KR102351951B1 - Method for detecting mycobacterium tuberculosis - Google Patents
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Abstract
본 발명은 결핵균을 검출하는 방법에 있어서, 긴 시간이 소요되는 기존의 활동성 결핵을 검출하는 방법을 대체할 수 있는, 객담 도는 기관지 세척액 시료를 멤브레인 필터로 농축하고, 항체 또는 방사성동위원소가 표지 된 항체를 이용하여 결핵 또는 기관지 세척액 시료에서 결핵균을 검출하는 방법에 관한 것이다. The present invention provides a method for detecting Mycobacterium tuberculosis, which can replace the conventional method of detecting active tuberculosis, which takes a long time, by concentrating a sample of sputum or bronchial lavage with a membrane filter, and is labeled with an antibody or radioisotope. It relates to a method for detecting Mycobacterium tuberculosis in a tuberculosis or bronchial lavage sample using an antibody.
Description
본 발명은 결핵균을 검출하는 방법에 있어서, 긴 시간이 소요되는 기존의 활동성 결핵을 검출하는 방법을 대체할 수 있는, 객담 또는 기관지 세척액 시료를 멤브레인 필터로 농축하고, 항체 또는 방사성동위원소가 표지 된 항체를 이용하여 결핵 또는 기관지 세척액 시료에서 결핵균을 검출하는 방법에 관한 것이다. The present invention is a method for detecting Mycobacterium tuberculosis, which can replace the conventional method of detecting active tuberculosis that takes a long time, and concentrates the sample of sputum or bronchial lavage with a membrane filter, and is labeled with an antibody or radioisotope. It relates to a method for detecting Mycobacterium tuberculosis in a tuberculosis or bronchial lavage sample using an antibody.
전 세계적으로 매년 1천만 명 이상의 신규 결핵(Tuberculosis, TB) 환자가 발생하고 있으며, 결핵 사망자 수는 연간 180만 명에 달해 전 세계적으로 질병 부담이 심각한 상황이다. 2017년 한국에서 발생한 결핵환자는 총 36,044명이며, 이는 OECD 국가 중 전체 1위로서 국내 공중보건에 큰 위협이 되고 있다(질병관리본부, 2017). 또한, 북한의 결핵문제는 전 세계에서 가장 심각한 상태로서 2017년 기준 결핵환자는 13만 명으로 추산되며, 사망률 또한 크게 증가하고 있어 남북한 결핵문제는 세계적으로 중요한 이슈이다(WHO, 2018).More than 10 million new cases of tuberculosis (TB) occur every year worldwide, and the number of deaths from tuberculosis has reached 1.8 million annually, putting a serious burden on the world. In 2017, a total of 36,044 tuberculosis patients occurred in Korea, which ranks first among all OECD countries and poses a great threat to domestic public health (Centers for Disease Control and Prevention, 2017). In addition, the tuberculosis problem in North Korea is the most serious in the world, and as of 2017, the number of tuberculosis patients was estimated at 130,000, and the death rate is also increasing significantly, so the tuberculosis problem between the two Koreas is an important global issue (WHO, 2018).
Mycobacterium Tuberculosis 등 결핵균에 의하여 발병되는 결핵은 결핵균의 상태에 따라 잠복결핵(Latent tuberculosis)과 활동성결핵(Active tuberculosis)으로 구분된다. 결핵균이 잠복하고 있어 결핵증상과 전염성이 없는 상태를 잠복결핵이라고 하며, 면역력 저하 등의 다양한 원인으로 인하여 결핵증상과 전염성을 가지게 되는 상태를 활동성결핵이라고 한다. 따라서, 결핵의 전염을 억제하고 조기에 치료하기 위해서는 활동성결핵을 신속하게 진단하는 것이 가장 중요하다. Tuberculosis caused by Mycobacterium tuberculosis, such as Mycobacterium tuberculosis, is divided into latent tuberculosis and active tuberculosis depending on the condition of Mycobacterium tuberculosis. The condition in which tuberculosis bacteria is dormant and not contagious is called latent tuberculosis. Therefore, it is most important to quickly diagnose active tuberculosis in order to suppress the transmission of tuberculosis and treat it at an early stage.
활동성결핵을 진단하기 위해서는, 객담 등 환자로부터 발생한 시료에서 살아있는 상태의 결핵균을 검출하는 것이 필요하다. 현재는 환자의 객담 시료로부터 살아있는 결핵균을 배양하여 확인하는 배양법이 표준 방법(gold standard)으로 사용되고 있다. 그러나 배양법으로 결핵균을 검출하기 위해서는 4~8주의 긴 시간이 필요하다. 이렇게 활동성결핵의 진단에 소요되는 시간이 길기 때문에, 조기에 결핵을 치료하기 어려울 뿐만 아니라 격리조치가 어려워 결핵 전파의 주요 원인이 되고 있다. 따라서 환자의 시료에서 살아있는 결핵균을 보다 신속하게 검출함으로써 활동성결핵을 진단할 수 있는 새로운 기술이 필요하다. In order to diagnose active tuberculosis, it is necessary to detect live Mycobacterium tuberculosis in samples generated from patients, such as sputum. Currently, a culture method for culturing and confirming live Mycobacterium tuberculosis from a patient's sputum sample is used as a gold standard. However, in order to detect Mycobacterium tuberculosis by culture method, a long time of 4 to 8 weeks is required. Because of the long time required for the diagnosis of active tuberculosis, it is difficult to treat tuberculosis at an early stage, as well as difficult to isolate, which is a major cause of tuberculosis transmission. Therefore, there is a need for a new technology that can diagnose active tuberculosis by more rapidly detecting live Mycobacterium tuberculosis in a patient's sample.
본 발명은 결핵균을 검출하는 방법에 있어서, 긴 시간이 소요되는 기존의 활동성 결핵을 검출하는 방법을 대체할 수 있는 기술로서, 객담 또는 기관지 세척액 시료를 멤브레인 필터로 농축하고, 항체 또는 방사성동위원소가 표지 된 항체를 이용하여 결핵 또는 기관지 세척액 시료에서 결핵균을 신속하게 검출하는 방법을 제공하고자 한다. The present invention is a technology that can replace the conventional method for detecting active tuberculosis, which takes a long time in the method for detecting Mycobacterium tuberculosis, and by concentrating a sample of sputum or bronchial lavage with a membrane filter, and adding an antibody or radioisotope An object of the present invention is to provide a method for rapidly detecting Mycobacterium tuberculosis in tuberculosis or bronchial lavage samples using a labeled antibody.
그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.However, the technical problem to be achieved by the present invention is not limited to the above-mentioned problems, and other problems not mentioned will be clearly understood by those skilled in the art from the following description.
본 발명은 0.45um 내지 1.00um 사이즈의 멤브레인 필터를 이용하여 시료내 결핵균을 검출하는 방법을 제공할 수 있다. The present invention can provide a method for detecting Mycobacterium tuberculosis in a sample using a membrane filter having a size of 0.45um to 1.00um.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 멤브레인 필터는 Polyvinylidene Fluoride(PVDF) 또는 Polytetrafluoroethylene(PTFE) 소재로 제작된 것일 수 있다. In one embodiment of the present invention, the membrane filter may be made of polyvinylidene fluoride (PVDF) or polytetrafluoroethylene (PTFE) material.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 시료는 객담 시료 또는 기관지 세척액 시료일 수 있다. In one embodiment of the present invention, the sample may be a sputum sample or a bronchial lavage sample.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 결핵균은 활동성 결핵균일 수 있다. In one embodiment of the present invention, the Mycobacterium tuberculosis may be an active Mycobacterium tuberculosis.
본 발명은 또한 0.45um 내지 1.00um 사이즈의 멤브레인 필터 및 결핵균에 특이적으로 결합할 수 있는 항체를 포함하는 결핵 진단용 키트를 제공할 수 있다. The present invention may also provide a tuberculosis diagnostic kit comprising a membrane filter having a size of 0.45um to 1.00um and an antibody capable of specifically binding to Mycobacterium tuberculosis.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 멤브레인 필터는 Polyvinylidene Fluoride(PVDF) 또는 Polytetrafluoroethylene(PTFE) 소재로 제작된 것 일 수 있다. In one embodiment of the present invention, the membrane filter may be made of polyvinylidene fluoride (PVDF) or polytetrafluoroethylene (PTFE) material.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 분석 대상이 되는 시료는 객담 또는 또는 기관지 세척액 시료일 수 있다. In one embodiment of the present invention, the sample to be analyzed may be a sputum or a bronchial lavage sample.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 추가로 상기 항체에 특이적으로 결합하는 검출체, 세척액 및 효소반응 정지액을 포함할 수 있다. In one embodiment of the present invention, it may further include a detector that specifically binds to the antibody, a washing solution and an enzyme reaction stop solution.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 검출체는 발색효소, 형광물질 및 방사성 동위원소로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나로 표지된 접합체일 수 있다. In one embodiment of the present invention, the detector may be a conjugate labeled with any one selected from the group consisting of a chromogenic enzyme, a fluorescent substance, and a radioactive isotope.
본 발명에 따른 결핵균을 검출하는 방법은 멤브레인 필터를 사용하여 환자의 객담 또는 기관지 폐포 세척액 시료를 농축하고, 검출하고자 하는 결핵균의 농도를 높여 검출 효율을 향상 시키는 효과가 있다. 결핵균에 결합하는 항체 또는 방사성 동위원소가 표지 된 항체를 농축된 시료와 반응시킨 후에 발색법 또는 방사선 계수법으로 확인함으로써, 멤브레인 상의 결핵균을 직접으로 검출함으로써, 검출에 소요되는 시간을 단축시키며 신속하게 활동성 결핵을 진단할 수 있는 효과가 있다.The method for detecting Mycobacterium tuberculosis according to the present invention has the effect of enhancing the detection efficiency by concentrating a sample of a patient's sputum or bronchoalveolar lavage solution using a membrane filter, and increasing the concentration of Mycobacterium tuberculosis to be detected. By reacting an antibody that binds to Mycobacterium tuberculosis or an antibody labeled with a radioactive isotope with a concentrated sample, and confirming it by chromogenic or radioactive counting, it directly detects Mycobacterium tuberculosis on the membrane, shortening the time required for detection and rapidly increasing activity It is effective in diagnosing tuberculosis.
도 1은 방사성동위원소가 표지된 항체를 이용하여 결핵균을 검출 한 뒤, 방사선계수법을 이용하여 결핵균을 검출한 결과이다.
도 2은 I-125 주입량 대비 흡착량 분석 결과이다. 1 is a result of detecting Mycobacterium tuberculosis using a radioactive isotope-labeled antibody, and then detecting Mycobacterium tuberculosis using a radiation counting method.
2 is an analysis result of the amount of adsorption compared to the amount of I-125 injected.
본 발명자들은 결핵균을 검출하는 방법에 있어서, 긴 시간이 소요되는 기존의 활동성 결핵을 검출하는 방법을 대체할 수 있는 기술로서, 객담 또는 기관지 세척액 시료를 멤브레인 필터로 농축하고, 항체 또는 방사성동위원소가 표지 된 항체를 이용하여 결핵 또는 기관지 세척액 시료에서 결핵균을 신속하게 검출할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다. In the method for detecting Mycobacterium tuberculosis, as a technology that can replace the conventional method of detecting active tuberculosis, which takes a long time, the sputum or bronchial lavage sample is concentrated with a membrane filter, and the antibody or radioisotope is It was confirmed that Mycobacterium tuberculosis can be rapidly detected from tuberculosis or bronchial lavage samples using the labeled antibody, and the present invention was completed.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.
본 발명은 0.45um 내지 1.00um 사이즈의 멤브레인 필터를 이용하여 시료내 결핵균을 검출하는 방법을 제공할 수 있다. The present invention can provide a method for detecting Mycobacterium tuberculosis in a sample using a membrane filter having a size of 0.45um to 1.00um.
상기 멤브레인 필터는 Polyvinylidene Fluoride(PVDF) 또는 Polytetrafluoroethylene(PTFE) 소재로 제작된 것일 수 있다. The membrane filter may be made of polyvinylidene fluoride (PVDF) or polytetrafluoroethylene (PTFE) material.
본 발명자들은 다양한 사이즈 및 종류의 멤브레인 필터를 사용하여 결핵균을 검출한 결과, Polyvinylidene Fluoride(PVDF) 또는 Polytetrafluoroethylene(PTFE) 소재로 제작된 0.45um 내지 1.00um의 pore size의 멤브레인 필터가 최적임을 확인하였다 (표 1). As a result of detecting Mycobacterium tuberculosis using various sizes and types of membrane filters, the present inventors confirmed that a membrane filter with a pore size of 0.45um to 1.00um made of Polyvinylidene Fluoride (PVDF) or Polytetrafluoroethylene (PTFE) material was optimal ( Table 1).
상기 시료는 객담 시료 또는 기관지 세척액 시료일 수 있다.The sample may be a sputum sample or a bronchial lavage sample.
상기 결핵균은 활동성 결핵균일 수 있다.The Mycobacterium tuberculosis may be an active Mycobacterium tuberculosis.
본 발명은 또한 0.45um 내지 1.00um 사이즈의 멤브레인 필터 및 결핵균에 특이적으로 결합할 수 있는 항체를 포함하는 결핵 진단용 키트를 제공할 수 있다.The present invention may also provide a tuberculosis diagnostic kit comprising a membrane filter having a size of 0.45um to 1.00um and an antibody capable of specifically binding to Mycobacterium tuberculosis.
상기 멤브레인 필터는 Polyvinylidene Fluoride(PVDF) 또는 Polytetrafluoroethylene(PTFE) 소재로 제작된 것 일 수 있다.The membrane filter may be made of polyvinylidene fluoride (PVDF) or polytetrafluoroethylene (PTFE) material.
분석 대상이 되는 시료는 객담 또는 또는 기관지 세척액 시료일 수 있다. The sample to be analyzed may be a sample of sputum or bronchial lavage.
본 발명은 또한 상기 키트에 추가로 상기 항체에 특이적으로 결합하는 검출체, 세척액 및 효소반응 정지액을 포함할 수 있다. The present invention may also include a detector that specifically binds to the antibody, a washing solution, and an enzyme reaction stop solution in addition to the kit.
상기 검출체는 발색효소, 형광물질 및 방사성 동위원소로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나로 표지된 접합체일 수 있다. 예를 들어, 상기 발색효소는 퍼록시다제(peroxidase), 알칼라인 포스파타제(alkaline phosphatase) 또는 산성 포스파타제(acid phosphatase)[예: 양고추냉이 퍼록시다제(horseradish peroxidase)]일 수 있고; 형광물질인 경우, 콜로이드 골드(Coloid gold), 플루오레신카복실산(FCA), 플루오레신 이소티오시아네이트(FITC), RITC(Rhodamine-Bisothiocyanate), 플루오레신 티오우레아(FTH), 7-아세톡시쿠마린-3-일, 플루오레신-5-일, 플루오레신-6-일, 2',7'-디클로로플루오레신-5-일, 2',7'-디클로로플루오레신-6-일, 디하이드로테트라메틸로사민-4-일, 테트라메틸로다민-5-일, 테트라메틸로다민-6-일, 4,4-디플루오로-5,7-디메틸-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-에틸 또는 4,4-디플루오로-5,7-디페닐-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-에틸일 수 있고, 동위원소인 경우 I-125, H-3, C-14, P-32, P-33, Cr-51 등을 사용하는 것이 가능하나, 이에 제한되지 않는다.The detector may be a conjugate labeled with any one selected from the group consisting of a chromogenic enzyme, a fluorescent material, and a radioactive isotope. For example, the chromogenic enzyme may be peroxidase, alkaline phosphatase, or acid phosphatase (eg, horseradish peroxidase); In case of fluorescent material, colloidal gold (Coloid gold), fluorescein carboxylic acid (FCA), fluorescein isothiocyanate (FITC), RITC (Rhodamine-Bisothiocyanate), fluorescein thiourea (FTH), 7-acetate Toxicoumarin-3-yl, fluorescein-5-yl, fluorescein-6-yl, 2',7'-dichlorofluorescein-5-yl, 2',7'-dichlorofluorescein-6 -yl, dihydrotetramethylrosamine-4-yl, tetramethylrhodamine-5-yl, tetramethylrhodamine-6-yl, 4,4-difluoro-5,7-dimethyl-4-bora- 3a,4a-diaza-s-indacene-3-ethyl or 4,4-difluoro-5,7-diphenyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacene-3-ethyl In the case of isotopes, it is possible to use I-125, H-3, C-14, P-32, P-33, Cr-51, and the like, but is not limited thereto.
본 발명의 키트는 상기 항원항체 복합체의 항원항체 반응을 측정하는 방법 또는 상기 항원항체 복합체에 검출체를 처리한 후 검출체의 양을 측정함으로써 결핵을 진단할 수 있다. 상기 항원항체 반응으로서 효소면역측정법 (ELISA), 면역침강법, 형광면역법, 효소기질발색법, 항원항체응집법 등을 들 수 있고, 검출체의 양 측정이나 존재 검출은 발색, 형광, 발광, 화학발광(chemiluminescence), 흡광도, 반사 또는 투과를 통해 이루어질 수 있다The kit of the present invention can diagnose tuberculosis by measuring the antigen-antibody response of the antigen-antibody complex or by measuring the amount of the detection body after treating the antigen-antibody complex with the detection body. Examples of the antigen-antibody reaction include enzyme immunoassay (ELISA), immunoprecipitation method, fluorescence immunoassay, enzyme substrate color development method, antigen-antibody aggregation method, and the like. (chemiluminescence), can be achieved through absorbance, reflection or transmission
상기 검출체의 양을 탐색하는 방법으로는 검출체로 방사선 동위원소가 부착되어 방사선을 검출함으로써 수행되는 방사선법 또는 검출체에 결합된 발색효소의 발색을 유도하는 기질을 처리하여 발색반응을 측정하는 방법을 이용하는 것이 바람직하고, 여기에는 검출체로 형광물질이 부착되어 형광을 검출함으로써 수행되는 형광법; 검출체의 표지 없이 표면의 플라즈몬 공명 변화를 실시간으로 측정하는 SPR(surface plasmon resonance) 방법 또는 SPR 시스템을 영상화하여 확인하는 SPRI(surface plasmon resonance imaging) 방법을 이용하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.As a method of detecting the amount of the detector, a radiation method in which a radioactive isotope is attached to the detector to detect radiation, or a method of measuring a color reaction by treating a substrate that induces color development of a chromogenic enzyme bound to the detector It is preferable to use a fluorescence method, which is performed by attaching a fluorescent material to a detector to detect fluorescence; It is preferable to use a surface plasmon resonance (SPR) method for measuring changes in surface plasmon resonance in real time without labeling a detector or a surface plasmon resonance imaging (SPRI) method for confirming an SPR system by imaging, but is not limited thereto.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, preferred examples are presented to help the understanding of the present invention. However, the following examples are only provided for easier understanding of the present invention, and the contents of the present invention are not limited by the following examples.
실시예 1. 멤브레인 필터의 조건 및 항체의 발색법을 이용한 결핵균 검출Example 1. Detection of Mycobacterium tuberculosis using membrane filter conditions and antibody color development method
생리식염수 50ul(대조군) 및 결핵환자의 객담을 배양한 시료 50ul(실험군)를 아래의 조건별 멤브레인 필터에 주입하고, Tris-buffered Saline(TBS) 2ml을 주입하여 세척하였다. 결핵균에 결합하는 1차 항체 100ul를 넣고 2시간 동안 상온에서 반응시켰다. TBS 5~10ml을 2회 주입하여 세척하였다. 1차 항체에 결합하는 Horseradish peroxidase(HRP)가 표지된 2차 항체 100ul를 넣고 30분간 상온에서 반응시켰다. TBS 5~10ml을 2회 주입하여 세척하였다. 발색법으로 결핵균을 검출하기 위하여 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine(TMB) 100ul를 넣고, 5분간 상온에서 반응시켰다. 발색 여부를 확인함으로써 결핵균 검출을 위한 멤브레인 필터의 조건을 평가하였다. 시료 내 존재하는 결핵균을 농축하여 검출하기 위해서는 Polyvinylidene Fluoride(PVDF) 또는 Polytetrafluoroethylene(PTFE) 소재로 제작된 0.45um ~ 1.00um의 pore size의 멤브레인 필터가 최적임을 확인하였다 (표 1).50ul of physiological saline (control group) and 50ul of a sample cultured with tuberculosis patient's sputum (experimental group) were injected into the membrane filter according to the following conditions, and 2ml of Tris-buffered Saline (TBS) was injected and washed. 100ul of the primary antibody binding to Mycobacterium tuberculosis was added and reacted at room temperature for 2 hours. It was washed by injecting 5-10 ml of TBS twice. 100ul of a secondary antibody labeled with Horseradish peroxidase (HRP) binding to the primary antibody was added and reacted at room temperature for 30 minutes. It was washed by injecting 5-10 ml of TBS twice. 100ul of 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine (TMB) was added to detect Mycobacterium tuberculosis by a colorimetric method, and reacted at room temperature for 5 minutes. The condition of the membrane filter for detecting Mycobacterium tuberculosis was evaluated by checking whether or not color was developed. In order to concentrate and detect Mycobacterium tuberculosis present in the sample, it was confirmed that a membrane filter with a pore size of 0.45um to 1.00um made of Polyvinylidene Fluoride (PVDF) or Polytetrafluoroethylene (PTFE) material was optimal (Table 1).
추가로 결핵균에 대한 특이적 검출을 확인하기 위하여 타 세균(E.coli)를 이용한 음성대조군 실험을 수행하였다. 위 실험과 같은 조건에서 생리식염수 50ul(대조군), E.coli(음성대조군), 결핵균(실험군)을 각각 주입하여 평가한 결과, 음성대조군에서는 발색이 되지 않았다. 이를 통하여 결핵균 특이적인 검출이 가능함을 확인하였다 (표 2).In addition, to confirm the specific detection of Mycobacterium tuberculosis, a negative control experiment using other bacteria (E. coli) was performed. Under the same conditions as the above experiment, 50ul of physiological saline (control group), E.coli (negative control group), and Mycobacterium tuberculosis (experimental group) were each injected and evaluated. As a result, color development was not observed in the negative control group. Through this, it was confirmed that tuberculosis-specific detection was possible (Table 2).
실시예 2. 방사성동위원소가 표지된 항체 및 방사선계수법을 이용한 결핵균 검출Example 2. Detection of Mycobacterium tuberculosis using radioisotope-labeled antibody and radiation counting method
생리식염수 50ul(대조군) 및 결핵환자의 객담을 배양한 시료 50ul(실험군)를 멤브레인 필터에 주입하고, Tris-buffered Saline(TBS) 2ml을 주입하여 세척하였다. 결핵균에 결합하는 1차 항체 100ul를 넣고 2시간 동안 상온에서 반응시켰다. TBS 5~10ml을 2회 주입하여 세척하였다. 방사성동위원소 I-125가 표지된 2차 항체 100ul를 넣고 30분간 상온에서 반응시켰다. TBS 5~10ml을 2회 주입하여 세척하였다. I-125의 주요 감마 에너지 영역(35.49 keV)에 대한 방사능량을 Multichannel Analyzer(MCA)를 이용하여 1,800초간 측정하였다. 또한, 측정된 값을 초기 주입된 방사능량(Injected Dose)으로 나누어, 결핵균에 I-125 표지항체가 결합된 비율(%Binding)을 분석하였다. Background 및 대조군에 비하여 실험군에서 높은 방사능량이 측정되었다. 이로써 방사성동위원소가 표지된 항체 및 방사선계수법을 이용하여 결핵균 검출이 가능함을 확인하였다 (도 1 및 도 2).50ul of physiological saline (control group) and 50ul of a sample cultured with tuberculosis patient's sputum (test group) were injected into the membrane filter, and 2ml of Tris-buffered Saline (TBS) was injected and washed. 100ul of the primary antibody binding to Mycobacterium tuberculosis was added and reacted at room temperature for 2 hours. It was washed by injecting 5-10 ml of TBS twice. 100ul of radioisotope I-125-labeled secondary antibody was added and reacted at room temperature for 30 minutes. It was washed by injecting 5-10 ml of TBS twice. The radioactivity for the main gamma energy region (35.49 keV) of I-125 was measured for 1,800 seconds using a Multichannel Analyzer (MCA). In addition, the ratio of the I-125-labeled antibody to Mycobacterium tuberculosis (%Binding) was analyzed by dividing the measured value by the initial injected dose (Injected Dose). Higher radioactivity was measured in the experimental group compared to the background and control group. Accordingly, it was confirmed that Mycobacterium tuberculosis could be detected using a radioisotope-labeled antibody and radiation counting method ( FIGS. 1 and 2 ).
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.The above description of the present invention is for illustration, and those of ordinary skill in the art to which the present invention pertains can understand that it can be easily modified into other specific forms without changing the technical spirit or essential features of the present invention. will be. Therefore, it should be understood that the embodiments described above are illustrative in all respects and not restrictive.
Claims (9)
(a) 환자로부터 채취된 객담 시료를 0.45um 내지 1.00um 사이즈의 hydrophilic Polyvinylidene Fluoride(친수성 PVDF) 멤브레인 필터에 주입하여 결핵균을 농축하는 단계;
(b) 상기 결핵균에 특이적으로 결합하는 1차 항체를 (a)단계에서 농축된 결핵균과 반응시키는 단계; 및
(c) 상기 1차 항체에 2차 항체를 반응시킨 후 결핵균 포함 여부를 식별하는 단계.A method for detecting Mycobacterium tuberculosis, comprising the steps of:
(a) concentrating Mycobacterium tuberculosis by injecting the sputum sample collected from the patient into a hydrophilic Polyvinylidene Fluoride (hydrophilic PVDF) membrane filter having a size of 0.45um to 1.00um;
(b) reacting the primary antibody specifically binding to Mycobacterium tuberculosis with the Mycobacterium tuberculosis concentrated in step (a); and
(c) after reacting the secondary antibody with the primary antibody, identifying whether or not Mycobacterium tuberculosis is included.
(c) 단계는 발색법 또는 방사선계수법을 통해 결핵균 포함 여부를 식별하는 것을 특징으로 하는, 결핵균을 검출하는 방법. According to claim 1,
(c) step is a method for detecting Mycobacterium tuberculosis, characterized in that it identifies whether Mycobacterium tuberculosis is included through a colorimetric method or radiation counting method.
상기 시료는 객담 시료 또는 기관지 세척액 시료인, 결핵균을 검출하는 방법. According to claim 1,
The sample is a sputum sample or a bronchial lavage sample, a method for detecting Mycobacterium tuberculosis.
상기 결핵균은 활동성 결핵균인, 결핵균을 검출하는 방법.According to claim 1,
The Mycobacterium tuberculosis is an active Mycobacterium tuberculosis, a method for detecting Mycobacterium tuberculosis.
The kit for diagnosing tuberculosis according to claim 8, wherein the detector is a conjugate labeled with any one selected from the group consisting of a chromogenic enzyme, a fluorescent substance, and a radioactive isotope.
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