KR102363980B1 - Biomarker for diagnosis or prognosis analysis of brain metastasis and diagnosis method using same - Google Patents
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Abstract
본 발명은 전이성 뇌종양의 진단 또는 예후 분석용 바이오마커 및 이를 이용한 진단방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 뇌종양의 진단 또는 예후 분석용 바이오마커는 전이성 뇌종양의 진단 및 재발 예후 예측을 정확하게 분석할 수 있다.The present invention relates to a biomarker for diagnosis or prognosis analysis of metastatic brain tumor and a diagnostic method using the same, and the biomarker for diagnosis or prognosis analysis of brain tumor according to the present invention can accurately analyze the diagnosis of metastatic brain tumor and prediction of recurrence .
Description
본 발명은 전이성 뇌종양의 진단 또는 예후 분석용 바이오마커 및 이를 이용한 진단방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 전이성 뇌종양의 암 관련 섬유아세포에서 발현되는 α-SMA, FAPα, S100A4/FSP1, PDGFR-α, PDGFR-β, Collagen type I, NG2, Tenascin-C 및 Twist1와 특이적으로 결합하는 제제를 포함하는 조성물 및 이를 이용한 전이성 뇌종양의 진단 및 예후를 분석하는 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a biomarker for diagnosis or prognosis analysis of metastatic brain tumor and a diagnostic method using the same, and more particularly, α-SMA, FAPα, S100A4/FSP1, PDGFR-α expressed in cancer-related fibroblasts of metastatic brain tumor, To a composition comprising an agent that specifically binds to PDGFR-β, Collagen type I, NG2, Tenascin-C and Twist1, and a method for analyzing the diagnosis and prognosis of metastatic brain tumor using the same.
최근, 화학치료제, 표적치료제 및 면역치료제 등 다양한 항암치료제의 개발과 예후 예측을 위한 진단 키트의 개발에도 불구하고 여전히 항암치료 반응을 보지 못하는 환자가 많다. 암 환자들의 예후 예측을 위한 기존의 키트는 주로 암 조직 자체에 초점이 맞춰져 있으나, 예후 분석의 정확도가 떨어지고 전이 및 재발 가능성을 정확하게 예측하기 어려운 문제가 존재하는 상황이다. Recently, despite the development of various anticancer drugs such as chemotherapeutic agents, targeted therapies, and immunotherapeutic agents and the development of diagnostic kits for predicting prognosis, there are still many patients who do not see a response to chemotherapy. Existing kits for predicting the prognosis of cancer patients mainly focus on the cancer tissue itself, but there are problems in that the accuracy of prognosis analysis is low and it is difficult to accurately predict the possibility of metastasis and recurrence.
암세포는 체내의 면역세포와 주변 미세환경을 자신에게 유리하도록 조절하는 능력을 가지고 있다. 암을 둘러싼 종양미세환경에는 크게 항종양 (anti-tumor) 면역세포와 종양촉진 (pro-tumor) 면역억제세포가 존재하고, 암세포는 '면역억제 스위칭 (immunosuppressive switching)' 기전을 통해 면역억제세포의 분화와 분획을 증가시켜 암의 진행과 전이를 촉진한다. 면역억제세포에는 대표적으로 암 관련 섬유아세포 (cancer-associated fibroblasts; CAF), M2-like 종양연관대식세포 (tumor-associated macrophages; TAM) 및 골수유래면역억제세포 (myeloid derived suppressor cell; MDSC) 등이 있다. Cancer cells have the ability to regulate the immune cells and surrounding microenvironment in the body to be beneficial to them. In the tumor microenvironment surrounding cancer, there are largely anti-tumor immune cells and pro-tumor immunosuppressive cells. It promotes cancer progression and metastasis by increasing differentiation and fractionation. Examples of immunosuppressive cells include cancer-associated fibroblasts (CAF), M2-like tumor-associated macrophages (TAM), and myeloid derived suppressor cell (MDSC). have.
한편, 최근 암의 진행에는 암세포뿐 아니라 주변의 종양미세환경 또한 매우 중요한 것으로 알려졌으며, 이에 따라, 암 환자들의 예후 예측 검사를 위해 암을 둘러싼 종양미세환경 구성 세포 및 이의 특이적 발현 분자를 활용한 신규 바이오마커의 개발이 중요한 실정이다.Meanwhile, it is known that not only cancer cells but also the surrounding tumor microenvironment are very important in the progression of cancer. The development of new biomarkers is an important situation.
이에 본 발명자들은 전이성 뇌종양의 진단 및 재발 예후 예측을 정확하게 분석할 수 있는 신규한 바이오마커를 발굴하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과 α-SMA, FAPα, S100A4/FSP1, PDGFR-α, PDGFR-β, Collagen type I, NG2, Tenascin-C 및 Twist1가 전이성 뇌종양의 종양미세환경 내 암 관련 섬유아세포 (cancer-associated fibroblasts; CAF)에서 발현됨을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다. Accordingly, the present inventors made intensive research efforts to discover novel biomarkers that can accurately analyze the diagnosis of metastatic brain tumor and prediction of recurrence prognosis. As a result, α-SMA, FAPα, S100A4/FSP1, PDGFR-α, PDGFR-β, Collagen type I, NG2, Tenascin-C and Twist1 were found to be cancer-associated fibroblasts (CAF) in the tumor microenvironment of metastatic brain tumors. ) to complete the present invention by confirming that it is expressed in
이에, 본 발명의 목적은, 전이성 뇌종양의 진단 또는 예후 분석용 조성물을 제공하는 것이다.Accordingly, it is an object of the present invention to provide a composition for diagnosis or prognosis analysis of metastatic brain tumor.
본 발명의 다른 목적은, 전이성 뇌종양의 진단 또는 예후 분석용 키트를 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a kit for diagnosis or prognosis analysis of metastatic brain tumor.
본 발명의 다른 목적은, 전이성 뇌종양의 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a method for providing information necessary for the diagnosis of metastatic brain tumor.
본 발명은 전이성 뇌종양의 진단 또는 예후 분석용 바이오마커 및 이를 이용한 진단방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 뇌종양의 진단 또는 예후 분석용 바이오마커는 전이성 뇌종양의 진단 및 재발 예후 예측을 정확하게 분석할 수 있다.The present invention relates to a biomarker for diagnosis or prognosis analysis of metastatic brain tumor and a diagnostic method using the same, and the biomarker for diagnosis or prognosis analysis of brain tumor according to the present invention can accurately analyze the diagnosis of metastatic brain tumor and prediction of recurrence .
본 발명자들은 이에 전이성 뇌종양 주변의 암 관련 섬유아세포 (cancer-associated fibroblasts; CAFs)에서 발현된 α-SMA, FAPα, S100A4/FSP1, PDGFR-α, PDGFR-β, Collagen type I, NG2, Tenascin-C 및 Twist1의 발현수준과 전이성 뇌종양의 예후 사이에 유의적인 상관관계가 있음을 확인하였다.The present inventors thus found that α-SMA, FAPα, S100A4/FSP1, PDGFR-α, PDGFR-β, Collagen type I, NG2, Tenascin-C expressed in cancer-associated fibroblasts (CAFs) around metastatic brain tumors And it was confirmed that there is a significant correlation between the expression level of Twist1 and the prognosis of metastatic brain tumor.
본 발명의 일 양태는 전이성 뇌종양의 암 관련 섬유아세포에서 발현된 마커와 특이적으로 결합하는 제제를 포함하는 전이성 뇌종양의 진단 또는 예후 분석용 조성물이다.One aspect of the present invention is a composition for diagnosis or prognosis analysis of metastatic brain tumor, comprising an agent that specifically binds to a marker expressed in cancer-related fibroblasts of metastatic brain tumor.
본 명세서 상의 용어 “전이성 뇌종양”은 신체의 다른 부위에 생긴 암이 뇌로 전이되어 발생한 종양으로서, 원발성 장기인 유방, 직결장, 신장, 간, 폐, 흑색종, 위 등에서 발생한 암이 뇌에 전이되어 발생한 종양을 의미한다.As used herein, the term “metastatic brain tumor” refers to a tumor caused by metastasis of cancer in other parts of the body to the brain. refers to the tumor that has arisen.
본 명세서 상의 용어 “암 관련 섬유아세포”는 암의 내부 또는 암의 주변 미세환경에 존재하여, 암 주변 환경을 조절하고 구성하는 섬유아세포를 의미하는 것으로, 다양한 암 기질 내의 두드러진 세포 유형을 의미한다. 또한, 본 명세서 상의 용어 “암 관련 섬유아세포”는 본 발명의 목적을 고려하여 전이성 뇌종양의 내부 또는 주변 미세환경에 존재하는 전이성 뇌종양의 암 관련 섬유아세포를 의미한다.As used herein, the term “cancer-associated fibroblasts” refers to fibroblasts that exist in cancer or in the surrounding microenvironment of the cancer, regulate and constitute the cancer surrounding environment, and refer to prominent cell types in various cancer stroma. In addition, the term “cancer-associated fibroblasts” as used herein refers to cancer-related fibroblasts of a metastatic brain tumor that exist in the microenvironment inside or around the metastatic brain tumor in consideration of the purpose of the present invention.
본 명세서 상의 용어 "마커(marker)"는 전이성 뇌종양 질환을 가진 개체를 정상군 개체와 구분하여 진단할 수 있는 물질로, 전이성 뇌종양 질환을 갖는 개체에서 증가 또는 감소를 보이는 폴리펩티드, 단백질 또는 핵산, 지질, 당지질, 당단백질 또는 당 등과 같은 유기 생체 분자들을 모두 포함할 수 있고, 예를 들어, 전이성 뇌종양 질환을 갖는 개체에서 발현이 증가되는 단백질일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.As used herein, the term "marker" refers to a substance capable of diagnosing an individual with metastatic brain tumor disease by distinguishing it from a normal group individual, and a polypeptide, protein or nucleic acid, lipid showing an increase or decrease in an individual with metastatic brain tumor disease. , may include all organic biomolecules such as glycolipids, glycoproteins, or sugars, and may be, for example, proteins whose expression is increased in individuals with metastatic brain tumor disease, but is not limited thereto.
본 발명에 있어서 마커는 전이성 뇌종양 질환을 갖는 개체의 암 관련 섬유아세포에서 증가되는 단백질 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.In the present invention, the marker may be a protein that is increased in cancer-related fibroblasts of individuals with metastatic brain tumor disease, but is not limited thereto.
본 발명에 있어서 마커는 α-SMA (Alpha-smooth muscle actin), FAPα (Fibroblast activation protein alpha), S100A4/FSP1 (Fibroblast-specific protein 1), PDGFR-α (platelet-derived growth factor receptor A), PDGFR-β (Platelet-derived growth factor receptor beta), Collagen type I, NG2 (Neuron-glial antigen 2), Tenascin-C 및 Twist1 (Twist-related protein 1)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것일 수 있다.In the present invention, the markers are α-SMA (Alpha-smooth muscle actin), FAPα (Fibroblast activation protein alpha), S100A4/FSP1 (Fibroblast-specific protein 1), PDGFR-α (platelet-derived growth factor receptor A), PDGFR -β (Platelet-derived growth factor receptor beta), Collagen type I, NG2 (Neuron-glial antigen 2), Tenascin-C, and Twist1 (Twist-related protein 1) may be at least one selected from the group consisting of.
본 발명의 일 구현예에서, 마커는 α-SMA, FAPα, S100A4/FSP1, PDGFR-α, PDGFR-β, Collagen type I, NG2, Tenascin-C 및 Twist1일 수 있다.In one embodiment of the present invention, the marker may be α-SMA, FAPα, S100A4/FSP1, PDGFR-α, PDGFR-β, Collagen type I, NG2, Tenascin-C and Twist1.
본 발명의 일 구현예에서, 마커는 α-SMA, FAPα, S100A4/FSP1, PDGFR-α, PDGFR-β, Collagen type I, NG2, Tenascin-C 및 Twist1로 이루어진 군에서 선택된 둘 이상인 것일 수 있으며, 예를 들어, PDGFR-β 및 α-SMA일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.In one embodiment of the present invention, the marker may be two or more selected from the group consisting of α-SMA, FAPα, S100A4/FSP1, PDGFR-α, PDGFR-β, Collagen type I, NG2, Tenascin-C and Twist1, For example, it may be PDGFR-β and α-SMA, but is not limited thereto.
본 발명의 일 구현예에서, 마커는 α-SMA, FAPα, S100A4/FSP1, PDGFR-α, PDGFR-β, Collagen type I, NG2, Tenascin-C 및 Twist1로 이루어진 군에서 선택된 세개의 것일 수 있으며, 예를 들어, PDGFR-β, α-SMA, FAP-α일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.In one embodiment of the present invention, the marker may be three selected from the group consisting of α-SMA, FAPα, S100A4/FSP1, PDGFR-α, PDGFR-β, Collagen type I, NG2, Tenascin-C and Twist1, For example, it may be PDGFR-β, α-SMA, FAP-α, but is not limited thereto.
본 발명의 일 구현예에서, 마커는 α-SMA, FAPα, S100A4/FSP1, PDGFR-α, PDGFR-β, Collagen type I, NG2, Tenascin-C 및 Twist1로 이루어진 군에서 선택된 셋 이상인 것일 수 있으며, 예를 들어, PDGFR-β, α-SMA, FAP-α, S100A4/FSP1, collagen I 및 twist1일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.In one embodiment of the present invention, the marker may be three or more selected from the group consisting of α-SMA, FAPα, S100A4/FSP1, PDGFR-α, PDGFR-β, Collagen type I, NG2, Tenascin-C and Twist1, For example, it may be PDGFR-β, α-SMA, FAP-α, S100A4/FSP1, collagen I and twist1, but is not limited thereto.
본 발명에 있어서 제제는 항체 또는 앱타머를 포함하는 것일 수 있다.In the present invention, the formulation may include an antibody or an aptamer.
본 발명에 있어서 항체 또는 앱타머는, α-SMA, FAPα, S100A4/FSP1, PDGFR-α, PDGFR-β, Collagen type I, NG2, Tenascin-C 및 Twist1로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상과 각각 특이적으로 결합하는 것일 수 있다.In the present invention, the antibody or aptamer is specific to one or more selected from the group consisting of α-SMA, FAPα, S100A4/FSP1, PDGFR-α, PDGFR-β, Collagen type I, NG2, Tenascin-C and Twist1, respectively. may be combined with
본 명세서 상의 용어 “항체”는, 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미하는 것으로, 본 발명의 목적상 마커 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미할 수 있으며, 다클론 항체, 단클론 항체, 재조합 항체 및 항원 결합성을 갖는 것이면 그것의 일부도 모두 포함할 수 있다. 또한 본 발명의 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함할 수 있다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, 예를 들어, Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.As used herein, the term “antibody” refers to a specific protein molecule directed against an antigenic site, and for the purpose of the present invention, may refer to an antibody that specifically binds to a marker protein, polyclonal antibody, Monoclonal antibodies, recombinant antibodies, and parts thereof as long as they have antigen-binding properties may be included. In addition, the antibody of the present invention may include a functional fragment of an antibody molecule as well as a complete form having two full-length light chains and two full-length heavy chains. A functional fragment of an antibody molecule refers to a fragment having at least an antigen-binding function, and may be, for example, Fab, F(ab'), F(ab') 2 and Fv, but is not limited thereto.
본 발명에 따른 항체는 당업계에 널리 공지된 기술에 따라 생산될 수 있으며, 다클론 또는 단클론 항체로 생산될 수 있다. 다클론 항체는 α-SMA, FAPα, S100A4/FSP1, PDGFR-α, PDGFR-β, Collagen type I, NG2, Tenascin-C 또는 Twist1을 동물에 주사하고, 동물로부터 채혈한 혈청을 수득하는 공지된 방법에 따라 생산할 수 있다. 단클론 항체는 당업계에 널리 공지된 방법인 하이브리도마 방법 또는 파지 항체 라이브러리 기술을 이용하여 제조될 수 있다.The antibody according to the present invention may be produced according to a technique well known in the art, and may be produced as a polyclonal or monoclonal antibody. Polyclonal antibodies are prepared by injecting α-SMA, FAPα, S100A4/FSP1, PDGFR-α, PDGFR-β, Collagen type I, NG2, Tenascin-C or Twist1 into an animal, and a known method for obtaining blood serum from the animal. can be produced according to Monoclonal antibodies can be prepared using a hybridoma method or a phage antibody library technology, which are methods well known in the art.
본 발명의 일 구현예에서, α-SMA에 특이적으로 결합하는 항체는 Abcam. catalogue no. ab5694 일 수 있다.In one embodiment of the present invention, the antibody specifically binding to α-SMA is Abcam. catalog no. ab5694.
본 발명의 일 구현예에서, FAPα에 특이적으로 결합하는 항체는 R&D. catalogue no. AF3715 일 수 있다.In one embodiment of the present invention, the antibody that specifically binds to FAPα is R&D. catalog no. It could be AF3715.
본 발명의 일 구현예에서, S100A4/FSP1에 특이적으로 결합하는 항체는 Atlas. catalogue no. HPA007973 일 수 있다.In one embodiment of the present invention, the antibody that specifically binds to S100A4/FSP1 is Atlas. catalog no. It may be HPA007973.
본 발명의 일 구현예에서, PDGFR-α에 특이적으로 결합하는 항체는 Santa Cruz. catalogue no. sc398206 일 수 있다.In one embodiment of the present invention, the antibody that specifically binds to PDGFR-α is Santa Cruz. catalog no. It can be sc398206.
본 발명의 일 구현예에서, PDGFR-β에 특이적으로 결합하는 항체는 Abcam. catalogue no. ab32570 일 수 있다.In one embodiment of the present invention, the antibody specifically binding to PDGFR-β is Abcam. catalog no. It can be ab32570.
본 발명의 일 구현예에서, Collagen type I에 특이적으로 결합하는 항체는 Abcam. catalogue no. ab34710 일 수 있다.In one embodiment of the present invention, the antibody specifically binding to collagen type I is Abcam. catalog no. It may be ab34710.
본 발명의 일 구현예에서, NG2에 특이적으로 결합하는 항체는 Abcam. catalogue no. ab139406일 수 있다.In one embodiment of the present invention, the antibody specifically binding to NG2 is Abcam. catalog no. ab139406.
본 발명의 일 구현예에서, Tenascin-C에 특이적으로 결합하는 항체는 Santa Cruz. catalogue no. sc25328 일 수 있다.In one embodiment of the present invention, the antibody specifically binding to Tenascin-C is Santa Cruz. catalog no. It can be sc25328.
본 발명의 일 구현예에서, Twist1에 특이적으로 결합하는 항체는 Abcam. catalogue no. ab50887 일 수 있다. In one embodiment of the present invention, the antibody that specifically binds to Twist1 is Abcam. catalog no. It can be ab50887.
본 발명의 일 구현예에서, α-SMA에 특이적으로 결합하는 항체는 Abcam. catalogue no. ab5694 일 수 있고, FAPα에 특이적으로 결합하는 항체는 R&D. catalogue no. AF3715 일 수 있고, S100A4/FSP1에 특이적으로 결합하는 항체는 Atlas. catalogue no. HPA007973 일 수 있고, PDGFR-α에 특이적으로 결합하는 항체는 Santa Cruz. catalogue no. sc398206 일 수 있고, PDGFR-β에 특이적으로 결합하는 항체는 Abcam. catalogue no. ab32570 일 수 있고, Collagen type I에 특이적으로 결합하는 항체는 Abcam. catalogue no. ab34710 일 수 있고, NG2에 특이적으로 결합하는 항체는 Abcam. catalogue no. ab139406일 수 있고, Tenascin-C에 특이적으로 결합하는 항체는 Santa Cruz. catalogue no. sc25328 일 수 있고, Twist1에 특이적으로 결합하는 항체는 Abcam. catalogue no. ab50887 일 수 있다. In one embodiment of the present invention, the antibody specifically binding to α-SMA is Abcam. catalog no. ab5694, wherein the antibody specifically binding to FAPα is R&D. catalog no. AF3715, the antibody that specifically binds to S100A4/FSP1 is described in Atlas. catalog no. HPA007973, wherein the antibody specifically binding to PDGFR-α is from Santa Cruz. catalog no. sc398206, wherein the antibody specifically binding to PDGFR-β is Abcam. catalog no. It may be ab32570, and the antibody specifically binding to collagen type I is Abcam. catalog no. It may be ab34710, and the antibody specifically binding to NG2 is Abcam. catalog no. ab139406, the antibody that specifically binds to Tenascin-C is from Santa Cruz. catalog no. sc25328, and the antibody specifically binding to Twist1 is Abcam. catalog no. It can be ab50887.
본 명세서 상의 용어, "앱타머 (aptamer)"는 20~60 뉴클레오티드 정도의 크기를 갖는 단일가닥 올리고 뉴클레오티드로서, 소정의 표적 분자에 대한 결합 활성을 갖는 핵산 분자를 의미한다. 앱타머는 서열에 따라 다양한 3차원 구조를 가지 며, 항원-항체 반응처럼 특정 물질과 높은 친화력을 가질 수 있다. 앱타머는 소정의 표적 분자에 대하여 결합함으로써, 소정의 표적 분자를 검출하거나 이의 활성을 저해할 수 있다. 본 발명에 있어서 앱타머는 RNA, DNA, 변형된 (modified) 핵산 또는 이들의 혼합물일 수 있으며, 직쇄상 또는 환상의 형태일 수 있다.As used herein, the term “aptamer” refers to a single-stranded oligonucleotide having a size of about 20 to 60 nucleotides, and refers to a nucleic acid molecule having binding activity to a predetermined target molecule. Aptamers have various three-dimensional structures according to their sequences, and can have high affinity with specific substances like antigen-antibody reactions. The aptamer may detect a predetermined target molecule or inhibit its activity by binding to a predetermined target molecule. In the present invention, the aptamer may be RNA, DNA, modified nucleic acid, or a mixture thereof, and may be in a linear or cyclic form.
본 발명의 일 구현예에서, 전이성 뇌종양은 유방, 직결장, 신장, 간, 폐, 흑색종 및 위로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상으로부터 유래된 것일 수 있다.In one embodiment of the present invention, the metastatic brain tumor may be derived from one or more selected from the group consisting of breast, colorectal, kidney, liver, lung, melanoma, and stomach.
본 발명의 다른 양태는 전이성 뇌종양의 암 관련 섬유아세포에서 발현된 마커와 특이적으로 결합하는 제제를 포함하는 전이성 뇌종양의 진단 또는 예후 분석용 키트이다.Another aspect of the present invention is a kit for diagnosis or prognosis analysis of metastatic brain tumor, comprising an agent that specifically binds to a marker expressed in cancer-associated fibroblasts of metastatic brain tumor.
본 발명에 있어서 키트는 전이성 뇌종양의 암 관련 섬유아세포에서 발현된 마커와 특이적으로 결합하는 제제를 포함하는 전이성 뇌종양의 진단 또는 예후 분석용 조성물을 포함할 수 있고, 이에 따라, 조성물 및 키트 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 회피하기 위하여 그 기재를 생략한다.In the present invention, the kit may include a composition for diagnosis or prognosis analysis of metastatic brain tumor, which includes an agent that specifically binds to a marker expressed in cancer-related fibroblasts of metastatic brain tumor, and thus, between the composition and the kit. The description of common content is omitted in order to avoid excessive complexity of the present specification.
본 발명에 있어서 키트는 α-SMA, FAPα, S100A4/FSP1, PDGFR-α, PDGFR-β, Collagen type I, NG2, Tenascin-C 및 Twist1로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 검출할 수 있는 것으로, 마이크로어레이, 앱타머 칩 키트, 엘라이자 (Enzyme linked immunosorbent assay; ELISA) 키트, 블랏팅 (blotting) 키트, 면역침전법 키트, 면역형광검사 키트, 면역염색키트, 단백질 칩 키트 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있다.In the present invention, the kit is capable of detecting one or more selected from the group consisting of α-SMA, FAPα, S100A4/FSP1, PDGFR-α, PDGFR-β, Collagen type I, NG2, Tenascin-C and Twist1, A group consisting of an array, an aptamer chip kit, an enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) kit, a blotting kit, an immunoprecipitation kit, an immunofluorescence assay kit, an immunostaining kit, a protein chip kit, and combinations thereof It may be selected from
본 발명의 일 구현예에서, 키트는 항체의 면역학적 검출을 위하여 기질, 적당한 완충용액, 발색 효소 또는 형광물질로 표지된 2차 항체, 발색 기질 등을 포함할 수 있다. 기질은 니트로셀룰로오스 막, 폴리비닐 수지로 합성된 96 웰 플레이트, 폴리스티렌 수지로 합성된 96 웰 플레이트 및 유리로 된 슬라이드글라스 등이 이용될 수 있다. 발색효소는 퍼옥시다아제 (peroxidase), 알칼라인 포스파타아제 (Alkaline Phosphatase)가 사용될 수 있다. 형광물질은 FITC, RITC 등이 사용될 수 있다. 발색 기질액은 ABTS (2,2'-아지노-비스(3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산)) 또는 OPD (o-페닐렌디아민), TMB (테트라메틸 벤지딘)가 사용될 수 있다. In one embodiment of the present invention, the kit may include a substrate, a suitable buffer, a secondary antibody labeled with a chromogenic enzyme or a fluorescent substance, a chromogenic substrate, and the like for immunological detection of the antibody. As the substrate, a nitrocellulose membrane, a 96-well plate synthesized from polyvinyl resin, a 96-well plate synthesized from polystyrene resin, and glass slide glass may be used. As the chromogenic enzyme, peroxidase and alkaline phosphatase may be used. As the fluorescent material, FITC, RITC, or the like may be used. ABTS (2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)), OPD (o-phenylenediamine), or TMB (tetramethyl benzidine) can be used as a color development substrate solution.
본 발명의 또 다른 양태는 다음 단계를 포함하는 전이성 뇌종양의 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법이다:Another aspect of the present invention is a method for providing information necessary for diagnosis of metastatic brain tumor comprising the steps of:
전이성 뇌종양의 암 관련 섬유아세포를 포함하는 시료를 준비하는 준비 단계;A preparation step of preparing a sample containing cancer-associated fibroblasts of metastatic brain tumor;
상기 암 관련 섬유아세포의 α-SMA, FAPα, S100A4/FSP1, PDGFR-α, PDGFR-β, Collagen type I, NG2, Tenascin-C 및 Twist1로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상의 발현수준을 측정하는 측정 단계.A measuring step of measuring the expression level of one or more selected from the group consisting of α-SMA, FAPα, S100A4/FSP1, PDGFR-α, PDGFR-β, Collagen type I, NG2, Tenascin-C and Twist1 of the cancer-related fibroblasts.
본 발명에 있어서 시료는 전이성 뇌종양 질환을 보유한 개체 또는 전이성 뇌종양 질환이 의심되는 개체로부터 수득한 생물학적 시료일 수 있다.In the present invention, the sample may be a biological sample obtained from an individual having a metastatic brain tumor disease or an individual suspected of having a metastatic brain tumor disease.
본 발명에 있어서 측정 단계는 웨스턴 블랏, 엘라이자 (enzyme linked immunosorbent assay; ELISA), 방사선 면역 분석 (Radioimmunoassay; RIA), 방사 면역 확산법 (radioimmunodiffusion), 오우크테로니 (oucherlony) 면역 확산법, 로케트 (rocket) 면역 전기영동, 면역 조직 화학 염색, 면역 형광 염색, 면역침전 분석법 (Immunoprecipitation assay), 보체 고정 분석법 (complement fixation assay), 유세포 분석 (Fluorescence Activated cell sorter; FACS), 앱타머 칩 (aptamer chip), 마이크로어레이 (microassay), 단백질 칩 (protein chip) 또는 이들의 조합으로 수행될 수 있고, 예를 들어, 면역 조직 화학 염색 또는 면역 형광 염색에 의해 수행될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.In the present invention, the measuring step is Western blot, ELISA (enzyme linked immunosorbent assay; ELISA), radioimmunoassay (RIA), radioimmunodiffusion, oucherlony immune diffusion method, rocket (rocket) ) Immunoelectrophoresis, immunohistochemical staining, immunofluorescence staining, immunoprecipitation assay (Immunoprecipitation assay), complement fixation assay (complement fixation assay), flow cytometry (Fluorescence Activated cell sorter; FACS), aptamer chip, It may be performed using a microarray, a protein chip, or a combination thereof, for example, may be performed by immunohistochemical staining or immunofluorescence staining, but is not limited thereto.
본 발명의 일 구현예에서, 측정단계는 α-SMA, FAPα, S100A4/FSP1, PDGFR-α, PDGFR-β, Collagen type I, NG2, Tenascin-C 및 Twist1로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상과 각각 결합하는 항체 또는 앱타머를 통해 발현수준을 측정하는 것일 수 있다.In one embodiment of the present invention, the measuring step binds to one or more selected from the group consisting of α-SMA, FAPα, S100A4/FSP1, PDGFR-α, PDGFR-β, Collagen type I, NG2, Tenascin-C and Twist1, respectively It may be to measure the expression level through the antibody or aptamer.
본 발명에 있어서 항체 또는 앱타머는 α-SMA, FAPα, S100A4/FSP1, PDGFR-α, PDGFR-β, Collagen type I, NG2, Tenascin-C 및 Twist1로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상과 특이적으로 결합하여 항원-항체 복합체 또는 항원-앱타머 복합체를 형성할 수 있다. 그리고, 항원-항체 복합체 또는 항원-앱타머 복합체의 형성량은 검출 라벨 (detection label)의 시그널의 크기를 통해서 정량적으로 측정할 수 있다.In the present invention, the antibody or aptamer binds specifically to one or more selected from the group consisting of α-SMA, FAPα, S100A4/FSP1, PDGFR-α, PDGFR-β, Collagen type I, NG2, Tenascin-C and Twist1. It can form antigen-antibody complexes or antigen-aptamer complexes. And, the formation amount of the antigen-antibody complex or antigen-aptamer complex can be quantitatively measured through the magnitude of the signal of the detection label.
본 발명에 있어서 검출 라벨은 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자 (microparticle), 레독스 분자 및 방사선 동위원소로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. In the present invention, the detection label may be at least one selected from the group consisting of enzymes, fluorescent substances, ligands, luminescent substances, microparticles, redox molecules, and radioactive isotopes, but is not limited thereto.
검출라벨로 사용되는 효소는 β-글루쿠로니다제, β-D-글루코시다제, β-D-갈락토시다제, 우레아제, 퍼옥시다아제 또는 알칼라인 포스파타아제, 아세틸콜린에스테라제, 글루코즈 옥시다제, 헥소키나제와 GDPase, RNase, 글루코즈 옥시다제와 루시페라제, 포스포프럭토키나제, 포스포에놀피루베이트 카복실라제, 아스파르테이트 아미노 트랜스페라제, 포스페놀피루베이트 데카복실라제, β-라타마제일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 형광물은 FITC, RITC, 플루오레신, 이소티오시아네이트, 로다민, 피코에리테린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, o-프탈데히드, 플루오레스카민일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 리간드는 바이오틴 유도체일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 발광물은 아크리디늄 에스테르, 루시페린, 루시퍼라아제일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 미소입자는 콜로이드 금, 착색된 라텍스가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 레독스 분자는 페로센, 루테늄 착화합물, 바이올로젠, 퀴논, Ti 이온, Cs 이온, 디이미드, 1,4-벤조퀴논, 하이드로퀴논, K4W(CN)8 , [Os(bpy)3]2+ ,[RU(bpy)3]2+, [MO(CN)8]4- 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 방사선동위원소는 3H, 14C, 32P, 35S, 36Cl, 51Cr, 57Co, 58Co, 59Fe, 90Y, 125I, 131I, 186Re일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.Enzymes used as detection labels are β-glucuronidase, β-D-glucosidase, β-D-galactosidase, urease, peroxidase or alkaline phosphatase, acetylcholinesterase, glucose oxy Dase, hexokinase and GDPase, RNase, glucose oxidase and luciferase, phosphofructokinase, phosphoenolpyruvate carboxylase, aspartate aminotransferase, phosphophenolpyruvate decarboxylase, β- It may be latamase, but is not limited thereto. The fluorescent substance may be FITC, RITC, fluorescein, isothiocyanate, rhodamine, phycoerythrine, phycocyanin, allophycocyanin, o-phthalaldehyde, fluorescamine, but is not limited thereto. The ligand may be a biotin derivative, but is not limited thereto. The luminescent material may be an acridinium ester, luciferin, or luciferase, but is not limited thereto. The microparticles include, but are not limited to, colloidal gold and colored latex. Redox molecules are ferrocene, ruthenium complex, viologen, quinone, Ti ion, Cs ion, diimide, 1,4-benzoquinone, hydroquinone, K 4 W(CN) 8 , [Os(bpy) 3 ] 2+ ,[RU(bpy) 3 ] 2+ , [MO(CN) 8 ] 4- may be, but is not limited thereto. The radioisotope may be 3 H, 14 C, 32 P, 35 S, 36 Cl, 51 Cr, 57 Co, 58 Co, 59 Fe, 90 Y, 125 I, 131 I, 186 Re, but is limited thereto no.
본 발명에 따른 측정 단계에서 발현수준은 항원-항체 복합체 또는 항원-앱타머의 복합체의 형성량을 측정함으로써 측정될 수 있고, 항원-항체 복합체 측정은 ELISA법을 이용하여 측정될 수 있다.In the measuring step according to the present invention, the expression level can be measured by measuring the amount of formation of the antigen-antibody complex or antigen-aptamer complex, and the antigen-antibody complex can be measured using an ELISA method.
본 발명의 일 구현예에서, ELISA는 직접적 ELISA, 간접적 ELISA, 직접적 샌드위치 ELISA, 간접적 샌드위치 ELISA일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.In one embodiment of the present invention, the ELISA may be, but is not limited to, direct ELISA, indirect ELISA, direct sandwich ELISA, or indirect sandwich ELISA.
본 발명의 일 구현에에서, 측정 단계는 α-SMA, FAPα, S100A4/FSP1, PDGFR-α, PDGFR-β, Collagen type I, NG2, Tenascin-C 및 Twist1로 이루어진 군에서 선택된 둘 이상의 발현수준을 측정하는 것일 수 있으며, 예를 들어, PDGFR-β 및 α-SMA의 발현수준을 측정하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.In one embodiment of the present invention, the measuring step is the expression level of two or more selected from the group consisting of α-SMA, FAPα, S100A4 / FSP1, PDGFR-α, PDGFR-β, Collagen type I, NG2, Tenascin-C and Twist1 It may be to measure, for example, it may be to measure the expression level of PDGFR-β and α-SMA, but is not limited thereto.
본 발명의 일 구현예에서, 측정 단계는 α-SMA, FAPα, S100A4/FSP1, PDGFR-α, PDGFR-β, Collagen type I, NG2, Tenascin-C 및 Twist1로 이루어진 군에서 선택된 셋 이상의 발현수준을 측정하는 것일 수 있으며, 예를 들어, PDGFR-β, α-SMA, FAP-α, S100A4/FSP1, collagen I 및 twist1의 발현수준을 측정하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.In one embodiment of the present invention, the measuring step is the expression level of three or more selected from the group consisting of α-SMA, FAPα, S100A4 / FSP1, PDGFR-α, PDGFR-β, Collagen type I, NG2, Tenascin-C and Twist1 It may be measured, for example, it may be to measure the expression level of PDGFR-β, α-SMA, FAP-α, S100A4 / FSP1, collagen I and twist1, but is not limited thereto.
본 발명의 일 구현예에서, 전이상 뇌종양은 유방, 직결장, 신장, 간, 폐, 흑색종 및 위로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상으로부터 유래된 것일 수 있다.In one embodiment of the present invention, the metastatic brain tumor may be derived from one or more selected from the group consisting of breast, colorectal, kidney, liver, lung, melanoma and stomach.
본 발명은 전이성 뇌종양의 진단 또는 예후 분석용 바이오마커 및 이를 이용한 진단방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 뇌종양의 진단 또는 예후 분석용 바이오마커는 전이성 뇌종양의 진단 및 재발 예후 예측을 정확하게 분석할 수 있다.The present invention relates to a biomarker for diagnosis or prognosis analysis of metastatic brain tumor and a diagnostic method using the same, and the biomarker for diagnosis or prognosis analysis of brain tumor according to the present invention can accurately analyze the diagnosis of metastatic brain tumor and prediction of recurrence .
도 1은 다양한 원발성 종양 (primary cancer)의 뇌전이 조직 내에서 본 발명의 일 실시예에 따른 바이오 마커 PDGFR-β, S100A4/FSP1, FAP-α, α-SMA, collagen I의 발현을 나타내는 면역 조직 화학 염색의 결과를 보여주는 사진이다.
도 2는 다양한 원발성 종양의 뇌전이 조직 내에서 본 발명의 일 실시예에 따른 바이오 마커 PDGFR-β, S100A4/FSP1, FAP-α, α-SMA, collagen I의 발현 수준을 나타내는 그래프이다.
도 3은 다양한 원발성 종양의 뇌전이 조직 내에서 본 발명의 일 실시예에 따른 바이오 마커 Twist1, NG2, tenascin-C 및 PDGRF-α의 발현수준을 나타내는 도면이다.
도 4는 임상병리학적 변수 (연령, 절제, 크기 및 보조방사선 요법) 및 본 발명의 일 실시예에 따른 암 관련 섬유아세포 바이오마커 PDGFR-β, α-SMA의 발현수준에 대하여 로그 순위 검정 (log-rank test)에 의한 카플란-마이어법 (Kaplan-Meier estimator)을 사용하여 도출한 RFS (recurrence-free survival) 곡선 그래프이다.
도 5는 임상병리학적 변수 (연령, 전신의 전이, 1차 그룹) 및 본 발명의 일 실시예에 따른 암 관련 섬유아세포 바이오마커 S100A4, PDGFR-β, α-SMA의 발현수준에 대하여 로그 순위 검정 (log-rank test)에 의한 카플란-마이어법 (Kaplan-Meier estimator)을 사용하여 도출한 PFS (progression-free survival) 곡선 그래프이다.
도 6은 정상 섬유아세포 (NFs)와 암 관련 섬유아세포 (cancer-associated fibroblasts; CAFs)의 형태를 광학 현미경을 통해 관찰한 사진이다.
도 7은 정상 섬유아세포, 전이성 뇌종양의 암 관련 섬유아세포에 대한 본 발명의 일 실시예에 따른 바이오 마커 PDGFR-β, α-SMA, FAP- α와 결합하는 항체의 웨스턴 블롯 실험 결과를 나타내는 사진이다.
도 8은 정상 섬유아세포, 전이성 뇌종양의 암 관련 섬유아세포에서 발명의 일 실시예에 따른 바이오 마커 PDGFR-β, α-SMA의 발현을 나타내는 면역 형광 염색의 결과를 보여주는 사진이다.1 is an immune tissue showing the expression of biomarkers PDGFR-β, S100A4/FSP1, FAP-α, α-SMA, and collagen I according to an embodiment of the present invention in brain metastasis tissues of various primary cancers A photograph showing the results of chemical staining.
2 is a graph showing the expression levels of biomarkers PDGFR-β, S100A4/FSP1, FAP-α, α-SMA, and collagen I according to an embodiment of the present invention in brain metastases of various primary tumors.
3 is a view showing the expression levels of biomarkers Twist1, NG2, tenascin-C and PDGRF-α according to an embodiment of the present invention in brain metastasis tissues of various primary tumors.
4 is a log-rank test (log) for clinical pathologic variables (age, resection, size and adjuvant radiation therapy) and the expression levels of cancer-related fibroblast biomarkers PDGFR-β and α-SMA according to an embodiment of the present invention. -rank test) is a graph of the RFS (recurrence-free survival) curve derived using the Kaplan-Meier estimator.
5 is a log rank test for clinical pathological variables (age, systemic metastasis, primary group) and the expression levels of cancer-related fibroblast biomarkers S100A4, PDGFR-β, and α-SMA according to an embodiment of the present invention It is a PFS (progression-free survival) curve graph derived using the Kaplan-Meier estimator by (log-rank test).
6 is a photograph of observation of the morphology of normal fibroblasts (NFs) and cancer-associated fibroblasts (CAFs) through an optical microscope.
7 is a photograph showing the results of western blot experiments of antibodies binding to biomarkers PDGFR-β, α-SMA, and FAP-α according to an embodiment of the present invention for normal fibroblasts and cancer-related fibroblasts of metastatic brain tumors. .
8 is a photograph showing the results of immunofluorescence staining showing the expression of biomarkers PDGFR-β and α-SMA according to an embodiment of the present invention in normal fibroblasts and cancer-related fibroblasts of metastatic brain tumors.
이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to the following examples. However, these examples are only for illustrating the present invention, and the scope of the present invention is not limited by these examples.
실시예 1: 인간 조직 표본 및 임상 데이터 선별Example 1: Screening of Human Tissue Specimens and Clinical Data
2004 년부터 2018 년 사이의 15년 동안 전남 대학교 화순 병원 및 의과 대학에서 두개골절단술 및 종양제거술을 시행받은 전이성 뇌종양 (brain metastasis; BM) 382 증례 중 7개의 원발장기 (유방, 직결장, 신장, 간, 폐, 흑색종 및 위)를 대표하는 68 건의 전이성 뇌종양 표본 및 임상 정보를 확보하였다. Seven primary organs (breast, rectal colon, kidney, liver) among 382 cases of metastatic brain metastasis (BM) who underwent craniotomy and tumor removal at Chonnam National University Hwasun Hospital and College of Medicine for 15 years between 2004 and 2018 , lung, melanoma, and stomach) representative of 68 metastatic brain tumor specimens and clinical information were obtained.
그리고, 본 발명의 모든 실험은 전남 대학교 화순 병원 임상 시험 심사위원회의 승인을 받아 진행하였다. 또한, 임상 정보 및 병리학적 표본의 사용에 대해서 환자 또는 법적 대리인으로부터 서면 사전 동의를 얻어 진행하였다.And, all experiments of the present invention were carried out with the approval of the Clinical Trial Review Committee of Chonnam National University Hwasun Hospital. In addition, prior written consent from the patient or legal representative was obtained for the use of clinical information and pathological specimens.
실시예 2: 면역 조직 화학 염색 및 염색 결과 해석Example 2: Immunohistochemical staining and interpretation of staining results
헤마톡실린&에오신 염색 (Hematoxylin and eosin; H&E) 및 면역조직화학염색 (immunohistochemistry; IHC)을 위한 대표적인 전이성 뇌종양 조직의 블록을 선정하였다. 이후, 전이성 뇌종양의 헤마톡실린&에오신 염색 및 면역조직화학 염색을 위한 3 μm 두께의 파라핀블럭을 제작하였다.Representative blocks of metastatic brain tumor tissue were selected for hematoxylin and eosin (H&E) and immunohistochemistry (IHC) staining. Thereafter, 3 μm thick paraffin blocks were prepared for hematoxylin & eosin staining and immunohistochemical staining of metastatic brain tumors.
암 관련 섬유아세포 (cancer-associated fibroblasts; CAFs)의 면역 조직 화학 염색에는 Bond-max 자동염색기 (Leica Microsystems, Buffalo Grove, IL, USA)를 사용하였다. 그리고, α-SMA (1:100 희석, Abcam), FAPα (1:1000 희석, R & D), S100A4/FSP1 (1:1000 희석, Atlas), PDGFR-α (1:100 희석, Santa Cruz), PDGFR-β (1:400 희석, Abcam), Collagen type I (1:300 희석, Abcam), NG2 (1:600 희석, Abcam), Tenascin-C (1:50 희석, Santa Cruz) 및 Twist1 (1:100 희석, Abcam)의 9종의 항체를 이용하여 면역 조직 화학 염색을 진행하였다.For immunohistochemical staining of cancer-associated fibroblasts (CAFs), a Bond-max automatic stainer (Leica Microsystems, Buffalo Grove, IL, USA) was used. and α-SMA (1:100 dilution, Abcam), FAPα (1:1000 dilution, R&D), S100A4/FSP1 (1:1000 dilution, Atlas), PDGFR-α (1:100 dilution, Santa Cruz) , PDGFR-β (1:400 dilution, Abcam), Collagen type I (1:300 dilution, Abcam), NG2 (1:600 dilution, Abcam), Tenascin-C (1:50 dilution, Santa Cruz) and Twist1 ( Immunohistochemical staining was performed using 9 types of antibodies (dilution 1:100, Abcam).
염색 후, 숙련된 두 명의 병리의사가 임상적 세부사항에 대해 모른 채, 헤마톡실린&에오신 및 면역 조직 화학 염색된 슬라이드를 광학 현미경을 사용하여 염색 강도를 저발현과 고발현으로 나누어서 평가하였다. After staining, hematoxylin & eosin and immunohistochemical stained slides were evaluated by dividing the staining intensity into low expression and high expression using a light microscope by two experienced pathologists, without knowing the clinical details.
암 관련 섬유 아세포의 염색 강도는 다음 기준에 따라 등급이 매겨졌다: The staining intensity of cancer-associated fibroblasts was graded according to the following criteria:
(1) α-SMA, FAP-α, PDGFR-β, S100A4/FSP1 및 Collagen type I 염색에서 염색강도가 낮은 경우 (0, 1)점 부여, 높은 경우 (≥2)점 부여. (1) In α-SMA, FAP-α, PDGFR-β, S100A4/FSP1 and Collagen type I staining, low (0, 1) points were given, and high (≥2) points were assigned.
(2) Twist1 염색에서 양성인 경우 (≥1)점 부여, 음성인 경우 0점 부여.(2) If Twist1 staining is positive, (≥1) points are given, and if negative, 0 points are assigned.
실시예 3: 세포 배양 및 조건화 배양액 준비Example 3: Preparation of Cell Culture and Conditioning Medium
조건화 배양액 (Conditoned media) 제조를 위해 MRC-5, NIH-3T3, LLC1, MB-231, SL4 및 MC-38의 암 세포주를 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 (American Type Culture Collection; ATCC)에서 구입하고, GL261 암 세포주를 시카고 대학교의 Maciej S. Lesniak 박사로부터 제공받아 사용하였다. Cancer cell lines of MRC-5, NIH-3T3, LLC1, MB-231, SL4 and MC-38 were purchased from American Type Culture Collection (ATCC) for the preparation of conditioned media, and GL261 cancer The cell line was provided by Dr. Maciej S. Lesniak of the University of Chicago and was used.
NIH-3T3, GL261, LLC1, SL4, MC-38, MRC-5, MB-231 세포를 각각 10 % 소 태아 혈청 (Invitrogen, USA), 100 U/mL 페니실린 및 100 μg/mL 스트렙토마이신 (Sigma-Aldrich, USA)을 첨가하여 37°인큐베이터에서 5 % CO2가습 조건으로 배양하였다. NIH-3T3, GL261, LLC1, SL4, MC-38, MRC-5, and MB-231 cells were each treated with 10% fetal bovine serum (Invitrogen, USA), 100 U/mL penicillin and 100 µg/mL streptomycin (Sigma- Aldrich, USA) was added and cultured in a humidified condition of 5% CO 2 in a 37° incubator.
상기 암 세포주를 70-80 %의 컨플루언시 (confluency)까지 배양한 다음, PBS로 헹군 후 DMEM으로 성장 배지를 교체하였다. 이어서, 배양물을 24 시간 동안 유지하고 배지를 수집한 다음 12000 rpm에서 10분 동안 원심분리한 후, 0.22 μ필터로 여과하여 조건화 배양액를 제조하였다. 그리고, 이후 세포 배양 시 배양액과 상기 제조된 조건화 배양액을 2:1의 비율로 혼합하여 사용하였다.The cancer cell line was cultured to 70-80% confluency, and then rinsed with PBS and then the growth medium was replaced with DMEM. Then, the culture was maintained for 24 hours, the medium was collected, centrifuged at 12000 rpm for 10 minutes, and filtered through a 0.22 μ filter to prepare a conditioned culture solution. Then, during cell culture, the culture solution and the prepared conditioned culture solution were mixed in a ratio of 2:1 and used.
실시예 4: 원발성 암 관련 섬유 아세포 및 정상 섬유 아세포의 확립Example 4: Establishment of primary cancer-associated fibroblasts and normal fibroblasts
암 관련 섬유 아세포 및 정상 섬유 아세포의 배양을 위하여 환자 및 C57BL/6 마우스로부터 수득한 뇌전이암, 직결장암, 인체정상피부, 마우스피부조직을 샘플로 사용하였다. For culturing cancer-related fibroblasts and normal fibroblasts, brain metastasis cancer, colorectal cancer, human normal skin, and mouse skin tissue obtained from patients and C57BL/6 mice were used as samples.
수술 직후 수득한 신선조직을 1 mm이하의 작은 조직으로 분절한 후 콜라게나제 I (1 mg/mL, Sigma-Aldrich), DNase I (0.1 mg/mL, STEMCELL Technologies) 및 노르모신 (100 μg/mL, InvivoGen)을 함유하는 DMEM/F12를 사용하여 배양기내에 교반기 (shaker)를 넣어서 분해하였다. After the fresh tissue obtained immediately after surgery was segmented into small tissues of 1 mm or less, collagenase I (1 mg/mL, Sigma-Aldrich), DNase I (0.1 mg/mL, STEMCELL Technologies) and normosin (100 μg/ mL, InvivoGen) containing DMEM/F12 was put into the incubator for digestion.
분해된 샘플을 700rpm에서 5분 동안 원심분리하여 상층액을 얻고, 얻은 상층액을 다시 800rpm에서 8분 동안 원심분리하여 섬유아세포를 분리하였다. 분리된 섬유아세포는 PBS로 세척한 후, 10 % FBS 및 1 % 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 DMEM/F12 배지에서 배양하였으며, 사용된 모든 암 관련 섬유아세포 및 정상 섬유아세포는 3계대 이내에 해당하는 세포를 사용하였다. The decomposed sample was centrifuged at 700 rpm for 5 minutes to obtain a supernatant, and the obtained supernatant was centrifuged again at 800 rpm for 8 minutes to separate fibroblasts. After washing with PBS, the isolated fibroblasts were cultured in DMEM/F12 medium supplemented with 10% FBS and 1% penicillin-streptomycin, and all cancer-related fibroblasts and normal fibroblasts used were cells corresponding to within 3 passages was used.
실시예 5: 웨스턴 블롯 분석Example 5: Western Blot Analysis
프로테아제 억제제 칵테일 (Roche, Germany)을 함유하는 방사성 면역 침전 분석 (radioimmunoprecipitation assay; RIPA) 완충액 (Bio Solution, South Korea)을 사용하여 정상 섬유아세포 및 암 관련 섬유아세포를 용해하여 단백질을 추출하였다. Proteins were extracted by lysing normal fibroblasts and cancer-associated fibroblasts using a radioimmunoprecipitation assay (RIPA) buffer (Bio Solution, South Korea) containing a protease inhibitor cocktail (Roche, Germany).
이 후, 30 μg의 단백질 용해물을 0.1 % 소듐도데실 설페이트를 함유하는 8-10 % 폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동을 이용하여 분리하고, 폴리비닐리덴 플루오라이드 멤브레인 (GE Healthcare, USA)으로 전기영동적으로 이동시켰다. After that, 30 μg of the protein lysate was separated using 8-10% polyacrylamide gel electrophoresis containing 0.1% sodium dodecyl sulfate, and electrophoresed with a polyvinylidene fluoride membrane (GE Healthcare, USA). moved to
이 후, 멤브레인을 실온에서 1 시간 동안 차단완충제 (5 % 무 지방 탈지유)와 배양하고, 4 ℃에서 16 시간 동안 1차 항체 α-SMA(1:1000, Abcam), FAP-α(1:1000, Abcam), PDGFR-β (1:5000, Abcam), pan-Cytokeratin, (1:1000, Santa Cruz), β-actin (1:5000, Cell Signaling)로 탐침하였다. 그 후, 겨자무과산화효소 (horseradish peroxidase)와 접합된 항-토끼 또는 항-마우스 면역글로불린 2차 항체를 실온에서 1시간 동안 멤브레인에 탐침시켰다. Thereafter, the membrane was incubated with blocking buffer (5% nonfat skim milk) at room temperature for 1 h, and primary antibodies α-SMA (1:1000, Abcam), FAP-α (1:1000) at 4 °C for 16 h. , Abcam), PDGFR-β (1:5000, Abcam), pan-Cytokeratin, (1:1000, Santa Cruz), and β-actin (1:5000, Cell Signaling). Then, an anti-rabbit or anti-mouse immunoglobulin secondary antibody conjugated with horseradish peroxidase was probed on the membrane for 1 hour at room temperature.
형성된 밴드는 β-액틴을 대조군으로 사용하여 전기화학발광 시스템 (Millipore, USA)을 이용하여 검출하였으며, 자외선 (UV) 이미징 시스템인 LAS 4000 이미지 퀀트 시스템 (GE Healthcare, USA)으로 밴드를 정량화하였다.The formed band was detected using an electrochemiluminescence system (Millipore, USA) using β-actin as a control, and the band was quantified with an ultraviolet (UV) imaging system, LAS 4000 Image Quant System (GE Healthcare, USA).
실시예 6: 면역 형광 염색Example 6: Immunofluorescence staining
배양된 암 관련 섬유아세포, 정상 섬유아세포 및 환자에서 유래한 전이성 뇌종양의 파라핀 블록 조직을 절단하여 이중면역형광 염색을 수행하였다. Cultured cancer-associated fibroblasts, normal fibroblasts, and paraffin block tissues of patient-derived metastatic brain tumors were cut and subjected to double immunofluorescence staining.
배양된 암 관련 섬유아세포 및 정상 섬유아세포를 알코올로 탈수하고, 4 % 포름알데히드로 고정시킨 후, 실온에서 30분 동안 2 % 소 혈청 알부민 (BSA)으로 차단하고 0.1 % Triton X-100에 20분 동안 투과시켰다. 이후, 이를 일차항체 α-SMA, (1:200, Abcam) α-SMA (1:100, Abcam), PDGFR-β (1:100, Abcam) CD34 (1:50), EMA (1:200, Dako), GFAP (1:200, Cell Signaling Technology) 와 4℃에서 16시간 동안 공동배양했다. 이어서, 이차항체로 염소 항-마우스 IgG (goat anti-mouse IgG) (1:400, Life Technologies), 염소 항-토끼 IgG (goat anti-rabbit IgG) (1:400, Life Technologies) 항체와 1시간 동안 실온에서 공동배양 하였다. Cultured cancer-associated fibroblasts and normal fibroblasts were dehydrated with alcohol, fixed with 4% formaldehyde, blocked with 2% bovine serum albumin (BSA) for 30 min at room temperature, and 20 min in 0.1% Triton X-100. permeated while Thereafter, the primary antibody α-SMA, (1:200, Abcam) α-SMA (1:100, Abcam), PDGFR-β (1:100, Abcam) CD34 (1:50), EMA (1:200, Dako) and GFAP (1:200, Cell Signaling Technology) were co-cultured at 4°C for 16 hours. Then, as a secondary antibody, goat anti-mouse IgG (1:400, Life Technologies), goat anti-rabbit IgG (goat anti-rabbit IgG) (1:400, Life Technologies) antibody and 1 hour was co-cultured at room temperature.
또한, 인간 전이성 뇌종양의 파라핀-포매 조직을 3 mm 두께로 절단하고, 자일렌을 사용하여 파라핀을 제거하였다. 항원 검색은 열-활성화 시트레이트 완충액 (PH=6.0)을 이용하여 15분 동안 수행하였으며, 3% 과산화 수소를 이용해 내인성 퍼옥시다제를 불활성화하였다. 그 후, 조직을 일차항체 α-SMA, (1:200, Abcam) α-SMA (1:100, Abcam), PDGFR-β (1:100, Abcam) CD34 (1:50), EMA (1:200, Dako), GFAP (1:200, Cell Signaling Technology) 와 4℃에서 16시간 동안 공동배양 하고, 이어서, 이차항체로 사용한 염소 항-마우스 IgG (goat anti-mouse IgG) (1:400, Life Technologies), 염소 항-토끼 IgG (goat anti-rabbit IgG) (1:400, Life Technologies) 항체와 1시간 동안 실온에서 공동배양 하였다.In addition, paraffin-embedded tissue of human metastatic brain tumor was cut to a thickness of 3 mm, and paraffin was removed using xylene. Antigen retrieval was performed for 15 minutes using heat-activated citrate buffer (PH=6.0), and endogenous peroxidase was inactivated with 3% hydrogen peroxide. Thereafter, the tissues were treated with primary antibodies α-SMA, (1:200, Abcam) α-SMA (1:100, Abcam), PDGFR-β (1:100, Abcam) CD34 (1:50), EMA (1: 200, Dako) and GFAP (1:200, Cell Signaling Technology) and co-cultured at 4°C for 16 hours, and then goat anti-mouse IgG (goat anti-mouse IgG) used as a secondary antibody (1:400, Life Technologies), a goat anti-rabbit IgG (1:400, Life Technologies) antibody and co-cultured for 1 hour at room temperature.
그리고, 조직 섹션을 300 nM의 DAPI와 함께 20 분 동안 배양한 후 PBS로 세척하였으며, 이를 방부제가 든 배지에 탑재하고 EVOS®형광 이미징 시스템 (Thermo Fisher Scientific, USA)을 사용하여 이미지화 하였다.Then, the tissue sections were incubated with 300 nM of DAPI for 20 minutes, washed with PBS, mounted in a medium containing a preservative, and imaged using an EVOS ® fluorescence imaging system (Thermo Fisher Scientific, USA).
실시예 7: 통계 분석Example 7: Statistical Analysis
종양의 크기 또는 국소적 재발의 존재, 임상 병리학적 변수들을 비교하기 위해, 카이 제곱 검정 (chi-squared test) 및 이항 논리 회귀 분석 (binary logistic regression)이 단변량, 다변량 분석에 적용되었다. 비재발 생존 (Recurrence-free survival; RFS) 및 비진행 생존 (Progression-free survival; PFS)에 대한 생존율을 일변량 및 다변량 분석하였다. 일변량 분석에는 로그 순위 검정으로 Kaplan-Meier 방법을 사용하였으며, 다변량 분석에서는 콕스 비례 위험 모델(Cox proportional hazards model)을 사용하여 분석하였다. 통계적 유의성은 p 값이 <0.05 인 경우를 유의성 있는 것으로 고려하였다.To compare tumor size or presence of local recurrence and clinical pathologic variables, chi-squared test and binary logistic regression were applied to univariate, multivariate analysis. The survival rates for recurrence-free survival (RFS) and progression-free survival (PFS) were analyzed univariately and multivariately. For univariate analysis, the Kaplan-Meier method was used as a log-rank test, and for multivariate analysis, the Cox proportional hazards model was used for analysis. For statistical significance, a case with a p value of <0.05 was considered significant.
그리고, 이러한 통계 분석은 SPSS 통계 분석 소프트웨어(SPSS Inc, USA)와 Graph Pad Prism (La Jolla, USA)을 사용하여 실시하였다.And, this statistical analysis was performed using SPSS statistical analysis software (SPSS Inc, USA) and Graph Pad Prism (La Jolla, USA).
실험예 1: 전이성 뇌종양에서의 암 관련 섬유아세포 바이오마커의 발현Experimental Example 1: Expression of cancer-related fibroblast biomarkers in metastatic brain tumors
전이성 뇌종양의 암 관련 섬유아세포에서의 바이오마커의 발현을 확인하기 위해, 원발성 암 유형 (폐, 유방, 결장 직장 및 간암 각각 10 건, 위암 11건, 흑색 종 9건, 신장 8건)에 따라 총 68 건의 전이성 뇌종양 표본에서 면역조직화학 분석을 수행하였다.To determine the expression of biomarkers in cancer-associated fibroblasts of metastatic brain tumors, the total number of cancer types according to the primary cancer type (lung, breast, colorectal and liver cancers, respectively, 10 cases, stomach cancer 11 cases, melanoma 9 cases, kidney 8 cases) Immunohistochemical analysis was performed on 68 metastatic brain tumor specimens.
분석결과, 도 1 및 도 2에서 확인할 수 있듯이, 암 관련 섬유아세포에서 PDGFR-β, S100A4/FSP1, FAP-α, α-SMA 및 collagen type I의 뚜렷한 발현을 관찰하였으며, 특히 모든 바이오 마커는 종양 주변에서 현저한 발현을 보였다.As a result of the analysis, as can be seen in FIGS. 1 and 2 , distinct expressions of PDGFR-β, S100A4/FSP1, FAP-α, α-SMA and collagen type I were observed in cancer-related fibroblasts. A significant expression was observed in the surrounding area.
또한, 도 3에서 확인할 수 있듯이, twist1은 원발 장기가 폐, 유방, 결장 직장 및 간인 경우의 전이성 뇌종양의 암 관련 섬유아세포에서는 크게 발현되었고, NG2는 원발장기가 유방, 결장 직장, 간 및 신장인 경우에 발현되었으며, tenascin-C 또한 원발장기가 폐 및 유방암인 경우에 발현되었다. 그리고, PDGRF-α는 종양 영역에서 현저하게 발현되었으나, 암 관련 섬유아세포에서는 발현되지 않았다.In addition, as can be seen in FIG. 3 , twist1 was greatly expressed in cancer-related fibroblasts of metastatic brain tumors when the primary organs were lung, breast, colorectal and liver, and NG2 was expressed in NG2 whose primary organs were breast, colorectal, liver and kidney. was expressed in cases, and tenascin-C was also expressed in cases where the primary organs were lung and breast cancer. In addition, PDGRF-α was significantly expressed in the tumor region, but not in cancer-associated fibroblasts.
실험예 2: 암 관련 섬유아세포-바이오 마커의 임상적 관련성 확인 Experimental Example 2 : Confirmation of clinical relevance of cancer-related fibroblasts-biomarkers
암 관련 섬유아세포-바이오마커 발현과 종양의 크기 (종양 크기 ≥ 3 cm로 정의됨) 사이의 임상 병리학적 변수의 상관 관계를 분석하여 표 1에 나타내었다. Table 1 shows the correlation of clinical pathologic parameters between cancer-associated fibroblast-biomarker expression and tumor size (defined as tumor size ≥ 3 cm).
그리고, 외과적 절제 후 두개골내 국소 재발을 포함하는 전이성 뇌종양 환자에서의 임상 병리학적 변수 사이의 상관 관계를 분석하여 표 2에 나타내었다. And, the correlation between clinical and pathological variables in patients with metastatic brain tumor including local recurrence within the skull after surgical resection was analyzed and shown in Table 2.
분석 결과, 표 1에서 확인할 수 있듯이, PDGFR-β, α-SMA, collagen type I의 세 가지 표지자의 발현이 종양의 크기와 유의하게 관련이 있었으며, PDGFR-β의 높은 발현은 다변량 분석에서 전이성 뇌종양의 크기에 대한 가장 강력한 예측 인자였다.As can be seen in Table 1, the expression of three markers, PDGFR-β, α-SMA, and collagen type I, was significantly related to the size of the tumor, and high expression of PDGFR-β was observed in metastatic brain tumors in multivariate analysis. was the strongest predictor of the size of
또한, 표 2에서 확인할 수 있듯이, 국소재발과 관련 있는 인자는 PDGFR-β 발현, 및 α-SMA 발현으로 나타났다.In addition, as can be seen in Table 2, factors related to local recurrence were PDGFR-β expression and α-SMA expression.
그리고, 이러한 결과를 도 4와 같이 Kaplan-Meier 곡선으로 나타내었으며, 도 4에서 확인할 수 있듯이, PDGFR-β의 높은 발현은 더 짧은 비재발 생존과 유의한 관련이 있음을 확인하였다. 또한, 도 5에서 확인할 수 있듯이, α-SMA의 고발현은 낮은 비진행 생존율과 관련이 있음을 확인하였다.And, this result was shown as a Kaplan-Meier curve as shown in FIG. 4 , and as can be seen in FIG. 4 , it was confirmed that high expression of PDGFR-β was significantly associated with shorter non-relapse survival. In addition, as can be seen in FIG. 5 , it was confirmed that high expression of α-SMA was associated with a low non-progression survival rate.
실험예 3: 원발성 암 관련 유전 및 정상 섬유아세포의 분리 및 특성 확인Experimental Example 3: Isolation and characterization of primary cancer-related genetic and normal fibroblasts
암 관련 섬유아세포의 특성을 분석하기 위해, 뇌 전이암과 대장암으로 수술받은 환자의 신선조직에서 암 관련 섬유아세포와 정상 섬유아세포를 배양한 후, 웨스턴 블롯 분석과 면역 형광 염색을 수행하였다. To analyze the characteristics of cancer-associated fibroblasts, western blot analysis and immunofluorescence staining were performed after culturing cancer-related fibroblasts and normal fibroblasts in fresh tissues of patients undergoing surgery for brain metastasis and colorectal cancer.
도 6에 나타난 것과 같이, 배양된 암 관련 섬유아세포는 정상 섬유모 세포보다 좀더 납작하거나 굽은 모양을 보였다. 그리고, 도 7에서 확인할 수 있듯이, 단백검출을 위한 웨스턴 블롯 분석에서는 정상 섬유아세포에 비해서 암 관련 섬유아세포에서 α-SMA, PDGFR-β, FAP-α 등 표지자의 발현이 훨씬 높게 나타났다. As shown in FIG. 6 , the cultured cancer-associated fibroblasts showed a more flattened or curved shape than normal fibroblasts. And, as can be seen in FIG. 7 , in the Western blot analysis for protein detection, the expression of markers such as α-SMA, PDGFR-β, and FAP-α was much higher in cancer-related fibroblasts than in normal fibroblasts.
그리고, 이러한 결과는 도 8에 나타나듯이, 면역 형광 염색 및 수술 조직 파라핀블럭 이중형광염색에 결과에서도, α-SMA, FAP-α 마커의 발현이 훨씬 높게 나타난 것을 확인하였다.And, as shown in FIG. 8, it was confirmed that the expression of α-SMA and FAP-α markers was much higher in the results of immunofluorescence staining and paraffin block double fluorescence staining of surgical tissue.
Claims (13)
α-SMA, FAPα, S100A4/FSP1, PDGFR-α, PDGFR-β, NG2, Tenascin-C 및 Twist1로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상;
과 특이적으로 결합하는 제제를 포함하는, 전이성 뇌종양의 진단 또는 예후 분석용 조성물.Collagen type I expressed in cancer-associated fibroblasts (CAFs) of metastatic brain tumors; and
at least one selected from the group consisting of α-SMA, FAPα, S100A4/FSP1, PDGFR-α, PDGFR-β, NG2, Tenascin-C and Twist1;
A composition for diagnosis or prognostic analysis of metastatic brain tumor, comprising an agent that specifically binds to.
α-SMA, FAPα, S100A4/FSP1, PDGFR-α, PDGFR-β, NG2, Tenascin-C 및 Twist1로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상;
과 특이적으로 결합하는 제제를 포함하는, 전이성 뇌종양의 진단 또는 예후 분석용 키트.Collagen type I expressed in cancer-associated fibroblasts (CAFs) of metastatic brain tumors; and
at least one selected from the group consisting of α-SMA, FAPα, S100A4/FSP1, PDGFR-α, PDGFR-β, NG2, Tenascin-C and Twist1;
A kit for diagnosis or prognostic analysis of metastatic brain tumor, comprising an agent that specifically binds to.
전이성 뇌종양의 암 관련 섬유아세포 (cancer-associated fibroblasts; CAFs)를 포함하는 시료를 준비하는 준비 단계; 및
상기 암 관련 섬유아세포의 α-SMA, FAPα, S100A4/FSP1, PDGFR-α, PDGFR-β, NG2, Tenascin-C 및 Twist1로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상, 및 Collagen type I의 발현수준을 측정하는 측정 단계.A method of providing information necessary for a diagnosis of metastatic brain tumor comprising the steps of:
A preparation step of preparing a sample containing cancer-associated fibroblasts (CAFs) of metastatic brain tumor; and
At least one selected from the group consisting of α-SMA, FAPα, S100A4/FSP1, PDGFR-α, PDGFR-β, NG2, Tenascin-C and Twist1 of the cancer-related fibroblasts, and a measurement to measure the expression level of collagen type I step.
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