사 후 생식소에서의 ER의 발현변화를 나타낸 것이다.
미성숙 암컷을 이용한 성질이 다른 두 아로마타제 억제제의 효과를 분석하였다. 미성숙 개체를 이용하여 아로마타제 억제제 중 스테로이드인 Exe 및 비스테로이드인 Ana 비교 실험한 결과, 두 물질 모두 ER 및 VTG의 mRNA의 생성을 억제하는 효과가 유사한 것으로 나타났다. 하지만, 스테로이드 물질인 Exe 보다 비스테로이드 물질인 Ana에서 유의적으로 효과가 다소 낮은 것으로 나타났다. 아로마타제 억제제의 효능은 Tam의 투여군보다는 효과가 큰 것으로 나타났다(도 9 및 도 10).
ER의 합성 유도에 있어서도 VTG의 합성과 유사한 결과를 나타내었으며, Exa가 Ana에 비해 높은 억제효과를 가져왔다. 생식소에서의 ER에 대한 변화도 간세포에 나타난 결과와 유사한 결과를 나타내었다(도 11). 이를 통해, 두 종류의 아로마타제 억제제는 생식소에서 E2의 합성을 억제시켜 혈중 E2 농도를 낮춤으로써 성 성숙을 억제하는 물질로 Tam에 의한 ER 합성 억제에 비교하여 더 높은 성 성숙 억제 효과를 가지는 것으로 예측하였다.
3. GnRH 억제제인 도파민(Da)의 성 성숙 억제효과
(1) Da 투여 후의 미성숙 암컷의 뇌하수체 GnRH 및 GtH의 발현변화
도 12는 미성숙 암컷 넙치 뇌하수체에서의 Da 투여 후, GnRH 유전자 발현(A), GtH 유전자 발현(B), 그리고 미성숙 암컷 넙치에 Da 주사 후 생식소에서 ER 유전자 발현(C)을 나타낸 것이다.
도 12를 살펴보면, Da를 미성숙 넙치에 복강 투여 후 시상하부에서 GnRH는 성 성숙시기를 조건으로 설계된 E2 투여 후 Da 투여 시에는 변화가 없었으나, 장시간의 Da 투여 조건인 E2+Da의 조건에서는 유의하게 억제하는 것으로 나타났다. 따라서, 미성숙 시기에 Da를 투여하는 것이 보다 효과적인 적으로 평가되었다. 한편 Da를 미성숙 넙치에 복강 투여 후 뇌하수체에서 GtH의 발현량은 성숙시기에 있어서도 GtH의 발현을 억제하였으며, 성숙 시기 이전의 단계에 투여할 경우 보다 효과적인 감소 작용을 유도하는 것으로 판단되었다.
이를 통해, Da는 GnRH의 의해 방출되는 GTH를 억제하여 생식선의 발달과 성 스테로이드 호르몬의 분비를 억제하는 역할을 하는 것으로, 넙치에서는 미성숙 단계에 사용하는 것이 보다 효과적임을 확인할 수 있다.
(2) 미성숙 암컷 넙치에 도파민 투여 후 생식소에서 에스트로겐 수용체(ER) 발현변화
Da를 미성숙 넙치에 복강 투여 후 생식소에서 ER 유전자 발현을 평가한 결과, GtH의 감소 추세와 유사한 결과를 나타내었다. 이것은 Da의 투여에 따른 GtH의 감소에 의해 E2의 분비가 억제되어 전반적으로 ER의 발현 또한 억제된 것으로 추정된다. 반면, GtH에서 나타난 Da 단독 투여군의 시간 경과에 따른 감소 현상은 나타나지 않았다.
이러한 결과를 통해, Da가 넙치에 있어서도 GtH 생성을 억제하며, 특히 초기의 성 성숙 단계에 Da를 투여함으로써 보다 효과적인 성 성숙 제어가 가능할 것으로 예측되었다.
[실시예 3] 생식소 중량 지수(Gonadsomatic index, GSI)의 변화
도 13은 Exe(A), Ana(B), Tam(C) 및 Da(D) 투여군의 생식소 중량 지수 결과를 나타낸 것이다.
도 13을 살펴보면, 생식소 중량 지수의 결과는 직접적인 E2 효과를 억제하는 Tam을 투여하였을 때 가장 억제하는 작용을 나타내는 것으로 나타났다. Exe 및 Ana의 경우에 있어서도 생식소 중량 지수는 감소되는 경향을 보였으나, Tam에 의한 작용보다는 크지 않았다. Da의 경우는 E2와의 혼합 투여군에서는 큰 변화가 나타나지 않았다.
[실시예 4] 생식소의 조직학적 변화
도 14 및 도 15는 성 성숙을 억제하는 화학물질의 투여에 따른 생식소의 조직학적 변화를 나타낸 것이다. 도 14(A)는 Exe, 도 14(B)는 Tam, 도 15(A)는 Ana, 도 15(B)는 Da 투여군의 결과이며, a는 대조군 (6일차), b는 에스트라디올 17β (estradiol 17, E2) (6일차), c는 E2+화학물질 (3일차), d는 화학물질 (3일차), e는 E2→화학물질(6일차), f는 E2→화학물질(6일차), g는 화학물질(6 days), OC(oocyte)는 난모세포, SC(spermatocyte)는 정모세포, SG(spermatogonia)는 정원세포를 나타낸다.
각각의 화학물질 투여군에서 생식소 발달과정, 예를 들어 생식세포의 성숙을 지연시키는 결과를 나타내었다. 특히 Tam 투여군에서는 간성의 특성인 정모세포는 관찰되지 않았다(도 14(B)). 반면, Exe, Ana 및 Da의 투여군에서는 간성이 발견되어 성 성숙의 억제뿐 만이 아니라 성호르몬의 변화도 초래하였다. 따라서, Exe, Ana 및 Da의 투여군에서는 넙치의 웅성화를 유도할 가능성이 높을 것으로 예측되었다.
이러한 결과를 통해, Tam의 경우에는 에스트로겐 수용체의 발현을 억제하여 성 성숙을 일시적으로 멈추게 하는 작용을 하는 것으로 예측되며, 아로마타제 억제제는 에스트로겐 합성을 억제하는 대신에 웅성호르몬의 생성을 촉진하여 간성을 유도하는 것으로 판단하였다. 한편, Da의 경우에는 FSH의 발현을 억제하는 작용을 통하여 미성 성숙 시기에서의 단계에 그 작용이 크고, 수컷에서 주로 작용하여 웅성호르몬을 생성하는 LH의 반응을 억제하지 못함으로 인해 간성의 개체가 나타난 것으로 추측하였다.
[실시예 5] 사료 공급을 통한 성 성숙 억제 유효성 평가 실험
도 16은 사료 내 Ana 및 Exe 첨가 급이에 따른 간에서의 ER(A) 및 VTG(C) 발현과 생식소에서의 ER(B)의 발현을 나타낸 것이며, 도 17은 사료 내 Tam 및 Da 첨가 급이에 따른 간에서의 ER(A) 및 VTG(C) 발현과 생식소에서의 ER(B)의 발현을 나타낸 것이다. 아로마타제 억제제인 아나스트로졸 및 엑스메스탄, 항-에스트로겐인 타목시펜과 도파민 5mg을 99.9% 에탄올(ethanol)에 녹여 10ml의 솔루션(solution)을 제작 후 시중에 판매하는 tetra-min 사료에 분무기로 분사하여 코팅 후 dry oven에서 24시간 건조시킨 후 사료 첨가 하였다.
도 17 및 도 18을 살펴보면, 사료 내에 Ana 및 Exe를 첨가하여 급이한 결과에 있어서도 복강 투여(복강 주사)를 이용한 방법과 유사하게 ER 및 VTG 유전자 발현이 감소하였다. 따라서, Tam 및 Da의 사료 내 첨가 급이에 의해서도 ER 및 VTG 생성 억제효과를 나타내어 복강 투여가 아닌 사료 공급으로도 성 성숙의 억제효과를 가짐을 확인할 수 있다.
이를 통해, 집단 사육으로 이루어지는 양식어류에 대하여 성 성숙 화학물질의 사료 내 첨가 공급을 통하여 성 성숙의 억제효과를 거두어 산업적 활용기술로 접목 가능할 것으로 예측하였다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> Jeju National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Composition comprising chemical material for inhibiting gonadal maturation in fishes and method for inhibiting gonadal maturation in fishes using the same <130> DP20200065 <160> 6 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VTG forward primer <400> 1 cacagactgg gcagaccata 20 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VTG reverse primer <400> 2 agcaaaatgc ggagctgta 19 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ER forward primer <400> 3 tggctgagat cttcgacatg c 21 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ER reverse primer <400> 4 tgtcctgaac tggctgaaga 20 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Beta actin forward primer <400> 5 tgaaccctaa agccaacagg gaga 24 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Beta actin reverse primer <400> 6 tgatgctgtt gtaggtggtc tcgt 24

Claims (6)

  1. 도파민을 유효성분으로 포함하는, 넙치의 성 성숙 억제용 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 넙치의 생식 세포의 성숙을 지연시키는 것임을 특징으로 하는, 넙치의 성 성숙 억제용 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 넙치용 사료 조성물인 것을 특징으로 하는, 넙치의 성 성숙 억제용 조성물.
  4. 도파민을 유효성분으로 포함하는 조성물을 주입하는 단계를 포함하는, 넙치의 성 성숙 억제 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 성 성숙 억제 방법은 넙치의 생식 세포의 성숙을 지연시키는 것임을 특징으로 하는, 넙치의 성 성숙 억제 방법.
  6. 제4항에 있어서, 상기 주입은 복강 투여 또는 사료 내 첨가하여 공급하는 것임을 특징으로 하는, 넙치의 성 성숙 억제 방법.
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