KR102392774B1 - Rt-pcr composition for detecting feline coronavirus - Google Patents
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Abstract
본 발명은 고양이 코로나바이러스 검출을 위한 RT-PCR용 조성물 및 고양이 코로나바이러스 검출방법에 관한 것으로, 구체적으로 RT-PCR을 통하여 전염성 복막염-유발 코로나 바이러스 및 위장관염-유발 코로나 바이러스를 구별할 수 있는 RT-PCR 조성물 및 이를 이용하여 고양이 코로나바이러스를 검출하는 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a composition for RT-PCR for detecting feline coronavirus and a method for detecting feline coronavirus. Specifically, RT capable of distinguishing infectious peritonitis-causing coronavirus and gastroenteritis-causing coronavirus through RT-PCR. - It relates to a PCR composition and a method for detecting feline coronavirus using the same.
Description
본 발명은 고양이 코로나바이러스 검출을 위한 RT-PCR용 조성물 및 고양이 코로나바이러스 검출방법에 관한 것으로, 구체적으로 RT-PCR을 통하여 전염성 복막염-유발 코로나 바이러스 및 위장관염-유발 코로나 바이러스를 구별할 수 있는 RT-PCR 조성물 및 이를 이용하여 고양이 코로나바이러스를 검출하는 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a composition for RT-PCR for detecting feline coronavirus and a method for detecting feline coronavirus. Specifically, RT capable of distinguishing infectious peritonitis-causing coronavirus and gastroenteritis-causing coronavirus through RT-PCR. - It relates to a PCR composition and a method for detecting feline coronavirus using the same.
고양이 코로나바이러스는 위장관염의 주요한 원인바이러스로 알려져 있으며 특히 만성감염으로 진행하여 장내에 증식하다가 변이된 코로나바이러스에 의해 바이러스의 조직친화성이 변화하여 장 이외의 조직으로 이동하여 육아종성 염증을 일으켜 고양이에 매우 치명적인 고양이 전염성 복막염을 유발하는 것으로 알려져 있다.Feline coronavirus is known as a major causative virus of gastroenteritis, and in particular, it progresses to chronic infection and proliferates in the intestine. It is known to cause very fatal feline infectious peritonitis.
이들에 대한 발생빈도를 살펴보면 고양이 코로나바이러스에 노출된 고양이 중 대부분 (약 80% 이상)에서 급성으로 감염되고 이 중 약 20%가 만성으로 진행하여 간헐적으로 코로나바이러스를 분변중에 배설하고 이 중 약 10% 정도가 즉 전체 고양이 중 약 1-3%가 전염성복막염(FIP)로 진행되는 것으로 알려져 있다.Looking at the frequency of these occurrences, most of the cats exposed to the feline coronavirus are acutely infected (more than about 80%), and about 20% of them progress to chronicity, intermittently excreting the coronavirus in feces, and about 10 of them It is known that approximately 1-3% of all cats will progress to infectious peritonitis (FIP).
고양이 코로나바이러스는 장 코로나바이러스로부터 변이된 코로나바이러스에 의해 체내 실질장기에서 만성염증이 발생하고 이로 인해 매우 치명적인 전염성 복막염까지 진행되는 것으로 알려져 있어 국내 유행하는 고양이 코로나바이러스의 진단 및 분석 (1형, 2형 코로나바이러스 및 전염성 복막염 바이러스 등으로)은 전염성 복막염으로 인한 반려묘의 치명적인 임상경과를 최소화하기 위한 가장 중요한 핵심분야이다.Feline coronavirus is known to cause chronic inflammation in parenchymal organs by a coronavirus mutated from intestinal coronavirus, which leads to very fatal infectious peritonitis. type coronavirus and infectious peritonitis virus) are the most important key areas to minimize the fatal clinical course of cats due to infectious peritonitis.
코로나바이러스 양성시료를 대상으로 한 추적검사에서도 약 30% 이상의 케이스에서 고양이 코로나바이러스가 수개월 이상 만성적으로 감염되어 있는 것으로 확인되었고 FIP 의심사례 중 복수, 흉수 또는 복강내 매스 등의 다양한 장조직 이외의 검체에서 코로나바이러스 검출되어 FIP가 반려묘의 감염질환 중 가장 위협적인 감염병이라는 상황을 확인할 수 있었다.In follow-up tests for coronavirus positive samples, it was confirmed that feline coronavirus was chronically infected for more than several months in more than 30% of cases. It was possible to confirm the situation that FIP is the most threatening infectious disease among infectious diseases in cats.
고양이 전염성 복막염 (Feline Infectious Peritonitis; FIP)은 고양이에서 사형선고와 같은 질병으로 FIP 진단을 받게 되면 거의 치료를 포기하는 임상적인 예후가 매우 좋지 않은 질환군이다.Feline Infectious Peritonitis (FIP) is a disease with a very poor clinical prognosis that almost gives up treatment when FIP is diagnosed as a disease such as death sentence in cats.
현재까지 알려진 바에 의하면 FIP는 고양이가 장코로나바이러스에 감염된 후 만성으로 감염이 경과하고 이러한 경과중 장코로나바이러스가 항체와 결합하여 백혈구에 탐식되고 백혈구에 탐식된 코로나바이러스가 유전자의 변이를 일으켜 장에서 증식하는 바이러스의 조직친화성이 다른 실질장기에서 증식이 가능한 형태로 조직의 친화성(Tropism)이 변화하여 발생한다. According to what is known so far, FIP is chronically infected after a cat is infected with intestinal coronavirus, and during this process, the intestinal coronavirus binds to antibodies and is engulfed by white blood cells, and the coronavirus phagocytosed on white blood cells causes gene mutations in the intestine. It is caused by a change in the affinity (Tropism) of the tissue to a form capable of propagation in a parenchymal organ with a different tissue affinity of the proliferating virus.
FIP로 질병이 진전되면 다양한 실질장기에서 대식세포, 다핵의 호중구 등이 염증에 관여하여 화농을 동반한 육아종성 염증을 일으키면서 복강이나 흉강 내에 체액이 저류되거나 (wet form FIP) 신장, 임파절, 뇌, 간장 등 실질장기에 매스를 형성하지만 체액의 저류를 관찰할 수 없는 형태의 dry form의 FIP로 진전되게 되는데 이러한 경우 치료가 어려워 치사율이 거의 100%에 이르는 것으로 보고되어 있다. When the disease progresses with FIP, macrophages and multinucleated neutrophils in various parenchymal organs are involved in inflammation, causing granulomatous inflammation accompanied by suppuration, and fluid is stored in the abdominal or chest cavity (wet form FIP) or kidney, lymph node, brain Although it forms mass in parenchymal organs such as liver and liver, it progresses to dry form FIP in which no retention of body fluid can be observed.
이러한 FIP의 임상적인 중요성이 높은 이유로 FIP로 진전된 이후에는 적절한 치료를 수행하기 곤란하므로 장코로나바이러스의 감염을 원천적으로 예방하거나 만성감염시 바이러스의 지속적인 증식을 억제해주는 것이 FIP로 진행되는 중간의 과정을 차단하는 좋은 수단으로서 작용할 수 있다.Because of the high clinical importance of FIP, it is difficult to perform appropriate treatment after it has progressed to FIP. It can act as a good means of blocking
본 발명자는 효율성이 향상된 새로운 프라이머를 디자인하고 이를 이용한 RT-PCR, 바람직하게는 실시간 RT-PCR을 수행함으로써 고양이 코로나바이러스를 검출하는 방법을 개발하였으며, 본 발명은 전염성 복막염-유발 코로나 바이러스 및 위장관염-유발 코로나 바이러스를 구별할 수 있는 기술적 특징을 갖는다.The present inventors have developed a method for detecting feline coronavirus by designing a new primer with improved efficiency and performing RT-PCR, preferably real-time RT-PCR using the same, and the present invention relates to infectious peritonitis-causing coronavirus and gastroenteritis -Has technical characteristics that can distinguish the causative coronavirus.
상기 기술적 과제를 해결하고자, 본 발명은 1) 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 프라이머 세트; 및 2) 서열번호 3 및 서열번호 4의 염기서열로 표시되는 프라이머 세트를 포함하고, 전염성 복막염-유발 코로나 바이러스인 경우 1) 프라이머 세트를 이용한 RT-PCR에 의하여 유전자 증폭이 일어나고, 2) 프라이머 세트를 이용한 RT-PCR에 의하여 유전자 증폭이 일어나지 않고, 위장관염-유발 코로나 바이러스인 경우 1) 프라이머 세트 및 2) 프라이머 세트를 이용한 RT-PCR에 의하여 모두 유전자 증폭이 일어나는 것을 특징으로 하는, 고양이 코로나바이러스 검출을 위한 RT-PCR(reverse transcript-polymerase chain reaction)용 조성물을 제공한다;In order to solve the above technical problem, the present invention is 1) a primer set represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2; and 2) a primer set represented by the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4, and in the case of an infectious peritonitis-inducing coronavirus 1) gene amplification occurs by RT-PCR using a primer set, 2) a primer set Cat coronavirus, characterized in that gene amplification does not occur by RT-PCR using To provide a composition for RT-PCR (reverse transcript-polymerase chain reaction) for detection;
[서열번호 1][SEQ ID NO: 1]
5′-ATCCATATGGTTCTGGCATGG-35'-ATCCATATGGTTCTGGCATGG-3
[서열번호 2][SEQ ID NO: 2]
5′-TTTAGCYGTACTATAATCATTGAGCA-3′5'-TTTAGCYGTACTATAATCATTGAGCA-3'
[서열번호 3][SEQ ID NO: 3]
5′-CCCACAATGACTCAAATGAA-3′5'-CCCACAATGACTCAAATGAA-3'
[서열번호 4][SEQ ID NO: 4]
5′-TCTGGTTCYACCCAACACTT-3′.5′-TCTGGTTCYACCCAACACTT-3′.
본 발명의 또 다른 실시예에서, 3) 서열번호 5 및 서열번호 6의 염기서열로 표시되는 프라이머 세트; 및 4) 서열번호 7 및 서열번호 8의 염기서열로 표시되는 프라이머 세트를 추가로 포함하고, 전염성 복막염-유발 코로나 바이러스인 경우 3) 프라이머 세트를 이용한 RT-PCR에 의하여 유전자 증폭이 일어나고, 4) 프라이머 세트를 이용한 RT-PCR에 의하여 유전자 증폭이 일어나지 않고, 위장관염-유발 코로나 바이러스인 경우 3) 프라이머 세트 및 4) 프라이머 세트를 이용한 RT-PCR에 의하여 모두 유전자 증폭이 일어나는 것을 특징으로 하는, 고양이 코로나바이러스 검출을 위한 RT-PCR(reverse transcript-polymerase chain reaction)용 조성물을 제공한다;In another embodiment of the present invention, 3) a primer set represented by the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6; And 4) further comprising a primer set represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8, in the case of infectious peritonitis-inducing coronavirus 3) gene amplification occurs by RT-PCR using the primer set, 4) Cat, characterized in that gene amplification does not occur by RT-PCR using a primer set, and gene amplification occurs by RT-PCR using 3) a primer set and 4) a primer set in case of gastroenteritis-inducing coronavirus To provide a composition for RT-PCR (reverse transcript-polymerase chain reaction) for detecting coronavirus;
[서열번호 5][SEQ ID NO: 5]
5′-TCTGTKGCCATCAAAATCAC-3′5'-TCTGTKGCCATCAAAATCAC-3'
[서열번호 6][SEQ ID NO: 6]
5′-CATTAACATCHACCATTACATCTG-3′5'-CATTAACATCHACCATTACATCTG-3'
[서열번호 7][SEQ ID NO: 7]
5′-GCGGTTMTAAACGAAATTGA-3′5'-GCGGTTMTAAACGAAATTGA-3'
[서열번호 8][SEQ ID NO: 8]
5′-TGAGTAATCACCRGCTTTAGATTT-3′.5′-TGAGTAATCACCRGCTTTAGATTT-3′.
상기 1) 프라이머 세트는 고양이 코로나바이러스 NSP3 유전자를 증폭시키고, 상기 2) 프라이머 세트는 고양이 코로나바이러스 NSP12 유전자를 증폭시키는 것을 특징으로 한다. The 1) primer set amplifies the cat coronavirus NSP3 gene, and the 2) primer set amplifies the cat coronavirus NSP12 gene.
상기 3) 프라이머 세트는 고양이 코로나바이러스 스파이크(Spike) 유전자를 증폭시키고, 상기 4) 프라이머 세트는 고양이 코로나바이러스 멤브레인(Membrane) 유전자를 증폭시키는 것을 특징으로 한다. The 3) primer set amplifies the cat coronavirus spike gene, and the 4) primer set amplifies the cat coronavirus membrane gene.
본 발명의 또 다른 실시예에서, 상기 조성물을 포함하고, 전염성 복막염-유발 코로나 바이러스와 위장관염-유발 코로나 바이러스를 구별할 수 있는 것을 특징으로 하는 고양이 코로나바이러스 검출용 키트를 제공한다. In another embodiment of the present invention, it provides a kit for detecting feline coronavirus, comprising the composition, and capable of distinguishing an infectious peritonitis-causing coronavirus and a gastroenteritis-causing coronavirus.
상기 검출용 키트는 반응 완충액, DNA 중합효소 및 역전사효소를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. The detection kit may include a reaction buffer, a DNA polymerase, and a reverse transcriptase, but is not limited thereto.
본 발명의 또 다른 실시 예에서, 1) 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 프라이머 세트를 이용하여 RT-PCR(reverse transcript-polymerase chain reaction)을 수행하는 단계; 및 2) 서열번호 3 및 서열번호 4의 염기서열로 표시되는 프라이머 세트를 이용하여 RT-PCR(reverse transcript-polymerase chain reaction)을 수행하는 단계를 포함하고, 상기 각 단계의 RT-PCR 결과에 의하여 전염성 복막염-유발 코로나 바이러스와 위장관염-유발 코로나 바이러스를 구별할 수 있는 것을 특징으로 하는 고양이 코로나바이러스 검출방법을 제공한다;In another embodiment of the present invention, 1) performing RT-PCR (reverse transcript-polymerase chain reaction) using the primer set represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2; and 2) performing RT-PCR (reverse transcript-polymerase chain reaction) using the primer sets represented by the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4, and according to the RT-PCR result of each step To provide a method for detecting a feline coronavirus, characterized in that it is capable of distinguishing an infectious peritonitis-causing coronavirus and a gastroenteritis-causing coronavirus;
[서열번호 1][SEQ ID NO: 1]
5′-ATCCATATGGTTCTGGCATGG-35'-ATCCATATGGTTCTGGCATGG-3
[서열번호 2][SEQ ID NO: 2]
5′-TTTAGCYGTACTATAATCATTGAGCA-3′5'-TTTAGCYGTACTATAATCATTGAGCA-3'
[서열번호 3][SEQ ID NO: 3]
5′-CCCACAATGACTCAAATGAA-3′5'-CCCACAATGACTCAAATGAA-3'
[서열번호 4][SEQ ID NO: 4]
5′-TCTGGTTCYACCCAACACTT-3′.5′-TCTGGTTCYACCCAACACTT-3′.
여기서 전염성 복막염-유발 코로나 바이러스인 경우 1) 단계의 RT-PCR에 의하여 유전자 증폭이 일어나고, 2) 단계의 RT-PCR에 의하여 유전자 증폭이 일어나지 않고, 위장관염-유발 코로나 바이러스인 경우 1) 단계 및 2) 단계의 RT-PCR에 의하여 모두 유전자 증폭이 일어나는 것을 특징으로 한다. Here, in the case of infectious peritonitis-causing coronavirus, gene amplification occurs by RT-PCR in step 1), and gene amplification does not occur by RT-PCR in step 2), in case of gastroenteritis-causing coronavirus, step 1) and It is characterized in that all genes are amplified by the RT-PCR of step 2).
본 발명의 또 다른 실시 예에서, 3) 서열번호 5 및 서열번호 6의 염기서열로 표시되는 프라이머 세트를 이용하여 RT-PCR(reverse transcript-polymerase chain reaction)을 수행하는 단계; 및 4) 서열번호 7 및 서열번호 8의 염기서열로 표시되는 프라이머 세트를 이용하여 RT-PCR(reverse transcript-polymerase chain reaction)을 수행하는 단계를 포함하고, 상기 각 단계의 RT-PCR 결과에 의하여 전염성 복막염-유발 코로나 바이러스와 위장관염-유발 코로나 바이러스를 구별할 수 있는 것을 특징으로 하는 고양이 코로나바이러스 검출방법을 제공한다;In another embodiment of the present invention, 3) performing RT-PCR (reverse transcript-polymerase chain reaction) using the primer set represented by the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6; and 4) performing RT-PCR (reverse transcript-polymerase chain reaction) using the primer set represented by the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8, and by the RT-PCR result of each step To provide a method for detecting a feline coronavirus, characterized in that it is capable of distinguishing an infectious peritonitis-causing coronavirus and a gastroenteritis-causing coronavirus;
[서열번호 5][SEQ ID NO: 5]
5′-TCTGTKGCCATCAAAATCAC-3′5'-TCTGTKGCCATCAAAATCAC-3'
[서열번호 6][SEQ ID NO: 6]
5′-CATTAACATCHACCATTACATCTG-3′5'-CATTAACATCHACCATTACATCTG-3'
[서열번호 7][SEQ ID NO: 7]
5′-GCGGTTMTAAACGAAATTGA-3′5'-GCGGTTMTAAACGAAATTGA-3'
[서열번호 8][SEQ ID NO: 8]
5′-TGAGTAATCACCRGCTTTAGATTT-3′.5′-TGAGTAATCACCRGCTTTAGATTT-3′.
여기서 전염성 복막염-유발 코로나 바이러스인 경우 3) 단계의 RT-PCR에 의하여 유전자 증폭이 일어나고, 4) 단계의 RT-PCR에 의하여 유전자 증폭이 일어나지 않고, 위장관염-유발 코로나 바이러스인 경우 3) 단계 및 4) 단계의 RT-PCR에 의하여 모두 유전자 증폭이 일어나는 것을 특징으로 한다. Here, in case of infectious peritonitis-causing coronavirus, gene amplification occurs by RT-PCR in step 3), gene amplification does not occur by RT-PCR in step 4), and in case of gastroenteritis-causing coronavirus, step 3) and It is characterized in that all genes are amplified by the RT-PCR of step 4).
본 발명에서 '프라이머'는 짧은 자유 3 말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 핵산의 주형 (template)과 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 핵산 주형의 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 상기 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 폴리머레이즈 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재 하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다.In the present invention, a 'primer' is a nucleic acid sequence having a short free 3' hydroxyl group, which can form a base pair with a template of a complementary nucleic acid and is used for strand copying of the nucleic acid template. It refers to a short nucleic acid sequence that serves as a starting point. The primer is capable of initiating DNA synthesis in the presence of four different nucleoside triphosphates and reagents for polymerization (ie, DNA polymerase or reverse transcriptase) in an appropriate buffer and temperature.
본 발명에서 'RT-PCR (reverse transcript-polymerase chain reaction) 조성물'은 고양이 코로나바이러스 유전형을 검출하기 위한 조성물로, 상기 조성물에는 본 발명에서 설계한 프라이머 이외에 역전사 반응과 중합반응을 수행하기 위한 당업계에 공지된 DNA 중합효소, 역전사효소, dNTP 및 반응 완충액을 포함할 수 있다. 나아가 필요한 경우 DNase, RNase 억제제, DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수도 있다.In the present invention, the 'RT-PCR (reverse transcript-polymerase chain reaction) composition' is a composition for detecting the cat coronavirus genotype, and the composition includes a primer designed in the present invention for performing a reverse transcription reaction and a polymerization reaction. DNA polymerases, reverse transcriptases, dNTPs and reaction buffers known to may be included. Furthermore, if necessary, DNase, RNase inhibitor, DEPC-water, sterile water, etc. may be included.
본 발명에서 'RT-PCR 키트'는 상기 RT-PCR 조성물을 동결 건조된 형태로 플라스틱 튜브에 담아 제조될 수 있으며, 상기 키트는 RT-PCR 조성물 외에, 분석에 사용되는 적절한 시약 및 도구를 더 포함할 수 있으며, 이러한 시약 및 도구로는 적합한 담체, 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지, 용해제, 세정제 등이 포함된다. In the present invention, the 'RT-PCR kit' may be prepared by putting the RT-PCR composition in a freeze-dried form in a plastic tube, and the kit further includes appropriate reagents and tools used for analysis in addition to the RT-PCR composition. and such reagents and tools include suitable carriers, labels capable of generating a detectable signal, solubilizing agents, detergents, and the like.
상기 적합한 담체로는, 이에 한정되지는 않으나, 가용성 담체, 예를 들어 당 분야에 공지된 생리학적으로 허용되는 완충액, 예를 들어 PBS, 불용성 담체, 예를 들어 폴리스틸렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리에스테르, 폴리아크릴로니트릴, 불소 수지, 가교 덱스트란, 폴리사카라이드, 라텍스에 금속을 도금한 자성 미립자와 같은 고분자, 기타 종이, 유리, 금속, 아가로스 및 이들의 조합일 수 있다.Suitable carriers include, but are not limited to, soluble carriers such as physiologically acceptable buffers known in the art such as PBS, insoluble carriers such as polystyrene, polyethylene, polypropylene, polyester , polyacrylonitrile, fluororesin, crosslinked dextran, polysaccharide, polymer such as magnetic fine particles plated with metal in latex, other paper, glass, metal, agarose, and combinations thereof.
상기 RT-PCR은 생물 시료로부터 RNA를 수득하는 단계를 더 포함할 수 있으며, 상기 생물시료는 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇌척수액 또는 분뇨와 같은 시료 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. The RT-PCR may further include the step of obtaining RNA from a biological sample, wherein the biological sample includes a sample such as tissue, cells, whole blood, serum, plasma, saliva, sputum, cerebrospinal fluid or manure. not limited
상기 생물시료로부터 RNA를 수득하기 위해 통상적으로 당업자들이 사용하는 RNA 추출키트를 사용할 수 있다.In order to obtain RNA from the biological sample, an RNA extraction kit commonly used by those skilled in the art can be used.
본 발명에서 RT-PCR 수행시 반응 온도 및 시간은 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 역전사 반응을 40 내지 50℃에서 5분 내지 15분, 90 내지 100℃ 5분 내지 15분으로 수행하고 PCR 반응은 90 내지 100℃에서 10 내지 20초, 50 내지 70℃에서 40초 내지 80초일 수 있으며, 상기 PCR 반응은 20 내지 50회 반복 수행할 수 있다.In the present invention, when performing RT-PCR, the reaction temperature and time are not limited thereto, but preferably the reverse transcription reaction is performed at 40 to 50° C. for 5 to 15 minutes, 90 to 100° C. for 5 to 15 minutes, and the PCR reaction is 90 It may be 10 to 20 seconds at 100 ° C., 40 seconds to 80 seconds at 50 to 70 ° C., and the PCR reaction may be repeated 20 to 50 times.
상기 증폭산물의 검출은 통상적인 실시간 RT-PCR 방법 및 장치를 사용하여 수행할 수 있다. 상기 실시간 PCR 방법은 DNA 중합효소와 형광공명 에너지이동(Fluorescence Resonance Energy Transfer, FRET)의 원리에 의해 PCR의 매 주기마다 실시간으로 시행되는 형광을 검출하고 정량하는 방법이다. 이러한 방법은 특이적인 증폭산물을 비 특이적인 증폭산물로부터 구별하여 확인할 수 있으며, 자동화된 양상으로 분석 결과를 쉽게 입수할 수 있다.The detection of the amplification product may be performed using a conventional real-time RT-PCR method and apparatus. The real-time PCR method is a method for detecting and quantifying fluorescence performed in real time every cycle of PCR by the principle of DNA polymerase and fluorescence resonance energy transfer (FRET). In this method, specific amplification products can be identified by distinguishing them from non-specific amplification products, and analysis results can be easily obtained in an automated manner.
본 발명의 고양이 코로나바이러스 검출용 조성물은 고양이 코로나바이러스에만 특이적으로 반응하며, 고양이 코로나바이러스 검출뿐만 아니라 전염성 복막염-유발 코로나 바이러스와 위장관염-유발 코로나 바이러스를 동시에 구별할 수 있는 특징을 갖는다.The composition for detecting feline coronavirus of the present invention reacts specifically to feline coronavirus, and has a feature that can detect feline coronavirus as well as distinguish infectious peritonitis-causing coronavirus and gastroenteritis-causing coronavirus at the same time.
도 1은 고양이 코로나바이러스 양성시료에 대한 바이러스 검출역가의 차이를 나타내는 그래프이다(장코로나바이러스 vs FIP).1 is a graph showing the difference in virus detection titers for cat coronavirus positive samples (enteric coronavirus vs FIP).
이하, 실시예를 통해 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다. 그러나 이들 예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐 어떠한 의미로든 본 발명의 범위가 이들 예로 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail through examples. However, these examples are only for helping the understanding of the present invention, and the scope of the present invention is not limited to these examples in any sense.
실시예Example
1. 코로나바이러스 양성시료 확보1. Securing coronavirus positive samples
팝애니랩에 검사의뢰되는 다양한 검체 중 고양이 위장관염 검체(분변) 및 FIP 의심검체를 대상으로 (주)포스트바이오에서 제공되는 고양이 코로나바이러스 특이 프로브를 사용한 real time RT-qPCR 진단키트를 이용하여 코로나바이러스의 존재여부 및 바이러스의 양을 정량하였다. Among the various samples requested to be tested by POPANYLab, the real-time RT-qPCR diagnostic kit using the cat coronavirus-specific probe provided by Postbio for cat gastroenteritis samples (feces) and samples suspected of FIP The presence of virus and the amount of virus were quantified.
2018년 1월 1일부터 11월 30일까지 포스트바이오에서 운영중인 반려동물 수탁검사 서비스(팝애니랩)로 의뢰된 고양이 검체 중 위장관염 검사로 의뢰된 642건의 분변검체에 대해서 고양이 코로나바이러스의 존재여부를 확인하였으며 검사결과 642건 중 316건에서 고양이 코로나바이러스가 검출되었으며 검출된 코로나바이러스의 검출결과의 Ct의 평균값은 27.71로 확인되었다. Presence of cat coronavirus in 642 fecal samples requested for gastroenteritis test among cat samples requested to the companion animal consignment test service (Pop Any Lab) operated by Postbio from January 1 to November 30, 2018 As a result, feline coronavirus was detected in 316 out of 642 cases, and the average Ct value of the detection results of the detected coronavirus was confirmed to be 27.71.
고양이 코로나바이러스 감염이 확인된 316건에 대한 분석결과 316건 중 81건(25.6%)은 고양이 코로나바이러스 단독감염으로 확인되었고 고양이 코로나바이러스 감염과 함께 고양이에서 위장관염을 유발할 수 있는 세균, 바이러스, 원충 등 18종의 추가 감염병 병원체에 대해 혼합감염된 사례는 235건으로 약 74.4%를 차지하였다. As a result of analysis of 316 confirmed cases of feline coronavirus infection, 81 cases (25.6%) of 316 cases (25.6%) were confirmed as a single infection with feline coronavirus, and bacteria, viruses, and protozoa that can cause gastroenteritis in cats together with feline coronavirus infection There were 235 cases of mixed infection with 18 additional infectious disease pathogens, including about 74.4%.
2018년 1월부터 11월 사이 위장관염 의뢰사례 중 장코로나바이러스 검출된 검체의 수량 및 양성률을 비교분석한 결과 일반적으로 바이러스성 질환이 겨울에 유행하고 세균성 질환이 여름에 유행하는 양상과는 다르게 양성률이 높은 시기는 약 56%, 양성률이 낮은 시기는 42.3%로 시기별로 약간의 차이는 있으나 연중 발생률이 매우 높고 시기에 따른 감염률의 차이는 없는 것으로 확인되었다. As a result of comparative analysis of the quantity and positive rate of intestinal corona virus detected samples among gastroenteritis request cases between January and November 2018, the positive rate is different from the pattern in which viral diseases are prevalent in winter and bacterial diseases in summer. The high period was about 56% and the low positive rate was 42.3%. Although there were some differences by period, it was confirmed that the annual incidence rate was very high and there was no difference in the infection rate according to the period.
2018년 1월 1일부터 11월 30일까지 포스트바이오에서 운영 중인 반려동물 수탁검사 서비스(팝애니랩)로 의뢰된 고양이 검체 중 고양이 전염성 복막염 (Feline Infectious Peritonitis; FIP) 검사로 의뢰된 43건의 체액(복수 또는 흉수 등)에 고양이 코로나바이러스의 존재여부를 확인하였으며 검사결과 43건의 검체 중 14건에서 고양이 코로나바이러스가 검출되었으며 검출된 코로나바이러스의 검출결과의 Ct의 평균값은 32.68로 확인되었다. From January 1 to November 30, 2018, 43 bodily fluids requested for Feline Infectious Peritonitis (FIP) test among cat samples requested to the companion animal consignment inspection service (Pop Any Lab) operated by Postbio The presence of feline coronavirus was confirmed in (ascites or pleural effusion, etc.), and as a result of the test, feline coronavirus was detected in 14 of 43 samples, and the average Ct value of the detection results of the detected coronavirus was confirmed to be 32.68.
장코로나바이러스 검출된 양성시료와 전염성 복막염 양성시료에 대해서 Realtime RT-PCR을 이용하여 상대적인 바이러스의 정량값을 비교한 결과 장코로나바이러스 감염증 양성케이스는 전염성 복막염에 비해서 36배 가량 바이러스의 역가가 낮은 것으로 확인되어 전염성 복막염의 경우 만성으로 염증이 진행되어 바이러스의 역가가 낮을 뿐 아니라 임상증상으로는 전염성 복막염이 의심되지만 코로나바이러스가 검출되지 않은 경우도 약 67.4%에 이르는 것으로 확인되었다(도 1).As a result of comparing the relative quantitative values of the virus with the positive sample detected for intestinal coronavirus and the positive sample for infectious peritonitis using Realtime RT-PCR, the positive case of intestinal coronavirus infection showed that the virus titer was 36 times lower than that of infectious peritonitis. In the case of infectious peritonitis confirmed, chronic inflammation progressed, and the virus titer was low, and infectious peritonitis was suspected as a clinical symptom, but it was confirmed that about 67.4% of cases where no coronavirus was detected (FIG. 1).
2. 고양이 코로나바이러스 유전자 염기서열분석2. Feline coronavirus gene sequencing
다양한 임상증례에서 확보한 고양이 코로나바이러스의 구조단백질 및 비구조단백질 유전자를 대상으로 RT-PCR을 수행한 후 증폭된 산물을 일반적인 염기서열분석방식을 통해 유전자형 및 국내유행하는 고양이 코로나바이러스의 유전자변이를 확인하였다. After performing RT-PCR on the structural and non-structural protein genes of feline coronavirus obtained from various clinical cases, the amplified product is subjected to a general sequencing method to confirm the genotype and genetic variation of the domestic cat coronavirus did
RT-PCR에 사용된 프라이머는 [표 1]에 기재된 서열을 갖는다. The primers used for RT-PCR have the sequences shown in [Table 1].
바이러스 검출을 위한 표적 유전자 서열에 대한 리얼타임 PCR을 수행하기 위한 프라이머 농도는 최종 농도가 500nM, 증폭반응 결과물을 확인할 수 있는 형광표지가 된 프로브는 최종 농도가 250nM이 되도록 PCR 반응액에 첨가하였다. RT-PCR은 15℃에서 역전사(reverse transcription) 반응을 수행한 후, 95℃에서 10분간 변성하고 나서 45 사이클로 95℃ 10초, 55℃ 30초 조건을 반복하여 각각의 바이러스 검출을 위한 표적 유전자 서열을 증폭하여 수행되었다. RT-PCR 증폭반응시 주형은 상기 확보한 고양이 코로나 바이러스에서 추출된 RNA를 10배씩 연속 희석한 시료를 6단계로 준비하여 사용하였다.The primer concentration for performing real-time PCR on the target gene sequence for virus detection was added to the PCR reaction solution so that the final concentration was 500 nM, and the fluorescent-labeled probe capable of confirming the amplification reaction product had a final concentration of 250 nM. RT-PCR performs a reverse transcription reaction at 15°C, denatures at 95°C for 10 minutes, and then repeats the conditions of 95°C for 10 seconds and 55°C for 30 seconds in 45 cycles to detect target gene sequences for each virus. was amplified. For the RT-PCR amplification reaction, a sample obtained by serially diluting the obtained RNA extracted from the cat corona virus by 10 times was used as a template in 6 steps.
또한, 리얼 타임 PCR 증폭 반응결과물을 확인하고 이를 정량적으로 분석하기 위해 프로브는 형광물질 및 소광물질로 이중 표지되는데, 전술한 바와 같이 코로나바이러스를 검출하는데 사용되는 프로브의 경우에는 5' 말단에 형광 물질인 FAM(최대 흡수파장: 495nm, 최대 방출 파장: 520nm)으로 표지하였고, 3' 말단에는 IDT사의 소광물질인 ZEN-IBFQ로 표지하였다. In addition, in order to confirm the real-time PCR amplification reaction result and quantitatively analyze it, the probe is double-labeled with a fluorescent material and a quenching material. Phosphorus FAM (maximum absorption wavelength: 495 nm, maximum emission wavelength: 520 nm) was labeled, and the 3' end was labeled with ZEN-IBFQ, a quenching material from IDT.
시험에 사용된 두 가지 임상증상(위장관염과 전염성 복막염)으로부터 양성으로 확인된 코로나바이러스에 대해서 4개의 유전자에 대해 RT-PCR을 수행한 결과 비구조단백질은 NSP3와 구조단백질인 Spike 단백질에 대해서 시험에 사용한 검체 중 두 가지 질환군에 대해서 유전자증폭이 되는 것을 확인한 반면 NSP12와 Membrane 단백질의 경우 전염성 복막염 검체에서는 유전자증폭을 확인할 수 없었던 반면 위장관염 검체에서는 유전자의 증폭이 확인되었다. As a result of performing RT-PCR on four genes for coronavirus, which was confirmed positive from two clinical symptoms (gastroenteritis and infectious peritonitis) used in the test, the nonstructural protein was tested for NSP3 and the structural protein, Spike protein. Among the samples used, gene amplification was confirmed for two disease groups, whereas in the case of NSP12 and Membrane proteins, gene amplification was not confirmed in the infectious peritonitis sample, whereas the gene amplification was confirmed in the gastroenteritis sample.
두가지 임상증상 예에서 모두 유전자가 검출된 Spike 단백질의 경우 두가지 임상증례에서 모두 유전자가 증폭되었지만 임상검체에 따라서 증폭된 산물의 사이즈가 달라 전염성 복막염과 급성 위장관염에서 검출된 고양이 코로나바이러스 사이에 상당한 유전자 변이가 있을 것으로 예상되었다.In the case of the Spike protein whose gene was detected in both clinical cases, the gene was amplified in both clinical cases, but the size of the amplified product was different depending on the clinical sample, so a significant gene between the feline coronavirus detected in infectious peritonitis and acute gastroenteritis variation was expected.
<110> POSTBIO <120> RT-PCR COMPOSITION FOR DETECTING FELINE CORONAVIRUS <130> Pn-2019-0208 <160> 8 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FCoV nsp3 F1 <400> 1 atccatatgg ttctggcatg g 21 <210> 2 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FCoV nsp3 R1 <400> 2 tttagcygta ctataatcat tgagca 26 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FCoV nsp12 F1 <400> 3 cccacaatga ctcaaatgaa 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FCoV nsp12 R1 <400> 4 tctggttcya cccaacactt 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FCoV S F1 <400> 5 tctgtkgcca tcaaaatcac 20 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FCoV S R1 <400> 6 cattaacatc haccattaca tctg 24 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FCoV M F1 <400> 7 gcggttmtaa acgaaattga 20 <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FCoV M R1 <400> 8 tgagtaatca ccrgctttag attt 24 <110> POSTBIO <120> RT-PCR COMPOSITION FOR DETECTING FELINE CORONAVIRUS <130> Pn-2019-0208 <160> 8 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FCoV nsp3 F1 <400> 1 atccatatgg ttctggcatg g 21 <210> 2 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FCoV nsp3 R1 <400> 2 tttagcygta ctataatcat tgagca 26 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FCoV nsp12 F1 <400> 3 cccacaatga ctcaaatgaa 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FCoV nsp12 R1 <400> 4 tctggttcya cccaacactt 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FCoV S F1 <400> 5 tctgtkgcca tcaaaatcac 20 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FCoV S R1 <400> 6 cattaacatc haccattaca tctg 24 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FCoV M F1 <400> 7 gcggttmtaa acgaaattga 20 <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FCoV M R1 <400> 8 tgagtaatca ccrgctttag attt 24
Claims (10)
2) 서열번호 3 및 서열번호 4의 염기서열로 표시되는 프라이머 세트를 포함하고,
전염성 복막염-유발 코로나 바이러스인 경우 1) 프라이머 세트를 이용한 RT-PCR에 의하여 유전자 증폭이 일어나고, 2) 프라이머 세트를 이용한 RT-PCR에 의하여 유전자 증폭이 일어나지 않고,
위장관염-유발 코로나 바이러스인 경우 1) 프라이머 세트 및 2) 프라이머 세트를 이용한 RT-PCR에 의하여 모두 유전자 증폭이 일어나는 것을 특징으로 하는,
고양이 코로나바이러스 검출을 위한 RT-PCR(reverse transcript-polymerase chain reaction)용 조성물;
[서열번호 1]
5′-ATCCATATGGTTCTGGCATGG-3
[서열번호 2]
5′-TTTAGCYGTACTATAATCATTGAGCA-3′
[서열번호 3]
5′-CCCACAATGACTCAAATGAA-3′
[서열번호 4]
5′-TCTGGTTCYACCCAACACTT-3′.
1) a primer set represented by the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2; and
2) including a primer set represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4,
In the case of infectious peritonitis-causing coronavirus 1) gene amplification occurs by RT-PCR using a primer set, 2) gene amplification does not occur by RT-PCR using a primer set,
In the case of gastroenteritis-inducing corona virus, it is characterized in that all gene amplification occurs by RT-PCR using 1) a primer set and 2) a primer set,
RT-PCR (reverse transcript-polymerase chain reaction) composition for detecting cat coronavirus;
[SEQ ID NO: 1]
5'-ATCCATATGGTTCTGGCATGG-3
[SEQ ID NO: 2]
5'-TTTAGCYGTACTATAATCATTGAGCA-3'
[SEQ ID NO: 3]
5'-CCCACAATGACTCAAATGAA-3'
[SEQ ID NO: 4]
5′-TCTGGTTCYACCCAACACTT-3′.
3) 서열번호 5 및 서열번호 6의 염기서열로 표시되는 프라이머 세트; 및
4) 서열번호 7 및 서열번호 8의 염기서열로 표시되는 프라이머 세트를 추가로 포함하고,
전염성 복막염-유발 코로나 바이러스인 경우 3) 프라이머 세트를 이용한 RT-PCR에 의하여 유전자 증폭이 일어나고, 4) 프라이머 세트를 이용한 RT-PCR에 의하여 유전자 증폭이 일어나지 않고,
위장관염-유발 코로나 바이러스인 경우 3) 프라이머 세트 및 4) 프라이머 세트를 이용한 RT-PCR에 의하여 모두 유전자 증폭이 일어나는 것을 특징으로 하는,
고양이 코로나바이러스 검출을 위한 RT-PCR(reverse transcript-polymerase chain reaction)용 조성물;
[서열번호 5]
5′-TCTGTKGCCATCAAAATCAC-3′
[서열번호 6]
5′-CATTAACATCHACCATTACATCTG-3′
[서열번호 7]
5′-GCGGTTMTAAACGAAATTGA-3′
[서열번호 8]
5′-TGAGTAATCACCRGCTTTAGATTT-3′.
The method of claim 1,
3) a primer set represented by the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6; and
4) further comprising a primer set represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8;
In the case of infectious peritonitis-causing coronavirus 3) gene amplification occurs by RT-PCR using a primer set, 4) gene amplification does not occur by RT-PCR using a primer set,
In the case of gastroenteritis-inducing corona virus, it is characterized in that all gene amplification occurs by RT-PCR using 3) a primer set and 4) a primer set,
RT-PCR (reverse transcript-polymerase chain reaction) composition for detecting cat coronavirus;
[SEQ ID NO: 5]
5'-TCTGTKGCCATCAAAATCAC-3'
[SEQ ID NO: 6]
5'-CATTAACATCHACCATTACATCTG-3'
[SEQ ID NO: 7]
5'-GCGGTTMTAAACGAAATTGA-3'
[SEQ ID NO: 8]
5′-TGAGTAATCACCRGCTTTAGATTT-3′.
상기 1) 프라이머 세트는 고양이 코로나바이러스 NSP3 유전자를 증폭시키고,
상기 2) 프라이머 세트는 고양이 코로나바이러스 NSP12 유전자를 증폭시키는 것을 특징으로 하는 고양이 코로나바이러스 검출을 위한 RT-PCR(reverse transcript-polymerase chain reaction)용 조성물.
The method of claim 1,
1) the primer set amplifies the cat coronavirus NSP3 gene,
The 2) primer set is a composition for RT-PCR (reverse transcript-polymerase chain reaction) for detecting cat coronavirus, characterized in that it amplifies the cat coronavirus NSP12 gene.
상기 3) 프라이머 세트는 고양이 코로나바이러스 스파이크(Spike) 유전자를 증폭시키고,
상기 4) 프라이머 세트는 고양이 코로나바이러스 멤브레인(Membrane) 유전자를 증폭시키는 것을 특징으로 하는 고양이 코로나바이러스 검출을 위한 RT-PCR(reverse transcript-polymerase chain reaction)용 조성물.
3. The method of claim 2,
3) the primer set amplifies the cat coronavirus Spike gene,
The 4) primer set is a composition for RT-PCR (reverse transcript-polymerase chain reaction) for detecting cat coronavirus, characterized in that it amplifies the cat coronavirus membrane gene.
전염성 복막염-유발 코로나 바이러스와 위장관염-유발 코로나 바이러스를 구별할 수 있는 것을 특징으로 하는 고양이 코로나바이러스 검출용 키트.
A composition comprising the composition of any one of claims 1 to 4,
A kit for detecting feline coronavirus, characterized in that it can distinguish infectious peritonitis-causing coronavirus and gastroenteritis-causing coronavirus.
상기 검출용 키트는 반응 완충액, DNA 중합효소 및 역전사효소를 포함하는 것인 검출용 키트.
6. The method of claim 5,
The detection kit is a detection kit comprising a reaction buffer, a DNA polymerase and a reverse transcriptase.
2) 서열번호 3 및 서열번호 4의 염기서열로 표시되는 프라이머 세트를 이용하여 RT-PCR(reverse transcript-polymerase chain reaction)을 수행하는 단계를 포함하고,
상기 각 단계의 RT-PCR 결과에 의하여 전염성 복막염-유발 코로나 바이러스와 위장관염-유발 코로나 바이러스를 구별할 수 있는 것을 특징으로 하는 고양이 코로나바이러스 검출방법;
[서열번호 1]
5′-ATCCATATGGTTCTGGCATGG-3
[서열번호 2]
5′-TTTAGCYGTACTATAATCATTGAGCA-3′
[서열번호 3]
5′-CCCACAATGACTCAAATGAA-3′
[서열번호 4]
5′-TCTGGTTCYACCCAACACTT-3′.
1) performing reverse transcript-polymerase chain reaction (RT-PCR) using a primer set represented by the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2; and
2) performing RT-PCR (reverse transcript-polymerase chain reaction) using a primer set represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4,
Cat coronavirus detection method, characterized in that it is possible to distinguish the infectious peritonitis-causing coronavirus and the gastroenteritis-causing coronavirus by the RT-PCR results of each step;
[SEQ ID NO: 1]
5'-ATCCATATGGTTCTGGCATGG-3
[SEQ ID NO: 2]
5'-TTTAGCYGTACTATAATCATTGAGCA-3'
[SEQ ID NO: 3]
5'-CCCACAATGACTCAAATGAA-3'
[SEQ ID NO: 4]
5′-TCTGGTTCYACCCAACACTT-3′.
전염성 복막염-유발 코로나 바이러스인 경우 1) 단계의 RT-PCR에 의하여 유전자 증폭이 일어나고, 2) 단계의 RT-PCR에 의하여 유전자 증폭이 일어나지 않고,
위장관염-유발 코로나 바이러스인 경우 1) 단계 및 2) 단계의 RT-PCR에 의하여 모두 유전자 증폭이 일어나는 것을 특징으로 하는 고양이 코로나바이러스 검출방법.
8. The method of claim 7,
In the case of infectious peritonitis-causing coronavirus, gene amplification occurs by RT-PCR in step 1), and gene amplification does not occur by RT-PCR in step 2),
In the case of gastroenteritis-causing coronavirus, a method for detecting a cat coronavirus, characterized in that gene amplification occurs by RT-PCR in steps 1) and 2).
3) 서열번호 5 및 서열번호 6의 염기서열로 표시되는 프라이머 세트를 이용하여 RT-PCR(reverse transcript-polymerase chain reaction)을 수행하는 단계; 및
4) 서열번호 7 및 서열번호 8의 염기서열로 표시되는 프라이머 세트를 이용하여 RT-PCR(reverse transcript-polymerase chain reaction)을 수행하는 단계를 포함하고,
상기 각 단계의 RT-PCR 결과에 의하여 전염성 복막염-유발 코로나 바이러스와 위장관염-유발 코로나 바이러스를 구별할 수 있는 것을 특징으로 하는 고양이 코로나바이러스 검출방법;
[서열번호 5]
5′-TCTGTKGCCATCAAAATCAC-3′
[서열번호 6]
5′-CATTAACATCHACCATTACATCTG-3′
[서열번호 7]
5′-GCGGTTMTAAACGAAATTGA-3′
[서열번호 8]
5′-TGAGTAATCACCRGCTTTAGATTT-3′.
8. The method of claim 7,
3) performing reverse transcript-polymerase chain reaction (RT-PCR) using the primer set represented by the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6; and
4) performing RT-PCR (reverse transcript-polymerase chain reaction) using the primer set represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8;
Cat coronavirus detection method, characterized in that it is possible to distinguish the infectious peritonitis-causing coronavirus and the gastroenteritis-causing coronavirus by the RT-PCR results of each step;
[SEQ ID NO: 5]
5'-TCTGTKGCCATCAAAATCAC-3'
[SEQ ID NO: 6]
5'-CATTAACATCHACCATTACATCTG-3'
[SEQ ID NO: 7]
5'-GCGGTTMTAAACGAAATTGA-3'
[SEQ ID NO: 8]
5′-TGAGTAATCACCRGCTTTAGATTT-3′.
전염성 복막염-유발 코로나 바이러스인 경우 3) 단계의 RT-PCR에 의하여 유전자 증폭이 일어나고, 4) 단계의 RT-PCR에 의하여 유전자 증폭이 일어나지 않고,
위장관염-유발 코로나 바이러스인 경우 3) 단계 및 4) 단계의 RT-PCR에 의하여 모두 유전자 증폭이 일어나는 것을 특징으로 하는 고양이 코로나바이러스 검출방법. 10. The method of claim 9,
In the case of infectious peritonitis-causing coronavirus, gene amplification occurs by RT-PCR in step 3), and gene amplification does not occur by RT-PCR in step 4),
In the case of gastroenteritis-causing coronavirus, a method for detecting a cat coronavirus, characterized in that gene amplification occurs by RT-PCR in steps 3) and 4).
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| GRNT | Written decision to grant |