KR102414997B1 - Composition comprising recombinant botulinum toxin light chain protein having improved stability - Google Patents

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Abstract

본 발명은 재조합 보툴리눔 독소 단백질을 함유하는 조성물에 관한 것이며, 안정화제로 당 알코올을 포함한다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 보툴리눔 독소 A형 경쇄 단백질 또는 이의 절편 및 안정화제로써 탄소 원자의 개수가 6개 이하 및/또는 20℃에서 물에서의 용해도가 150 mg/mL 이상인 당 알코올을 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명의 조성물은 안정화제를 통해 보툴리눔 독소 단백질의 안정성을 충분히 확보하면서, 재조합 보툴리눔 독소 경쇄 단백질의 생물학적 활성을 사용 가능한 수준으로 유지하는 효과를 발휘할 수 있다.The present invention relates to a composition containing a recombinant botulinum toxin protein, comprising a sugar alcohol as a stabilizer. More specifically, the present invention relates to a botulinum toxin type A light chain protein or fragment thereof and a sugar alcohol having 6 or less carbon atoms and/or a solubility in water of 150 mg/mL or more at 20°C as a stabilizer. A composition is provided. The composition of the present invention can exhibit the effect of maintaining the biological activity of the recombinant botulinum toxin light chain protein at an usable level while sufficiently ensuring the stability of the botulinum toxin protein through the stabilizing agent.

Description

안정성이 개선된 재조합 보툴리눔 독소 경쇄 단백질 조성물{COMPOSITION COMPRISING RECOMBINANT BOTULINUM TOXIN LIGHT CHAIN PROTEIN HAVING IMPROVED STABILITY}Recombinant botulinum toxin light chain protein composition with improved stability {COMPOSITION COMPRISING RECOMBINANT BOTULINUM TOXIN LIGHT CHAIN PROTEIN HAVING IMPROVED STABILITY}

본 발명은 재조합 보툴리눔 독소 경쇄 단백질의 안정성을 개선시킨 조성물에 관한 것이다.The present invention relates to a composition having improved stability of a recombinant botulinum toxin light chain protein.

보툴리눔 독소는 혐기성 박테리아인 클로스트리디움 보툴리눔(Clostridium botulinum)의 폴리펩타이드 생성물로 신경독소의 일종이다. 이 독소는 신경근 접합부에서 신경 전달 물질인 아세틸콜린의 시냅스 전 방출을 차단함으로써 포유류에게서 근육 마비를 야기시킨다.Botulinum toxin is a polypeptide product of Clostridium botulinum , an anaerobic bacterium, and is a kind of neurotoxin. The toxin causes muscle paralysis in mammals by blocking the presynaptic release of the neurotransmitter acetylcholine at the neuromuscular junction.

보툴리눔 독소는 이 독소의 인체에 전혀 영향을 주지 않는 용량 이하를 주사약으로 사용하면 주사 부위의 근육만 부분적으로 마비시킬 수 있는 원리를 이용해 사시, 특발성 안검경련, 반측안면, 사경, 구하악골 근긴장 이상, 경련성 발성 장애, 및 다양한 종류의 근육 경련 및 발작을 포함하는 어떤 불수의근 운동 장애를 치료하는 데 있어서 치료학적으로 사용되고 있다.Botulinum toxin, using the principle that only the muscle at the injection site can be partially paralyzed, when the dose of this toxin is used as an injection that does not affect the human body at all. It is used therapeutically to treat convulsive dysphonia, and certain involuntary muscle movement disorders, including various types of muscle spasms and seizures.

최근에는 눈가나 미간, 이마 등에 주름살을 만드는 근육을 마비시킴으로써 안면 상의 주름살을 비외과적으로 감소시키는 것을 비롯하여, 모공 축소, 여드름, 탄력 부여, 사각턱 완화 등의 심미적, 미용학적 분야에서도 사용되고 있다.Recently, it is used not only to non-surgically reduce wrinkles on the face by paralyzing the muscles that make wrinkles around the eyes, between the forehead and the forehead, but also in the aesthetic and cosmetic fields such as pore reduction, acne, elasticity, and square jaw relief.

보툴리눔 독소는 8가지 신경독소로 분류되며, 이 중 7종(A, B, C, D, E, F, G)은 신경의 마비를 유발할 수 있다.Botulinum toxin is classified into eight neurotoxins, and seven of them (A, B, C, D, E, F, G) can cause nerve paralysis.

보툴리눔 독소의 크기는 약 150 kDa으로, 보툴리눔 독소 단백질 이외에 비독소 단백질(non-toxin)의 복합체로 구성되어 각 복합체의 크기는 독소형의 종류에 따라 최대 900 kDa까지 생성된다. 보툴리눔 독소형에 따라 작용 형태와 대상, 활성기간 등이 달라지는데 그 중 보툴리눔 독소 A형은 치명적인 생물학적 작용제 중 하나로 알려져 있다.The size of the botulinum toxin is about 150 kDa, and it is composed of a complex of non-toxin in addition to the botulinum toxin protein. The size of each complex is up to 900 kDa depending on the type of toxin. The type of action, target, and duration of action vary depending on the botulinum toxin type. Among them, botulinum toxin type A is known as one of the deadly biological agents.

독소형에 관계없이, 보툴리눔 독소의 분자적 메커니즘은 유사한 것으로 보인다. 보툴리눔 독소는 하나의 폴리펩타이드로 발현되어, 발현 후 재구성 과정에 의해 약 100 kDa의 중쇄(Heavy chain, H 사슬)와 약 50 kDa의 경쇄(Light chain, L 사슬)로 나뉘어 지게 되며, 다시 H 사슬과 L 사슬은 디설파이드 결합으로 연결된다. 보툴리눔 독소형에 따라 상이한 표적을 갖지만, 공통적으로 H 사슬은 신경세포의 수용체와 결합하여 엔도시토시스를 통해 독소를 포함하는 엔도좀을 형성, 보툴리눔 독소가 내부로 들어갈 수 있도록 한다. L 사슬은 세포 안으로 들어간 후 엔도좀을 빠져나와 세포질 내의 SNARE 단백질을 절단하여 아세틸콜린 분비를 억제시켜 근육 마비 효과를 나타낸다.Regardless of the toxin type, the molecular mechanisms of botulinum toxin appear to be similar. Botulinum toxin is expressed as a single polypeptide, and is divided into a heavy chain (Heavy chain, H chain) of about 100 kDa and a light chain (Light chain, L chain) of about 50 kDa by a reconstitution process after expression, and again the H chain and L chains are linked by disulfide bonds. Although it has different targets depending on the botulinum toxin type, in common, the H chain binds to a receptor of a nerve cell and forms an endosome containing the toxin through endocytosis, allowing the botulinum toxin to enter the inside. After entering the cell, the L chain exits the endosome and cuts the SNARE protein in the cytoplasm to suppress the secretion of acetylcholine, resulting in muscle paralysis.

일반적으로 단백질 제제는 단백질의 변성, 응집 등에 의하여 안정성이 저하되기 쉽다. 이러한 단백질 제제의 불안정성은 단백질 제제의 보관 시간이 경과됨에 따라 증가되며, 단백질 제제의 제형화에 있어서 주요 목적은 단백질의 용해도, 안정성, 생활성도 등을 유지하는 것이다. 특히, 단백질 제제 가운데 효소는 그들의 3차원적 구조에 따라 생활성도가 크게 달라지며, 정제된 보툴리눔 독소 결정을 생리 식염수 또는 물로 희석하는 경우, 생물학적 활성 및 약제학적 특성이 상실된다. 또한, 40℃ 이상의 온도에서 쉽게 변성됨이 알려져 있다. 즉, 적합한 안정화제가 없으면 보툴리눔 독소의 독성이 빠르게 제거된다는 것이 공지되어 있다.In general, protein preparations tend to have poor stability due to protein denaturation, aggregation, and the like. The instability of the protein preparation increases as the storage time of the protein preparation elapses, and the main purpose in formulating the protein preparation is to maintain the solubility, stability, bioactivity, etc. of the protein. In particular, among protein preparations, enzymes have significant bioactivity depending on their three-dimensional structure, and when purified botulinum toxin crystals are diluted with physiological saline or water, their biological activity and pharmaceutical properties are lost. In addition, it is known that it is easily denatured at a temperature of 40° C. or higher. That is, it is known that the toxicity of botulinum toxin is rapidly eliminated in the absence of a suitable stabilizer.

약제학적 목적으로 유통되는 보툴리눔 독소는 대개 비-독소 단백질(non-toxin protein)과 보툴리눔 독소 단백질 분자를 포함하는 독소 복합체로, 비-독소 단백질은 독소 복합체에서 보툴리눔 독소 분자를 안정화시키고, 변성으로부터 보호하여 보툴리눔 독소의 활성을 보호하는 역할을 한다고 할 수 있다. 화장료의 목적으로 보툴리눔 독소를 사용하기 위해서는 약독화(toxicity attenuation) 과정과 피부 투과성을 갖춰야 한다. 따라서, 비-독소 단백질과의 함께 독소 복합체 형태가 아닌, L 사슬만으로 보툴리눔 독소의 활성을 유지할 수 있도록 하는 조성물의 개발이 요구되었다.Botulinum toxin distributed for pharmaceutical purposes is usually a toxin complex comprising a non-toxin protein and a botulinum toxin protein molecule. The non-toxin protein stabilizes the botulinum toxin molecule in the toxin complex and protects it from denaturation. Therefore, it can be said that it plays a role in protecting the activity of botulinum toxin. In order to use botulinum toxin for cosmetic purposes, it is necessary to have a toxicity attenuation process and skin permeability. Therefore, there has been a demand for the development of a composition capable of maintaining the activity of a botulinum toxin with only the L chain, rather than in the form of a toxin complex with a non-toxin protein.

미국 등록특허 제8,617,568호US Patent No. 8,617,568

보툴리눔 독소의 경쇄는 펩티드 결합을 가수분해할 수 있는 엔도펩티다제(endopeptidase)로, 보툴리눔 독소 A형의 경우, SNARE 단백질 가운데 SNAP-25를 절단한다. 따라서, 신경세포의 아세틸콜린 분비 억제는 경쇄 단독으로도 가능하다고 할 수 있다. 이에 착안하여, 근육 마비 효과를 가지는 보툴리눔 독소 경쇄만을 가지는 조성물을 개발하고자 하였으며, 바람직하게는 경피 전달이 가능한 형태로 개발하고자 하였다.The light chain of botulinum toxin is an endopeptidase that can hydrolyze peptide bonds, and in the case of botulinum toxin type A, it cleaves SNAP-25 among the SNARE proteins. Therefore, it can be said that the inhibition of acetylcholine secretion by neurons is possible with the light chain alone. Taking this into consideration, an attempt was made to develop a composition having only a botulinum toxin light chain having a muscle paralysis effect, preferably in a form capable of transdermal delivery.

따라서 본 발명이 해결하고자 하는 과제는, 재조합 보툴리눔 독소 경쇄 단백질을 함유한 안정한 조성물을 제공하는 것이다.Accordingly, an object of the present invention is to provide a stable composition containing a recombinant botulinum toxin light chain protein.

특히, 본 발명은 더 나아가 냉장 조건에서뿐만 아니라 상온에서 장시간 보관 시에도, 보툴리눔 독소의 엔도펩티다제(endopeptidase) 활성을 유지하는 조성물을 제공하고자 하며, 더욱 바람직하게는 사용상의 불편함을 해소하기 위한 제제 형태로서 동결건조형태가 아닌 액상형태의 조성물을 제공하고자 한다.In particular, the present invention further aims to provide a composition that maintains the endopeptidase activity of botulinum toxin even when stored for a long time at room temperature as well as under refrigerated conditions, and more preferably, for solving the inconvenience of use It is intended to provide a composition in a liquid form rather than a freeze-dried form as a formulation.

본 발명자들은 본 발명의 조성물이 특정한 안정화제를 통해 재조합 보툴리눔 독소 경쇄 단백질의 안정성을 충분히 확보하면서, 재조합 보툴리눔 독소 경쇄 단백질의 생물학적 활성을 사용 가능한 수준으로 유지하는 놀라운 효과를 발견하여, 본 발명을 완성하게 되었다.The present inventors found a surprising effect of maintaining the biological activity of the recombinant botulinum toxin light chain protein at a usable level while sufficiently ensuring the stability of the recombinant botulinum toxin light chain protein through a specific stabilizing agent, and completed the present invention did it

구체적으로, 본 발명자들은 재조합 보툴리눔 독소 경쇄 단백질 함유 조성물에 당 알코올, 폴리올, 고분자 화합물, 계면활성제, 산화방지제 등 다양한 단백질 안정화를 위한 안정화제들 중 어느 하나 이상을 포함시키어 실온에서 단백질 안정성이 증진된 조성물을 제조하고자 시도했으나, 안정화제의 종류에 따라 재조합 보툴리눔 독소 경쇄 단백질 안정성이 크게 다름을 확인하였다.Specifically, the present inventors have found that the composition containing recombinant botulinum toxin light chain protein contains any one or more of various stabilizing agents for protein stabilization, such as sugar alcohol, polyol, high molecular compound, surfactant, and antioxidant, to improve protein stability at room temperature. An attempt was made to prepare a composition, but it was confirmed that the stability of the recombinant botulinum toxin light chain protein was significantly different depending on the type of stabilizer.

각종 단백질 안정화제 중에서, 당 알코올(Sugar alcohol)만이 보툴리눔 독소 A형 경쇄 단백질 또는 이의 절편(실질적으로 동일한 효능을 가지는 절편)의 안정성을 크게 증진시켰으며, 이러한 예기치 못한 실험결과를 확인하여 본 발명을 완성하였다.Among various protein stabilizers, only sugar alcohol significantly improved the stability of the botulinum toxin type A light chain protein or fragment thereof (fragment having substantially the same efficacy), and the present invention by confirming these unexpected experimental results completed.

본 발명에 따른 당 알코올은 전형적으로 당으로부터 유도된 유기화합물로, 각각의 탄소 원자에 하나의 하이드록시기(-OH)가 부착된 물질이다. 탄소수에 따라 사슬의 길이가 다양하며, 하이드록시기의 방향에 따라 여러 종류의 이성질체가 존재한다. 여러 개의 하이드록시기를 포함하고 있기 때문에 폴리올(Polyol)로 분류되지만, 본 명세서에서는 폴리올과 당 알코올을 구분하여, 폴리올을 당 알코올을 제외한 하이드록시기를 갖는 물질로 정의한다.The sugar alcohol according to the present invention is typically an organic compound derived from sugar, and is a substance in which one hydroxyl group (-OH) is attached to each carbon atom. The length of the chain varies according to the number of carbons, and various types of isomers exist depending on the direction of the hydroxyl group. Although it is classified as a polyol because it contains several hydroxyl groups, in the present specification, polyols and sugar alcohols are distinguished, and polyols are defined as substances having hydroxyl groups excluding sugar alcohols.

본 발명은 보툴리눔 독소 A형 경쇄 단백질 또는 이의 절편 및 안정화제를 포함하는 조성물이며, 여기서 안정화제는 당 알코올인 조성물을 제공한다.The present invention provides a composition comprising a botulinum toxin type A light chain protein or fragment thereof and a stabilizing agent, wherein the stabilizing agent is a sugar alcohol.

바람직하게, 본 발명에 따른 보툴리눔 독소 A형 경쇄 단백질은 서열 번호: 1의 448개의 아미노산 서열을 포함하는 보툴리눔 독소 A형 경쇄 단백질이다. 본 발명의 바람직한 일 실시예에서, 본 발명에 따른 보툴리눔 독소 A형 경쇄 단백질은 서열 번호: 1로 이루어진다.Preferably, the botulinum toxin type A light chain protein according to the present invention is a botulinum toxin type A light chain protein comprising the 448 amino acid sequence of SEQ ID NO:1. In a preferred embodiment of the present invention, the botulinum toxin type A light chain protein according to the present invention consists of SEQ ID NO: 1.

본 발명의 일 실시예에서, 보툴리눔 독소 A형 경쇄 단백질은 경쇄 단백질 아미노산 서열 이외에 단백질 생산, 단백질 정제 등의 목적으로 추가적인 아미노산 서열을 더 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 보툴리눔 독소 A형 경쇄 단백질은 서열 번호: 1의 아미노산 서열에 서열 번호: 3의 21개 아미노산 서열과 같은 추가적인 아미노산 서열을 추가로 더 포함할 수 있다.In one embodiment of the present invention, the botulinum toxin type A light chain protein may further include an additional amino acid sequence for the purpose of protein production, protein purification, etc. in addition to the light chain protein amino acid sequence. For example, the botulinum toxin type A light chain protein of the present invention may further include an additional amino acid sequence such as the 21 amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.

또한, 본 발명에 있어 본 발명에 따른 보툴리눔 독소 A형 경쇄 단백질 대신 이와 동일한 효능을 가진 절편이 이용될 수 있다. 예를 들어, 이러한 절편으로 서열 번호: 2의 425개의 아미노산 서열을 포함하는 보툴리눔 독소 A형 경쇄 단백질 절편이 이용될 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 본 발명에 따른 보툴리눔 독소 A형 경쇄 단백질 절편은 서열 번호: 2의 서열로 이루어진다.Also, in the present invention, a fragment having the same efficacy may be used instead of the botulinum toxin type A light chain protein according to the present invention. For example, a botulinum toxin type A light chain protein fragment including the 425 amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 may be used as the fragment. In one embodiment of the present invention, the botulinum toxin type A light chain protein fragment according to the present invention consists of the sequence of SEQ ID NO:2.

본 발명의 일 실시예에서, 보툴리눔 독소 A형 경쇄 단백질 절편은 절편의 아미노산 서열 이외에 단백질 생산, 단백질 정제 등의 목적으로 추가적인 아미노산 서열을 더 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 보툴리눔 독소 A형 경쇄 단백질 절편은 서열 번호: 2의 아미노산 서열에 서열 번호: 3의 21개 아미노산 서열과 같은 추가적인 아미노산 서열을 추가로 더 포함할 수 있다.In one embodiment of the present invention, the botulinum toxin type A light chain protein fragment may further include an additional amino acid sequence for the purpose of protein production, protein purification, etc. in addition to the amino acid sequence of the fragment. For example, the botulinum toxin type A light chain protein fragment of the present invention may further include an additional amino acid sequence such as the 21 amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.

다만, 추가적인 아미노산 서열을 더 포함하더라도 보툴리눔 독소 A형 경쇄 단백질 또는 이의 절편의 기능이 달라지는 것은 아니다.However, even if an additional amino acid sequence is further included, the function of the botulinum toxin type A light chain protein or fragment thereof is not changed.

본 발명의 일 실시예에서, 보툴리눔 독소 A형 경쇄 단백질은 보툴리눔 독소 A형 단백질의 아미노산 서열 가운데 효소 활성을 갖는 N-말단 부분의 아미노산 서열을 이용한 재조합 단백질이다.In one embodiment of the present invention, the botulinum toxin type A light chain protein is a recombinant protein using the amino acid sequence of the N-terminal portion having enzymatic activity among the amino acid sequence of the botulinum toxin type A protein.

본 명세서에 사용된 용어 "재조합" 단백질은 숙주 세포, 예컨대 박테리아 또는 진핵생물 세포 내로 도입된 이종 (예를 들어, 재조합) 핵산에 의해 코딩되는 단백질이다. 즉 대량의 산물이 생산될 수 있도록 유전자 조작을 거친 단백질을 지칭한다.As used herein, the term “recombinant” protein is a protein encoded by a heterologous (eg, recombinant) nucleic acid introduced into a host cell, such as a bacterial or eukaryotic cell. That is, it refers to a protein that has been genetically engineered so that a large amount of product can be produced.

본 발명에 따른 단백질 또는 이의 절편은 당해 기술분야에 공지된 통상적인 방법에 따라 제조할 수 있다. 예를 들어, 미국 등록특허 제10,300,118호 등에 언급된 방법이 이용될 수 있다.The protein or fragment thereof according to the present invention can be prepared according to a conventional method known in the art. For example, the method mentioned in US Patent No. 10,300,118 and the like can be used.

본 발명의 일 실시예에서, 본 발명에 따른 조성물은 바람직하게는 액상 조성물이다. 본 발명의 조성물의 액상 형태는 동결건조형태에 비해 소비자의 사용상의 불편함을 개선할 수 있을 뿐만 아니라, 화장품의 제조 과정에 있어서, 동결건조형태의 단백질의 안정성을 확보하기 위한 질소 충전 과정을 필요로 하지 않아 경제적인 측면에서 유리하다. 통상적으로 액상 형태에서 안정성이 떨어지는데, 본 발명의 조성물은 이러한 액상 형태에서도 안정성을 유지할 수 있다는 큰 장점이 있다.In one embodiment of the invention, the composition according to the invention is preferably a liquid composition. The liquid form of the composition of the present invention can not only improve the inconvenience of use by consumers compared to the freeze-dried form, but also requires a nitrogen filling process to secure the stability of the freeze-dried protein in the manufacturing process of cosmetics. This is advantageous from an economic point of view. In general, stability in a liquid form is poor, but the composition of the present invention has a great advantage that it can maintain stability even in such a liquid form.

본 발명의 일 실시예에서, 본 발명에 따른 조성물은 바람직하게는 화장료 조성물, 더욱 바람직하게는 피부 주름 개선용 화장료 조성물을 제공한다.In one embodiment of the present invention, the composition according to the present invention preferably provides a cosmetic composition, more preferably a cosmetic composition for improving skin wrinkles.

본 발명에 있어서, 용어 "주름 개선"이란 피부에 주름이 생성되는 것을 억제 또는 저해하거나, 이미 생성된 주름을 완화시키는 것을 말한다.In the present invention, the term "wrinkle improvement" refers to suppressing or inhibiting the generation of wrinkles on the skin, or alleviating the already generated wrinkles.

본 발명에 있어서, 본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 제형인 용액, 현탁액, 유탁액, 로션, 오일, 화장수, 유연수 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연화장수, 영양화장수, 스킨, 스킨 소프트너, 스킨토너, 아스트린젠트, 밀크로션, 모이스쳐로션, 영양로션, 유액, 에멀젼, 에센스, 영양에센스 등의 화장품 제형으로 제조될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.In the present invention, the cosmetic composition of the present invention may be formulated as a solution, suspension, emulsion, lotion, oil, lotion, soft water, etc., which are formulations commonly prepared in the art, but is not limited thereto. More specifically, it can be prepared in cosmetic formulations such as softening lotion, nutrient lotion, skin, skin softener, skin toner, astringent, milk lotion, moisture lotion, nutrient lotion, emulsion, emulsion, essence, nutritional essence, etc. It is not limited.

본 발명에 있어서, 본 발명의 화장료 조성물은 화장품학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 추가로 포함할 수 있으며, 본 발명의 화장료 조성물에 포함되는 화장품학적으로 허용 가능한 담체는 제형에 따라 다양하다.In the present invention, the cosmetic composition of the present invention may further include one or more cosmetically acceptable carriers, and the cosmetically acceptable carriers included in the cosmetic composition of the present invention vary depending on the formulation.

본 발명에 있어서, 본 발명 조성물의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는, 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되며, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알콜, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜, 소르비탄의 지방산 에스테르 등을 단독으로 또는 조합하여 이용할 수 있다.In the present invention, when the formulation of the composition of the present invention is a solution or emulsion, a solvent, solubilizer or emulsifier is used as a carrier component, for example, water, ethanol, isopropanol, ethyl carbonate, ethyl acetate, benzyl alcohol, benzyl Benzoate, propylene glycol, 1,3-butyl glycol oil, glycerol aliphatic ester, polyethylene glycol, fatty acid ester of sorbitan, etc. may be used alone or in combination.

본 발명에 있어서, 본 발명 조성물의 제형이 현탁액인 경우에는, 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알콜, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가, 트라칸트 등을 단독으로 또는 조합하여 이용할 수 있다.In the present invention, when the formulation of the composition of the present invention is a suspension, as a carrier component, a liquid diluent such as water, ethanol or propylene glycol, ethoxylated isostearyl alcohol, polyoxyethylene sorbitol ester, and polyoxyethylene sorbitan ester Such suspending agents, microcrystalline cellulose, aluminum metahydroxide, bentonite, agar, tracanth, and the like may be used alone or in combination.

본 발명에 있어서, 본 발명의 화장료 조성물은 통상적인 화장료 제조법을 이용하여 제조될 수 있으며, 본 발명의 화장료 조성물은 화장품의 형태로 제조될 수 있다. 이러한 화장품은 추가의 성분을 임의로 선정하여 적절히 배합할 수 있다. 예를 들어, 점증제, 계면활성제, 보습제, 연마제, 감미제, pH조정제, 방부제, 결합제, 습윤제, 기포제, 용해화제, 안료 및 향료와 같은 통상적인 성분을 포함할 수 있다.In the present invention, the cosmetic composition of the present invention may be prepared using a conventional cosmetic preparation method, and the cosmetic composition of the present invention may be prepared in the form of cosmetics. Such cosmetics can be appropriately formulated by selecting additional ingredients arbitrarily. For example, it may contain conventional ingredients such as thickeners, surfactants, humectants, abrasives, sweeteners, pH adjusters, preservatives, binders, wetting agents, foaming agents, solubilizers, pigments and flavoring agents.

본 발명에 따른 안정화제는 당 알코올이다. 당 알코올, 폴리올, 고분자 화합물 등을 포함하는 다양한 물질들 중에 당 알코올이 본 발명에 따른 보툴리눔 독소 A형 경쇄 단백질 또는 이의 절편의 안정성에 매우 효과적이었다.The stabilizing agent according to the invention is a sugar alcohol. Among various substances including sugar alcohols, polyols, and polymer compounds, sugar alcohols were very effective in stabilizing the botulinum toxin type A light chain protein or fragment thereof according to the present invention.

본 발명의 일 실시예에서, 본 발명에 따른 안정화제는 바람직하게는 탄소수가 6 이하이며, 더 바람직하게는 탄소수가 2 내지 6인 당 알코올이다.In one embodiment of the present invention, the stabilizer according to the present invention is preferably a sugar alcohol having 6 or less carbon atoms, more preferably 2 to 6 carbon atoms.

본 발명의 일 실시예에서, 본 발명에 따른 안정화제는 바람직하게는 20℃에서 물에서의 용해도가 150 mg/mL 이상이며, 더 바람직하게는 20℃에서 물에서의 용해도가 150 mg/mL 내지 10,000 mg/mL인 당 알코올이다.In one embodiment of the present invention, the stabilizing agent according to the present invention preferably has a solubility in water of 150 mg/mL or more at 20°C, more preferably a solubility in water of 150 mg/mL to 20°C It is a sugar alcohol of 10,000 mg/mL.

본 발명의 일 실시예에서, 본 발명에 따른 안정화제는 탄소수가 6 이하인 당 알코올 가운데, 20℃에서 물에서의 용해도가 150 mg/mL 이상인 당 알코올이다. 바람직하게는, 상기 안정화제는 탄소수가 2 내지 6이고, 20℃ 물에서 150 mg/mL 내지 10,000 mg/mL의 용해도를 갖는 당 알코올이다.In one embodiment of the present invention, the stabilizer according to the present invention is a sugar alcohol having a solubility in water of 150 mg/mL or more at 20°C among sugar alcohols having 6 or less carbon atoms. Preferably, the stabilizer is a sugar alcohol having 2 to 6 carbon atoms and a solubility of 150 mg/mL to 10,000 mg/mL in water at 20°C.

본 발명의 일 실시예에서, 본 발명에 따른 안정화제는 에틸렌 글라이콜(Ethylene glycol), 글리세롤(Glycerol), 에리스리톨(Erythritol), 트레이톨(Threitol), 아라비톨(Arabitol), 자일리톨(Xylitol), 리비톨(Ribitol), 솔비톨(Sorbitol), 이디톨(Iditol) 또는 이들의 혼합물이다. 바람직하게는, 본 발명의 안정화제는 글리세롤(Glycerol), 자일리톨(Xylitol), 솔비톨(Sorbitol) 또는 이들의 혼합물이며, 더욱 바람직하게는, 글리세롤이다. 글리세롤이 다른 안정화제들보다 훨씬 더 좋은 효과를 나타내었다.In one embodiment of the present invention, the stabilizer according to the present invention is ethylene glycol, glycerol, erythritol, threitol, arabitol, xylitol , Ribitol, Sorbitol, Iditol, or a mixture thereof. Preferably, the stabilizing agent of the present invention is glycerol, xylitol, sorbitol, or a mixture thereof, and more preferably, glycerol. Glycerol showed a much better effect than other stabilizers.

본 발명의 일 실시예에서, 본 발명은 안정화제가 조성물 총 중량 대비 50 중량% 이하, 바람직하게는 20 내지 50 중량%인 조성물을 제공한다. 본 발명의 안정화제가 유효한 단백질 안정화 효과를 갖기 위하여 조성물 총 중량 대비 20 중량% 이상 구성되어야 한다.In one embodiment of the present invention, the present invention provides a composition in which the stabilizer is 50% by weight or less, preferably 20 to 50% by weight, based on the total weight of the composition. In order to have an effective protein stabilization effect, the stabilizer of the present invention should be composed of 20% by weight or more based on the total weight of the composition.

본 명세서에 사용된 용어 "안정한", "안정화하는", "안정화시키다" 또는 "안정화"는 재조합 보툴리눔 독소 경쇄 단백질을 25℃ 이하에서 보관하였을 때 효소 활성이 특정 조성물로 재구성되었을 때의 효소 활성의 1/3 수준 이상으로 유지되는 것을 의미한다. '효소 활성이 1/3 수준 이상'이 의미하는 바는 미국 등록특허 제8,617,568호에서 기존 보툴리눔 독소 단백질의 평가 시 3 유닛(Unit) 처리하여 1 유닛 이상의 활성을 보이면 그 활성이 유의미하다고 평가하는 것과 동일하게 기준을 설정하였다.As used herein, the terms “stable,” “stabilizing,” “stabilize,” or “stabilization” refer to the enzyme activity when the recombinant botulinum toxin light chain protein is stored at 25° C. or less and the enzyme activity when reconstituted into a specific composition. It means that it is maintained above 1/3 level. The meaning of 'enzyme activity of 1/3 or higher' means that in US Patent No. 8,617,568, when evaluating the existing botulinum toxin protein, it is evaluated that the activity is significant when it shows activity of 1 unit or more by treating 3 units. The standards were set in the same way.

본 발명에 기재된 모든 성분은, 바람직하게는, 한국, 중국, 미국, 유럽, 일본 등의 관련 법규, 규범 (예를 들어, 화장품 안전 기준 등에 관한 규정(한국), 화장품 안전 기술 규범(중국), 위생 규범(중국)) 등에서 규정한 최대사용치를 초과하지 않는다. 즉, 바람직하게, 본 발명에 따른 화장료 또는 퍼스널 케어용 조성물은 각국의 관련 법규, 규범에서 허용되는 함량 한도로 본 발명에 따른 성분들을 포함한다.All ingredients described in the present invention, preferably, relevant laws and regulations, such as Korea, China, the United States, Europe, Japan, etc. (for example, regulations on cosmetic safety standards (Korea), cosmetic safety technical standards (China), Do not exceed the maximum use value stipulated in sanitary standards (China), etc. That is, preferably, the composition for cosmetic or personal care according to the present invention contains the ingredients according to the present invention within the content limit allowed by the relevant laws and regulations of each country.

본 발명은 안정성이 개선된, 즉, 그 효과가 장기간 유지될 수 있는 보툴리눔 독소 A형 경쇄 단백질 또는 이의 절편을 포함하는 조성물을 제공한다. 특히, 본 발명의 조성물은 액상인 제형에서도 안정성이 확보될 수 있다.The present invention provides a composition comprising a botulinum toxin type A light chain protein or fragment thereof with improved stability, ie, the effect can be maintained for a long period of time. In particular, the composition of the present invention can ensure stability even in a liquid formulation.

도 1은 다양한 안정화제를 포함하는 조성물에서 재조합 보툴리눔 독소 경쇄 단백질의 안정성 확보 기간을 나타낸 것이다.
도 2는 폴리솔베이트 20를 0.2중량% 포함하는 조성물의 보툴리눔 독소 효소 활성 평가 결과이다.
도 3은 폴리솔베이트 20 0.2중량%와 메티오닌 0.3중량%를 포함하는 조성물의 보툴리눔 독소 효소 활성 평가 결과이다.
도 4는 폴록사머 188을 1중량% 포함하는 조성물의 보툴리눔 독소 효소 활성 평가 결과이다.
도 5는 트록세루틴을 3중량% 포함하는 조성물의 보툴리눔 독소 효소 활성 평가 결과이다.
도 6은 글리세롤을 20 또는 50중량% 포함하는 조성물의 보툴리눔 독소 효소 활성 평가 결과이다.
도 7은 자일리톨을 20 또는 50중량% 포함하는 조성물의 보툴리눔 독소 효소 활성 평가 결과이다.
도 8은 솔비톨을 20 또는 50중량% 포함하는 조성물의 보툴리눔 독소 효소 활성 평가 결과이다.
도 9는 1,3-부틸렌글라이콜(1,3-BG)을 20중량% 포함하는 조성물의 보툴리눔 독소 효소 활성 평가 결과이다.
도 10은 디프로필렌글라이콜(DPG)을 20중량% 포함하는 조성물의 보툴리눔 독소 효소 활성 평가 결과이다.1 shows the stability period for a recombinant botulinum toxin light chain protein in a composition containing various stabilizers.
2 is a result of evaluation of botulinum toxin enzyme activity of a composition containing 0.2% by weight of polysorbate 20;
3 is a result of evaluation of botulinum toxin enzyme activity of a composition comprising 0.2 wt% of polysorbate 20 and 0.3 wt% of methionine.
4 is a result of evaluation of botulinum toxin enzyme activity of a composition containing 1% by weight of poloxamer 188;
5 is a result of evaluation of botulinum toxin enzyme activity of a composition containing 3% by weight of troxerutin.
6 is a result of evaluation of botulinum toxin enzyme activity of a composition containing 20 or 50% by weight of glycerol.
7 is a result of evaluation of botulinum toxin enzyme activity of a composition containing 20 or 50% by weight of xylitol.
8 is a result of evaluation of botulinum toxin enzyme activity of a composition containing 20 or 50% by weight of sorbitol.
9 is a result of evaluation of botulinum toxin enzyme activity of a composition containing 1,3-butylene glycol (1,3-BG) in an amount of 20% by weight;
10 is a result of evaluation of botulinum toxin enzyme activity of a composition containing 20% by weight of dipropylene glycol (DPG).

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 본 발명에 따른 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 발명의 실시예는 본 발명이 속한 분야에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.Hereinafter, in order to help the understanding of the present invention, it will be described in more detail through examples. However, the examples according to the present invention are for illustrative purposes of the present invention, and the scope of the present invention should not be construed as being limited to the following examples. The embodiments of the present invention are provided to more completely explain the present invention to those of ordinary skill in the art to which the present invention pertains.

본 발명에 따른 조성물이 나타내는, SNARE 단백질을 절단할 수 있는 엔도펩티다제 활성은 FRET(fluorescence resonance energy transfer) 기반의 보툴리눔 독소 A형 효소 활성 평가(SNAPtide® 521, List Biological Laboratories, Inc.)를 통해 확인하였다.The endopeptidase activity capable of cleaving SNARE proteins exhibited by the composition according to the present invention was evaluated by fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based botulinum toxin type A enzyme activity evaluation (SNAPtide® 521, List Biological Laboratories, Inc.). confirmed through.

단백질 안정화를 위한 특정 안정화제와 재조합 보툴리눔 독소 A형 경쇄 단백질(이하, '재조합 보툴리눔 독소 경쇄 단백질'이라 지칭함)을 포함하는 조성물을 25℃에서 보관하고, 그 안정성을 SNAPtide® 평가법으로 평가하였다. 그 결과 10주 이상 안정한 재조합 보툴리눔 독소 단백질은 특정 당 알코올, 그 예로, 글리세롤, 솔비톨, 또는 자일리톨을 안정화제로 한 경우로 나타났다. 제시한 세 가지의 당 알코올 가운데 탄소 사슬의 길이가 짧을수록 재조합 보툴리눔 독소 경쇄 단백질을 안정화시키는 효과가 큼을 확인하였다.A composition comprising a specific stabilizer for protein stabilization and recombinant botulinum toxin type A light chain protein (hereinafter referred to as 'recombinant botulinum toxin light chain protein') was stored at 25° C., and the stability was evaluated by the SNAPtide® evaluation method. As a result, the recombinant botulinum toxin protein stable for more than 10 weeks was found to be stabilized with a specific sugar alcohol, such as glycerol, sorbitol, or xylitol. It was confirmed that the shorter the carbon chain length among the three suggested sugar alcohols, the greater the effect of stabilizing the recombinant botulinum toxin light chain protein.

1. 조합 구성1. Combination composition

재조합 보툴리눔 독소 경쇄 단백질과 다양한 단백질 안정화를 위한 안정화제와의 조합에서 재조합 보툴리눔 독소 경쇄 단백질의 안정화 효과를 확인하였다. 안정화제와 단백질의 조합을 제외한 중량은 물과 소량의 pH 조절제로 구성되었다. 본 발명의 실시예에서는 pH 조절제로 인산칼륨(KH2PO4)과 인산이나트륨(Na2HPO4)을 사용하였다. 인산칼륨 0.14중량%, 인산이나트륨 0.8중량%, 염화나트륨(NaCl) 9중량%, 물 90.06중량%의 포스페이트 버퍼(phosphate buffer)로 안정화제와 단백질을 제외한 중량을 채워 대조군과 조합 1 내지 17을 완성하였다.The stabilizing effect of the recombinant botulinum toxin light chain protein was confirmed in combination with the recombinant botulinum toxin light chain protein and a stabilizing agent for stabilizing various proteins. The weight, excluding the combination of stabilizer and protein, consisted of water and a small amount of pH adjuster. In an embodiment of the present invention, potassium phosphate (KH 2 PO 4 ) and disodium phosphate (Na 2 HPO 4 ) were used as pH adjusters. 0.14% by weight of potassium phosphate, 0.8% by weight of disodium phosphate, 9% by weight of sodium chloride (NaCl), and 90.06% by weight of water with phosphate buffer (phosphate buffer) to complete the control and combinations 1 to 17 by filling the weight except for the stabilizer and protein did

재조합 보툴리눔 독소 경쇄 단백질과 당 알코올 계열의 안정화제와의 조합에 의한 단백질 안정화 효과를 확인하기 위한 실험을 위하여 구체적인 일례는 다음 (1) 내지 (9)와 같이 구성하였다.For an experiment to confirm the protein stabilization effect of the combination of the recombinant botulinum toxin light chain protein and a sugar alcohol-based stabilizer, specific examples were constructed as follows (1) to (9).

안정화제stabilizer 중량%weight% 단백질protein 중량%weight% 대조군control -- -- 재조합 보툴리눔 독소 경쇄 단백질Recombinant botulinum toxin light chain protein 0.010.01 조합 1Combination 1 글리세롤glycerol 1010 조합 2combination 2 글리세롤glycerol 2020 조합 3combination 3 글리세롤glycerol 5050 조합 4combination 4 자일리톨xylitol 2020 조합 5combination 5 자일리톨xylitol 5050 조합 6combination 6 솔비톨sorbitol 2020 조합 7combination 7 솔비톨sorbitol 5050 조합 8combination 8 만니톨mannitol 55 조합 9combination 9 만니톨mannitol 1515

재조합 보툴리눔 독소 경쇄 단백질과 당 알코올 이외의 폴리올 계열 안정화제와의 조합에 의한 단백질 안정화 효과를 확인하기 위한 실험을 위하여 구체적인 일례는 다음 (10) 내지 (13)와 같이 구성하였다.For an experiment to confirm the protein stabilization effect of the combination of the recombinant botulinum toxin light chain protein with a polyol-based stabilizer other than sugar alcohol, a specific example was constructed as follows (10) to (13).

안정화제stabilizer 중량%weight% 단백질protein 중량%weight% 조합 10combination 10 1,3-부틸렌글라이콜1,3-butylene glycol 2020 재조합 보툴리눔 독소 경쇄 단백질Recombinant botulinum toxin light chain protein 0.010.01 조합 11combination 11 1,3-부틸렌글라이콜1,3-butylene glycol 5050 조합 12combination 12 디프로필렌글라이콜dipropylene glycol 2020 조합 13combination 13 디프로필렌글라이콜dipropylene glycol 5050

재조합 보툴리눔 독소 경쇄 단백질과 폴리올 계열 이외 안정화제와의 조합에 의한 단백질 안정화 효과를 확인하기 위한 실험을 위하여 구체적인 일례는 다음 (14) 내지 (17)와 같이 구성하였다.For an experiment to confirm the protein stabilization effect of the combination of the recombinant botulinum toxin light chain protein with a stabilizer other than the polyol series, specific examples were constructed as follows (14) to (17).

조합Combination 안정화제stabilizer 중량%weight% 단백질protein 중량%weight% 조합 14combination 14 폴리솔베이트 20Polysorbate 20 0.20.2 재조합 보툴리눔 독소 경쇄 단백질Recombinant botulinum toxin light chain protein 0.010.01 조합 15combination 15 폴리솔베이트 20Polysorbate 20 0.20.2 메티오닌methionine 0.30.3 조합 16combination 16 폴록사머 188Poloxamer 188 1One 조합 17combination 17 트록세루틴troxerutin 33

실시예. 엔도펩티다제 활성 평가Example. Endopeptidase activity evaluation

본 발명에서 사용한 재조합 보툴리눔 독소 경쇄 단백질의 생물학적 기능인 엔도펩티다제 활성의 변화를 통해 단백질 안정성을 평가하는 실험법을 이용하였다.An experimental method was used to evaluate protein stability through changes in endopeptidase activity, which is a biological function of the recombinant botulinum toxin light chain protein used in the present invention.

[표 1], [표 2] 및 [표 3]의 조합에 따라 재조합 보툴리눔 독소 경쇄 단백질과 안정화제를 포함하는 조성물을 만들어 25℃에서 보관하였으며, SNAPtide® 평가법을 통해 재조합 보툴리눔 독소 경쇄 단백질의 효소 활성을 추적하여 단백질 안정성을 평가하였다.A composition containing a recombinant botulinum toxin light chain protein and a stabilizer was prepared according to a combination of [Table 1], [Table 2], and [Table 3] and stored at 25 ° C. Enzyme of recombinant botulinum toxin light chain protein through SNAPtide® evaluation Protein stability was assessed by tracking activity.

(1) 약제학적 목적으로 유통되는 보툴리눔 독소의 비-단백질 안정화제로 사용되는 계면활성제, 그리고 계면활성제와 아미노산의 혼합 조성물(조합 14, 15)의 보툴리눔 독소 효소 활성을 추적하였다. 실험 결과는 도 2와 도 3에 명시하였다.(1) The botulinum toxin enzyme activity of a surfactant used as a non-protein stabilizer of a botulinum toxin distributed for pharmaceutical purposes, and a mixture composition of a surfactant and an amino acid (Combinations 14 and 15) were tracked. Experimental results are shown in FIGS. 2 and 3 .

실험 결과, 계면활성제인 폴리솔베이트 20(Polysorbate 20)을 0.2중량% 혼합하였을 때, 어떠한 안정화제의 추가도 없는 조성물(대조군)에 비해 재조합 보툴리눔 독소 경쇄 단백질의 안정성 확보 기간이 증가하지만, 그 정도가 매우 미미하여 실용 불가능하였다.As a result of the experiment, when 0.2% by weight of the surfactant, Polysorbate 20, was mixed, the stability period of the recombinant botulinum toxin light chain protein was increased compared to the composition without any stabilizer (control), but the amount was so small that it was not practical.

또한, 폴리솔베이트 20 0.2중량%에 메티오닌(Methionine)을 0.3중량% 혼합하였을 때, 오히려 대조군과 유사한 단백질 안정성 확보 기간을 가졌다. 즉, 재조합 보툴리눔 독소 경쇄 단백질의 안정화를 위해서는 기존 보툴리눔 독소의 안정화에 사용된 안정화제가 아닌 새로운 안정화제의 사용이 필요함을 확인하였다(도 2, 도 3).In addition, when 0.3% by weight of methionine was mixed with 0.2% by weight of polysorbate 20, it had a period of securing protein stability similar to that of the control group. That is, it was confirmed that in order to stabilize the recombinant botulinum toxin light chain protein, it is necessary to use a new stabilizer rather than the stabilizer used for stabilizing the existing botulinum toxin ( FIGS. 2 and 3 ).

(2) 재조합 보툴리눔 독소 경쇄 단백질의 안정화제를 탐색하기 위해, 다른 종류의 화합물인 고분자 중합체와 산화방지제가 포함된 조성물(조합 16, 17)의 보툴리눔 독소 효소 활성을 추적하였다. 실험 결과는 도 4과 도 5에 명시하였다.(2) In order to search for a stabilizer for recombinant botulinum toxin light chain protein, the botulinum toxin enzyme activity of compositions (combinations 16 and 17) containing different types of compounds, a high molecular polymer and an antioxidant, were traced. Experimental results are indicated in FIGS. 4 and 5 .

실험 결과, 고분자 중합체인 폴록사머 188(Poloxamer 188)을 혼합하거나, 산화방지제인 트록세루틴(Troxerutin)을 혼합하였을 때, 대조군에 비해 단백질 안정성 확보 기간이 증가하지만, 실용적인 수준은 아님을 확인하였다(도 4, 도 5).As a result of the experiment, when the high molecular weight polymer Poloxamer 188 was mixed or the antioxidant Troxerutin was mixed, the period of securing protein stability was increased compared to the control, but it was confirmed that it was not at a practical level ( 4, 5).

(3) 당 알코올을 포함하는 조성물(조합 1 내지 9)의 실험 결과는 도 6 내지 8에 명시하였다. (3) Experimental results of compositions containing sugar alcohol (Combinations 1 to 9) are shown in FIGS. 6 to 8 .

실험 결과, 자일리톨과 솔비톨을 각각 포함하는 조성물의 재조합 보툴리눔 독소 경쇄 단백질의 활성을 추적하였을 때, 탄소 사슬의 길이가 더 짧은 자일리톨이 탄소 사슬의 길이가 더 긴 솔비톨보다 단백질 안정화 효과가 뛰어남을 확인하였다. 만니톨(Mannitol)은 솔비톨의 이성질체로, 유사한 구조로 인해 솔비톨과 유사한 수준의 단백질 안정화 효과를 기대하였으나, 낮은 용해도로 인하여 유의미한 단백질 안정화 효과를 얻지 못하였다.As a result of the experiment, when the activity of the recombinant botulinum toxin light chain protein of the composition containing xylitol and sorbitol was traced, it was confirmed that xylitol with a shorter carbon chain had a superior protein stabilization effect than sorbitol with a longer carbon chain. . Mannitol (Mannitol) is an isomer of sorbitol, and due to a similar structure, a protein stabilizing effect at a level similar to that of sorbitol was expected, but a significant protein stabilizing effect was not obtained due to low solubility.

단백질 안정화 효과를 보이는 세 가지의 당 알코올, 즉, 글리세롤, 자일리톨, 솔비톨은 모두 농도와 안정화 효과가 비례하며 화합물의 크기가 작을수록 안정화 효과가 큼을 확인하였다(도 6 내지 8).It was confirmed that the three sugar alcohols showing the protein stabilizing effect, ie, glycerol, xylitol, and sorbitol, all had a proportional concentration and stabilizing effect, and the smaller the compound, the greater the stabilizing effect ( FIGS. 6 to 8 ).

(4) 당 알코올을 제외한 폴리올 가운데, 글리세롤과 유사한 짧은 선형의 구조를 가지며, 화장료로 널리 사용하고 있는 폴리올을 포함하는 조성물(조합 10 내지 13)의 실험 결과는 도 9과 도 10에 명시하였다.(4) Among polyols excluding sugar alcohols, the experimental results of compositions (Combinations 10 to 13) containing polyols having a short linear structure similar to glycerol and widely used as cosmetics are shown in FIGS. 9 and 10 .

실험 결과, 제시된 두 가지의 폴리올(1,3-부틸렌글라이콜(1,3-Butylene Glycol, 1,3-BG), 디프로필렌글라이콜(Dipropylene Glycol, DPG) 각각을 20 중량% 포함하는 조합의 경우, 대조군에 비해 단백질 안정성 확보 기간이 증가하지만, 실용적인 수준은 아님을 확인하였다. 또한, 상기 두 가지 폴리올은 당 알코올과 달리 농도와 안정화 효과가 비례하지 않음을 확인하였다(도 9, 도 10).As a result of the experiment, 20% by weight of each of the two presented polyols (1,3-butylene glycol (1,3-BG) and dipropylene glycol (DPG)) In the case of the combination, it was confirmed that the period for securing protein stability was increased compared to the control, but not at a practical level.In addition, it was confirmed that the concentration and stabilization effect of the two polyols were not proportional to the sugar alcohol (Fig. 9, Fig. 10).

이상에서, 출원인은 본 발명의 바람직한 실시예들을 설명하였지만, 이와 같은 실시예들은 본 발명의 기술적 사상을 구현하는 일 실시예일뿐이며 본 발명의 기술적 사상을 구현하는 한 어떠한 변경예 또는 수정예도 본 발명의 범위에 속하는 것으로 해석되어야 한다.In the above, the applicant has described preferred embodiments of the present invention, but these embodiments are only one embodiment implementing the technical idea of the present invention, and any changes or modifications are not allowed as long as the technical idea of the present invention is implemented. should be construed as within the scope.

<110> LG HOUSEHOLD & HEALTH CARE LTD. <120> Composition comprising recombinant botulinum toxin light chain protein having improved stability <130> P19-00111, LH19-070 <160> 3 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 448 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 1 Met Pro Phe Val Asn Lys Gln Phe Asn Tyr Lys Asp Pro Val Asn Gly 1 5 10 15 Val Asp Ile Ala Tyr Ile Lys Ile Pro Asn Ala Gly Gln Met Gln Pro 20 25 30 Val Lys Ala Phe Lys Ile His Asn Lys Ile Trp Val Ile Pro Glu Arg 35 40 45 Asp Thr Phe Thr Asn Pro Glu Glu Gly Asp Leu Asn Pro Pro Pro Glu 50 55 60 Ala Lys Gln Val Pro Val Ser Tyr Tyr Asp Ser Thr Tyr Leu Ser Thr 65 70 75 80 Asp Asn Glu Lys Asp Asn Tyr Leu Lys Gly Val Thr Lys Leu Phe Glu 85 90 95 Arg Ile Tyr Ser Thr Asp Leu Gly Arg Met Leu Leu Thr Ser Ile Val 100 105 110 Arg Gly Ile Pro Phe Trp Gly Gly Ser Thr Ile Asp Thr Glu Leu Lys 115 120 125 Val Ile Asp Thr Asn Cys Ile Asn Val Ile Gln Pro Asp Gly Ser Tyr 130 135 140 Arg Ser Glu Glu Leu Asn Leu Val Ile Ile Gly Pro Ser Ala Asp Ile 145 150 155 160 Ile Gln Phe Glu Cys Lys Ser Phe Gly His Glu Val Leu Asn Leu Thr 165 170 175 Arg Asn Gly Tyr Gly Ser Thr Gln Tyr Ile Arg Phe Ser Pro Asp Phe 180 185 190 Thr Phe Gly Phe Glu Glu Ser Leu Glu Val Asp Thr Asn Pro Leu Leu 195 200 205 Gly Ala Gly Lys Phe Ala Thr Asp Pro Ala Val Thr Leu Ala His Glu 210 215 220 Leu Ile His Ala Gly His Arg Leu Tyr Gly Ile Ala Ile Asn Pro Asn 225 230 235 240 Arg Val Phe Lys Val Asn Thr Asn Ala Tyr Tyr Glu Met Ser Gly Leu 245 250 255 Glu Val Ser Phe Glu Glu Leu Arg Thr Phe Gly Gly His Asp Ala Lys 260 265 270 Phe Ile Asp Ser Leu Gln Glu Asn Glu Phe Arg Leu Tyr Tyr Tyr Asn 275 280 285 Lys Phe Lys Asp Ile Ala Ser Thr Leu Asn Lys Ala Lys Ser Ile Val 290 295 300 Gly Thr Thr Ala Ser Leu Gln Tyr Met Lys Asn Val Phe Lys Glu Lys 305 310 315 320 Tyr Leu Leu Ser Glu Asp Thr Ser Gly Lys Phe Ser Val Asp Lys Leu 325 330 335 Lys Phe Asp Lys Leu Tyr Lys Met Leu Thr Glu Ile Tyr Thr Glu Asp 340 345 350 Asn Phe Val Lys Phe Phe Lys Val Leu Asn Arg Lys Thr Tyr Leu Asn 355 360 365 Phe Asp Lys Ala Val Phe Lys Ile Asn Ile Val Pro Lys Val Asn Tyr 370 375 380 Thr Ile Tyr Asp Gly Phe Asn Leu Arg Asn Thr Asn Leu Ala Ala Asn 385 390 395 400 Phe Asn Gly Gln Asn Thr Glu Ile Asn Asn Met Asn Phe Thr Lys Leu 405 410 415 Lys Asn Phe Thr Gly Leu Phe Glu Phe Tyr Lys Leu Leu Cys Val Arg 420 425 430 Gly Ile Ile Thr Ser Lys Thr Lys Ser Leu Asp Lys Gly Tyr Asn Lys 435 440 445 <210> 2 <211> 425 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 2 Met Pro Phe Val Asn Lys Gln Phe Asn Tyr Lys Asp Pro Val Asn Gly 1 5 10 15 Val Asp Ile Ala Tyr Ile Lys Ile Pro Asn Ala Gly Gln Met Gln Pro 20 25 30 Val Lys Ala Phe Lys Ile His Asn Lys Ile Trp Val Ile Pro Glu Arg 35 40 45 Asp Thr Phe Thr Asn Pro Glu Glu Gly Asp Leu Asn Pro Pro Pro Glu 50 55 60 Ala Lys Gln Val Pro Val Ser Tyr Tyr Asp Ser Thr Tyr Leu Ser Thr 65 70 75 80 Asp Asn Glu Lys Asp Asn Tyr Leu Lys Gly Val Thr Lys Leu Phe Glu 85 90 95 Arg Ile Tyr Ser Thr Asp Leu Gly Arg Met Leu Leu Thr Ser Ile Val 100 105 110 Arg Gly Ile Pro Phe Trp Gly Gly Ser Thr Ile Asp Thr Glu Leu Lys 115 120 125 Val Ile Asp Thr Asn Cys Ile Asn Val Ile Gln Pro Asp Gly Ser Tyr 130 135 140 Arg Ser Glu Glu Leu Asn Leu Val Ile Ile Gly Pro Ser Ala Asp Ile 145 150 155 160 Ile Gln Phe Glu Cys Lys Ser Phe Gly His Glu Val Leu Asn Leu Thr 165 170 175 Arg Asn Gly Tyr Gly Ser Thr Gln Tyr Ile Arg Phe Ser Pro Asp Phe 180 185 190 Thr Phe Gly Phe Glu Glu Ser Leu Glu Val Asp Thr Asn Pro Leu Leu 195 200 205 Gly Ala Gly Lys Phe Ala Thr Asp Pro Ala Val Thr Leu Ala His Glu 210 215 220 Leu Ile His Ala Gly His Arg Leu Tyr Gly Ile Ala Ile Asn Pro Asn 225 230 235 240 Arg Val Phe Lys Val Asn Thr Asn Ala Tyr Tyr Glu Met Ser Gly Leu 245 250 255 Glu Val Ser Phe Glu Glu Leu Arg Thr Phe Gly Gly His Asp Ala Lys 260 265 270 Phe Ile Asp Ser Leu Gln Glu Asn Glu Phe Arg Leu Tyr Tyr Tyr Asn 275 280 285 Lys Phe Lys Asp Ile Ala Ser Thr Leu Asn Lys Ala Lys Ser Ile Val 290 295 300 Gly Thr Thr Ala Ser Leu Gln Tyr Met Lys Asn Val Phe Lys Glu Lys 305 310 315 320 Tyr Leu Leu Ser Glu Asp Thr Ser Gly Lys Phe Ser Val Asp Lys Leu 325 330 335 Lys Phe Asp Lys Leu Tyr Lys Met Leu Thr Glu Ile Tyr Thr Glu Asp 340 345 350 Asn Phe Val Lys Phe Phe Lys Val Leu Asn Arg Lys Thr Tyr Leu Asn 355 360 365 Phe Asp Lys Ala Val Phe Lys Ile Asn Ile Val Pro Lys Val Asn Tyr 370 375 380 Thr Ile Tyr Asp Gly Phe Asn Leu Arg Asn Thr Asn Leu Ala Ala Asn 385 390 395 400 Phe Asn Gly Gln Asn Thr Glu Ile Asn Asn Met Asn Phe Thr Lys Leu 405 410 415 Lys Asn Phe Thr Gly Leu Phe Glu Phe 420 425 <210> 3 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 3 Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro 1 5 10 15 Arg Gly Ser His Met 20 <110> LG HOUSEHOLD & HEALTH CARE LTD. <120> Composition comprising recombinant botulinum toxin light chain protein having improved stability <130> P19-00111, LH19-070 <160> 3 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 448 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 1 Met Pro Phe Val Asn Lys Gln Phe Asn Tyr Lys Asp Pro Val Asn Gly 1 5 10 15 Val Asp Ile Ala Tyr Ile Lys Ile Pro Asn Ala Gly Gln Met Gln Pro 20 25 30 Val Lys Ala Phe Lys Ile His Asn Lys Ile Trp Val Ile Pro Glu Arg 35 40 45 Asp Thr Phe Thr Asn Pro Glu Glu Gly Asp Leu Asn Pro Pro Glu 50 55 60 Ala Lys Gln Val Pro Val Ser Tyr Tyr Asp Ser Thr Tyr Leu Ser Thr 65 70 75 80 Asp Asn Glu Lys Asp Asn Tyr Leu Lys Gly Val Thr Lys Leu Phe Glu 85 90 95 Arg Ile Tyr Ser Thr Asp Leu Gly Arg Met Leu Leu Thr Ser Ile Val 100 105 110 Arg Gly Ile Pro Phe Trp Gly Gly Ser Thr Ile Asp Thr Glu Leu Lys 115 120 125 Val Ile Asp Thr Asn Cys Ile Asn Val Ile Gln Pro Asp Gly Ser Tyr 130 135 140 Arg Ser Glu Glu Leu Asn Leu Val Ile Ile Gly Pro Ser Ala Asp Ile 145 150 155 160 Ile Gln Phe Glu Cys Lys Ser Phe Gly His Glu Val Leu Asn Leu Thr 165 170 175 Arg Asn Gly Tyr Gly Ser Thr Gln Tyr Ile Arg Phe Ser Pro Asp Phe 180 185 190 Thr Phe Gly Phe Glu Glu Ser Leu Glu Val Asp Thr Asn Pro Leu Leu 195 200 205 Gly Ala Gly Lys Phe Ala Thr Asp Pro Ala Val Thr Leu Ala His Glu 210 215 220 Leu Ile His Ala Gly His Arg Leu Tyr Gly Ile Ala Ile Asn Pro Asn 225 230 235 240 Arg Val Phe Lys Val Asn Thr Asn Ala Tyr Tyr Glu Met Ser Gly Leu 245 250 255 Glu Val Ser Phe Glu Glu Leu Arg Thr Phe Gly Gly His Asp Ala Lys 260 265 270 Phe Ile Asp Ser Leu Gln Glu Asn Glu Phe Arg Leu Tyr Tyr Tyr Asn 275 280 285 Lys Phe Lys Asp Ile Ala Ser Thr Leu Asn Lys Ala Lys Ser Ile Val 290 295 300 Gly Thr Thr Ala Ser Leu Gln Tyr Met Lys Asn Val Phe Lys Glu Lys 305 310 315 320 Tyr Leu Leu Ser Glu Asp Thr Ser Gly Lys Phe Ser Val Asp Lys Leu 325 330 335 Lys Phe Asp Lys Leu Tyr Lys Met Leu Thr Glu Ile Tyr Thr Glu Asp 340 345 350 Asn Phe Val Lys Phe Phe Lys Val Leu Asn Arg Lys Thr Tyr Leu Asn 355 360 365 Phe Asp Lys Ala Val Phe Lys Ile Asn Ile Val Pro Lys Val Asn Tyr 370 375 380 Thr Ile Tyr Asp Gly Phe Asn Leu Arg Asn Thr Asn Leu Ala Ala Asn 385 390 395 400 Phe Asn Gly Gln Asn Thr Glu Ile Asn Asn Met Asn Phe Thr Lys Leu 405 410 415 Lys Asn Phe Thr Gly Leu Phe Glu Phe Tyr Lys Leu Leu Cys Val Arg 420 425 430 Gly Ile Ile Thr Ser Lys Thr Lys Ser Leu Asp Lys Gly Tyr Asn Lys 435 440 445 <210> 2 <211> 425 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 2 Met Pro Phe Val Asn Lys Gln Phe Asn Tyr Lys Asp Pro Val Asn Gly 1 5 10 15 Val Asp Ile Ala Tyr Ile Lys Ile Pro Asn Ala Gly Gln Met Gln Pro 20 25 30 Val Lys Ala Phe Lys Ile His Asn Lys Ile Trp Val Ile Pro Glu Arg 35 40 45 Asp Thr Phe Thr Asn Pro Glu Glu Gly Asp Leu Asn Pro Pro Glu 50 55 60 Ala Lys Gln Val Pro Val Ser Tyr Tyr Asp Ser Thr Tyr Leu Ser Thr 65 70 75 80 Asp Asn Glu Lys Asp Asn Tyr Leu Lys Gly Val Thr Lys Leu Phe Glu 85 90 95 Arg Ile Tyr Ser Thr Asp Leu Gly Arg Met Leu Leu Thr Ser Ile Val 100 105 110 Arg Gly Ile Pro Phe Trp Gly Gly Ser Thr Ile Asp Thr Glu Leu Lys 115 120 125 Val Ile Asp Thr Asn Cys Ile Asn Val Ile Gln Pro Asp Gly Ser Tyr 130 135 140 Arg Ser Glu Glu Leu Asn Leu Val Ile Ile Gly Pro Ser Ala Asp Ile 145 150 155 160 Ile Gln Phe Glu Cys Lys Ser Phe Gly His Glu Val Leu Asn Leu Thr 165 170 175 Arg Asn Gly Tyr Gly Ser Thr Gln Tyr Ile Arg Phe Ser Pro Asp Phe 180 185 190 Thr Phe Gly Phe Glu Glu Ser Leu Glu Val Asp Thr Asn Pro Leu Leu 195 200 205 Gly Ala Gly Lys Phe Ala Thr Asp Pro Ala Val Thr Leu Ala His Glu 210 215 220 Leu Ile His Ala Gly His Arg Leu Tyr Gly Ile Ala Ile Asn Pro Asn 225 230 235 240 Arg Val Phe Lys Val Asn Thr Asn Ala Tyr Tyr Glu Met Ser Gly Leu 245 250 255 Glu Val Ser Phe Glu Glu Leu Arg Thr Phe Gly Gly His Asp Ala Lys 260 265 270 Phe Ile Asp Ser Leu Gln Glu Asn Glu Phe Arg Leu Tyr Tyr Tyr Asn 275 280 285 Lys Phe Lys Asp Ile Ala Ser Thr Leu Asn Lys Ala Lys Ser Ile Val 290 295 300 Gly Thr Thr Ala Ser Leu Gln Tyr Met Lys Asn Val Phe Lys Glu Lys 305 310 315 320 Tyr Leu Leu Ser Glu Asp Thr Ser Gly Lys Phe Ser Val Asp Lys Leu 325 330 335 Lys Phe Asp Lys Leu Tyr Lys Met Leu Thr Glu Ile Tyr Thr Glu Asp 340 345 350 Asn Phe Val Lys Phe Phe Lys Val Leu Asn Arg Lys Thr Tyr Leu Asn 355 360 365 Phe Asp Lys Ala Val Phe Lys Ile Asn Ile Val Pro Lys Val Asn Tyr 370 375 380 Thr Ile Tyr Asp Gly Phe Asn Leu Arg Asn Thr Asn Leu Ala Ala Asn 385 390 395 400 Phe Asn Gly Gln Asn Thr Glu Ile Asn Asn Met Asn Phe Thr Lys Leu 405 410 415 Lys Asn Phe Thr Gly Leu Phe Glu Phe 420 425 <210> 3 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 3 Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro 1 5 10 15 Arg Gly Ser His Met 20

Claims (9)

유효성분으로 보툴리눔 독소 A형 경쇄 단백질 또는 이의 절편을 포함하고, 추가로 안정화제를 포함하는 조성물이며,
상기 안정화제는 글리세롤인, 조성물.A composition comprising botulinum toxin type A light chain protein or a fragment thereof as an active ingredient, and further comprising a stabilizing agent,
The stabilizer is glycerol. 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 제1항에 있어서, 상기 안정화제는 조성물 총 중량 대비 20 내지 50 중량%인, 조성물.The composition of claim 1, wherein the stabilizer is 20 to 50% by weight based on the total weight of the composition. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 액상인, 조성물.The composition of claim 1 , wherein the composition is liquid. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 화장료인, 조성물.The composition of claim 1, wherein the composition is a cosmetic.
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