KR102353589B1 - 핵 인자-κB 전위에 근거하여 화합물의 독성을 예측하는 방법 - Google Patents

핵 인자-κB 전위에 근거하여 화합물의 독성을 예측하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 화합물의 독성에 대해 스크리닝하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은, 핵 인자(NF)-κB가 접촉 전에 활성화되지 않은 세포의 시험 집단과 시험 화합물을 접촉시키는 단계; 접촉에 이어 시험 집단에서 NF-κB의 핵 국소화 수준을 측정하는 단계; 및 시험 화합물과 접촉하지 않은 대조군 집단의 NF-κB의 핵 국소화 수준과 비교하는 단계를 포함한다. 대조군 집단에 비해 시험 집단의 NF-κB의 핵 국소화 수준의 증가는, 시험 화합물이 세포를 손상시키고/시키거나 전-염증성 반응을 유도하므로 상기 방법에 사용된 세포 유형에 독성임을 나타낸다.

Description

핵 인자-κB 전위에 근거하여 화합물의 독성을 예측하는 방법{METHOD FOR PREDICTING TOXICITY OF A COMPOUND BASED ON NUCLEAR FACTOR-κB TRANSLOCATION}
본 발명은 장기-특이적 독성 또는 조직-특이적 독성을 포함하여 화합물의 독성을 예측하는 시험관내 방법에 관한 것이다.
[관련 출원에 대한 상호 참조]
본 출원은 2014년 3월 17일자로 출원된 싱가폴 출원 제 10201400705X 호(이의 내용은 본원에 참고로 인용됨)를 우선권 주장한다.
전사 인자의 NF-κB 계열(본원에서 총괄적으로 NF-κB로 지칭됨)은 동물 및 인간에서 염증 및 스트레스 반응의 주요 조절자이다[1,2]. NF-κB는 편재(遍在)적으로 발현되고 통상적으로 세포질에서[3,4] 불활성화 상태로 유지된다.
NF-κB는, 사이토카인, 세균 독소, 바이러스 생성물, 저산소증, 활성산소종 및 UV 광선을 포함하여 매우 다양한 상이한 스트레스 인자들에 의해 활성화될 수 있다[3-5]. 활성화시, NF-κB는 신속하게 핵내로 전위되고, 핵에서 많은 표적 유전자들을 조절한다.
NF-κB에 의해 표적화된 유전자들의 수 및 다양성으로 인해, NF-κB 활성화는 암[1,6] 및 염증 질환, 예를 들면, 류마티스성 관절염, 아테롬성경화증, 천식, 다발성 경화증, 염증성 장 질환 및 궤양성 대장염[7]을 포함하여 많은 질환과 연관된다. 상기 질환들은 폐, 장, 심혈관계 또는 중추신경계와 같은 다양한 기관계에서 발생한다. NF-κB 활성화는 또한 다양한 형태의 신장 질환과 연관된다[8,9]. NF-κB는, 질환 과정에 수반되거나 특정 스트레스원에 의해 영향을 받는 특정 세포 유형에서 활성화된다.
전사 인자의 NF-κB 계열은 상이한 단백질 아단위의 호모- 또는 헤테로이량체로 이루어진다. 지금까지, 5개의 단백질 아단위가 확인되었다[5]. NF-κB에 의해 조절되는 표적 유전자들중 다수가 염증 반응에 수반되지만; 어떤 정확한 유전자 세트가 표적화되는지는 NF-κB의 이성질형(isoform) 및 수반되는 아단위에 따라 달라진다. NF-κB의 p65 아단위는 전-염증성(pro-inflammatory) 인터루킨(IL) IL-6 및 IL-8의 활성화에 필수적이다[10-12].
NF-κB를 활성화시키고 그의 핵 전위를 유도하는 화합물의 능력에 의해 반영되는 바와 같은, 화합물의 장기-특이적 또는 조직-특이적 독성의 예측을 위한 시험관내 분석법이 제공된다.
상기 분석법은 NF-κB의 핵 전위, 예를 들면, NF-κB 아단위 p65의 핵 전위의 검출에 기초한다. 간략하게, 선택된 세포 유형을 먼저, 스크리닝될 잠재적으로 독성이거나 무독성인 화합물로 처리한 다음, 화합물의 독성, 및 NF-κB의 활성화에 의해 전-염증성 NF-κB 신호전달을 유도하는 그의 능력을 예측하기 위해 NF-κB 전위를 측정한다. 상기 분석법은 대용량 스크리닝(high content screening, HCS)에 적합하며, 일부 태양에서 HCS는 NF-κB 전위를 평가하기에 바람직한 방법일 수 있다.
상기 분석법은 1차 장기- 또는 조직-특이적 체세포 또는 줄기 세포, 줄기-세포 유래 장기-특이적 척추동물 세포, 생식 세포 또는 이의 전구체, 또는 장기- 또는 조직-특이적 계통확립 세포주(established cell line), 즉, 불멸 또는 불멸화 세포주를 사용할 수 있다.
한 양태에서, 본 발명은 핵 인자(NF)-κB가 접촉 전에 활성화되지 않은 세포의 시험 집단과 시험 화합물을 접촉시키는 단계; 접촉에 이어 시험 집단에서 NF-κB의 핵 국소화 수준을 측정하는 단계; 및 시험 화합물과 접촉하지 않은 세포들의 대조군 집단의 NF-κB의 핵 국소화 수준과 시험 집단의 NF-κB의 핵 국소화 수준을 비교하는 단계를 포함하는, 화합물의 독성에 대해 스크리닝하는 시험관내 방법으로서, 이때, 대조군 집단에 비해 시험 집단에서의 NF-κB의 핵 국소화 수준의 증가가, 시험 화합물이 세포를 손상시키고/시키거나 전-염증성 반응을 유도함을 나타내는, 방법을 제공한다.
상기 방법에서 평가된 NF-κB는 NF-κB의 임의의 이성질형 또는 아단위일 수 있다. 일부 태양에서, NF-κB는 NF-κB의 p65 아단위이다. 일부 태양에서, NF-κB의 p65 아단위는 서열번호 1 내지 4중 어느 하나에 나타낸 서열 또는 서열번호 5 또는 6에 나타낸 서열을 포함한다.
시험 집단 및 대조군 집단의 세포를 포함하여, 상기 방법에 사용된 세포는 인간 세포일 수 있거나, 비-인간 동물 세포일 수 있다.
세포는, 예를 들면, 배아 줄기 세포, 중간엽 줄기 세포, 조혈 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포, 조직-특이적 줄기 세포 또는 장기-특이적 줄기 세포를 포함하여, 줄기 세포를 포함할 수 있다.
세포는 체세포, 또는 줄기 세포로부터 유도된 세포를 포함할 수 있다.
예를 들면, 세포는 종양 세포, 생식 세포 또는 이의 전구체, 또는 1차 세포를 포함할 수 있다. 일부 태양에서, 세포는 간 세포, 신장 세포, 심혈관 세포, 중추신경계 세포, 피부 세포, 폐 세포, 췌장 세포, 소화관 세포, 눈 세포, 귀 세포, 골수 세포 또는 혈액 세포를 포함할 수 있다. 세포는, 예를 들면, 인간 1차 신장 근위 세뇨관 세포를 포함하여, 신장 근위 세뇨관 세포를 포함할 수 있다.
예를 들면, 세포는, 예를 들어, HK-2 세포 또는 LLC-PK1 세포를 포함하여, 계통확립 세포주로부터의 세포를 포함할 수 있다.
예를 들면, 세포는 배아 줄기 세포, 중간엽 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포 또는 장기/조직-특이적 줄기 세포로부터 분화된 줄기 세포로부터 유도된 세포를 포함할 수 있다. 일부 태양에서, 세포는 간 세포, 신장 세포, 심혈관 세포, 중추신경계 세포, 피부 세포, 폐 세포, 췌장 세포, 소화관 세포, 생식 세포 또는 이의 전구체, 눈 세포, 귀 세포, 골수 세포 또는 혈액 세포와 유사하도록 적어도 부분적으로 분화될 수 있다. 일부 태양에서, 세포는 신장 근위 세뇨관-유사 세포일 수 있다.
상기 방법에서, 접촉은, 예를 들면, 약 1 내지 약 16 시간, 약 12 내지 약 16 시간, 또는 약 30 내지 약 36 시간, 또는 약 3 일동안의 기간에 걸쳐 수행된다.
상기 방법은, 측정 전에 4 주 이하의 전체 기간에 걸쳐 규칙적인 간격으로 1회 이상 접촉을 반복하는 것을 추가로 포함할 수 있으며, 이때 상기 접촉은 접촉의 각각의 경우에 대해 동일한 기간동안 수행된다.
상기 방법은, 접촉에 이은 측정을 4 주 이하의 전체 기간에 걸쳐 규칙적인 간격으로 1회 이상 반복하는 것을 추가로 포함할 수 있으며, 이때 상기 접촉은 접촉의 각각의 경우에 대해 동일한 기간동안 수행된다.
본 발명의 다른 양태 및 특징들은 첨부한 표 및 도면들과 함께 본 발명의 특정 태양들에 대한 하기 설명을 검토할 때 당해 분야에 통상의 기술을 가진 자에게 명백해질 것이다.
본 발명의 태양들을 오직 예로서만 예시하는 도면들은 다음과 같다.
도 1: 종래 NF-κB-기반 분석법과 본 발명의 방법의 태양들을 비교한 개략도.
도 2: 화합물-유도된 NF-κB 전위를 검출하기 위해 사용된, 본 발명의 방법의 대용량 스크리닝(HCS) 태양의 개요.
도 3: (표 1 포함) NF-κB 전위에 대해 시험된 41개의 상이한 화합물들에 대한 히트맵(heat map).
도 4: (표 2 포함) 시험된 41개의 상이한 화합물들에 대해 측정된 양성 세포들의 EC50 값 및 최고 퍼센트.
도 5: (표 3 포함) 시험된 42개의 상이한 화합물들에 대한 NF-κB 전위의 정성적 분석.
도 6: 민감도, 특이성 및 임상 데이터와의 전체적 일치율을 나타낸 그래프.
도 7: (표 4 포함) 시험된 43개의 상이한 화합물들에 대한 히트맵.
도 8: (표 5 포함) 평가변수로서 화합물-유도된 NF-κB 전위를 사용한 약물-유도성 근위 세뇨관 독성의 예측.
도 9: HCS에 의해 영상화된 HPTC1(대조군).
도 10: 인간에서 근위 세뇨관을 직접적으로 손상시키는 신장독으로 처리(나타낸 농도에서) 후 HCS에 의해 영상화된 HPTC1. EC50 및 IC50 값을 각 화합물에 대해 측정하였다.
도 11: 인간에서 근위 세뇨관을 직접적으로 손상시키는 신장독으로 처리(1000 ㎍/mL에서) 후 HCS에 의해 영상화된 HPTC1.
도 12: 인간에서 근위 세뇨관 세포에 직접적으로 독성이 아닌 화합물로 처리(1000 ㎍/mL에서) 후 HCS에 의해 영상화된 HPTC1.
전사 인자 NF-κB의 활성화는 편재적으로 발현된 NF-κB의 세포질로부터 핵으로의 전위를 야기한다. NF-κB 활성화는 많은 질환과 연관된다; 그 결과, 활성화된 NF-κB의 활성을 조절하거나 억제하는 화합물을 확인하는데 관심이 있다[7, 13, 14].
따라서, NF-κB 활성에 대한 해당 시험 화합물의 영향을 검출하기 위한 분석법이 이미 개발되었다. 상기 종래 분석법은 NF-κB 핵 전위 및 따라서 활성화를 유도하는 것으로 알려진 작용제를 사용하고, 이어서 NF-κB의 작용제-유도된 핵 전위에 대한 시험 화합물의 효과를 평가한다. 상기 분석법에 사용된 작용제는 전형적으로 종양 괴사 인자(TNF)-α 또는 IL-1을 포함한다. 그러므로, 이들 종래 기술된 분석법들은, NF-κB를 조절하는 신호전달 경로를 포함하여, 세포 신호전달을 다루지만, 세포독성, 또는 스크리닝될 시험 화합물에 의해 NF-κB를 활성화시키는 능력은 다루지 않는다.
NF-κB를 활성화시키는 활성화제/작용제를 사용하는 이전에 확립된 NF-κB-기반 분석법과 대조적으로, 본 발명의 방법은, 독성 화합물이 세포에 스트레스를 부가하고, 상기 스트레스는 이어서 NF-κB를 활성화시키고 이의 핵 전위를 유도할 수 있다는 가설에 기초한다. 따라서, 본원에 기술된 방법에서는, 화합물의 독성을 측정하는 방법으로서, NF-κB 전위를 유도하는 (임의의 활성화제 또는 작용제의 부재하에서) 시험 화합물의 능력을 측정한다. 또한, 시험 화합물에 의해 유도된 NF-κB의 전위는 NF-κB 신호전달을 활성화시키고 전-염증성 효과를 유도하는 화합물의 잠재력을 반영한다.
본원에 기술된 분석 방법에서는, 세포를 먼저, 독성에 대해 스크리닝될, 잠재적으로 독성인 시험 화합물로 처리한다. 이어서, 화합물의 독성 및 이의 전-염증성 잠재력을 측정하기 위해 NF-κB 전위를 측정한다. NF-κB 전위를 유도하는 화합물은 양성으로 분류되고, 사용된 특정 세포 유형에 대해 독성인 것으로 예측된다.
도 1은 NF-κB의 조절을 측정하기 위해 사용된 이전에 공지된 분석법의 디자인을 나타내고 본원에 기술된 바와 같은 방법의 디자인과 비교한다.
이전에 공지된 NF-κB-기반 분석법(도 1의 좌측)은 활성화된 NF-κB에 대한 화합물의 조절 효과를 검출하도록 디자인된다. 그러므로, NF-κB의 핵 전위는 먼저 작용제(예를 들면, TNF-α 또는 IL1)에 의해 유도된다. 활성 상태는 도면에서 옅은 색의 세포질 및 진한 색의 핵을 갖는 세포로 나타나 있다. 이어서, 핵에 증가된 NF-κB 국소화를 갖는 활성화된 샘플을 스크리닝될 화합물(화살표)로 처리한다. 작용제-유도된 NF-κB 활성에 대한 스크리닝된 화합물의 조절 효과는 흔히 HCS에 의해 검출한다.
대조적으로, 본원에 기술된 방법(도 1의 우측)에서는, 세포를 스크리닝될 화합물로만 처리한다. NF-κB의 핵 전위를 유도하기 위해 작용제를 사용하지 않는다. 따라서, NF-κB는 세포질에 국소화되고, 스크리닝될 화합물과의 임의의 접촉 전에 불활성이다(도면에서 진한 색의 세포질 및 옅은 색의 핵을 갖는 세포로 나타나 있다). 독성 세포 손상으로 인한 잠재적인 NF-κB 활성화는 HCS에 의해 검출할 수 있다.
특히, 사이토카인 또는 또 다른 작용제(예, TNF-α)에 의한 NF-κB의 활성화는 본원에 기술된 분석 방법에서는 사용되지 않는다. 이러한 특징은 이전에 공지된 NF-κB-기반 HCS 분석법과 본원에 기술된 분석법을 차별화시킨다. 즉, 본원에 기술된 분석법은 NF-κB 전위를 유도하는 화합물의 능력은 측정하지만, 또 다른 화합물에 의해 유도된 NF-κB의 핵 전위에 이은 시험 화합물에 의한 NF-κB 활성의 조절은 측정하지 않는다.
따라서, 한 양태에서, 시험 화합물의 독성을 스크리닝하기 위한 시험관내 방법이 제공된다.
간략하게, 상기 방법은, 시험 화합물을, NF-κB가 접촉 전에 활성화되지 않은 세포들의 시험 집단과 접촉시키는 단계를 포함한다. 이어서, NF-κB의 핵 국소화 수준을 측정하고 시험 화합물로 처리되지 않은 대조군 집단에 대한 NF-κB 핵 국소화 수준과 비교한다.
시험 화합물은, 본 방법을 수행하기 전에 NF-κB를 활성화시키거나 NF-κB 핵 전위를 유도하는 그의 능력이 알려지지 않은 화합물을 포함하여, 그 독성이 평가될 임의의 화합물일 수 있다. 시험 화합물은, 대상에 의해 흡입되거나, 대상에게 국소적으로 적용되거나, 대상에 의해 흡수되거나, 대상에 의해 섭취되거나, 대상에게 투여되거나, 대상내에 이식되는 것을 포함하여, 대상과 접촉될 것으로 예상되는 임의의 화합물일 수 있다. 예를 들면, 시험 화합물은 약학 화합물, 유기 화합물, 무기 화합물, 살충제, 제초제, 환경 독소, 곰팡이 독소, 미생물 독소, 중금속-함유 화합물, 유기 용매, 세척제, 방부제, 식품 첨가제, 식이 보조제, 약초 화합물, 동물-유래 화합물, 살균 화합물, 화장품 성분, 미립자 또는 나노입자일 수 있다.
시험 화합물은 세포들의 시험 집단과 접촉된다.
세포들의 시험 집단은 시험 화합물과의 접촉 전에 NF-κB의 활성화가 유도되지 않았다. 따라서, NF-κB의 대부분은 접촉 전에 시험 집단의 세포들의 세포질에 위치할 것이며, 따라서, 접촉시 시험 화합물의 활성에 따라서, 활성화되고 이어서 핵으로 전위되는데 이용하능하다.
시험 집단은 시험 화합물의 독성이 평가될 필요가 있는 세포들의 임의의 집단일 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "세포"는, 세포들의 대조군 집단 또는 세포들의 시험 집단에 속하는 세포를 지칭할 때를 포함하여, 문맥상 가능한 경우, 단일 세포뿐 아니라 다수의 세포 또는 세포 집단을 지칭하기 위한 것이다. 유사하게, 용어 "세포" 또는 세포의 "집단"은 또한 문맥상 가능한 경우 단일 세포를 말하기 위한 것이다.
세포들의 시험 집단은, 인간 동물 세포, 또는 마우스 세포 또는 래트 세포를 포함한 비-인간 동물 세포의 임의의 유형을 포함하여 임의 유형의 세포들로 이루어질 수 있다. 세포는 줄기 세포일 수 있거나, 체세포, 예를 들면, 1차 세포, 계통확립 세포주, 예를 들어, 불멸 또는 불멸화 세포, 종양 세포, 생식 세포 또는 이의 전구체뿐 아니라, 유도 만능 줄기 세포로부터 유도되거나 분화된 것을 포함하여, 줄기 세포로부터 유도되거나 분화된 세포일 수 있다.
세포들의 시험 집단은 단일 세포 유형일 수 있거나, 2개 이상의 상이한 세포 유형들을 함유하는 혼합 집단일 수 있다.
따라서, 시험 집단은 줄기 세포 집단을 포함할 수 있다. 줄기 세포로는 배아 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포, 성인 줄기 세포, 예를 들어, 중간엽 줄기 세포, 조혈 줄기 세포 또는 조직-특이적 줄기 세포, 또는 장기-특이적 줄기 세포가 포함된다. 줄기 세포는, 기존 세포주로부터의 인간 배아 줄기 세포를 포함하여, 인간 배아 줄기 세포를 포함할 수 있다.
시험 집단은 생식 세포 또는 이의 전구체의 집단을 포함할 수 있다.
사용된 시험 집단은 체세포, 체세포로부터 유도된 세포, 또는 줄기 세포를 분화시켜 유도된 세포를 포함할 수 있다. 상기 세포는 1차 세포, 불멸화 세포주를 포함하여 계통확립 세포주로부터의 세포, 또는 종양 세포를 포함할 수 있다. 세포는, 배아 줄기 세포로부터, 중간엽 줄기 세포로부터, 유도 만능 줄기 세포로부터, 조직-특이적 줄기 세포로부터 또는 장기-특이적 줄기 세포로부터 분화되는 것을 포함하여, 줄기 세포로부터 분화될 수 있다.
체세포, 및 체세포로부터 유도된 세포는 1차 세포, 또는 계통확립, 불멸 또는 불멸화 세포주로부터의 세포를 포함한다. 예를 들면, 체세포는 장기-특이적 또는 조직-특이적 세포 유형 중 임의 유형, 예를 들면, 제한하지 않고, 간 세포(간세포 또는 기타 간 세포 유형), 신장 세포(사구체, 세뇨관 및 기타 신장 세포 유형), 심혈관 세포(심근세포, 내피 세포), 중추신경계 세포(뉴런, 성상교세포, 아교세포), 피부 세포(각질세포, 피부 섬유아세포, 및 부속 구조물: 선 및 모공에 특이적인 세포 유형), 폐 세포(기도 상피 세포, 폐포 세포), 췌장 세포(베타-세포 및 기타 췌장 세포 유형), 소화관 세포(위 및 소장의 여러가지 세포 유형들), 생식 기관에 특이적인 세포 유형, 감각 기관(눈- 및 귀-특이적 세포 유형), 골수 세포 또는 혈액 세포일 수 있다. 일부 태양에서, 세포는, 예를 들면, 인간 1차 신장 근위 세뇨관 세포, HK-2 세포 또는 LLC-PK1 세포를 포함하여, 신장 근위 세뇨관 세포이다.
줄기 세포로부터 유도된 세포는 배아 줄기 세포로부터, 중간엽 줄기 세포로부터, 유도 만능 줄기 세포로부터, 장기-특이적 줄기 세포로부터 또는 조직-특이적 줄기 세포로부터 분화된 세포를 포함한다. 예를 들면, 줄기 세포로부터 유도된 세포는, 간 세포(간세포 또는 기타 간 세포 유형), 신장 세포(사구체, 세뇨관 및 기타 신장 세포 유형), 심혈관 세포(심근세포, 내피 세포), 중추신경계 세포(뉴런, 성상교세포, 아교세포), 피부 세포(각질세포, 피부 섬유아세포, 및 부속 구조물: 선 및 모공에 특이적인 세포 유형), 폐 세포(기도 상피 세포, 폐포 세포), 췌장 세포(베타-세포 및 기타 췌장 세포 유형), 소화관 세포(위 및 소장의 여러가지 세포 유형들), 생식 세포 및 이의 전구체를 포함한 생식 기관에 특이적인 세포 유형, 감각 기관(눈- 및 귀-특이적 세포 유형), 골수 세포 및 혈액 세포와 유사하도록 적어도 부분적으로 분화된 세포를 포함한다. 일부 태양에서, 세포는 신장 근위 세뇨관-유사 세포이다.
미분화되거나 부분적으로 분화된 줄기 세포의 사용은, 조직 특이성 또는 장기 특이성에 대해 반드시 평가할 필요없이, 화합물의 배아독성 및/또는 일반적인 독성을 평가하는 것을 가능하게 할 수 있다.
그러나, 조직-특이적 독성 또는 장기-특이적 독성의 평가를 포함하여, 특정 세포 유형에서 독성을 평가하는 것이 바람직할 수 있다. NF-κB는 모든 인간 및 동물 세포 유형에서 편재적으로 발현되며, NF-κB 활성화는 부상, 질환 및 염증과 관련된 많은 상이한 기관계에서 일어난다[7]. 장기-특이적 독성의 예측을 위한 시험관내 분석법에 대한 평가변수로서 NF-κB 핵 전위의 사용이 특히 흥미롭다. 이전에는, 상기 시험관내 분석법에 적절한 평가변수를 확인하는 것이 어려웠다. 일반 세포독성(예를 들면, 세포 사멸, 감소된 대사 활성, ATP 고갈)을 측정하기 위한 평가변수가 널리 사용되지만, 상기 평가변수를 사용한 장기-특이적 독성의 예측은 성공적이지 않았다[16,17]. 현재, 인간 내부 장기에 대한 독성 효과의 예측을 위한 용인된 시험관내 분석법은 없다(유효하고 용인된 대체 방법들의 목록이 alttox.org/mapp/table-of-validated-and-accepted-alternative-methods/에 제공되어 있다).
그러한 경우에, 사용되는 세포는 부분적으로 또는 완전히 분화될 수 있다. 예를 들면, 세포 집단은 특정 유형의 조직 또는 장기에 특이적인 1차 체세포, 체세포로부터 유도된 세포, 예를 들면, 종양 세포 또는 계통확립 세포주, 조직-특이적 줄기 세포, 장기-특이적 줄기 세포, 또는 배아 줄기 세포 또는 유도 만능 줄기 세포를 포함하여 줄기 세포로부터 부분적으로 또는 완전히 분화된 세포일 수 있다.
시험 화합물을 세포들의 시험 집단과 접촉시키기 전에, 시험 집단은 먼저 사용된 세포의 유형에 적합한 표준 조직 배양 방법에 따라서 배양될 수 있다. 다양한 세포 유형들에 대한 조직 배양 조건 및 기술은, 예를 들면, 문헌 [Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4 th ed., by Michael R. Green and Joseph Sambrook, ⓒ2012, Cold Spring Harbor Laboratory Press] 및 참조문헌 [18]에 기술된 바와 같이, 공지되어 있다.
세포들의 시험 집단은, 융합성(confluent) 단층, 준융합성(subconfluent) 단층, 융합성 상피, 오가노이드(organoid) 배양, 융합성 2D 배양, 시험관내 세관, 3D 오가노이드 배양, 또는 정적 3D 배양 또는 미세유체 조건하에서 성장한 3D 배양을 포함한 3D 배양을 포함하여, 임의의 포맷으로 배양될 수 있다. 상기에서 언급했듯이, 시험 집단은 단일 세포 유형으로 이루어질 수 있거나 2가지 이상의 상이한 세포 유형들의 공-배양물을 나타낼 수 있다.
일부 태양에서, 세포는 단층, 예를 들면, 융합성 또는 준융합성 단층으로 성장한다. 자동화 검출 방법이 사용될 것인 경우, 3D 배양은 본 발명의 HCS 방법에 적합하지 않은 다중 세포층을 수반하기 때문에, 단층 배양이 바람직하다.
예를 들면, 세포는 다중-웰 플레이트에서 고밀도(예를 들면, 약 20 000 내지 약 50 000 세포/cm2)로 접종될 수 있다. 폴리스티렌으로 제조된 조직 배양 플레이트는 전형적으로, 불멸 세포주 또는 인간 1차 신장 근위 세뇨관 세포(HPTC)와 같은 세포가 사용되는 경우, 코팅제, 겔 등을 사용한 어떤 처리도 필요하지 않다. 다른 1차 인간 세포 유형(예를 들면, 통상적으로 콜라겐 I 코팅제와 함께 배양된, 간세포) 또는 줄기 세포를 사용하는 경우, 조직 배양 플레이트는 마트리겔(Matrigel™) 또는 합성 코팅제와 같은 코팅제를 필요로 할 수 있다. 예를 들면, hESC 및 hiPSC를 배양하고 HPTC-유사 세포로 분화시키는 것은 조직 배양 플레이트 상에 hESC-적격 마트리겔™ 코팅제의 사용을 수반할 수 있다.
세포는, 필요한 경우, 균형을 맞추고, 단층을 형성하고, 분화될 시간을 세포에 제공하기 위해, 화합물과 접촉 전에, 적절한 기간동안, 예를 들면, 약 1 일 이상, 약 3 일 이상 또는 약 1 내지 약 3 일동안 배양될 수 있다. 예를 들면, HPTC를 사용하는 경우, 시험 화합물과의 접촉 전에 단일 세포층(즉, 단순 상피)으로 이루어진 분화된 신장 상피가 형성될 수 있다.
일부 태양에서, 세포는, 융합성 또는 준융합성 단층의 형태를 포함하여, 미세유체 생물반응기에서 성장할 수 있다. 미세유체 생물반응기는 장기 배양 및 본원에 기술된 바와 같은 시험 화합물에 반복 노출에 유용할 수 있다. 상기 포맷은 배양물 내에 화합물 농도 구배를 제공하기에 유용할 수 있다.
인지하듯이, 동일한 세포 유형이 시험 집단 및 대조군 집단에 사용되어야 한다. 대조군 집단은 전형적으로 시험 화합물과의 접촉을 제외하고 시험 집단과 동일한 방식으로 배양되고 처리되어야 한다. 대신, 대조군 집단은 비히클 대조군, 예를 들면, 시험 화합물을 용해시키기 위해 사용되지만 어떤 시험 화합물도 포함하지 않는 용액 또는 용매와 접촉시키는 것이 적절할 수 있다.
상기 방법에서, 시험 화합물은 이어서 시험 집단과 접촉된다.
접촉은 세포가 배양되는 배양 배지에 화합물을 첨가함으로써 수행될 수 있다. 예를 들면, 화합물은 액체 비히클, 예를 들어, 용매 또는 용액에 용해되거나 분산될 수 있다.
접촉은, 예를 들면, 배양시에 시험될 화합물을 세포와 함께 배양함으로써 일정 시간에 걸쳐 수행될 수 있다.
접촉은 약 1 분 이상, 약 5 분 이상, 약 15 분 이상, 약 1 시간 이상, 약 2 시간 이상, 약 4 시간 이상, 약 8 시간 이상, 약 16 시간 이상, 약 24 시간 이상, 약 36 시간 이상, 약 48 시간 이상, 약 60 시간 이상, 또는 약 72 시간 이상의 기간에 걸쳐 수행될 수 있다. 접촉은 약 15 분 내지 약 72 시간, 약 1 내지 약 48 시간, 약 1 내지 약 24 시간, 약 1 내지 약 16 시간, 약 8 내지 약 36 시간, 약 16 내지 약 24 시간, 약 12 내지 약 16 시간, 또는 약 30 내지 약 36 시간의 기간에 걸쳐, 또는 약 3 일동안 수행될 수 있다.
시험 화합물은 세포 배양 배지중에 남을 수 있으며, 배지가 전체 배양 기간이 완료되기 전에 교체가 필요한 경우, 첨가되는 새 배지는 또한 접촉을 유지하기 위해 시험 화합물을 함유할 수 있다.
사용될 시험 화합물의 농도는 변화될 수 있으며, 시험될 화합물에 따라 달라질 수 있다.
예를 들면, 시험 화합물은 약 0.001 ㎍/mL 이상, 약 0.01 ㎍/mL 이상, 약 0.1 ㎍/mL 이상, 약 1 ㎍/mL 이상, 약 10 ㎍/mL 이상, 약 100 ㎍/mL 이상, 약 1,000 ㎍/mL 이상, 또는 약 10,000 ㎍/mL 이상의 농도에서 세포들의 집단과 접촉될 수 있다. 시험 화합물은 약 0.001 내지 약 10,000 ㎍/mL, 약 0.001 내지 약 1,000 ㎍/mL, 약 0.005 내지 약 5,000 ㎍/mL, 약 0.005 내지 약 1,000 ㎍/mL, 약 0.01 내지 약 1,000 ㎍/mL, 또는 약 0.01 내지 약 500 ㎍/mL의 농도로 세포 집단과 접촉될 수 있다.
상기에 나타낸 바와 같이, 세포의 대조군 집단은, 시험 화합물과 접촉하지는 않지만, 음성 대조군 용액, 예를 들면, 시험 집단과 접촉하기 위한 시험 화합물을 용해시키거나 분산시키기 위해 사용되는 용매 또는 용액(비히클 대조군)과 접촉될 수 있다.
접촉은, 주기적 기준을 포함하여, 반복될 수 있다. 예를 들면, 접촉은 주어진 기간에 걸쳐, 선택적으로 시험 집단이 시험 화합물과 접촉되지 않는 기간이 사이에 배치되어, 2회 이상, 3회 이상, 4회 이상 또는 5회 이상 수행될 수 있다.
예를 들면, 첫번째 접촉 기간이 완료된 후, 조직 배양 배지는 시험 화합물을 함유하는 새 배지로 교체될 수 있다. 또는, 배지는 시험 화합물을 함유하지 않는 새 배지로 교체될 수 있고, 접촉하지 않는 기간 후에, 시험 화합물은 이어서 다시 세포의 시험 집단과 접촉될 수 있다.
따라서, 접촉은 1회 이상의 추가 횟수로(첫번째 접촉 단계를 지나서) 반복될 수 있다.
예를 들면, 접촉은, 주기적 기준을 포함하여, 약 3 내지 약 14 일, 또는 약 3 일 내지 약 4 주의 기간에 걸쳐 반복될 수 있다.
시험 화합물의 임의의 접촉(즉, 세포를 새 배지에 노출시키는)이 없는 간격은, 접촉 기간 사이에, 예를 들면, 약 16 시간 내지 약 14 일, 약 1 내지 약 10 일, 약 1 내지 약 3 일, 약 1 내지 약 5 일 또는 약 2 내지 약 3 일동안 지속될 수 있다.
반복되는 경우, 접촉은 전체 기간 내에 규칙적인 간격으로 반복될 수 있다. 각각의 접촉 사건은 전체 기간 내에서 동일한 길이의 시간동안 수행될 수 있다.
예를 들면, 약 2 주의 기간에 걸쳐, 시험 화합물은 약 8 시간동안, 2 일마다 한번씩 반복하여 시험 집단과 접촉될 수 있다.
다시, 대조군 집단은, 시험 화합물이 대조군 집단과 접촉하는 것으로부터 배제되는 것을 제외하고, 시험 집단과 유사한 방식으로 처리되어야 한다. 예를 들면, 비히클 대조군은, 시험 화합물을 시험 집단과 접촉시키는 경우에 수행되는 바와 같이, 동일한 기간동안 반복하여, 동일한 수의 접촉을 위해서 및 동일한 전체 기간에 걸쳐, 대조군 집단의 배양 배지에 첨가될 수 있다.
일단 접촉이 완료되면, 핵 NF-κB의 수준은 시험 집단 및 대조군 집단 둘 다에 대해 측정된다.
NF-κB에 대한 언급은 NF-κB의 임의의 아단위 또는 이성질형을 포함하여 NF-κB 전사 인자의 임의의 계열 구성원에 대한 언급을 포함한다. 따라서, 핵 전위에 관하여 평가되는 NF-κB는 임의의 NF-κB일 수 있으며, 세포의 시험 집단에 사용되는 세포 유형에 따라 달라질 수 있다. NF-κB는 편재하지만, 다양한 세포 유형에서 발견되는 NF-κB의 형태는 상이할 수 있으며, 따라서 분석법에서 핵 전위에 관하여 측정되는 NF-κB는 사용된 세포 유형에 적절한 형태의 NF-κB이어야 한다.
예를 들면, 상기 방법에서 검출되는 NF-κB는, 예를 들면, NF-κB의 p65 아단위를 포함하여, NF-κB의 상이한 이성질형 또는 아단위를 포함한다.
NF-κB는, 일부 태양에서, 하기 서열번호 1에 나타낸 바와 같은 인간 NF-κB p65 아단위 이성질형 1을 포함하거나, 필수적으로 그로 이루어지거나, 그로 이루어질 수 있다:
MDELFPLIFPAEPAQASGPYVEIIEQPKQRGMRFRYKCEGRSAGSIPGERSTDTTKTHPTIKINGYTGPGTVRISLVTKDPPHRPHPHELVGKDCRDGFYEAELCPDRCIHSFQNLGIQCVKKRDLEQAISQRIQTNNNPFQVPIEEQRGDYDLNAVRLCFQVTVRDPSGRPLRLPPVLSHPIFDNRAPNTAELKICRVNRNSGSCLGGDEIFLLCDKVQKEDIEVYFTGPGWEARGSFSQADVHRQVAIVFRTPPYADPSLQAPVRVSMQLRRPSDRELSEPMEFQYLPDTDDRHRIEEKRKRTYETFKSIMKKSPFSGPTDPRPPPRRIAVPSRSSASVPKPAPQPYPFTSSLSTINYDEFPTMVFPSGQISQASALAPAPPQVLPQAPAPAPAPAMVSALAQAPAPVPVLAPGPPQAVAPPAPKPTQAGEGTLSEALLQLQFDDEDLGALLGNSTDPAVFTDLASVDNSEFQQLLNQGIPVAPHTTEPMLMEYPEAITRLVTGAQRPPDPAPAPLGAPGLPNGLLSGDEDFSSIADMDFSALLSQISS
NF-κB는, 일부 태양에서, 하기 서열번호 2에 나타낸 바와 같은 인간 NF-κB p65 아단위 이성질형 2를 포함하거나, 필수적으로 그로 이루어지거나, 그로 이루어질 수 있다:
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NF-κB는, 일부 태양에서, 하기 서열번호 3에 나타낸 바와 같은 인간 NF-κB p65 아단위 이성질형 3을 포함하거나, 필수적으로 그로 이루어지거나, 그로 이루어질 수 있다:
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NF-κB는, 일부 태양에서, 하기 서열번호 4에 나타낸 바와 같은 인간 NF-κB p65 아단위 이성질형 4를 포함하거나, 필수적으로 그로 이루어지거나, 그로 이루어질 수 있다:
MDELFPLIFPAEPAQASGPYVEIIEQPKQRGMRFRYKCEGRSAGSIPGERSTDTTKTHPTIKINGYTGPGTVRISLVTKDPPHRPHPHELVGKDCRDGFYEAELCPDRCIHSFQNLGIQCVKKRDLEQAISQRIQTNNNPFQVPIEEQRGDYDLNAVRLCFQVTVRDPSGRPLRLPPVLSHPIFDNRAPNTAELKICRVNRNSGSCLGGDEIFLLCDKVQKEDIEVYFTGPGWEARGSFSQADVHRQVAIVFRTPPYADPSLQAPVRVSMQLRRPSDRELSEPMEFQYLPDTDDRHRIEEKRKRTYETFKSIMKKSPFSGPTDPRPPPRRIAVPSRSSASVPKPAPQPYPFTSSLSTINYDEFPTMVFPSGQISQASALAPAPPQVLPQAPAPAPAPAMVSALAQRPPDPAPAPLGAPGLPNGLLSGDEDFSSIADMDFSALLSQISS
NF-κB는, 일부 태양에서, 하기 서열번호 5에 나타낸 바와 같은 마우스 NF-κB p65 아단위를 포함하거나, 필수적으로 그로 이루어지거나, 그로 이루어질 수 있다:
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NF-κB는, 일부 태양에서, 하기 서열번호 6에 나타낸 바와 같은 래트 NF-κB p65 아단위를 포함하거나, 필수적으로 그로 이루어지거나, 그로 이루어질 수 있다:
MDDLFPLIFPSEPAQASGPYVEIIEQPKQRGMRFRYKCEGRSAGSIPGERSTDTTKTHPTIKINGYTGPGTVRISLVTKDPPHRPHPHELVGKDCRDGFYEAELCPDRCIHSFQNLGIQCVKKRDLEQAISQRIQTNNNPFQVPIEEQRGDYDLNAVRLCFQVTVRDPSGRPLRLTPVLSHPIFDNRAPNTAELKICRVNRNSGSCLGGDEIFLLCDKVQKEDIEVYFTGPGWEARGSFSQADVHRQVAIVFRTPPYADPSLQAPVRVSMQLRRPSDRELSEPMEFQYLPDTDDRHRIEEKRKRTYETFKSIMKKSPFNGPTEPRPPPRRIAVPSRGPTSVPKPAPQPYAFSTSLSTINFDEFSPMVLPPGQISNQALALAPSSAPVLAQTMVPSSAMVPSLAQPPAPVPVLAPGPPQSLSAPVPKSTQAGEGTLSEALLHLQFDADEDLGALLGNNTDPGVFTDLASVDNSEFQQLLNQGVAMSHSTAEPMLMEYPEAITRLVTGSQRPPDPAPATLGTSGLPNGLSGDEDFSSIADMDFSALLSQISS
일부 태양에서, NF-κB는, NF-κB의 기능을 여전히 가지면서, 서열번호 1 내지 서열번호 6 중 어느 하나와 약 75% 이상, 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상, 약 96% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상, 또는 약 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 단백질을 포함하거나, 그로 이루어지거나, 필수적으로 그로 이루어진다.
본원에서 사용된 바와 같이, "필수적으로 이루어진다" 또는 "필수적으로 이루어지는"은, 단백질 서열이 서열의 한쪽 또는 양쪽 말단에 및/또는 서열 내에 1개 이상의 아미노산 잔기, 예를 들면, 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 10개 이상, 1 내지 10개, 또는 1 내지 5개 아미노산 잔기를 포함하지만 추가의 아미노산은 단백질의 기능에 실질적으로 영향을 미치지 않는 것을 의미한다.
따라서, 시험 화합물과의 접촉 후에, 시험 집단의 핵내의 NF-κB의 수준을 측정한다. 이것은 핵내 NF-κB 수준의 절대값의 항목으로 수행될 수 있거나, 핵과 세포질 사이의 NF-κB의 상대량을 비교함으로써 달성될 수 있다. 예를 들면, 시험 집단에서 NF-κB의 핵 전위 수준을 측정하는 것은 시험 집단 내의 NF-κB 수준의 세포질/핵 비를 측정함으로써 달성할 수 있다.
핵 NF-κB 수준은 정량적 영상 분석과 결합된 영상화 기술을 이용하여 측정할 수 있다. NF-κB에 대한 형광 표지된 항체를 이용한 면역염색 기술, NF-κB에 대한 1차 항체 및 표지된 2차 항체를 사용한 검출 방법, 또는 일시적으로 또는 안정하게 형질감염된 세포주에서 발현된 형광성 NF-κB 융합 단백질의 영상화를 포함하여, 세포내 분자의 위치확인, 영상화 및 정량화를 위한 다양한 방법들이 공지되어 있다.
핵 및 선택적으로 세포질 내 NF-κB 수준의 측정은 대용량 스크리닝(HCS) 기술을 포함하여 자동 영상화 및 영상 분석 기술을 포함할 수 있다. HCS 기술은 공지되어 있으며, 다중-웰 플레이트에서 접종되거나 배양된 대량의 세포의 자동 영상화에 이은 후속의 정량적 영상 분석을 포함한다. HCS 절차를 사용하는 방법의 한 태양의 개요가 도 2에 묘사되어 있다. 흔히 사용되는 HCS의 유의어는 고속-대량 스크리닝 또는 대용량 영상화를 포함한다. 사실상, NF-κB 전위의 검출 및 정량화를 기반으로 하는 HCS 분석법은 확립되었다[13-15]. 예를 들면, p65 아단위를 포함하여 NF-κB의 특정 아단위는 면역염색에 의해 검출하였다. 또는, NF-κB의 아단위가 형광성 리포터 단백질에 융합되는 융합 단백질 기술이 이용되었다. 상기 HCS 분석법은 인간 및 동물 형질전환 및 암 세포주를 사용하여 확립되었다.
따라서, 컴퓨터-활용 검출 기술의 사용은 핵 및 세포질 내 NF-κB 국소화 수준을 검사하는 것을 용이하게 할 수 있다. 상기 분석법은 속도를 증가시키기 위해 로보트 또는 자동화 장치 또는 미세유체 장치를 사용하여 수행될 수 있다.
상기 방법에서, 일단 NF-κB 국소화 수준이 시험 집단 및 대조군 집단 둘 다에 대해 평가되면, 시험 집단에 대해 수득된 NF-κB 국소화 수준을 시험 화합물과의 접촉을 빼고 동일한 조건하에서 배양시 세포의 대조군 집단에 대해 수득된 값과 비교한다.
대조군 집단에 비해 시험 집단에서 NF-κB의 핵 국소화 수준의 증가는 시험 화합물이 세포를 손상시키고/시키거나 전-염증성 반응을 유도하는 것을 시사하여, 시험 화합물이 그 세포 유형에 대해 독성인 것을 의미한다. 따라서, 예를 들면, 대조군 집단에 비해 시험 집단에서 NF-κB의 세포질/핵 국소화 수준의 비의 감소(또는 핵/세포질 국소화 수준의 비의 증가)는 시험 화합물이 세포를 손상시키고/시키거나 전-염증성 반응을 유도하며, 따라서 그 세포 유형에 대해 독성임을 시사한다.
NF-κB 국소화 수준의 검출을 위한 임계 수준을 설정하는 것이 바람직할 수 있다. 이것은 사용되는 세포의 유형에 무독성인 것으로 알려진 화합물, 일반적으로 독성인 것으로 알려진 일련의 화합물, 및 조직-특이적 또는 장기-특이적 독성이 평가되는 경우, 사용되는 세포 유형에 특이적으로 독성인 것으로 알려진 일련의 화합물로 처리된 양성 및 음성 대조군 집단을 사용함으로써 이루어질 수 있다. 양성 및 음성 대조군은 또한 전체 분석 성능을 측정하기 위해 사용될 수 있다. 진양성, 위양성, 진음성 및 위음성 집단의 수는 시험관내 분석법의 결과를 생체내 데이터와 비교함으로써 측정될 수 있다. 이어서, 주 성능 측정기준(민감도, 특이성, 균형잡힌 정확도, 양성 예측값, 음성 예측값 및 수신자 조작 특성 곡선의 곡선하면적(AUC))을 측정할 수 있다.
또한, 역치 값은 시험 결과가 양성인지 음성인지를 결정하기 위해 측정할 수 있다. 역치 값은 비히클 대조군에 비해 NF-κB 핵 국소화에서의 배수 증가와 관련된다.
예를 들면, NF-κB의 핵 국소화 수준의 증가가 역치 값과 유사하거나 그보다 큰 경우 시험 결과는 양성일 수 있다. 일부 경우에서, NF-κB의 핵 국소화 수준은 NF-κB의 세포질/핵 비를 측정함으로써 평가할 수 있다. NF-κB의 세포질/핵 비의 감소는 NF-κB의 핵 국소화의 증가에 상응함을 인지할 것이다. 따라서, 세포질/핵 비를 이용하는 경우, 양성 값은 전형적으로 역치 값보다 낮다. 최적의 역치 값은 보다 광범위한 역치 값을 시험함으로써 결정될 수 있다. 실제 역치 값은 사용되는 세포의 유형 및 사용되는 배양 및 접촉 조건에 따라 달라질 수 있다.
또는, 자동화 분류 방법을 결과에 이용할 수 있다. 이것은, 예를 들면, 서포트 벡터 머신(support vector machine) 또는 랜덤 포레스트(random forest)와 같은 머신 러닝(machine learning) 알고리즘을 사용함으로써 달성될 수 있다.
임의의 해당 시험 화합물에 대해, 용량 반응 곡선은 화합물을 증가하는 농도로 시험하고 각 농도에 대한 결과를 대조군 집단에 대한 결과와 비교함으로써 산출될 수 있다. 이렇게, 상기 방법에서 독성인 것으로 밝혀진 시험 화합물에 대해 EC50 값이 수득될 수 있다.
본 발명의 방법 및 용도는 하기의 비-제한 실시예에 의해 더 예시된다.
실시예
본 발명자들은, 평가변수로서 NF-κB(예를 들면, 아단위 p65)의 핵 전위를 이용하는, 인간에서 신장 근위 세뇨관(PT) 독성의 예측을 위한 HCS-기반 시험관내 모델을 개발하였다.
하기의 실시예 2 및 3에 나타낸 바와 같이, 인간 1차 신장 근위 세뇨관 세포(HPTC) 또는 근위 세뇨관 세포주(HK-2 및 LLC-PK1)를 사용하여, 모델의 균형잡힌 정확도는 70% 이상인 것으로 밝혀졌다(표 5(도 8)).
하기에 기술되는 바와 같이 수득된 결과들은, NF-κB의 핵 전위가 장기-특이적 독성의 예측을 위한 시험관내 분석법에 평가변수로서 사용될 수 있으며 본 발명의 이전의 발견들과 일치함을 입증한다. 이전에, 본 발명자들은 IL-6 및 IL-8의 상향조절을 측정하는 것이 HPTC, HK-2 및 LLC-PK1 세포[18], 또는 인간 배아[20] 또는 유도 만능 줄기 세포로부터 유도된 HPTC-유사 세포를 사용하여 화합물의 PT 독성에 대해 탁월한 예측성을 제공함을 밝혔다(Kandasamy, Chuah et al., 제출된 사본). IL-6 및 IL-8은 NF-κB의 표적 유전자이며 p65에 의해 상향조절된다[10-12]. IL-6/IL-8 기반 분석법[18,20]이 qPCR에 기반하고 HCS와 양립가능하지 않음을 유의하는 것이 중요하다. 따라서, IL-6/IL-8 기반 분석법은 HCS와 결합시 NF-κB-기반 분석법보다 훨씬 더 낮은 처리량을 가지며 훨씬 더 비싸다.
실시예 1
화합물-유도된 NF-κB 전위를 검출하기 위한 HCS 방법의 개요는 도 2에 나타내었다. 상기 도면은 세포 접종 및 처리 절차의 흐름도(수직 화살)를 나타낸다.
도 2에 나타낸 태양에 묘사된 바와 같이, 세포를 제 0 일에 다중-웰 플레이트(도 2에 나타낸 실시예에서는, 384-웰 플레이트를 사용하였다) 내에 접종시켰다. 접종 후에, 세포를 배양하여 융합성 단층을 생성시켰다. 화합물 처리는 제 3 일에 약 16 시간동안 밤새 수행하였으며, 이어서 세포를 제 4 일에 고정시키고, 예를 들면, 4',6-다이아미디노-2-페닐인돌(DAPI, 세포핵) 및 전체 세포의 가시화를 위해 전세포 염색(WCS)을 이용하여 염색하였다. NF-κB p65는 면역염색에 의해 검출하였다. 염색 후에, 플레이트를 HCS에 의해 영상화하였다. 하기 실시예 2 및 3에 기술된 일부 실험에서는, F-액틴도 또한 검출되었다.
도 2의 하부 우측 부분은 1개 플레이트에 대한 HCS 결과를 나타내며, 웰 당 1개의 다중-채널 영상을 나타내었다(웰 당 9개 다중-채널 영상이 포착되었음을 유의하시오; 플레이트의 가장자리의 웰은 도시되지 않았으며 가장자리 효과를 배제하기 위해 사용하지 않았다). 플레이트 디자인의 윤곽은 도면의 상단 우측에 나타내었다.
각각의 화합물(D1 내지 D9)을 하부로부터 상단까지 증가하는 농도하에(1.6 ㎍/mL로부터 1,000 ㎍/mL) 2개 컬럼(농도당 4개 웰(복제물))에 적용하였다. 대조군들의 위치(Ctrl)를 나타내었다. 세포 사멸로 인해 세포가 고갈된 웰은 진하게 나타났다(우측, 하부).
실시예 2
방법
화합물 및 정의 : 이전에 기술된 바와 같은(참조문헌 [18] 및 [20]) 41개 화합물의 동일한 세트를 이용하였다. 심바스타틴(Simvastatin)이 42번째 화합물로 포함되었으나, 그의 일반적인 높은 세포독성으로 인해 대부분의 분석에서 배제되었다. 화합물 1 내지 22(군 1)는 인간에서 신장독성이며 근위 세뇨관(PT) 세포에 독성이다. 화합물 23 내지 33(군 2)은 인간에서 신장독성이지만, PT 세포에는 독성이 아니다. 화합물 34 내지 41(군 3)은 인간에서 신장독성이 아니다. 진양성(TP)은 시험관내에서 양성 시험 결과를 제공한 군 1 화합물로서 정의되었다. 진음성(TN)은 시험관내에서 음성 시험 결과를 제공한 군 2 및 군 3 화합물로서 정의되었다. 민감도는 TP의 수/22(군 1) 화합물로서 정의되었다. 특이성은 TN의 수/19(군 2 + 3) 화합물로서 정의되었다.
세포 배양 및 화합물 처리 : 상업적인 HPTC(ATCC, PCS-400-010)를 신장 상피 세포 성장 키트(Renal Epithelial Cell Growth Kit, ATCC, PCS-400-040)로 보충된 신장 세포 기본 배지(Renal Cell Basal Medium, ATCC, PCS-400-030)에서 배양하였다. 계대수 4 또는 계대수 5의 세포를 50,000 세포/cm2의 밀도에서 96-웰 팔콘(Falcon) 블랙 플레이트 내에 접종시켰다. 세포를 3일동안 배양한 후 밤새(16 시간) 약물 처리하였다. 모든 화합물을 1,000, 500, 250, 125, 63, 31, 16 및 1.6 ㎍/mL의 농도에서 스크리닝하였다. 25 ㎍/mL의 산화아르센(III)을 양성 대조군으로 사용하였다. 음성 대조군(세포들은 임의의 화합물 또는 비히클로 처리되지 않았다) 및 비히클 대조군을 각 플레이트 상에 포함시켰다. 3개 복제물이 각 데이터점에 포함되었다.
면역염색 : 화합물로 밤새 처리후, 포스페이트-완충 식염수(PBS) 중의 3.7% 포름알데하이드를 사용하여 세포를 고정시켰다. 세포를 5% 소 혈청 알부민(BSA) 및 0.2% 트리톤(Triton) X-100을 함유하는 PBS로 1 시간동안 차단시켰다. 항-NF-κB p65 항체(1:100, sc-372; 산타 크루즈 바이오테크놀로지(Santa Cruz Biotechnology), 미국 캘리포니아주 산타 크루즈 소재)를 실온에서 샘플과 함께 1.5 시간동안 배양하였다. 2차 항체는 알렉사 플루오르(Alexa Fluor) 488 염소 항-토끼 IgG(H+L)(A11008; 1:200; 몰레큘라 프로브즈(Molecular Probes), 라이프 테크놀로지스, 싱가포르)이었다. 샘플을 실온에서 2차 항체 및 로다민 팔로이딘(몰레큘라 프로브즈, R415)과 함께 1 시간동안 배양하였다(로다민 팔로이딘으로 검출된 F-액틴 패턴도 또한 평가하였으나, 이것은 NF-κB와 관련되지 않았다). 마지막으로, 4'.6-다이아미디노-2-페닐인돌(DAPI)(4 ng/mL)을 사용하여 세포 핵을 염색시켰다.
HCS 및 영상 분석 : 이미지엑스프레스마이크로(ImageXpressMICRO) 시스템 버전 2.0(몰레큘라 디바이시즈(Molecular Devices), 영국 워킹엄 소재)을 사용하여 HCS를 수행하였다. 웰 당 4개 영상을 포착하였다. 메타엑스프레스(MetaXpress™) 영상 분석 소프트웨어(버전 2.0; 몰레큘라 디바이시즈)를 사용하여 양성 세포의 퍼센트를 정량화하였다. 세포는 핵 영역(DAPI 염색에 의해 정의됨)이 시토졸의 정의된 영역과 같거나 그보다 높은 중간 강도의 녹색 형광을 가질 때 NF-κB 전위에 대해 양성인 것으로 정의되었다. 상기 시토졸 영역은 핵 영역 주위에 2 ㎛ 두께의 고리로 이루어졌다.
결과
표 1(도 3)은 분석법에 사용된 41개의 상이한 시험 화합물들에 대한 히트맵을 포함한다; HPTC는 나타낸 41개 약물로 16 시간동안 처리하였다. 다음의 약물 농도를 사용하였다: 1,000, 500, 250, 125, 63, 31, 16 및 1.6 ㎍/mL. 세포를 HCS에 의해 영상화하였으며, HCS 데이터 세트는, 약물 42번(심바스타틴)이 표 1에 포함되지 않은 것을 제외하고, 하기 표 3에 사용된 데이터 세트와 동일하다.
영상 분석은 방법 부분에서 개략된 바와 같이 수행하였다. 각 상자 안의 숫자는 양성이며 NF-κB의 핵 전위를 나타낸 세포들의 퍼센트(복제물당 4개 영상을 사용하여 3개 복제물의 평균)를 나타낸다. 별표는 세포수가 세포 사멸로 인해 낮은 경우를 구별한 것이다.
표 2(도 4)는 표 1에 나타낸 결과로부터 유도된 EC50 값을 나타내며 시험한 농도 범위 내에서 화합물의 임의의 해당 농도에서의 양성 세포의 최고 퍼센트를 요약한 것이다(표 1의 각 열에 최고값).
육안 검사로 측정한 바와 같은, NF-κB 전위의 정성적 분석의 내용을 표 3(도 5)에 나타내었다. 그로부터 표 3에 요약되어 있는 결과가 유도된 HCS 연구는 2013년 6월 20일부터 2013년 7월 5일까지의 기간동안 수행하였다. 스크리닝은 96-웰 플레이트를 사용하여 수행하였으며, 상기 플레이트에 세포를 접종하고, 약물로 처리하고, 면역염색하고 HCS로 영상화하였다. 스크리닝시 개개 화합물을 사용하여 수득된 스크리닝 결과를 기록하였으며, 이것은 전체 스크리닝이 2013년 7월 5일에 종료되었을 때 재평가하고 표 3에 집계하였다. 예를 들면, 양성 결과는 파라쿼트, 산화아르센(III), 산화비스무트(III), 염화금(I), 아세트산납, 이크롬산칼륨 및 테트라사이클린을 사용하여 수득되었다.
도 6은 민감도, 특이성 및 임상 데이터와의 전체적 일치율의 퍼센트(y-축)를 나타낸다. 컷-오프 값(x-축)은 양성 세포의 퍼센트를 나타낸다. 예를 들면, 70%의 컷-오프 값에서 모든 결과는 양성으로 분류되었으며, 이때 NF-κB 전위가 세포의 70% 이상에서 유도되었다(시험한 범위 내의 임의의 농도에서, 표 2, 우측난). 70%의 컷-오프 값은 70% 초과의 인간 임상 데이터와의 전체적 일치율 및 균형잡힌 정확도(민감도 + 특이성의 평균)를 제공하였다.
실시예 3
방법
화합물 및 정의 : 실시예 2의 41개 화합물 세트 중 38개(토브라마이신, 이포스파미드, 아토르바스타틴 제외) 및 5개의 새로운 화합물(세팔로리딘, 세팔로틴, 메트포르민 하이드로클로라이드, 아리스톨로크산 및 오크라톡신 A)을 포함하는 43개 화합물 세트를 사용하였다. 화합물 1 내지 24(군 1)는 인간에서 신장독성이며 근위 세뇨관(PT) 세포에 독성이다. 화합물 25 내지 43(군 2)은 인간에서 신장독성이 아니거나 인간에서 신장독성이지만, PT 세포에는 직접적으로 독성은 아니다. 진양성(TP)은 시험관내에서 양성 시험 결과를 제공한 군 1 화합물로서 정의되었다. 진음성(TN)은 시험관내에서 음성 시험 결과를 제공한 군 2 화합물로서 정의되었다. 민감도는 (TP의 수)/24(군 1) 화합물로서 정의되었다. 특이성은 (TN의 수)/19(군 2) 화합물로서 정의되었다. 균형잡힌 정확도는 민감도와 특이성의 평균값이다.
세포 배양 및 화합물 처리 : HPTC의 3개의 상이한 배치를 사용하였다. 상업 적인 HPTC, Lot. No. 58488852(HPTC1) 및 Lot. No. 61247356(HPTC10)을 미국 균주은행(American Type Culture Collection, ATCC, 미국 버지니아주 매너서스 소재)으로부터 가져왔다. HPTC6은 국립 대학 병원(National University Health System, NUHS, 싱가포르)에서 입수한 신장절제술 샘플로부터 단리하였다. 병리학적 변화가 없는 정상 조직만을 사용하였으며, 이것은 병리학자에 의해 선별되었다. HPTC의 3개 배치 모두, 신장 상피 세포 성장 키트(ATCC, Cat. No. PCS-400-040) 및 1% 페니실린 스트렙토마이신(Penicillin Streptomycin)(깁코(Gibco), Cat. No. 15140-122)으로 보충된 ATCC 신장 상피 세포 기본 배지(ATCC, Cat. No. PCS-400-030)에서 배양하였다. 계대수(P) 4 및 P5의 HPTC만을 사용하였다. HK-2 및 LLC-PK1 세포는 ATCC로부터 구입하였다. 상기 2개의 세포주는 10% 태아 소 혈청(FBS) 및 1% 페니실린 스트렙토마이신으로 보충된 둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle Medium, DMEM)에서 유지하였다. 인간 신장 샘플(DSRB-E/11/143) 및 세포 유형(NUS-IRB Ref. Code: 09-148E)을 사용한 연구에 대한 승인을 획득하였다. 모든 세포는 37 ℃ 및 5% CO2에서 가습 대기하에 배양하였다.
세포를 투명 바닥을 갖는 384-웰 블랙 플레이트(그레이너(Greiner), Cat. No. 781091) 내에 접종하였다. HPTC1 및 HPTC6은 50,000 세포/cm2로 접종하고; HPTC10은 100,000 세포/cm2로 접종하고; HK-2 세포는 20,000 세포/cm2로 접종하고 LLC-PK1 세포는 10,000 세포/cm2로 접종하여, 사용된 상이한 세포 유형 및 배치들의 상이한 성장 동역학에 맞춰 조정하였다. 모든 세포는 3 일동안 배양하여 분화된 단순 상피의 형성을 달성한 후 밤새(16 시간) 약물 처리하였다. 스크리닝된 43개 약물의 농도는 1,000, 500, 250, 125, 63, 16 및 1.6 ㎍/mL이었다. 100 ㎍/mL의 퓨로마이신 및 100 ng/mL의 TNF-α를 양성 대조군으로 사용하였다. 음성 대조군은 처리되지 않고 남은 세포(무비히클, 무화합물) 및 100 ㎍/mL 덱사메타손으로 처리된 세포를 포함하였다. 비히클 대조군도 또한 각 플레이트상에 포함되었다. 각각의 화합물 및 농도 당 4개 복제물을 시험하였다.
면역염색 : 화합물로 밤새 처리후, 포스페이트-완충 식염수(PBS) 중의 3.7% 포름알데하이드를 사용하여 세포를 고정시켰다. 세포를 5% 소 혈청 알부민(BSA) 및 0.2% 트리톤 X-100을 함유하는 PBS로 1 시간동안 차단시켰다. 샘플을 4 ℃에서 항-NF-κB p65 항체(압캠(Abcam), Cat. No. ab16502)와 함께 밤새 배양하였다. 알렉사 플루오르 488 염소 항-토끼 IgG(H+L)(인비트로겐(Invitrogen), Cat. No. A11008)를 2차 항체로 사용하였다. 최종적으로, 세포를 DAPI(메르크(Merck), Cat. No. 268298), 로다민 팔로이딘(인비트로겐, Cat. No. R415) 및 전세포 염색 레드(셀로믹스(Cellomics), Cat. No. 8403401)로 대비염색하였다. 로다민 팔로이딘을 사용한 F-액틴의 검출은 NF-κB에 대한 연구와 무관하였다.
HCS 및 영상 분석 : HCS에 의한 영상 수집은 실시예 1 및 2에 기술된 바와 동일한 장비 및 소프트웨어를 사용하여 수행하였다. DAPI(세포핵), 알렉사 플루오르 488(NF-κB; 염색 패턴에 대한 보다 나은 인지를 위해 NF-κB 염색은 도 9 내지 12에서 적색으로 나타내었다), 로다민 팔로이딘(F-액틴) 및 Cy5(전세포 염색 레드)를 검출하기 위해 4개의 상이한 채널을 이용하였다. 웰 당 9개 부위를 영상화하였다(모두 4개 채널). 영상들은 전위-증대 모듈(Translocation-Enhanced Module)[19]을 사용하여 메타엑스프레스™ 영상 분석 소프트웨어 버전 2.0을 이용함으로써 자동적으로 분석되었다. DAPI 염색된 영역을 이용하여 내부 핵 영역(핵) 및 외부 핵 영역(핵 주위 세포질)을 정의하였다. DAPI 염색된 영역의 가장자리로부터 2 ㎛ 이내의 영역을 내부 핵 영역(핵)으로 정의하였다. DAPI 염색된 영역의 외부 가장자리로부터 0.1 내지 2 ㎛의 고리를 외부 핵 영역(세포질)으로 정의하였다. 외부 핵 영역 대 내부 핵 영역의 강도 비는 메타엑스프레스™ 영상 분석 소프트웨어(버전 2.0)에 의해 자동으로 정량화되었다. 각각의 데이터점에 대한 최종 정량적 결과는 36개 영상들(웰 당 9개의 다중-채널 영상을 사용하여 4개 복제물(웰))로부터의 평균 결과였다.
결과
표 4(도 7)는 히트맵을 나타낸 것이다. HPTC의 3개 배치 및 2개 세포주(HK-2 및 LLC-PK1)를 나타낸 43개 화합물로 16 시간동안 처리하였다. 다음의 화합물 농도를 사용하였다: 1,000, 500, 250, 125, 63, 16 및 1.6 ㎍/mL. 세포를 이미지엑스프레스마이크로 시스템을 사용하여 HCS에 의해 영상화하였다. 영상들은 방법 부분에서 기술된 바와 같은 메타엑스프레스™ 영상 분석 소프트웨어 버전 2.0에 의해 자동 분석되었다. 외부 핵 영역(세포질) 대 내부 핵 영역(핵)의 평균 강도 비는 각 화합물에 대해 시험한 각 농도에서 측정하였다. 각 상자 안의 숫자는 시험한 농도의 전체 범위에 대해 각 화합물에 대해 수득된 최저 강도 비를 나타낸다(시험한 7개 농도에서 7개의 값들을 수득하였으며, 최저값을 선택하고 표 4에 나타내었다).
표 4에 나타낸 결과는 0.75의 컷-오프 값을 이용하여 양성 또는 음성으로 분류하였다(0.75 이하의 모든 결과는 양성으로 분류되었다). 표 5(도 8)는 상기 컷-오프 값을 사용하여 민감도, 특이성 및 균형잡힌 정확도에 대해 수득된 결과를 나타낸 것이다. HPTC의 3개의 상이한 배치 및 2개 세포주(HK-2 및 LLC-PK1)를 사용하였다.
도 9에 나타낸 바와 같이, HPTC1은 미처리 상태에서(상단) 또는 나타낸 대조군 화합물로 처리한 후에 HCS에 의해 영상화하였다. DAPI 염색된 세포 핵(청색, 좌측) 또는 NF-κB-염색(적색, 중앙)이 나타나 있다. 병합된 영상은 우측에 나타내었다. 핵 영역은 미처리 세포, 비히클 대조군 및 음성 대조군에서 NF-κB가 고갈되었다(NF-κB(적색, 중앙)에 대해 염색된 세포 중심에 "진한색 전체"). 양성 대조군 샘플(100 ㎍/mL의 퓨로마이신 및 100 ng/mL의 TNF-α)은 NF-κB의 핵 전위를 나타내었다(DAPI-양성 핵 영역에서 NF-κB의 증가된 강도). 축척바: 50 ㎛.
도 10에 나타낸 바와 같이, HPTC1은 나타낸 화합물들로 처리후 HCS에 의해 영상화하였다. DAPI 염색된 세포 핵(청색, 좌측) 또는 NF-κB-염색(적색, 중상)이 나타나 있다. 병합된 영상은 우측에 나타내었다. 모든 화합물들은 인간에서 근위 세뇨관 세포에 직접적으로 독성인 신장독이었다. 나타낸 선택 사례에서 사용된 농도는 화합물 이름 아래에 제공되어 있다(모든 화합물은 전체 범위의 농도에서 시험하였지만, 영상들의 전부를 여기에 나타낼 수는 없다). 여기서 선택된 농도는 시토졸로부터 핵으로의 NF-κB 전위가 관찰된 화합물의 최저 농도였다. 시험한 전체 범위의 농도에서 수득된 HCS 결과를 기준으로, EC50(세포의 50%에서 NF-κB의 핵 전위가 일어난 화합물 농도) 및 IC50(세포의 50%에서 세포 사멸이 일어난 화합물 농도; 세포 핵의 총수를 기준으로 한 결과) 값을 산출하였다. 세포의 50% 초과가 1,000 ㎍/mL의 최고 화합물 농도에서 여전히 존재하는 경우 1,000 ㎍/mL 초과의 IC50 값을 나타내었다. 1,000 ㎍/mL 초과의 상기 높은 IC50 값을 기준으로, 각각의 화합물들은 세포 사멸이 독성을 예측하기 위한 평가변수로 사용된 경우 인간에서 근위 세뇨관 세포에 독성이 아닌 것으로 예측되었다(이 도면에 포함된 모든 화합물들은 상기 세포 유형에 독성이다). 대조적으로, 모든 경우에서, NF-κB의 핵 전위는 시험한 농도 범위 내에서 50% 초과의 세포에서 관찰되었으며, 모든 화합물들은 상기 결과에 근거하여 독성인 것으로 예측된다. 상기 결과는 NF-κB 전위가 세포 사멸과 비교한 평가변수로 사용될 때 민감도가 더 높음을 나타낸다. 이것은 또한 EC50 값이 IC50 값보다 낮다는 사실(타크롤리무스(Tacrolimus)는 제외, 여기서는 두 값이 다 비교작 낮다)에 의해서도 반영된다. 축척바: 50 ㎛.
HPTC1은 도 11에 나타낸 바와 같이, 나타낸 화합물들로 처리 후에 HCS에 의해 영상화하였다. 도 10에 대해서와 동일한 화합물을 사용하였다. 도 11에서의 영상들은 최대 화합물 농도(1,000 ㎍/mL)로 처리 후에 포착하였다. NF-κB의 실질적인 핵 전위가 관찰되었다. 일부 영상들에서는 세포 사멸로 인해 몇개의 세포만을 볼 수 있다. 축척바: 50 ㎛.
도 12에서 보이듯이, HPTC1은 나타낸 화합물들로 처리 후에 HCS에 의해 영상화하였다. 영상들은 최대 화합물 농도(1,000 ㎍/mL)로 처리후에 포착하였다. 상기 도면에 포함된 모든 화합물들은 인간에서 근위 세뇨관 세포에 직접적으로 독성이 아니다. NF-κB의 실질적인 핵 전위 또는 세포 사멸은 관찰되지 않았다. 모든 EC50 및 IC50 값은 1,000 ㎍/mL 초과이었다. 축척바: 50 ㎛.
고찰
전술한 실시예 1 및 2는 1차 및 불멸화 인간 신장 세포에 관한 것이지만, NF-κB 전위는 또한 각각의 장기-특이적 세포 유형을 이용하여 다른 장기들에 대한 독성 효과를 스크리닝하기 위해 사용될 수 있다. NF-κB는 모든 인간 및 동물 세포 유형에서 편재적으로 발현되며, NF-κB 활성화는 부상, 질환 및 염증과 관련하여 많은 상이한 기관계에서 일어난다[7].
따라서, NF-κB 전위는 또한 인간 또는 동물에서 다른 기관계와 관련하여 화합물들의 독성 및 전-염증성 능력을 평가하기 위해 사용될 수 있다. 이것은 각각의 장기-특이적 인간 또는 동물 세포 유형을 사용함으로써 이루어질 수 있다. 바람직하게는, 1차 세포, 또는 성인, 배아 또는 유도 만능 줄기 세포로부터 유도된 유사한 세포 유형이 사용되어야 한다.
따라서, 장기-특이적 세포 유형은 HCS에 적절한 기재(예, 다중-웰 플레이트) 위에 접종된다. 상기 기재상에서, 장기-특이적 세포 유형은 상기 세포 유형에 대한 잠재적인 독성 및 전-염증성 효과에 대해 스크리닝될 화합물로 처리된다. 상기 화합물에 의한 NF-κB 핵 전위의 유도는 HCS 및 후속 영상 분석에 의해 측정되며, NF-κB의 활성화는 양성 결과로 분류된다. 상기 분석법은 1차 인간 또는 동물 장기-특이적 세포 유형(예를 들면, 1차 신장 세포 유형, 예를 들어, HPTC, 1차 래트 간세포 또는 1차 인간 피부 각질세포)을 사용하여 수행된다. 또는, 줄기 세포로부터 유도된 장기-특이적 세포 유형이 사용될 수 있다. 적절한 줄기 세포 유형은 모든 종류의 인간 또는 동물 성인 줄기 세포(예를 들면, 골수-유래 중간엽 줄기 세포 또는 지방-유래 줄기 세포), 또는 인간- 또는 동물-유래 유도 만능 줄기 세포 또는 배아 줄기 세포를 포함한다.
상기 NF-κB-기반 분석법에 포함될 수 있는 기관계 및 세포 유형은 다음과 같다: 간(간세포 또는 기타 간 세포 유형), 신장(사구체, 세뇨관 및 기타 신장 세포 유형), 심혈관계(심근세포, 내피 세포), 중추신경계(뉴런, 성상교세포, 아교세포), 피부(각질세포, 피부 섬유아세포, 및 부속 구조물: 선 및 모공에 특이적인 세포 유형), 폐(기도 상피 세포, 폐포 세포), 췌장(베타-세포 및 기타 췌장 세포 유형), 소화관(위 및 소장의 여러가지 세포 유형들), 생식 세포 및 이의 전구체를 포함한 생식 기관에 특이적인 세포 유형, 감각 기관(눈- 및 귀-특이적 세포 유형), 골수 및 혈액 세포
본원에 기술된 분석법과 이전에 확립된 NF-κB-기반 HCS 분석법의 차이는 다음과 같다. (1) 본원에 기술된 바와 같은 분석법에서는, NF-κB/p65 전위가 화합물의 장기-특이적 독성 및 NF-κB 신호전달을 유도하는 그의 능력을 예측하기 위한 평가변수로 사용된다. 상기 분석법은 시험되는 화합물로 처리 전에 활성화제/작용제(예를 들면, TNF-α 또는 IL-1)에 의해 유도된 NF-κB 전위의 조절은 다루지 않는다. (2) NF-κB의 활성화제/작용제, 예를 들면, TNF-α 또는 IL-1이 사용되지 않는다. (3) HSC 분석법은 인간 1차 장기-특이적 세포 유형을 사용하여 수행되었지만, 줄기 세포로부터 유도된 분화된 세포를 사용하여서도 또한 수행될 수 있다.
본 명세서에 인용된 모든 출판물 및 특허출원은, 각각의 개개 출판물 또는 특허 출원이 참고로 인용되는 것으로 분명히 개별적으로 나타낸 바와 같이 본원에 참고로 인용된다. 임의 출판물의 인용은 출원일 이전의 그의 개시내용에 대한 것이며, 본 발명이 선행 발명 때문에 상기 출판물보다 앞서는 권리가 없다는 인정으로 이해해서는 안된다.
본 명세서 및 첨부된 특허청구범위에서 사용된 바와 같이, 단수형은 문맥상 명확히 달리 지시하지 않는 한 복수의 언급대상을 포함한다. 본 명세서 및 첨부된 특허청구범위에서 사용된 바와 같이, 용어 "포함하다", "포함하는", "포함" 및 상기 용어의 다른 형태들은 비-제한적 포괄적인 의미에서 의도된다, 즉, 임의의 다른 요소 또는 성분을 배제하지 않고 특정한 나열된 요소들 또는 성분들을 포함하는 것이다. 본 명세서 및 첨부된 특허청구범위에서 사용된 바와 같이, 주어진 바와 같은 모든 범위 및 목록들은 그 안에 포함된 임의의 중간 값 또는 범위 또는 임의의 항목 또는 부분목록을 시사하는 것이다. 달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 당해 분야에 통상의 기술을 가진 자에게 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다.
명확한 이해를 위해 상기 발명을 예시 및 예로써 다소 상세하게 기술하였지만, 본 발명의 교시에 비추어서 본 발명의 진의 및 범위에서 벗어나지 않고 본 발명에 특정한 변화 및 수정이 이루어질 수 있음은 당해 분야에 통상의 기술을 가진 자에게 용이하게 명백하다.
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Ser Ile Ala Asp Met Asp Phe Ser Ala Leu 530 535 540 Leu Ser Gln Ile Ser Ser 545 550

Claims (22)

  1. 특정 세포 타입에서 화합물의 독성을 예측하는 시험관내 방법으로서,
    핵 인자(NF)-κB가 접촉 전에 활성화되지 않은 상기 특정 세포 타입의 세포의 시험 집단과, 시험 화합물을 1시간 또는 그 이상의 기간 동안 접촉시키는 단계로서, 상기 화합물은 독성이 평가되어야 하고, 상기 방법을 수행하기 전에 NF-κB를 활성화하거나 NF-κB 핵 전위를 유도하는 능력이 알려지지 않은 화합물인, 단계;
    상기 접촉에 이어 시험 집단에서 NF-κB의 핵 국소화 수준을 측정하는 단계;
    시험 집단의 NF-κB의 핵 국소화 수준을, 시험 화합물과 접촉하지 않은, 상기 특정 세포 타입의 세포의 대조군 집단의 NF-κB의 핵 국소화 수준과 비교하는 단계; 및
    대조군 집단에 대한 시험 집단에서의 NF-κB의 핵 국소화 수준의 증가에 기초하여, 시험 화합물이 상기 특정 세포 타입에게 독성이 있는지를 예측하는 단계
    를 포함하는, 시험관내 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    NF-κB가 NF-κB의 p65 아단위인, 시험관내 방법.
  3. 제 2 항에 있어서,
    NF-κB의 p65 아단위가 서열번호 1 내지 4 중 어느 하나에 나타낸 서열을 포함하는, 시험관내 방법.
  4. 제 2 항에 있어서,
    NF-κB의 p65 아단위가 서열번호 5 또는 6에 나타낸 서열을 포함하는, 시험관내 방법.
  5. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    시험 집단 및 대조군 집단의 세포가 인간 세포인, 시험관내 방법.
  6. 제 1 항, 제 2 항 및 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    시험 집단 및 대조군 집단의 세포가 비-인간 동물 세포인, 시험관내 방법.
  7. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    시험 집단 및 대조군 집단의 세포가 줄기 세포를 포함하는, 시험관내 방법.
  8. 제 7 항에 있어서,
    줄기 세포가 배아 줄기 세포, 중간엽 줄기 세포, 조혈 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포, 조직-특이적 줄기 세포 또는 장기-특이적 줄기 세포를 포함하는, 시험관내 방법.
  9. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    시험 집단 및 대조군 집단의 세포가 체세포, 또는 줄기 세포로부터 유도된 세포를 포함하는, 시험관내 방법.
  10. 제 9 항에 있어서,
    세포가 종양 세포를 포함하는, 시험관내 방법.
  11. 제 9 항에 있어서,
    세포가 1차 세포를 포함하는, 시험관내 방법.
  12. 제 9 항에 있어서,
    세포가 간 세포, 신장 세포, 심혈관 세포, 중추신경계 세포, 피부 세포, 폐 세포, 췌장 세포, 소화관 세포, 눈 세포, 귀 세포, 골수 세포 또는 혈액 세포를 포함하는, 시험관내 방법.
  13. 제 9 항에 있어서,
    세포가 신장 근위 세뇨관 세포를 포함하는, 시험관내 방법.
  14. 제 13 항에 있어서,
    신장 근위 세뇨관 세포가 인간 1차 신장 근위 세뇨관 세포인, 시험관내 방법.
  15. 제 9 항에 있어서,
    세포가 계통확립 세포주로부터의 세포를 포함하는, 시험관내 방법.
  16. 제 15 항에 있어서,
    세포가 HK-2 세포 또는 LLC-PK1 세포인, 시험관내 방법.
  17. 제 9 항에 있어서,
    세포가 배아 줄기 세포, 중간엽 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포 또는 장기/조직-특이적 줄기 세포로부터 분화된 줄기 세포로부터 유도된 세포를 포함하는, 시험관내 방법.
  18. 제 17 항에 있어서,
    세포가 간 세포, 신장 세포, 심혈관 세포, 중추신경계 세포, 피부 세포, 폐 세포, 췌장 세포, 소화관 세포, 생식 세포 또는 이의 전구체, 눈 세포, 귀 세포, 골수 세포 또는 혈액 세포와 유사하도록 적어도 부분적으로 분화되는, 시험관내 방법.
  19. 제 18 항에 있어서,
    세포가 신장 근위 세뇨관-유사 세포인, 시험관내 방법.
  20. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 기간이 1 내지 16 시간, 12 내지 16 시간, 30 내지 36 시간, 또는 3 일 동안인, 시험관내 방법.
  21. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    측정 전에 4주 이하의 전체 기간에 걸쳐 규칙적인 간격으로 1회 이상 접촉을 반복하는 것을 추가로 포함하되, 상기 접촉이 상기 접촉의 각각의 경우에 대해 동일한 기간동안 수행되는, 시험관내 방법.
  22. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    접촉에 이은 측정을 4주 이하의 전체 기간에 걸쳐 규칙적인 간격으로 1회 이상 반복하는 것을 추가로 포함하되, 상기 접촉이 상기 접촉의 각각의 경우에 대해 동일한 기간동안 수행되는, 시험관내 방법.
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