KR102403691B1

KR102403691B1 - 전환 성장 인자-베타-활성화 키나아제 1의 내인성 억제제 lgals3bp 및 이의 용도

Info

Publication number: KR102403691B1
Application number: KR1020190146948A
Authority: KR
Inventors: 정익주; 조상희; 배우균; 홍창수; 선은진; 박미라; 최지나; 박명숙; 김대환
Original assignee: 전남대학교산학협력단
Priority date: 2019-11-15
Filing date: 2019-11-15
Publication date: 2022-05-31
Also published as: KR20210059462A

Abstract

본 발명은 Transforming growth factor-β-activated kinase 1의 내인성 억제제 LGALS3BP 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 조성물, 염증 질환 모델 마우스 및 방법을 이용하는 경우, TAK1 키나아제 활성을 억제, 염증성 질환을 예방 또는 치료, 시험관 내 세포의 염증성 사이토 카인의 발현을 억제 할 수 있다. 또한, LGALS3BP 유전자가 결손된 세포 또는 모델 마우스를 이용하여 인 비보 또는 인 비트로 상에서 염증성 사이토카인의 발현률을 감소하는 후보 물질을 선별할 수 있다.

Description

전환 성장 인자-베타-활성화 키나아제 1의 내인성 억제제 LGALS3BP 및 이의 용도　{Endogenous Inhibitor LGALS3BP of Transforming Growth Factor-β-activated Kinase 1 and Uses thereof}

본 발명은 Transforming growth factor-β-activated kinase 1의 내인성 억제제 LGALS3BP 및 이의 용도에 관한 것이다.

전환 성장 인자-β-활성화 키나아제 1(Transforming growth factor-β-activated kinase 1, TAK1)은 미토겐 활성화 단백질 키나아제 키나아제 키나아제(Mitogen-activated protein kinase kinase kinase, MAP3K) 군의 일원이며, 트랜스포밍 증식인자-β, 인터루킨-1(IL-1), 종양괴사인자-α(TNF-α), 지질다당류(lipopolysaccharide), NF-κB 리간드의 수용체 활성제(activator) 및 IL-8에 의해 자극되는 신호 전달 경로에 있어서 중요한 역할을 수행한다.

또한, TAK1은 IκB 키나아제(IKK) 신호 전달경로를 조절하여, 전사인자 AP-1(activating protein-1) 및 NF-κB(nuclear factor-κB)를 활성화시키며, 전사인자인 AP-1 및 NF-κB의 활성화는 스트레스에 대한 반응, 면역, 염증 그리고 암에서 중요한 역할을 한다.

TAK1의 과활성화 및 조절장애는 암의 발생, 염증성 질환 및 조직 섬유증, 면역 질환과 밀접하게 연관되어 있다. 특히 비정상적으로 활성화된 TAK1-NF-κB 신호전달체계는 암의 항암제 저항성, 생존, 상피 중간엽 전이(epithelial-mesenchymal transition, EMT), 암의 줄기세포능 등을 유도한다. 이처럼 TAK1의 과활성화 및 조절장애가 상기 질환들을 유도함에 따라 TAK1 타겟팅은 상기 질환의 새로운 치료법으로 대두되고 있다.

이에 따라 TAK1의 화학적 저해제에 대한 발굴 연구가 이루어지고 있으며 뿐만 아니라 TAK1의 내인성 억제제 기능을 갖는 분자에 대한 연구가 활발히 모색되어 왔다.

Mihaly SR, Ninomiya-Tsuji J, Morioka S. TAK1 control of cell death.　Cell Death Differ.　(2014) 21:1667-76.

본 발명자들은 TAK1 관련 질환의 예방과 치료를 위해 TAK1의 내인성 억제제를 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과 LGALS3BP 유전자와 TAK1의 관계를 규명함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 LGALS3BP 단백질 또는 이의 단편, LGALS3BP 단백질 또는 이의 단편을 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 포함하는 벡터, 상기 벡터를 포함하는 숙주세포, 또는 이들의 조합을 유효성분으로 포함하는 TAK1 키나아제 활성 억제용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 LPS 처리를 통해, 염증 활성이 유도된 세포를, 상술한 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는, 시험관 내(in vitro) 세포의 염증성 사이토카인 발현 억제 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 LGALS3BP 유전자를 결손시키는 단계를 포함하는 LGALS3BP 결손 염증 질환 모델 마우스 제조 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 LGALS3BP 유전자가 결손된 염증 질환 모델 마우스를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 LGALS3BP 유전자가 결손된 염증 질환 모델 마우스를 이용한 염증성 질환 예방 또는 치료용 물질의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 LGALS3BP 유전자가 결손된 세포를 이용한 염증성 질환 예방 또는 치료용 물질의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 LGALS3BP 단백질 또는 이의 단편, LGALS3BP 단백질 또는 이의 단편을 코딩하는 유전자에 관한 것이다.

본 명세서 상의 용어 "LGALS3BP 단백질 또는 이의 단편"은 면역계와 연관된 스캐빈저 수용체 시스테인-풍부(scavenger receptor cysteine-rich, SRCR) 도메인-함유 단백질 패밀리에 속하는 LGALS3BP 단백질 전체, 또는 TAK1 억제 기능에 관여하는 유효활성 도메인 및 펩타이드를 의미한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 LGALS3BP 단백질은 서열번호 1 또는 2의 아미노산 서열을 포함하는 것이나 이에 한정되는 것은 아니다.

아미노산	서열	서열번호 (SEQ ID NO.)
Human LGALS3BP 단백질의 아미노산 (Genbank # NP_005558.1)	MTPPRLFWVWLLVAGTQGVNDGDMRLADGGATNQGRVEIFYRGQWGTVCDNLWDLTDASVVCRALGFENATQALGRAAFGQGSGPIMLDEVQCTGTEASLADCKSLGWLKSNCRHERDAGVVCTNETRSTHTLDLSRELSEALGQIFDSQRGCDLSISVNVQGEDALGFCGHTVILTANLEAQALWKEPGSNVTMSVDAECVPMVRDLLRYFYSRRIDITLSSVKCFHKLASAYGARQLQGYCASLFAILLPQDPSFQMPLDLYAYAVATGDALLEKLCLQFLAWNFEALTQAEAWPSVPTDLLQLLLPRSDLAVPSELALLKAVDTWSWGERASHEEVEGLVEKIRFPMMLPEELFELQFNLSLYWSHEALFQKKTLQALEFHTVPFQLLARYKGLNLTEDTYKPRIYTSPTWSAFVTDSSWSARKSQLVYQSRRGPLVKYSSDYFQAPSDYRYYPYQSFQTPQHPSFLFQDKRVSWSLVYLPTIQSCWNYGFSCSSDELPVLGLTKSGGSDRTIAYENKALMLCEGLFVADVTDFEGWKAAIPSALDTNSSKSTSSFPCPAGHFNGFRTVIRPFYLTNSSGVD	1
Mouse LGALS3BP 단백질의 아미노산 (Genbank # NP_035280.1)	MALLWLLSVFLLVPGTQGTEDGDMRLVNGASANEGRVEIFYRGRWGTVCDNLWNLLDAHVVCRALGYENATQALGRAAFGPGKGPIMLDEVECTGTESSLASCRSLGWMVSRCGHEKDAGVVCSNDTTGLHILDLSGELSDALGQIFDSQQGCDLFIQVTGQGYEDLSLCAHTLILRTNPEAQALWQVVGSSVIMRVDAECMPVVRDFLRYFYSRRIEVSMSSVKCLHKLASAYGATELQDYCGRLFATLLPQDPTFHTPLDLYAYARATGDSMLEDLCVQFLAWNFEPLTQSESWSAVPTTLIQALLPKSELAVSSELDLLKAVDQWSTETIASHEDIERLVEQVRFPMMLPQELFELQFNLSLYQDHQALFQRKTMQALEFHTVPVEVLAKYKGLNLTEDTYKPRLYTSSTWSSLVMASTWRAQRYEYNRYNQLYTYGYGSVARYNSYQSFQTPQHPSFLFKDKQISWSATYLPTMQSCWNYGFSCTSNELPVLGLTTSSYSNPTIGYENRVLILCGGYSVVDVTSFEGSKAPIPTALDTNSSKTPSLFPCASGAFSSFRVVIRPFYLTNSTDMV	2

본 명세서 상의 용어 "LGALS3BP 단백질 또는 이의 단편을 코딩하는 유전자"는 상기 단백질 또는 이의 단편의 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열을 가진 유전자를 의미한다. 보다 상세하게, 상기 유전자는 서열번호 1 또는 2의 아미노산 서열을 가지는 단백질을 코딩하는 유전자이다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 LGALS3BP 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 3 또는 4의 염기서열을 포함하는 것이나 이에 한정되는 것은 아니다.

유전자	서열 (5' to 3')	서열번호 (SEQ ID NO.)
Human LGALS3BP 단백질을 코딩하는 유전자 (Genbank# NM_005567.3)	ATGACCCCTCCGAGGCTCTTCTGGGTGTGGCTGCTGGTTGCAGGAACCCAAGGCGTGAACGATGGTGACATGCGGCTGGCCGATGGGGGCGCCACCAACCAGGGCCGCGTGGAGATCTTCTACAGAGGCCAGTGGGGCACTGTGTGTGACAACCTGTGGGACCTGACTGATGCCAGCGTCGTCTGCCGGGCCCTGGGCTTCGAGAACGCCACCCAGGCTCTGGGCAGAGCTGCCTTCGGGCAAGGATCAGGCCCCATCATGCTGGATGAGGTCCAGTGCACGGGAACCGAGGCCTCACTGGCCGACTGCAAGTCCCTGGGCTGGCTGAAGAGCAACTGCAGGCACGAGAGAGACGCTGGTGTGGTCTGCACCAATGAAACCAGGAGCACCCACACCCTGGACCTCTCCAGGGAGCTCTCGGAGGCCCTTGGCCAGATCTTTGACAGCCAGCGGGGCTGCGACCTGTCCATCAGCGTGAATGTGCAGGGCGAGGACGCCCTGGGCTTCTGTGGCCACACGGTCATCCTGACTGCCAACCTGGAGGCCCAGGCCCTGTGGAAGGAGCCGGGCAGCAATGTCACCATGAGTGTGGATGCTGAGTGTGTGCCCATGGTCAGGGACCTTCTCAGGTACTTCTACTCCCGAAGGATTGACATCACCCTGTCGTCAGTCAAGTGCTTCCACAAGCTGGCCTCTGCCTATGGGGCCAGGCAGCTGCAGGGCTACTGCGCAAGCCTCTTTGCCATCCTCCTCCCCCAGGACCCCTCGTTCCAGATGCCCCTGGACCTGTATGCCTATGCAGTGGCCACAGGGGACGCCCTGCTGGAGAAGCTCTGCCTACAGTTCCTGGCCTGGAACTTCGAGGCCTTGACGCAGGCCGAGGCCTGGCCCAGTGTCCCCACAGACCTGCTCCAACTGCTGCTGCCCAGGAGCGACCTGGCGGTGCCCAGCGAGCTGGCCCTACTGAAGGCCGTGGACACCTGGAGCTGGGGGGAGCGTGCCTCCCATGAGGAGGTGGAGGGCTTGGTGGAGAAGATCCGCTTCCCCATGATGCTCCCTGAGGAGCTCTTTGAGCTGCAGTTCAACCTGTCCCTGTACTGGAGCCACGAGGCCCTGTTCCAGAAGAAGACTCTGCAGGCCCTGGAATTCCACACTGTGCCCTTCCAGTTGCTGGCCCGGTACAAAGGCCTGAACCTCACCGAGGATACCTACAAGCCCCGGATTTACACCTCGCCCACCTGGAGTGCCTTTGTGACAGACAGTTCCTGGAGTGCACGGAAGTCACAACTGGTCTATCAGTCCAGACGGGGGCCTTTGGTCAAATATTCTTCTGATTACTTCCAAGCCCCCTCTGACTACAGATACTACCCCTACCAGTCCTTCCAGACTCCACAACACCCCAGCTTCCTCTTCCAGGACAAGAGGGTGTCCTGGTCCCTGGTCTACCTCCCCACCATCCAGAGCTGCTGGAACTACGGCTTCTCCTGCTCCTCGGACGAGCTCCCTGTCCTGGGCCTCACCAAGTCTGGCGGCTCAGATCGCACCATTGCCTACGAAAACAAAGCCCTGATGCTCTGCGAAGGGCTCTTCGTGGCAGACGTCACCGATTTCGAGGGCTGGAAGGCTGCGATTCCCAGTGCCCTGGACACCAACAGCTCGAAGAGCACCTCCTCCTTCCCCTGCCCGGCAGGGCACTTCAACGGCTTCCGCACGGTCATCCGCCCCTTCTACCTGACCAACTCCTCAGGTGTGGACTAG	3
Mouse LGALS3BP 단백질을 코딩하는 유전자 (Genbank # NM_011150.3)	ATGGCTCTCCTGTGGCTCCTCTCTGTGTTCTTGCTGGTTCCAGGGACTCAAGGTACAGAAGATGGAGACATGCGCTTGGTTAACGGGGCCTCAGCCAATGAGGGCCGCGTGGAGATCTTCTACAGAGGCCGGTGGGGGACAGTGTGTGACAACCTCTGGAACCTTTTGGATGCCCACGTCGTCTGCCGGGCCCTGGGCTATGAGAACGCCACCCAAGCACTGGGCAGAGCTGCCTTCGGGCCAGGAAAGGGACCGATCATGCTGGATGAGGTGGAATGTACAGGGACCGAGTCCTCACTGGCCAGTTGCAGATCCCTGGGTTGGATGGTGAGCCGCTGTGGGCACGAGAAGGACGCAGGCGTGGTCTGCTCCAACGATACCACGGGGCTTCACATCCTGGACCTCTCTGGAGAGCTCTCAGATGCACTGGGCCAGATCTTTGACAGCCAGCAGGGCTGCGACCTATTCATCCAGGTGACAGGGCAGGGGTATGAGGACCTGAGCCTCTGTGCCCACACGCTGATCCTGCGCACCAACCCCGAGGCCCAGGCCCTGTGGCAAGTGGTGGGCAGCAGCGTCATCATGAGAGTGGATGCTGAGTGCATGCCTGTCGTCAGAGACTTCCTCAGGTACTTTTACTCCCGAAGAATCGAGGTCAGCATGTCTTCTGTTAAGTGCTTGCACAAGCTAGCCTCTGCCTATGGGGCCACAGAGCTTCAGGACTACTGTGGACGGCTTTTTGCCACCCTCCTCCCCCAAGACCCCACTTTCCATACTCCCTTGGACCTTTATGCGTACGCACGGGCCACCGGGGACTCTATGCTGGAAGATCTGTGTGTACAGTTTCTGGCCTGGAACTTCGAGCCTCTGACACAGTCTGAGTCCTGGTCGGCTGTTCCCACCACCTTGATCCAGGCTCTCCTCCCCAAGAGTGAGCTGGCTGTGTCTAGTGAGCTGGATCTGCTGAAGGCAGTGGACCAGTGGAGCACAGAAACCATTGCCTCACACGAGGATATAGAGCGCCTGGTGGAACAGGTCCGCTTCCCCATGATGCTGCCCCAGGAGCTGTTCGAGCTGCAGTTCAACCTGTCCTTGTACCAAGATCACCAGGCACTGTTCCAGAGGAAGACCATGCAGGCCTTGGAGTTCCACACAGTGCCTGTCGAAGTGCTGGCCAAGTACAAAGGCCTGAACCTCACGGAGGACACCTACAAGCCCCGCCTTTACACCTCTTCCACCTGGAGTAGCTTGGTGATGGCCTCCACCTGGAGGGCACAAAGATATGAATACAATCGATACAATCAGCTCTATACATATGGCTATGGCTCAGTAGCCCGGTACAATAGCTACCAGTCCTTCCAAACCCCACAACACCCCAGCTTCCTCTTCAAGGACAAGCAGATCTCCTGGTCAGCCACCTACCTCCCCACCATGCAGAGCTGCTGGAACTATGGCTTCTCGTGTACCTCTAACGAGCTCCCTGTACTGGGCCTCACCACATCCAGCTACTCCAATCCGACAATTGGCTATGAGAACAGAGTACTGATCCTCTGCGGAGGCTACAGTGTGGTGGATGTCACCAGCTTTGAAGGCTCCAAGGCCCCTATTCCCACTGCCCTGGACACCAATAGTTCCAAGACTCCCTCCCTCTTTCCCTGTGCCTCAGGGGCCTTTAGCAGCTTCCGTGTGGTCATACGCCCCTTCTACCTCACTAACTCCACTGACATGGTGTAA	4

본 명세서에서 상기 유전자는 핵산 분자를 의미한다. 상기 "핵산 (nucleic acid)"은 DNA(gDNA 및 cDNA) 그리고 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 가지며, 핵산 분자에서 기본 구성 단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드 뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체(analogue)도 포함한다 (Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990)).

본 발명의 일 구현 예에 있어서, 본 발명의 상기 LGALS3BP 단백질 또는 이의 단편을 인코딩하는 염기서열은 상기 LGALS3BP 단백질 또는 이의 단편을 구성하는 아미노산 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열인 것으로 족하며, 어느 특정 뉴클레오타이드 서열에 한정되지 않는다는 것은 당업자에게 자명하다.

이는 뉴클레오티드 서열의 변이가 발생하더라도 변이된 뉴클레오타이드 서열을 단백질로 발현하면 단백질 서열에서 변화를 가져오지 않는 경우도 있기 때문이다. 이를 코돈의 축퇴성이라고 한다. 따라서 상기 뉴클레오타이드 서열은 기능적으로 균등한 코돈 또는 동일한 아미노산을 코딩하는 코돈 (예를 들어, 코돈의 축퇴성에 의해, 아르기닌 또는 세린에 대한 코돈은 여섯 개이다), 또는 생물학적으로 균등한 아미노산을 코딩하는 코돈을 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.

상술한 생물학적 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면, 본 발명의 LGALS3BP 단백질 또는 이의 단편을 인코딩하는 핵산 분자는 서열목록에 기재된 서열과 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 61%의 상동성, 보다 바람직하게는 70%의 상동성, 보다 더 바람직하게는 80%의 상동성, 가장 바람직하게는 90%의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다. 서열비교를 위한 얼라인먼트 방법은 당업계에 공지되어 있다. 얼라인먼트에 대한 다양한 방법 및 알고리즘은 Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482(1981); Needleman and Wunsch, J. Mol. Bio. 48:443(1970); Pearson and Lipman, Methods in Mol. Biol. 24: 307-31(1988); Higgins and Sharp, Gene 73:237-44(1988); Higgins and Sharp, CABIOS 5:151-3(1989); Corpet et al., Nuc. Acids Res. 16:10881-90(1988); Huang et al., Comp. Appl. BioSci. 8:155-65(1992) and Pearson et al., Meth. Mol. Biol. 24:307-31(1994)에 개시되어 있다. NCBI Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)(Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-10(1990))은 NBCI(National Center for Biological Information) 등에서 접근 가능하며, 인터넷 상에서 blastp, blastn, blastx, tblastn 및 tblastx와 같은 서열 분석 프로그램과 연동되어 이용할 수 있다. BLAST는 ncbi 웹사이트의 BLAST 페이지를 통하여 접속 가능하다. 이 프로그램을 이용한 서열 상동성 비교 방법은 ncbi 웹사이트의 BLAST help 페이지에서 확인할 수 있다.

본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상기 LGALS3BP 유전자를 포함하는 벡터를 제공한다.

본 명세서에서 용어 "벡터"는 숙주 세포에서 목적 유전자를 발현시키기 위한 수단으로 플라스미드 벡터; 코즈미드 벡터; 그리고 박테리오파아지 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 및 아데노-연관 바이러스 벡터 같은 바이러스 벡터 등을 포함한다.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명의 벡터에서 상기 스위치 분자를 코딩하는 핵산 분자는 상기 벡터의 프로모터와 작동적으로 결합(operatively linked)되어 있다.

본 명세서에서, 용어 "작동적으로 결합된"은 핵산 발현 조절 서열(예: 프로모터, 시그널 서열, 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 해독을 조절하게 된다.

본 발명의 재조합 벡터 시스템은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있으며, 이에 대한 구체적인 방법은 Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)에 개시되어 있으며, 이 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.

본 발명의 벡터는 전형적으로 유전자 클로닝을 위한 벡터 또는 단백질의 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다.

예를 들어, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 포유동물 세포의 지놈으로부터 유래된 프로모터(예: 메탈로티오닌 프로모터, β-액틴 프로모터, 사람 헤로글로빈 프로모터 및 사람 근육 크레아틴 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터(예: 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터, HSV의 tk 프로모터, 마우스 유방 종양 바이러스(MMTV) 프로모터, HIV의 LTR 프로모터, 몰로니 바이러스의 프로모터, 엡스타인 바 바이러스(EBV)의 프로모터 및 로우스 사코마 바이러스(RSV)의 프로모터)가 이용될 수 있으며, 이들은 일반적으로 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 갖는다.

본 발명의 벡터는 그로부터 발현되는 폴리펩타이드 또는 단백질의 정제를 용이하게 하기 위하여, 다른 서열과 융합될 수도 있다. 융합되는 서열은 예컨대, 글루타티온 S-트랜스퍼라제(Pharmacia, USA), 말토스 결합 단백질(NEB, USA), FLAG(IBI, USA) 및 6x His(hexahistidine; Quiagen, USA) 등이 있다.

한편, 본 발명의 발현 벡터는 선택표지로서, 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함하며, 예를 들어 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 제네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자가 있다.

벡터를 이용하는 목적은 원하는 유전 물질을 대량 발현하는데 있으므로 벡터로서의 기능을 하기 위해 필요한 공통 요소가 존재하는데, 복제 원점(Replication Origin), 여러 제한효소 자리 (Multicloning site), 선택표지(selective marker)가 반드시 존재하여야 한다. 벡터 그 자체는 DNA 염기 서열로 이식할 유전자(transgene)와 벡터 백본(backbone)을 포함한다.

본 발명에 이용될 수 있는 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드 (예: pSC101, ColE1, pBR322, pUC8/9, pHC79, pUC19, pET, pEGFP, pCR 등), 파지 (예: gt4B, -Charon, z1 및 M13 등) 또는 바이러스 (예: SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있다. 바람직하게는 본 발명의 벡터는 발현 벡터이다.

본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상기 LGALS3BP 유전자를 포함하는 벡터로 형질전환 된 숙주세포를 제공한다.

본 발명의 벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주 세포는 당업계에 공지되어 있으며, 어떠한 숙주 세포도 이용할 수 있다.

본 발명에서 숙주세포는 동물세포임이 바람직하나, 이에 한정되지 않고, 동물세포의 종류는 토끼, 양, 염소, 개, 고양이, 마우스 및 사람 등이 바람직하나, 이에 한정 되지 않는다.

예컨대, 상기 벡터의 적합한 진핵세포 숙주 세포는 원숭이 신장 세포7(COS7: monkey kidney cells), NSO 세포, SP2/0, 차이니즈 햄스터 난소(CHO: Chinese hamster ovary) 세포, W138, 어린 햄스터 신장(BHK: baby hamster kidney) 세포, MDCK, 골수종 세포주, HuT 78 세포 및 HEK-293 세포를 포함하나 이에 한정되지 않는다.

본 명세서에서 용어 "형질전환된", "형질도입된" 또는 "형질감염된"은 외인성 핵산이 숙주세포 내로 전달되거나 도입되는 과정을 지칭한다. "형질전환된", "형질도입된" 또는 "형질감염된" 세포는 외인성 핵산으로 형질전환, 형질도입 또는 형질감염된 세포이며, 상기 세포는 당해 세포 및 그의 계대 배양으로 인한 자손 세포를 포함한다.

본 발명의 벡터를 숙주 세포 내로 운반하는 방법은, 숙주 세포가 원핵 세포인 경우, CaCl2 방법(Cohen, S.N. et al., Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9:2110-2114(1973)), 하나한 방법(Cohen, S.N. et al., Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9:2110-2114(1973); 및 Hanahan, D., J. Mol. Biol., 166:557-580(1983)) 및 전기 천공 방법(Dower, W.J. et al., Nucleic. Acids Res., 16:6127-6145(1988)) 등에 의해 실시될 수 있다. 또한, 숙주세포가 진핵 세포인 경우에는, 미세 주입법(Capecchi, M.R., Cell, 22:479(1980)), 칼슘 포스페이트 침전법(Graham, F.L. et al., Virology, 52:456(1973)), 전기 천공법(Neumann, E. et al., EMBO J., 1:841(1982)), 리포좀-매개 형질감염법(Wong, T.K. et al., Gene, 10:87(1980)), DEAE-덱스트란 처리법(Gopal, Mol. Cell Biol., 5:1188-1190(1985)), 및 유전자 밤바드먼트(Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 87:9568-9572(1990)) 등에 의해 벡터를 숙주 세포 내로 주입할 수 있다.

본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 LGALS3BP 단백질 또는 이의 단편, LGALS3BP 유전자, LGALS3BP 유전자를 포함하는 벡터, 상기 벡터를 포함하는 숙주세포, 또는 이들의 조합을 유효성분으로 포함하는 TAK1 키나아제 활성 억제용 조성물을 제공한다.

본 명세서 상의 용어 "활성 억제"란 대상이 되는 단백질의 유전자가 발현되지 않거나 발현되더라도 기능성이 있는 단백질을 생산하지 않는 것을 의미하거나, 그 발현수준이 현저하게 낮아 실질적으로 발현되지 않는 것도 포함하며, 기능성 단백질이 정상적으로 생산되더라도 해당 단백질과 상호작용 파트너 단백질의 결합 능력을 감소시키거나, 해당 단백질의 인산화를 억제하거나, 해당 단백질의 안정도를 감소시켜 대상이 되는 단백질이 제 기능을 하지 못하는 것을 의미한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 조성물은 NF-κB의 활성을 억제하는 것이다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 조성물은 염증성 사이토카인인 IL-6, TNF-α 및 IL-1β의 활성을 억제하는 것이다.

본 명세서 상의 용어 "염증성 사이토카인"은 체내에서 발생하는 염증반응을 유발시키는 사이토카인을 의미한다. 이들 염증성 사이토카인은 IL-1β, TNF-α, IL-6, MCP-1 등이 있을 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 조성물을 유효 성분으로 포함하는 염증성 질환 또는 자가면역 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 약제학적 조성물은 유효성분인 상기 조성물 외에 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 예컨대 척추강 내 투여, 정맥내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 근육내 투여, 복강내 투여, 흉골 내 투여, 종양 내 투여, 비내 투여, 뇌내 투여, 두개골 내 투여, 폐내 투여 및 직장내 투여 등으로 투여할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량(약제학적 유효량)을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 약제학적 조성물의 1일 투여량은 0.0001-100 ㎎/㎏이다.

본 명세서에서 용어 "약제학적 유효량"은 상술한 질환을 예방 또는 치료하는 데 충분한 양을 의미한다.

본 명세서에서 용어 “예방”은 질환 또는 질환 상태의 방지 또는 보호적인 치료를 의미한다. 본 명세서에서 용어 “치료”는 질환 상태의 감소, 억제, 진정 또는 근절을 의미한다.

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 내복약, 주사제 등 다양하게 제조될 수 있고, 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 좌제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 또한 상술한 상기 조성물 외에 다른 약제학적 활성 약제 또는 약물, 예를 들어, 미토마이신-C, 로수바스타틴 등의 치료제를 포함할 수 있다.

본 명세서 상의 용어"염증성 질환"이란 염증 반응을 주요 증상으로 하는 질병을 의미하며, 염증 반응이란 다양한 원인, 예를 들어 손상이나 박테리아, 곰팡이, 바이러스 등 외부 물질에 의해 자극되어 각종 염증 매개 인자 및 면역 세포에 의한 효소의 활성화, 염증 매개물질 분비, 체액 침윤, 세포의 이동, 조직 파괴 등 일련의 복합적인 생리적 반응이 일어나는 것을 의미한다.

본 명세서 상의 용어"자가면역 질환"이란 신체가 자신의 조직에 대해 부적절한 면역반응을 보일 때 일어나는 질환을 의미하며, 면역 시스템이 몸의 하나 또는 그 이상의 정상적인 구성 성분을 "자신"으로 인식하지 못하고 자신의 세포, 조직 그리고 기관을 공격하는 항체인 자가 항체를 생산하는 것을 의미한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 염증성 질환은 골관절염, 간염, 각막염, 위염, 장염, 신장염, 결핵, 기관지염, 흉막염, 복막염, 척추염, 췌장염, 염증성 통증, 요도염, 방광염, 염증성 동맥경화증, 패혈증, 피부염, 치주염 및 치은염으로 이루어지는 군에서 선택되는 것이나 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 자가면역 질환은 그레이브스 병, 하시모토 갑상선염, 천식, 류마티스 관절염, 전신성 홍반성 루푸스, 패혈증성 쇼크, 알러지성 천식, 알러지성 비염, 아토피성 피부염, 궤양성 대장염, 누선염, 알츠하이머 질환, 뇌졸중, 동맥경화증, 혈관 재협착, I형 당뇨병, II 형 당뇨병, 담마진, 결막염, 건선, 전신성염증반증후군, 다발성근염, 피부근염, 결절성 다발관절염, 혼합결합 조직증, 쇼그렌증후군, 통풍, 파킨슨병, 근위축성측색경화증, 당뇨성망막증, 다발성경화증, 크론병, 만성 갑상선염, 세리아크병, 중증근무력증, 심상성천포창, 바이러스질환, 세균성질환, 방사선에 의한 장해, 자가면역성 동맥경화증, 혈관종, 혈관섬유종, 재관류장해 및 심장비대증으로 이루어지는 군에서 선택되는 것이나 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 LPS 처리를 통해, 염증 활성이 유도된 세포를, 상기 TAK1 키나아제 활성 억제용 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는, 시험관 내(in vitro) 세포의 염증성 사이토카인 발현 억제 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 상기 시험관 내에서 LPS에 의해 염증 활성이 유도된 세포에서의 염증성 사이토카인의 발현을 억제하는 방법은 상기 세포를 배양하는 배지에 상기 TAK1 키나아제 활성 억제용 조성물을 처리하는 것이다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 염증성 사이토카인은 IL-6, TNF-α, 또는 IL-1β 인 것이다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 LGALS3BP 유전자를 결손시키는 단계를 포함하는 LGALS3BP 결손 염증 질환 모델 마우스 제조 방법 제공한다.

유전자를 결손시키는 단계란 표적 유전자의 기능 저하를 가져다 주는 유전자 서열 상의 변형을 일으키는 단계를 의미하며, 표적 유전자의 발현이 탐지될 수 없거나 무의미한 수준으로만 존재하게 하는 단계를 의미한다. 유전자를 결손시키는 단계는 표적 유전자의 변형을 증진시키는 물질을 노출시키거나, 유전자를 절단하거나, 염색체 상에 특정 유전자 서열을 삽입하여 서열을 변형시킴으로써 수행되는 것으로, 유전자를 결손시키는 방법은 당업계에 알려진 임의의 방법을 사용할 수 있으며, 보다 구체적으로는ZFN, TALEN 또는 CRISPR-Cas 유전자 가위 기술, siRNA, 또는 shRNA가 포함된 벡터 등을 사용 할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 LGALS3BP 유전자를 결손시키는 단계는 (i) 마우스 배아 내로 LGALS3BP 유전자를 타겟팅하는 가이드 RNA 및 Cas 단백질을 주입하는 단계; 및

(ii) 마우스 배아를 마우스 대리모에 이식하는 단계를 포함하는 것이다.

본 발명에서 용어, "Cas 단백질"은 CRISPR/Cas 시스템의 주요 단백질 구성 요소로, 활성화된 엔도뉴클레아제로 작용할 수 있는 단백질로서, RGEN (RNA-guided engineered nuclease)으로 명명되는 유전자 가위에 해당된다. 상기 Cas 단백질은 crRNA (CRISPR RNA) 및 tracrRNA (trans-activating crRNA)와 복합체를 형성하여 이의 활성을 나타낼 수 있다.

상기 Cas 단백질은 유전체에서 특정 염기서열을 인식해 이중나선절단 (double strand break, DSB)을 일으킨다.

상기 이중나선절단은 DNA의 이중 나선을 잘라 둔단 (blunt end) 또는 점착종단 (cohesive end)을 만드는 것을 모두 포함한다. DSB는 세포 내에서 상동재조합 (homologous recombination) 또는 비상동재접합 (nonhomologous end-joining, NHEJ) 기작에 의해 효율적으로 수선되는데 이 과정에 연구자가 원하는 변이를 표적 장소에 도입할 수 있다. 본 발명에서 Cas 단백질은 NGG 트리뉴클레오타이드 (trinucleotide)를 인식하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

Cas 단백질 또는 유전자 정보는 NCBI (National Center for Biotechnology Information)의 GenBank와 같은 공지의 데이터 베이스에서 얻을 수 있다. 구체적으로, 상기 Cas 단백질은 Cas9 단백질, Cas9 오르토로그에 의해 인코딩되는 Cas9-유사 단백질, Cas9-유사 합성 단백질, Cpf1 단백질, Cpf1 오르토로그에 의해 인코딩되는 단백질, Cpf1-유사 합성 단백질, C2c1 단백질, C2c2 단백질, C2c3 단백질, 및 이들의 변이체 및 변형체일 수 있다.

또한, 상기 Cas 단백질은 이에 제한되는 것은 아니나, 스트렙토코커스 (Streptococcus) 속, 네이세리아(Neisseria) 속, 파스테우렐라 (Pasteurella) 속, 프란시셀라 (Francisella) 속, 캄필로박터 속(Campylobacter) 속 유래의 Cas 단백질일 수 있고, 보다 구체적으로 스트렙토코커스 피요젠스 (Streptococcus pyogenes) 유래일 수 있다. 그러나, 상기 기술된 예에 본 발명이 제한되는 것은 아니다.

상기 Cas9 단백질의 변이체는 촉매 아스파라긴산 (aspartate) 잔기가 다른 아미노산, 예컨대 알라닌 (alanine)으로 교체된 것일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명에서 상기 Cas 단백질은 재조합 단백질일 수 있다. 상기 용어 "재조합"은, 예컨대 세포, 핵산, 단백질 또는 벡터 등을 언급하며 사용될 때, 이종 (heterologous) 핵산 또는 단백질의 도입 또는 천연형 (native)핵산 또는 단백질의 변경, 또는 변형된 세포로부터 유래한 세포에 의해 변형된 세포, 핵산, 단백질, 또는 벡터를 나타낸다. 따라서, 예컨대, 재조합 Cas9은 인간 코돈 표 (human codon table)를 이용하여 Cas9 단백질을 암호화하는 서열을 재구성함으로써 만들 수 있다.

상기 Cas 단백질은 상기 단백질이 핵 내에서 작용할 수 있게 하는 형태일 수 있고, 세포 내로 도입되기에 용이한 형태일 수 있다. 그 예로 Cas 단백질은 세포 침투 펩타이드 또는 단백질 전달 도메인 (protein transduction domain)과 연결될 수 있다. 상기 단백질 전달 도메인은 폴리-아르기닌 또는 HIV 유래의 TAT 단백질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 세포 침투 펩타이드 또는 단백질 전달 도메인은 상기 기술된 예 외에도 다양한 종류가 당업계에 공지되어 있으므로, 당업자는 상기 예에 제한되지 않고 다양한 예를 본 발명에 적용할 수 있다.

본 발명에서 용어 "가이드 RNA (guide RNA)"는 표적 유전자를 암호화하는 DNA 특이적인 RNA를 의미하며, 표적 서열과 전부 또는 일부 상보적으로 결합하여 Cas 단백질이 표적 서열을 절단할 수 있다.

통상적으로 가이드 RNA는 두 개의 RNA, 즉, crRNA (CRISPR RNA) 및 tracrRNA (trans-activating crRNA)를 구성 요소로 포함하는 이중 RNA (dual RNA); 또는 표적 DNA 내 서열과 전부 또는 일부 상보적인 서열을 포함하는 제1 부위 및 RNA-가이드 뉴클레아제와 상호작용하는 서열을 포함하는 제2 부위를 포함하는 단일-사슬 가이드 RNA(sgRNA) 형태를 말하나, RNA-가이드 뉴클레아제가 표적 서열에서 활성을 가질 수 있는 형태라면 제한 없이 본 발명의 범위에 포함될 수 있다. 일례로, 상기 가이드 RNA를 Cas9에 적용할 경우에는 crRNA 및 tracrRNA를 구성 요소로 포함하는 이중 RNA 형태 또는 crRNA 및 tracrRNA의 주요 부분이 융합된 형태인 단일-사슬 가이드 RNA (single-chain guide RNA; sgRNA) 형태일 수 있다. 상기 sgRNA는 표적 DNA 내 서열과 상보적인 서열을 가지는 부분 (이를 Spacer region, Target DNA recognition sequence, base pairing region 등으로도 명명함) 및 Cas 단백질 결합을 위한 헤어핀 (hairpin) 구조를 포함할 수 있다. 보다 구체적으로, 표적 DNA 내 서열과 전부 또는 일부 상보적인 서열을 가지는 부분, Cas 단백질 결합을 위한 hairpin 구조 및 Terminator 서열을 포함할 수 있다. 상기 기술된 구조는 5' 에서 3' 순으로 순차적으로 존재하는 것일 수 있다. 그러나, 이에 제한되는 것은 아니며, 상기 가이드 RNA가 crRNA의 주요 부분 또는 표적 DNA의 전부 또는 일부 상보적인 부분을 포함하는 경우라면 어떠한 형태의 가이드 RNA도 본 발명에서 사용될 수 있다.

상기 가이드 RNA는 이에 제한되지 않으나, 분리된 RNA (naked RNA)의 형태일 수 있다. 가이드 RNA가 분리된 RNA의 형태로 세포 또는 유기체에 형질주입될 때, 당업계에 알려진 임의의 시험관 내 전사 시스템을 사용하여 가이드 RNA를 제조할 수 있다.

상기 가이드 RNA는 표적 DNA 내 서열과 전부 또는 일부 상보적인 서열을 포함하며, sgRNA의 업스트림 부위, 구체적으로 sgRNA의 5' 말단에 하나 이상의 추가의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 상기 추가의 뉴클레오티드는 구아닌 (guanine, G)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 단계 (i)의 마우스 배아 내로 재조합 단백질을 주입하는 방법은 미세주입법(microinjection), 전기천공법(electroporation), 입자 분사법(particle bombardment), 정자를 이용하는 방법(sperm-mediated gene transfer), 바이러스 감염법(viral infection), 및 트랜스포존(transposon)을 이용한 기법 중에서 적절하게 선택될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

본 명세서에서 상기 용어 "siRNA"는 특정 mRNA의 절단(cleavage)을 통하여 RNAi(RNA interference) 현상을 유도할 수 있는 짧은 이중사슬 RNA를 의미한다. 타겟 유전자의 mRNA와 상동인 서열을 가지는 센스 RNA 가닥과 이와 상보적인 서열을 가지는 안티센스 RNA 가닥으로 구성된다. siRNA는 타겟 유전자의 발현을 억제할 수 있기 때문에 효율적인 유전자 넉다운 방법으로서 또는, 유전자치료(gene therapy)의 방법으로 제공된다.

siRNA는 RNA끼리 짝을 이루는 이중사슬 RNA 부분이 완전히 쌍을 이루는 것에 한정되지 않고 미스매치(대응하는 염기가 상보적이지 않음), 벌지(일방의 사슬에 대응하는 염기가 없음)등에 의하여 쌍을 이루지 않는 부분이 포함될 수 있다. 전체 길이는 10 내지 100 염기, 바람직하게는 15 내지 80 염기, 가장 바람직하게는 20 내지 70 염기이다. siRNA 말단 구조는 타겟 유전자의 발현을 RNAi 효과에 의하여 억제할 수 있는 것이면 평활(blunt)말단 혹은 점착(cohesive) 말단 모두 가능하다. 점착 말단 구조는 3 말단 돌출한 구조와 5 말단 쪽이 돌출한 구조 모두 가능하다. 돌출하는 염기 수는 한정되지 않는다. 예를 들어, 염기 수로는 1 내지 8 염기, 바람직하게는 2 내지 6 염기로 할 수 있다. 또한, siRNA는 타겟 유전자의 발현억제 효과를 유지할 수 있는 범위에서 예를 들어, 한 쪽 말단의 돌출 부분에 저분자 RNA(예를 들어, tRNA, rRNA, 바이러스 RNA와 같은 천연의 RNA분자 또는 인공의 RNA분자)를 포함할 수 있다. siRNA 말단구조는 양측 모두 절단 구조를 가질 필요는 없고, 이중사슬 RNA의 일방의 말단 부위가 링커 RNA에 의하여 접속된 스템 루프형 구조일 수도 있다. 링커의 길이는 스템 부분의 쌍을 이루는 데 지장이 없는 길이면 특별히 한정되지 않는다.

본 명세서에서 상기 용어 "shRNA"는 단일 가닥으로 50-70개로 구성된 뉴클레오타이드를 의미하며, in vivo상에서 스템-루프(stem-loop) 구조를 이루고 있다. 5-10개의 뉴클레오타이드의 루프 부위 양쪽으로 상보적으로 19-29개의 뉴클레오타이드의 긴 RNA가 염기쌍을 이루어 이중가닥의 스템을 형성한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 LGALS3BP 유전자가 결손된 염증 질환 모델 마우스를 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 염증성 질환 예방 또는 치료용 물질의 스크리닝 방법을 제공한다.

(a) LPS 및 테스트 물질을 LGALS3BP 유전자가 결손된 염증 질환 모델 마우스에 처리하는 단계;

(b) 테스트 물질이 처리된 마우스의 염증성 사이토카인의 발현률을 측정하는 단계; 및

(c) 테스트 물질을 미처리한 마우스에 비하여 테스트 물질이 처리된 마우스에서 염증성 사이토카인의 발현률이 감소하는 후보 물질을 선별하는 단계.

본 발명의 염증성 질환 예방 또는 치료용 물질의 스크리닝 방법을 단계별로 설명한다.

단계 (a): LPS 및 테스트 물질을 LGALS3BP 유전자가 결손된 염증 질환 모델 마우스에 처리하는 단계

LPS 및 테스트 물질을 모델 마우스에 처리하는 순서는 제한이 없으며 동시에 처리할 수 도 있다.

상기 테스트 물질은 천연화합물, 합성화합물, RNA, DNA, 폴리펩티드, 효소, 단백질, 리간드, 항체, 항원, 박테리아 또는 진균의 대사산물 및 생활성 분자 등으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

단계 (b): 테스트 물질이 처리된 마우스의 염증성 사이토카인의 발현률을 측정하는 단계

상기 염증성 사이토카인의 발현률을 측정하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있으며, 예를 들어, 분광학적, 광화학적, 생물화학적, 면역화학적, 전기적, 흡광적, 화학적 및 기타 방법을 이용하여 검출 할 수 있다. 보다 구체적으로는 ELISA, RIA, 웨스턴 블롯, PCR, 면역침강법, 면역염색법, 유동세포계수법/FACS, 크로마토그래피 등이 있을 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

단계 (c): 테스트 물질을 미처리한 마우스에 비하여 테스트 물질이 처리된 마우스에서 염증성 사이토카인의 발현률이 감소하는 후보 물질을 선별하는 단계

단계 (c)는 단계 (b)에서 결과를 기초로 하여, 테스트 물질을 미처리한 마우스에 비하여 테스트 물질이 처리된 마우스의 염증성 사이토카인의 발현률이 감소된 경우, 테스트 물질을 염증성 질환 예방 또는 치료용 물질로 선별하는 것이다.

(a) LPS 및 테스트 물질을 LGALS3BP 유전자가 결손된 세포에 처리하는 단계;

(b) 테스트 물질이 처리된 세포의 염증성 사이토카인의 발현률을 측정하는 단계; 및

(c) 테스트 물질을 미처리한 세포에 비하여 테스트 물질이 처리된 세포 에서 염증성 사이토카인의 발현률이 감소하는 후보 물질을 선별하는 단계.

단계 (a): LPS 및 테스트 물질을 LGALS3BP 유전자가 결손된 세포에 처리하는 단계

LPS 및 테스트 물질을 세포에 처리하는 순서는 제한이 없으며 동시에 처리할 수 도 있다.

상기 LGALS3BP 유전자가 결손된 세포는 siRNA를 이용하여 제조된 세포 또는 LGALS3BP 유전자 녹아웃 마우스로부터 채취된 세포일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 상기 LGALS3BP 유전자가 결손된 세포는 LGALS3BP 유전자가 결손된 대식세포일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

단계 (b): 테스트 물질이 처리된 세포의 염증성 사이토카인의 발현률을 측정하는 단계

단계 (c): 테스트 물질을 미처리한 세포에 비하여 테스트 물질이 처리된 세포 에서 염증성 사이토카인의 발현률이 감소하는 후보 물질을 선별하는 단계

단계 (b) 및 (c)의 내용은 상술한 마우스를 이용한 염증성 질환 예방 또는 치료용 물질의 스크리닝 내용과 공통되기 때문에 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 본 발명은 LGALS3BP 단백질 또는 이의 단편, LGALS3BP 단백질 또는 이의 단편을 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 포함하는 벡터, 상기 벡터를 포함하는 숙주세포, 또는 이들의 조합을 유효성분으로 포함하는 TAK1 키나아제 활성 억제용 조성물을 제공한다.

(b) 본 발명은 TAK1 키나아제 활성 억제용 조성물을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.

(c) 본 발명은 LPS 처리를 통해, 염증 활성이 유도된 세포를, TAK1 키나아제 활성 억제용 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는, 시험관 내(in vitro) 세포의 염증성 사이토카인 발현 억제 방법을 제공한다.

(d) 본 발명은 LGALS3BP 유전자를 결손시키는 단계를 포함하는 LGALS3BP 결손 염증 질환 모델 마우스 제조 방법을 제공한다.

(e) 본 발명은 LGALS3BP 유전자가 결손된 염증 질환 모델 마우스를 제공한다.

(f) 본 발명은 포함하는 염증성 질환 예방 또는 치료용 물질의 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명을 이용하는 경우 TAK1 키나아제 활성을 억제, 염증성 질환을 예방 또는 치료, 시험관 내 세포의 염증성 사이토 카인의 발현을 억제 할 수 있다.

또한, LGALS3BP 유전자가 결손된 세포 또는 모델 마우스를 이용하여 인 비보 또는 인 비트로 상에서 염증성 사이토카인의 발현률을 감소하는 후보 물질을 선별할 수 있다.

도 1a는 PCR을 통해 비장, 간 조직 및 골수유래대식세포에서 LGALS3BP 유전자의 결손을 전사 단계에서 확인한 결과를 나타낸다.
도 1b는 DNA 시퀀싱을 통해 LGALS3BP exon3의 7-nucleotide의 결손을 확인한 결과를 나타낸다.
도 1c는 DNA 시퀀싱을 통해 7-nucleotide 결손으로 LGALS3BP의 mRNA transcript는 오픈리딩프레임 (ORF)의 변화로 인해 폴리펩타이드로의 번역(translation)이 도중에 종결되어 기능적 단백질을 합성할 수 없음을 확인한 결과를 나타낸다.
도 1d는 웨스턴 블롯을 통해 비장, 간 조직 및 골수유래대식세포에서 LGALS3BP의 단백질이 발현되지 않음을 확인한 결과를 나타낸다.
도 2a는 LPS 및 D-갈락토사민(D-galactosamine)을 야생형 마우스 및 녹아웃 마우스 복강 내 주사한 후 그들의 생존율을 확인한 결과를 나타낸다.
도 2b는, ELISA를 통해, LPS로 처리된 야생형 마우스 및 녹아웃 마우스의 혈장 내 IL-6, TNF-α, IL-1β를 측정한 결과를 나타낸다.
도 2c는, ELISA를 통해, LPS로 처리된 야생형 마우스 및 녹아웃 마우스 MEF의 세포 배양 상층액(culture supernatant)의 IL-6, TNF-α, IL-1β를 측정한 결과를 나타낸다.
도 2d는, RT-PCR을 통해, LPS로 처리된 야생형 마우스 및 녹아웃 마우스의 MEF의 IL-6, TNF-α, IL-1β mRNA 발현량을 측정한 결과를 나타낸다.
도 2e는, 루시퍼라아제 리포터 분석을 통해, 야생형 마우스 및 녹아웃 마우스 MEF의 LPS 자극에 대한 NF-κB 활성 정도를 확인한 결과를 나타낸다.
도 2f는, 면역형광염색을 통해, 야생형 마우스 및 녹아웃 마우스 MEF에서 LPS 자극에 의한 NF-κB p65의 핵내 전이(translocation)를 확인한 결과를 나타낸다.
도 2g는, 핵-세포질 분리 후 웨스턴 블롯을 통해, 야생형 마우스 및 녹아웃 마우스 MEF에서 LPS 자극에 의한 NF-κB p65의 핵내 전이(translocation)를 확인한 결과를 나타낸다.
도 2h는, 웨스턴 블롯을 통해, LPS로 처리된 야생형 마우스 및 녹아웃 마우스의 MEF에서 mGal-3BP, β-actin 및 LPS 하위 신호전달체계인자로서 TLR4, MyD88, p-IRAK4, IRAK4, TRAF6, p-TAK1, TAK1, p-IKKα/β, p-IκBα, IκBα, p-p65, p-ERK, ERK, p-p38, p38, p-JNK을 측정한 결과를 나타낸다.
도 3은, RT-qPCR을 통해, LPS로 처리된 야생형 마우스 및 녹아웃 마우스의 MEF에서 사이토카인(IL-6, TNF-α, IL-1β) 및 케모카인(Ccl2, Ccl5, Ccl7, Cxcl2, Cxcl3, Cxcl10)의 mRNA 발현을 정량적으로 측정한 결과를 나타낸다.
도 4a는, 루시퍼라아제 리포터 분석을 통해, siRNA 매개 Lgals3bp 녹다운 MEF 및 음성 대조군 siNC 처리 MEF에서 LPS 처리에 의한 NF-κB 활성 정도를 확인한 결과를 나타낸다.
도 4b는, 웨스턴 블롯과 RT-PCR을 통해, siRNA 매개 Lgals3bp 녹다운 MEF 및 음성 대조군 siNC 처리 MEF에서 LPS 처리에 의한 염증성 사이토카인 IL-6, TNF-α, IL-1β의 mRNA 발현량을 측정한 결과를 나타낸다.
도 4c는, ELISA를 통해, LPS로 처리된 야생형 마우스 및 녹아웃 마우스(siRNA을 이용)의 IL-6, TNF-α, IL-1β를 측정한 결과를 나타낸다.
도 5a는 ELISA를 통해 LPS로 처리된 야생형 마우스 및 녹아웃 마우스의 골수유래대식세포 BMDM의 세포배양 상층액의 IL-6, TNF-α, IL-1β를 측정한 결과를 나타낸다.
도 5b는 RT-PCR을 통해, LPS로 처리된 야생형 마우스 및 녹아웃 마우스의 BMDM의 LGALS3BP, IL-6, TNF-α, IL-1β mRNA 발현량을 측정한 결과를 나타낸다.
도 5c는 면역형광염색을 통해, 야생형 마우스 및 녹아웃 마우스 BMDM에서 LPS 자극에 의한 NF-κB p65의 핵내 전이(translocation)를 확인한 결과를 나타낸다.
도 5d는 핵-세포질 분리 후 웨스턴 블롯을 통해, 야생형 마우스 및 녹아웃 마우스 BMDM에서 LPS 자극에 의한 NF-κB p65의 핵내 전이(translocation)를 확인한 결과를 나타낸다.
도 6a는, 루시퍼라아제 리포터 분석을 통해, LGALS3BP의 과발현을 일으킨 마우스 MEF 및 RAW264.7에서의 LPS 자극에 의한 NF-κB 활성 정도를 확인한 결과를 나타낸다.
도 6b는, 웨스턴 블롯을 통해, LGALS3BP의 과발현을 일으킨 녹아웃 마우스 MEF에서 mGal-3BP 및 LPS 하위 신호전달체계 인자로서 TLR4, MyD88, p-IRAK4, IRAK4, TRAF6, p-TAK1, TAK1, p-IKKα/β, p-IκBα, IκBα, p-p65, p-ERK, ERK, p-p38, p38, p-JNK, β-actin을 측정한 결과를 나타낸다.
도 6c는 LGALS3BP의 과발현을 일으킨 야생형 마우스 MEF에서 mGal-3BP, β-actin 및 LPS 하위 신호전달쳬계 인자로서 TLR4, MyD88, p-IRAK4, IRAK4, TRAF6, p-TAK1, TAK1, p-IKKα/β, p-IκBα, IκBα, p-p65, p-ERK, ERK, p-p38, p38, p-JNK을 측정한 결과를 나타낸다.
도 6d는, RT-PCR을 통해, LPS로 처리된 LGALS3BP의 과발현을 일으킨 야생형 마우스 MEF에서 LGALS3BP 및 염증성 사이토카인인 IL-6, TNF-α, IL-1β mRNA 발현량을 측정한 결과를 나타낸다.
도 6e는, ELISA를 통해, LPS로 처리된 LGALS3BP의 과발현을 일으킨 야생형 마우스 및 녹아웃 마우스 MEF의 세포배양 상층액에서 IL-6, TNF-α, IL-1β를 측정한 결과를 나타낸다.
도 7a는, 루시퍼라아제 리포터 분석을 통해, LGALS3BP의 과발현을 일으킨 마우스 HEK293T에서 LPS, IL-1β 및 TNF-α의 다양한 자극에 의한 NF-κB 활성 정도를 확인한 결과를 나타낸다.
도 7b는, RT-qPCR을 통해, LGALS3BP의 과발현을 일으킨 마우스 HEK293T에서 IL-6, TNF-α, IL-1β mRNA 발현량을 측정한 결과를 나타낸다.
도 7c는, 루시퍼라아제 리포터 분석을 통해, TAK1 단백질 복합체 구성인자들의 과발현을 일으킨 마우스 HEK293T에서 에서 Lgals3bp의 발현 증가에 따른 NF-κB 활성 정도를 확인한 결과를 나타낸다.
도 7d는, 루시퍼라아제 리포터 분석을 통해, LGALS3BP의 과발현을 일으킨 마우스 HEK293T에서 TRAF6, TAB1, TAB2 및 TAB3 벡터로 형질 전환하였고, 그 다음에 TAK1으로 공동 형질 전환 후 NF-κB 활성 정도를 확인한 결과를 나타낸다.
도 8a는, 면역침강법을 통해, 마우스 HEK 293T에서 LGALS3BP와 TAK1 및 TAK1 단백질 복합체의 구성 인자들 간의 단백질 결합 및 상호작용 분석한 결과를 나타낸다.
도 8b는, 면역침강법을 통해, 야생형 및 녹아웃 마우스 MEF에서 LGALS3BP와 TAK1의 내인성 상호결합을 분석한 결과를 나타낸다.
도 8c는, 면역침강법을 통해, 마우스 HEK 293T에서 LGALS3BP와 TAK1 및 TAK1 단백질 복합체의 구성 인자들 간의 단백질 결합 및 상호작용 분석한 결과를 나타낸다.
도 9a는, 웨스턴 블롯을 통해, 다양한 용량의 LGALS3BP의 과발현을 일으킨 마우스 HEK293T에서 hGal-3BP, TAK1, p-TAK1(T184/187), p-TAK1(S412), β-actin을 측정한 결과를 나타낸다.
도 9b는, TAK1-TAB1 Kinase Enzyme System (Promega)을 통해, 수포 염기성 단백질(Myelin basic protein, MBP)을 기질로 하는 TAK1-TAB1 융합단백질의 키나아제 활성에 미치는 LGALS3BP 단백의 효과를 분석한 결과를 나타낸다.
도 9c는, CHX chase 분석을 통해, LGALS3BP에 의한 TAK1 단백질의 불안정화를 재검증한 결과를 나타낸다.
도 9d는, 유비퀴틴-프로테아좀 억제제 처리를 통해, LGALS3BP에 의한 TAK1의 분해 기전을 분석한 결과를 나타낸다.
도 10은 TAK1 의존적 NF-κB 신호 전달 경로에 대한 LGALS3BP의 억제 효과 매커니즘을 나타낸다.
도 11a는 LGALS3BP의 단백질 단편을 나타낸다.
도 11b는 루시퍼라아제 리포터 분석을 통해, 활성화된 NF-κB가 LGALS3BP 단백질 및 그의 단편에 의해 억제됨을 나타낸다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실험재료 및 방법

1. 시약과 항체

LPS와 진핵세포 단백질 합성 억제제 시클로헥사미드(cycloheximide)는 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)에서 구매하였다. 마우스 IL-6, TNF-α, IL-1β 재조합 단백질은 PeproTech (Rocky Hill, NJ, USA)에서 구매하였다. MyD88, IRAK4, p-IRAK4, TRAF6, p-TAK1 (T184/187), TAB2, TAB3, IκBα, p-IκBα, p-IKKαβ, p38, p-p38, ERK, p-ERK, JNK, p-JNK, NF-κB p65, p-NF-κB p65, Lamin B에 대한 항체는 Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA)에서 구매하였다. TAK1, hemagglutinin (HA), β-actin, β-tubulin에 대한 항체는 Abcam (Cambridge, UK)에서 구매하였다. TLR4, TAB1에 대한 항체는 Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA)에서 구매하였다. LGALS3BP에 대한 항체는 Immuno-Biological Laboratories (Fujioka-Shi, Gunma, Japan)에서 구매하였다. p-TAK1 (S412), Myc-Tag 항체는 Millipore (Billerica, MA, USA)에서 구매하였다. Flag에 대한 항체는 Medical & Biological Laboratories (Naka-ku, Nagoya, Japan)에서 구매하였다.

2. DNA 벡터 제작

마우스와 사람의 LGALS3BP는 PCR을 통해 오픈 리딩 프레임 (open reading frame, ORF)을 증폭한 후 pcDNA6/myc-His A 벡터 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)에 삽입하였다. TLR4, HA-TRAF6, HA-TAK1, Flag-TAB1, Flag-TAB2 및 Flag-TAB3 벡터 모두 동일한 방법으로 PCR 증폭 후 발현 벡터에 삽입하였으며 분자 생물학의 표준기술에 따라 제작하였다.

상기 플라스미드 제작에 사용된 primer 서열은 다음과 같다. Primer의 서열은 벡터 제작을 위한 제한효소 인식 서열과 오픈 리딩 플레임과 상보적으로 결합 및 증폭할 수 있는 효소 인식 서열과 오픈 리딩 플레임과 상보적으로 결합 및 증폭할 수 있는 서열로 구성되어 있다. (표 3)

유전자	방향	서열 (5' to 3')	백터	서열번호 (SEQ ID NO.)
mGal-3BP	Forward	ACCGAGCTCGGATCCATGGCTCTCCTGTGGCTCCTCTCT	pcDNA6/myc	5
mGal-3BP	Reverse	GAAGGGCCCTCTAGACACCATGTCAGTGGAGTTAGT	pcDNA6/myc	6
hGal-BP	Forward	ACCGAGCTCGGATCCATGACCCCTCCGAGGC	pcDNA6/myc	7
hGal-BP	Reverse	CGAAGGGCCCTCTAGAGTCCACACCTGAGGAG	pcDNA6/myc	8
hTLR4	Forward	GATGACGACAAGCGGGGTACCGAAAGCTGGGAGCCC	pcDNA3-FlaB	9
hTLR4	Reverse	GGATCCGAGCTCGGTACCTCAGATAGATGTTGC	pcDNA3-FlaB	10
hTRAF6	Forward	TTCATCGATAGATCTGAGTCTGCTAAACTGTGAA	pFLAG-CMV-2	11
hTRAF6	Reverse	GAGTCGACTGGTACCCTATACCCCTGCATCAGT	pFLAG-CMV-2	12
hTAK1	Forward	GTACCGAGCTCGGATCCATGTCTACAGCCTCTGCCGCC	pcDNA3-HA-B	13
hTAK1	Reverse	AACGGGCCCTCTAGATCATGAAGTGCCTTGTCGTTTC	pcDNA3-HA-B	14
hTAB1	Forward	ATTCATCGATAGATCTGATGGCGGCGCAGAGGAGGAGC	pFLAG-CMV-2	15
hTAB1	Reverse	CCGGGATCCTCTAGATCACGGTGCTGTCACCACGCTC	pFLAG-CMV-2	16
hTAB2	Forward	ATTCATCGATAGATCTGATGGCCCAAGGAAGCCACC	pFLAG-CMV-2	17
hTAB2	Reverse	CCGGGATCCTCTAGATCAAGTTAGATTATTTTCCATTTC	pFLAG-CMV-2	18
hTAB3	Forward	ATTCATCGATAGATCTGATGGCGCAAAGCAGCCCACAGC	pFLAG-CMV-2	19
hTAB3	Reverse	CCGGGATCCTCTAGATCAGGTGTACCGTGGCATCTCG	pFLAG-CMV-2	20

제작된 발현 벡터는 DNA 시퀀싱을 통해 검증하였다. 루시퍼라아제(Luciferase) 분석을 위해 루시퍼라아제 유전자 상위에 네 개의 NF-κB 결합 서열이 존재하는 NF-κB 리포터 벡터는 Clontech (Palo Alto, CA, USA)에서 구매하였다. 발현 벡터의 과발현을 위해 lipofectamine 3000 (Invitrogen)을 이용해 형질 전환하였다.

3. 면역형광염색

세포를 8-well 챔버 슬라이드 (Nalge Nunc, Rochester, NY, USA)에 접종한 후 24시간 배양하였다. LPS 전처리 후, 세포를 세척하고 3% 포름알데히드(formaldehyde) 용액으로 고정하였다. 3% BSA를 포함한 PBS로 blocking 반응을 하고 항-NF-κB 항체 (Cell Signaling Technology)를 4 ℃에서 12시간 동안 반응하였다. 이후에 2차 항체 (anti-mouse FITC conjugated)와 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, Invitrogen)를 1시간 반응시킨 후에 confocal microscopy (Leica, Switzerland)를 이용해 관찰하였다.

4. 웨스턴 블롯 (Western blotting)

세포로부터 세포 용해물의 분리 및 정량 후, 동량의 단백질을 SDS-PAGE를 통해 분리하고 이를 폴리비닐리덴 디플루오라이드(polyvinylidene difluoride, PVDF) 멤브레인 (GE Healthcare Bio-sciences, Piscataway, NJ, USA)으로 옮겼다. 1차 항체로 4 ℃에서 12 시간 동안 반응시킨 후 1X TBST 완충액으로 10분간 3회 세척하였다. 1차 항체에 따라 적합한 anti-rabbit-HRP 또는 anti-mouse-HRP 2차 항체를 상온에서 1시간 반응시킨 후 1X TBST 완충액으로 10분간 3회 세척하였다. ECL 용액 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Crux, CA, USA)을 이용한 horseradish peroxide(HRP)-기질 반응을 통해 단백질의 발현을 분석하였다.

5. 통계

통계 분석은 SPSS 12.0 소프트웨어 (SPSS, Inc., Chicago, IL, USA)를 이용하여 수행하였다. 통계적 유의성은 Student's two-tailed t-test에 의해 평가되었다. 0.05 미만의 P- value를 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.

실시예 1: LGLAS3BP-유전자 녹아웃 마우스 제작 및 스크리닝 방법

실시예 1-1. LGLAS3BP 유전자 녹아웃 마우스 제작 방법

모든 동물 실험은 전남대학교 의과대학연구소 동물실험윤리위원회. (IACUC, Institutional Animal Care and Use Committee)의 승인을 받아 수행하였다.

LGLAS3BP-유전자 녹아웃 마우스는 CRISPR-Cas9 유전자 편집 시스템을 이용하여 제작하였다 (Macrogen, Inc., Seoul, Korea).

LGALS3BP의 exon 3을 타겟팅하는 두 개의 single-guide RNAs (sgRNAs)를 체외 전사 (in vitro transcription)을 통해 제작하였다. 제작된 sgRNAs와 Cas9 재조합 단백질을 C57BL/6의 마우스 배아에 공동 주입한 후, 신생아를 얻기 위해 마우스 배아를 대리모(foster mother) 마우스의 난관에 이식하였다.

상기 sgRNAs의 서열은 다음과 같다.

5′-GCCAGGCAATGGCTCTCCTGTGG-3′ (서열번호 21)

5′-CTGTGTTCTTGCTGGTTCCAGGG-3′ (서열번호 22)

LGALS3BP 유전자 녹아웃 마우스를 꼬리에서 추출한 genomic DNA의 시퀀싱 및 중합효소 연쇄반응 (Polymerase Chain Reaction, PCR)을 통해 스크리닝하였다. 최종적으로 LGALS3BP의 exon 3의 7-뉴클레오타이드가 결손 된 founder 유전자 녹아웃 마우스를 제작하였다.

실시예 1-2. LGLAS3BP 유전자 녹아웃 마우스의 스크리닝 방법

LGLAS3BP 유전자 녹아웃 마우스의 스크리닝을 위해 PCR, DNA 시퀀싱, genotyping PCR, 웨스턴 블롯을 통해 확인하였다.

DNA 시퀀싱을 위한 PCR에 사용된 primer 서열은 다음과 같다.

정방향 TGAGCTGGATCTGCTGAAGG (5'-3'방향, mGal-3BP-F, 서열번호 23)

역방향 AGGTGTCCTCCGTGAGGTTC　(5'-3'방향, mGal-3BP-R, 서열번호 24)

Genotyping PCR에 사용한 서열은 다음과 같다.

정방향 AGCAAAAGACCCAGAGCTGA (5'-3'방향, mGal-3BP-ex3-F, 서열번호 25)

역방향 GTGAGGACTCGGTCCCTGTA　(5'-3'방향, mGal-3BP-ex3-R, 서열번호 26)

정방향 TGGAGACATGCGCTTGGTT 　(5'-3'방향, mGal-3BP-KO-R, 서열번호 27)

웨스턴 블롯에 사용된 항체는 mGal-3BP에 대한 항체이다.

그 결과, 도 1a에 나타난 바와 같이, 비장과 간 조직 및 골수유래대식세포에서의 LGALS3BP 유전자의 결손을 전사 단계에서 확인하였다.

또한, 도 1b에 나타난 바와 같이, DNA 시퀀싱을 통해 LGALS3BP exon 3의 7-뉴클레오타이드의 결손을 확인하였다.

따라서, 도 1c에 나타난 바와 같이, 7-뉴클레오타이드 결손으로 인해 LGALS3BP의 mRNA transcript는 오픈리딩프레임 (ORF)의 변화로 인해 번역(translation)이 도중에 종결되어 기능적 전장 단백질(full-length protein)을 합성할 수 없다.

최종적으로, 도 1d에 나타난 바와 같이, 비장, 간 조직 및 골수유래대식세포에서 LGALS3BP의 단백질이 발현되지 않음을 웨스턴 블롯을 통해 확인하였다.

실시예 2: 마우스배아섬유아세포(MEF)에서 LGALS3BP 녹아웃에 의한 염증성 사이토카인의 과발현 및 NF-κB의 과활성화 확인

실시예 2-1. 혈장 사이토카인 분석을 통한 LGALS3BP 녹아웃 마우스에서의 염증인자 발현 증가 확인

본 발명자들은 상기 검증된 LGALS3BP 녹아웃 마우스와 야생형 마우스의 염증 반응을 비교하기 위해, 마우스에 LPS (40 mg/kg body weight)와 D-갈락토사민(D-galactosamine)(400 mg/kg body weight)을 복강 주사하여 마우스 생존률 분석 및 혈액 샘플을 채취하여 혈장 사이토카인을 분석하였다.

혈장 사이토카인을 ELISA를 통해 분석하였으며, 사용된 항체는 IL-6, TNF-α, IL-1β에 대한 항체이다.

도 2a에 나타난 바와 같이, 녹아웃 마우스는 야생형 마우스에 비해 낮은 생존률을 나타냈다.

또한 도 2b에 나타난 바와 같이 녹아웃 마우스는 IL-6, TNF-α, IL-1β와 같은 염증성 사이토카인의 수치가 야생형 마우스에 비해 높게 나타냈다.

이러한 결과는 LGALS3BP 녹아웃 마우스가 야생형 마우스에 비해 높은 염증 반응성을 가지며, 내독성 쇼크(endotoxin shock)에 더 취약함을 의미한다.

실시예 2-2. LGALS3BP 녹아웃 마우스에서 분리한 MEF에서의 염증인자 발현 증가 확인

본 발명자들은 상기 결과를 검증하기 위해 야생형 마우스와 녹아웃 마우스에서 분리한 MEF를 이용하여 LPS 자극에 의한 염증성 사이토카인의 발현 유도 및 분비량을 분석하였다.

MEF는 13 일령의 마우스배아로부터 분리하였다. 세포는 10% (v/v)의 태아 소 혈청 (fetal bovine serum, FBS)과 1% 페니실린/스트렙토마이신을 함유한 DMEM(Dulbecco’s modified Eagle’s medium) 배지로 37 ℃, 5 % CO₂의 가습조건에서 배양하였다. LPS 자극을 위해서 1 μg/ml의 LPS를 세포에 처리하였다.

사이토카인의 발현 유도 및 분비량 분석은 ELISA 및 RT-PCR을 이용해 수행하였다.

LPS 처리 24 시간 후에 ELISA를 이용하여 IL-6, TNF-α, IL-1β 를 측정하였다.

LPS 처리 24 시간 후에 RT-PCR을 이용하여 마우스 IL-6, TNF-α, IL-1β의 mRNA 발현 수준을 측정하였다. RT-PCR에서 사용된 프라이머 서열은 표 4에 나타낸다.

유전자	방향	서열 (5' to 3')	서열번호 (SEQ ID NO.)
mIL6	Forward	TTCTCCACAAGCGCCTTCGGTC	28
mIL6	Reverse	CTGTGTGGGGCGGCTACATCT	29
mTNF-α	Forward	TCTTCTCGAACCCCGAGTGA	30
mTNF-α	Reverse	CCTCTGATGGCACCACCAG	31
mIL-1β	Forward	AGATGATAAGCCCACTCTACAG	32
mIL-1β	Reverse	ACATTCAGCACAGGACTCTC	33
mGAPDH	Forward	ACCACAGTCCATGCCATCAC	34
mGAPDH	Reverse	TCCACCACCCTGTTGCTGTAG	35

그 결과 도 2c와 2d에 나타난 바와 같이, 녹아웃 마우스의 MEF에서 염증성 사이토카인의 발현과 분비가 증가하였다.

실시예 2-3. NF-κB 루시퍼라아제 리포터 분석을 통한 LGALS3BP 녹아웃 마우스에서 분리한 MEF에서의 NF-κB 활성화 확인

NF-κB는 염증 반응의 핵심 조절 인자이다. 따라서 본 발명자들은 LGALS3BP 녹아웃에 의한 염증 반응의 증가 기전을 확인하기 위해 LGALS3BP와 NF-κB의 상관관계를 분석하였다.

이를 위해 야생형 마우스와 LGALS3BP 녹아웃 마우스에서 분리한 MEF를 이용하여 LPS 자극에 대한 NF-κB 루시퍼라아제 리포터 분석을 실시하였다.

야생형 및 녹아웃 MEF는 NF-κB 루시퍼라아제 리포터 플라스미드에 의해 형질 전환되었으며, LPS 자극을 위해서 1 μg/ml의 LPS를 세포에 처리하였다. LPS 자극 후 24시간 후에 NF-κB 의존적 루시퍼라아제 활성을 분석하였다.

그 결과 도 2e에 나타난 바와 같이, LPS 자극에 의한 NF-κB 활성화가 LGALS3BP 유전자 결손에 의해 유의적으로 증가됨을 확인하였다.

실시예 2-4. 면역형광염색법을 통한 LGALS3BP 녹아웃 마우스에서 분리한 MEF에서의 NF-κB 활성화 확인

NF-κB p65는 상위 신호전달체계에 의해 인산화 되면 활성화되어 세포질에서 핵 내로 전이(translocation)된다. 그러므로 NF-κB p65의 핵 전이는 NF-κB 활성을 측정하는 또 다른 분석법이다.

본 발명자들은 MEF에 1 μg/ml LPS를 처리한 후 NF-κB p65의 위치 변화를 면역형광염색법 및 웨스턴 블롯으로 분석하였다.

LPS 처리 30분 후에 면역형광염색법을 이용하여 NF-κB p65의 핵내 전이를 확인하였다. 면역형광염색법에 사용한 1차 항체는 NF-κB p65에 대한 항체이다.

LPS 처리 30분 후에 핵-세포질을 분리한 후, 웨스턴 블롯을 이용하여 핵과 세포질의 단백질 발현을 측정하였다. 웨스턴 블롯에 사용한 1 차 항체는 NF-κB p65, Lamin B, β-tubulin에 대한 항체이다.

그 결과, 도 2f에 나타난 바와 같이, LPS 자극에 의한 NF-κB p65의 핵내 전이(translocation)가 LGALS3BP 녹아웃 MEF에서 유의적으로 증가하였고 이는 도 2g에 나타난 핵-세포질 분리 후 웨스턴 블롯 분석 결과와 일치하였다.

실시예 2-5. LGALS3BP 녹아웃 마우스에서 분리한 MEF에서의 TAK1-NF-κB 신호전달체계 활성화 확인

본 발명자들은 LPS 자극에 의해 활성화되는 신호전달체계를 검증하기 위해, MEF를 이용하여 LPS 자극에 따른 TLR4-TAK1-NF-κB 신호전달체계 및 이러한 신호전달체계에 LGALS3BP가 미치는 영향을 분석하였다.

이를 위해 유전자 녹아웃 마우스와 야생형 마우스 유래 MEF에 LPS를 처리한 후 웨스턴 블롯을 이용해 검출되는 단백질을 분석하였다.

LPS 처리 1 시간 후에, 웨스턴 블롯을 이용하여 단백질 발현을 측정하였다. 웨스턴 블롯에 사용한 1차 항체는 mGal-3BP, TLR4, MyD88, p-IRAK4, IRAK4, TRAF6, p-TAK1, TAK1, p-IKKα/β, p-IκBα, IκBα, p-p65, p-ERK, ERK, p-p38, p38, p-JNK, β-actin에 대한 항체이다.

그 결과 도 2h에 나타난 바와 같이, TLR4와 TRAF6 분자는 야생형 마우스 및 녹아웃 마우스 유래 세포에서 모두 유사한 수준의 활성화를 나타냈다.

그러나 녹아웃 마우스 유래 세포에서 TAK1 인산화가 현저하게 증가되었으며 이는 TAK1의 활성화를 반영하는 증거이다.

또한 TAK1의 하위 신호전달 분자인 IKKα/β, IκBα, NF-κB p65, ERK, p38 및 JNK의 인산화가 녹아웃 세포에서 증가하였다.

상기 웨스턴 블롯 결과 및 TAK1은 NF-κB의 상위 핵심 조절인자라는 사실을 종합하여 보면, 상기 결과는 LGALS3BP 유전자의 결손이 TAK1의 과활성화를 통해 NF-κB 신호전달체계를 활성화시킴을 의미한다.

실시예 2-6. LGALS3BP 녹아웃 마우스에서 분리한 MEF에서의 염증성 사이토카인 및 케모카인 발현 증가 확인

본 발명자들은 도 2c에 나타난 대표적인 염증성 사이토카인 외에도 LPS 자극에 의한 사이토카인 및 케모카인의 발현 유도에 LGALS3BP 유전자의 결손이 미치는 영향을 RT-qPCR을 이용해 분석하였다.

RT-PCR에 사용된 프라이머 서열은 표 5에 나타낸다.

유전자	방향	서열 (5' to 3')	서열번호 (SEQ ID NO.)
mIL6	Forward	TTCTCCACAAGCGCCTTCGGTC	28
mIL6	Reverse	CTGTGTGGGGCGGCTACATCT	29
mTNF-α	Forward	TCTTCTCGAACCCCGAGTGA	30
mTNF-α	Reverse	CCTCTGATGGCACCACCAG	31
mIL-1β	Forward	AGATGATAAGCCCACTCTACAG	32
mIL-1β	Reverse	ACATTCAGCACAGGACTCTC	33
mCCL2	Forward	AGCACCAGCCAACTCTCACT	36
mCCL2	Reverse	CGTTAACTGCATCTGGCTGA	37
mCCL5	Forward	ATATGGCTCGGACACCACTC	38
mCCL5	Reverse	TTCTTCGAGTGACAAACACG	39
mCCL7	Forward	CCTGGGAAGCTGTTATCTTCAA	40
mCCL7	Reverse	TGGAGTTGGGGTTTTCATGTC	41
mCxcl2	Forward	GAAGTCATAGCCACTCTCAAGG	42
mCxcl2	Reverse	TTCCGTTGAGGGACAGCA	43
mCxcl3	Forward	CAGCCACACTCCAGCCTA	44
mCxcl3	Reverse	CACAACAGCCCCTGTAGC	45
mCxcl10	Forward	GGATCCCTCTCGCAAGGA	46
mCxcl10	Reverse	ATCGTGGCAATGATCTCAACA	47

그 결과 도 3에 나타난 바와 같이, 녹아웃 마우스 유래 MEF에서 LPS 자극에 의해 염증성 사이토카인 IL-6, TNF-α, IL-1β 뿐 아니라 Ccl2, Ccl5, Ccl7, Cxcl2, Cxcl3, Cxcl10 케모카인의 발현이 유의적으로 증가함을 확인하였다.

실시예 2-6. siRNA를 이용한 LGALS3BP 녹다운에 의한 NF-κB 활성화 및 염증성 사이토카인의 발현 증가 확인

본 발명자들은 LGALS3BP 녹아웃 효과를 재검증하기 위해 siRNA를 이용한 LGALS3BP 녹다운(knockdown)에 의한 NF-κB 활성 및 염증성 사이토카인의 발현 분석을 수행하였다.

상기 분석을 위해 루시퍼라아제 리포터 분석, RT-PCR, 웨스턴 블롯, ELISA를 수행하였다.

루시퍼라아제 리포터 분석을 위해 음성 대조군 siRNA(siNC) 또는 siLGALS3BP로 처리 된 야생형 마우스에서 유래한 MEF를 NF-κB 루시퍼라아제 리포터 플라스미드로 형질 전환시키고, 그 후 LPS로 자극 하였다. LPS 자극 후에 NF-κB 의존적 루시퍼라아제 활성을 분석하였다.

야생형 마우스에서 유래한 MEF를 siRNA(siNC) 또는 siLGALS3BP로 48 시간 동안 처리하고 그 후 LPS로 24시간 동안 처리하였다. 그 결과를 웨스턴 블롯 및 RT-PCR을 이용해 측정하였다. 웨스턴 블롯에서 사용한 1차 항체는 mGAL-3BP, β-actin 에 대한 항체를 사용하였다. RT-PCR에서 사용된 프라이머 서열은 표 6에 나타낸다.

야생형 마우스에서 유래한 MEF를 siRNA(siNC) 또는 siLGALS3BP로 48 시간 동안 처리한 후 LPS로 세포를 자극한 결과를 ELISA을 이용해 측정하였다. ELISA에 사용된 항체는 IL-6, TNF-α, IL-1β에 대한 항체이다.

그 결과 도 4a에 나타난 바와 같이, MEF를 이용한 NF-κB 루시퍼라아제 리포터 분석 결과 siRNA를 이용한 LGALS3BP 녹다운 시 LPS에 의한 NF-κB 활성이 siNC 컨트롤에 비해 유의적으로 증가됨을 확인하였다.

또한 도 4b와 4c에 나타난 바와 같이, NF-κB 하위 염증성 사이토카인의 발현 및 분비가 LGALS3BP 녹다운에 의해 유의적으로 증가됨을 확인하였다.

이는 LGALS3BP 녹아웃 분석과 일치하는 결과로서 LGALS3BP가 LPS에 의한 NF-κB 활성화 과정에서 NF-κB의 활성을 억제 및 제한하여 하위 염증성 사이토카인의 발현 및 분비를 억제할 수 있음을 의미한다.

실시예 3: 골수유래 대식세포(BMDMs)에서 LGALS3BP 녹아웃에 의한 염증성 사이토카인의 발현 증가 및 NF-κB의 과활성화 확인

본 연구자들은 MEF 뿐 아니라 염증 반응에 중추적인 대식세포를 이용하여 LGALS3BP의 기능을 분석하였다.

마우스에서 분리한 골수세포를 30 ng/ml 대식세포 콜로니 자극 인자(macrophage colony-stimulating factor, M-CSF)을 함유한 RPMI 1640 배지에 배양하여 골수유래 대식세포(BMDM)를 분화 및 획득하였다. 세포는 10% (v/v)의 태아 소 혈청 (fetal bovine serum, FBS)과 1% 페니실린/스트렙토마이신을 함유한 DMEM(Dulbecco’s modified Eagle’s medium) 배지로 37 ℃, 5% CO₂의 가습조건에서 배양하였다. LPS 자극을 위해서 1 μg/ml의 LPS를 세포에 처리하였다.

염증성 사이토카인을 분석하기 위해 ELISA, RT-PCR, 면역형광염색, 웨스턴 블롯을 수행하였다.

LPS 처리 24 시간 후에 ELISA를 이용하여 IL6, TNF-α, IL-1β 를 측정하였다.

LPS 처리 24 시간 후에 RT-PCR을 이용하여 mRNA 발현 수준을 측정하였다. RT-PCR에서 사용된 프라이머 서열은 표 4에 나타낸다.

LPS 처리 10분 후에 면역형광염색법을 이용하여 NF-κB p65의 핵내 전이를 확인하였다. 면역형광염색법에 사용한 1차 항체는 NF-κB p65에 대한 항체이다.

LPS 처리 1시간 후에 핵-세포질을 분리한 후, 웨스턴 블롯을 이용하여 핵과 세포질의 단백질 발현을 측정하였다. 웨스턴 블롯에 사용한 1 차 항체는 NF-κB p65. Lamin B, β-tubulin에 대한 항체이다.

야생형 마우스와 LGALS3BP 녹아웃 마우스의 골수유래 대식세포를 이용하여 LPS 자극에 의한 염증성 사이토카인을 분석한 결과, 도 5a와 도 5b에 나타난 바와 같이 LGALS3BP 녹아웃에 의해 염증성 사이토카인 IL-6, TNF-α 및 IL-1β의 발현과 분비가 유의적으로 증가함을 확인하였다.

또한 도 5c와 5d에 나타난 바와 같이, LPS 자극에 의한 NF-κB p65의 핵내 전이(translocation)가 LGALS3BP 녹아웃 골수유래 대식세포에서 유의적으로 증가하였고 이는 핵-세포질 분리 후 웨스턴 블롯 분석 결과와 일치하였다.

실시예 4: LGALS3BP 과발현에 의한 TAK1-NF-κB 신호전달체계 활성 억제 및 염증성 사이토카인 발현 억제 확인

실시예 4-1. MEF 및 RAW264.7에서의 LGALS3BP 과발현에 의한 NF-κB 활성 억제 확인

본 발명자들은 LGALS3BP 녹아웃에 의한 TAK1-NF-κB 신호전달체계 과활성화 및 염증성 사이토카인의 분비 증가의 상기 결과를 역으로 확인하기 위해 LGALS3BP 과발현 실험을 수행하였다.

LGALS3BP 과발현 실험을 수행하기 위해 루시퍼라아제 리포터 분석과 MEF 및 대식세포주 RAW264.7를 사용하였다.

MEF 및 RAW264.7은 vector 컨트롤 또는 LGALS3BP 플라스미드와 함께 NF-κB-루시퍼라아제 리포터 플리스미드로 형질 전환되었다. LPS 접종 24 시간 후에 NF-κB 의존적 루시퍼라아제 활성을 측정하였다.

그 결과 도 6a에 나타난 바와 같이, LPS에 의해 유도된 NF-κB의 활성화가 LGALS3BP의 과발현에 의해 억제되었으며 이는 야생형 마우스 및 녹아웃 마우스 유래 MEF에서 모두 동일하게 재현되었다. 또한 LPS 자극이 없는 기저 수준의 NF-κB의 활성 역시 LGALS3BP의 과발현에 의해 억제되었다. 대식세포주 Raw 264.7 세포에서도 동일한 효과가 확인되었다.

이러한 결과들은 LGALS3BP에 의해 NF-κB 활성이 억제됨을 의미한다.

실시예 4-2. 마우스 유래 MEF에서의 LGALS3BP 과발현에 의한 TAK1-NF-κB 신호전달체계 억제 확인

본 발명자들은 TLR4-TAK1-NF-κB 신호전달체계의 어떠한 분자가 LGALS3BP에 의해 영향을 받는지 분석하였다.

야생형 및 녹아웃 마우스에서 유래한 MEF를 벡터 대조군 또는 LGALS3BP 발현 플라스미드를 이용해 형질 전환하였다. 형질 전환 된 세포를 LPS를 이용해 자극하였다. 그 후 웨스턴 블롯을 사용해 단백질을 분석하였다.

웨스턴 블롯에서 사용한 1차 항체는 mGal-3BP, TLR4, MyD88, p-IRAK4, IRAK4, TRAF6, p-TAK1, TAK1, p-IKKα/β, p-IκBα, IκBα, p-p65, p-ERK, ERK, p-p38, p38, p-JNK, β-actin에 대한 항체이다.

그 결과 도 6b에 나타난 바와 같이, 녹아웃 MEF에서 LGALS3BP 과발현이 LPS 자극에 의해 유도된 TAK1의 인산화를 현저하게 억제하였다.

또한, 녹아웃 MEF에서 LGALS3BP 과발현이 TAK1의 하위 신호전달 분자인 IKKα/β, IκBα, NF-κB p65, ERK, p38 및 JNK의 인산화 역시 억제하였다. 이러한 결과는 도 6c에 나타난 바와 같이, 야생형 MEF에서도 동일하게 확인하였다.

이는 LGALS3BP가 LPS 자극에 의한 TAK1의 인산화를 억제하며 이를 통해 하위 NF-κB 신호전달체계를 억제함을 의미한다.

실시예 4-3. 마우스 유래 MEF에서의 LGALS3BP 과발현에 의한 염증성 사이토카인의 발현 및 분비 억제 확인

염증성 사이토카인 IL-6, TNF-α 및 IL-1β는 LPS에 의해 유도되는 TLR4-TAK1-NF-κB 신호전달체계의 주요 하위인자이다

본 발명자들은 LGALS3BP 과발현에 의한 TAK1-NF-κB 신호전달체계의 억제가 염증성사이토카인의 발현 및 분비에 미치는 영향을 분석하였다.

야생형 및 녹아웃 마우스에서 유래한 MEF를 벡터 대조군 또는 LGALS3BP 발현 플라스미드를 이용해 형질 전환하였다. 형질 전환된 세포를 LPS를 이용해 자극하였다. 그 후 염증성 사이토카인의 분석은 RT-PCR 및 ELISA를 사용해 분석하였다.

RT-PCR에서 사용된 프라이머 서열은 표 6에 나타낸다.

ELISA에 사용된 1차 항체는 IL-6, TNF-α 및 IL-1β에 대한 항체이다.

그 결과 도 6d에 나타난 바와 같이, MEF에서 LGALS3BP 과발현이 LPS자극으로 유도된 염증성 사이토카인 IL-6, TNF-α 및 IL-1β의 mRNA 발현을 억제하였다. 또한 발현의 억제뿐 아니라 도 6e에 나타난 바와 같이 LGALS3BP 과발현이 LPS자극으로 유도된 염증성 사이토카인의 분비 또한 억제하였다.

이러한 결과는 LGALS3BP가 LPS 자극에 의한 TAK1의 인산화를 억제함으로서 하위 신호전달체계 분자인 NF-κB을 억제하며, 그 결과 주요 하위 인자인 염증성 사이토카인의 발현 및 분비가 억제됨을 의미한다.

실시예 5: TAK1 활성 조절을 통한 LGALS3BP의 NF-κB 활성 억제 기전 확인

실시예 5-1. 인간배아신장세포 293T에서의 LGALS3BP 과발현에 의한 TLR4에 의해 유도되는 NF-κB 활성 억제 및 염증성 사이토카인의 발현 억제 확인

TAK1은 다양한 신호 자극을 NF-κB 신호경로로 전달하는 신호전달체계의 상위 핵심 인자이다. 본 발명자들은 LGALS3BP에 의한 NF-κB 활성화의 억제가 TAK1 조절을 매개로 이루어지는지 분석하였다.

보다 구체적으로 TAK1-NF-κB 신호전달체계의 활성화를 유발하는 TLR4 과발현과 LPS의 동시 자극, IL-1β 및 TNF-α 처리에 의해 유도되는 NF-κB 활성을 LGALS3BP가 억제하는지 분석하였다.

인간배아신장세포 (Human Embryonic Kidney, HEK) 293T 는 10% (v/v)의 태아 소 혈청 (fetal bovine serum, FBS)과 1% 페니실린/스트렙토마이신을 함유한 DMEM(Dulbecco’s modified Eagle’s medium) 배지로 37 ℃, 5% CO₂의 가습조건에서 배양하였다.

HEK 293T를 vector 컨트롤, TLR4 또는 LGALS3BP 플라스미드와 함께 NF-κB-루시퍼라아제 리포터 플라스미드로 형질 전환하여 LPS, IL-1β, 또는 TNF-α로 24시간 동안 처리하였다. 그 후, NF-κB 의존적 루시퍼라아제 활성을 분석하였다.

또한, HEK 293T를 vector 컨트롤 또는 LGALS3BP 발현 플라스미드로 형질 전환하여 LPS로 3시간 동안 자극하였다. 그 후, IL-6, TNF-α 및 IL-1β의 mRNA 발현 수준을 RT-qPCR을 이용해 측정하였다.

그 결과 도 7a에 나타난 바와 같이, HEK 293T에서 LPS, IL-1β 및 TNF-α 처리에 의해 NF-κB의 활성이 증가되었으며, 활성화된 NF-κB가 LGALS3BP의 과발현에 의해 억제됨을 확인하였다.

또한 도 7b에 나타난 바와 같이, HEK 293T에서 LPS에 의해 유도된 염증성 사이토카인 IL-6, TNF-α 및 IL-1β의 발현이 LGALS3BP의 과발현에 의해 억제됨을 확인하였다.

실시예 5-2. HEK 293T에서의 LGALS3BP 과발현에 의한 TRAF6, TAK1, TAB1, TAB2 및 TAB3 매개 NF-κB 활성 억제 확인

본 발명자들은 LGALS3BP에 의한 NF-κB 신호경로의 억제가 TAK1 활성 조절을 매개로 일어나는지 재검증하였다.

보다 구체적으로 TAK1 단백질 복합체의 구성 인자들과 LGALS3BP를 동시 발현하여 NF-κB 루시퍼라아제 분석을 통해 NF-κB 활성도를 측정하였다.

HEK 293T를 vector 컨트롤, LGALS3BP 플라스미드와 함께 NF-κB-루시퍼라아제 리포터, TRAF6, TAK1, TAB1, TAB2 및 TAB3 벡터로 형질 전환하였고, 그 후 NF-κB 의존적 루시퍼라아제 활성을 분석하였다.

그 결과 도 7c에 나타난 바와 같이, TAK1 단백질 복합체의 구성 인자인 TRAF6, TAK1, TAB1, TAB2, TAB3의 과발현으로 NF-κB의 활성화를 유도하였다.

또한 LGALS3BP는 TRAF6와 TAK1 과발현에 의해 증가되는 NF-κB의 활성만을 용량 의존적으로 억제하였다.

이에 반해 LGALS3BP는 TAB1과 TAB2 과발현에 의해 유도된 NF-κB의 활성은 LGALS3BP에 의해 억제되지 않았다.

TAB3 과발현에 의해 유도된 NF-κB의 활성은 가장 높은 발현의 LGALS3BP에 의해서만 억제되었고, 저발현된 용량의 LGALS3BP는 NF-κB의 활성을 억제하지 않았다.

실시예 5-3. HEK 293T에서의 TAK1과 TRAF6, TAB1, TAB2, TAB3의 동시 존재 시 LGALS3BP 과발현에 의한 NF-κB 활성 억제 확인

NF-κB의 상위 핵심인자인 TAK1의 키나아제 활성은 TRAF6와 그 외 어댑터 단백질 TAB1, TAB2, TAB3와의 상호작용으로 촉진된다.

본 발명자들은 TAK1 활성에 관여하는 TRAF6, TAB1, TAB2, TAB3의 존재 하에 LGALS3BP에 의한 NF-κB의 활성 변화를 측정하였다.

HEK 293T를 vector 컨트롤, LGALS3BP 플라스미드와 함께 NF-κB-루시퍼라아제 리포터, TRAF6, TAB1, TAB2 및 TAB3 벡터로 형질 전환하였고, 그 다음에 TAK1으로 공동 형질 전환하였다. 형질 전환 후, NF-κB 의존적 루시퍼라아제 활성을 분석하였다.

그 결과 도 7d에 나타난 바와 같이, TAK1 단독 발현에 비해 어댑터 단백질의 존재 시 TAK1 발현에 의한 NF-κB 활성이 더욱 증가하였다. 또한, 어댑터 단백질의 존재 시 LGALS3BP에 의한 NF-κB 활성이 억제되는 정도가 더욱 증가하였다.

상기의 분석 결과는 LGALS3BP가 TAK1 의존적인 NF-κB의 활성화를 억제함을 의미한다.

실시예 6: LGALS3BP에 의한 TAK1 단백의 불안정화 및 키나아제 활성 억제 확인

실시예 6-1. 면역침강법을 통한 LGALS3BP와 TAK1 및 TAK1 단백질 복합체 구성 인자의 상관관계 확인

본 발명자들은 LGALS3BP에 의한 TAK1 억제 기전 연구를 위해, LGALS3BP와 TAK1 및 TAK1 단백질 복합체의 구성 인자들 간의 단백질 결합 및 상호작용 분석을 실시하였다.

단백질 결합 및 상호작용 분석을 위해 면역침강 및 웨스턴 블롯을 수행하였다.

면역 침강을 위해 세포 용해액 500 μg을 항체 1 μg과 혼합한 후 4 ℃에서 12시간 동안 반응하였다. 단백질 A/G-아가로즈 bead를 첨가한 후 4 ℃에서 2시간 동안 반응한 후 면역침강물을 워싱 버퍼로 3회 세척하였다. 최종 세척 후, 침전된 단백질-bead 복합체를 LDS 샘플 용액 및 세포 용해 버퍼 30 μl을 첨가하여 열처리로 변성시킨 후 SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis) 및 웨스턴 블롯을 수행하였다. 단백질의 발현 수준을 확인하기 위하여 동일한 세포 용해액으로 웨스턴 블롯을 동시 수행하였다. 면역침강의 washing 용액의 조성은 다음과 같다.

50 mM Tris-Cl (pH 7.4), 150 mM NaCl, 1 mM ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), 1% Nonidet P-40, 0.25% sodium deoxycholate, 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF), 10 μg/ml aprotinin, and 10 μg/ml leupeptin.

그 결과 도 8a에 나타난 바와 같이, HEK 293T에서 각 분자들을 과발현하여 LGALS3BP는 TAK1 단백질 복합체 구성 인자 중 유일하게 TAK1과 단백질 결합 및 상호작용을 하였다.

또한 도 8b에 나타난 바와 같이, 야생형 마우스 및 녹아웃 마우스 유래 MEF를 이용한 면역침강 및 웨스턴 블롯을 통해 LGALS3BP와 TAK1의 내재적 (endogenous) 상호 결합을 재확인하였다.

도 8c에 나타난 바와 같이, 복합체 구성 인자 중 TAB1이 TAK1과 가장 강한 단백질 결합을 하며, 이러한 TAK1-TAB1의 강한 결합 친화력은 LGALS3BP의 과발현으로 현저하게 감소하였다. 뿐만 아니라 LGALS3BP의 과발현은 TAK1과 TAB2 및 TAB3간 단백질 결합을 완벽하게 억제하였다. 동시에 LGALS3BP에 의해 TAK1 단백질 복합체 구성인자의 단백질 발현 수준 또한 감소하였다.

실시예 6-2. HEK 293T에서의 LGALS3BP에 의한 TAK1 인산화의 감소 확인

본 발명자들은 LGALS3BP와 TAK1의 단백질 상호결합 분석 결과를 토대로, LGALS3BP가 TAK1 활성에 미치는 영향을 분석하였다.

HEK 293T를 TAK1 및 다양한 농도의 LGALS3BP 발현 플라스미드로 형질 전환하였다. 형질 전환된 플라스미드의 발현 및 활성 수준을 웨스턴 블롯을 통해 검증하였다. 웨스턴 블롯에 사용한 1차 항체는 hGal-3BP, TAK1, p-TAK1(T184/187), p-TAK1(S412), β-actin에 대한 항체이다.

그 결과 도 9a에 나타난 바와 같이, LGALS3BP는 TAK1의 활성화를 대변하는 TAK1 인산화를 용량 의존적으로 억제하였다. TAK1의 자가인산화 (autophosphorylation) 잔기 T184/187과 활성화 잔기 S412의 인산화 모두 LGALS3BP에 의해 감소되었으며, TAK1의 단백질 수준도 감소하였다.

실시예 6-3. LGALS3BP에 의한 TAK1 키나아제(kinase) 활성 감소 확인

본 발명자들은 LGALS3BP에 의한 TAK1과 TAB1의 단백질 결합 친화력의 감소 및 TAK1의 인산화 감소의 결과를 토대로 TAK1의 키나아제 활성도가 LGALS3BP에 의해 직접적으로 조절되는지 확인하였다.

TAK1의 키나아제 활성은 TAK1-TAB1 Kinase Enzyme System (Promega)을 이용하여 분석하였다. 사람 LGALS3BP 재조합 단백질은 R&D Systems (Minneapolis, MIN, USA)에서 구매하였다.

수포 염기성 단백질(Myelin basic protein, MBP)을 기질로 사용하여 TAK1-TAB1 융합 단백질의 키나아제 활성을 분석한 결과, 도 9b에 나타난 바와 같이, LGALS3BP 재조합 단백질을 첨가함에 따라 용량 의존적으로 TAK1의 키나아제 활성도가 억제되었다. 이는 단백질 분해 시스템이 존재하지 않는 인-비트로의 분석 결과로서, 이 결과는 LGALS3BP가 TAK1과 TAB1의 결합 억제를 통해 TAK1의 효소 활성을 직접적으로 저해함을 의미한다.

실시예 6-4. CHX chase 분석을 통한 LGALS3BP에 의한 TAK1의 안정도 감소 확인

본 발명자들은 LGALS3BP에 의한 TAK1 단백질의 불안정화를 재검증하기 위해 단백질 합성 억제제 시크로헥사미드(cyclohexamide, CHX)를 이용하여 CHX chase 분석을 수행하였다.

HEK 293T를 TAK1 및 벡터 컨트롤 또는 LGALS3BP 발현 플라스미드로 형질 전환하였다. 형질 전환 후 24 시간 후에, 세포를 20 μg/ml CHX로 처리하였다.

그 결과 도 9c에 나타난 바와 같이, TAK1의 단백질 발현 수준이 CHX 처리 후 시간이 지남에 따라 감소하였고, LGALS3BP의 과발현에 의해 현저하게 감소되었다. CHX chase 분석은 이미 합성된 단백질의 반감기(half-life)를 측정하는 것으로서, 이와 같은 결과는 LGALS3BP에 의해 TAK1의 안정도가 감소됨을 의미한다.

실시예 6-5. 유비퀴틴-프로테아좀 억제제 처리를 통한 TAK1의 회복 확인

LGALS3BP에 의한 TAK1의 분해 기전을 분석하고자, 본 발명자들은 유비퀴틴-프로테아좀 억제제(ubiquitine-proteasome inhibitor) MG132를 처리하여 TAK1의 단백질 발현 정도를 확인하였다.

HEK 293T를 TAK1 및 벡터 컨트롤 또는 LGALS3BP 발현 플라스미드로 형질 전환하였다. 형질 전환 후 16 시간이 지난 다음에, 세포를 16 μM MG132로 처리하였다.

그 결과 도 9d에 나타난 바와 같이, LGALS3BP에 의해 감소되었던 TAK1의 단백질 양이 MG132 처리를 통해 복원됨을 확인하였다.

이러한 상기 결과를 종합하여 볼 때 LGALS3BP는 TAK1의 활성화를 다음과 같은 메커니즘으로 억제한다. 첫째, TAK1과 상호작용 파트너 단백질 간 결합 친화력을 줄임으로써 TAK1의 키나아제 활성 억제를 유도한다. 둘째, LGALS3BP가 TAK1 단백질 안정도 자체를 감소시킨다.

실시예 7. 인간배아신장세포 293T 세포에서의 LGALS3BP 단백질 및 단편의 과발현에 의한 TLR4-TAK1-NF-κB 신호전달체계 억제 확인

본 발명자들은 LGALS3BP에 의한 TLR4-TAK1-NF-κB 신호전달체계 억제가 LGALS3BP 단백질 뿐 아니라 단편(domain)에 의해서도 이루어지는지 분석하였다.

보다 구체적으로 TLR4-TAK1-NF-κB 신호전달체계를 구성하는 핵심분자 NF-κB의 과발현에 의해 유도되는 NF-κB 활성이 LGALS3BP 단백질 또는 이의 단편에 의해 억제되는지 분석하였다.

HEK 293T를 vector 컨트롤, NF-κB 또는 LGALS3BP 플라스미드와 함께 NF-κB-루시퍼라아제 리포터 플라스미드로 형질 전환하여 48시간 동안 배양 후, NF-κB 의존적 루시퍼라아제 활성을 분석하였다

그 결과 도 11에 나타난 바와 같이, HEK 293T에서 NF-κB 발현에 의해 NF-κB의 활성이 증가되었으며, 활성화된 NF-κB가 LGALS3BP 단백질의 과발현에 의해 억제됨을 확인하였다. 또한 LGALS3BP 단백질의 단편에 의해서도 NF-κB의 활성이 억제됨을 확인하였다.

고 찰

본 발명은 TAK1의 내인성 억제제 LGALS3BP에 관한 것이다. 그 결과는 도 10에 정리된 바와 같다.

LPS, TNF-α, IL-1β 등 다양한 세포 자극은 공통의 상류 키나아제인 TAK1을 통해 NF-κB 신호 경로를 활성화시킨다.

외부 자극에 의한 TAK1 단백질 복합체의 활성화는 하위 신호전달 분자인 IKKα/β 및 IκB의 인산화로 이어진다. 인산화 된 IκB 단백질은 ubiquitin-proteasome system (UPS)을 통해 분해된다. NF-κB의 상호결합인자인 IκB 단백질의 분해로 NF-κB가 복합체로부터 유리, 인산화 및 활성화된다. 인산화 된 NF-κB는 세포질에서 핵 내로 이동하여 전사인자 작용을 통해 하위 타겟 유전자인 염증성 사이토카인 IL-6, TNF-α 및 IL-1β의 발현을 유도한다.

LGALS3BP는 이 신호전달체계에서 TAK1과의 결합을 통해 1) TAK1과 상호작용 파트너 단백질의 결합 능력을 감소시키며 2) TAK1의 인산화 및 활성화 억제로 키나아제 효소 활성을 억제하며 3) TAK1 단백질의 안정도를 감소시킨다.

또한, LGALS3BP에 의한 TAK1 활성화 저해로 TAK1의 하위 신호전달체계 NF-κB의 활성 또한 억제된다. 그 결과 NF-κB의 하위 타겟 유전자인 염증성 사이토카인의 발현이 감소하게 된다.

본 발명은 TAK1의 내인성 억제제로서의 LGALS3BP의 기능 및 기전에 관한 것으로 이는 TAK1 조절 장애 및 과활성화에 기인한 다양한 질병의 새로운 치료 방법 및 병태생리학적 정보를 제공하는데 이용할 수 있을 것이다.

<110> INDUSTRY FOUNDATION OF CHONNAM NATIONAL UNIVERSITY <120> Endogenous Inhibitor LGALS3BP of Transforming Growth Factor-beta-activated Kinase 1 and Uses thereof <130> PN190294 <160> 47 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 585 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human LGALS3BP <400> 1 Met Thr Pro Pro Arg Leu Phe Trp Val Trp Leu Leu Val Ala Gly Thr 1 5 10 15 Gln Gly Val Asn Asp Gly Asp Met Arg Leu Ala Asp Gly Gly Ala Thr 20 25 30 Asn Gln Gly Arg Val Glu Ile Phe Tyr Arg Gly Gln Trp Gly Thr Val 35 40 45 Cys Asp Asn Leu Trp Asp Leu Thr Asp Ala Ser Val Val Cys Arg Ala 50 55 60 Leu Gly Phe Glu Asn Ala Thr Gln Ala Leu Gly Arg Ala Ala Phe Gly 65 70 75 80 Gln Gly Ser Gly Pro Ile Met Leu Asp Glu Val Gln Cys Thr Gly Thr 85 90 95 Glu Ala Ser Leu Ala Asp Cys Lys Ser Leu Gly Trp Leu Lys Ser Asn 100 105 110 Cys Arg His Glu Arg Asp Ala Gly Val Val Cys Thr Asn Glu Thr Arg 115 120 125 Ser Thr His Thr Leu Asp Leu Ser Arg Glu Leu Ser Glu Ala Leu Gly 130 135 140 Gln Ile Phe Asp Ser Gln Arg Gly Cys Asp Leu Ser Ile Ser Val Asn 145 150 155 160 Val Gln Gly Glu Asp Ala Leu Gly Phe Cys Gly His Thr Val Ile Leu 165 170 175 Thr Ala Asn Leu Glu Ala Gln Ala Leu Trp Lys Glu Pro Gly Ser Asn 180 185 190 Val Thr Met Ser Val Asp Ala Glu Cys Val Pro Met Val Arg Asp Leu 195 200 205 Leu Arg Tyr Phe Tyr Ser Arg Arg Ile Asp Ile Thr Leu Ser Ser Val 210 215 220 Lys Cys Phe His Lys Leu Ala Ser Ala Tyr Gly Ala Arg Gln Leu Gln 225 230 235 240 Gly Tyr Cys Ala Ser Leu Phe Ala Ile Leu Leu Pro Gln Asp Pro Ser 245 250 255 Phe Gln Met Pro Leu Asp Leu Tyr Ala Tyr Ala Val Ala Thr Gly Asp 260 265 270 Ala Leu Leu Glu Lys Leu Cys Leu Gln Phe Leu Ala Trp Asn Phe Glu 275 280 285 Ala Leu Thr Gln Ala Glu Ala Trp Pro Ser Val Pro Thr Asp Leu Leu 290 295 300 Gln Leu Leu Leu Pro Arg Ser Asp Leu Ala Val Pro Ser Glu Leu Ala 305 310 315 320 Leu Leu Lys Ala Val Asp Thr Trp Ser Trp Gly Glu Arg Ala Ser His 325 330 335 Glu Glu Val Glu Gly Leu Val Glu Lys Ile Arg Phe Pro Met Met Leu 340 345 350 Pro Glu Glu Leu Phe Glu Leu Gln Phe Asn Leu Ser Leu Tyr Trp Ser 355 360 365 His Glu Ala Leu Phe Gln Lys Lys Thr Leu Gln Ala Leu Glu Phe His 370 375 380 Thr Val Pro Phe Gln Leu Leu Ala Arg Tyr Lys Gly Leu Asn Leu Thr 385 390 395 400 Glu Asp Thr Tyr Lys Pro Arg Ile Tyr Thr Ser Pro Thr Trp Ser Ala 405 410 415 Phe Val Thr Asp Ser Ser Trp Ser Ala Arg Lys Ser Gln Leu Val Tyr 420 425 430 Gln Ser Arg Arg Gly Pro Leu Val Lys Tyr Ser Ser Asp Tyr Phe Gln 435 440 445 Ala Pro Ser Asp Tyr Arg Tyr Tyr Pro Tyr Gln Ser Phe Gln Thr Pro 450 455 460 Gln His Pro Ser Phe Leu Phe Gln Asp Lys Arg Val Ser Trp Ser Leu 465 470 475 480 Val Tyr Leu Pro Thr Ile Gln Ser Cys Trp Asn Tyr Gly Phe Ser Cys 485 490 495 Ser Ser Asp Glu Leu Pro Val Leu Gly Leu Thr Lys Ser Gly Gly Ser 500 505 510 Asp Arg Thr Ile Ala Tyr Glu Asn Lys Ala Leu Met Leu Cys Glu Gly 515 520 525 Leu Phe Val Ala Asp Val Thr Asp Phe Glu Gly Trp Lys Ala Ala Ile 530 535 540 Pro Ser Ala Leu Asp Thr Asn Ser Ser Lys Ser Thr Ser Ser Phe Pro 545 550 555 560 Cys Pro Ala Gly His Phe Asn Gly 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Claims

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서열번호 1의 아미노산 서열 중 23 내지 127번째의 아미노산 서열로 이루어진 LGALS3BP 단백질 단편, 서열번호 1의 아미노산 서열 중 23 내지 127번째의 아미노산 서열로 이루어진 LGALS3BP 단백질 단편을 코딩하는 유전자, 서열번호 1의 아미노산 서열 중 23 내지 127번째의 아미노산 서열로 이루어진 LGALS3BP 단백질 단편을 코딩하는 유전자를 포함하는 벡터, 서열번호 1의 아미노산 서열 중 23 내지 127번째의 아미노산 서열로 이루어진 LGALS3BP 단백질 단편을 코딩하는 유전자를 포함하는 벡터로 형질 전환된 숙주세포,
서열번호 1의 아미노산 서열 중 127 내지 251번째의 아미노산 서열로 이루어진 LGALS3BP 단백질 단편, 서열번호 1의 아미노산 서열 중 127 내지 251번째의 아미노산 서열로 이루어진 LGALS3BP 단백질 단편을 코딩하는 유전자, 서열번호 1의 아미노산 서열 중 127 내지 251번째의 아미노산 서열로 이루어진 LGALS3BP 단백질 단편을 코딩하는 유전자를 포함하는 벡터, 서열번호 1의 아미노산 서열 중 127 내지 251번째의 아미노산 서열로 이루어진 LGALS3BP 단백질 단편을 코딩하는 유전자를 포함하는 벡터로 형질 전환된 숙주세포,
서열번호 1의 아미노산 서열 중 409 내지 585번째의 아미노산 서열로 이루어진 LGALS3BP 단백질 단편, 서열번호 1의 아미노산 서열 중 409 내지 585번째의 아미노산 서열로 이루어진 LGALS3BP 단백질 단편을 코딩하는 유전자, 서열번호 1의 아미노산 서열 중 409 내지 585번째의 아미노산 서열로 이루어진 LGALS3BP 단백질 단편을 코딩하는 유전자를 포함하는 벡터, 및 서열번호 1의 아미노산 서열 중 409 내지 585번째의 아미노산 서열로 이루어진 LGALS3BP 단백질 단편을 코딩하는 유전자를 포함하는 벡터로 형질 전환된 숙주세포
로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 또는 자가면역 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
제 6 항에 있어서, 상기 염증성 질환은 골관절염, 인슐린 저항성 지방간, 비알코올성 지방간, 간염, 각막염, 위염, 장염, 신장염, 결핵, 기관지염, 흉막염, 복막염, 척추염, 췌장염, 염증성 통증, 요도염, 방광염, 염증성 동맥경화증, 패혈증, 피부염, 치주염 및 치은염으로 이루어지는 군에서 선택되는 것인, 염증성 질환 또는 자가면역 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
제 6 항에 있어서, 상기 자가면역 질환은 그레이브스 병, 하시모토 갑상선염, 천식, 류마티스 관절염, 전신성 홍반성 루푸스, 패혈증성 쇼크, 알러지성 천식, 알러지성 비염, 아토피성 피부염, 궤양성 대장염, I형 당뇨병, 건선, 다발성근염, 피부근염, 쇼그렌증후군, 다발성경화증, 크론병, 만성 갑상선염, 중증근무력증, 심상성천포창, 및 자가면역성 동맥경화증으로 이루어지는 군에서 선택되는 것인, 염증성 질환 또는 자가면역 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
LPS 처리를 통해, 염증 활성이 유도된 세포를, 제 6 항에 따른 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는, 시험관 내(in vitro) 세포의 염증성 사이토카인 발현 억제 방법.
제 9 항에 있어서, 상기 염증성 사이토카인은 IL-6, TNF-α, 또는 IL-1β 인, 시험관 내(in vitro) 세포의 염증성 사이토카인 발현 억제 방법.
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