KR102352489B1 - 소수성 개질된 글리콜 키토산 나노입자 및 이를 이용한 신장 표적화 약물 전달체 - Google Patents

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Abstract

본 발명의 일 실시예는, 소수성 담즙산으로 치환된 글리콜 키토산을 포함하는 글리콜 키토산 나노입자를 제공한다.

Description

소수성 개질된 글리콜 키토산 나노입자 및 이를 이용한 신장 표적화 약물 전달체{Hydrophobically modified glycol chitosan nanoparticle and renal targeted drug delivery system using the same}
본 발명은 소수성 개질된 글리콜 키토산 나노입자, 상기 글리콜 키토산 나노입자를 포함하는 신장 표적용 약물전달체, 및 상기 약물전달체를 포함하는 약학제제에 관한 것이다.
최근 만성 신장 질환 및 말기 신장 질환의 유병률이 증가하고 있으며, 이는 심각한 사회경제적 부담을 나타낸다. 이와 같이 신장 조직이 손상되어 신장 이식을 시행한 환자의 경우, 면역 거부 반응을 억제하기 위하여 평생 면역억제제를 투여 받아야 한다. 면역억제제로 알려진 타크로리무스(tacrolimus, TAC), 시클로스포린과 같은 칼시뉴린 억제제는 신장 이식 후 면역 거부 반응을 억제하기 위하여 주로 전신 투여로 주사된다.
면역억제제의 장기 투여는 신장 독성이나 신경 독성과 같은 전신 부작용을 보이기도 하지만, 환자의 면역력을 감소시켜서 다양한 감염 질환이나 고혈압, 당뇨, 종양 등에 노출될 가능성이 높게 한다.
이를 최소화하기 위해서는 면역억제제를 이식 부위인 신장 조직에 특이적으로 전달하려는 노력이 필요하다. 이와 같이 신장 조직에 약물을 표적화하는 것은 표적에 도달하기 전 발생할 수 있는 표적외 독성, 좁은 치료 지수 및 약물의 대사 불활성화에 의해 유발되는 어려움을 감소시킬 수 있다.
대한민국 공개특허 제10-2013-0121813호
본 발명의 일 과제는 소수성 담즙산으로 치환된 글리콜 키토산을 포함하는 글리콜 키토산 나노입자를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 일 과제는 상기 글리콜 키토산 나노입자를 포함하는 신장 표적화 약물전달체 및 이를 포함하는 신장 표적화 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명자들은 소수성 글리콜 키토산 나노입자가 신장-표적화 특성을 나타내는 것을 통해 면역억제제 등 약물을 신장 조직에 특이적으로 전달할 수 있는 가능성을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 일 양태는 소수성 담즙산으로 치환된 글리콜 키토산을 포함하는 글리콜 키토산 나노입자를 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 소수성 담즙산은 5-β콜란산, 콜산, 케노데옥시콜산, 글리코콜산, 타우로콜산, 데옥시콜산, 리소콜산 및 7-옥소-리소콜산으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 소수성 담즙산은 5-β 콜란산일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 글리콜 키토산은 마이셀 형태일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 글리콜 키토산 나노입자는 형광염료를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 형광염료는 하기 화학식 1로 표시될 수 있다:
Figure 112019127166311-pat00001
본 발명의 다른 일 양태는 상기 글리콜 키토산 나노입자를 포함하는 신장 표적화 약물전달체를 제공한다.
본 발명의 또 다른 일 양태는 상기 신장 표적화 약물전달체 및 상기 약물전달체 내부에 담지된 약물을 포함하는 신장 표적화 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 약물은 면역억제제, 신암치료제 또는 만성신장질환 치료제일 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 양태는 상기 약물전달체를 이용하는 신장으로의 약물 전달 방법을 제공한다.
본 발명을 일 실시예에 따른 소수성기인 담즙산으로 치환된 글리콜 키토산을 포함하는 글리콜 키토산 나노입자는 신장을 표적으로 하여 이동하므로 전신 투여 시에도 단시간 내에 신장 조직에 과량 축적될 수 있다.
글리콜 키토산은 자기조립에 의하여 마이셀을 형성하여 그 내부 공동에 약물을 담지할 수 있으며, 담지된 약물을 신장 조직에 특이적으로 전달할 수 있어 약물의 신장 분포를 향상시키는 동시에 전신 독성 및 면역력 감소를 방지할 수 있다. 또한, 상기 마이셀은 약물을 장기간 지속적으로 방출할 수 있기 때문에 그 유용성이 크다.
또한, 형광염료가 포함된 글리콜 키토산 나노입자는 보다 개선된 전술한 효과와 함께, 약물 위치의 표지로서도 사용할 수 있다.
본 발명의 효과는 상기한 효과로 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 상세한 설명 또는 특허청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 소수성 담즙산인 5-β콜란산으로 치환된 글리콜 키토산의 합성을 위한 반응식을 나타낸다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 글리콜 키토산 나노입자의 자기조립을 통한 HGC-TAC 나노마이셀 형성 과정의 모식도를 나타낸다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 글리콜 키토산 나노입자에 대한 1H-NMR 스펙트럼(a); 임계 마이셀 농도(CMC) 그래프(b); FE-TEM 이미지(c); 및 TAC의 방출 특성(d)을 나타낸다.
도 4는 발명의 일 실시예에 따른 글리콜 키토산 나노입자(HGC), TAC-담지 글리콜 키토산 나노입자(HGC-TAC) 및 TAC 함유 배지에서의 세포 생존능(a, b; value = mean ± SD. n=3) 및 시간에 따른 글리콜 키토산 나노입자의 세포 흡수를 확인할 수 있는 CLSM 이미지(c)를 나타낸다(scale bar= 50 μm).
도 5는 HK-2 세포주에서 본 발명의 일 실시예에 따른 형광염료(F675) 접합된 HGC-TAC 나노마이셀의 세포내 흡수 억제 양상을 나타낸다(scale bar = 100 μm).
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 형광염료(F675) 접합된 HGC-TAC 나노마이셀 주사 후 시간 경과에 따른 각 기관에서의 형광 이미지(a) 및 형광 강도(b)를 나타낸다 (value = mean ± SD, n=3, 이원 변량 분석(Two-way ANOVA)을 사용하여 수행된 통계적 유의성 : **p < 0.01; ***p<0.001).
도 7은 신장에서의 본 발명의 일 실시예에 따른 나노마이셀의 주사 후 사구체 및 근위 세뇨관 영역에서의 형광 이미지(a) 및 대조군(b)을 나타내며(상단 행은 4X 배율, scale bar = 1,000 μm; 하단 행은 40X 배율, scale bar = 100 μm), 신장 조직의 면역화학염색 이미지를 나타낸다((c): AQP 1 - 녹색, HGC-TAC F675 나노마이셀 - 적색, 핵염색 DAPI - 청색, scale bar = 100μm; 포도신 - 녹색, HGC-TAC F675 나노마이셀 - 적색, 핵염색 DAPI - 청색, scale bar = 200μm).
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 나노마이셀의 주사 후 혈장에서의 TAC 농도 프로파일(a) 및 신장에서의 TAC 농도(% injection dose/gram of tissue)(b)를 나타낸다(data = 평균 ± SD, 이원 변량 분석을 사용하여 수행된 통계적 유의성 : **p < 0.05, ***p<0.001은 유의한 것, NS는 비유의한 것으로 간주됨).
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 나노마이셀(HGC-TAC 나노마이셀) 및 TAC의 마우스 신장에서의 각 마커 단백질의 발현에 미치는 효과, 및 IHC 염색 이미지를 나타낸다(원배율, 100x, scale bar = 100 μm; 삽입도: 사구체의 확대도, 원배율, 400x. scale bar = 25 μm).
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 나노마이셀 및 TAC의 마우스에 대한 전신효과를 확인하기 위한 체중, 혈청 크레아닌 및 혈장 TAC 수준을 나타낸다(data = 평균 ± SEM, *p < 0.05, NS는 비유의한 것).
이하에서는 첨부한 도면을 참조하여 본 발명을 설명하기로 한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며, 따라서 여기에서 설명하는 실시예로 한정되는 것은 아니다.
본 명세서에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 명세서에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 명세서상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
본 발명의 일 양태는 소수성 담즙산으로 치환된 글리콜 키토산을 포함하는 글리콜 키토산 나노입자를 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 따른 글리콜 키토산 나노입자는 소수성 담즙산으로 치환된 글리콜 키토산이 자기조립 되어 형성된 마이셀, 바람직하게는 나노마이셀 형태로 제공될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 “키토산”은 D-글루코사민과 N-아세틸 글루코사민으로 구성된 선형 공중합체로서, 키틴의 탈아세틸화로부터 수득된 생분해성 다당류 중합체이다. 키토산은 분자량 및 탈아세틸화 정도에 따라 상이한 물리화학적 특성을 보유하는 것으로 알려져 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 “글리콜 키토산(glycol chitosan, GC)”은 키토산과 에틸렌글리콜의 접합에 의해 생성된 키토산의 수용성 유도체로서, 독성이 낮으며 생분해성 및 생체적합성이 뛰어나고, 수용성 및 반응성 아미노 및 카복실기의 존재로 인해 약물 전달 용도로서 연구 대상이 되고 있다. 글리콜 키토산의 크기는 103 Da 내지 104 Da일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 “담즙산(bile acid)” 또는 “소수성 담즙산”은 쓸개즙의 주요 성분으로, 콜레스테롤에서 생성되는 바 그 화학적 구조는 스테로이드에 속한다. 상기 담즙산은 5-β콜란산(5-βcholanic acid), 콜산(cholic acid), 케노데옥시콜산(chenodeoxycholic acid), 글리코콜산 (glycocholic acid), 타우로콜산(taurocholic acid), 데옥시콜산(deoxycholic acid), 리소콜산(lithocholic acid) 및 7-옥소-리소콜산(7-oxo-lithocholic acid)으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있으며, 바람직하게는 5-β 콜란산일 수 있다.
예를 들어, 소수성 담즙산으로 치환된 글리콜 키토산은 글리콜 키토산의 아민기에 콜란산의 카복실기가 결합됨으로써 제조될 수 있다(도 1). 구체적으로, 소수성 담즙산으로 치환된 글리콜 키토산은 수용성 용매에 키토산을 용해시켜 제조한 키토산 용액에, 유기 용매에 담즙산을 용해시켜 제조한 담즙산 용액을 교반 하에 적하시킴으로써 제조될 수 있다. 이때, 담즙산과 키토산을 결합시키기 위한 촉매제로서 N-(3-디메틸아미노프로필)-N'-에틸카보디이미드 염산염(N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide hydrochloride), EDC) 및 N-하이드로숙신이미드 (NHS) 중 하나 이상을 사용할 수 있다.
상기 소수성 치환된 글리콜 키토산은 담즙산의 소수성 기와 키토산의 친수성 기에 의한 양친성으로 인하여 수계에서 마이셀과 같은 구형 자기집합체를 형성할 수 있다(도 2). 이러한 마이셀을 이용한 약물 전달 방법은 표적세포에 대한 선택성을 충분히 나타내면서 정상세포에의 독성을 현저히 줄이고 장기간 약물이 지속적으로 방출되도록 하는 약물 전달체계로서 적용될 수 있다.
상기 마이셀 형태의 글리콜 키토산 나노입자의 공동에 약물을 담지할 수 있다. 상기 약물은 면역억제제, 신암치료제 또는 만성신장질환 치료제일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 글리콜 키토산 나노입자는 형광염료를 추가로 포함할 수 있다.
상기 형광염료는 근적외선(NIR) 형광단을 포함하는 염료로서, 시아닌계 염료 또는 이의 유도체일 수 있다. 시아닌계 염료 및 이의 유도체는 비편재화된 전하를 가지며 두 개의 질소 원자 사이에 폴리메틴 브릿지(polymethine bridge)를 포함하는 구조를 가지며, 비설폰화 시아닌계 염료 및 설폰화 시아닌계 염료를 포함한다. 상기 시아닌계 염료 등의 흡수 대역(파장) 및 강도(흡수계수)는 질소 원자 사이의 탄소 사슬의 길이에 의존하나, 질소 원자 너머의 말단기의 특성에는 크게 영향을 받지 않는다. 상기 형광염료는, 예를 들어, Cy3, Cy3.5, Cy5, Cy5.5, Cy7, Cy7.5, sulfo-Cy3, sulfo-Cy5, sulfo-Cy7, IR780, IR820, Flamma® 552 Vinylsulfone, Flamma® 581 Vinylsulfone, Flamma® 594 Vinylsulfone, Flamma® 648 Vinylsulfone, Flamma® 675 Vinylsulfone, Flamma® 749 Vinylsulfone, Flamma® 774 Vinylsulfone, Alexa Fluor® 555, Alexa Fluor® 594, Alexa Fluor® 680, Alexa Fluor® 750, CF770, IRDye 680LT, IRDye 750, DyLight 549, DyLight 594, DyLight 650, DyLight 680, DyLight 755, ATTO 550, ATTO 647N를 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 형광염료는, 예를 들어, 하기 화학식 1로 표시되는 Flamma® 675 비닐설폰일 수 있다:
[화학식 1]
Figure 112019127166311-pat00002
상기 형광염료를 추가로 포함하는 글리콜 키토산 나노입자는 상기 제조된 글리콜 키토산 나노입자를 용해시킨 용액에 형광염료를 용해시킨 용액을 첨가하여 일정 시간 동안 교반한 후 정제함으로써 제조할 수 있다.
상기 형광염료를 추가로 포함하는 글리콜 키토산 나노입자는 전신 투여 시에도 신장에 특이적으로 축적되므로, 형광 검출을 통하여 약물 전달 효능을 모니터링할 수 있다. 또한 상기 형광염료를 추가로 포함하는 글리콜 키토산 나노입자는 형광염료를 포함하지 않은 글리콜 키토산 나노입자에 비하여 더 향상된 신장에의 축적도를 나타낼 수 있다.
상기 글리콜 키토산 나노입자는 신장 조직에 대한 호밍 효과를 나타낼 수 있다. 글리콜 키토산 나노입자의 아민 그룹은 신장 관상피 세포에 존재하는 메가린(megalin) 수용체를 통해 전달된 입자의 메가린-매개 흡수를 촉진할 것으로 예상되는데, 이는 메가린이 신장 내에서 다수의 세포내 이입을 매개하는 폐포 수용체로서 작용하기 때문이다.
본 발명의 다른 일 양태는 본 발명의 일 실시예에 따른 글리콜 키토산 나노입자를 포함하는 신장 표적화 약물전달체를 제공한다. 또한 본 발명의 또 다른 일 양태는 상기 신장 표적화 약물전달체 및 상기 약물전달체 내부에 담지된 약물을 포함하는 신장 표적화 약학적 조성물을 제공한다.
상기 약물은 면역억제제, 예컨대, 타크로리무스(TAC); 신암치료제; 또는 만성신장질환 치료제를 포함하나, 이에 한정되지 않으며, 신장에서의 집중적 흡수가 필요한 약물이라면 이에 포함될 수 있다.
상기 약학적 조성물은 상기 기재한 유효성분 이외에 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 및/또는 희석제를 포함하여 제제화할 수 있다.
상기 약학 제제는 산제, 과립제, 정제, 피복정, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 좌제, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 주사제의 형태로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 약학제제는 하나 이상의 부형제, 예를 들어, 전분, 락토오스, 젤라틴, 수크로오스; 윤활제; 보존제; 방향제; 감미제 등을 추가로 혼합하여 조제될 수 있다.
상기 신장 표적화 약물 전달체 및 상기 약물전달체 내부에 담지된 약물, 예를 들어, TAC를 포함하는 신장 표적화 약학적 조성물은, 이를 통해 혈액 내의 TAC의 농도는 현저히 낮게 유지하면서도 소정의 농도 이상을 신장 조직에 전달할 수 있게 하며, 상기 약물전달체에서 TAC가 서서히 방출되는 특성으로 인하여 투여 빈도수를 현저히 낮출 수 있게 된다. 이러한 신장 표적성을 나타내는 글리콜 키토산 나노입자를 사용함으로써 약물의 전신 투여로 인해 야기되는 부작용을 최소화하고 장기적으로 약물 투여할 수 있는 가능성이 열리게 되었다.
본 발명의 또 다른 일 양태는 본 발명의 일 실시예에 따른 약물전달체를 이용하는 신장으로의 약물 전달 방법을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 따른 약물전달체는 소수성 담즙산으로 치환된 글리콜 키토산을 포함하는 글리콜 키토산 나노입자를 포함하며, 글리콜 키토산 나노입자는 는 신장 조직에 대한 호밍 효과를 나타낼 수 있다. 상기 글리콜 키토산 나노입자는 신장 조직에 대한 호밍 효과를 나타낼 수 있다. 글리콜 키토산 나노입자의 아민 그룹은 신장 관상피 세포에 존재하는 메가린(megalin) 수용체를 통해 전달된 입자의 메가린-매개 흡수를 촉진할 것으로 예상되는데, 이는 메가린이 신장 내에서 다수의 세포내 이입을 매개하는 폐포 수용체로서 작용하기 때문이다. 이에 따라, 상기 약물전달체는 그에 담지된 약물을 신장 조직에 특이적으로 전달할 수 있다.
실시예
재료
글리콜 키토산(GC), 탈아세틸화 및 5β콜란산 : Merck KGaA (독일 다름슈타트)
형광 표지 : Flamma®675 Vinylsulfone : Bioacts (한국 서울)
타크롤리무스 (FK-506) : Tocris (영국 브리스톨)
N-히드록시숙신이미드 (98%) (NHS) 및 N-3-디메틸아미노프로필-N-에틸 카보디이미드 히드로클로라이드 (EDC) : Merck KGaA
세포 배양 : 둘베코의 변형된 이글 배지 (Dulbecco's modified Eagle's medium) / 영양 혼합물 F-12 (DMEM F/12) : 웰젠 (한국) (10% 소태아혈청 및 1% 항생제가 보충됨)
3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-5-(3-카복시메톡시페닐)-2-(4-설포페닐)-2H-테트라졸륨) (MTS) : Promega (미국 위스콘신주)
BD Vacutainer K2EDTA tube : Becton Dickinson (미국 뉴저지주)
신장 근위 관상피 (HK-2) 세포 : American Type Culture Collection (미국 버지니아주)
사용된 다른 시약은 달리 명시되지 않는 한 상업적 공급 업체로부터 얻은 분석 범위였다.
동물
모든 실험 프로토콜은 전남대학교 의과대학 동물실험윤리위원회의 개정 및 승인된 지침(CNU-IACUC-H2018-59)에 따라 수행되었다.
두 그룹의 수컷 BALB/C 마우스를 사용했다 (약물 프로파일 분석 : 8 주령, 20 - 22g, (주)오리엔트바이오 (한국 성남시); 신장 병증(nephropathy) 모델 제작: 10 - 13 주령, 체중 23 - 28 g, (주)샘타코 (한국 경기도)). 동물을 수돗물에 자유롭게 접근하고 나트륨 결핍식이를 갖는 통상적인 조건 하에서 12 시간 명암 주기로 유지시켰다 (미국 위스컨신주 매디슨, Teklad Diet, Envigo). HGC-TAC 및 캡슐화되지 않은 TAC의 전신 및 신장 효과를 비교하기 위해, 마우스를 무작위로 4 개의 그룹으로 그룹화하고 14 일 동안 매일 TAC (1 mg/kg/day)의 복강 내(i.p.) 주사, 또는 HGC-TAC (로딩 용량 1 mg/kg) 정맥 내(i.v.) 주사를 주사했다. TAC 주사 14 일 후에, 마취 하에 마우스를 희생시켰다. 면역조직화학 또는 웨스턴블롯 분석에 사용될 때까지 신장을 분리하여 -70 ℃에서 보관하였다.
실시예 1. HGC의 합성
접합(conjugation)을 위한 고분자량 분획의 글리콜 키토산을 수득하기 위해, 글리콜키토산(GC)을 3 일 동안 증류수로 투석(100 kDa MWCO)하였다. 분자량 100 kDa(초기 중량의 80 - 85%)을 초과하는 수득된 GC를 동결건조한 후, 추가 사용 시까지 보관하였다. EDC/NHS 화학을 통해 GC의 아미노기를 5β콜란산의 카복실기와 공유 접합시킴으로써 HGC를 제조하였다. 간략하게, 100 mg의 동결건조된 GC를 24 ml의 메탄올 (MeOH) : 물 혼합물 (1 : 1 비율)에 용해시킨 후, 24 mg EDC를 500 μl MeOH에 넣은 용액을 GC 용액에 첨가하였다. 별도로, 14.4 mg NHS (500 ㎕)를 30 mg 5β콜란산 (24 ml의 100 % MeOH) 용액에 첨가하고, 이 혼합물을 교반하면서 GC 용액에 첨가하고, 반응을 하루 동안 진행시켰다. 용액을 기공크기 80-μm의 필터를 사용하여 여과한 후, 여과물을 12 - 14 KDa의 MWCO(Rancho Dominiguez, 미국 캘리포니아)를 갖는 Spectra/Por®투석막을 이용하여, 제1일차에는 3 : 1의 MeOH : 물 혼합물에 대하여, 제2일차에는 1 : 1 MeOH : 물 혼합물에 대하여, 그리고 이후 3일 동안은 증류수에 대하여 투석하였다. 회수된 샘플을 동결 건조하고 추가 사용을 위해 보관하였다.
실시예 2. 형광단 Flamma 675를 이용하는 HGC의 개질
세포 흡수, 신장 축적 및 조직 분포를 평가하기 위해, 상기 실시예 1에서 제조된 HGC 나노마이셀을 근적외선(NIR) 형광단(fluorophore ) 인 Flamma®675 비닐설폰(여기/방출 : 675 ± 3 nm / 691 ± 4 nm)로 표지하였다. 간략하게, 제조된 HGC 30 mg을 0.1 M 카보네이트 버퍼(pH 9) 12 ml에 용해시킨 후, 디메틸설폭사이드 DMSO에서 제조된 Flamma®675 비닐설폰(0.33 mg)을 첨가하였다. 이후, 상기 혼합물을 연속교반 하에 하루 동안 4 ℃에서 유지시켰다. 이를 0.1 M NaCl 용액에 대해 2 일 동안 용액을 투석하고, 이어서 증류수에 대해 3 일 동안 투석함으로써 반응하지 않은 염료 분자를 제거하였다. 투석된 샘플(HGC-F675)을 동결건조하여 보관하였다.
실시예 3. HGC-TAC의 합성
TAC-담지된 나노마이셀을 나노침전법을 사용하여 제조하였다. 간략하게, 상기 실시예 1에서 제조된 HGC 20 mg을 증류수 6 ml에 용해시켰다. 완전한 용해를 위해 샘플에 1 분 동안 온화한 초음파 처리를 적용하였다. 이어서, MeOH 중에 제조된 TAC(6mg)를 ON/OFF 사이클 및 23% 진폭으로 10 초 동안 초음파 처리(SONICS®Sonics & Materials Inc., CT, USA) 하에 HGC 용액에 적가한 후, 동일 전원 진폭 하에서 추가 10 분 동안 초음파 처리를 지속하였다. 약물-로딩된 샘플(HGC-TAC)을 투석막(MWCO : 12 - 14 kDa)을 사용하여 2 일 동안 증류수에 대해 투석하고, 동결건조하여 사용 시까지 보관하였다.
TAC-로딩된 나노마이셀 중의 TAC의 양을 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC; Shimadzu, 일본 교토)을 이용하여 측정하였다. 간략하게 HGC-TAC를 100% MeOH 중에 혼합하고, 볼텍싱하고, 5 분 동안 초음파 처리하였다. 용액을 13500 x g에서 10 분 동안 원심분리하고 수집된 상청액을 HPLC 분석에 사용하였다. 약물 로딩 및 캡슐화 효율의 백분율을 하기 식 1-1 및 식 1-2를 사용하여 결정하였다:
[식 1-1]
Figure 112019127166311-pat00003
[식 1-2]
Figure 112019127166311-pat00004
실시예 4 및 5. HGC-TAC의 합성
상기 실시예 3에 있어서, TAC를 각각 4 mg 및 2 mg 사용하는 것을 제외하고는 상기 실시예 3과 동일한 방법으로 HGC-TAC 나노마이셀을 제조하였다.
실험예 1. HGC의 특성 관찰
1.1. 핵자기공명 (NMR) 분광법
HGC의 1H NMR 스펙트럼을 NMR 분광법(300 MHz, Bruker, 미국 매사추세츠주)에 의해 기록하였다. GC 및 5β-콜란산을 각각 중수소 산화물(D2O) 및 메탄올-d4 (CD3OD)에 용해시키고, HGC를 CD3OD : D2O (3 : 1 v / v)에 용해시켰다. 수득된 1H-NMR 스펙트럼 결과를 GC에 대한 1H-NMR 스펙트럼과 비교하여 분석하여 GC쇄상의 5β-콜란산기의 치환도를 결정하였다.
분석 결과, 5β-콜란산-컨쥬게이트 GC(HGC)는 0.6 내지 2.5 ppm (0.61-CH3; 0.93-CH3; 0.96-CH3) 범위의 5β-콜란산의 새로운 특성 피크를 확인하였다. 이 스펙트럼 통해 5β-콜란산의 HGC로의 컨쥬게이션을 확인하였다. 또한, HGC는 GC상의 δ (ppm) 1.9-2.1 (CH3, N-아세트아미도글루코오스 단위(-NHCOCH3)의 아세틸기의 메틸 양성자); 2.60 (CH, N-미치환된 글루코사민 단위의 양성자); 및 3-4 (CH, 글루코사민 단위의 양성자 및 CH2, 글리콜 잔기의 메틸렌 양성자)에서 특징적인 GC 피크를 나타냈다(도 3의 (a)).
콜란산의 치환도(%)를 GC-NHCOCH3의 피크 강도를 5β-콜란산의 -CH3 기에 대한 특징적인 피크와 통합함으로써 결정하였으며, 그 결과 36.3%임을 확인하였다.
1.2. HGC의 임계 마이셀 농도 측정
마이셀 형성에 필요한 HGC 중합체의 최소 농도를 결정하기 위해, 형광 탐침인 피렌(pyrene)을 사용하여 HGC의 임계 마이셀 농도(CMC)를 측정했다. 간단히, 아세톤 중 6.0 × 10-7M의 피렌을 다른 바이알에 첨가하고, 아세톤을 증발시켰다. 0.001 - 4 mg/ml 범위의 상이한 농도의 HGC를 바이알에 첨가하고, 30 분 동안 초음파 처리(POWERSONIC 410, 한국 서울)한 후 24 시간 동안 인큐베이션 하였다. SPARK 10M 마이크로판독기(Untersbergstr. 1A, Tecan Austria GmbH)를 사용하여 336 nm의 여기 및 360 내지 450 nm 범위의 방출로 형광 스펙트럼을 기록 하였다. HGC 농도의 로그에 대한 제1 피크 I1(372nm) 대 제3 피크 I3(384nm) (I1/I3)의 강도 비율로 그래프를 작성하였다. 중합체의 CMC는 두 직선의 교차로 간주되었다.
실험 결과, HGC의 CMC는 0.36 mg/ml임을 확인하였다(도 3의 (b)).
1.3. 입자 크기, 표면 전하 및 전계 방출 투과 전자 현미경 (FE-TEM) 분석
상기 실시예 1 및 3 내지 5에서 제조된 HGC 및 HGC-TAC 나노마이셀의 유체역학적 입자 크기 및 표면 전하를 동적 광산란 시스템(Zetasizer Nano 시리즈, Malvern Instruments, 영국 맬버른)을 이용해 측정하였다.
나노마이셀의 크기 및 형태를 200 kV에서 작동된 FE-TEM(JEM-2100F, 일본 도쿄)을 사용하여 측정하였다.
실험 결과, HGC-TAC 나노마이셀의 FE-TEM 이미지 및 방출 특성을 도 3의 (c) 및 (d)에, 그밖의 특성을 하기 표 1에 나타내었다.
실시예 3 내지 5 각각의 나노마이셀의 약물 로딩 효율은 약 26%, 15% 및 12%였다.
HGC 나노마이셀은 HGC에 대해 다분산지수(PDI)가 0.496 ± 0.177이고 직경은 198.1 ± 21.68 nm의 평균 유체 역학적 크기를 나타냈다. HGC 나노마이셀에 TAC 로딩 후, HGC-TAC의 유체 역학적 크기는 0.669 ± 0.094의 PDI로 334.83 ± 20.42 nm로 증가함을 확인하였다. 이러한 입자 크기의 약간의 증가는 HGC-TAC의 증가된 유체 역학적 부피에 기여하는 HGC 나노마이셀의 소수성 코어에 포획된 약물 분자에 기인하는 것으로 예상되었다.
여기서, 약물 로딩 효율이 가장 높은 HGC-TAC 나노마이셀(HGC-TAC 3; 실시예 3)을 추가 연구에 사용하였다.
HGC와 HGC-TAC 나노마이셀의 평균 제타전위 간에는 유의한 차이가 관찰되지 않았으며, HGC-TAC 나노마이셀의 양의 표면전하는 근위 세관 세포의 표면에 존재하는 음으로 하전된 결합 부위를 통해 세포 흡수를 향상시킬 수 있을 것으로 예측되었다.
HGC-TAC 나노마이셀의 FE-TEM 이미지는 입자크기 250 nm 미만의 구형 형태를 나타냈다 (도 3의 (c)).
공급비
(TAC:HGC) (w/w%)		 샘플 유체역학적
직경
(nm)		 제타 전위 (mV) 다분산지수
(PDI)		 약물 로딩 효율a)
(%)		 캡슐화
효율
(%)
-- HGC 198.1 ± 21.68 24.1 ± 1.17 0.496 ± 0.177 -- --
1:10
(실시예 5)		 HGC 1 219.13 ± 7.90 21.9 ± 8.51 0.713 ± 0.083 12.4 ± 0.8 85.02 ± 3.23
2:10
(실시예 4)		 HGC 2 221.9 ± 22.65 22.03 ± 4.34 0.838 ± 0.089 15.96 ± 1.10 78.05 ± 3.55
3:10
(실시예 3)		 HGC 3 334.83 ± 20.42 21.4 ± 2.83 0.669 ± 0.094 26.85 ± 1.75 92.31 ± 5.37
a) HGC 1, HGC 2 및 HGC 3의 로딩 효율을 HPLC 분석에 의해 계산하고 주어진 방정식을 사용하여 데이터를 분석하였다. 모든 샘플을 3회 분석하고 데이터를 (평균 ± SD)로 제공하였다.
실험예 2. 시험관 내 약물 방출 연구
시험관 내 약물 방출은 투석법에 의해 수행되었다. 간략하게, 1 mg의 약물-로딩된 나노마이셀을 1 ml 둘베코 인산완충생리식염수(PBS)에 용해시키고, 투석백(MWCO 12 - 14 kDa)으로 옮긴 후, 0.1% Tween 20(v/v)이 보충된 PBS(pH 7.4) 방출배지 20 ml에 넣었다. 이어서 샘플을 37 ℃ 및 100 rpm의 인큐베이터에서 유지시켰다. 그 후, 상이한 배양 시점에서 방출 배지 1ml를 수집하고 동량의 PBS로 교체하였다. TAC 농도를 HPLC 분석을 통해 측정하였다. 대조군으로서, MeOH에 용해된 TAC 용액도 동일한 조건 하에서 시험하였다.
실험 결과, 캡슐화되지 않은 TAC군이 초기 2 시간 내에 93%의 버스트 방출을 나타내는 반면, HGC-TAC 나노마이셀로부터의 TAC 방출은 지속 방출 및 2상 방출을 나타냈는데, 6 시간까지의 초기 버스트 방출(37%) 패턴으로, 이후 72 시간까지 지속 방출을 나타내었다(도 3의 (d)).
HGC-TAC 나노마이셀로부터의 TAC의 초기 버스트 방출은 나노마이셀 상에 부착된 TAC의 탈착으로 인해 발생하였고, 그 후 느린 확산을 통해 HGC-TAC 나노 마이셀의 소수성 영역에 포획된 TAC의 느리고 지속적인 방출이 이어진 것으로 판단되었다. 이러한 결과는 TAC의 느리고 지속적인 방출이 생리 학적 조건 하에서 발생할 것이며, 이는 효과적인 생체 내 약물 전달 시스템에 적용될 수 있을 것으로 검토되었다.
실험예 3. 세포 생존력 시험
HK-2 세포를 37 ℃ 및 5% CO2가 유지되는 인큐베이터에서 10% 소태아혈청 및 1% 항생제가 보충된 DMEM F12 배지를 이용하여 배양하였다.
시험관 내 세포 생존력의 연구를 위해, 96-웰 세포배양접시에 웰당 1 × 104 개의 세포를 접종하고 밤새 배양하였다. 배양 배지를 상이한 농도의 HGC, HGC-TAC 및 TAC 함유 배지로 교체하고, 제조사의 프로토콜에 따라, 24 시간 동안 배양한 후, MTS 분석을 수행하기 위한 MTS 시약을 첨가하여 4 시간 동안 배양한 후 490 nm에서의 흡광도를 기록하였다. 어떠한 처리도 하지 않은 세포를 양성대조군으로 사용하였고, 0.1% 트리톤-X 100으로 처리한 세포를 음성대조군으로 간주하였다.
실험 결과, HGC, HGC-TAC 및 TAC 함유 배지에서 세포가 매우 높은 생존력 프로파일을 나타냄을 확인하였다(도 4의 (a) 및 (b)). 배지 중 TAC의 농도가 증가함에 따라 세포 생존력은 약간 감소하였으나, 동등한 양의 TAC를 갖는 HGC-TAC 나노 마이셀은 높은 세포 생존력 프로파일을 나타내었고, 이를 통해 나노입자가 생체 의학 응용에 안전하게 사용될 수 있음을 확인하였다.
실험예 4. HGC-TAC 나노마이셀의 세포내 흡수 확인
HGC-나노마이셀의 세포 흡수를 확인하기 위해, Lab-Tek®챔버 슬라이드(Thermo Fisher, 미국 매사추세츠주)에 웰당 5 x 104 개의 세포를 접종하고 37 ℃ 및 5% CO2 배양기에서 밤새 배양하였다. 세포를 DMEM F12 배지에 현탁된 F675-표지된 나노마이셀로 처리하였다. 상이한 시점에서, 세포를 PBS로 세척하고 4% 파라포름알데히드를 사용하여 고정하고, ProLong DAPI (4',6-디아미디노 -2-페닐인돌) (Invitrogen, 영국 페이즐리)로 대조염색 하였다. 나노마이셀의 흡수를 공초점 레이저 스캐닝 현미경(Zeiss LSM510, 독일 예나)을 사용하여 시각화하였다. HK-2 세포에서 HGC-TAC 나노마이셀의 세포내 흡수 메카니즘을 확인하기 위해, 메틸-β-시클로덱스트린(MβCD) (카베올리 경로(caveolar pathway)), 클로로퀸(CQ) (클라트린-의존적 세포내 이입) 및 아밀로라이드(AML) (미소음 세포 활동(micropinocytosis))와 같은 억제제를 사용하였다. 간략하게, 세포를 HGC-TAC과 함께 배양하기 전에, MβCD(10 mg /ml), CQ(200 μM) 또는 AML(3 mM)과 함께 1 시간 동안 예비배양 한 후, 억제제와 함께 4 시간 동안 억제제와 함께 배양하였다. 세포를 세척하고, 파라포름알데히드로 고정시키고, 상기 기재된 바와 같이 DAPI로 대조염색하고 형광 현미경(Evos FL Auto 2, 미국 매사추세츠주)으로 시각화하였다.
HK-2 세포에서 HGC-TAC 나노마이셀의 특이적 흡수에 대한 메가린(megalin)-매개 세포내 이입의 역할을 추가로 확인하기 위해, 경쟁적 억제 분석을 수행하였다. 간략하게, 세포를 1 mg/ml 젠타마이신 또는 GC와 함께 1 시간 동안 예비배양 하였다. 배지를 흡인한 후 HGC-TAC 나노마이셀로 처리하고, 4 시간 동안 배양하였다. 세포를 4% 파라포름알데히드로 고정시키고, ProLong DAPI로 대조염색하고, 형광 현미경(Evos FL Auto 2) 하에서 관찰하였다.
실험 결과, 형광 강도는 HK-2 세포에서 시간-의존적 세포 내재화를 나타내는 시간이 흐름에 따라 증가되었다. 　HGC-TAC 나노마이셀을 4 - 6 시간에 내재화하자, 세포막 영역에서 적색 형광을 확인할 수 있었다. 형광 강도는 세포막 및 시토졸 영역에서 서서히 증가하고 점차적으로 핵막에 국한되었으며, 이를 통해 나노마이셀의 효율적인 세포 흡수를 확인하였다(도 4 의 (c)).
HGC-TAC 나노마이셀의 높은 세포 흡수는 양성 표면 전하에 의해 촉진될 수 있으며, 이는 HK-2 세포에서 발현된 음으로 하전된 메가린 수용체에 대한 결합을 강화시킨 후, HGC-TAC의 메가 린-매개 흡수가 일어날 수 있다.
실험예 5. 메가린-매개 세포내 이입을 통한 HGC-TAC 나노마이셀의 세포흡수 메커니즘 확인
HGC-TAC 나노마이셀의 흡수에 대한 기본 메커니즘을 추가로 확인하기 위해, 상이한 세포 내 이입(endocytosis) 억제제의 영향 하에 나노마이셀의 세포 흡수를 평가하였다.
Mβ와 같은 억제제는 지질 뗏목(lipid raft)을 파괴함으로써 카베올린(caveolin) 및 클라트린(clathrin)-의존성 세포내 이입을 목표로 한다. 　클로로퀸(chloroquine)은 클라트린 및 클라트린-코팅된 소포에 영향을 미치고 클라트린-매개 세포내 이입을 억제할 수 있는 소수성 아민을 포함한다. 아밀로라이드는 세포 표면에서 Na+/K+ 교환을 억제함으로써 대음세포 작용(macropinocytosis)을 억제한다. .
실험 결과, Mβ-처리 군은 HGC만을 처리한 군에 비해 HK-2에 의한 흡수가 약간 감소되었으나, 클로로퀸(CQ)은 처리 후 높은 억제율을 나타내었고, 이를 통해 클라트린-매개 세포내 이입의 흡수에 관여함을 확인할 수 있었다. 한편, 아밀로라이드(AML) 처리 군에서 눈에 보이는 억제가 관찰되지 않았으므로 대음세포 작용의 관여를 배제했다(도 5의 (a)).
메가린은 신장의 클라트린-코팅된 홈에서 고도로 발현되는 거대 당단백질이며, 세포내 이입 수용체로서 기능한다. 메가린이 저밀도 지단백질 수용체 수퍼패밀리의 구성원들과 높은 상동성을 공유함에 따라, 신장에서 HGC-TAC 나노마이셀의 흡수는 메가린 및 이의 관련 단백질을 통해 클라트린-매개 세포내 이입을 통하여 일어난 것으로 추정할 수 있었다.
HGC-TAC 나노마이셀 흡수에서 메가린의 역할을 추가로 확인하기 위해, 메가린 수용체에 대한 경쟁적 억제제로서 젠타마이신(gentamicin)을 사용하였다. 젠타마이신은 신장 근위 세뇨관 세포에서 메가린-매개 상호 작용을 통한 세포내 이입을 통해 신장에 선택적으로 축적되는 아미노글리코시드이다.
실험 결과, 젠타마이신으로 처리한 후, 세포흡수는 대조군에 비해 현저히 감소하였으며, 이를 통해 HGC-TAC 나노마이셀 세포흡수에서의 메가린의 역할을 확인할 수 있었다(도 5의 (b)).
또한, 세포를 유리 글리콜 키토산으로 예비배양함으로써 잠재적 경쟁억제를 평가하였다. 이는 HGC-TAC 나노마이셀 흡수의 억제를 초래하였고, 이는 HGC-TAC 나노마이셀이 HGC-TAC에 대한 리간드-특이성을 나타내는 HK-2 세포 상에 존재하는 메가린 수용체를 통해 내재화됨을 확인하였다.
실험예 6. 나노마이셀의 생체내 체내분포 확인
체내분포(biodistribution) 분석을 위해, 8 주령 BALB/c 백색 마우스에 100 μl PBS 중 20 mg/kg의 HGC-F675를 정맥(i.v.) 주사하였다. 정맥 주사 후 소정의 시점에 마우스를 희생시켜 기관을 해부하고, 각 주요 기관의 이미지를 형광-표지 유기체 바이오-이미징 기기(FOBI, ㈜네오사이언스, 대한민국 경기도)를 사용하여 20 일까지 상이한 시점(시간 간격당 n = 3)으로 촬영하였다. 모든 기관의 형광 강도를 FOBI 시스템을 이용하여 분석하였다.
분리된 신장을 급속 냉동(snap-freezing)시키고, 동결-절단 전에 OCT 화합물 중에 매립시켰다. 동결 신장 절편 10 μm를 준비하고 95% 에탄올로 고정한 후 ProLong DAPI로 대조염색하여 형광 분석에 사용하였다. 형광 현미경(Evos FL Auto 2)을 사용하여 이미지를 획득하였다.
실험 결과, HGC-F675 나노마이셀의 주사 후 3 시간 후 신장에서 F675의 강력한 형광 강도를 관찰되었고, 신장에서 형광 강도는 주사 후 9 시간에 정점에 도달하였고 24 시간까지 점진적으로 감소하였다(도 6의 (a)).
다른 기관과 비교하여, 간 및 폐에서 주로 향상된 형광 강도가 나타났다. 다음으로, 매 시간 간격마다 수집된 장기의 형광 강도를 정량화하였다. 신장에서 최고 형광 강도가 나타났으며, 이어서 간, 폐, 심장, 비장 및 방광 순으로 나타났고, 이는 생체외 영상화의 결과와 일치하였다. HGC-F675 나노마이셀의 정맥 주사 24 시간 후, 신장으로부터의 형광은 기관으로부터 나노마이셀이 제거됨으로써 감소됨을 확인하였다. 형광 강도는 시간이 지남에 따라 다른 모든 기관에서 감소한 반면, 신장에서는 약간 일정한 형광 프로파일을 나타냄을 확인하였다. (이는 나노마이셀의 긴 순환 및 분해 전 며칠 동안의 신장 상피 세포에서 HGC 나노마이셀에 대한 개선된 보유에 기인한 것으로 예상됨.) (도 6의 (b))
따라서, HGC-TAC 나노마이셀은 신장 사구체 기저막(GBM)에서 나노마이셀의 부분적 분해 및 근위 관상피 세포에서의 일시적 흡수를 포함하는 우수한 신장 흡수 효율을 나타냄을 확인하였다.
주사 후 24 시간 후에 수집된 신장으로부터 제조된 냉동 절편에서 F675의 형광 강도를 관찰함으로써 신장 조직에서 HGC-TAC 나노 마이셀의 국소화를 시각화하였다. 근위 세뇨관 세포 및 사구체의 위치에 상응하는 수질 영역에서 형광 강도가 명확하게 관찰되는 반면, PBS를 투여한 대조군에서는 형광 신호가 관찰되지 않았다(도 7의 (a) 및 (b)). 근위 세뇨관 상피세포(PTEC)와는 별도로, 인간 족세포(podocyte) 및 래트와 마우스의 일부 세포주도 메가린 수용체를 발현하여 메가 린-매개 세포내 이입을 지원하는 것으로 보고되었다(H. Yamazaki, A. Saito, H. Ooi, N. Kobayashi, P. Mundel, F. Gejyo, Differentiation-Induced Cultured Podocytes Express Endocytically Active Megalin, a Heymann Nephritis Antigen, Nephron Experimental Nephrology 96(2) (2004) e52-e58). 따라서, 사구체 및 근위 세뇨관 영역에 걸친 형광 신호는 초기에 족세포 상에 존재하는 메가린 수용체를 통해 HGC-TAC 나노마이셀의 흡수 가능성을 제안하였고, 이어서 PTEC 상에 존재하는 메가린 내피 수용체를 통해 신장 근위 세관을 통과하는 사구체 여과물로부터 HGC-TAC 나노마이셀의 흡수 가능성을 제안하였다. GBM에 존재하는 대략 40 KDa의 사구체는 더 큰 입자 크기의 HGC-TAC 나노마이셀을 보유할 수 있고 더 작고 분해 된 나노마이셀이 통과할 수 있게 한다. GBM에서 탈출한 나노입자가 PTEC에서 일시적으로 흡수될 수 있기 때문에 이것은 신장의 사구체 영역에서 관찰되는 형광 강도의 기초가 될 수도 있다.
실험예 7. 면역조직화학적 염색
신장 조직에서 HGC-TAC 나노마이셀의 위치를 확인하기 위해, 족세포 상에 존재하는 단백질 성분인 포도신 및 근위 세관의 표면에서 발견되는 AQP1에 대한 항체 염색에 의해 면역 형광을 수행하였다.
분리된 신장을 2 μm 두께의 슬라이스로 횡단면화 하였다. 이어서, 슬라이드를 포름알데히드로 1 시간 동안 침지고정시키고, 파라핀-매립 후, TGF-β(1 : 100), α-SMA (1 : 1000), iNOS (1:50) 및 Bax (1:100)에 대하여 각각의 1차 항체와 함께 배양하였다. 신장에 대한 HGC 나노마이셀의 조직 국소화를 확인하기 위해, 6-μm 두께의 냉동 절편을 수득하여 95% 에탄올로 고정한 후 면역형광염색 하였다. 간략하게, 조직을 실온에서 1 시간 동안 1% 소혈청알부민(BSA)으로 고정시키고, 포도신(podocin; P 0372)에 대한 1차 항체(Sigma-Aldrich) 및 아쿠아포린 1(AQP 1)에 대한 1차 항체(Merck KGaA)와 함께 4 ℃에서 밤새 배양하였다. 조직을 염소 항-토끼 IgG, Flamma 488 (BioActs)과 함께 추가로 배양 하였다. 슬라이드를 ProLong DAPI로 대조염색하고 형광 현미경(Evos FL Auto 2)을 사용하여 형광이미지를 획득하였다.
실험 결과, 근위 세관 세포에서 밝은 형광을 통하여 근위 세관 세포에서의 HGC-TAC 나노마이셀 축적의 존재를 확인할 수 있었다. 이는 나노마이셀의 메가린-매개 세포흡수 때문일 것으로 예상되었다(도 7의 (c)). 반면, 포도신 영역에서는 낮은 적색 형광(F675 나노마이셀)만이 관찰되는 반면, 신장의 근위 관형 영역을 반영할 수 있는 주변 영역에서는 비교적 높은 적색 형광을 확인하였다(도 7의 (d)).
실험예 8. 신장 및 혈장 TAC 농도의 결정
TAC의 혈장 농도를 결정하기 위해, 마우스(그룹당 n = 6)에 HGC-TAC 및 캡슐화되지 않은 TAC(1 mg/kg) 정맥 주사를 투여하고, 상이한 시점에서 후안와 부비동(retroorbital sinus) 출혈을 통해 혈액을 수집하였다. 혈장을 수집하기 위해 혈액을 845 × g에서 10 분 동안 원심분리 하였다. 동량의 100% MeOH를 플라즈마에 첨가하고 10 - 15 초 동안 볼텍싱 한 후 2 분 동안 13500 × g에서 원심분리하였다. 수집된 상청액을 HPLC 분석에 사용하였다. 미처리된 마우스로부터 수집된 혈장을 대조군으로 사용하였다.
신장에서 TAC의 농도를 유사한 방법을 이용하여 측정하였다. 간략하게, 1 mg/kg의 HGC-TAC 또는 동등한 TAC를 마우스의 꼬리 정맥에 정맥 주사로 투여하였다 (그룹당 n = 6). 마우스를 희생시키고 신장을 상이한 시간 간격으로 분리시켰다. TissueLyser II(Qiagen, 독일 힐덴)를 사용하여 MeOH에서 각 신장을 균질화시켰다. 균질화된 용액을 13500 × g에서 10 분 동안 원심분리 한 후, 상청액을 HPLC 분석을 위해 수집하였다. PBS를 주사한 마우스로부터 제조된 신장 용해물을 대조군으로 사용하였다.
실험 결과, TAC 단독군은 모든 시간 간격에서 HGC-TAC 나노마이셀군과 비교하여 높은 혈장 농도 프로파일을 나타냄을 확인하였다. 혈장내 유리 약물의 직접 투여 및 혈장에 대한 TAC의 높은 친화성 때문에 혈장 내 더 높은 TAC 농도가 전자의 경우에 발생했을 가능성을 상정할 수 있었다. 반대로, HGC 나노마이셀의 코어에 캡슐화된 TAC의 경우, 혈액에 대한 TAC의 노출이 적음을 확인하였다. 그러나, HGC-TAC 나노마이셀군은 초기 시간에 비교적 높은 약물 농도를 나타내었고, 이는 점차 0으로 감소하였다. 더욱이, 혈액에서 신장으로의 HGC-TAC 나노마이셀의 이동은 혈장 TAC 농도가 더 낮은 이유를 설명할 수 있었다(도 8의 (a)).
HGC-TAC 나노마이셀의 낮은 혈장 TAC 프로파일은 혈액과의 직접적인 상호 작용의 결과로 발생할 수 있는 원치 않는 전신 독성 영향을 피하는데 도움이 될 수 있을 것으로 예상되며, 혈장에서 TAC의 효소-매개 대사를 피함으로써, 표적 조직을 향한 TAC의 이용 가능성을 향상시킬 수 있을 것으로 예상되었다.
신장에서 TAC의 생체 이용률을 유사한 실험 절차를 통하여 조사하였다. 간략하게, 마우스는 정맥에 1 mg/kg의 TAC 등가의 HGC-TAC 나노마이셀 및 동량의 캡슐화되지 않은 TAC를 주사한 후, 소정의 시간 간격으로 마우스를 희생시켜 신장 용해물로의 HPLC 분석에 의해 TAC 농도를 측정하였다.
　실험 결과, 신장 조직 그램당 주사 용량 백분율(%ID/gram of tissue)을 TAC 및 HGC-TAC 나노마이셀-주입된 군 모두에 대하여 계산하였다. 초기 시간 간격에서, HGC-TAC 나노마이셀-주입된 군으로부터의 신장에서는 HGC-TAC 나노마이셀의 신장으로의 축적 증가로 인해 TAC 농도 프로파일에서 유의미한 증가를 확인하였다. 이는 HGC-F675 나노마이셀의 ex-vivo 형광 이미징에서 얻은 결과와 상관 관계가 있으며, 이는 또한 신장에 강화된 축적을 나타내었다(도 8의 (b)).
따라서, HGC-TAC 나노마이셀을 마우스에 주사한 후 초기 시간에, HGC-TAC 나노마이셀은 혈액으로부터 감소되고 신장에 크게 축적되어, TAC에 대하여 저농도의 혈장 및 증가된 신장 프로파일을 나타냈다. 캡슐화되지 않은 TAC 및 HGC-TAC 나노마이셀 군 사이에는 유의한 차이가 관찰되지 않았지만, 4, 9 및 24 시간에서의 TAC 프로파일은 점진적인 감소를 나타냈다.
실험예 9. 나노마이셀 처리 유뮤에 따른 비교
TAC는 FDA 승인된 면역억제제이나, 장기간의 투여는 혈액 중 요소 질소의 증가, 혈청 크레아티닌 수준, 크레아티닌 제거율의 감소 및 섬유증 및 사구체 경화증을 비롯한 다른 조직학적 변화를 특징으로 하는 신독성(nephrotoxicity)을 초래한다. 따라서, HGC-TAC 나노마이셀이 신체에서 이러한 전신 또는 국소 부작용을 나타내는지 여부를 결정하는 것이 우선되었다. TAC-유도된 신장병증 모델은 TAC-유도된 독성을 연구하기 위해 이미 확립된 실험 모델을 구성하였다. 따라서, 마우스의 전신 또는 신병증 효과를 연구하기 위해 HGC-TAC 나노마이셀을 정맥 주사한 마우스를 TAC-유도된 신장병증 마우스와 비교하였다.
TAC는 좁은 치료 지수를 가지므로, 정맥 경로에서 최대 농도(Cmax)가 증가하고 50% 치사량(LD50)을 빠르게 달성할 것이다. 본 실험에서, TAC-유도된 신병증 마우스를 TAC의 복강내 주사로 생성하였다. 간략하게, 마우스에 14 일 동안 매일 TAC(1 mg/kg/day)를 복강내로 주사하여 TAC-유도된 신장병증을 확립하였다. 염증매개체, TGF-β산화스트레스 및 아폽토시스 세포 사멸을 포함하는 다른 분자 기전은 TAC-유도된 신장병증의 발달을 설명한다. 따라서 신장에 미치는 HGC-TAC 나노마이셀의 영향을 평가하기 위해, 발명자들은, 캡슐화되지 않은 TAC-유도된 신장병증 마우스와 대비하여, HGC-TAC 나노마이셀의 단일 정맥 주사 후에 따르는 α-SMA(섬유증 마커), iNOS(염증 마커), Bax/Bcl-2 비율(아폽토시스 마커) 및 TGF-β1의 단백질 발현을 조사하였다.
실험 결과, HGC-TAC 나노마이셀을 정맥 주사한 경우에서 α-SMA, Bax/Bcl-2 비율, iNOS 및 TGF-β의 단백질 발현이 대조군 신장에 비해 유의하게 증가함을 확인하였다(도 9의 (a) 내지 (c)). 특히, 캡슐화되지 않은 TAC에서 HGC-TAC 나노마이셀-처리된 마우스에 대한 신장 손상 마커의 발현 수준 사이에 차이가 관찰되지 않았으며, 이는 단일 HGC-TAC 정맥 주사가 매일의 복강내 TAC 처리와 유사한 효능을 가짐을 유추할 수 있었다. 이 결과는 HGC-TAC 나노마이셀의 단일 정맥 주사는 충분량의 TAC를 신장에 전달하여, 적절한 효능을 제공함을 보여주었고, 간접적으로, TAC를 신장에 전달하기 위한 효율적인 수단으로서 HGC 나노마이셀의 유용성을 뒷받침하였다.
실험예 10. 웨스턴 블로팅
웨스턴 블로팅(Western blotting)을 전술한 바와 같이 수행하였다. 분리된 조직을 용해완충액에 재현탁시킨 후 초음파 처리하였다. 조직 용해물을 원심분리 한 후 상청액을 수집하였다. BCA 단백질 분석 키트(Pierce Biotechnology, 미국 일리노이주)를 사용하여 단백질 추출물의 단백질 농도를 측정하였다. 단백질 추출물을 9% 또는 12% 소듐 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동을 사용하여 분리하고 니트로 셀룰로스 막으로 이동시켰다. 막을 PBS-T 중의 5% 우유로 1 시간 동안 블로킹 한 후, 1차 항체와 함께 4 ℃에서 밤새 배양하였다. α-평활근 액틴(SMA) (A2547) 및 β액틴(A3854)에 대한 1 차 항-마우스 항체를 Sigma-Aldrich (미국 미주리주)에서, Bax (2772), Bcl-2 (2870), 유도성 산화질소 신타제 (iNOS; 3120), 및 종양성장인자(TGF)-β(3711)을 Cell Signaling Technology, Inc.(미국 매사추세츠주)로부터 입수하였다. 그 후, 1차 항체-처리된 막을, 1차 항체에 따라, 홍당무 과산화수소(horseradish peroxidase)-접합된 항-마우스, 항-염소 또는 항-토끼 2차 항체와 함께 배양하였다. 결과는 LAS-3000 강화 화학발광 시스템(Fuji Photo Film Co., 일본 도쿄)을 사용하여 시각화되었다. 그 후, Scion Image(Frederick, 미국 메릴랜드주)를 이용하여 밀도 측정 분석을 수행하였다.
실험 결과, HGC-TAC 나노마이셀 및 매일 복강내 비캡슐화된 TAC-처리된 신장 모두에서의 발현이 대조군에 비해 명확히 증가함을 확인하였다. 그러나, HGC-TAC-처리된 마우스에서 비캡슐화된 TAC-처리된 마우스와 비교하여 사구체에서 비교적 강화된 α-SMA, Bax 및 TGF-β면역 염색을 확인할 수 있었다(도 9의 (d)). 이를 통해, 소량의 HGC-TAC 나노마이셀이 사구체에 유지된 다음 TAC를 방출함으로써 신장에 영향을 미침을 예상할 수 있었다.
실험예 11. 체중 및 혈청 크레아티닌 측정
매일 복강내 주사의 전신 효과(systemic effect)를 평가하기 위해, 체중, (신장 기능을 평가하기 위한) 혈청의 크레아티닌 수준 및 TAC의 혈장 농도의 변화를 측정하였다. 상기 혈청의 크레아티닌 수준은 자동분석기(autoanalyzer; Coulter-STKS; Coulter Electronics, 핀란드 하이얼리아)를 사용하여 측정하였다.
실험 결과, TAC-유도된 신장병증 마우스는 대조군 마우스와 비교하여 주사 후 14 일째에 혈청 크레아티닌의 수준 증가와 함께 체중 감소를 나타냄을 확인하였다. 그러나, HGC-TAC-처리된 마우스에서는 대조군과 비교하여 이들 측정에서 변화가 검출되지 않았다. 이는 HGC-TAC 나노마이셀이 TAC의 신장-표적 전달을 위한 우수한 약물 전달 수단으로 사용될 수 있음을 나타내었다.
더욱이, HGC-TAC 나노마이셀은 체중 변화의 부족(the lack of change of body weight)으로 추정되는 바와 같은 전신 독성 효과를 나타내지 않았다.
또한, 14 일 동안 매일 복강내(i.p.) 비캡슐화된 TAC 투여 또는 HGC-TAC의 단일 정맥(i.v.) 투여 후 TAC의 혈장 농도를 측정하였다.
실험 결과, HGC-TAC 나노마이셀 군에서는 TAC의 어떠한 흔적도 보이지 않았으마, 복강내 TAC 군에서는 혈장에서 상당량의 TAC를 확인하였다(도 10의 (a) 및 (b)). 이를 통해, 다른 경로에 의한 투여가 다른 기관 또는 조직에 대하여 독성 부작용에 더 큰 감수성을 부여하는 것에 비해, HGC-TAC 나노마이셀은 장기적인 전신 부작용으로 이어지지 않을 것임을 예측할 수 있었다.
실험예 12. 통계 분석
통계적 분석을 짝지어진 또는 짝지어지지 않은 스튜던트 T 검정(Student's t-test)을 이용하여 수행한 후, 터키 다중 비교 사후 검증(Turkey multiple comparison post-test) 및 *?*이원 분산 분석(ANOVA)을 적절히 수행하였다. p-값 < 0.05인 경우에 대해 통계적으로 유의미한 차이가 고려되었다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.
본 발명의 범위는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (10)

  1. 신장 표적화 약물전달체 및 상기 약물전달체 내부에 담지된 약물을 포함하고,
    상기 신장 표적화 약물전달체는 글리콜 키토산 나노입자를 포함하고,
    상기 글리콜 키토산 나노입자는 소수성 담즙산으로 치환된 글리콜 키토산을 포함하고,
    상기 소수성 담즙산은 콜산, 케노데옥시콜산, 글리코콜산, 타우로콜산, 데옥시콜산, 리소콜산 및 7-옥소-리소콜산으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상이고,
    상기 글리콜 키토산 나노입자는 형광염료를 포함하고,
    상기 형광염료는 Cy3, Cy3.5, Cy5, Cy5.5, Cy7, Cy7.5, sulfo-Cy3, sulfo-Cy5, sulfo-Cy7, IR780, IR820, Flamma® 552 Vinylsulfone, Flamma® 581 Vinylsulfone, Flamma® 594 Vinylsulfone, Flamma® 648 Vinylsulfone, Flamma® 749 Vinylsulfone, Flamma® 774 Vinylsulfone, Alexa Fluor® 555, Alexa Fluor® 594, Alexa Fluor® 680, Alexa Fluor® 750, CF770, IRDye 680LT, IRDye 750, DyLight 549, DyLight 594, DyLight 650, DyLight 680, DyLight 755, ATTO 550 및 ATTO 647N으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나이고,
    상기 약물은 타크로리무스(Tacrolimus)이고,
    상기 글리콜 키토산은 마이셀 형태인 것을 특징으로 하는 신장 표적화 약학적 조성물.
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  10. 제 1 항에 따른 약학적 조성물을 이용하는 인간을 제외한 동물의 신장으로의 약물 전달 방법.
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