KR102427969B1

KR102427969B1 - Monitoring method of heart rate for toxicity test using high-speed digital holography

Info

Publication number: KR102427969B1
Application number: KR1020200144571A
Authority: KR
Inventors: 권익환; 이태걸; 이상원
Original assignee: 한국표준과학연구원
Priority date: 2020-02-03
Filing date: 2020-11-02
Publication date: 2022-08-03
Also published as: KR20210098829A; JP7291735B2; JP2021124731A

Abstract

본 발명은 고속 디지털 홀로그래피를 이용한 독성 테스트를 위한 심박수 모니터링 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 물벼룩, 제브라피쉬(zebrafish), 소금물 새우(brine shrimp) 등을 포함하는 개방형 순환계 수중 생물의 심박수 모니터링 방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 수중 생물의 심박수의 실시간 측정을 통한 개체 반응 평가 방법 및 수중 생물의 심박수의 실시간(real-time) 측정을 통한 개체 반응 평가 장치는 수중 생물 심박수의 실시간 측정을 위해, 수중 생물의 생체에 영향을 주지 않고, 움직이지 않도록 효과적으로 고정할 수 있으며, 이를 디지털 홀로그래피를 이용해 측정하여, 심박수를 디스플레이하면서, 해당 데이터를 장시간 저장할 수 있는 데이터 포맷을 구성함으로써, 개체 반응을 유도하기 위한 화합물을 처리한 후, 실시간으로 심박수의 변화를 영상 처리를 통해 확보한 후, 개체 반응의 유도에 따른 유해성 유무를 효과적으로 판별할 수 있는 효과가 있다.The present invention relates to a heart rate monitoring method for toxicity testing using high-speed digital holography, and more particularly, to a heart rate monitoring method for aquatic organisms including daphnia, zebrafish, and brine shrimp. To the present invention, a method for evaluating an individual response through real-time measurement of a heart rate of an aquatic organism and an apparatus for evaluating an individual response through real-time measurement of a heart rate of an aquatic organism according to the present invention are provided for real-time measurement of the heart rate of an aquatic organism, It can be effectively fixed so as not to move without affecting the living body of living things, and by measuring this using digital holography, displaying the heart rate, and composing a data format that can store the data for a long time, to induce an individual response. After treating the compound, the change in heart rate is secured through image processing in real time, and there is an effect of effectively determining the presence or absence of harmfulness according to the induction of an individual reaction.

Description

BACKGROUND ART Monitoring method of heart rate for toxicity test using high-speed digital holography

본 발명은 고속 디지털 홀로그래피를 이용한 독성 테스트를 위한 심박수 모니터링 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 물벼룩, 제브라피쉬(zebrafish), 소금물 새우(brine shrimp) 등을 포함하는 개방형 순환계 수중 생물의 심박수 모니터링 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a heart rate monitoring method for toxicity testing using high-speed digital holography, and more particularly, to a heart rate monitoring method for aquatic organisms including daphnia, zebrafish, and brine shrimp. it's about

지브라피쉬 또는 물벼룩과 같은 수생 생물의 동적 행동 변화는 생태 독성학, 환경 안전 및 나노 동석학 분야 등에서 광범위하게 연구되어 왔다. 물벼룩은 좁은 공간에서 다수를 배양할 수 있는 점과 짧은 성장 시간으로 인해, 마이크로 사이즈의 바이오 시험에 적합하다. 또한 이들의 배양 환경이 국제 표준 수중 독성 평가 지침에 명시되기 때문에, 공동 연구에도 유리한 점으로 작용해 왔다. 물벼룩을 이용한 심장 독성 평가는 나노 입자 또는 활성 산소(reactive oxygen species)에 대한 흥미로운 결과를 나타내 왔으며, 물벼룩을 이용한 심박수의 변화는 인간과 동일하지 않을 수 있으나, 화합물 또는 나노 입자의 항산화 약물 검사와 같은 일반적인 대사 과정에 대한 영향을 확인할 수 있었다.The dynamic behavioral changes of aquatic organisms such as zebrafish or daphnia have been extensively studied in the fields of ecotoxicology, environmental safety, and nano-staphysiology. Daphnia is suitable for micro-sized bio-tests due to its short growth time and the ability to culture a large number in a narrow space. In addition, since their culture environment is specified in the international standard aquatic toxicity assessment guideline, it has been an advantage for joint research. Cardiac toxicity evaluation using daphnia has shown interesting results for nanoparticles or reactive oxygen species, and the change in heart rate using daphnia may not be the same as that of humans. The effect on general metabolic processes was confirmed.

페트리 디쉬 또는 웰 플레이트 상에 소량 침지된 배지에 배치된 물벼룩의 심박수는 통상 현미경을 통해 눈으로 관찰되었으며, 현재까지도 널리 사용되고 있다. 이와 같은 방법은 실험자의 동적 시력에 따라 정확도가 낮은 문제점이 있어, 이에 대한 개선이 필요하다. 최근 위상 현미경을 이용하여 상기 문제점을 해결하고자 하고 있으나, 장기간 실험 중 생성된 이미지가 컴퓨터 메모리 및 데이터 스토리지를 차지하는 규모가 방대하여 적합하지 않은 문제가 있어, 이에 대한 개선 또한 절실한 상황이다.The heart rate of daphnia placed in a medium immersed in a small amount on a Petri dish or well plate was usually observed visually through a microscope, and is still widely used to this day. Such a method has a problem of low accuracy depending on the dynamic visual acuity of the experimenter, and needs to be improved. Recently, a phase microscope has been used to solve the above problem, but there is a problem that the image generated during a long-term experiment occupies a computer memory and data storage is large and is not suitable, so improvement is also urgently needed.

Lovern SB et al. Behavioral and Physiological Behavioral and Physiological Changes in Daphnia magna when Exposed to Nanoparticle Suspensions (Titanium Dioxide, Nano-C 60 , and C 60 HxC 70 Hx). Environ. Sci. Technol. 41, 4465-4470 (2007). Lovern S B et al. Behavioral and Physiological Behavioral and Physiological Changes in Daphnia magna when Exposed to Nanoparticle Suspensions (Titanium Dioxide, Nano-C 60 , and C 60 HxC 70 Hx). Environ. Sci. Technol. 41, 4465-4470 (2007). Kim BS et al., Stimulus-Responsive Anti-Oxidizing Drug Crystals and their Ecological Implication. Small 15, 1-11 (2019). Kim BS et al., Stimulus-Responsive Anti-Oxidizing Drug Crystals and their Ecological Implication. Small 15, 1-11 (2019).

상기와 같은 문제의 해결을 위해 본 발명에서는 수중 생물의 심박수를 장시간 실시간으로 측정하고, 이를 모니터링할 수 있는 심박수의 실시간 측정을 통한 개체 반응 평가 방법을 제공한다.In order to solve the above problems, the present invention provides a method for evaluating an individual's response through real-time measurement of a heart rate capable of measuring the heart rate of an aquatic organism in real time for a long time and monitoring it.

또한, 본 발명에서는 수중 생물의 움직임을 자연스럽게 고정시키는 수중 환경이 모사된 챔버와, 이를 포함하는 수중 생물 심박수 실시간 측정을 통한 개체 반응 평가 장치를 제공한다.In addition, the present invention provides a chamber simulating an aquatic environment for naturally fixing the movement of aquatic organisms, and an apparatus for evaluating an individual's reaction through real-time measurement of an aquatic organism's heart rate including the chamber.

본 발명에 따른 수중 생물의 심박수의 실시간 측정을 통한 개체 반응 평가 방법은 디지털 홀로그래피를 이용한 개체 반응 평가 방법에 있어서, (a) 챔버(chamber) 내부의 하단에 고정된 하부 고정부와, 상기 하부 고정부와 이격되어 하부 고정부 방향 또는 그 반대 방향으로 이동할 수 있는 상부 고정부 사이에 측정 개체가 개체 반응 유도를 위한 화합물이 첨가된 배양용 액체에 잠기도록 배치하고, 상기 상부 고정부를 개체에 밀착시켜 개체의 높이를 측정한 후, 상부 고정부의 위치를 조정하여 상기 개체를 고정하는 단계; (b) 상기 개체에 대한 디지털 홀로그램(digital hologram)을 연속적으로 측정하는 단계; 및 (c) 상기 측정을 통해 얻은 디지털 홀로그램을 복원하여, 심박수 변화를 계산하고, 이로부터 상기 개체 반응 유도를 위한 화합물에 의한 개체 반응 유발 여부를 판단하는 단계;를 포함한다.The method for evaluating individual responses through real-time measurement of the heart rate of aquatic organisms according to the present invention comprises: (a) a lower fixing part fixed to a lower end inside a chamber; A measurement object is placed between the upper fixing part that is spaced apart from the government and can move in the direction of the lower fixing part or in the opposite direction so that the measurement object is immersed in the culture liquid to which the compound for inducing the individual's reaction is added, and the upper fixing part is in close contact with the object after measuring the height of the object, adjusting the position of the upper fixing part to fix the object; (b) continuously measuring a digital hologram of the object; and (c) reconstructing the digital hologram obtained through the measurement, calculating a change in heart rate, and determining whether an individual response is induced by the compound for inducing the individual response from this.

본 발명의 일 예에 따른 수중 생물의 심박수의 실시간 측정을 통한 개체 반응 평가 방법에 있어서, 상기 (a) 단계는 배양용 액체가 담지된 챔버(chamber) 내부의 하단에 고정된 하부 고정부와, 상기 하부 고정부와 이격되어, 하부 고정부 방향 또는 그 반대 방향으로 이동할 수 있는 상부 고정부 사이에 상기 액체에 잠기도록 측정 대상 개체를 배치하고, 상기 상부 고정부를 개체에 밀착시켜 개체의 높이를 측정한 후, 상부 고정부의 위치를 조정하여 상기 개체를 고정하는 단계; 및 상기 챔버에 개체 반응 유도를 위한 화합물을 첨가하는 단계;를 포함할 수 있다.In the method for evaluating individual responses through real-time measurement of the heart rate of aquatic organisms according to an embodiment of the present invention, the step (a) includes a lower fixing part fixed to the lower end inside a chamber in which a liquid for culture is loaded; The object to be measured is placed between the upper fixing part that is spaced apart from the lower fixing part and can move in the direction of the lower fixing part or in the opposite direction to be immersed in the liquid, and the height of the object is measured by closely contacting the upper fixing part to the object. after measuring, fixing the object by adjusting the position of the upper fixing part; and adding a compound for inducing an individual response to the chamber.

본 발명의 일 예에 따른 수중 생물의 심박수의 실시간 측정을 통한 개체 반응 평가 방법에 있어서, 상기 (a) 단계는 개체 반응 유도를 위한 화합물이 첨가된 배양용 액체가 담지된 챔버(chamber) 내부의 하단에 고정된 하부 고정부와, 상기 하부 고정부와 이격되어, 하부 고정부 방향 또는 그 반대 방향으로 이동할 수 있는 상부 고정부 사이에 상기 액체에 잠기도록 측정 대상 개체를 배치하고, 상기 상부 고정부를 개체에 밀착시켜 개체의 높이를 측정한 후, 상부 고정부의 위치를 조정하여 상기 개체를 고정하는 단계;를 포함할 수 있다.In the method for evaluating an individual's response through real-time measurement of the heart rate of an aquatic organism according to an embodiment of the present invention, the step (a) is performed inside a chamber in which a compound for inducing an individual's response is added. An object to be measured is arranged to be submerged in the liquid between a lower fixing part fixed to the lower end, and an upper fixing part spaced apart from the lower fixing part and movable in the direction of the lower fixing part or the opposite direction, and the upper fixing part may include; after measuring the height of the object by adhering to the object, fixing the object by adjusting the position of the upper fixing part.

본 발명의 일 예에 따른 수중 생물의 심박수의 실시간 측정을 통한 개체 반응 평가 방법에 있어서, 상기 상부 고정부의 위치를 조정하여 고정한 후, 하부 고정부와 상부 고정부 사이의 거리는 측정 대상 개체의 높이 대비 0.92 내지 0.95의 비율일 수 있다.In the method for evaluating an individual response through real-time measurement of the heart rate of an aquatic organism according to an embodiment of the present invention, after adjusting and fixing the position of the upper fixing part, the distance between the lower fixing part and the upper fixing part is the height of the object to be measured Contrast may be in a ratio of 0.92 to 0.95.

본 발명의 일 예에 따른 수중 생물의 심박수의 실시간 측정을 통한 개체 반응 평가 방법에 있어서, 상기 화합물은 유기화합물, 금속, 산-알칼리, 가스, 의약품, 또는 나노 입자일 수 있다.In the method for evaluating an individual's response through real-time measurement of the heart rate of an aquatic organism according to an embodiment of the present invention, the compound may be an organic compound, a metal, an acid-alkali, a gas, a drug, or a nanoparticle.

본 발명의 일 예에 따른 수중 생물의 심박수의 실시간 측정을 통한 개체 반응 평가 방법에 있어서, 상기 화합물은 디메틸포름아미드, 메탄올, 메틸이소부틸케톤, 벤젠, 사염화탄소, 스티렌,시클로헥산, 아세톤, 아세트알데히드, 이소부틸알콜, 메틸클로라이드, 에틸렌글리콜, 크실렌, 톨루엔, 톨루엔-2,4-디이소시아네이트, 트리클로로에틸렌, n-헥산, 납, 니켈, 망간, 수은, 아연, 알루미늄, 철, 카드뮴, 크롬, 과산화수소, 초산, 수산화나트륨, 염산,황산, 질산, 인산, 암모니아, 염소, 오존, 황화수소, 일산화탄소, 이산화황, 이산화질소, 의약품, 금나노, 은나노, SWCNT(single-walled carbon　nanotube), MWCNT(multi-walled carbon　nanotube),풀러린(fullerene, C₆₀), 철 나노입자, 카본블랙, 이산화티탄, 산화알루미늄, 산화세륨, 산화아연, 이산화규소, 폴리스틸렌, 덴드리머, 및 나노클레이로부터 선택되는 것일 수 있다.In the method for evaluating individual responses through real-time measurement of the heart rate of aquatic organisms according to an embodiment of the present invention, the compound is dimethylformamide, methanol, methyl isobutyl ketone, benzene, carbon tetrachloride, styrene, cyclohexane, acetone, acetaldehyde , isobutyl alcohol, methyl chloride, ethylene glycol, xylene, toluene, toluene-2,4-diisocyanate, trichloroethylene, n-hexane, lead, nickel, manganese, mercury, zinc, aluminum, iron, cadmium, chromium, Hydrogen peroxide, acetic acid, sodium hydroxide, hydrochloric acid, sulfuric acid, nitric acid, phosphoric acid, ammonia, chlorine, ozone, hydrogen sulfide, carbon monoxide, sulfur dioxide, nitrogen dioxide, pharmaceuticals, gold nano, silver nano, SWCNT (single-walled carbon nanotube), MWCNT (multi-walled carbon nanotube) carbon nanotube), fullerene (C ₆₀ ), iron nanoparticles, carbon black, titanium dioxide, aluminum oxide, cerium oxide, zinc oxide, silicon dioxide, polystyrene, dendrimer, and nanoclay may be selected from.

본 발명의 일 예에 따른 수중 생물의 심박수의 실시간 측정을 통한 개체 반응 평가 방법에 있어서, 상기 화합물은 0.01 ~ 0.10 mM의 농도로 처리하는 것일 수 있다.In the method for evaluating an individual's response through real-time measurement of the heart rate of an aquatic organism according to an embodiment of the present invention, the compound may be treated at a concentration of 0.01 to 0.10 mM.

본 발명의 일 예에 따른 수중 생물의 심박수의 실시간 측정을 통한 개체 반응 평가 방법에 있어서, 상기 복원을 위한 알고리즘은 2차원 복원된 시간차 상대 위상 지도(2D-time-resolved-relative phase map)를 실시간으로 표시하고, 심박수(heart rate)를 동시에 저장하는 단계를 더 포함하는 것일 수 있다.In the method for evaluating an individual's response through real-time measurement of the heart rate of an aquatic organism according to an embodiment of the present invention, the algorithm for restoration uses a 2D-time-resolved-relative phase map in real time. and may further include the step of simultaneously storing a heart rate.

본 발명의 일 예에 따른 수중 생물의 심박수의 실시간 측정을 통한 개체 반응 평가 방법에 있어서, 상기 심박수는, a) 확보한 디지털 홀로그램에서 심장 영역에 해당하는 픽셀을 선별하는 단계; b) 각각의 리프레쉬 간격(refreshing interval)에 푸리에 스펙트럼 방법(Fourier spectrum method)을 적용하는 단계; c) 각각의 리프레쉬 간격(refreshing interval)에서 최다 빈도의 심박수(most frequent heart rate)를 검색 하는 단계; 및 d) 상기 최다 빈도의 심박수로부터 분당 심박수를 계산하는 단계;를 포함하는 분석 방법을 통해 얻을 수 있다.In a method for evaluating an individual's response through real-time measurement of a heart rate of an aquatic organism according to an embodiment of the present invention, the heart rate may include: a) selecting a pixel corresponding to a heart region from a secured digital hologram; b) applying a Fourier spectrum method to each refreshing interval; c) retrieving the most frequent heart rate in each refreshing interval; and d) calculating a heart rate per minute from the heart rate of the highest frequency.

본 발명의 일 예에 따른 수중 생물의 심박수의 실시간 측정을 통한 개체 반응 평가 방법에 있어서, 상기 푸리에 스펙트럼 방법을 적용하는 단계는, 하기의 수학식에 의한 k-공간(k-space) 각 스펙트럼법(angular spectrum method)에 의한 값을 기반으로 얻는 것일 수 있다.In the method for evaluating individual responses through real-time measurement of the heart rate of an aquatic organism according to an embodiment of the present invention, the step of applying the Fourier spectrum method includes the k-space angular spectrum method by the following equation It may be obtained based on the value by (angular spectrum method).

[수학식 II][Equation II]

[수학식 III][Equation III]

본 발명의 일 예에 따른 수중 생물의 심박수의 실시간 측정을 통한 개체 반응 평가 방법에 있어서, 상기 심박수 변화는 최초 심박수(original heart rate, OHR) 및 하기 수학식에 의한 이완 심박수(relaxation heart rate, RHR)를 계산하여 얻는 것일 수 있다.In the method for evaluating individual responses through real-time measurement of the heart rate of an aquatic organism according to an embodiment of the present invention, the change in heart rate is an original heart rate (OHR) and a relaxation heart rate (RHR) by the following equation ) can be obtained by calculating

[수학식 IV][Equation IV]

여기서, t_i및 t_f는 이완 상태에서 최초 및 최후 시간 도메인을 의미한다.Here, t _i and t _f mean the first and last time domains in the relaxed state.

본 발명에 따른 수중 생물의 심박수의 실시간(real-time) 측정을 통한 개체 반응 평가 장치 는 디지털 홀로그래피를 이용한 수중 생물의 심박수의 실시간(real-time) 측정을 통한 개체 반응 평가 장치에 있어서, 상기 개체 반응 평가 장치는 배양용 액체가 담지된 챔버; 하부 고정부; 상기 하부 고정부와 이격된 상부 고정부; 및 상기 상부 고정부의 위치를 제어하는 제어부를 포함하고, 상기 하부 고정부는 상기 챔버 내부의 하단에 고정되고, 상기 상부 고정부와의 사이에 측정 대상 개체가 배치되며, 상기 상부 고정부는 상기 챔버의 일 측면에 고정되어 상하로 이동가능하고, 상기 제어부는 상기 상부 고정부를 개체에 밀착시켜 개체의 높이를 측정한 후, 상부 고정부의 위치를 조정하여 상기 개체를 고정한다.The apparatus for evaluating an individual's response through real-time measurement of the heart rate of an aquatic organism according to the present invention is an apparatus for evaluating an individual's reaction through real-time measurement of the heart rate of an aquatic organism using digital holography, wherein the object The reaction evaluation apparatus includes a chamber in which the culture liquid is loaded; lower fixing part; an upper fixing part spaced apart from the lower fixing part; and a control unit for controlling the position of the upper fixing part, wherein the lower fixing part is fixed to a lower end of the chamber, and an object to be measured is disposed between the upper fixing part and the upper fixing part, the upper fixing part of the chamber It is fixed to one side and movable up and down, and the control unit adjusts the position of the upper fixing part to fix the object after measuring the height of the object by making the upper fixing part in close contact with the object.

본 발명의 일 예에 따른 수중 생물의 심박수의 실시간(real-time) 측정을 통한 개체 반응 평가 장치에 있어서, 상기 개체 반응 평가 장치는 광원부; 참조광을 만드는 참조광 생성부; 물체광을 만드는 물체광 생성부; 상기 참조광과 물체광을 결합하여 홀로그램을 기록하는 CCD; 및 상기 기록된 홀로그램의 간섭 무늬를 수치적으로 분석하는 연산부; 상기 연산부를 통해 수치적으로 분석된 디지털 홀로그램을 표시하는 디스플레이부; 및 상기 분석된 디지털 홀로그램으로부터 심박수 분석을 수행하는 심박수 분석부;를 더 포함하고, 상기 연산부는 CCD에 기록된 홀로그램에 대하여 다수 개의 위상 복원상을 획득하고, 이로부터 진폭(amplitude) 및 각도(angle)을 계산하여 디스플레이부로 전달하며, 상기 디스플레이부는 CCD에 기록된 홀로그램의 복원 이미지를 실시간으로 표시한 후, 심박수 분석부로 전달하며, 상기 심박수 분석에서는 최다 빈도의 심박수로부터 분당 심박수를 계산할 수 있다.In accordance with an embodiment of the present invention, an apparatus for evaluating an individual's reaction through real-time measurement of a heart rate of an aquatic organism, the apparatus for evaluating an individual's reaction, includes: a light source; a reference light generating unit generating a reference light; an object light generating unit for generating object light; a CCD for recording a hologram by combining the reference light and the object light; and a calculator for numerically analyzing the interference fringes of the recorded holograms. a display unit for displaying a digital hologram analyzed numerically through the operation unit; and a heart rate analyzer for performing heart rate analysis from the analyzed digital hologram, wherein the calculating unit obtains a plurality of phase reconstruction images with respect to the hologram recorded on the CCD, and therefrom, an amplitude and an angle ) is calculated and transmitted to the display unit, and the display unit displays the reconstructed image of the hologram recorded on the CCD in real time and then transmits it to the heart rate analyzer.

본 발명의 일 예에 따른 수중 생물의 심박수의 실시간(real-time) 측정을 통한 개체 반응 평가 장치에 있어서, 상기 제어부는 하부 고정부와 상부 고정부 사이의 거리를 측정 대상 개체의 높이 대비 0.87 내지 0.95의 비율로 조정하는 것일 수 있다.In the apparatus for evaluating an individual's response through real-time measurement of the heart rate of an aquatic organism according to an embodiment of the present invention, the control unit measures the distance between the lower fixed part and the upper fixed part from 0.87 to 0.87 to the height of the object to be measured. It may be to adjust at a ratio of 0.95.

본 발명의 일 예에 따른 수중 생물의 심박수의 실시간(real-time) 측정을 통한 개체 반응 평가 장치에 있어서, 상기 제어부는 하부 고정부와 상부 고정부 사이의 거리를 측정 대상 개체의 높이 대비 0.92 내지 0.95의 비율로 조정하는 것일 수 있다.In the apparatus for evaluating an individual's response through real-time measurement of the heart rate of an aquatic organism according to an embodiment of the present invention, the control unit measures the distance between the lower fixed part and the upper fixed part from 0.92 to 0.92 to the height of the object to be measured. It may be to adjust at a ratio of 0.95.

본 발명의 일 예에 따른 수중 생물의 심박수의 실시간(real-time) 측정을 통한 개체 반응 평가 장치에 있어서, 상기 개체 반응 평가 장치는 수중 생물의 실시간 심박수, 하부 고정부와 상부 고정부의 이격 간격, 시간차 상대 위상 이미지의 실시간 디스플레이, 이완 심박수(relaxation heart rate)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 데이터를 동시에 측정 가능한 것일 수 있다.In the apparatus for evaluating an individual's response through real-time measurement of a heart rate of an aquatic organism according to an embodiment of the present invention, the apparatus for evaluating an individual's response includes a real-time heart rate of the aquatic organism, and a spacing between the lower and upper fixed parts , a real-time display of a time difference relative phase image, and one or more data selected from the group consisting of a relaxation heart rate may be simultaneously measured.

본 발명의 일 예에 따른 수중 생물의 심박수의 실시간(real-time) 측정을 통한 개체 반응 평가 장치에 있어서, 상기 개체 반응 평가 장치를 통해 동시에 측정된 데이터는 인공 지능 기법(artificial intelligence method)을 적용하여 반복학습을 통해 축적시키는 것일 수 있다.In the apparatus for evaluating an individual's reaction through real-time measurement of the heart rate of an aquatic organism according to an embodiment of the present invention, an artificial intelligence method is applied to data simultaneously measured by the apparatus for evaluating the individual's reaction Therefore, it may be accumulated through repeated learning.

본 발명의 일 예에 따른 수중 생물의 심박수의 실시간(real-time) 측정을 통한 개체 반응 평가 장치에 있어서, 상기 반복학습을 통해 고등생물에서의 심박수의 변화를 예측하기 위해 사용되는 것일 수 있다.In the apparatus for evaluating an individual response through real-time measurement of the heart rate of an aquatic organism according to an embodiment of the present invention, it may be used to predict a change in heart rate in a higher organism through the repeated learning.

본 발명에 따른 수중 생물의 심박수의 실시간 측정을 통한 개체 반응 평가 방법 및 수중 생물의 심박수의 실시간(real-time) 측정을 통한 개체 반응 평가 장치는 수중 생물 심박수의 실시간 측정을 위해, 수중 생물의 생체에 영향을 주지 않고, 움직이지 않도록 효과적으로 고정할 수 있으며, 이를 디지털 홀로그래피를 이용해 측정하여, 심박수를 디스플레이하면서, 해당 데이터를 장시간 저장할 수 있는 데이터 포맷을 구성함으로써, 개체 반응을 유도하기 위한 화합물을 처리한 후, 실시간으로 심박수의 변화를 영상 처리를 통해 확보한 후, 개체 반응의 유도에 따른 유해성 유무를 효과적으로 판별할 수 있는 효과가 있다.The method for evaluating an individual's response through real-time measurement of the heart rate of an aquatic organism and an apparatus for evaluating an individual's response through real-time measurement of the heart rate of an aquatic organism according to the present invention are provided for real-time measurement of an aquatic organism's heart rate, It can be effectively fixed so that it does not move without affecting Then, there is an effect of effectively determining the presence or absence of harmfulness according to the induction of an individual reaction after the change in heart rate is secured through image processing in real time.

도 1은 본 발명에 따른 수중 생물의 심박수 실시간 측정을 통한 개체 반응 평가 방법에 대한 순서도이고,
도 2는 본 발명에 따른 수중 생물의 심박수 실시간 측정을 위한 개체 반응 평가 장치 중 핵심 요소인 챔버의 구성에 관한 도면이고,
도 3은 본 발명에 따른 수중 생물의 심박수 실시간 측정을 위한 개체 반응 평가 장치의 개략도 및 구현예에 관한 개략도이고,
(a) 축외 디지털 홀로그래피로, Mach Zehnder 간섭계를 기반으로 한 홀로그래피 설정예, (b) 챔버 및 (c) 수중 생물의 심박수 실시간 측정을 위한 개체 반응 장치의 구현된 하드웨어.
도 4는 본 발명에 따른 수중 생물의 심박수 실시간 측정을 통한 개체 반응 평가 방법에 있어서, 공간 필터 방법을 사용한 디지털 홀로그래피의 수치 재구성 과정에 관한 것이고,
도 5는 본 발명에 따른 수중 생물의 심박수 실시간 측정을 위한 개체 반응 평가 장치로, 재구성된 시간 분해 위상 분포(reconstructed time resolved phase distribution)을 이용하여 물벼룩의 심박수를 분석한 것이며,
도 6은 본 발명에 따른 수중 생물의 심박수 실시간 측정을 통한 개체 반응 평가 방법에 대한 순서도 단계별 상세 프로세스에 관한 것이며,
도 7은 본 발명에 따른 수중 생물의 심박수 실시간 측정을 통한 개체 반응 평가 방법을 통해, 과산화수소 0.00 mM(파랑), 0.03 mM(주황), 및 0.06 mM(빨강) 처리 후 2시간 경과된 물벼룩의 심박수를 측정한 결과이고,
도 8은 본 발명에 따른 수중 생물의 심박수 실시간 측정을 통한 개체 반응 평가 방법을 통해, 농도별로 24시간 노출 후 이완 심박수(relaxation heart rate, RHR) 분석 결과이다.
도 9는 본 발명에 따른 수중 생물의 심박수 실시간 측정을 통한 개체 반응 평가 방법과, 종래 통상적으로 사용되던 방법의 차이점에 대한 비교 결과이다.1 is a flowchart of a method for evaluating an individual's response through real-time measurement of heart rate of aquatic organisms according to the present invention;
2 is a view of the configuration of a chamber, which is a key element among the apparatus for evaluating the individual response for real-time measurement of the heart rate of aquatic organisms according to the present invention;
3 is a schematic diagram and a schematic diagram of an individual response evaluation apparatus for real-time measurement of heart rate of aquatic organisms according to the present invention,
(a) Off-axis digital holography, an example of a holographic setup based on a Mach Zehnder interferometer, (b) a chamber and (c) implemented hardware of an object reaction device for real-time measurement of heart rate of aquatic organisms.
Figure 4 relates to a numerical reconstruction process of digital holography using a spatial filter method in the method for evaluating individual responses through real-time measurement of the heart rate of aquatic organisms according to the present invention;
5 is an individual response evaluation apparatus for real-time measurement of the heart rate of aquatic organisms according to the present invention, wherein the heart rate of daphnia is analyzed using a reconstructed time resolved phase distribution;
6 is a flow chart step-by-step detailed process for a method for evaluating an individual response through real-time measurement of heart rate of aquatic organisms according to the present invention;
7 shows the heart rate of daphnia 2 hours after treatment with hydrogen peroxide 0.00 mM (blue), 0.03 mM (orange), and 0.06 mM (red) through the method for evaluating individual responses through real-time measurement of heart rate of aquatic organisms according to the present invention. is the result of measuring
8 is a relaxation heart rate (RHR) analysis result after 24 hours of exposure to each concentration through the method for evaluating individual responses through real-time measurement of the heart rate of aquatic organisms according to the present invention.
9 is a comparison result of the difference between the method for evaluating an individual's response through real-time measurement of the heart rate of an aquatic organism according to the present invention and a conventionally used method.

이하 첨부한 표 또는 도면들을 참조하여 본 발명의 수중 생물의 심박수의 실시간 측정을 통한 개체 반응 평가 방법에 대해 상세히 설명한다.Hereinafter, with reference to the accompanying tables or drawings, a method for evaluating an individual's response through real-time measurement of the heart rate of an aquatic organism of the present invention will be described in detail.

도면이 기재되어 있을 경우, 이는 당업자에게 본 발명의 사상이 충분히 전달될 수 있도록 하기 위해 예로서 제공되는 것이다. 따라서 본 발명은 제시되는 도면들에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있으며, 상기 도면들은 본 발명의 사상을 명확히 하기 위해 과장되어 도시될 수 있다.When drawings are described, they are provided as examples so that the spirit of the present invention can be sufficiently conveyed to those skilled in the art. Therefore, the present invention is not limited to the drawings presented and may be embodied in other forms, and the drawings may be exaggerated to clarify the spirit of the present invention.

제 1, 제 2 등의 용어는 다양한 구성 요소들을 설명하는 데 사용될 수 있지만, 상기 구성 요소들은 상기 용어들에 의해 한정되어서는 안 된다. 상기 용어들은 하나의 구성요소를 다른 구성요소로부터 구별하는 목적으로만 사용된다. 예를 들어, 본 발명의 권리 범위를 벗어나지 않으면서 제 1 구성요소는 제 2 구성요소로 명명될 수 있고, 유사하게 제 2 구성요소도 제 1 구성요소로 명명될 수 있다.Terms such as first, second, etc. may be used to describe various elements, but the elements should not be limited by the terms. The above terms are used only for the purpose of distinguishing one component from another. For example, without departing from the scope of the present invention, a first component may be referred to as a second component, and similarly, a second component may also be referred to as a first component.

이때, 사용되는 기술 용어 및 과학 용어에 있어서 다른 정의가 없다면, 이 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 통상적으로 이해하고 있는 의미를 가지며, 하기의 설명 및 첨부 도면에서 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있는 공지 기능 및 구성에 대한 설명은 생략한다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥 상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의되지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.At this time, if there is no other definition in the technical terms and scientific terms used, it has the meaning commonly understood by those of ordinary skill in the art to which this invention belongs, and the gist of the present invention in the following description and accompanying drawings Descriptions of known functions and configurations that may be unnecessarily obscure will be omitted. Terms such as those defined in a commonly used dictionary should be interpreted as having a meaning consistent with the meaning in the context of the related art, and should not be interpreted in an ideal or excessively formal meaning unless explicitly defined in the present application. does not

또한 본 발명의 명세서에서 사용되는 단수 형태는 문맥에서 특별한 지시가 없는 한 복수 형태도 포함하는 것으로 의도할 수 있다. In addition, the singular form used in the specification of the present invention may also be intended to include the plural form unless the context specifically dictates otherwise.

또한 본 발명의 명세서에서 특별한 언급 없이 사용된 단위는 중량을 기준으로 하며, 일 예로 % 또는 비의 단위는 중량% 또는 중량비를 의미한다.In addition, in the specification of the present invention, the unit used without special mention is based on the weight, for example, the unit of % or ratio means weight % or weight ratio.

또한 본 발명의 명세서에서, “포함한다”는 표현은 “구비한다”, “함유한다”, “가진다” 또는 “특징으로 한다” 등의 표현과 등가의 의미를 가지는 개방형 기재이며, 추가로 열거되어 있지 않은 요소, 재료 또는 공정을 배제하지 않는다. 또한 “실질적으로…로 구성된다”는 표현은 특정된 요소, 재료 또는 공정과 함께 열거되어 있지 않은 다른 요소, 재료 또는 공정이 발명의 적어도 하나의 기본적이고 신규한 기술적 사상에 허용할 수 없을 만큼의 현저한 영향을 미치지 않는 양으로 존재할 수 있는 것을 의미한다. 또한 “구성된다”는 표현은 기재된 요소, 재료 또는 공정만이 존재하는 것을 의미한다.In addition, in the specification of the present invention, the expression "comprising" is an open-ended description having an equivalent meaning to expressions such as "having", "containing", "having" or "characterized by", and additionally listed It does not exclude elements, materials or processes that do not exist. Also, “really… The expression “consisting of” means that other elements, materials or processes not listed together with the specified elements, materials or processes do not unacceptably significantly affect at least one basic and novel technical idea of the invention. It means that it can exist in quantity. Also, the expression “consisting of” means that only the elements, materials, or processes described are present.

본 발명의 명세서에서 사용된 용어, "성분", "조성물", "화합물의 조성물", "화합물", "약물", "약학적 활성제", "활성제", "치유" "치료법" "치료" 또는 "약제"는 대상체(인간 또는 동물)에 투여될 때 국소 및/또는 전신 작용에 의해 원하는 약학적 및/또는 생리학적 효과를 유도하는 화합물 또는 화합물(들) 또는 물질의 조성물을 의미하기 위해 상호교환적으로 사용된다.As used herein, the terms “ingredient”, “composition”, “composition of a compound”, “compound”, “drug”, “pharmaceutically active agent”, “active agent”, “healing” “treatment” “treatment” or "agent" is used interchangeably to mean a compound or composition of compound(s) or substances that, when administered to a subject (human or animal), induces a desired pharmaceutical and/or physiological effect by local and/or systemic action. used interchangeably.

본 발명에 있어 “샘플” 또는 “시료”는 분석을 위한 대상을 나타내는 것으로, 명세서에 걸쳐 동일한 의미로 사용되었다.In the present invention, “sample” or “sample” refers to a subject for analysis, and is used in the same sense throughout the specification.

이하, 본 발명의 내용을 실시예를 통하여 보다 구체적으로 설명한다. 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 권리범위가 이들에 의해 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the content of the present invention will be described in more detail through examples. The examples are only for explaining the present invention in more detail, and the scope of the present invention is not limited thereto.

이하 본 발명의 수중 생물의 심박수의 실시간 측정을 통한 개체 반응 평가 방법에 대해 상세히 설명한다.Hereinafter, the method for evaluating an individual's response through real-time measurement of the heart rate of an aquatic organism of the present invention will be described in detail.

상기 (a) 단계는 배양용 액체가 담지된 챔버(chamber) 내부의 하단에 고정된 하부 고정부와, 상기 하부 고정부와 이격되어, 하부 고정부 방향 또는 그 반대 방향으로 이동할 수 있는 상부 고정부 사이에 상기 액체에 잠기도록 측정 대상 개체를 배치하고,, 상기 상부 고정부를 개체에 밀착시켜 개체의 높이를 측정한 후, 상부 고정부의 위치를 조정하여 상기 개체를 고정하는 단계; 및 상기 챔버에 개체 반응 유도를 위한 화합물을 첨가하는 단계;를 포함할 수 있으며, 또한, 상기 (a) 단계는 개체 반응 유도를 위한 화합물이 첨가된 배양용 액체가 담지된 챔버(chamber) 내부의 하단에 고정된 하부 고정부와, 상기 하부 고정부와 이격되어, 하부 고정부 방향 또는 그 반대 방향으로 이동할 수 있는 상부 고정부 사이에 상기 액체에 잠기도록 측정 대상 개체를 배치하고, 상기 상부 고정부를 개체에 밀착시켜 개체의 높이를 측정한 후, 상부 고정부의 위치를 조정하여 상기 개체를 고정하는 단계;를 포함할 수 있다.The step (a) includes a lower fixing part fixed to the lower end inside the chamber in which the culture liquid is loaded, and an upper fixing part that is spaced apart from the lower fixing part and can move in the direction of the lower fixing part or the opposite direction. placing an object to be measured so as to be submerged in the liquid therebetween, measuring the height of the object by attaching the upper fixing part to the object, and then fixing the object by adjusting the position of the upper fixing part; and adding a compound for inducing an individual's response to the chamber; and, in addition, the step (a) is performed inside a chamber in which the compound for inducing an individual's response is loaded with a culture liquid. An object to be measured is arranged to be submerged in the liquid between a lower fixing part fixed to the lower end, and an upper fixing part spaced apart from the lower fixing part and movable in the direction of the lower fixing part or the opposite direction, and the upper fixing part may include; after measuring the height of the object by adhering to the object, fixing the object by adjusting the position of the upper fixing part.

이 때, 상기 상부 고정부의 위치를 조정하여 고정한 후, 하부 고정부와 상부 고정부 사이의 거리는 측정 대상 개체의 높이 대비 0.87 내지 0.95, 좋게는 0.89 내지 0.95, 더욱 좋게는 0.92 내지 0.95의 비율일 수 있다.At this time, after adjusting and fixing the position of the upper fixing part, the distance between the lower fixing part and the upper fixing part is 0.87 to 0.95, preferably 0.89 to 0.95, more preferably 0.92 to 0.95 compared to the height of the object to be measured. can

상기 화합물은 유기화합물, 금속, 산-알칼리, 가스, 의약품, 또는 나노 입자일 수 있으며, 보다 구체적인 일 예시에 의하면, 디메틸포름아미드, 메탄올, 메틸이소부틸케톤, 벤젠, 사염화탄소, 스티렌,시클로헥산, 아세톤, 아세트알데히드, 이소부틸알콜, 메틸클로라이드, 에틸렌글리콜, 크실렌, 톨루엔, 톨루엔-2,4-디이소시아네이트, 트리클로로에틸렌, n-헥산, 납, 니켈, 망간, 수은, 아연, 알루미늄, 철, 카드뮴, 크롬, 과산화수소, 초산, 수산화나트륨, 염산,황산, 질산, 인산, 암모니아, 염소, 오존, 황화수소, 일산화탄소, 이산화황, 이산화질소, 의약품, 금나노, 은나노, SWCNT(single-walled carbon　nanotube), MWCNT(multi-walled carbon　nanotube),풀러린(fullerene, C₆₀), 철 나노입자, 카본블랙, 이산화티탄, 산화알루미늄, 산화세륨, 산화아연, 이산화규소, 폴리스틸렌, 덴드리머, 및 나노클레이 등으로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이에 한정하는 것은 아니며, 개체에 대한 세포 독성을 측정할 수 있는 것이라면 그 종류에 상관없이 적절히 선택하여 사용할 수 있다.The compound may be an organic compound, metal, acid-alkali, gas, drug, or nanoparticles, and according to a more specific example, dimethylformamide, methanol, methyl isobutyl ketone, benzene, carbon tetrachloride, styrene, cyclohexane, Acetone, acetaldehyde, isobutyl alcohol, methyl chloride, ethylene glycol, xylene, toluene, toluene-2,4-diisocyanate, trichloroethylene, n-hexane, lead, nickel, manganese, mercury, zinc, aluminum, iron, Cadmium, chromium, hydrogen peroxide, acetic acid, sodium hydroxide, hydrochloric acid, sulfuric acid, nitric acid, phosphoric acid, ammonia, chlorine, ozone, hydrogen sulfide, carbon monoxide, sulfur dioxide, nitrogen dioxide, pharmaceuticals, gold nano, silver nano, SWCNT (single-walled carbon nanotube), MWCNT (multi-walled carbon nanotube), fullerene (C ₆₀ ), iron nanoparticles, carbon black, titanium dioxide, aluminum oxide, cerium oxide, zinc oxide, silicon dioxide, polystyrene, dendrimer, and nanoclay, etc. However, the present invention is not limited thereto, and as long as it can measure cytotoxicity to an individual, it can be appropriately selected and used regardless of the type.

상기 화합물의 처리시 그 농도는 특별히 제한되는 것은 아니나, 구체적인 일 예로 0.001 ~ 0. 50 mM, 좋게는 0.005 ~ 0.30 mM, 더욱 좋게는 0.01 ~ 0.10 mM의 농도로 처리하는 것일 수 있다.The concentration of the compound during treatment is not particularly limited, but as a specific example, it may be treated at a concentration of 0.001 to 0.50 mM, preferably 0.005 to 0.30 mM, more preferably 0.01 to 0.10 mM.

상기 복원을 위한 알고리즘은 2차원 분해된 시간차 상대 위상 지도(2D-resolved-relative phase map)를 실시간으로 표시하고, 심박수(heart rate)를 동시에 저장하는 단계를 더 포함하는 것일 수 있다.The reconstruction algorithm may further include displaying a 2D-resolved-relative phase map in real time and simultaneously storing a heart rate.

상기 심박수는, a) 확보한 디지털 홀로그램에서 심장 영역에 해당하는 픽셀을 선별하는 단계; b) 각각의 리프레쉬 간격(refreshing interval)에 푸리에 스펙트럼 방법(Fourier spectrum method)을 적용하는 단계; c) 각각의 리프레쉬 간격(refreshing interval)에서 최다 빈도의 심박수(most frequent heart rate)를 검색 하는 단계; 및 d) 상기 최다 빈도의 심박수로부터 분당 심박수를 계산하는 단계;를 포함하는 분석 방법을 통해 얻을 수 있다.The heart rate may be determined by: a) selecting a pixel corresponding to a heart region from the obtained digital hologram; b) applying a Fourier spectrum method to each refreshing interval; c) retrieving the most frequent heart rate in each refreshing interval; and d) calculating a heart rate per minute from the heart rate of the highest frequency.

상기 확보한 디지털 홀로그램 I(x,y)는 물체광과 간섭과의 광간섭 신호를 나타낸다. 본 발명의 일 실시예에 따른 공간 마스킹 방법(spacial masking method)을 통해, 홀로그램 이미지의 2차원 FFT(fast Fourier transform) 방법에 의한 개체 파동 장(object wave-field)을 정의한다.The secured digital hologram I(x,y) represents an optical interference signal between object light and interference. An object wave-field is defined by a two-dimensional fast Fourier transform (FFT) method of a holographic image through a spatial masking method according to an embodiment of the present invention.

[수학식 I][Equation I]

상기 식에서, U _o 및 U _r 은 각각 개체와 참조의 파동-장을 나타내고, *(asterisk)는 켤레 복소수값(complex conjugate value)와 관련된다. 상기 수학식 I을 구성하는 네 가지 항 중, 앞의 두 항은 자기 상관값 (autocorrelation term), 세번째 항은 실수 이미지항(real image term), 네번째 항은 허수 이미지항(virtual image term)을 각각 나타낸다. 상기 방법을 적용한 것과 관련해서는 본 발명의 일 실시예에 따른 도 4b에 기술하였다.In the above formula, U _o and U _r represent the wave-field of the entity and reference, respectively, and *(asterisk) is associated with a complex conjugate value. Of the four terms constituting Equation I, the first two terms represent an autocorrelation term, the third term represents a real image term, and the fourth term represents an imaginary image term, respectively. indicates. The application of the method is described in FIG. 4B according to an embodiment of the present invention.

홀로그램에서 거리 z에 따른 개체 파동-장(object wave-field)은 각도 스펙트럼 방법(angular spectrum method)를 이용하여 수학적으로 계산될 수 있으며, 상기 방법은 푸리에 변환을 통해 얻은 홀로그램 평면 H과 위상 전파 인자(phase propagation factor) exp[ikz]에 의한 파동 전파 방법(wave propagation technique)으로 획득할 수 있다. The object wave-field according to the distance z in the hologram can be mathematically calculated using an angular spectrum method, which is a hologram plane H obtained through Fourier transform and a phase propagation factor. It can be obtained by the wave propagation technique by the (phase propagation factor) exp[ikz].

상기 푸리에 스펙트럼 방법을 적용하는 단계는, 하기의 수학식에 의한 k-공간(k-space) 각 스펙트럼법(angular spectrum method)에 의한 값을 기반으로 얻는 것일 수 있다.The step of applying the Fourier spectrum method may be obtained based on a value by a k-space angular spectrum method according to the following equation.

[수학식 II][Equation II]

[수학식 III][Equation III]

상기 심박수 변화는 최초 심박수(original heart rate, OHR) 및 하기 수학식에 의한 이완 심박수(relaxation heart rate, RHR)를 계산하여 얻는 것일 수 있다.The change in heart rate may be obtained by calculating an original heart rate (OHR) and a relaxation heart rate (RHR) by the following equation.

[수학식 IV][Equation IV]

다양한 정량적 위상 이미징 방법 중 디지털 홀로그래픽 현미경(digital holographic microscopy, DHM)은 간섭 이미지에서 물체 파동 장의 진폭 및 위상 정보를 포함하는 복잡한 진폭으로 표현되는 지형 정보를 재구성 할 수 있다. 이러한 디지털 홀로그래픽 현미경의 능력은 고속 카메라로 주어진 생물학적 표본에 존재하는 굴절률 분포에 대한 재구성 된 위상 정보를 생성 할 수 있기 때문에 실시간 생물학적 현상 측정에 유리하다.Among various quantitative phase imaging methods, digital holographic microscopy (DHM) can reconstruct topographic information expressed in complex amplitudes including amplitude and phase information of the wave field of an object in an interference image. The ability of such digital holographic microscopy is advantageous for real-time measurement of biological phenomena as a high-speed camera can generate reconstructed phase information about the refractive index distribution present in a given biological specimen.

도 1에는 상기 수중 생물의 실시간 측정을 통한 개체 반응 평가 방법에 대한 개략적인 순서도가 도시되어 있다.1 is a schematic flowchart of a method for evaluating an individual response through real-time measurement of the aquatic organism.

상기 도면을 참조하면, 상기 수중 생물의 실시간 측정을 토한 개체 반응 평가 방법은 설치 단계(S101), 이미지 확보 단계(S102), 데이터 연산 단계(S103), 디스플레이 단계(S104) 및 심박수 분석 단계(S105)를 포함한다.Referring to the drawings, the method for evaluating an individual's response to real-time measurement of aquatic organisms includes an installation step (S101), an image acquisition step (S102), a data calculation step (S103), a display step (S104), and a heart rate analysis step (S105) ) is included.

설치 단계(S101)은 검사 대상 수중 생물을 챔버 내 하부 고정부와 상부 고정부 사이에 위치시킨 후 고정하는 단계이다. 상기 설치 단계(S101)이 완료된 후, 디지털 홀로그래피 현미경(Digital Holographic Microscopy)에 의해 상기 수중 생물에 대한 연속적인 이미지를 획득하여 홀로그램을 작성한다.The installation step (S101) is a step of fixing the aquatic organism to be tested after positioning it between the lower fixing part and the upper fixing part in the chamber. After the installation step (S101) is completed, a hologram is created by acquiring a continuous image of the aquatic life by using a digital holographic microscope (Digital Holographic Microscopy).

이미지 확보 단계(S102)는 개체를 통과한 물체광(object beam)과 광원부로부터 조사된 참조광(reference beam)으로부터 생성된 광간섭 신호를 CCD 카메라 등의 유닛으로 촬영하여 홀로그램을 생성하는 단계를 포함한다. 광원부를 작동시켜 물체광 및 참조광을 생성하고, 빔 스플리터를 통해 생성된 광간섭 신호를 촬영하여 홀로그램 영상을 획득하게 된다.The image securing step (S102) includes generating a hologram by photographing an optical interference signal generated from an object beam passing through an object and a reference beam irradiated from a light source with a unit such as a CCD camera. . An object light and a reference light are generated by operating the light source unit, and a holographic image is obtained by photographing an optical interference signal generated through a beam splitter.

데이터 연산 단계(S103)는 획득한 홀로그램 영상을 복원하여, 복소진폭 값을 획득한다. 이 때, 복소 진폭의 변위(amplitude)와 페이즈 각도(phase angle)를 계산하는 방법은 특별히 제한되는 것은 아니나, 일예로 Angular spectrum method 을 적용할 수 있다. 상기 방법으로 복원된 데이터에 대한 시간차 위상 값을 계산하게 된다. In the data operation step S103, a complex amplitude value is obtained by reconstructing the obtained holographic image. In this case, a method of calculating the amplitude and the phase angle of the complex amplitude is not particularly limited, but an angular spectrum method may be applied as an example. A time difference phase value for the data restored by the above method is calculated.

디스플레이 단계(S104)는 상기 데이터 연산 단계에서 복원된 데이터를 전달 받아 이를 디스플레이 화면에 실시간으로 표시하고, 심장 부위에 해당하는 부위인 경우, 심박수 분석 단계로 전달되어, 분당 심박수의 계산에 활용된다.In the display step (S104), the data restored in the data calculation step is received and displayed on the display screen in real time, and in the case of a heart portion, the data is transferred to the heart rate analysis step and used to calculate the heart rate per minute.

심박수 분석 단계(S105)는 상기 디스팔레이 단계(S104)에서 심장 부위에 해당하는 것으로 판별된 데이터를 전달받아 분당 심박수를 계산한다. The heart rate analysis step S105 receives the data determined to correspond to the heart region in the display step S104 and calculates the heart rate per minute.

상기 개체 반응 평가 장치는 광원부; 참조광을 만드는 참조광 생성부; 물체광을 만드는 물체광 생성부; 상기 참조광과 물체광을 결합하여 홀로그램을 기록하는 CCD; 및 상기 기록된 홀로그램의 간섭 무늬를 수치적으로 분석하는 연산부; 상기 연산부를 통해 수치적으로 분석된 디지털 홀로그램을 표시하는 디스플레이부; 및 상기 분석된 디지털 홀로그램으로부터 심박수 분석을 수행하는 심박수 분석부;를 더 포함하고, 상기 연산부는 CCD에 기록된 홀로그램에 대하여 다수 개의 위상 재생상을 획득하고, 이로부터 진폭(amplitude) 및 각도(angle)을 계산하여 디스플레이부로 전달하며, 상기 디스플레이부는 CCD에 기록된 모든 홀로그램에 대한 분석이 완료될 때까지 해당하는 디지털 홀로그램을 선별하여 표시한 후, 심박수 분석부로 전달하며, 상기 심박수 분석에서는 최다 빈도의 심박수로부터 분당 심박수를 계산할 수 있다.The individual reaction evaluation apparatus includes a light source unit; a reference light generating unit generating a reference light; an object light generating unit for generating object light; a CCD for recording a hologram by combining the reference light and the object light; and a calculator for numerically analyzing the interference fringes of the recorded holograms. a display unit for displaying a digital hologram analyzed numerically through the operation unit; and a heart rate analyzer for performing heart rate analysis from the analyzed digital hologram, wherein the calculating unit obtains a plurality of phase reproduction images for the hologram recorded on the CCD, and therefrom, an amplitude and an angle ( You can calculate your heart rate per minute from your heart rate.

상기 제어부는 하부 고정부와 상부 고정부 사이의 거리를 측정 대상 개체의 높이 대비 0.87 내지 0.95의 비율, 좋게는 0.92 내지 0.95의 비율로 조정하는 것일 수 있다. 상기 비율로 개체를 고정함으로써, 개체의 혈액 순환 등 신진 대사에 영향을 주지 않으면서, 하부 고정부와 상부 고정부 사이에 효율적으로 개체 고정이 가능한 장점이 있어 바람직하다.The control unit may adjust the distance between the lower fixing part and the upper fixing part in a ratio of 0.87 to 0.95, preferably 0.92 to 0.95, compared to the height of the object to be measured. By fixing the object in the above ratio, it is preferable because the object can be efficiently fixed between the lower fixing part and the upper fixing part without affecting the metabolism such as blood circulation of the individual.

상기 개체 반응 평가 장치는 수중 생물의 실시간 심박수, 하부 고정부와 상부 고정부의 이격 간격, 심박수 페이즈의 실시간 디스플레이, 이완 심박수(relaxation heart rate)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 데이터를 동시에 측정 가능한 것일 수 있다.The individual response evaluation device may simultaneously measure one or more data selected from the group consisting of a real-time heart rate of an aquatic organism, a separation interval between the lower and upper fixed parts, a real-time display of a heart rate phase, and a relaxation heart rate. can

상기 개체 반응 평가 장치를 통해 동시에 측정된 데이터는 인공 지능 기법(artificial intelligence method)을 적용하여 반복학습을 통해 축적시키는 것일 수 있다.The data simultaneously measured by the object reaction evaluation device may be accumulated through repeated learning by applying an artificial intelligence method.

상기 반복학습을 통해 고등생물에서의 심박수의 변화를 예측하기 위해 사용되는 것일 수 있다.It may be used to predict a change in heart rate in higher organisms through the repeated learning.

도면을 통해 상기 개체 반응 평가 장치의 핵심 구성 요소인 챔버에 대해 보다 상세히 설명하면 다음과 같다.The chamber, which is a key component of the apparatus for evaluating individual reaction, will be described in more detail with reference to the drawings.

도 2의 본 발명에 따른 개체 반응 평가 장치는 챔버(100) 내에서, 하부 구조부(110)과 상부 구조부(120) 사이에 수중 생물을 고정할 수 있도록 하며, 상기 상부 구조부는 제어부(130)에 의해 수중 생물에 대한 심박수 측정에 영향을 주지 않는 범위에서 상기 수중 생물이 움직이지 않도록 상하로 이동하여 수중 생물과 밀착되는 형태로 고정된다.The apparatus for evaluating an individual reaction according to the present invention of FIG. 2 allows an aquatic organism to be fixed between the lower structure part 110 and the upper structure part 120 in the chamber 100, and the upper structure part is connected to the control unit 130. It is fixed in a form in close contact with the aquatic life by moving up and down so that the aquatic life does not move in a range that does not affect the heart rate measurement for the aquatic life.

상기 하부 구조부(110)과 상부 구조부(120)는 물체광이 투과될 수 있는 소재로 형성되어, 홀로그램 생성을 위한 광의 투과가 이루어진다.The lower structure part 110 and the upper structure part 120 are formed of a material that can transmit object light, so that light for generating a hologram is transmitted.

광원부는 도면에 도시되진 않았지만, 챔버의 하방, 하부 구조부의 하방에 설치되어, 상기 고정된 개체를 향해 물체광(object beam)을 조사하는 물체광 생성부(제 1광원)과, 상기 물체광의 광로 상으로 참조광(reference beam)을 조사하는 참조광 생성부(제 2 광원)를 구비한다. 상기 제 1 광원 및 제 2 광원은 일예로 레이저를 사용할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니며, 상기 레이저의 파장 또한 정상적인 홀로그램을 형성할 수 있다면 그 파장의 범위는 제한되는 것은 아니며, 일예로 633.2 nm인 레이저를 사용할 수 있다.Although not shown in the drawings, the light source unit includes an object light generating unit (first light source) installed below the chamber and below the lower structure to irradiate an object beam toward the fixed object, and an optical path of the object light. A reference light generating unit (second light source) for irradiating a reference beam onto the image is provided. The first light source and the second light source may use a laser as an example, but is not limited thereto, and if the wavelength of the laser can also form a normal hologram, the range of the wavelength is not limited, for example, a laser having a wavelength of 633.2 nm. can be used

상기 물체광과 참조광의 광로가 서로 교차되는 지점에는 빔 스플리터(beam splitter)가 설치되어, 상기 개체와 대물렌즈를 투과한 물체광과 상기 참조광으로부터 광간섭 신호를 생성한다. 상기 빔 스플리터는 물체광과 참조광 사이에 광간섭 신호를 생성하기 위해 종래 디지털 홀로그피 현미경에 사용되는 빔 스플리터이므로, 이에 대한 상세한 설명은 생략한다.A beam splitter is installed at a point where the optical paths of the object light and the reference light intersect each other to generate an optical interference signal from the object light passing through the object and the objective lens and the reference light. Since the beam splitter is a beam splitter used in a conventional digital holographic microscope to generate an optical interference signal between an object light and a reference light, a detailed description thereof will be omitted.

상기 빔 스플리터의 상측에 광간섭 신호의 촬영을 위한 유닛이 설치되며, 일예로 CCD 카메라를 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.A unit for photographing an optical interference signal is installed above the beam splitter, and a CCD camera may be used as an example, but is not limited thereto.

도 3은 본 발명에 따른 개체 반으 평가 장치의 예시로서, 축외 디지털 홀로그래피를 사용하는 실시간 심박수 모니터링 시스템을 나타낸다.3 illustrates a real-time heart rate monitoring system using off-axis digital holography as an example of an individual class evaluation apparatus according to the present invention.

(a)는 Mach-Zehnder 간섭계(Mach-Zehnder interometer)를 기반으로 하는 축외 디지털 홀로그래피 설정의 개략도를 나타내며, 광원으로는 5 mW 출력의 633.2 nm 파장 헬륨-네온 레이저(He-Ne laser; Thorlabs)를 사용한다. 대물 렌즈(micro objective lens; 10x/N.A. 0.30, Olympus, UMPLFLN 10XW)는 수중 침지 형태로 사용되며, 3.5 mm의 작동 거리를 갖는다.(a) shows a schematic diagram of an off-axis digital holography setup based on a Mach-Zehnder interometer, and a 633.2 nm wavelength He-Ne laser (Thorlabs) with 5 mW output was used as a light source. use. A micro objective lens (10x/N.A. 0.30, Olympus, UMPLFLN 10XW) is used in the submerged form and has a working distance of 3.5 mm.

물체광과 간섭광의 광간섭 신호를 촬영하는 CCD 카메라(aca2040-180km, Basler)는 공장 출하 기준 해상도 2048x2048 및 픽셀크기 5.5 um x 5.5 um로 세팅되어 사용되며, 외부에 연결된 데이터 확보 장치에 연결되어 노출 시간 2.5 ms로 촬영에 활용되었다.The CCD camera (aca2040-180km, Basler), which captures the optical interference signal of object light and interference light, is set to factory default resolution of 2048x2048 and pixel size of 5.5 um x 5.5 um, and is connected to an externally connected data acquisition device for exposure. A time of 2.5 ms was used for shooting.

[실시예][Example]

챔버에 물벼룩의 침지 및 고정Immersion and immobilization of daphnia in the chamber

상기 도 3의 (b)와 같은 개략도를 갖는 챔버와 디지털 홀로그래피 장치를 연결하여 (c)와 같이 구현한 본 발명에 따른 개체 반응 평가 장치를 이용하여, 물벼룩에 대한 독성 반응을 시험하였다.A toxic reaction to daphnia was tested using the individual reaction evaluation apparatus according to the present invention implemented as shown in (c) by connecting a chamber having a schematic diagram as shown in (b) of FIG. 3 and a digital holography device.

도 2의 10~15℃의 아가로스젤(agarose gel, Sigma-Aldrich) (또는 다른 배지 대체 가능)이 담지된 챔버(110)의 하부 구조부(110)와 상부 구조부(120) 사이에 물벼룩을 조심스럽게 배치하고, 제어부(130)를 작동시켜 물벼룩의 높이를 측정하도록 한 후, 상기 물벼룩 높이의 0.95%가 되도록 상부 구조부의 높이를 제어하여 위치시켰다. 이 때, 물벼룩의 높이는 538 um로 측정되었다.Beware of daphnia between the lower structure part 110 and the upper structure part 120 of the chamber 110 in which the agarose gel (Sigma-Aldrich) (or other medium can be substituted) at 10-15 ° C. of FIG. 2 is loaded. After the height of the daphnia was measured by operating the controller 130, the height of the upper structure was controlled to be 0.95% of the height of the daphnia. At this time, the height of the daphnia was measured to be 538 um.

디지털 홀로그래피 현미경을 이용한 심박 신호의 생성Generation of a heartbeat signal using a digital holographic microscope

상기 개체 반응 장치에서 외축 디지털 홀로그래피 방법을 이용하여 CCD 카메라로 물벼룩의 홀로그램을 촬영하였다.A hologram of daphnia was photographed with a CCD camera using an external digital holography method in the object reaction apparatus.

그 결과를 도 4에 도시하였다.The results are shown in FIG. 4 .

이미지는 픽셀 크기가 0.5 um x 0.5 um이며 8 비트의 해상도 1024 x 1024로 설정하여 촬영하였다. 주황색 점선 원으로 표시된 심장 영역의 최대 신호 강도 비율은 0.047 (SR < 5%)로 측정되었다(도 4a). 간섭 이미지의 2차원 푸리에 변환(2D Fourier transfom)을 통한 k-space 이미지를 얻었으며(도 4b), 홀로그램으로부터 7.6 um에서 수치적으로 재구성된 개체 파동 장 강도 분포(object wave-field intensity distribution)을 확보하였다. 이 때, 상기 재구성 알고리즘은 각도 스펙트럼 방법을 사용하였다(도 4c). 도4d는 수치적으로 재구성된 물체(위)와 물벼룩 없이 촬영된 참조(아래) 개체 파동 장 강도 분포(object wave-field intensity distribution)를 나타낸다. The image was taken with a pixel size of 0.5 um x 0.5 um and 8-bit resolution set to 1024 x 1024. The maximum signal intensity ratio of the heart region indicated by the orange dotted circle was measured to be 0.047 (SR < 5%) (Fig. 4a). A k-space image was obtained through the 2D Fourier transform of the interference image (Fig. 4b), and the numerically reconstructed object wave-field intensity distribution at 7.6 um from the hologram was obtained. secured. At this time, the reconstruction algorithm used the angle spectrum method (Fig. 4c). Figure 4d shows the numerically reconstructed object (top) and the reference (bottom) object wave-field intensity distribution taken without daphnia.

참조(reference) 파동 장에서 개체 파동-장을 결합한 후 물벼룩의 위상 분포를 얻었다(도 4e). 이 때 위상은 -π로부터 +π까지의 범위를 커버한다. 공간 위상(spatial phase)은 시편 두께(specimen thickness)와 굴절율(refractive index)에 비례하므로, 이로부터 물벼룩 심장 영역의 시간 분해 상대 위상 분포(time-resolved relative phase distribution)를 얻었으며, 이를 주황색 사각형으로 표시하였다(도 4f~도 4h).After combining the individual wave-fields in the reference wave field, the phase distribution of Daphnia was obtained (Fig. 4e). In this case, the phase covers the range from -π to +π. Since the spatial phase is proportional to the specimen thickness and the refractive index, a time-resolved relative phase distribution of the daphnia heart region was obtained from this, which is represented by the orange rectangle. indicated (Figs. 4f to 4h).

재구성된 시간 분해 위상 분포를 사용한 물벼룩의 심박수 분석Heart Rate Analysis of Daphnia Using Reconstructed Time Resolved Phase Distribution

상기 방법을 통해 얻은 심박 신호로부터, 재구성된 시간 분해 위상 분포(reconstructed time resolved phase distributions)에 의해 물벼룩의 심박수를 분석하였다.From the heart rate signals obtained through this method, the heart rate of daphnia was analyzed by reconstructed time resolved phase distributions.

그 결과를 도 5에 도시하였다.The results are shown in FIG. 5 .

25 프레임 간격 (0.125 초)으로 강도(위), 위상(중간), 상대 위상(아래) 분포로부터 시간 분해 이미지 세트(time resolved image sets)를 비교하였다 (도 5a). 결과에 의하면, 홀로그램에 비해 공간 위상 지도에서 물벼룩의 모습을 보다 명확히 인식할 수는 있지만, 홀로그램에 비해 공간 위상 지도에서 심장 영역을 구분하기 어렵다.Time resolved image sets were compared from intensity (top), phase (middle) and relative phase (bottom) distributions at 25 frame intervals (0.125 s) ( FIG. 5A ). According to the results, it is possible to recognize the appearance of daphnia more clearly on the spatial topology map compared to the hologram, but it is difficult to distinguish the heart region on the spatial topology map compared to the hologram.

이어서, 시간 분해 1차원 심박 신호의 래핑(WP), 언래핑(UWP) 및 상대적 언래핑(relative unwapped) 위상을 비교하였다(도 5b). 결과에 의하면, 심장 영역이 보다 명확히 보이며, 이는 물벼룩을 챔버의 하부 구조부(110)와 상부 구조부(120) 사이에 물벼룩 높이의 95%로 고정함으로써, 등딱지의 공간 위상이 소멸되었기 때문인 것으로 추측된다.Then, the wrapped (WP), unwrapped (UWP), and relative unwapped phases of the time-resolved one-dimensional heartbeat signal were compared ( FIG. 5B ). According to the results, the cardiac region is more clearly visible, which is presumed to be because the spatial phase of the carapace is lost by fixing the daphnia to 95% of the height of the daphnia between the lower structure 110 and the upper structure 120 of the chamber.

심박수 분석은 주기적 특성을 평가하기 위해 푸리에 스펙트럼 방법(Fourier spectrum method)을 사용하였다. 도 5c는 1000 프레임 세트의 각 픽셀에 대해 반복적인 1차원 푸리에 스펙트럼 방법을 사용하여 물벼룩의 2차원 주파수 분포(frequency distribution)을 계산하였다. 내부에 포함된 도면은 7.8 Hz(흰색 화살표)를 갖는 지점에서의 푸리에 스펙트럼 플롯이며, 5초 동안의 심박수는 38이다.For heart rate analysis, a Fourier spectrum method was used to evaluate periodic characteristics. Figure 5c calculates the two-dimensional frequency distribution of daphnia using an iterative one-dimensional Fourier spectrum method for each pixel in a set of 1000 frames. Included therein is a Fourier spectrum plot at a point with 7.8 Hz (white arrow), the heart rate for 5 seconds is 38.

실시간 디지털 홀로그래피 모니터링 시스템 구현Real-time digital holography monitoring system implementation

상기 실시예 1에서와 같은 심박수 처리 장치의 프레임 비율(frame rate)에 부합할 수 있도록, 실시간 디지털 홀로그래피를 관찰할 수 있는 고성능의 컴퓨팅 시스템을 구축하였다.A high-performance computing system capable of observing real-time digital holography was constructed so as to conform to the frame rate of the heart rate processing device as in the first embodiment.

이를 위해 3단계로 수행되는 FFT(fast Fourier transform) 연산을 기반으로 하는 컨볼루션 방법(convolution method)로 디지털 홀로그래피 재구성 알고리즘을 개발하였다.To this end, a digital holography reconstruction algorithm was developed as a convolution method based on a fast Fourier transform (FFT) operation performed in three steps.

상기 알고리즘은 2차원 시간-분해 상대 위상 지도를 실시간으로 디스플레이할 수 있는 GUI(graphical user interface)를 구비하고, 심박 신호를 GPU(graphical processing unit)을 이용한 고속 연산을 통해 저장하도록 하였다(도 6 참조).The algorithm has a graphical user interface (GUI) capable of displaying a two-dimensional time-resolved relative phase map in real time, and stores the heartbeat signal through high-speed operation using a graphical processing unit (GPU) (see FIG. 6 ). ).

상기 GPU를 이용한 연산은 nVidia사에서 지원하는 CUDA FFT 라이브러리(cuFFT)를 이용한 병렬 컴퓨팅 연산 방법을 통해 처리 속도를 극대화하였다. 이를 통해, 처리된 시간 분해 상대 위상 지도를 실시간으로 디스플레이하는 것을 가능하도록 하였다.The calculation using the GPU maximizes the processing speed through a parallel computing calculation method using the CUDA FFT library (cuFFT) supported by nVidia. This made it possible to display the processed time-resolved relative phase map in real time.

상기 실시간 디지털 홀로그래피 모니터링 시스템의 성능은 하기 표 1과 같다.The performance of the real-time digital holography monitoring system is shown in Table 1 below.

[표 1] 실시간 디지털 홀로그래피 모니터링 시스템의 성능[Table 1] Performance of real-time digital holography monitoring system

또한, 본 발명에서는 전체 간섭계 이미지 세트(interferometric image sets)의 정보를 필요로 하는 종래의 디지털 홀로그래피 방법과는 달리, 시간 분해된 심박 신호(time-resolved heartbeat signal)만을 필요로 함으로써, 10 x 10 pixels 크기의 심장 영역의 동일한 심박 신호를 저장하는 데 필요한 데이터 저장 영역의 시간당 크기를 703 GB/시간 으로부터 3.43 MB/시간으로 200,000배 이상 감소시키는 놀라운 공간 절약 효과를 이루었으며, 이를 통해 장시간 동안 실시간 디지털 홀로그래피를 모니터링 할 수 있는 새로운 효과를 얻었다.In addition, in the present invention, unlike the conventional digital holography method that requires information of the entire interferometric image sets, only a time-resolved heartbeat signal is required, so 10 x 10 pixels A remarkable space saving effect of more than 200,000 times the hourly size of the data storage area required to store the same heart rate signal of the same size of heart area, from 703 GB/hour to 3.43 MB/hour, was achieved, resulting in real-time digital holography for a long time. A new effect was obtained that can be monitored.

과산화수소(Hhydrogen peroxide (H ₂₂ OO ₂₂ ) 노출에 따른 물벼룩의 심박수 모니터링) monitoring the heart rate of daphnia according to exposure

상기 실시예에서, 90 mL M4 배지가 담지된 챔버(100)에 물벼룩을 상기와 같은 방법으로 고정시킨 후, 관찰하였다.In the above example, after fixing daphnia in the chamber 100 loaded with 90 mL M4 medium in the same manner as above, observation was made.

관찰 2시간 경과 뒤 농도가 각각 0.00 mM, 0.03 mM 및 0.06 mM인 과산화수소 19 mL를 실험 회차별로 각각 혼합하여, 물벼룩이 상기 과산화수소에 노출되도록 반복 실험하였다. 이 때 음성대조군인 0.00 mM 처리 시, 부피를 통일하기 위해 10 mL M4 배지를 추가로 혼합하였다.After 2 hours of observation, 19 mL of hydrogen peroxide having a concentration of 0.00 mM, 0.03 mM, and 0.06 mM, respectively, was mixed in each experiment cycle, and repeated experiments were performed so that daphnia was exposed to the hydrogen peroxide. At this time, 10 mL M4 medium was additionally mixed to unify the volume when treated with 0.00 mM, a negative control.

관찰 시, 과산화수소에 노출 전과 후로 구간을 나누어 심박수 분석을 수행하였다.During observation, heart rate analysis was performed by dividing the sections into before and after exposure to hydrogen peroxide.

도 7에 그 결과를 도시하였다.7 shows the results.

도 7b의 심박수 경향을 표현하기 위해, 도 7a에서는 30분 간격으로 이동 평균 방법(moving average method)으로 최초 심박수(original heart rate, OHR)를 평탄화하였다.In order to express the heart rate trend of FIG. 7B , in FIG. 7A , the original heart rate (OHR) was flattened by a moving average method at 30-minute intervals.

이로부터, 각 시험군에 대한 심박수와 OHR 사이의 표준 편차(단위: BPM, beat per minute)를 측정한 결과, 과산화수소 농도별로 18 BPM, 11 BPM, 및 14 BPM으로 나타나는 것을 확인하였다.From this, as a result of measuring the standard deviation (unit: BPM, beat per minute) between the heart rate and OHR for each test group, it was confirmed that 18 BPM, 11 BPM, and 14 BPM for each hydrogen peroxide concentration appeared.

도 7c는 초기 RHR에 대하여 정규화(normalization)을 수행한 결과로, 심장에 대한 독성을 평가하기 위한 독성 물질에의 노출에 따른 심박수의 변화를 측정한 결과이다. 음성 대조군을 제외한 0.03 mM 및 0.06 mM의 과산화수소를 각각 처리한 시료에 대하여, 최종 RHR을 측정한 결과, 최초 심박수(OHR) 대비 심박수가 각각 3.3% (-13 BPM), 22.7% (-109 BPM) 감소하는 것을 확인하였다.7c is a result of normalization of the initial RHR, and is a result of measuring a change in heart rate according to exposure to a toxic substance for evaluating toxicity to the heart. As a result of measuring the final RHR for samples treated with 0.03 mM and 0.06 mM hydrogen peroxide, respectively, excluding the negative control, the heart rate compared to the initial heart rate (OHR) was 3.3% (-13 BPM) and 22.7% (-109 BPM), respectively. was confirmed to decrease.

상기 정규화를 통한 심박수의 비교 결과, 음성 대조군은 OHR과 동일한 최종 RHR을 갖는 반면, 과산화수소를 처리한 두 시험군의 경우, 심박수의 감소를 확인하였다.As a result of comparison of heart rate through the normalization, the negative control group had the same final RHR as the OHR, whereas, in the case of the two test groups treated with hydrogen peroxide, a decrease in heart rate was confirmed.

상기 정규화된 결과에 대해 t-검정 방법을 적용하여 상기 감소의 유의성을 측정한 결과, 0.03 mM의 과산화수소를 처리한 시험군의 경우 F 값이 0.89를 나타내어 분산의 이분산성(heteroscedasticity of variance) 및 0.05보다 큰 유의 확률을 나타냈다. 이로부터, 불균일 분산을 가정한 t-검정 결과는 0.01보다 작았으며, 이로부터, 0.03 mM 과산화수소 처리시 최종 RHR은 OHR 대비 유의적인 차이를 나타내는 것을 확인하였다.As a result of measuring the significance of the decrease by applying the t-test method to the normalized result, the F value was 0.89 in the test group treated with 0.03 mM hydrogen peroxide, which is higher than the heteroscedasticity of variance and 0.05. showed a high probability of significance. From this, the t-test result assuming non-uniform dispersion was less than 0.01, and from this, it was confirmed that the final RHR exhibited a significant difference compared to OHR when treated with 0.03 mM hydrogen peroxide.

본 발명에서, 상기 각 실험군에 대한 측정은 3개의 물벼룩 시험군에 대해 동시로 처리할 수도 있었으며, 음성대조군 및 과산화수소 처리 시험군에 대한 이완 심박수 측정 결과를 하기 표 2에 정리하였다.In the present invention, measurements for each of the experimental groups could be simultaneously processed for three daphnia test groups, and the results of relaxation heart rate measurements for the negative control group and the hydrogen peroxide treatment test group are summarized in Table 2 below.

[표 2] 시험군에 따른 이완 심박수(RHR, relaxation heartbeat rate) 측정 결과[Table 2] Measurement results of relaxation heartbeat rate (RHR) according to test group

상기 결과로부터, 0.03 mM을 처리한 경우와 마찬가지로 0.06 mM 과산화수소를 처리한 결과의 t-검정을 수행한 결과, 역시 0.01보다 작은 값을 얻었으며, 이로부터, 0.06 mM 처리시에도 최종 RHR은 OHR 대비 유의적인 차이를 나타내는 것을 확인하였다.From the above results, as in the case of treatment with 0.03 mM, a t-test of the result of treatment with 0.06 mM hydrogen peroxide was performed, and a value smaller than 0.01 was also obtained. It was confirmed that a significant difference was shown.

도 8에 상기 표 2의 노출 그룹(exposure group)들에 대한 평균 RHR을 분석한 결과를 도시하였다. 도 8a의 정규화되지 않은 비교 결과 그 차이는 유의하지 않은 것으로 나타난 반면, 정규화를 수행한 이후인 도 8b 및 도 8c의 경우, 음성 대조군은 24시간 경과 이후 0.42%의 심박수 증가만이 발생한 반면, 0.03 mM 및 0.06 mM을 처리한 시험군 그룹의 경우 24시간 경과 이후 각각 7.16% 및 25.97%의 심박수 감소가 일어난 것을 확인하였다.8 shows the results of analyzing the average RHR for the exposure groups of Table 2 above. As a result of the non-normalized comparison of FIG. 8A , the difference was found to be insignificant, whereas in the case of FIGS. 8B and 8C after normalization, the negative control group only experienced an increase in heart rate of 0.42% after 24 hours, whereas 0.03 In the case of the test group treated with mM and 0.06 mM, it was confirmed that the heart rate decreased by 7.16% and 25.97%, respectively, after 24 hours.

도 8d는 과산화수소 처리에 따른 활성산소종(ROS, reactive oxygen species) 레벨을 측정한 결과이다. 그 결과 0.06 mM 처리한 시험군의 경우, 0.03 mM 처리군 대비 7.8배로, 현저히 증가한 활성산소종 레벨을 나타내는 것을 확인하였다. 이로부터, 활성산소종 레벨 측정을 통해, 과산화수소 노출에 따른 심박수 감소와 활성산소종의 레벨의 상관 관계를 검증하였다.Figure 8d is a result of measuring the level of reactive oxygen species (ROS) according to the hydrogen peroxide treatment. As a result, in the case of the test group treated with 0.06 mM, it was confirmed that the level of reactive oxygen species significantly increased, 7.8 times compared to the 0.03 mM treatment group. From this, by measuring the level of reactive oxygen species, the correlation between the decrease in heart rate and the level of reactive oxygen species according to the hydrogen peroxide exposure was verified.

제시된 실시예들에 대한 설명은 임의의 본 발명의 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 본 발명을 이용하거나 또는 실시할 수 있도록 제공한다. 이러한 실시예들에 대한 다양한 변형들은 본 발명의 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명백할 것이며, 여기에 정의된 일반적인 원리들은 본 발명의 범위를 벗어남이 없이 다른 실시예들에 적용될 수 있다. 그리하여, 본 발명은 여기에 제시된 실시예들로 한정되는 것이 아니라, 여기예 제시된 원리들 및 신규한 특징들과 일관되는 최광의의 범위에서 해석되어야 할 것이다.The description of the presented embodiments is provided to enable any person skilled in the art to use or practice the present invention. Various modifications to these embodiments will be readily apparent to those skilled in the art, and the generic principles defined herein may be applied to other embodiments without departing from the scope of the invention. Thus, the present invention is not intended to be limited to the embodiments presented herein, but is to be construed in the widest scope consistent with the principles and novel features presented herein.

S101: 설치 단계
S102: 이미지 확보 단계
S103: 데이터 연산 단계
S104: 디스플레이 단계
S105: 심박수 분석 단계
100: 챔버
110: 하부 고정부
120: 상부 고정부
130: 제어부S101: Installation steps
S102: Image Acquisition Step
S103: data operation step
S104: display stage
S105: heart rate analysis step
100: chamber
110: lower fixing part
120: upper fixing part
130: control unit

Claims

In a method for evaluating an object reaction using digital holography,
(a) between the lower fixing part fixed to the lower end inside the chamber, and the upper fixing part that is spaced apart from the lower fixing part and can move in the direction of the lower fixing part or the opposite direction, the measurement object is used for inducing an individual reaction placing the compound to be submerged in the culture liquid added thereto, measuring the height of the object by attaching the upper fixing part to the object, and then fixing the object by adjusting the position of the upper fixing part;
(b) continuously measuring a digital hologram of the object with a digital holographic microscopy; and
(c) reconstructing the digital hologram obtained through the measurement, calculating a change in heart rate, and determining whether an individual response is induced by the compound for inducing the individual response;
A method for evaluating an individual's response through real-time measurement of the heart rate of aquatic organisms, comprising:
The algorithm for the restoration further comprises the step of displaying a 2D-resolved-relative phase map in real time and simultaneously storing the heart rate. A method for evaluating an individual's response through real-time measurements.

The method of claim 1,
The step (a) includes a lower fixing part fixed to the lower end inside the chamber in which the culture liquid is loaded, and an upper fixing part that is spaced apart from the lower fixing part and can move in the direction of the lower fixing part or the opposite direction. placing an object to be measured so as to be submerged in the liquid therebetween, measuring the height of the object by attaching the upper fixing part to the object, and then fixing the object by adjusting the position of the upper fixing part; and adding a compound for inducing an individual response to the chamber;

The method of claim 1,
In the step (a), a lower fixing part fixed to the lower end inside a chamber in which a compound for inducing an individual reaction is added is loaded, and spaced apart from the lower fixing part, in the direction of the lower fixing part or its Place the object to be measured so as to be immersed in the liquid between the upper fixing parts that can move in opposite directions, measure the height of the object by contacting the upper fixing part to the object, and then adjust the position of the upper fixing part to adjust the position of the object A method of evaluating an individual's response through real-time measurement of the heart rate of an aquatic organism, comprising the step of fixing.

4. The method according to any one of claims 1 to 3,
After adjusting and fixing the position of the upper fixing part, the distance between the lower fixing part and the upper fixing part is a ratio of 0.87 to 0.95 compared to the height of the object to be measured. .

5. The method of claim 4,
After adjusting and fixing the position of the upper fixing part, the distance between the lower fixing part and the upper fixing part is a ratio of 0.92 to 0.95 compared to the height of the object to be measured. .

The method of claim 1,
Wherein the compound is an organic compound, a metal, an acid-alkali, a gas, a pharmaceutical, or a nanoparticle, a method for evaluating an individual's reaction through real-time measurement of the heart rate of an aquatic organism.

7. The method of claim 6,
The compound is dimethylformamide, methanol, methyl isobutyl ketone, benzene, carbon tetrachloride, styrene, cyclohexane, acetone, acetaldehyde, isobutyl alcohol, methyl chloride, ethylene glycol, xylene, toluene, toluene-2,4-diisocyanate , trichlorethylene, n-hexane, lead, nickel, manganese, mercury, zinc, aluminum, iron, cadmium, chromium, hydrogen peroxide, acetic acid, sodium hydroxide, hydrochloric acid, sulfuric acid, nitric acid, phosphoric acid, ammonia, chlorine, ozone, hydrogen sulfide, Carbon monoxide, sulfur dioxide, nitrogen dioxide, pharmaceuticals, gold nano, silver nano, SWCNT (single-walled carbon nanotube), MWCNT (multi-walled carbon nanotube), fullerene (C ₆₀ ), iron nanoparticles, carbon black, titanium dioxide, oxidation A method for evaluating individual responses through real-time measurement of heart rates of aquatic organisms, which is selected from aluminum, cerium oxide, zinc oxide, silicon dioxide, polystyrene, dendrimers, and nanoclays.

7. The method of claim 6,
Wherein the compound is treated at a concentration of 0.01 to 0.10 mM, a method for evaluating an individual's response through real-time measurement of the heart rate of an aquatic organism.

delete

The method of claim 1,
The heart rate is
a) selecting a pixel corresponding to a heart region from the obtained digital hologram;
b) applying a Fourier spectrum method to each refreshing interval;
c) retrieving the most frequent heart rate in each refreshing interval; and
d) calculating heart rates per minute from the most frequent heart rate;
A method for evaluating an individual's response through real-time measurement of the heart rate of aquatic organisms, which is obtained through an analysis method comprising a.

11. The method of claim 10,
The step of applying the Fourier spectrum method is to obtain a real-time measurement of the heart rate of an aquatic organism, which is obtained based on a value by a k-space angular spectrum method by the following equation Methods for assessing individual responses.
[Equation II]

[Equation III]

4. The method according to any one of claims 1 to 3,
The change in heart rate is obtained by calculating the initial heart rate (original heart rate, OHR) and the relaxation heart rate (RHR) by the following equation, a method for evaluating individual responses through real-time measurement of the heart rate of aquatic organisms.
[Equation IV]

Here, t _i and t _f mean the first and last time domains in the relaxed state.

An apparatus for evaluating an individual's reaction through real-time measurement of a heart rate of an aquatic organism using digital holography, the apparatus comprising:
The individual reaction evaluation apparatus includes: a chamber in which a culture liquid is loaded; lower fixing part; an upper fixing part spaced apart from the lower fixing part; and a control unit for controlling the position of the upper fixing part,
The lower fixing part is fixed to a lower end inside the chamber, a measurement target object is disposed between the upper fixing part and the upper fixing part, the upper fixing part is fixed to one side of the chamber and movable up and down, and the control part is the After measuring the height of the object by attaching the upper fixture to the object, the object is fixed by adjusting the position of the upper fixture. as,
The individual reaction evaluation apparatus may include a light source unit; a reference light generating unit generating a reference light; an object light generating unit generating object light; a CCD for recording a hologram by combining the reference light and the object light; and a calculator for numerically analyzing the interference fringes of the recorded holograms. a display unit for displaying a digital hologram numerically analyzed through the operation unit; and a heart rate analyzer for performing heart rate analysis from the analyzed digital hologram;
The calculation unit acquires a plurality of phase reproduction images for the holograms recorded on the CCD, calculates amplitude and angle from them, and transmits them to the display unit, and the display unit analyzes all holograms recorded on the CCD Until this is completed, the corresponding digital hologram is selected, the 2D-resolved-relative phase map is displayed in real time, and then transferred to the heart rate analyzer that stores the heart rate at the same time. , In the heart rate analysis, the heart rate per minute is calculated from the heart rate of the highest frequency.

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14. The method of claim 13,
Wherein the control unit adjusts the distance between the lower fixing part and the upper fixing part in a ratio of 0.87 to 0.95 compared to the height of the object to be measured, an apparatus for evaluating individual responses through real-time measurement of the heart rate of an aquatic organism.

16. The method of claim 15,
Wherein the control unit adjusts the distance between the lower fixing part and the upper fixing part in a ratio of 0.92 to 0.95 compared to the height of the object to be measured.

In the apparatus for evaluating an individual's reaction through real-time measurement of the heart rate of an aquatic organism using the digital holography of claim 13,
The individual response evaluation device is capable of simultaneously measuring one or more data selected from the group consisting of a real-time heart rate of an aquatic organism, a separation interval between the lower and upper fixed parts, a real-time display of a heart rate phase, and a relaxation heart rate. An individual response evaluation device through real-time measurement of the heart rate of humans and aquatic organisms.

18. The method of claim 17,
Entity reaction evaluation device through real-time measurement of the heart rate of aquatic organisms, in which the data simultaneously measured through the individual reaction evaluation device is accumulated through repeated learning by applying an artificial intelligence method .

19. The method of claim 18,
An apparatus for evaluating an individual response through real-time measurement of a heart rate of an aquatic organism, which is used to predict a change in heart rate in higher organisms through the repeated learning.