KR102368585B1 - Bioimaging technique using reversibly expandable/recoverable hydrogel dependent on temperature change - Google Patents

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Abstract

본 발명은 온도 변화에 따라 가역적으로 팽창 또는 수축하는, 생체시료와 미리 결정된 온도 범위에서 온도의 변화에 따라 가역적으로 팽창 또는 초기화가 가능한 온도 감응성 하이드로겔의 복함체 및 이를 이용한 생체 시료의 이미징 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a complex body of a biological sample that reversibly expands or contracts according to a change in temperature, and a temperature-sensitive hydrogel that can reversibly expand or reset according to a change in temperature in a predetermined temperature range, and an imaging method of a biological sample using the same. it's about

Description

온도에 따라 가역적 팽창/초기화가 가능한 하이드로젤을 이용한 생체조직 이미징{Bioimaging technique using reversibly expandable/recoverable hydrogel dependent on temperature change}Bioimaging technique using reversibly expandable/recoverable hydrogel dependent on temperature change

본 발명은 가역적 팽창/초기화가 가능한 하이드로젤을 통한 생체조직 이미징 및 독립항에 관한 것이다.The present invention relates to bio-tissue imaging and independent claims through a hydrogel capable of reversible expansion/initialization.

생체 조직을 광학현미경으로 보다 정밀하게 관찰하기 위해 조직을 하이드로젤에 도입한 뒤 지질분자 등을 제거하여 조직을 투명하게 만드는 방법이 제시되었고, 더 나아가 하이드로젤을 물리적으로 팽창시켜 하이드로젤에 연결된 생체분자의 상대적인 거리를 늘림으로써 이미징하는 대상의 해상도를 현저하게 증가시키는 확장된 하이드로젤을 통한 이미징(Expansion microscopy) 기술이 등장하였다. 하지만 'Expansion microscopy' 에서는 팽창된 하이드로젤로 인한 해상도 증가에 초점을 맞췄으며 팽창의 일방성이라는 한계를 가진다.In order to observe living tissue more precisely with an optical microscope, a method of making the tissue transparent by removing lipid molecules after introducing the tissue into the hydrogel has been proposed. Expansion microscopy technology, which remarkably increases the resolution of an imaged object by increasing the relative distance of molecules, has emerged. However, 'Expansion microscopy' focused on the increase in resolution due to the expanded hydrogel, and has a limit of one-way expansion.

투명한 하이드로젤에 원하는 방식으로 자극을 가하여 젤의 크기와 부피를 가역적으로 조절할 수 있다면 다양한 방법으로 응용가능하며 팽창된 젤에서 나타났던 한계 개선이 가능하다. 예를 들어 팽창된 젤에서는 빠른 속도로 전체적인 이미지를 얻기 힘든 것에 반해, 크기 조절이 가역적으로 가능한 젤에서는 빠른 속도로 전체의 모습을 얻어내는 것이 가능하며 또한 원하는 부분에서 젤을 확대시켜 고해상도의 이미지를 얻을 수 있다. 따라서, 본 발명에서는 외부 자극에 의해 하이드로젤이 수축과 팽창이 가역적으로 가능하게 만듦으로써 기존의 하이드로젤 현미경 기술을 새로운 방향으로 발전시키고자 하였다.If the size and volume of the gel can be reversibly adjusted by applying stimulation to the transparent hydrogel in a desired way, it can be applied in various ways and it is possible to improve the limitations of the expanded gel. For example, in the case of expanded gel, it is difficult to obtain an overall image at a fast speed, whereas in a gel with reversible size adjustment, it is possible to obtain the overall appearance at a high speed. can be obtained Therefore, in the present invention, it was attempted to develop the existing hydrogel microscopy technology in a new direction by making the contraction and expansion of the hydrogel reversible by external stimulation.

본 발명은 최근 새롭게 떠오르는 기술인 'Expansion microscopy', 즉 생체조직을 하이드로젤에 포매한 후 젤을 팽창시켜 젤에 연결된 생체물질의 물리적인 거리를 확장하여 이미징함으로써 기존의 광학현미경이 가지는 분해능을 현저하게 개선시키는 기술과 관련이 있다. The present invention significantly improves the resolution of conventional optical microscopes by imaging a newly emerging technology, 'Expansion microscopy', that is, by embedding biological tissue in a hydrogel and expanding the gel to expand the physical distance of the biological material connected to the gel. It has to do with technology to improve.

본 발명자들은 하이드로젤에 온도에 따라 팽창과 수축이 가역적으로 가능한 특성을 부여함으로써, 초기 상태로 회복 시 넓은 영역을 빠르게 이미징하는 장점과 팽창 시 분해능을 높일 수 있는 장점을 동시에 도입하는 본 발명을 완성하였다. 즉, 본 발명은 생체 조직의 구성을 살피는 바이오 공학 또는 의학용 분야에 적용 가능하며, 하이드로젤 내에 포매된 생체 조직의 확대, 수축 이미지를 임의대로 관찰할 수 있는 장점을 제공할 수 있다.The present inventors have completed the present invention, which simultaneously introduces the advantage of rapidly imaging a wide area when recovering to the initial state and the advantage of increasing resolution during expansion by giving the hydrogel a property that can expand and contract reversibly according to temperature. did That is, the present invention is applicable to bio-engineering or medical fields examining the composition of biological tissues, and can provide an advantage of arbitrarily observing enlarged and contracted images of biological tissues embedded in hydrogels.

대한민국 등록특허 10-1912845Republic of Korea Patent Registration 10-1912845

본 발명의 하나의 목적은 생체시료 및 상기 생체시료를 포매한 하이드로겔을 포함하고, 상기 하이드로겔은 미리 결정된 온도 범위에서 온도의 변화에 따라 가역적으로 팽창 또는 수축하는 온도 감응성 하이드로겔인 것인, 생체시료-하이드로겔 복합체를 제공하는 것이다.One object of the present invention includes a biological sample and a hydrogel embedding the biological sample, wherein the hydrogel is a temperature-sensitive hydrogel that reversibly expands or contracts according to a change in temperature in a predetermined temperature range. To provide a biological sample-hydrogel complex.

본 발명의 다른 목적은 생체시료를 염색하는 단계, 상기 염색된 생체시료를 전처리하는 단계 및 상기 전처리된 생체시료를 하이드로겔 단량체와 중합하는 단계를 포함하는 것인, 생체시료-하이드로겔 복합체 제조방법을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to dye a biological sample, pre-treating the dyed biological sample, and polymerizing the pre-treated biological sample with a hydrogel monomer, a biological sample-hydrogel complex manufacturing method is to provide

본 발명의 다른 목적은 생체시료 이미징 방법: 복합체를 준비하는 제 1단계, 상기 복합체에 포함된 하이드로겔이 LCST 유형의 고분자인 경우 온도를 증가 또는 감소시켜 생체시료를 팽창시키는 제 2-1단계, 상기 복합체에 포함된 하이드로겔이 UCST 유형의 고분자인 경우 온도를 감소 또는 증가시켜 생체시료를 팽창시키는 제 2-2단계, 광학현미경으로 관찰하는 제3단계를 제공하는 것이다.Another object of the present invention is a biological sample imaging method: the first step of preparing the complex, the 2-1 step of expanding the biological sample by increasing or decreasing the temperature when the hydrogel included in the complex is an LCST type polymer; When the hydrogel contained in the complex is a UCST-type polymer, the second step is to reduce or increase the temperature to expand the biological sample, and the third step is to observe with an optical microscope.

이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 발명에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.This will be described in detail as follows. Meanwhile, each description and embodiment disclosed in the present invention may be applied to each other description and embodiment. That is, all combinations of the various elements disclosed herein fall within the scope of the present invention. In addition, it cannot be considered that the scope of the present invention is limited by the specific descriptions described below.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 하나의 양태는, 생체시료 및 상기 생체시료를 포매한 하이드로겔을 포함하고, 상기 하이드로겔은 미리 결정된 온도 범위에서 온도의 변화에 따라 가역적으로 팽창 또는 수축하는 온도 감응성 하이드로겔인 것인, 생체시료-하이드로겔 복합체를 제공한다.One aspect of the present invention for achieving the above object includes a biological sample and a hydrogel embedding the biological sample, wherein the hydrogel reversibly expands or contracts according to a change in temperature in a predetermined temperature range. It provides a sensitive hydrogel, a biological sample-hydrogel complex.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 다른 하나의 양태는, 생체시료를 염색하는 단계, 상기 염색된 생체시료를 전처리하는 단계 및 상기 전처리된 생체시료를 하이드로겔 단량체와 중합하는 단계를 포함하는 것인, 생체시료-하이드로겔 복합체 제조방법을 제공한다.Another aspect of the present invention for achieving the above object, comprising the steps of dyeing a biological sample, pre-treating the dyed biological sample, and polymerizing the pre-treated biological sample with a hydrogel monomer , a biological sample-hydrogel complex manufacturing method is provided.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 또 다른 하나의 양태는, 생체시료 이미징 방법을 제공한다.Another aspect of the present invention for achieving the above object provides a method for imaging a biological sample.

구체적으로, 상기 생체시료-하이드로겔 복합체는 종래에 일방성 팽창만을 하고, 팽창 시 넓어진 면적과 줄어든 형광 세기로 이미지 관찰에 시간이 많이 소요되는 문제를 가역적 회복으로 해결하고, 가역적인 팽창, 수축 과정을 거쳐 전체적인 정보를 빠르게 얻어내는 것을 가능하게 할 수 있다. 또한, 다시 팽창이 가능하기 때문에 원하는 부분에서 고해상도의 이미지를 얻는 효과, 온도에 따라 부피가 극적으로 변하기 때문에 염색이나 분자의 수송에서 물리적인 자극으로 작동할 수 있어 염색 효율 개선 및 분자 전달에 이점을 제공, 온도에 따라 가역적으로 크기가 변하는 하이드로겔은 온도 변화 범위를 임의로 조절하여 부피조절이 가능하다는 효과를 제공할 수 있다.Specifically, the biological sample-hydrogel complex in the prior art only unidirectionally expands, solves the problem of time-consuming image observation due to an enlarged area and reduced fluorescence intensity during expansion by reversible recovery, and reversible expansion and contraction process It can make it possible to quickly obtain the overall information through In addition, since it can be re-expanded, it has the effect of obtaining a high-resolution image from a desired part, and since the volume changes dramatically depending on the temperature, it can be operated as a physical stimulus in dyeing or transporting molecules, thereby improving dyeing efficiency and delivering molecules. Provided, the hydrogel, which reversibly changes in size depending on the temperature, can provide the effect that the volume can be adjusted by arbitrarily adjusting the temperature change range.

상기 생체시료는 세포 또는 조직을 포함하는 것일 수 있다.The biological sample may include cells or tissues.

본 발명의 용어, "세포"는 거의 모든 생물의 기능적, 구조적 기본 단위를 말하며, 세포는 기능적 특징에 따라 크기가 다양하지만 대부분은 마이크로미터 단위로, 육안으로 확인하기는 거의 불가능하므로 현미경으로 관찰해야 하는 것을 의미한다.As used herein, the term "cell" refers to the basic functional and structural unit of almost all living organisms, and although cells vary in size depending on functional characteristics, most are in micrometer units, and since it is almost impossible to confirm with the naked eye, it must be observed with a microscope. means to do

본 발명에서 세포는 분양 받은 세포주, 조직으로부터 분리한 세포 및 이의 배양물을 제한없이 포함한다.Cells in the present invention include, without limitation, cell lines that have been distributed, cells isolated from tissues, and cultures thereof.

본 발명의 용어, "조직"은 생물체를 구성하는 단위의 하나로서, 같은 형태나 기능을 가진 세포의 모임을 말하며, 다세포생물의 몸은 전체가 균질인 세포덩어리로 이루어져 있는 것이 아니라, 형상·성질을 달리하는 몇 종의 세포로 이루어져 있으며, 각 부분마다 같은 형태와 기능을 가지는 세포가 모여서 각 부분이 일정한 기능을 영위하도록 되어 있다. 조직은 이러한 형태 및 기능이 같은 세포의 모임을 의미한다.As used herein, the term “tissue” refers to a group of cells having the same shape or function as one of the units constituting an organism, and the body of a multicellular organism is not made up of a homogeneous cell mass as a whole, but rather in shape and properties It consists of several types of cells that differ from each other, and cells with the same shape and function are gathered for each part so that each part performs a certain function. Tissue refers to a group of cells having the same shape and function.

본 발명의 생체시료는 세포와 조직을 포함할 수 있고 이러한 생체시료는 하이드로겔에 포매하여 생체시료-하이드로겔 복합체를 형성할 수 있다.The biological sample of the present invention may include cells and tissues, and the biological sample may be embedded in a hydrogel to form a biological sample-hydrogel complex.

구체적으로, 상기 생체시료는 배양세포, 조직으로부터 분리된 세포 또는 생체조직인 것일 수 있다.Specifically, the biological sample may be cultured cells, cells isolated from tissues, or biological tissues.

상기 온도감응성 하이드로겔은 미리 결정된 온도 범위에서 온도 증가에 따라 팽창하는 UCST 유형의 하이드로겔 또는 온도 감소에 따라 팽창하는 LCST 유형의 하이드로겔인 것일 수 있다.The temperature-sensitive hydrogel may be a UCST-type hydrogel that expands with an increase in temperature in a predetermined temperature range or a LCST-type hydrogel that expands with a decrease in temperature.

본 발명의 용어, "하이드로겔(hydrogel)"은 물을 용매로 하는 것을 의미한다.As used herein, the term "hydrogel" means using water as a solvent.

본 발명의 용어, "UCST (upper critical solution temperature)유형 하이드로젤"은 소정의 온도 범위 내에서 온도가 증가함에 따라 팽창하고 다시 온도가 감소함에 따라 수축할 수 있는, 온도의존적이며 가역적인 팽창 수축이 가능한 하이드로젤을 의미할 수 있다.As used herein, the term "upper critical solution temperature (UCST) type hydrogel" is a temperature-dependent and reversible expansion and contraction that can expand as the temperature increases within a predetermined temperature range and shrink again as the temperature decreases. It may mean a possible hydrogel.

본 발명의 용어, "LCST (lower critical solution temperature) 유형의 하이드로젤"은 소정의 온도 범위 내에서 온도가 증가함에 따라 수축하고 다시 온도가 감소함에 따라 팽창할 수 있는, 온도의존적이며 가역적인 팽창 수축이 가능한 하이드로젤을 의미할 수 있다.As used herein, the term "lower critical solution temperature (LCST) type hydrogel" refers to a temperature-dependent and reversible expansion and contraction that can contract as the temperature increases within a predetermined temperature range and expand again as the temperature decreases. This may mean a possible hydrogel.

구체적으로, LCST 유형의 하이드로겔은 단량체 NIPAM (N-isopropylacrylamide)을 포함하여 acrylamide, N-tert-butyl acrylamide, N,N-diethylacrylamide등을 이용하여 조성을 결정할 수 있다.Specifically, the composition of the LCST-type hydrogel can be determined using acrylamide, N-tert-butyl acrylamide, N,N-diethylacrylamide, etc. including the monomer NIPAM (N-isopropylacrylamide).

본 발명의 하이드로겔은 수축/팽창이 온도에 따라 가역적으로 가능하며, 하이드로겔 종류를 선택하는 것에 따라 반응 방향을 조절하고 하이드로겔의 크기 조절이 온도를 통해 이루어지기 때문에 현미경 이미징 시 간단한 장치로도 온도를 설정하여 부피를 조절하는 효과를 제공할 수 있다.In the hydrogel of the present invention, contraction/expansion is reversible according to temperature, and the reaction direction is controlled according to the selection of the hydrogel type, and the size of the hydrogel is controlled through temperature, so even a simple device for microscopic imaging Setting the temperature can provide the effect of controlling the volume.

상기 미리 결정된 온도는 0℃ 내지 80℃ 인 것일 수 있다.The predetermined temperature may be 0 ℃ to 80 ℃.

구체적으로, 상기 미리 결정된 온도가 0℃ 미만일 때 상기 LCST의 경우 팽창할 수 있고 미리 결정된 온도가 80℃ 초과할 경우 상기 LCST의 경우 원래 크기로 돌아갈 수 있다. 상기 미리 결정된 온도가 0℃ 미만일 경우 상기 UCST의 경우 원래 크기로 돌아갈 수 있고 미리 결정된 온도가 80℃ 초과할 경우 상기 UCST의 경우 팽창할 수 있다.Specifically, the LCST may expand when the predetermined temperature is less than 0° C. and return to its original size when the predetermined temperature exceeds 80° C. When the predetermined temperature is less than 0 °C, the UCST may return to its original size, and when the predetermined temperature is greater than 80 °C, the UCST may expand.

더욱 구체적으로, 미리 결정된 온도는 LCST의 경우 4 내지 60℃일 수 있고, UCST의 경우 4 내지 80℃일 수 있다.More specifically, the predetermined temperature may be 4 to 60° C. for LCST and 4 to 80° C. for UCST.

상기 미리 결정된 온도는 단량체 비율을 설정하여 임의로 조절할 수 있다.The predetermined temperature can be arbitrarily controlled by setting the monomer ratio.

상기 생체시료-하이드로겔 복합체는 하이드로겔의 종류에 따라 선택적으로 온도를 증가 또는 감소시킴으로써 상기 생체시료-하이드로겔 복합체를 팽창시켜 생체시료를 이미징하는 용도인 것일 수 있다.The biological sample-hydrogel complex may be used for imaging a biological sample by selectively increasing or decreasing the temperature according to the type of hydrogel, thereby expanding the biological sample-hydrogel complex.

상기 하이드로겔은 UCST 유형 또는 LCST 유형 중에 선택되는 것일 수 있고, 하이드로겔 UCST는 미리 결정된 온도 범위를 초과할 경우 팽창하고, 미리 결정된 온도범위 미만일 경우 수축하는 것일 수 있다. 하이드로겔 LCST는 미리 결정된 온도 범위를 초과할 경우 수축하고, 미리 결정된 온도 범위 미만일 경우 팽창하는 것일 수 있다.The hydrogel may be one selected from the UCST type or the LCST type, and the hydrogel UCST expands when it exceeds a predetermined temperature range, and contracts when it is less than the predetermined temperature range. The hydrogel LCST may contract when it exceeds a predetermined temperature range, and expand when it is less than a predetermined temperature range.

상기 팽창된 복합체는 온도를 역으로 조절하여 팽창된 복합체를 원상태로 수축 시키는 것일 수 있다.The expanded composite may be to contract the expanded composite to its original state by reversely controlling the temperature.

본 발명의 생체시료-하이드로겔 복합체는 미리 결정된 온도에 따라 가역적으로 팽창할 수 있으며, 팽창된 생체시료-하이드로겔 복합체는 원상태로 수축하였을 때 본래의 생체시료의 왜곡도가 낮은 원상태를 얻는 것일 수 있다.The biological sample-hydrogel complex of the present invention can be reversibly expanded according to a predetermined temperature, and when the expanded biological sample-hydrogel complex is contracted to its original state, it may be to obtain an original state with a low degree of distortion of the original biological sample. there is.

구체적으로, 상기 하이드로겔 단량체는 N-이소 프로필 아크릴 아미드(NIPAM:N-isopropylacrylamide), 아크릴아미드(acrylamide), N-tert-부틸 아크릴 아미드(N-tert-butyl acrylamide), N,N-디에틸아크릴아미드(N,N-diethylacrylamide), N-에틸아크릴아미드(N-ethylacrylamide), N-n-프로필아크릴아미드(N-n-propylacrylamide), N,N-에틸메틸아크릴아미드(N,N-ethylmethylacrylamide), N-이소프로필메타크릴아미드(N-isopropylmethacrylamide), N-하이드록시에틸아크릴아미드(N-hydroxyethylacrylamide), N-(이소부톡시메틸)아크릴아미드(N-(isobutoxymethyl)acrylamide), N-털트-부틸메타크릴아미드(N-tert-butyl methacrylamide), N,N-디에틸메타크릴아미드(N,N-diethylmethacrlamide), N-에틸메티크릴아미드(N-ethylmethacrylamide), 설포베테인 메타크릴레이트(sulfobetainemethacrylate), 설포베테인아크릴레이트 (sulfobetaineacrylate), 카복시베테인메타크릴레이트(carboxybetaine methacrylate), 카복시베테인아크릴레이트(carboxybetaineacrylate), 포스포베테인메타크릴레이트(phosphobetainemethacrylate), 포스포베테인 아크릴레이트(phosphobetaineacrylate), ([2-(메타크릴로일옥시)에틸]디메틸-(3-설포프로필)암모늄하이드록사이드)(sulfobetaine([2-(methacryloyloxy)ethyl]dimethyl-(3-sulfopropyl)ammoniumhydroxide)), 아크릴산(acrylic acid) 및 N-비닐아세트아미드(N-vinylacetamide)로 구성된 군으로부터 선택되는 둘 이상의 조합인 것일 수 있다.Specifically, the hydrogel monomer is N-isopropyl acrylamide (NIPAM:N-isopropylacrylamide), acrylamide (acrylamide), N-tert-butyl acrylamide (N-tert-butyl acrylamide), N,N-diethyl Acrylamide (N,N-diethylacrylamide), N-ethylacrylamide (N-ethylacrylamide), Nn-propylacrylamide (Nn-propylacrylamide), N,N-ethylmethylacrylamide (N,N-ethylmethylacrylamide), N- Isopropylmethacrylamide, N-hydroxyethylacrylamide, N-(isobutoxymethyl)acrylamide, N-tert-butylmethacrylamide (N-tert-butyl methacrylamide), N,N-diethylmethacrlamide (N,N-diethylmethacrlamide), N-ethylmethacrylamide (N-ethylmethacrylamide), sulfobetainemethacrylate, sulfobetainemethacrylate sulfobetaineacrylate, carboxybetaine methacrylate, carboxybetaineacrylate, phosphobetainemethacrylate, phosphobetaineacrylate, ([2- (methacryloyloxy)ethyl]dimethyl-(3-sulfopropyl)ammonium hydroxide) (sulfobetaine([2-(methacryloyloxy)ethyl]dimethyl-(3-sulfopropyl)ammoniumhydroxide)), acrylic acid and It may be a combination of two or more selected from the group consisting of N-vinylacetamide.

더욱 구체적으로, LCST 유형의 하이드로젤의 경우 60℃초과한 온도에서 수축하고 4℃미만에서 팽창된 크기를 가질 수 있는데, 이러한 LCST 특징을 나타내는 대표적인 단량체인 N-이소 프로필 아크릴 아미드(NIPAM: N-isopropylacrylamide)를 기존에 하이드로젤을 구성하는 아크릴아미드(acrylamide)와 함께 도입할 수 있다. 아크릴아미드는 세포 조직을 담는 하이드로젤의 기본 골격을 이루지만 온도에 따른 팽창률 변화를 보이지 않기 때문에 온도응답성을 보이는 N-이소프로필아크릴아미드와 같이 하이드로젤을 형성할 수 있다. 하지만 N-이소 프로필 아크릴 아미드로는 원하는 온도 범위에서 팽창/수축이 일어나지 않아, 소수성이 강해 전이온도를 낮출 수 있는 N-tert-부틸 아크릴 아미드(N-tert-butyl acrylamide), N,N-디에틸아크릴아미드(N,N-diethylacrylamide)를 추가적으로 도입하여 해결 할 수 있고, 이런 하이드로겔 단량체를 통해 적절한 범위의 온도에서 하이드로젤의 팽창/수축을 조절 할 수 있다.More specifically, in the case of an LCST-type hydrogel, it may have a size that shrinks at a temperature exceeding 60 °C and swells at a temperature lower than 4 °C, and N-isopropyl acrylamide (NIPAM: N- isopropylacrylamide) can be introduced together with acrylamide constituting the existing hydrogel. Acrylamide forms the basic skeleton of a hydrogel containing cell tissues, but does not show a change in the expansion rate according to temperature, so it can form a hydrogel like N-isopropylacrylamide showing temperature response. However, with N-isopropyl acrylamide, expansion/contraction does not occur in the desired temperature range, so N-tert-butyl acrylamide, N,N-di It can be solved by additionally introducing ethylacrylamide (N,N-diethylacrylamide), and the expansion/contraction of the hydrogel can be controlled at an appropriate range of temperature through this hydrogel monomer.

상기 하이드로겔 단량체와 중합하는 단계는 개시제 및 가교제를 추가로 포함하여 수행하는 것일 수 있다.The step of polymerizing with the hydrogel monomer may be performed by additionally including an initiator and a crosslinking agent.

본 발명의 용어, "개시제"는 연쇄반응을 개시시키기 위해 사용되는 물질. 열이나 빛에 의해 용이하게 라디칼을 생성하는 물질(예를 들면 과산화벤조일), 물 등과 반응하여 쉽게 이온을 생성하는 물질을 의미한다.As used herein, the term “initiator” refers to a substance used to initiate a chain reaction. It refers to a substance that easily generates radicals by heat or light (eg, benzoyl peroxide) or a substance that easily generates ions by reacting with water.

본 발명의 용어, "가교제"는 사슬 모양 고분자 사슬 사이에서 가교 역할을 하는 물질. 가교는 수지(樹脂)에 경도(硬度)나 탄력성 등 기계적 강도와 화학적 안정성을 부여하는 것을 의미한다.As used herein, the term "crosslinking agent" refers to a substance that acts as a crosslinking agent between chain-like polymer chains. Crosslinking means imparting mechanical strength and chemical stability such as hardness or elasticity to resin.

본 발명은 중합하는 단계에 개시제 및 가교제를 추가로 포함하여, 농도를 조절하며 하이드로겔 단량체의 적절한 조성을 선택할 수 있다.The present invention may further include an initiator and a crosslinking agent in the polymerization step to control the concentration and select an appropriate composition of the hydrogel monomer.

구체적으로, 상기 가교제는 비스아크릴아미드(bisacrylamide), 디펜타에리트리톨 펜타아크릴레이트, 디펜타에리트리톨 헥사아크릴레이트, 에틸렌글리콜 디아크렐레이트, 에틸렌글리콜 디메타크릴레이트, 알릴 메타크릴레이트, 아세토아세톡시에틸 메타크릴레이트, 이소시아나토에틸 메타크릴레이트, 이소부틸메타크릴레이트 또는 노르말부틸메타크릴레이트를 포함하는 것일 수 있다.Specifically, the crosslinking agent is bisacrylamide, dipentaerythritol pentaacrylate, dipentaerythritol hexaacrylate, ethylene glycol diacrylate, ethylene glycol dimethacrylate, allyl methacrylate, acetoacetoxy It may include ethyl methacrylate, isocyanatoethyl methacrylate, isobutyl methacrylate or normal butyl methacrylate.

또한, 상기 개시제는 과황산암모늄(APS:ammonium persulfate), 포타슘 퍼설페이트(potassiumpersulfate;KPS) 또는 수용성 아조 개시제(WatersolubleAzoinitiators)를 포함하는 것일 수 있다.In addition, the initiator may include ammonium persulfate (APS), potassium persulfate (KPS), or watersoluble azoinitiators.

구체적으로, 상기 개시제의 수용성 아조 개시제는 VA-044, V-50, VA-057, VA-061, VA-086, V-501, V-70, V-65, V-601, V-59, V-40, 또는 VAm-110 포함할 수 있다.Specifically, the water-soluble azo initiator of the initiator is VA-044, V-50, VA-057, VA-061, VA-086, V-501, V-70, V-65, V-601, V-59, V-40, or VAm-110 may be included.

구체적으로, 상기 개시제 KPS 및 APS는 테트라메틸에틸렌디아민(TEMED:tetramethylethylenediamine) 촉진제와 함께 사용되는 것일 수 있다.Specifically, the initiators KPS and APS may be used together with a tetramethylethylenediamine (TEMED: tetramethylethylenediamine) accelerator.

본 발명의 생체시료 이미징 방법은 복합체를 준비하는 제 1단계, 상기 제1단계 이후 상기 복합체에 포함된 하이드로겔이 LCST 유형의 고분자인 경우 온도를 증가 또는 감소시켜 생체시료를 팽창시키는 제 2-1단계, 상기 제 1단계 이후 상기 복합체에 포함된 하이드로겔이 UCST 유형의 고분자인 경우 온도를 감소 또는 증가시켜 생체시료를 팽창시키는 제 2-2단계 및 광학현미경으로 관찰하는 제3단계를 제공한다.In the biological sample imaging method of the present invention, in the first step of preparing the complex, after the first step, if the hydrogel included in the complex is an LCST-type polymer, the temperature is increased or decreased to expand the biological sample in Step 2-1 Step, when the hydrogel included in the complex is a UCST-type polymer after the first step, a second step 2-2 of expanding the biological sample by decreasing or increasing the temperature and a third step of observing with an optical microscope are provided.

상기 복합체는 본 발명의 생체시료-하이드로겔 복합체일 수 있고, 온도 변화에 따라 가역적으로 팽창 또는 수축할 수 있고 광학현미경을 이용하여 팽창 또는 원래 크기로 회복된 상태의 이미지를 제공할 수 있다.The complex may be a biological sample-hydrogel complex of the present invention, may reversibly expand or contract according to temperature change, and may provide an image of a state in which it is expanded or restored to its original size using an optical microscope.

또한, 상기 원래 크기로 회복된 상태의 이미지는 형광 신호가 응축되어 보다 원활한 관찰이 가능한 효과를 제공할 수 있다.In addition, the image restored to the original size may provide an effect that enables smoother observation by condensing the fluorescence signal.

구체적인 일 실시예에서는, 본 발명의 생체시료-하이드로겔 복합체를 이용하여 종래에 일방성 팽창만을 하고, 시간이 소요되는 문제를 해결하고, 가역적인 팽창, 수축 과정을 거쳐 전체적인 정보를 빠르게 얻어내는 것을 가능하게 하였다. 또한, 다시 팽창이 가능하기 때문에 원하는 부분에서 고해상도의 이미지를 얻는 효과, 온도에 따라 부피가 극적으로 변하기 때문에 염색이나 분자의 수송에서 물리적인 자극으로 작동할 수 있어 염색 효율 개선 및 분자 전달에 이점을 제공하고, 온도에 따라 가역적으로 크기가 변하는 하이드로겔은 온도 변화 범위를 임의로 조절하여 부피조절이 가능하다는 효과를 제공하는 것을 확인하였다.In a specific embodiment, using the biological sample-hydrogel complex of the present invention, conventionally only unidirectional expansion, solving the time-consuming problem, and rapidly obtaining overall information through reversible expansion and contraction processes made it possible In addition, since it can be re-expanded, it has the effect of obtaining a high-resolution image from a desired part, and since the volume changes dramatically depending on the temperature, it can be operated as a physical stimulus in dyeing or transporting molecules, thereby improving dyeing efficiency and delivering molecules. It was confirmed that the hydrogel, which reversibly changes in size according to temperature, provides the effect that the volume can be adjusted by arbitrarily adjusting the temperature change range.

본 발명의 생체시료-하이드로겔 복합체는 종래에 일방성 팽창만을 하고, 시간이 소요되는 문제를 해결하고, 가역적인 팽창, 수축 과정을 거쳐 전체적인 정보를 빠르게 얻어내는 것을 가능하게 하였다. 또한, 다시 팽창이 가능하기 때문에 원하는 부분에서 고해상도의 이미지를 얻는 효과, 온도에 따라 부피가 극적으로 변하기 때문에 염색이나 분자의 수송에서 물리적인 자극으로 작동할 수 있어 염색 효율 개선 및 분자 전달에 이점을 제공하고, 온도에 따라 가역적으로 크기가 변하는 하이드로겔은 온도 변화 범위를 임의로 조절하여 부피조절이 가능하다는 효과를 제공한다.The biological sample-hydrogel complex of the present invention made it possible to quickly obtain overall information through only one-way expansion in the prior art, solving the time-consuming problem, and reversible expansion and contraction processes. In addition, since it can be re-expanded, it has the effect of obtaining a high-resolution image from a desired part, and since the volume changes dramatically depending on the temperature, it can be operated as a physical stimulus in dyeing or transporting molecules, which has advantages in improving dyeing efficiency and delivering molecules. The hydrogel, which reversibly changes size according to temperature, provides the effect that the volume can be adjusted by arbitrarily adjusting the temperature change range.

도 1은 LCST 유형 하이드로젤의 온도에 따른 팽창률 변화 및 UCST 유형 하이드로젤의 온도에 따른 팽창률 변화를 나타낸 모식도이다.
도 2는 기존의 하이드로젤을 이루는 아크릴 아미드와 아크릴 아미드에 N-이소 프로필 아크릴 아미드를 첨가하였을 때, 그리고 N-tert-부틸 아크릴 아미드, N,N-디에틸아크릴아미드를 추가적으로 도입하였을 때 온도에 따른 하이드로겔의 팽창률을 나타낸 그래프이다.
도 3의 (A)는 LCST 유형 하이드로젤의 4℃ 내지 60℃ 온도에 따른 크기 변화, (B)는 가열과 냉각 시 각 온도에서 직선방향의 팽창률 및 (C)는 60℃와 4℃에서 반복적으로 확인한 LCST 하이드로젤의 팽창률을 나타낸 사진 및 그래프이다.
도 4은 세포를 LCST 하이드로젤에 포매한 뒤, 60℃와 4℃에서 관찰한 핵의 이미지(a,b,c) 및 미세소관의 이미지(d,e,f)이다.
도 5는 60℃ 상태에 LCST 하이드로젤에서의 왜곡도(A) 및 4℃ 상태에 LCST 하이드로젤의 왜곡도(B)를 나타낸 그래프이다.
도 6는 고온과 저온의 LCST 하이드로젤에서 미세소관의 단면 프로파일(cross-sectional profile) 비교사진 및 그래프이다.
도 7은 UCST 하이드로젤의 20℃와 70℃에서 크기 변화 그래프, 20℃와 70℃에서 하이드로젤을 나타낸 사진이다.
도 8은 (B) 세포를 UCST 하이드로젤에 포매한 뒤, 70℃와 25℃에서 관찰한 핵의 이미지(a,b,c) 및 미세소관의 이미지(d,e,f)이다.
도 9은 (A) 저온 상태의 UCST 하이드로젤에서 왜곡도를 나타낸 그래프 및 (B) 고온 상태의 UCST 하이드로젤에서 왜곡도를 나타낸 그래프이다.1 is a schematic diagram showing the change in the expansion rate according to the temperature of the LCST type hydrogel and the expansion rate change according to the temperature of the UCST type hydrogel.
2 shows the temperature when N-isopropyl acrylamide was added to acrylamide and acrylamide constituting the conventional hydrogel, and when N-tert-butyl acrylamide and N,N-diethylacrylamide were additionally introduced. It is a graph showing the expansion rate of the hydrogel.
(A) of Figure 3 is the size change according to the temperature of 4 ℃ to 60 ℃ of the LCST-type hydrogel, (B) is the linear expansion rate at each temperature during heating and cooling, and (C) is repeated at 60 ℃ and 4 ℃ It is a photograph and graph showing the expansion rate of the LCST hydrogel confirmed by .
Figure 4 is an image of the nucleus (a, b, c) and microtubule images (d, e, f) observed at 60 °C and 4 °C after embedding the cells in the LCST hydrogel.
5 is a graph showing the distortion degree (A) of the LCST hydrogel at 60°C and the distortion degree (B) of the LCST hydrogel at 4°C.
6 is a comparative photograph and graph showing the cross-sectional profile of microtubules in high-temperature and low-temperature LCST hydrogels.
7 is a graph showing the size change at 20°C and 70°C of the UCST hydrogel, and a photograph showing the hydrogel at 20°C and 70°C.
(B) After embedding the cells in the UCST hydrogel, images of the nucleus (a, b, c) and microtubules (d, e, f) observed at 70 ° C and 25 ° C.
9 is a graph showing the degree of distortion in (A) a UCST hydrogel in a low temperature state and (B) a graph showing the distortion in a UCST hydrogel in a high temperature state.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail through examples. These Examples are for explaining the present invention in more detail, and the scope of the present invention is not limited by these Examples.

실시예 1: 생체시료-하이드로겔(LCST) 복합체 제조Example 1: Preparation of a biological sample-hydrogel (LCST) complex

부피의 수축/팽창이 가역적으로 가능한 하이드로젤을 사용하여 생체 조직에 도입하는 방식으로 기존의 팽창에만 초점을 맞춘 기술에 새로운 개념을 도입하여 제조하였다.It was manufactured by introducing a new concept to the existing technology focused only on expansion by using a hydrogel capable of reversibly contracting/expansion of volume and introducing it into living tissue.

배양 세포인 Hela 세포를 사용하고, 부피의 수축/팽창은 온도 응답성 고분자를 이용하였으며 저온에서 팽창하는 LCST (lower critical solution temperature) 유형의 하이드로젤과 고온에서 팽창하는 UCST (upper critical solution temperature)유형의 하이드로젤로 온도에 따른 양방향의 하이드로젤을 사용하였다.Hela cells, which are cultured cells, are used, and a temperature-responsive polymer is used for volume contraction/expansion. LCST (lower critical solution temperature) type hydrogel that expands at low temperature and UCST (upper critical solution temperature) type expands at high temperature Bidirectional hydrogel according to temperature was used as the hydrogel of

배양세포를 항체로 염색한 후 아크릴산 N-하이드록시석신이미드에스테르(acrylic acid N-hydroxysuccinimide ester)를 이용하여 세포 조직에 하이드로젤과 중합을 가능하게 하는 이중결합을 도입하여 전처리 하였다.After staining the cultured cells with an antibody, acrylic acid N-hydroxysuccinimide ester was used to introduce a double bond that enables polymerization with the hydrogel into the cell tissue, followed by pretreatment.

LCST 유형의 하이드로젤의 경우 고온에서 수축하고 저온에서 팽창된 크기를 가지는데, 이러한 하이드로젤을 이루는 대표적인 단량체 N-이소프로필 아크릴아미드(NIPAM:N-isopropylacrylamide), 아크릴아미드(acrylamide), N-tert-부틸아크릴아미드(N-tert-butylacrylamide) 및 N,N-디에틸아크릴아미드(N,N-diethylacrylamide)를 조합하여 LCST 하이드로젤 조성을 결정하고, 단량체를 녹인 용액에 가교제 비스아크릴아미드(bisacrylamide)와 개시제인 과황산암모늄(APS:ammonium persulfate), 테트라메틸에틸렌디아민(TEMED:tetramethylethylenediamine)를 사용하여 생체 조직인 배양 세포와 함께 1시간 동안 젤을 중합시켜 세포 -하이드로겔 복합체를 형성하였다.In the case of LCST-type hydrogels, they contract at high temperatures and expand at low temperatures. Representative monomers constituting such hydrogels are N-isopropylacrylamide (NIPAM: N-isopropylacrylamide), acrylamide, -Butylacrylamide (N-tert-butylacrylamide) and N,N-diethylacrylamide (N,N-diethylacrylamide) are combined to determine the LCST hydrogel composition, and the crosslinking agent bisacrylamide and Using initiators, ammonium persulfate (APS: ammonium persulfate) and tetramethylethylenediamine (TEMED: tetramethylethylenediamine), the gel was polymerized with cultured cells, which are living tissues, for 1 hour to form a cell-hydrogel complex.

만들어진 세포-하이드로젤 복합체는 고온에서 분해, 혹은 효소를 이용한 단백질 절단 등 생체분자 사이 물리적, 화학적 상호작용을 없앰으로써 팽창을 용이하고 균일한 팽창을 얻기 위하여 적절한 분해 과정을 거친 후 증류수로 충분히 씻어주어 시료를 준비했다.The created cell-hydrogel complex undergoes an appropriate decomposition process to facilitate expansion and uniform expansion by eliminating physical and chemical interactions between biomolecules, such as decomposition at high temperatures or protein cleavage using enzymes, and then wash thoroughly with distilled water. Samples were prepared.

실시예 2: 온도에 따른 팽창 수축 확인Example 2: Confirmation of expansion and contraction according to temperature

상기 실시예 1에서 제조한 세포-하이드로젤 복합체(LCST)를 4℃ 내지 60℃각각의 온도에서 3시간 이상 보관하여 온도별 크기를 관찰하였다. The cell-hydrogel complex (LCST) prepared in Example 1 was stored at each temperature of 4°C to 60°C for 3 hours or more to observe the size of each temperature.

도 2에서 나타난 바와 같이, 적절한 조성의 LCST 하이드로젤에서 온도에 따라 크기 변화가 일어나는 것을 확인하였다.As shown in Figure 2, it was confirmed that the size change occurs in accordance with the temperature in the LCST hydrogel of an appropriate composition.

도 3에서 나타난 바와 같이, 온도가 높아질수록 하이드로젤의 크기가 팽창하고 온도가 상승할수록 수축하여 반복적으로 부피를 조절할 수 있음을 확인하였다.As shown in FIG. 3 , it was confirmed that the size of the hydrogel expands as the temperature increases and contracts as the temperature increases, thereby repeatedly controlling the volume.

실시예 3: 현미경 관찰 실험Example 3: Microscopic observation experiment

상기 실시예 1로 제조한 생체시료-하이드로겔 복합체(LCST)를 Hoechst 33342을 이용하여 핵을 염색하고 항체를 이용해 염색한 미세소관을 공초점 현미경(Zeiss LSM 880)을 이용하여 세포 조직을 관찰하였다.The nuclei of the biological sample-hydrogel complex (LCST) prepared in Example 1 were stained using Hoechst 33342, and the microtubules stained using an antibody were observed using a confocal microscope (Zeiss LSM 880). .

도 4에서 나타난 바와 같이, 공초점 현미경으로 하이드로젤에 포매된 세포의 이미지를 얻었을 경우 온도에 따라 확대/수축된 핵의 이미지를 얻을 수 있었다. 고온의 수축된 상태의 하이드로젤에서 1.22배의 원래 상태로 회복된 이미지를 보인 반면에, 온도를 낮춰 하이드로젤을 팽창시켰을 시, 2.37배까지 세포 크기가 증가한 이미지를 얻을 수 있었다.As shown in FIG. 4 , when images of cells embedded in hydrogels were obtained with a confocal microscope, images of nuclei enlarged/contracted according to temperature could be obtained. On the other hand, when the hydrogel in a high temperature contracted state showed an image restored to its original state by 1.22 times, when the hydrogel was expanded by lowering the temperature, an image in which the cell size increased by 2.37 times was obtained.

따라서, 고온에서 수축하여 전체적인 이미지를 얻을 수 있고, 저온에서 팽창하여 원하는 곳에 초점을 맞춰 고해상도의 이미지를 얻을 수 있었다.Therefore, it was possible to obtain an overall image by contracting at a high temperature, and by expanding at a low temperature to obtain a high-resolution image by focusing on a desired place.

실시예 4: 왜곡도 실험 Example 4: Distortion Experiment

상기 실시예 1에서 제조한 생체-하이드로젤 복합체(LCST)를 각 온도에서 생물조직의 뒤틀림 정도를 원래의 세포와 비교하였다.The bio-hydrogel complex (LCST) prepared in Example 1 was compared with the original cells for the degree of distortion of the biological tissue at each temperature.

도 5에서 나타난 바와 같이, 각 온도에서 생물조직의 뒤틀림 정도를 원래의 세포와 비교하였을 때 고온과 저온 모두 4% 미만의 왜곡도로 종래대비 왜곡이 크지않은 이미징이 가능한 것을 확인하였다.As shown in FIG. 5 , when the degree of distortion of the biological tissue at each temperature was compared with that of the original cells, it was confirmed that imaging with less than 4% distortion at both high and low temperatures was possible with less distortion compared to the prior art.

실시예 5: 미세소관 관찰 Example 5: Microtubule Observation

미세소관을 LCST하이드로제로가 중합하여 복합체(LCST)를 형성하여 고온 및 저온에서 미세소관의 가닥을 관찰하였다.The microtubules were polymerized with LCST hydrogen to form a complex (LCST), and the strands of microtubules were observed at high and low temperatures.

도 6에서 나타난 바와 같이, LCST 하이드로젤에서 미세소관을 염색하여 관찰하였을 때, 고온에서 낮은 팽창률로 구분하기 어려웠던 가닥을 저온에서 팽창시킨 후에 증가된 해상도로 구분이 가능한 것을 확인하였다.As shown in FIG. 6 , when microtubules were stained and observed in the LCST hydrogel, it was confirmed that strands, which were difficult to distinguish at high temperature due to low expansion rate, could be distinguished with increased resolution after expansion at low temperature.

실시예 6: 생체시료-하이드로겔(UCST) 복합체 제조Example 6: Preparation of a biological sample-hydrogel (UCST) complex

상기 실시예 1에서 LCST 하이드로겔 단량체 대신 UCST 하이드로겔 단량체인 포베타인 ([2- (메타 크릴로 일옥시) 에틸] 디메틸-(3- 설포 프로필) 암모늄 하이드록사이드)(sulfobetaine ([2-(methacryloyloxy)ethyl]dimethyl- (3-sulfopropyl) ammonium hydroxide)) 을 단량체를 사용하는 방법 이외에 같은 방법으로 생체시료-하이드로겔 복합체를 제조하였다.In Example 1, instead of the LCST hydrogel monomer, the UCST hydrogel monomer fobetaine ([2- (methacryloyloxy) ethyl] dimethyl-(3-sulfopropyl) ammonium hydroxide) (sulfobetaine ([2-( A biological sample-hydrogel complex was prepared by the same method other than the method using methacryloyloxy)ethyl]dimethyl- (3-sulfopropyl) ammonium hydroxide)) as a monomer.

실시예 7: 생체시료-하이드로겔(UCST) 복합체 온도에 따른 팽창 수축 확인Example 7: Confirmation of expansion and contraction according to the temperature of the biological sample-hydrogel (UCST) complex

상기 실시예 6에서 제조한 세포-하이드로젤 복합체(UCST)를 20℃ 내지 70℃각각의 온도에서 3시간 이상 보관하여 온도별 크기를 관찰하였다.The cell-hydrogel complex (UCST) prepared in Example 6 was stored at each temperature of 20°C to 70°C for 3 hours or more to observe the size of each temperature.

도 7에서 나타난 바와 같이, 온도가 낮아질수록 하이드로젤의 크기가 작아지고 온도가 상승할수록 팽창하여 반복적으로 부피를 조절할 수 있음을 확인하였다.As shown in FIG. 7 , as the temperature decreased, the size of the hydrogel decreased, and as the temperature increased, it expanded and it was confirmed that the volume could be repeatedly adjusted.

실시예 8: 생체시료-하이드로겔(UCST) 복합체 현미경 관찰 실험Example 8: Biological sample-hydrogel (UCST) complex microscopic observation experiment

상기 실시예 6에서 제조한 세포-하이드로젤 복합체(UCST)를 Hoechst 33342을 이용하여 핵을 염색하고 항체를 이용해 염색한 미세소관을 공초점 현미경(Zeiss LSM 880)을 이용하여 세포 조직을 관찰하였다.The cell-hydrogel complex (UCST) prepared in Example 6 was stained with a nucleus using Hoechst 33342, and the microtubules stained with an antibody were observed using a confocal microscope (Zeiss LSM 880).

도 8에서 나타난 바와 같이, UCST 하이드로젤이 고온에서 직선방향으로 2배 이상 팽창됨을 확인하였다. 핵과 미세소관을 염색하여 세포를 하이드로젤에 포매하였고, 이를 공초점 현미경으로 이미징 하였을 때 저온에서 1.11 배의 팽창률을 보인 반면, 온도를 올려 젤을 팽창시켰을 시 2.25배의 팽창된 이미지를 얻을 수 있는 것을 확인하였다.As shown in FIG. 8 , it was confirmed that the UCST hydrogel expanded more than twice in the linear direction at high temperature. Cells were embedded in hydrogel by staining nuclei and microtubules, and when imaged with a confocal microscope, the expansion rate was 1.11 times at low temperature, whereas when the temperature was raised to expand the gel, a 2.25 times expanded image was obtained. confirmed that.

실시예 9: 생체시료-하이드로겔(UCST) 복합체 왜곡도 실험Example 9: Biological sample-hydrogel (UCST) complex distortion experiment

상기 실시예 6에서 제조한 생체-하이드로젤 복합체(UCST)를 각 온도에서 생물조직의 뒤틀림 정도를 원래의 세포와 비교하였다.The degree of distortion of the biological tissue of the bio-hydrogel complex (UCST) prepared in Example 6 at each temperature was compared with that of the original cells.

도 9에서 나타난 바와 같이, 저온과 고온에서의 얻어진 이미지는 계산을 통해 3% 근처(저온 약 3.1%, 고온 약 2.7%)의 왜곡도를 보임을 확인하였고, 각 온도에 따른 세포 팽창을 관찰할 수 있음을 실험적으로 증명한 것을 확인하였다.As shown in Fig. 9, it was confirmed that the obtained images at low and high temperature showed distortion of around 3% (about 3.1% at low temperature, about 2.7% at high temperature) through calculation, and cell expansion according to each temperature was observed. It has been confirmed experimentally that it can be

본 발명의 실시예 1 내지 실시예 9를 종합하면, LCST와 UCST 하이드로젤을 통해 온도에 따른 생체 분자의 면적 차이를 확인함으로써 기존의 팽창에 집중한 하이드로젤에 새로운 개념을 도입하여 하이드로젤의 수축과 팽창이 생체 조직의 수축과 팽창된 이미지를 얻는 기술에 가역적으로 가능함을 확인하였다.Combining Examples 1 to 9 of the present invention, by confirming the area difference of biomolecules according to temperature through the LCST and UCST hydrogels, a new concept is introduced to the hydrogel focused on the existing expansion, and the contraction of the hydrogel It was confirmed that over-expansion is reversibly possible with the technique of obtaining the contracted and expanded image of living tissue.

본 발명의 실시예를 이용하여 뇌를 비롯한 동물의 다양한 조직에 확장 적용이 가능하고, 수축/팽창된 크기에 따른 이미징의 장점뿐만 아니라 물리적 자극으로의 하이드로젤 수축/팽창을 이용해 물질 수송 부분을 개선효과를 제공할 수 있음을 확인하였다.By using the embodiment of the present invention, it is possible to extend the application to various tissues of animals including the brain, and improve the material transport part by using the hydrogel contraction/expansion with physical stimulation as well as the advantage of imaging according to the contracted/expanded size It was confirmed that it can provide an effect.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.From the above description, those skilled in the art to which the present invention pertains will understand that the present invention may be embodied in other specific forms without changing the technical spirit or essential characteristics thereof. In this regard, it should be understood that the embodiments described above are illustrative in all respects and not restrictive. The scope of the present invention should be construed as being included in the scope of the present invention, rather than the above detailed description, all changes or modifications derived from the meaning and scope of the following claims and their equivalents.

Claims (16)

생체시료; 및
상기 생체시료를 포매한 하이드로겔;을 포함하고,
상기 하이드로겔은 미리 결정된 온도 범위에서 온도의 변화에 따라 가역적으로 팽창 또는 수축하는 온도 감응성 하이드로겔이고,
상기 생체시료는 상기 하이드로겔과 중합되어 공유결합으로 연결되고,
상기 하이드로겔은 N-이소프로필 아크릴아미드와 적어도 1종 이상의 알킬 아크릴아미드를 단량체로 포함하거나, 설포베테인 아크릴레이트, 카복시베테인 아크릴레이트 및 포스포베테인 아크릴레이트와 같은 쌍극성 물질을 단량체로 포함하는 중합체인, 생체시료-하이드로겔 복합체.
biological sample; and
Including; hydrogel in which the biological sample is embedded,
The hydrogel is a temperature-sensitive hydrogel that reversibly expands or contracts according to a change in temperature in a predetermined temperature range,
The biological sample is polymerized with the hydrogel and connected by a covalent bond,
The hydrogel comprises N-isopropyl acrylamide and at least one kind of alkyl acrylamide as a monomer, or a bipolar material such as sulfobetaine acrylate, carboxybethane acrylate and phosphobetane acrylate as a monomer which is a polymer, a biological sample-hydrogel complex.
 제1항에 있어서,
상기 생체시료는 세포 또는 조직인 것인, 생체시료-하이드로겔 복합체.
According to claim 1,
The biological sample is a cell or tissue, a biological sample-hydrogel complex.
 제1항에 있어서,
상기 온도감응성 하이드로겔은 미리결정된 온도 범위에서 온도 증가에 따라 팽창하는 UCST(upper critical solution temperature) 유형의 하이드로겔 또는 온도 감소에 따라 팽창하는 LCST(lower critical solution temperature) 유형의 하이드로겔인 것인, 생체시료-하이드로겔 복합체.
According to claim 1,
The temperature-sensitive hydrogel is a UCST (upper critical solution temperature) type of hydrogel that expands with an increase in temperature in a predetermined temperature range or an LCST (lower critical solution temperature) type of hydrogel that expands with a decrease in temperature. A biological sample-hydrogel complex.
 제1항에 있어서,
상기 미리 결정된 온도는 0℃ 내지 80℃인 것인, 생체시료-하이드로겔 복합체.
According to claim 1,
The predetermined temperature is 0 ℃ to 80 ℃, the biological sample-hydrogel complex.
 제1항에 있어서,
상기 생체시료-하이드로겔 복합체는 하이드로겔의 종류에 따라 선택적으로 온도를 증가 또는 감소시킴으로써 상기 생체시료-하이드로겔 복합체를 팽창시켜 생체시료를 이미징하는 용도인 것인, 생체시료-하이드로겔 복합체.
According to claim 1,
The biological sample-hydrogel complex selectively increases or decreases the temperature depending on the type of hydrogel, thereby expanding the biological sample-hydrogel complex to image the biological sample, the biological sample-hydrogel complex.
 제5항에 있어서,
상기 팽창된 복합체는 온도를 역으로 조절하여 팽창된 복합체를 원상태로 수축시키는 것인, 생체시료-하이드로겔 복합체.
6. The method of claim 5,
The expanded complex is a biological sample-hydrogel complex, which shrinks the expanded complex to its original state by reversely controlling the temperature.
 생체시료를 염색하는 단계;
상기 염색된 생체시료를 전처리하는 단계; 및
상기 전처리된 생체시료를 하이드로겔 단량체와 중합하여 하이드로겔을 제공하는 단계를 포함하고,
상기 생체시료는 상기 하이드로겔과 중합되어 공유결합으로 연결되고,
상기 하이드로겔은 N-이소프로필 아크릴아미드와 적어도 1종 이상의 알킬 아크릴아미드를 단량체로 포함하거나, 설포베테인 아크릴레이트, 카복시베테인 아크릴레이트 및 포스포베테인 아크릴레이트와 같은 쌍극성 물질을 단량체로 포함하는 중합체인, 생체시료-하이드로겔 복합체 제조방법.
staining the biological sample;
pre-treating the dyed biological sample; and
Comprising the step of polymerizing the pre-treated biological sample with a hydrogel monomer to provide a hydrogel,
The biological sample is polymerized with the hydrogel and connected by a covalent bond,
The hydrogel comprises N-isopropyl acrylamide and at least one kind of alkyl acrylamide as a monomer, or a bipolar material such as sulfobetaine acrylate, carboxybethane acrylate and phosphobetane acrylate as a monomer which is a polymer, a biological sample-hydrogel complex manufacturing method.
 제7항에 있어서,
상기 생체시료는 배양세포, 조직으로부터 분리된 세포 또는 생체조직인 것인, 생체시료-하이드로겔 복합체 제조방법.
8. The method of claim 7,
The biological sample is a cultured cell, a cell or a biological tissue separated from a tissue, a biological sample-hydrogel complex manufacturing method.
 제7항에 있어서,
상기 생체시료-하이드로겔 복합체는 미리 결정된 온도에 따라 가역적 팽창수축으로 생체조직을 이미징하는 용도인 것인, 생체시료-하이드로겔 복합체 제조방법.
8. The method of claim 7,
The biological sample-hydrogel complex is for the purpose of imaging a living tissue by reversible expansion and contraction according to a predetermined temperature, a biological sample-hydrogel complex manufacturing method.
 제7항에 있어서,
상기 하이드로겔은 미리 결정된 온도 범위에서 온도의 변화에 따라 가역적으로 팽창 또는 수축하는 온도 감응성 하이드로겔인 것인, 생체시료-하이드로겔 복합체 제조방법.
8. The method of claim 7,
The hydrogel is a temperature-sensitive hydrogel that reversibly expands or contracts according to a change in temperature in a predetermined temperature range, a biological sample-hydrogel complex manufacturing method.
 제10항에 있어서,
상기 미리 결정된 온도는 0℃ 내지 80℃인 것인, 생체시료-하이드로겔 복합체 제조방법.
11. The method of claim 10,
The predetermined temperature is 0 ℃ to 80 ℃, a biological sample-hydrogel complex manufacturing method.
 제7항에 있어서,
상기 하이드로겔 단량체는 아크릴아미드(acrylamide), N-tert-부틸 아크릴 아미드(N-tert-butyl acrylamide), N,N-디에틸아크릴아미드(N,N-diethylacrylamide), N-에틸아크릴아미드(N-ethylacrylamide), N-n-프로필아크릴아미드(N-n-propylacrylamide), N,N-에틸메틸아크릴아미드(N,N-ethylmethylacrylamide), N-이소프로필메타크릴아미드(N-isopropylmethacrylamide), N-하이드록시에틸아크릴아미드(N-hydroxyethylacrylamide), N-(이소부톡시메틸)아크릴아미드(N-(isobutoxymethyl)acrylamide), N-털트-부틸메타크릴아미드(N-tert-butyl methacrylamide), N,N-디에틸메타크릴아미드(N,N-diethylmethacrlamide), N-에틸메티크릴아미드(N-ethylmethacrylamide), 설포베테인 메타크릴레이트(sulfobetainemethacrylate), 설포베테인아크릴레이트 (sulfobetaineacrylate), 카복시베테인메타크릴레이트(carboxybetaine methacrylate), 카복시베테인아크릴레이트(carboxybetaineacrylate), 포스포베테인메타크릴레이트(phosphobetainemethacrylate), 포스포베테인 아크릴레이트(phosphobetaineacrylate), ([2-(메타크릴로일옥시)에틸]디메틸-(3-설포프로필)암모늄하이드록사이드)(sulfobetaine([2-(methacryloyloxy)ethyl]dimethyl-(3-sulfopropyl)ammoniumhydroxide)), 아크릴산(acrylic acid) 및 N-비닐아세트아미드(N-vinylacetamide)로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상을 더 포함하는, 생체시료-하이드로겔 복합체 제조방법.
8. The method of claim 7,
The hydrogel monomer is acrylamide (acrylamide), N-tert-butyl acrylamide (N-tert-butyl acrylamide), N,N-diethylacrylamide (N,N-diethylacrylamide), N-ethyl acrylamide (N -ethylacrylamide), Nn-propylacrylamide (Nn-propylacrylamide), N,N-ethylmethylacrylamide (N,N-ethylmethylacrylamide), N-isopropylmethacrylamide, N-hydroxyethylacrylamide Amide (N-hydroxyethylacrylamide), N- (isobutoxymethyl) acrylamide (N- (isobutoxymethyl) acrylamide), N-tert-butyl methacrylamide (N-tert-butyl methacrylamide), N, N-diethyl methacryl Amide (N,N-diethylmethacrlamide), N-ethylmethacrylamide (N-ethylmethacrylamide), sulfobetainemethacrylate, sulfobetaineacrylate, carboxybetaine methacrylate , carboxybetaineacrylate, phosphobetainemethacrylate, phosphobetaineacrylate, ([2-(methacryloyloxy)ethyl]dimethyl-(3-sulfopropyl) Ammonium hydroxide) (sulfobetaine([2-(methacryloyloxy)ethyl]dimethyl-(3-sulfopropyl)ammoniumhydroxide)), one selected from the group consisting of acrylic acid and N-vinylacetamide Further comprising the above, a biological sample-hydrogel complex manufacturing method.
 제7항에 있어서,
상기 하이드로겔 단량체와 중합하는 단계는 개시제 및 가교제를 추가로 포함하여 수행하는 것인, 생체시료-하이드로겔 복합체 제조방법.
8. The method of claim 7,
The step of polymerizing with the hydrogel monomer is to be performed by additionally comprising an initiator and a crosslinking agent, a biological sample-hydrogel complex manufacturing method.
 제13항에 있어서,
상기 가교제는 비스아크릴아미드(bisacrylamide), 디펜타에리트리톨 펜타아크릴레이트, 디펜타에리트리톨 헥사아크릴레이트, 에틸렌글리콜 디아크렐레이트, 에틸렌글리콜 디메타크릴레이트, 알릴 메타크릴레이트, 아세토아세톡시에틸 메타크릴레이트, 이소시아나토에틸 메타크릴레이트, 이소부틸메타크릴레이트 또는 노르말부틸메타크릴레이트를 포함하는 것인, 생체시료-하이드로겔 복합체 제조방법.
14. The method of claim 13,
The crosslinking agent is bisacrylamide, dipentaerythritol pentaacrylate, dipentaerythritol hexaacrylate, ethylene glycol diacrylate, ethylene glycol dimethacrylate, allyl methacrylate, acetoacetoxyethyl methacrylate Late, isocyanatoethyl methacrylate, isobutyl methacrylate or normal butyl methacrylate, including a biological sample-hydrogel complex manufacturing method.
 제13항에 있어서,
상기 개시제는 과황산암모늄(APS:ammonium persulfate), 포타슘 퍼설페이트(potassiumpersulfate;KPS) 또는 수용성 아조 개시제(WatersolubleAzoinitiators)를 포함하는 것인, 생체시료-하이드로겔 복합체 제조방법.
14. The method of claim 13,
The initiator is ammonium persulfate (APS: ammonium persulfate), potassium persulfate (potassium persulfate; KPS) or water-soluble azo initiators (Watersoluble Azoinitiators) to include a biological sample-hydrogel complex manufacturing method.
 생체시료 이미징 방법:
복합체를 준비하는 제 1단계
상기 복합체에 포함된 하이드로겔이 LCST 유형의 고분자인 경우 온도를 증가 또는 감소시켜 생체시료를 팽창시키는 제 2-1단계
상기 복합체에 포함된 하이드로겔이 UCST 유형의 고분자인 경우 온도를 감소 또는 증가시켜 생체시료를 팽창시키는 제 2-2단계
상기 2-1 단계 또는 상기 2-2 단계 이후 광학현미경으로 관찰하는 제3단계를 포함하고,
상기 생체시료는 상기 하이드로겔과 중합되어 공유결합으로 연결되고,
상기 하이드로겔은 N-이소프로필 아크릴아미드와 적어도 1종 이상의 알킬 아크릴아미드를 단량체로 포함하거나, 설포베테인 아크릴레이트, 카복시베테인 아크릴레이트 및 포스포베테인 아크릴레이트와 같은 쌍극성 물질을 단량체로 포함하는 중합체인, 중합체이다.


Methods for imaging biological samples:
First step to prepare the complex
When the hydrogel included in the complex is an LCST type polymer, the 2-1 step of increasing or decreasing the temperature to expand the biological sample
When the hydrogel included in the complex is a UCST-type polymer, the second step 2-2 of reducing or increasing the temperature to expand the biological sample
and a third step of observing with an optical microscope after step 2-1 or step 2-2,
The biological sample is polymerized with the hydrogel and connected by a covalent bond,
The hydrogel comprises N-isopropyl acrylamide and at least one kind of alkyl acrylamide as a monomer, or a bipolar material such as sulfobetaine acrylate, carboxybethane acrylate and phosphobetane acrylate as a monomer It is a polymer that is a polymer that does.
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