KR102430543B1 - 하이드로겔 스폰지 내 h2o2 함입 plga 마이크로구체를 포함하는 창상피복재 및 이의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 하이드로겔 스폰지 내 H₂O_2-함입 PLGA 마이크로구체를 포함하는 창상피복재의 제조방법 및 이를 통해 제조되는 창상피복재에 관한 것이다.
본 발명의 창상피복재는 용매증발법을 이용하여 H₂O₂를 함입하는 PLGA 마이크로구체 내에 H₂O₂를 함입하고 이를 알긴산 기반의 하이드로겔 스폰지 내에 포함한다. 이에 따라 H₂O₂가 적절한 속도로 방출되고, 창상에 산소가 공급되어 조직의 재생을 돕는다.

Description

하이드로겔 스폰지 내 H2O2 함입 PLGA 마이크로구체를 포함하는 창상피복재 및 이의 제조방법 {WOUND DRESSING COMPRISING H2O2 EMBEDDED PLGA MICROSPHERES INTO HYDROGEL SPONGE AND MANUFACTURING METHOD THEREOF}

본 발명은 하이드로겔 스폰지 내 H₂O₂ 함입 PLGA 마이크로구체를 포함하는 창상피복재의 제조방법 및 이를 통해 제조되는 창상피복재에 관한 것이다.

상처의 처치는 의학의 기초로, 오랜 역사를 가지고 있다. 파피루스에 의하면 기원전 5000년 전부터 상처 치료를 위하여 동물기름이나 벌꿀, 면화를 이용한 것으로 기록되어 있다. 역사가 흐르면서 상처의 치료기술에도 많은 변화와 발전이 이루어졌다. 1962년 동물학자 윈터(Winter)가 상처를 건조하게 하여 가피(딱지)가 생기게 하는 것보다 상처를 습윤하게 유지하는 것이 더 치유에 도움이 된다는 연구 논문을 발표한 이후로, 습윤 상처 처치의 유용성이 지속적으로 입증되고 강조되어 왔다. 상처에서 분비되는 체액이 탈수되거나 건조되지 않도록 하는 습윤환경 상처처치(Wet dressing)방법은 현재 상처 치료를 용이하게 하는 것으로 확인되고 있다.

이상적인 창상피복재는 상처와 창상피복재 사이의 습윤환경 유지, 적절한 흡수성 및 투습성이 있어야 하고 상처면의 건조를 막고 주변 정상 피부의 짓무름이 일어나지 않도록 해야 한다. 또한 가스의 교환, 외부로부터의 세균침입 방지 등의 기능성을 갖고, 교환시 상처면에 달라붙어 신생조직 등에 손상을 입히지 않아야 한다. 이 밖에도 상처 치유 상태를 용이하게 관찰할 수 있고 무자극성이며 사용이 용이하고 경제적이라면 이상적인 창상피복재가 될 수 있다. 이러한 이상적인 조건들을 모두 만족시키는 창상피복재를 개발하기 위한 연구노력은 지금도 계속되고 있다.

한편, 인체의 조직에서 산소의 농도는 생물학적 과정을 통해 조절되며 상처 치유에 매우 중요하다. 새로운 조직이 재생되기 위해서는 산소 공급이 필수적이다. 산소는 미세 혈관 형성에 앞서 세포와 조직의 유지 및 분화에 필수적인 요소이기 때문이다. 산소는 상처의 감염을 예방하고, 혈관 신생을 유도하여 각화 세포 분화를 촉진하고, 섬유아세포의 증식 및 이동을 통한 재상피화를 촉진하고 콜라겐 합성을 유도함으로써 치유를 촉진한다.

산소가 일정 시간 내에 공급되지 않으면 조직의 기능이 손상되고 조직 신생 혈관 생성이 올바른 방식으로 진행되지 않는다. 카탁 연구팀은(Khattak S.F. et al)은 세포 대사 및 세포 생존력을 향상시킬수 있는 산소 전달 매트릭스를 제공하는 퍼플루오로 탄소가 탑재된 알긴산 구형 캡슐(perfluorocarbon-loaded alginate spherical capsules)을 보고하였다. 최근에는, 오 연구팀은(Oh et al) 신생 혈관(neovascularization)과 같은 감염 부위에서 큰 상처를 치유하기 위한 제한 요소를 극복하기 위해 폴리락트산-글리콜산 공중합체 (poly(lactic-co-glycolic acid), PLGA)과 과산화칼슘이 함께 결합 된 산소 생성 스캐폴드를 보고하였다.

그러나 대사 과정에서 생성되는 부산물 (염)은 조직의 pH를 변화시켜 조직의 손상을 유발할 수 있는 대사 반응을 일으키고 산소 방출 속도를 감소시킨다는 문제점이 있었다. 따라서, 산소 방출을 제어할 수 있는 이상적인 산소 발생 시스템의 개발이 요구되었다.

본 발명에서는 이러한 한계를 극복하기 위해 다양한 범위에 사용될 수 있는 마이크로구체를 개발하였다. 과산화수소 (H₂O₂)는 PLGA 산소 방출 마이크로구체(Oxygen-Releasing Microsphere, ORM)에 캡슐화되어 소독제로서의 H₂O₂ 또는 산소의 방출을 유도할 수 있으며, 이 시스템을 사용하여 다양한 친수성 약물을 캡슐화할 수 있으며, 약물 전달 시스템으로 사용할 수 있다. 또한 본 발명에서는 상처 치유 및 조직 재생을 위한 혈관 내피 세포의 형성을 향상시킬 수 있는 기능성 산소 방출 하이드로겔 스폰지 (Oxygen-Releasing Hydrogel Sponge, ORHS)를 개발하였다.

Zhenqing Li et al, Biomaterials, Vol. 33, 5914-5923, 2012

본 발명의 발명자들은 상처 치유 및 조직 재생을 위하여 혈관 내피세포의 형성을 향상시킬 수 있는 하이드로겔 스폰지 내 H₂O_2-함입 PLGA 마이크로구체를 포함하는 창상피복재를 개발하였다. 상기 창상피복재를 피부 결함에 대한 효과적인 치료제로 사용하기 위해 H₂O₂ 함입 PLGA 마이크로구체를 3D 하이드로 겔 구조 (습식 드레싱)에 분산시켜 산소 농도를 제어하고 상처 표면을 덮어 감염을 예방하는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

그러므로, 본 발명은 하이드로겔 스폰지 내 H₂O₂ 함입 PLGA 마이크로구체를 포함하는 창상피복재를 제공하는 것을 목표로 한다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 하나의 양태는

과산화수소를 캡슐화하는 폴리락트산-글리콜산(poly(lactic-co-glycolic acid); PLGA) 공중합체를 포함하는 입자; 폴리비닐 알콜; 알긴산나트륨; 및 폴리-L-리신 하이드로브로마이드;를 포함하는 창상 피복재를 제공한다.

상기 과산화수소를 캡술화하는 폴리락트산-글리콜산(poly(lactic-co-glycolic acid); PLGA) 공중합체를 포함하는 입자는 과산화수소를 폴리락트산-글리콜산 공중합체 (poly(lactic-co-glycolic acid); PLGA)가 둘러싸는 구조를 가짐으로써 고농도일 경우 조직에 손상을 줄 수 있는 과산화수소를 저농도로 조직에 안전하게 전달하여 창상에 산소를 공급하는 원리를 통해 우수한 치료 효과를 발휘할 수 있다.

본 발명의 상기 과산화수소를 캡술화하는 폴리락트산-글리콜산(poly(lactic-co-glycolic acid); PLGA) 공중합체를 포함하는 입자는 평균적으로 25 ㎛ 내지 250 ㎛의 크기를 가질 수 있으나, 반드시 이에 제한되는 것은 아니며, 상기 크기 범위에서 벗어나는 입자도 본 발명의 입자로 활용될 수 있다.

본 발명의 상기 "폴리락트산-글리콜산 공중합체" (poly(lactic-co-glycolic acid); PLGA)"는 하기 화학식 1의 구조식을 가지는 생분해성 고분자를 의미한다.

[화학식 1]

(상기 x는 락트산의 단위수, y는 글리콜산의 단위수임)

상기 PLGA는 과산화수소를 창상에 안전하고 저농도로 전달하기 위해 과산화수소를 함입하는 입자를 구성한다.

상기 PLGA는 생체 내에서 가수분해에 의하여 락트산(젖산)과 글리콜산으로 전환되며 최종적으로는 이산화탄소와 물로 배출된다. PLGA는 이와 같은 생분해성과 생체적합성을 가져 세포운반체 재료로서 미국 FDA의 승인을 받은 바 있으며, 생체흡수성 골절합용 플레이트, 스크루와 치과재료용 조직수복 멤브레인, 소아 경골과 골절 치료용 흡수성 핀, 봉합사 재료 등 조직 공학용 재료로서 다양하게 활용되고 있다.

본 발명의 PLGA는 이에 국한되지는 않으나, 상업적으로 구매할 수 있으며, 예를 들어 시그마 알드리치 등에서 구입할 수 있다.

본 발명의 상기 "폴리비닐알콜"은 인체 독성을 지닌 가교제를 사용하지 않고서도 생체적합성이 우수하며, 또한 매우 짧은 시간에 우수한 기계적 물성을 갖는 하이드로겔을 제조할 수 있어, 과산화수소-PLGA 코어-쉘 구조를 갖는 입자를 함유하면서도 물성이 뛰어난 하이드로겔을 제조하기 위해 사용되었다.

본 발명의 상기 "알긴산나트륨"은 약하게 결합하는 내부구조를 형성하는 콜로이드 혼합물로서 용액상에 용해되어 겔을 형성하는 제제를 의미하며, 동시에 창상재의 수분을 유지시키는 역할을 수행한다.

분산매질에 임의의 방식으로 알긴산나트륨을 첨가하는 경우 엉기는 경향이 있으므로 균일한 겔화가 어렵고 더욱 많은 시간을 필요로 할 수 있다. 따라서 보다 효율적인 겔화를 위해서는 매질을 교반하면서 조금씩 첨가하는 것이 바람직할 수 있다.

특히, 본 발명에서는 폴리-L-리신 하이드로브로마이드와의 정전기적 인력을 통한 창상피복재의 물성 확보를 위해 음전하를 갖는 알긴산나트륨이 사용된다.

본 발명의 상기 "폴리-L-리신 하이드로브로마이드"는 물성이 약한 알긴산나트륨 기반 하이드로겔의 물성 확보를 위해 코팅되며, 특히, 본 발명에서는 음전하를 띄는 알긴산나트륨과의 정전기적 인력을 통한 창상피복재의 물성 확보를 위해 양전하를 갖는다.

본 발명의 상기 "창상피복재"는 피부조직에 창상이 발생하면 창상부위는 박테리아, 세균, 바이러스 등 외부의 다양한 감염인자에 직접적으로 노출되는 것을 방지하기 위해, 창상의 표면을 창상피복재 등으로 덮어주어 창상 부위가 외부에 노출되는 것을 막고 외부로부터 창상을 보호하여 일차적인 감염을 방지하는 역할을 한다. 더불어 창상 부위의 습윤 정도를 유지시켜 창상 부위와 창상 주변 조직의 체액이 손실되는 것을 방지하고 치료 과정 중에 발생할 수 있는 조직의 수축을 예방하여 이차적인 피부 조직 손상이 일어나는 것을 방지한다. 또한, 창상피복재는 조직의 형태나 움직임에 따라 유연하게 적용할 수 있어야 하며, 강한 물성 외에 삼출액의 흡수성과 공기 투과성, 박테리아의 침투와 번식을 막는 특성 등이 우수해야 하고, 생체에 적용했을 때 적합하고 안전한 재료로 부작용의 위험이 적은 재료로 구성되어 있어야 한다.

본 발명의 일 구체예에서 상기 과산화수소는 2.0 내지 6.0 중량%인 것이며, 본 발명의 구체적 실시양태에 따르면 과산화수소는 4.0 중량% 인 것일 수 있다. 그러나, 반드시 이에 제한되는 것은 아니며 적절한 과산화수소의 중량 비율이 자유롭게 선택될 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서 상기 폴리비닐 알콜은 2.0 내지 5.0 중량%인 것이며, 본 발명의 구체적 실시양태에 따르면 폴리비닐 알콜은 3.5 중량%인 것일 수 있다. 그러나, 반드시 이에 제한되는 것은 아니며 적절한 폴리비닐 알콜의 중량 비율이 자유롭게 선택될 수 있다.

또한, 상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 하나의 양태는 폴리락트산-글리콜산 공중합체 (poly(lactic-co-glycolic acid); PLGA); 폴리비닐 알콜; 및 알긴산나트륨을 포함하는 창상 피복재 제조용 조성물을 제공한다.

상기 창상 피복재 제조용 조성물은 상기 언급된 폴리-L-리신 하이드로브로마이드를 추가로 더 포함할 수 있다.

본 발명의 창상 피복재 제조용 조성물을 활용하여 과산화수소를 함입하는 PLGA를 입자를 제조한 후, 이를 폴리비닐알콜과 2회 이상 혼합 및 교반한 후, 알긴산나트륨, 염화칼슘 등을 첨가하여 하이드로겔을 형성한 후 이를 폴리-L-리신 하이드로브로마이드에 코팅하여 창상피복재를 제조할 수 있다.

상기 폴리락트산-글리콜산 공중합체, 폴리비닐 알콜, 알긴산나트륨 및 염화칼슘은 상기 정의하였던 것과 동일한 의미를 갖는다.

또한, 상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 하나의 양태는

(1) 폴리락트산-글리콜산 공중합체(poly(lactic-co-glycolic acid); PLGA)를 용매 내에 용해시킨 후 과산화수소를 첨가하고 교반하는 단계로서, 상기 용매는 아세토니트릴, 아세톤, 에틸 아세테이트 및 디클로로메탄으로 이루어지는 군에서 어느 하나 이상 선택되는 것;

(2) (1) 단계의 혼합물을 폴리비닐 알콜과 혼합하여 교반하는 단계를 2회 이상 반복하는 단계;

(3) (2) 단계의 혼합물을 여과하고 건조하는 단계;

(4) (3) 단계의 생성물을 알긴산나트륨에 첨가하고 혼합하는 단계;

(5) (4) 단계의 생성물에 염화칼슘을 첨가하고 건조시키는 단계; 및

(6) (5) 단계의 생성물을 폴리-L-리신 하이드로브로마이드 내에 첨가하여 코팅시키는 단계;

를 포함하는 창상피복재의 제조방법을 제공한다.

상기 폴리락트산-글리콜산 공중합체, 폴리비닐 알콜, 알긴산나트륨, 염화칼슘 및 폴리-L-리신 하이드로브로마이드는 상기 정의하였던 것과 동일한 의미를 가진다.

상기 제(1)단계에 의해 과산화수소를 함입하며 PLGA를 포함하는 입자가 형성될 수 있다. 제(1)단계의 용매는 PLGA가 용매될 수 있는 임의의 용매가 사용될 수 있으며, 상기 용매는 아세토니트릴, 아세톤, 에틸 아세테이트 및 디클로로메탄으로 이루어지는 군에서 어느 하나 이상 선택되는 것일 수 있으나 반드시 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 제(2)단계는 용매증발법에 의해 폴리비닐 알콜과 과산화수소 함입 PLGA 입자가 혼합되어 생체적합성이 우수하며, 기계적 물성이 뛰어난 하이드로겔을 단시간 내에 제조할 수 있게 한다.

상기 (3) 단계 여과 단계는 여과 방법에 있어 제한되는 것은 아니나 공극을 갖는 도구를 이용하여 여과되는 것일 수 있으며 본 발명의 구체적인 실시 양태에 따르면 상기 공극을 갖는 도구는 체이다. 상기 도구는 30 내지 280 μm의 공극을 갖는 것일 수 있으며, 본 발명의 구체적 실시양태에 따르면 50 내지 250 μm의 공극을 갖는 것이다.

상기 제(4)단계에서 알긴산나트륨에 본 발명이 혼합물을 첨가함으로써 본 발명의 혼합물을 겔화시킬 수 있으며, 상기 사용되는 알긴산나트륨은 음전하를 띄는 것을 특징으로 한다.

상기 제(5)단계에서 염화칼슘을 첨가함으로써 하이드로겔의 내부 네트워크를 형성하고 팽창시킬 수 있다.

상기 제(6)단계에서 폴리-L-리신 하이드로브로마이드에 본 발명의 하이드로겔을 코팅함으로써 창상피복재에 요구되는 적절한 물성을 확보할 수 있다. 이때 상기 폴리-L-리신 하이드로브로마이드는 양전하를 띔으로써 음전하를 띄는 알긴산나트륨과의 정전기적 인력에 의해 기계적 물성이 확보된다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 또 다른 양태는 상기 제조방법 중 어느 하나의 제조방법으로 제조된 창상피복재이다.

중복되는 내용은 본 명세서의 복잡성을 고려하여 생락하며, 본 명세서에서 달리 정의되지 않은 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 의미를 갖는 것이다.

본 발명은 하이드로겔 스폰지 내 H₂O₂ 함입 PLGA 마이크로구체를 포함하는 창상피복재의 제조방법 및 이를 통해 제조되는 창상피복재에 관한 것이다.

본 발명의 창상피복재는 용매증발법을 이용하여 H₂O₂-PLGA 마이크로구체 내에 H₂O₂를 함입하고 이를 알긴산 기반의 하이드로겔 스폰지 내에 포함한다. 이에 따라 H₂O₂가 적절한 속도로 방출되고, 창상에 산소가 공급되어 조직의 재생을 돕는다.

도 1은 본 발명의 창상피복재의 개념도를 나타낸 것이다.
도 2의 (A)는 이중 에멀젼 용매 증발법에 의한 코어쉘 H₂O₂-PLGA 마이크로 구체의 캡슐화 공정을 나타낸 것이고, (B)는 ORHS의 제조 과정에 대한 개략도를 나타낸 것이다.
도 3은 래트의 등에 0.8cm 직경의 피부 전체 두께에 해당하는 상처를 펀칭(punching)으로 생성시킨 후, 미처리 그룹, 거즈 그룹, 알긴산 그룹, ORHS 그룹을 비교한 것이다.
도 4는 전계방사 주사전자현미경을 이용해 형태학적 특성을 확인한 것으로 (A)는 알긴산 그룹, (B)는 ORHS 그룹을 나타낸 것이다.
도 5는 용해된 산소의 방출 특성을 나타낸 것으로(n=5), (A)는 알긴산 그룹, (B)는 ORHS 그룹을 나타낸 것이다.
도 6은 알긴산 그룹과 OHS 그룹 내 세포 증식을 분석(CCK-8 분석)한 것이다.
도 7은 HaCaT 세포를 이용한 스크래치 상처의 봉합 모델을 나타낸 것으로 (A)는 미처리군, (B)는 알긴산 그룹, (C)는 ORHS 그룹을 나타낸 것이다.
도 8은 수술 후 시간 변화에 따른 상처의 형태 및 수술 후 상처가 아무는 정도를 그룹 별로 나타낸 것이다.
도 9는 각각 (A) 미처리 그룹, (B) 거즈 그룹, (C) 알긴산 그룹, (D)ORHS 그룹의 수술 후 7일째 조직학적 관찰 결과를 나타낸 것이다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 산소방출 하이드로겔 스폰지(Oxygen-Releasing Hydrogel Sponge; 이하 ORHS)의 제조

드레싱(dressing)을 피부 결함에 대한 효과적인 치료제로 사용하기 위해 H₂O₂를 3D 하이드로겔 스폰지의 PLGA 마이크로구체 내에 분산시켜 산소 농도를 조절하고 상처 표면을 덮어 1차 감염을 예방하였다(도 1).

PLGA 마이크로구체 내 H₂O₂를 용매 증발법(W₁/O/W₂)을 사용하여 제조하였다. 200mg의 폴리락트산-글리콜산 공중합체 (poly(lactic-co-glycolic acid), PLGA, lactic acid/glycolic acid, LA:GA, 50:50, MW = 11,000 g/mol, Boehringer Ingelheim, Ingelheim am Rhein, Germany)을 1.5mL 디클로로메탄(dichloromethane, DCM, Junsei Chemical, Tokyo, Japan) (O로 표시) 내에 용해시켰다. 그 후, 750 μL 4.0 중량%의 과산화 수소 (H₂O₂, 50 중량%, Sigma, St. Louis, MO, USA) (W₁으로 표시)를 혼합물에 첨가한 후, 고속으로 교반하여 에멀젼으로 변환시켰다[W₁/O]. 그 후, 상기 [W₁/O] 에멀젼을 4mL 3.5 중량%의 폴리비닐 알콜 (PVA, MW = 9000-11,000 g/mol, Sigma, St. Louis, MO, USA) (W₂로 표시) 용액 내에 천천히 첨가하고 30초간 고속으로 교반하였다. 그 후, (W₁/O/W₂) 에멀젼을 40mL 3.5 중량%의 PVA 내에 천천히 첨가한 후 상기 속도를 800rpm으로 조절하였고 반응을 실온에서 4시간 동안 진행시켰다. 반응이 완료된 후, 코어쉘 H₂O₂-PLGA 마이크로 구체(산소-방출 마이크로 구체, oxygen-release microspheres; 이하 ORM)를 50 내지 250 μm 공극을 갖는 체로 여과하였고 증류수로 3회 씻어 미반응 물질을 완전히 제거하였다. 순수한 ORM을 상온에서 18시간 건조하였고 이후 사용을 위해 -20℃에서 보관하였다(도 2A).

ORHS를 동결 건조 방법을 사용하여 제조하였다 20mg의 ORM을 20mL 1.0 중량%의 알긴산나트륨 (LVG, viscosity: 20-200 mPa-s, NovaMatrix, Sandvika, Norway)에 첨가하였고 균일하게 혼합하였다. 그 후, 500 μL의 분취 액을 각 웰(웰 크기: 85.4 x 127.6mm, 높이 9.75 mm), 내에 분배하였고, 48시간 동안 동결 건조를 위해 플레이트를 동결건조기(Ilshin Lab, FD5505, Gyeonggi-do, Korea) 내에 배치하였다. 그 후, 1 중량% 염화 칼슘 무수물 (CaCl₂-2H₂O, Sigma, St. Louis, MO, USA)을 각 웰에 첨가하였고, 플레이트를 24시간 동안 상온에 두어 가교 결합이 발생하도록 하였고, 그 후 플레이트를 증류수 및 95% 에틸알콜로 5회 씻어 칼슘 용액을 완전히 제거하였다. 플레이트는 동결 건조를 위하여 48시간 동안 동결 건조기 내부에 배치하였고, 그 후 폴리-L-리신 하이드로브로마이드(Poly-L-lysine hydrobromide, PLL, Sigma, St. Louis, MO, USA) 0.1 중량% 내에 담가 5분간 코팅하였다. 증류수로 3회 세척한 후 동결 건조기 내에 완전히 건조시켰고 이후 사용을 위해 -20℃에서 보관하였다(도 2B).

본 발명에서 사용된 모든 화학물질 및 용매는 분석 시약 등급이었다.

실시예 2. ORHS의 형태학 분석

상처 드레싱의 표면 및 단면을 형태학적으로 분석하기 위해 전계방사 주사전자현미경 (Field emission scanning electron microscope, FE-SEM, HitachiS-4300&EDX-350, Hitachi, Tarrytown, NY, USA)을 사용하였다. 공극률측정기(Porosimeter, MicrometricsAutoPore IV9520, Micrometrics, Norcross, GA, USA)를 드레싱의 표면적 뿐만 아니라 공극의 크기와 부피를 평가하기 위해 사용하였다.

그 결과, ORHS의 표면과 단면을 주사 전자 현미경으로 관찰하였을 때, 제조된 ORHS의 표면은 다공성인 것을 관찰하였는데, 이는 세포 접착을 허용하고 세포 생존을 촉진시킨다는 것을 암시하였다(도 4B).

제조된 ORHS의 다공성은 총 기공 표면적이 2.1 m²/g으로 90.5%였고, 반면 대조군 내 알긴산 그룹의 다공성은 총 기공 표면적이 7.1 m²/g으로 96.8%였다. ORHS는 대조건보다 불규칙한 다공성 구조를 가졌으며, 표면 및 단면 모두 대조군에 비해 현저하게 감소하였다. 이러한 데이터는 제조된 드레싱 내 총 기공 표면적 및 기공의 부피가 감소하여 ORHS에 다중 기공으로 구성된 개방 구조를 제공함을 나타낸다.

실시예 3. ORHS로부터의 산소 방출 분석

제조된 ORHS로부터의 산소 방출은 산소 측정기(Oxygen meter, Thermo Orion Series, 3 Star, Thermo Fisher, Waltham, MA, USA)를 사용하여 측정하였다. 용해된 산소 (Dissolved Oxygen, DO)를 측정하기 위해 밀폐된 공간에서 실험을 수행하여 환경으로부터 불필요한 간섭을 제거하였고. 모든 측정을 깨끗한 벤치에서 수행하였다. 정량의 드레싱을 20 mL 유리 용기 내부에 봉인하고 3 중량% 표준 카탈라아제 용액 10 mL에 침지하였다가 일정 시간 동안 배양하였다. 그 후, 유리 용기의 캡을 전극으로 대체하여 DO 수준(n = 5)을 측정하였다.

그 결과로 드레싱에 대한 3일간의 장기 산소 방출 프로파일을 도 5에 나타내었다. 산소 방출을 분석하기 위해 DO 수준을 평가한 결과, 초기 높은 산소 방출에도 불구하고 높은 표면적으로 인해 DO 값이 3일 후에 급격히 감소함을 관찰하였다. 따라서, 제조된 ORHS는 사용 3일째까지 산소 수준을 유지할 수 있는 것으로 나타났다.

실시예 4. ORHS 내 함유된 H ₂ O ₂ 방출 분석

제조된 ORHS 내 함유된 H₂O₂ 수준을 측정하기 위해, 과산화수소 키트(s-1150, Scinco, Co. Ltd., Seoul, Korea)를 정량 분석을 위해 사용하였으며, Cell Biolabs Inc., San Diego, CA, USA에 의해 승인된 하기의 프로토콜을 사용하였다. 현탁액 샘플을 24-웰 플레이트의 각 웰 내에 분배하였다. 250 μL의 지질 작용 시약 용액(lipid working reagent solution), (0.250 mL xylenolorange + 0.250 mL AFS + 25 μL BHT + 24.475 mL 90% MeOH) 을 첨가한 후, 플레이트를 24℃에서 30분 동안 배양하였다. 그 후, 각 웰 플레이트의 광학 밀도(optical density, OD)를 595 nm에서 측정하였고 ELISA-판독기를 사용하여 분석하였다(n=5). 이에 따른 ORHS 내 과산화수소 탑재 효율을 하기 표 1에 나타내었다.

대조군의 H2O2 c (n=5)	중량	총 H2O2 μM/탑재 효율(%)b
ORHSa	10.0mg	5.822/0.44 ± 0.0568

^a: [미처리]-[ORHS]; ^b: (H₂O₂ ^a/4.0% ORHS) x 100%; ^c: y = 0.0048x + 0.1344 R² = 0.9946; 대조군: 4.0 중량% H₂O_2.

H₂O₂ 함유 PLGA 마이크로구체로부터 방출된 H₂O₂ 농도는 6.6 μM이었고 ORHS로부터 방출된 H₂O₂ 농도는 5.8 μM이었다(표 1).

인간 체내 H₂O₂ 노출에 대한 내성의 최대 수준은 29.4 μM인데, 이는 방출된 H₂O₂ 수준이 내성 한계보다 낮기 때문에 ORHS의 내약성이 우수하고 인간 체내에서 안정적으로 유지될 수 있다는 것을 암시한다.

실시예 5. 세포 생존률에 대한 ORHS의 생체적합성 분석

저산소 상태 하에 인간 제대 정맥 내피 세포(human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)의 생존률 또한 스캐폴드(scaffold) 상에서 소비된 시간에 따라 평가하였다. 10% FBS, 500 U/mL 페니실린 및 500 μg/mL 스트렙토마이신을 함유하는 내피 세포 기본 배지-2 (Endothelial cell basal medium-2, EBM-2, Lonza, Walkersville, MD, USA)를 성장 배지로 사용하였고 상기 세포를 5% 이산화탄소 배양기 내 37℃에서 배양하였다. 드레싱의 세포 생존율을 분석하기 위해, 세포 밀도가 1x10⁵ 세포/웰인 세포 현탁액을 웰 내에 접종하였다. 본 실시예에서는 웰 내에 세포를 삽입하여 이식한 3개의 샘플을 제조하였다.

그룹 1은 미처리군을 이식하였다(대조군을 비교 분석을 위해 사용하였다). 그룹 2는 비-산소 방출 하이드로겔 스폰지(알긴산 포함)를 이식하였다. 그룹 3은 산소-방출 하이드로겔 스폰지(Oxygen Releasing Hydrogel Sponge, ORHS)를 이식하였다.

1, 2, 3, 4, 5, 6, 7일 동안 저산소 상태 (1% O₂, 5% CO₂, 94% N₂, Model MIC-101, Billups-Rothenberg) 하에서 48시간 동안 세포를 배양하였다.

배양 후, 세포에 고 수용성 테트라졸륨염(CCK-8, Dojindo Laboratories, Tokyo, Japan)을 첨가하였고 4시간 동안 추가로 5% 이산화탄소 배양기 내에 37℃에서 배양하였다(오렌지 색 반응의 끝이라는 신호이다).

450nm에서의 광학밀도를 ELISA-판독기를 사용하여 측정하여 세포 생전률에 대한 효과를 평가하였다(n=5).

그 결과 동일한 수의 세포를 접종한 실험군 (ORHS)의 세포 생존율 및 증식률은 대조군(알긴산 포함)과 비교하여 유의미한 차이가 없었다 (도 6). 그러나 7일 동안 HUVEC 세포 증식 속도와 비교함에 따라 산소 방출에 노출됨에 따라 세포 증식이 약간 향상되었다.

실시예 6. 체외(in vitro) 상처 모델을 사용한 세포 이동 분석

본 발명에서는 피부 재생 연구에 일반적으로 사용되는 인간 각질 세포 세포주 (the human keratinocyte cell line, 이하 HaCaT)를 사용하여 시간 의존적 세포 이동을 분석하여 상처 치유 효과를 확인하였다. ORHS의 상처 치유 효과를 분석하기 위해, HaCaT 세포의 이동을 체외 상처-치유 분석(In vitro wound-healing assay)으로 평가하였다. 10% FBS, 500 U/mL 페니실린 및 500 μg/mL 스트렙토마이신(Gibco)을 함유하는 개선된 이글 배지(Modified eagle's medium, MEM, Gibco)를 성장 배지로 사용하였고 상기 세포를 5% 이산화탄소 배양기 내 37℃에서 배양시켰다.

세포 이동 실험을 진행하는 동안, HaCaT 세포 주를 6-웰 플레이트 내에 성장시켰고 전체적으로 충분히 성장하였을 때, 상처를 1mL 블루 팁을 사용하여 생성시켰다. 실험은 3개의 상이한 세포 그룹을 갖는 저산소 조건(1% O₂, 5% CO₂, 94% N₂, Model MIC-101, Billups-Rothenberg) 하에서 수행하였다: 그룹 1은 미처리군을 이식하였다(대조군은 비교 분석을 위해 사용되었다). 그룹 2는 비-산소 방출 하이드로겔 스폰지(알긴산 포함)를 이식하였다. 그룹 3은 산소-방출 하이드로겔 스폰지(Oxygen Releasing Hydrogel Sponge, ORHS)를 이식하였다. 시간 의존적 세포 이동을 0 내지 24시간 동안 현미경 하에 관찰하여 치유에 걸리는 시간을 나타내었다.

그 결과 데이터는 ORHS를 사용한 것이 ORHS 그룹을 사용하지 않은 단순 세포에 비해 더 나은 상처 치유를 나타내는 훨씬 우수한 세포 이동을 나타냈다(도 7). 이러한 데이터는 상처 치유에 대한 산소 공급이 긍정적인 효과를 나타낸다는 것에 대한 간접적 증거를 제공한다.

생체 내 효능 평가

실시예 7. 생체 내 동물 모델을 이용한 분석

본 실험은 영남대학교 의료센터의 동물 관리 및 이용위원회(승인 번호: YUMC-AEC2012-023)의 윤리 기준을 따랐다. 수컷 SD-래트 (체중 250 ~ 300g, 8 주령)에게 염산케타민(ketamine hydrochloride, Ketara, Yuhan Corporation, Seoul, Korea) 및 자일라진(xylazine, Rumpum, Bayer Korea, Seoul, Korea)을 마취제로 근육 내 주사하고, 수술 부위를 면도하였다.

직경 1.0cm x 1.0cm인 진피의 전체 두께를 멧젠바움(Metzenbaum) 조직 가위를 사용하여 등의 각 네 군데에서 제거하였다. 총 4그룹의 샘플이 있었다: 그룹 1에는 두꺼운 진피가 제거된 경우, 즉 미처리군을 이식하였고, 그룹 2에는 거즈를 이식하였고, 그룹 3에는 비산소 방출 하이드로겔 스폰지(알긴산 포함)를 이식하였다. 그룹 4는 산소 방출 하이드로겔 스폰지(Oxygen Releasing Hydrogel Sponge, ORHS)를 이식하였다(도 3). 드레싱을 식염수 용액에 담겼고 피부 결함 영역을 덮는 데 사용하였다. 드레싱의 상부를 폴리우레탄 필름으로 덮어 재료를 보호하였고, 이에 따라 1, 3, 5 및 7일에 시각적 평가를 위해 조직 샘플을 수집하였다.

시각적 분석은 오버 헤드 프로젝터 필름(3M™ CG6000, 3M Science. Applied to Life™, 3M Korea, Seoul, Korea)을 사용하여 SD-래트의 스크래치 크기를 시간에 따라 측정하였으며 면적을 아이솔루션(isolution, 이미지 및 현미경 기술)을 사용하여 영역을 디지털화하여 계산하였다.

그 결과 ORHS를 이용한 창상 그룹에서 상처 크기는 거즈 그룹과 알긴산 그룹보다 작았고 표면 흉터도 개선되었다. 특히 부상 3일 후 ORHS 그룹을 덮는 상처의 크기는 거즈 그룹에 비해 감소하였고 봉합사(suture)를 5 일에서 7 일까지 유지하였다(도 8).

실시예 8. 면역조직학적 분석

7일 후, 이식한 드레싱을 수집하였고 4% 포르말린 완충액 내에 고정시켰고, 알콜로 탈수시켜고 파라핀 블록 내에 삽입하여 마이크로톰(microtome, Leica, Washington, DC, USA)을 사용하여 7 μm 두께 내로 절단하였다.

다음으로, 헤마톡실린-에오신(hematoxylin-eosin, H&E) 및 마손 트리크롬 염색(Masson's-trichrome staining)을 동시에 사용하여 일어난 조직의 면역 반응 뿐만 아니라 신생혈관의 범위의 분석을 세포 유입의 정도와 세포 내부의 핵의 존재를 평가하여 수행하였다.

또한, 상피화(epithelialization)가 일어난 정도(세포 외 기질이 형성되었는지 여부) 또한 평가하였다. 혈관 내피 성장 인자(vascular endothelial growth factor, VEGF)에 대한 염색을 수행하여 혈관 신생의 정도를 평가하였고, 그 후 광학 현미경(Olympus, Tokyo, Japan) 하에 염색 패턴을 관찰하였다.

그 결과 1일 및 7일 째에 각 그룹으로부터 채취한 상처 조직의 면역조직학적 분석은 1일째 염증 세포(적색)의 분포가 ORHS 그룹에서 대조군 또는 ORHS를 사용하지 않은 그룹보다 확연히 구별가능하게 나타났고 피부층의 완전한 형성을 7일 째에 관찰하였다(도 9).

3개의 그룹의 상처 영역 모두에서 호중구(Neutrophils)를 검출하였으나 7일째에는 ORHS가 있는 그룹에서만 약간의 감소가 있었다. 이러한 자료는 산소 방출이 상처 부위의 감염을 예방하고 결과적으로 염증 반응을 감소시킨다는 간접적인 증거를 제공한다.

콜라겐 침착을 검사하기 위한 마손 트리크롬 염색 결과는 상처를 치유하여 섬유아세포(fibroblast) (파란색)의 수를 유의미하게 증가시켰음을 보여주었다.

ORHS 군은 특히 대조군에 비해 파란색으로 염색된 부위가 더 큰 것으로 나타났는데, 이는 산소 방출이 상처 부위 내 콜라겐의 효과적인 합성을 가능케 한다는 것을 나타낸다. 또한, ORHS는 혈관 신생인자 VEGF의 유전자 발현 단계에 기초한 상처 치유 과정을 향상시키는 것을 관찰하였다. ORHS 그룹은 향상된 VEGF 발현을 나타냈으며 상처 치유 과정을 촉진시키는 것 또한 확인하였다.

모든 데이터는 평균 ± 평균의 표준오차로 표현하였다. 수집된 모든 데이터는 t-테스트 및 일원 분산 분석(one-way analysis of variance, ANOVA)을 사용하여 분석하였다.

상이한 데이터를 시그마 플롯 소프트웨어(Sigma Plot software, version 13, Systat Software, Inc., San Jose, CA, USA) 및 마이크로소프트 엑셀 2010(Microsoft Excel 2010, Microsoft, Redmond, WA, USA)을 사용하여 수집하였고 디지털화하였다.

이상과 같이 실시예를 통하여 본 발명을 설명하였다. 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 기술자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 상술한 실험예들은 모든 면에 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해되어야 한다. 본 발명의 범위는 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (4)

1. 알긴산나트륨을 포함하는 하이드로겔 스폰지;
   상기 하이드로겔 스폰지 상에 분산된, 과산화수소를 캡슐화하는 폴리락트산-글리콜산(poly(lactic-co-glycolic acid); PLGA) 입자; 및
   상기 하이드로겔 스폰지를 코팅하는 폴리-L-리신 하이드로브로마이드를 포함하는 창상 피복재.
2. 제1항에 있어서,
   상기 과산화수소는 2.0 내지 6.0 중량%인 것인 창상피복재.
3. 삭제
4. 삭제

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