KR102351732B1 - Pretreatment method for nuclear magnetic resonance spectroscopy sample - Google Patents
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Abstract
본 발명은 핵자기공명분광법으로 분석할 시료를 전처리하는 방법에 대한 것이다.
본 발명에 따른 방법으로 핵자기공명분광법 시료를 전처리 하는 경우, 시료, 특히 식물 시료 내에 잔류하는 화학물질의 변형이나 분해를 최소화할 수 있다. 따라서 본 발명의 핵자기공명분광법 시료용 전처리 방법은 화학사고 등으로 화학물질에 노출된 식물피해 평가에 효과적으로 사용될 수 있으며, 식물과 분말 등 사고현장의 고체상 시료에 대한 시험평가방법을 광범위하게 마련하여 식물피해 손실의 추정 대상 및 방법론을 마련하는데 기여할 수 있다.The present invention relates to a method for pre-treating a sample to be analyzed by nuclear magnetic resonance spectroscopy.
When a nuclear magnetic resonance spectroscopy sample is pre-treated by the method according to the present invention, modification or decomposition of chemical substances remaining in the sample, particularly, the plant sample can be minimized. Therefore, the pretreatment method for nuclear magnetic resonance spectroscopy samples of the present invention can be effectively used to evaluate damage to plants exposed to chemicals due to chemical accidents, etc. It can contribute to preparing the target and methodology for estimating plant damage loss.
Description
본 발명은 핵자기공명분광법으로 분석할 시료를 전처리하는 방법에 대한 것이다. The present invention relates to a method for pre-treating a sample to be analyzed by nuclear magnetic resonance spectroscopy.
화학사고는 사람의 건강, 동식물 등 생태계 및 재산을 포함한 물적 피해에 이르기까지 다양한 피해를 발생시킬 수 있다. 특히 화학사고 피해의 정확한 규모와 경제적 손실을 파악하는 것은 사고 수습 후 사후 조치를 취하기 위한 근거를 마련하는데 핵심적인 요소이다. '화학물질관리법'에 의하면 화학사고 발생 시, 필요한 경우 인적 또는 물적 피해 등을 포함한 영향조사를 실시하여야 하며 이를 토대로 피해규모와 피해액 등 피해의 정도를 산정하도록 되어있다.Chemical accidents can cause a variety of damage, ranging from material damage to human health, to ecosystems such as animals and plants, and property. In particular, identifying the exact scale and economic loss of chemical accident damage is a key factor in preparing the basis for taking follow-up measures after the accident is dealt with. According to the 'Chemical Substances Control Act', in the event of a chemical accident, if necessary, an impact investigation including human or material damage should be conducted, and the extent of damage, such as the size and amount of damage, should be calculated based on this.
미국과 EU 등 선진국에서는 과거 발생한 화학사고의 원인, 수습과정, 복구결과, 사고로부터의 교훈 등을 국가적인 차원에서 종합적으로 데이터베이스로 구축하여 예방정책수립 등의 제도개선에 적극적으로 활용하고 있는 상황이다. 미국은 위해관리계획(RMP, Risk Management Plan), 유럽은 토지이용계획(LUP, Land Use Planning)등의 엄격한 안전 관리계획 및 법령에 따라 유해화학물질 누출에 따른 환경의 영향을 고려하여 위험물을 취급, 관리하고 있으며 특히 미국의 경우 화학안전 및 위험조사위원회 (U.S. Chemical Safety and Hazard Investigation Board)를 독립기구로 발족시켜 미국에서 일어나는 화학 사고의 원인에 대한 조사를 전담하도록 하고 있으며 사고대응 측면에서 주도적 운영에 관한 책임을 맡고 있는 기구를 별개로 운영 중에 있다. 그러나 국내의 경우 화학사고 이후 식물피해의 피해액 산정이 가능한 작물은 제한적이고 실제 피해액 산정 방법이나 절차가 구체적으로 적립되어있지 않아 식물피해 시험평가방법의 국내외 자료가 미흡한 실정이고 화학사고 발생 현장에서 채취된 식물과 분말 등 고체시료에 대한 직접시험 평가방법으로 사용되는 적외선 분광법 등은 제한적인 정보를 제공한다는 한계가 있다.In advanced countries such as the United States and the EU, the causes of chemical accidents that have occurred in the past, recovery process, recovery results, and lessons learned from accidents have been comprehensively established as a database at the national level, and are being actively utilized for institutional improvement such as establishment of preventive policies. . Dangerous substances are handled in consideration of the environmental impact of hazardous chemical leakage in accordance with strict safety management plans and laws such as the Risk Management Plan (RMP) in the United States and the Land Use Planning (LUP) in Europe. In particular, the US Chemical Safety and Hazard Investigation Board (US Chemical Safety and Hazard Investigation Board) was established as an independent organization to investigate the causes of chemical accidents in the United States, and takes the lead in responding to accidents. There is a separate organization in charge of the However, in Korea, the amount of damage to plants that can be estimated after a chemical accident is limited, and there are no specific methods or procedures for calculating the actual amount of damage. Infrared spectroscopy, which is used as a direct test evaluation method for solid samples such as plants and powder, has a limitation in providing limited information.
A. Rivas et al. Method in Ecology and Evolution (2013) 464-473 등에서 현장 생태학에 적용할 수 있는 NMR 기반 프로토콜 등을 제공하고 있으나, 여전히 화학사고로 인한 식물피해 평가의 정밀도와 정확도 개선을 위해 최근 개발된 고체상핵자기공명분광법의 추가 도입이 요구되고 있다.A. Rivas et al. Although Method in Ecology and Evolution (2013) 464-473 provides NMR-based protocols that can be applied to field ecology, solid-state nuclear magnetic resonance has been recently developed to improve the precision and accuracy of plant damage assessment due to chemical accidents. Further introduction of spectroscopy is required.
이에 본 발명자들은 화학사고로 인한 식물피해 평가의 정밀도와 정확도를 개선할 수 있는 방안을 제공하고자 예의 노력한 결과, 핵자기공명분광법으로 분석할 시료 내 자류 화학물질의 변성 또는 분화를 최소화 하는 방안을 확립하여 본 발명을 완성하였다. Accordingly, the present inventors have made diligent efforts to provide a way to improve the precision and accuracy of the evaluation of plant damage due to chemical accidents, and as a result, establish a method to minimize the denaturation or differentiation of free chemical substances in the sample to be analyzed by nuclear magnetic resonance spectroscopy. Thus, the present invention was completed.
따라서, 본 발명은 핵자기공명분광법 시료용 전처리 방법을 제공한다.Accordingly, the present invention provides a pretreatment method for nuclear magnetic resonance spectroscopy samples.
본 발명은 i) 증류수에 세척한 식물 시료를 30 내지 45℃의 건조기에서 10 내지 15시간 동안 건조 후 -10 내지 -30℃ 냉동고에 보관하는 단계; The present invention comprises the steps of: i) drying a plant sample washed in distilled water for 10 to 15 hours in a dryer at 30 to 45° C. and storing it in a freezer at -10 to -30° C.;
ⅱ) 상기 단계 i)의 시료를 동결분쇄기로 미세하게 분쇄하는 단계; 및ii) finely pulverizing the sample of step i) with a freeze crusher; and
ⅲ) 상기 단계 ⅱ)의 분쇄된 시료를 동결건조하는 단계; iii) freeze-drying the pulverized sample of step ii);
를 포함하는 핵자기공명분광법 시료용 전처리 방법을 제공한다. It provides a pretreatment method for nuclear magnetic resonance spectroscopy samples comprising a.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 전처리 방법은According to a preferred embodiment of the present invention, the pretreatment method is
ⅳ) 상기 단계 ⅲ)의 동결건조된 시료 및 CDCl3 을 혼합하는 단계; iv) mixing the freeze-dried sample of step iii) and CDCl 3 ;
를 추가적으로 포함하는 핵자기공명분광법 시료용 전처리 방법을 제공한다. It provides a pretreatment method for nuclear magnetic resonance spectroscopy samples additionally comprising a.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 식물 시료는 식물의 꽃, 잎, 가지, 기둥 및 뿌리로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것이다. According to a preferred embodiment of the present invention, the plant sample is any one or more selected from the group consisting of flowers, leaves, branches, columns and roots of plants.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 핵자기공명분광법은 고분해능-MAS 핵자기공명분광법(HR-MAS NMR), 액체핵자기공명분광법(Solution state NMR) 및 고체핵자기공명분광법(Solid state NMR) 로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것이다. According to a preferred embodiment of the present invention, the nuclear magnetic resonance spectroscopy is high resolution-MAS nuclear magnetic resonance spectroscopy (HR-MAS NMR), liquid nuclear magnetic resonance spectroscopy (Solution state NMR), and solid state NMR spectroscopy (Solid state NMR). ) is at least one selected from the group consisting of.
본 발명은 또한, i) 식물 시료, 메탄올 수용액 및 클로로포름을 혼합하여 원심분리하는 단계;The present invention also comprises the steps of: i) centrifuging a mixture of a plant sample, an aqueous methanol solution and chloroform;
ⅱ) 상기 단계 i)의 원심분리된 수용액 층 또는 유기용매 층에서 각각 분취하는 단계;ii) separating each from the centrifuged aqueous solution layer or the organic solvent layer of step i);
ⅲ) 상기 단계 ⅱ)에서 분취 후 남은 수용액 층 및 유기용매 층에 메탄올 수용액 및 클로로포름을 혼합하여 원심분리하는 단계; 및iii) centrifuging by mixing an aqueous solution of methanol and chloroform in the aqueous solution layer and the organic solvent layer remaining after fractionation in step ii); and
ⅳ) 상기 단계 ⅲ)에서 원심분리된 수용액 층 또는 유기용매 층에서 각각 수용성 대사체 또는 불용성 대사체를 수득하는 단계;iv) obtaining a water-soluble metabolite or an insoluble metabolite from the aqueous solution layer or the organic solvent layer centrifuged in step iii);
를 포함하는 핵자기공명분광법 시료용 전처리 방법을 제공한다. It provides a pretreatment method for nuclear magnetic resonance spectroscopy samples comprising a.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 단계 i)의 식물 시료는 식물의 꽃, 잎, 가지, 기둥 및 뿌리로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것이다. According to a preferred embodiment of the present invention, the plant sample of step i) is any one or more selected from the group consisting of flowers, leaves, branches, columns and roots of plants.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 단계 i)의 식물 시료는 According to a preferred embodiment of the present invention, the plant sample of step i) is
i) 증류수에 세척한 식물 시료를 30 내지 45℃의 건조기에서 10 내지 15시간 동안 건조 후 -10 내지 -30℃ 냉동고에 보관하는 단계; i) drying the plant sample washed in distilled water for 10 to 15 hours in a dryer at 30 to 45° C. and storing it in a freezer at -10 to -30° C.;
ⅱ) 상기 단계 i)의 시료를 동결분쇄기로 미세하게 분쇄하는 단계; 및ii) finely pulverizing the sample of step i) with a freeze crusher; and
ⅲ) 상기 단계 ⅱ)의 분쇄된 시료를 동결건조하는 단계;iii) freeze-drying the pulverized sample of step ii);
로 제조되는 것이다. will be manufactured with
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 전처리 방법은 According to a preferred embodiment of the present invention, the pretreatment method is
v) 상기 단계 ⅳ)에서 수득한 수용성 대사체를 동결건조하여 가루형태의 시료로 제조하는 단계;v) preparing a sample in powder form by lyophilizing the water-soluble metabolite obtained in step iv);
vi) 상기 단계 v)의 가루형태의 시료 및 H2O 를 혼합하여 vortexing 후 원심분리하여 상층액을 분취 및 동결건조하는 단계; vi) mixing the powdered sample of step v) and H 2 O, vortexing, and centrifuging to fractionate and freeze-dry the supernatant;
ⅶ) 상기 단계 ⅵ)의 동결건조된 상층액을 D2O와 혼합하여 원심분리한 후 상층액을 분취하는 단계; vii) mixing the lyophilized supernatant of step vi) with D 2 O and centrifuging the mixture, followed by aliquoting the supernatant;
를 추가적으로 포함하는 것이다. will additionally include
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 전처리 방법은 According to a preferred embodiment of the present invention, the pretreatment method is
v) 상기 단계 ⅳ)에서 수득한 불용성 대사체를 회전증발농축기를 이용하여 용매를 제거하는 단계; 및v) removing the solvent from the insoluble metabolite obtained in step iv) using a rotary evaporator; and
vi) 상기 단계 v)의 용매가 제거된 불용성 대사체 및 CDCl3을 혼합하여 원심분리하여 상층액을 분취하는 단계; vi) mixing the insoluble metabolite from which the solvent of step v) has been removed and CDCl 3 and centrifuging the mixture to collect the supernatant;
를 추가적으로 포함하는 것이다. will additionally include
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 핵자기공명분광법은 고분해능-MAS 핵자기공명분광법(HR-MAS NMR), 액체핵자기공명분광법(Solution state NMR) 및 고체핵자기공명분광법(Solid state NMR) 로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것이다.According to a preferred embodiment of the present invention, the nuclear magnetic resonance spectroscopy is high resolution-MAS nuclear magnetic resonance spectroscopy (HR-MAS NMR), liquid nuclear magnetic resonance spectroscopy (Solution state NMR), and solid state NMR spectroscopy (Solid state NMR). ) is at least one selected from the group consisting of.
본 발명에 따른 방법으로 핵자기공명분광법 시료를 전처리 하는 경우, 시료, 특히 식물 시료 내에 잔류하는 화학물질의 변형이나 분해를 최소화할 수 있다. 따라서 본 발명의 핵자기공명분광법 시료용 전처리 방법은 화학사고 등으로 화학물질에 노출된 식물피해 평가에 효과적으로 사용될 수 있으며, 식물과 분말 등 사고현장의 고체상 시료에 대한 시험평가방법을 광범위하게 마련하여 식물피해 손실의 추정 대상 및 방법론을 마련하는데 기여할 수 있다.When a nuclear magnetic resonance spectroscopy sample is pre-treated by the method according to the present invention, modification or decomposition of chemical substances remaining in the sample, particularly, the plant sample can be minimized. Therefore, the pretreatment method for nuclear magnetic resonance spectroscopy samples of the present invention can be effectively used to evaluate damage to plants exposed to chemicals due to chemical accidents, etc. It can contribute to preparing the target and methodology for estimating plant damage loss.
도 1은 본 발명의 식물시료 전처리 방법의 과정을 나타낸다.
도 2는 Solution-State NMR을 이용한 도토리나무 잎의 수용성 대사체의 1H 실험 결과를 나타낸다.
도 3은 Solution-State NMR을 이용한 도토리나무 잎의 수용성 대사체의 1H-13C 2D 실험 결과를 나타낸다.
도 4는 Solution-State NMR을 이용한 도토리나무 잎의 불용성 대사체의 1H 실험 결과를 나타낸다.
도 5는 Solution-State NMR을 이용한 도토리나무 잎의 불용성 대사체의 1H-13C 2D 실험 결과를 나타낸다.
도 6은 HR-MAS NMR를 이용한 도토리나무 잎의 대사체의 1H 측정 결과를 나타낸다.
도 7은 Solid-State NMR를 이용한 도토리나무 잎의 대사체의 1H 측정 결과를 나타낸다.
도 8은 Solid-State NMR를 이용한 도토리나무 잎의 대사체의 13C 측정 결과를 나타낸다.1 shows the process of the plant sample pretreatment method of the present invention.
Figure 2 shows the results of 1 H experiment of water-soluble metabolites of acorn leaves using Solution-State NMR.
3 shows the results of 1 H- 13 C 2D experiment of water-soluble metabolites of acorn leaves using Solution-State NMR.
4 shows the results of 1 H experiment of insoluble metabolites of acorn leaves using Solution-State NMR.
5 shows the results of 1 H- 13 C 2D experiment of insoluble metabolites of acorn leaves using Solution-State NMR.
6 shows the results of 1 H measurement of metabolites in acorn leaves using HR-MAS NMR.
7 shows the results of 1 H measurement of metabolites in acorn leaves using solid-state NMR.
8 shows 13 C measurement results of metabolites of acorn leaves using solid-state NMR.
이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다. Hereinafter, the present invention will be described in more detail.
본 연구에서는 화학사고로 인한 식물피해 평가의 정밀도와 정확도 개선을 위해 최근 개발된 고체본 발명은 고체상핵자기공명분광기를 활용하여 고체 식물시료 내 화학물질의 분자구조 분석을 위한 CPMG, CPMAS등의 적용 가능한 펄스 시퀀스를 확인하고 이를 이용한 측정기법에 대해 조사를 완료하였고 측정기법을 확립하였다. 또한, 식물시료 내 잔류 화학물질의 변성이나 분해를 최소화 하는 수집, 건조, 보관 등 시료별 표준화된 전처리 방법을 표준화 방법으로 구축하였다(도 1). 상기 표준화 방법은 일반 도토리나무 잎을 사용하여 확립한 고체 시료 핵자기공명분광법 3종별 4종의 전처리 방법은 염산과 암모니아에 노출시켜 화학사고를 유발한 시료들에 적용하여 본 연구에서 표준화하고 확립한 시료 전처리 방법과 3종의 핵자기공명분광법을 적용하여 그 차이를 보여주어 기대 이상의 성과를 거두었다. 따라서, 식물과 분말 등 사고현장의 고체상 시료에 대한 시험평가방법을 광범위하게 마련하여 식물피해 손실의 추정 대상 및 방법론을 마련하는데 기여할 수 있다. In this study, the present invention, which was recently developed to improve the precision and accuracy of plant damage assessment due to chemical accidents, utilizes solid-state nuclear magnetic resonance spectroscopy to analyze the molecular structure of chemical substances in solid plant samples. Application of CPMG, CPMAS, etc. A possible pulse sequence was confirmed, and a measurement method using it was investigated, and the measurement method was established. In addition, a standardized pretreatment method for each sample such as collection, drying, and storage that minimizes denaturation or decomposition of residual chemical substances in plant samples was established as a standardization method (FIG. 1). The standardization method was standardized and established in this study by applying the 4 pretreatment methods for each 3 types of solid sample nuclear magnetic resonance spectroscopy established using general acorn leaves to the samples that caused chemical accidents by exposure to hydrochloric acid and ammonia. By applying the sample pre-treatment method and three types of nuclear magnetic resonance spectroscopy, the difference was shown and the results exceeded expectations. Therefore, it can contribute to preparing the target and methodology for estimating plant damage loss by providing a wide range of test and evaluation methods for solid samples at the accident site, such as plants and powder.
본 발명은, 동결건조한 시료(실시예 1)는 추가의 전처리 없이 로터(Rotor)에 패킹(packing)하여 고체핵자기공명분광실험을 수행할 수 있으며, CDCl3 같은 용매를 추가하여 잘 섞은 후에 고분해능-MAS(HR-MAS)핵자기공명분광실험을 수행할 수도 있고, 유기용매와 물용매에 가용성분을 추출하여 액체핵자기공명분광실험을 측정하면 대사산물에 대한 정보도 얻을 수 있다.In the present invention, the freeze-dried sample (Example 1) can be packed in a rotor without additional pretreatment to perform a solid nuclear magnetic resonance spectroscopy experiment, and a solvent such as CDCl 3 is added and mixed well, and then high resolution -MAS (HR-MAS) nuclear magnetic resonance spectroscopy can be performed, and information on metabolites can be obtained by measuring liquid nuclear magnetic resonance spectroscopy by extracting soluble components in organic and water solvents.
화학물질은 사고대비물질 99종에 포함되어 있는 화학물질 중에 선정하였으며, 그 중 2014년~2017년 4년간 6개의 합동방재센터 119화학구조센터에서 대응한 화학사고 물질별로 출동횟수에 근거하여 화학사고가 가장 많이 일어났던 물질로 선정하였다. 이에 따라 출동횟수가 가장 많았던 화학물질관리법 및 산업안전보건법상 지정된 사고 화학 물질인 염산(Hydrogen chloride, HCl), 암모니아(Ammonia. NH3)를 화학물질로 선정하였다. 염산은 부식성 기체, 압축가스, 염산 수용액 등의 무색의 상태로 존재하며 톡 쏘는 자극적인 냄새, 숨막히는 냄새가 난다. 제약용 염화수소산염을 생성하기 위해 사용되며, 반도체 결정을 에칭할 때, 고무 염소화, 촉매와 응축제 등으로써 사용된다. 수용액 상태의 염산은 심한 화상을 유발하며 증기 흡입시 심한 경우 폐부종, 순환 정지, 사망을 유발할 수 있다. 암모니아는 무색의 기체 상태로 자극적이고 마른 뇨 냄새가 나며 물에 녹였을 경우를 암모니아수라고 한다. 질산, 폭발물류, 합성 섬유류, 비료제 제조, 냉매로 자주 쓰인다. 액체 암모니아는 피부와 눈에 화상을 입힐 수 있으며 증기는 극도의 자극성을 가지므로 눈과 호흡기계에 자극을 일으킬 수 있다.Chemical substances were selected from among the 99 chemical substances included in accident preparation materials, and among them, chemical accidents were conducted based on the number of dispatches for each chemical accident substance responded to by the 119 chemical rescue centers in 6 joint disaster prevention centers for 4 years from 2014 to 2017. was selected as the material with the most occurrence. Accordingly, hydrochloric acid (HCl, HCl) and ammonia (Ammonia. NH 3 ), which were designated accidental chemicals under the Chemicals Control Act and Occupational Safety and Health Act, were selected as chemical substances, which had the highest number of dispatches. Hydrochloric acid exists in a colorless state such as a corrosive gas, compressed gas, or aqueous hydrochloric acid solution, and has a pungent, suffocating odor. Used to produce pharmaceutical hydrochloric acid salts, used as a rubber chlorinator, catalyst and condensing agent, etc. when etching semiconductor crystals. Hydrochloric acid in aqueous solution can cause severe burns and, in severe cases, can cause pulmonary edema, circulatory arrest, and death when inhaled. Ammonia is a colorless gas with an irritating, dry urine odor. When dissolved in water, it is called ammonia water. It is often used as nitric acid, explosives, synthetic fibers, fertilizers, and refrigerants. Liquid ammonia can cause skin and eye burns, and the vapors are extremely irritating and can cause eye and respiratory irritation.
식물 시료는 화학사고로 인해 화학물질에 영향을 받아 대사체에 변형이 생길 수 있는 식물이면 제한없이 사용될 수 있으나, 본 발명에서는 우리나라 어디서나 흔히 볼 수 있는 나무인 갈참나무(도토리나무)로 선정하였다. 갈참나무는 참나무과에 속하는 낙엽활엽교목으로 표고 800 m 이하의 산정이나 바다 가까운 야산, 섬에서 많이 볼 수 있다. 5~30 cm 정도의 잎이 가지에 어긋나게 달리며 끝이 뾰족하거나 뭉툭한 타원, 가장자리에 조금 날카롭거나 둥근 파도 모양의 불규칙한 톱니가 있으며 가죽처럼 두껍다. 앞면이 짙은 녹색을 띠며 윤기가 있고 뒷면은 회색빛 도는 흰색을 띤다. The plant sample can be used without limitation as long as it is a plant that can be affected by chemicals due to a chemical accident and can cause metabolite transformation, but in the present invention, a oak tree (acorn tree), which is commonly found anywhere in Korea, was selected. Brown oak is a deciduous broad-leaved arboreous tree belonging to the family Oak family, and it can be found in mountaintops below 800 m above sea level, in mountains near the sea, and on islands. Leaves of 5 to 30 cm are alternately hung on branches, with sharp or blunt ovals, slightly sharp or round wave-shaped irregular serrations on the edge, and thick like leather. The front side is dark green and shiny, and the back side is grayish white.
HR-MAS(High Resolution-Magic Angle Spinning)은 Solution-State NMR의 높은 분해능과 Solid-State NMR의 MAS (Magic angle spinning) 기법의 두 가지 NMR 기법을 조합한 것이다. 이는 고체상 또는 젤과 같은 상태 시료의 높은 분해능의 스펙트럼을 얻기 위해 고안된 방법이다. MAS는 로터를 자장에 대하여 Magic angle인 54.74˚로 놓고 빠르게 Spinning을 하는 기법이다. 이를 통해 넓은 선폭을 가지던 선을 상대적으로 선폭이 줄어들어 샤프한 선으로 만들 수 있다.HR-MAS (High Resolution-Magic Angle Spinning) is a combination of the high resolution of solution-state NMR and two NMR techniques, the magic angle spinning (MAS) technique of solid-state NMR. This is a method designed to obtain high-resolution spectra of solid-phase or gel-like samples. MAS is a technique of fast spinning by placing the rotor at a magic angle of 54.74˚ with respect to the magnetic field. In this way, a line with a wide line width can be made into a sharp line with a relatively reduced line width.
고체 핵자기공명분광법(Solid-State NMR)은 액체 핵자기공명분광법(Solution-State NMR)에 비해 스펙트럼선들이 넓은 선폭을 가지고 있다. 고분해능 Solid-State NMR 스펙트럼을 얻으려면 MAS, CP(Cross-polarization) 등의 많은 기법과 장비들이 필요하다. Solid-State NMR에서 측정 가능한 시료는 파우더 형태의 무정형 시료, 결정을 포함한 배향된 시료 등 거의 모든 시료를 측정 가능하다는 장점이 있다. 따라서, 식물 잎 대사체의 고체 상태 시료로부터 다양한 기법과 장비를 통해 고분해능 스펙트럼을 얻을 수 있다. 여기서 사용할 CP 기법은 감도가 낮고 자연 존재비가 작은 핵종(예 : 13C, 15N)의 감도를 높이기 위해 감도가 높고 자연 존재비가 큰 핵종(예 : 1H, 19F)의 감도를 빌려와 자연 존재비가 작은 핵종의 감도를 좋게할 수 있는 기법이다. 따라서 13C 핵종을 관측할 경우 1H 핵종의 감도만큼 고분해능 스펙트럼을 얻을 수 있다.Solid-state NMR spectral lines have a wider linewidth than liquid nuclear magnetic resonance spectroscopy (Solution-State NMR). In order to obtain a high-resolution solid-state NMR spectrum, many techniques and equipment such as MAS and CP (cross-polarization) are required. Samples that can be measured in solid-state NMR have the advantage of being able to measure almost all samples, such as amorphous samples in powder form and oriented samples including crystals. Therefore, high-resolution spectra can be obtained from solid-state samples of plant leaf metabolites through various techniques and equipment. The CP technique used here borrows the sensitivity of high-sensitivity and high natural abundance nuclides (e.g. 1 H, 19 F) to increase the sensitivity of nuclides with low natural abundance (e.g. , 13 C, 15 N). This is a technique that can improve the sensitivity of nuclides with low abundance. Therefore, when 13 C nuclide is observed, a high-resolution spectrum can be obtained as much as the sensitivity of 1 H nuclide.
따라서, 본 발명은 i) 증류수에 세척한 식물 시료를 30 내지 45℃의 건조기에서 10 내지 15시간 동안 건조 후 -10 내지 -30℃ 냉동고에 보관하는 단계; Accordingly, the present invention comprises the steps of: i) drying a plant sample washed in distilled water for 10 to 15 hours in a dryer at 30 to 45° C. and storing it in a freezer at -10 to -30° C.;
ⅱ) 상기 단계 i)의 시료를 동결분쇄기로 미세하게 분쇄하는 단계; 및ii) finely pulverizing the sample of step i) with a freeze crusher; and
ⅲ) 상기 단계 ⅱ)의 분쇄된 시료를 동결건조하는 단계; iii) freeze-drying the pulverized sample of step ii);
를 포함하는 핵자기공명분광법 시료용 전처리 방법을 제공할 수 있다. It is possible to provide a pretreatment method for a nuclear magnetic resonance spectroscopy sample comprising a.
바람직하게는 상기 단계 i)에서 식물 시료는 35 내지 40℃의 건조기에서 11 내지 13시간 동안 건조 후 -15 내지 -25℃ 냉동고에 보관하는 것이 바람직하다. Preferably, in step i), the plant sample is dried in a dryer at 35 to 40° C. for 11 to 13 hours and then stored in a freezer at -15 to -25° C.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 핵자기공명분광법이 고분해능-MAS 핵자기공명분광법(HR-MAS NMR), 액체핵자기공명분광법(Solution state NMR) 및 고체핵자기공명분광법(Solid state NMR) 로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있으나, 바람직하게는 고체핵자기공명분광법(Solid state NMR) 시료용 전처리 방법일 수 있다.According to a preferred embodiment of the present invention, the nuclear magnetic resonance spectroscopy is high-resolution-MAS nuclear magnetic resonance spectroscopy (HR-MAS NMR), liquid nuclear magnetic resonance spectroscopy (Solution state NMR), and solid state NMR spectroscopy (Solid state NMR). ) may be any one or more selected from the group consisting of, preferably, it may be a pretreatment method for solid state NMR samples.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 전처리 방법은 According to a preferred embodiment of the present invention, the pretreatment method is
ⅳ) 상기 단계 ⅲ)의 동결건조된 시료 및 CDCl3 을 혼합하는 단계; iv) mixing the freeze-dried sample of step iii) and CDCl 3 ;
를 추가적으로 포함하는 것일 수 있다. It may be to include additionally.
상기 ⅳ)단계를 추가적으로 포함하는 전처리 방법은, 고분해능-MAS 핵자기공명분광법(HR-MAS NMR), 액체핵자기공명분광법(Solution state NMR) 및 고체핵자기공명분광법(Solid state NMR) 로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 핵자기공명분광법 시료용 전처리 방법일 수 있으나, 바람직하게는 상기 핵자기공명분광법은 고분해능-MAS 핵자기공명분광법(HR-MAS NMR)인 것이 바람직하다. The pretreatment method additionally comprising step iv) is high-resolution-MAS nuclear magnetic resonance spectroscopy (HR-MAS NMR), liquid nuclear magnetic resonance spectroscopy (Solution state NMR) and solid state nuclear magnetic resonance spectroscopy (Solid state NMR) Any one or more nuclear magnetic resonance spectroscopy may be a pretreatment method for a sample selected from, but preferably, the nuclear magnetic resonance spectroscopy is high-resolution-MAS nuclear magnetic resonance spectroscopy (HR-MAS NMR).
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 식물 시료는 식물의 꽃, 잎, 가지, 기둥 및 뿌리로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있다. 바람직하게는 상기 식물 시료는 식물의 잎 일 수 있다. According to a preferred embodiment of the present invention, the plant sample may be any one or more selected from the group consisting of flowers, leaves, branches, columns and roots of plants. Preferably, the plant sample may be a leaf of a plant.
또한, 본 발명은 i) 식물 시료, 메탄올 수용액 및 클로로포름을 혼합하여 원심분리하는 단계;In addition, the present invention comprises the steps of: i) centrifugation by mixing a plant sample, aqueous methanol solution and chloroform;
ⅱ) 상기 단계 i)의 원심분리된 수용액 층 또는 유기용매 층에서 각각 분취하는 단계;ii) separating each from the centrifuged aqueous solution layer or the organic solvent layer of step i);
ⅲ) 상기 단계 ⅱ)에서 분취 후 남은 수용액 층 및 유기용매 층에 메탄올 수용액 및 클로로포름을 혼합하여 원심분리하는 단계; 및iii) centrifuging by mixing an aqueous solution of methanol and chloroform in the aqueous solution layer and the organic solvent layer remaining after fractionation in step ii); and
ⅳ) 상기 단계 ⅲ)에서 원심분리된 수용액 층 또는 유기용매 층에서 각각 수용성 대사체 또는 불용성 대사체를 수득하는 단계;iv) obtaining a water-soluble metabolite or an insoluble metabolite from the aqueous solution layer or the organic solvent layer centrifuged in step iii);
를 포함하는 핵자기공명분광법 시료용 전처리 방법을 제공할 수 있다.It is possible to provide a pretreatment method for a nuclear magnetic resonance spectroscopy sample comprising a.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 단계 i)의 식물 시료는 식물의 꽃, 잎, 가지, 기둥 및 뿌리로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있다. 바람직하게는 상기 식물 시료는 식물의 잎 일 수 있다. According to a preferred embodiment of the present invention, the plant sample of step i) may be any one or more selected from the group consisting of flowers, leaves, branches, columns and roots of plants. Preferably, the plant sample may be a leaf of a plant.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 단계 i)의 식물 시료는 According to a preferred embodiment of the present invention, the plant sample of step i) is
i) 증류수에 세척한 식물 시료를 30 내지 45℃의 건조기에서 10 내지 15시간 동안 건조 후 -10 내지 -30℃ 냉동고에 보관하는 단계; i) drying the plant sample washed in distilled water for 10 to 15 hours in a dryer at 30 to 45° C. and storing it in a freezer at -10 to -30° C.;
ⅱ) 상기 단계 i)의 시료를 동결분쇄기로 미세하게 분쇄하는 단계; 및ii) finely pulverizing the sample of step i) with a freeze crusher; and
ⅲ) 상기 단계 ⅱ)의 분쇄된 시료를 동결건조하는 단계;iii) freeze-drying the pulverized sample of step ii);
로 제조되는 것일 수 있다. It may be manufactured with
바람직하게는 상기 단계 i)에서 식물 시료는 35 내지 40℃의 건조기에서 11 내지 13시간 동안 건조 후 -15 내지 -25℃ 냉동고에 보관하는 것이 바람직하다. Preferably, in step i), the plant sample is dried in a dryer at 35 to 40° C. for 11 to 13 hours and then stored in a freezer at -15 to -25° C.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 대사체를 수득하는 단계를 포함하는 전처리 방법은 According to a preferred embodiment of the present invention, the pretreatment method comprising the step of obtaining the metabolite is
v) 상기 단계 ⅳ)에서 수득한 수용성 대사체를 동결건조하여 가루형태의 시료로 제조하는 단계;v) preparing a sample in powder form by lyophilizing the water-soluble metabolite obtained in step iv);
vi) 상기 단계 v)의 가루형태의 시료 및 H2O 를 혼합하여 vortexing 후 원심분리하여 상층액을 분취 및 동결건조하는 단계; vi) mixing the powdered sample of step v) and H 2 O, vortexing, and centrifuging to fractionate and freeze-dry the supernatant;
ⅶ) 상기 단계 ⅵ)의 동결건조된 상층액을 D2O와 혼합하여 원심분리한 후 상층액을 분취하는 단계; vii) mixing the lyophilized supernatant of step vi) with D 2 O and centrifuging the mixture, followed by aliquoting the supernatant;
를 추가적으로 포함하는 것일 수 있다. It may be to include additionally.
상기 v) 내지 ⅶ)의 단계를 추가적으로 포함하는 전처리 방법은, 고분해능-MAS 핵자기공명분광법(HR-MAS NMR), 액체핵자기공명분광법(Solution state NMR) 및 고체핵자기공명분광법(Solid state NMR) 로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 핵자기공명분광법 시료용 전처리 방법일 수 있으나, 바람직하게는 액체핵자기공명분광법(Solution state NMR) 시료용 전처리 방법일 수 있다. The pretreatment method additionally comprising the steps of v) to vii) is high-resolution-MAS nuclear magnetic resonance spectroscopy (HR-MAS NMR), liquid nuclear magnetic resonance spectroscopy (Solution state NMR), and solid state NMR spectroscopy (Solid state NMR). ) may be any one or more pretreatment methods for nuclear magnetic resonance spectroscopy samples selected from the group consisting of, but preferably may be pretreatment methods for liquid nuclear magnetic resonance spectroscopy (Solution state NMR) samples.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 대사체를 수득하는 단계를 포함하는 전처리 방법은 According to a preferred embodiment of the present invention, the pretreatment method comprising the step of obtaining the metabolite is
v) 상기 단계 ⅳ)에서 수득한 불용성 대사체를 회전증발농축기를 이용하여 용매를 제거하는 단계; 및v) removing the solvent from the insoluble metabolite obtained in step iv) using a rotary evaporator; and
vi) 상기 단계 v)의 용매가 제거된 불용성 대사체 및 CDCl3을 혼합하여 원심분리하여 상층액을 분취하는 단계; vi) mixing the insoluble metabolite from which the solvent of step v) has been removed and CDCl 3 and centrifuging the mixture to collect the supernatant;
를 추가적으로 포함하는 것일 수 있다. It may be to include additionally.
상기 v) 및 vi)의 단계를 추가적으로 포함하는 전처리 방법은, 고분해능-MAS 핵자기공명분광법(HR-MAS NMR), 액체핵자기공명분광법(Solution state NMR) 및 고체핵자기공명분광법(Solid state NMR) 로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 핵자기공명분광법 시료용 전처리 방법일 수 있으나, 바람직하게는 액체핵자기공명분광법(Solution state NMR) 시료용 전처리 방법일 수 있다. The pretreatment method additionally comprising the steps of v) and vi) is high-resolution-MAS nuclear magnetic resonance spectroscopy (HR-MAS NMR), liquid nuclear magnetic resonance spectroscopy (Solution state NMR), and solid state NMR spectroscopy (Solid state NMR). ) may be any one or more pretreatment methods for nuclear magnetic resonance spectroscopy samples selected from the group consisting of, but preferably may be pretreatment methods for liquid nuclear magnetic resonance spectroscopy (Solution state NMR) samples.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 제한되는 것으로 해석하지 않는 것은 해당 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명한 것이다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail through examples. These examples are only for illustrating the present invention, and it is obvious to those of ordinary skill in the art that the scope of the present invention is not to be interpreted as being limited by these examples.
식물시료 준비Plant sample preparation
<1-1> 식물 잎 처리<1-1> Plant leaf treatment
식물 피해를 단시간에 즉각적으로 관찰하기 위해서 화학물질안전원에서 발간한 '사고대비물질 노출에 따른 식물피해 정보집'을 참고하여 5% 염산, 5% 암모니아수를 이용하였다. 실험의 편의성을 위해 약 20 cm 정도 자라난 도토리나무의 잎을 선정하였다. 5% 염산 또는 5% 암모니아수를 각각 150 mm 페트리 접시에 20 ㎖를 붓는다. 도토리나무 잎의 앞면 또는 뒷면에 각각의 용액을 충분히 적시고 이후 3시간마다 잎을 충분히 적셨다. 9시간이 지났을 때에 정상적인 도토리나무 잎과 비교하였을 때 육안으로도 변화 양상을 확인할 수 있었기 때문에 총 9시간 동안 변화과정을 지켜보았다. In order to immediately observe plant damage in a short time, 5% hydrochloric acid and 5% ammonia water were used with reference to the 'Information on Plant Damage from Exposure to Accident Preparedness Substances' published by the Institute of Chemical Safety. For the convenience of the experiment, the leaves of the acorn tree, which grew to about 20 cm, were selected. Pour 20 ml of 5% hydrochloric acid or 5% aqueous ammonia into 150 mm Petri dishes, respectively. Each solution was sufficiently wetted on the front or back side of the acorn leaf, and the leaf was sufficiently wetted every 3 hours thereafter. After 9 hours, the change process was observed for a total of 9 hours because the change pattern could be confirmed with the naked eye when compared with the normal acorn leaf.
<1-2> 식물 잎에 대한 처리<1-2> Treatment for plant leaves
상기 실시예 <1-1>의 5% 염산에 노출된 도토리나무 잎(HCl), 5% 암모니아수에 노출된 도토리나무 잎(NH3), 정상적인 도토리나무의 잎(Control)을 각각 채취하여 3차 증류수에 세척하였다. 세척한 잎을 37℃의 건조기(Dry oven)에서 12시간 동안 건조 후 -20℃ 냉동고에 보관하였다. 말린 잎을 1분 동안 얼리고(Precool) 1분 30초 동안 분쇄 시간을 설정하고 12 CPS(Cycles per second)로 1회 반복하여 동결분쇄기(Freezer mill)를 이용하여 미세하게 가루로 분쇄하였다. 상온과의 온도 차이로 인해 시료가 수분을 머금을 수 있으므로 잘게 가루로 파쇄된 도토리나무 잎 시료를 12시간 이상 동결건조하였다. In Example <1-1>, acorn leaves exposed to 5% hydrochloric acid (HCl), acorn leaves exposed to 5% ammonia water (NH 3 ), and normal acorn leaves (Control) were collected and third It was washed with distilled water. The washed leaves were dried in a dry oven at 37°C for 12 hours and stored in a -20°C freezer. The dried leaves were frozen for 1 minute (Precool), the grinding time was set for 1 minute and 30 seconds, and repeated once at 12 CPS (Cycles per second), and then finely pulverized into a powder using a freeze grinder (Freezer mill). Since the sample may retain moisture due to the temperature difference from room temperature, the acorn leaf sample crushed into powder was freeze-dried for more than 12 hours.
<1-3> 식물 잎의 대사체 시료 준비<1-3> Preparation of metabolite samples from plant leaves
상기 실시예 <1-2>에서 준비한 동결분쇄기로 분쇄한 가루 형태의 도토리나무 잎 시료 100 mg을 6 ㎖의 50% 메탄올 수용액과 6 ㎖ 클로로포름을 시료가 들어 있는 원심분리 용기에 옮겼다. Vortex 15초, Sonication 2분 후 4℃, 1,100×g에서 15분간 원심분리하였다. 분리된 수용액 층과 유기용매 층에서 각각 4 ㎖씩 수용성 대사체와 불용성 대사체를 분취하였다. 분취 후 남은 수용액 층과 유기용매 층에 6 ㎖의 50% 메탄올 수용액과 6 ㎖ 클로로포름을 시료가 들어 있는 원심분리 용기에 옮겨 추출 과정을 한번 더 진행하여 각각 4 ㎖의 수용성 대사체와 불용성 대사체를 수득하였다. 먼저 수득한 4㎖와 이후 수득한 4㎖를 합하여 수용성 대사체와 불용성 대사체는 각각 8㎖로 이하 핵자기공명분광법 분석에 사용하였다. 100 mg of the acorn leaf sample in the form of a powder pulverized by a freeze grinder prepared in Example <1-2> was transferred to a centrifuge container containing 6 ml of 50% aqueous methanol solution and 6 ml of chloroform. After
액체핵자기공명분광법(Solution state NMR)Liquid nuclear magnetic resonance spectroscopy (Solution state NMR)
<2-1> 수용성 대사체 시료의 분석 <2-1> Analysis of water-soluble metabolite samples
상기 실시예 <1-3>에서 수득한 수용성 대사체를 동결건조하여 수용성 대사체를 가루 형태로 얻었다. 이와 4 ㎖ H2O를 넣고 15초간 Vortexing 하고, 14,500 rpm에서 3분간 원심분리하였다. 상층액을 분취하여 동결건조한 후, 다시 500 ㎕의 D2O에 녹여 15초간 Vortexing 후 14,500 rpm에서 3분간 원심분리하였다. 상층액을 분취하여 5 mm NMR 튜브에 옮겨 Solution-State NMR 실험을 진행하였다. The water-soluble metabolite obtained in Example <1-3> was freeze-dried to obtain a water-soluble metabolite in the form of a powder. 4 ㎖ H 2 O was added thereto, vortexed for 15 seconds, and centrifuged at 14,500 rpm for 3 minutes. After aliquoting the supernatant and freeze-drying, it was again dissolved in 500 μl of D 2 O, vortexed for 15 seconds, and centrifuged at 14,500 rpm for 3 minutes. The supernatant was aliquoted and transferred to a 5 mm NMR tube for a solution-state NMR experiment.
그 결과, [도 2]에서 나타나는 바와 같이 대조군 시료에 비하여 HCl에 노출되면 aromatic region의 변화가 뚜렷하게 증가하며 아미노산의 구조 변화가 생기는 것을 확인할 수 있었다. 그리고 NH3에 노출되면 아미노산의 구조 변화가 뚜렷하게 생기는 것을 확인할 수 있다. 붉은색 스펙트럼은 도토리나무 잎에 5% NH3를 처리한 후 수용성 대사체 추출법을 통해 얻어진 대사체의 1H 측정 결과이다. 파란색 스펙트럼은 도토리나무 잎에 5% HCl를 처리한 후 수용성 대사체 추출법을 통해 얻어진 대사체의 1H 측정 결과이다. As a result, as shown in [Fig. 2], when exposed to HCl compared to the control sample, the change in the aromatic region was significantly increased, and it was confirmed that the structural change of amino acids occurred. And when exposed to NH 3 It can be confirmed that the structural change of the amino acid occurs distinctly. The red spectrum is the result of 1 H measurement of the metabolite obtained through the water-soluble metabolite extraction method after treating the acorn leaf with 5% NH 3 . The blue spectrum is the result of 1 H measurement of metabolites obtained through water-soluble metabolite extraction after 5% HCl treatment on acorn leaves.
또한, [도 3]에서 나타나는 바와 같이 Carbon 100~120 ppm 범위 및 Proton 6~7.5 ppm 범위 내에서 5% HCl로 인한 peak이 두드러지게 나타나고, Carbon 20~50 ppm 범위 및 Proton 1~3 ppm 범위 내에서 5% Ammonia로 인한 peak이 두드러지게 나타나는 것을 확인할 수 있었다. 붉은색 Cross peak은 도토리나무 잎에 5% NH3를 처리한 후 수용성 대사체 추출법을 통해 얻어진 대사체의 1H-13C 2D 측정 결과이다. 파란색 Cross peak은 도토리나무 잎에 5% HCl를 처리 한 후 수용성 대사체 추출법을 통해 얻어진 대사체의 1H-13C 2D 측정 결과이다. 검은색 cross peak은 도토리나무 잎에 어떤 화학물질도 처리하지 않은 상태에서 대사체 추출법을 통해 얻어진 대사체의 1H-13C 2D 측정 결과이다. In addition, as shown in [Fig. 3], the peak due to 5% HCl is prominent in the
<2-2> 불용성 대사체 시료의 분석 <2-2> Analysis of insoluble metabolite samples
상기 실시예 <1-3>에서 수득한 불용성 대사체를 회전증발농축기를 이용하여 용매를 제거하였다. 남아있는 불용성 대사체 추출물을 500 ㎕의 CDCl3에 녹인다. 15초간 Vortexing 후 14,500 rpm에서 3분간 원심분리하였다. 상층액을 분취하여 5 mm NMR 튜브에 옮겨 Solution-state NMR 실험을 진행하였다.The solvent was removed from the insoluble metabolite obtained in Example <1-3> using a rotary evaporator. The remaining insoluble metabolite extract is dissolved in 500 μl of CDCl 3 . After vortexing for 15 seconds, centrifugation was performed at 14,500 rpm for 3 minutes. The supernatant was aliquoted and transferred to a 5 mm NMR tube for a solution-state NMR experiment.
그 결과, [도 4]에서 나타나는 바와 같이, 붉은색 스펙트럼은 도토리나무 잎에 5% NH3를 처리 한 후 불용성 대사체 추출법을 통해 얻어진 대사체의 1H 측정 결과이다. 파란색 스펙트럼은 도토리나무 잎에 5% HCl를 처리 한 후 불용성 대사체 추출법을 통해 얻어진 대사체의 1H 측정 결과이다. 검은색 스펙트럼은 도토리나무 잎에 어떤 화학물질도 처리하지 않은 상태에서 대사체 추출법을 통해 얻어진 대사체의 1H 측정 결과이다. 세 스펙트럼 사이에 두드러지게 큰 변화는 보이지 않으나 Unsaturated fatty acid region 및 Polyunsaturated fatty acid region에서 intensity의 차이가 나타남을 알 수 있다. As a result, a red color, as shown in Fig. 4 is a spectrum measurement result of 1 H metabolite obtained from the insoluble metabolites after extraction handle 5% NH3 in acorn leaves. The blue spectrum is the result of 1 H measurement of metabolites obtained through insoluble metabolite extraction method after treating acorn leaves with 5% HCl. The black spectrum is the result of 1 H measurement of metabolites obtained through metabolite extraction in acorn leaves without any chemical treatment. There is no significant change between the three spectra, but it can be seen that there is a difference in intensity in the unsaturated fatty acid region and the polyunsaturated fatty acid region.
또한, [도 5]에서 나타나는 바와 같이, 스펙트럼을 비교하였 때 두드러지게 큰 변화는 보이지 않으나 Unsaturated fatty acid 영역에서 5% HCl과 5% NH3에 노출된 시료에서 더 많은 cross peak가 나타난 것을 알 수 있다. 붉은색 cross peak은 도토리나무 잎에 5% NH3를 처리한 후 불용성 대사체 추출법을 통해 얻어진 대사체의 1H-13C 2D 측정 결과이다. 파란색 cross peak은 도토리나무 잎에 5% HCl를 처리한 후 불용성 대사체 추출법을 통해 얻어진 대사체의 1H-13C 2D 측정 결과이다. 검은색 cross peak은 도토리나무 잎에 어떤 화학물질도 처리하지 않은 상태에서 대사체 추출법을 통해 얻어진 대사체의 1H-13C 2D 측정 결과이다. In addition, as shown in [Fig. 5], when the spectra were compared, no significant change was observed, but more cross peaks appeared in the samples exposed to 5% HCl and 5% NH 3 in the unsaturated fatty acid region. have. The red cross peak is the result of 1 H- 13 C 2D measurement of metabolites obtained through the extraction of insoluble metabolites after 5% NH 3 treatment on acorn leaves. The blue cross peak is the result of 1 H- 13 C 2D measurement of the metabolite obtained through the extraction of insoluble metabolites after 5% HCl treatment on acorn leaves. The black cross peak is the result of 1 H- 13 C 2D measurement of metabolites obtained through metabolite extraction in acorn leaves without any chemical treatment.
고분해능-MAS 핵자기공명분광법(HR-MAS NMR)High Resolution-MAS Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (HR-MAS NMR)
상기 실시예 <1-2>의 동결건조한 식물 잎 시료를 일회용 HR-MAS rotor에 넣은 후 40 ㎕의 CDCl3를 추가하여 실험 진행하였다. After putting the freeze-dried plant leaf sample of Example <1-2> into a disposable HR-MAS rotor, 40 μl of CDCl 3 was added to proceed with the experiment.
그 결과, [도 6]에서 나타나는 바와 같이 도토리나무 잎의 불용성 대사체의 1H HR-MAS 실험 결과는 불용성 대사체의 1H Solution-State NMR 결과와 비슷하나 분해능이 좋지 않음을 알 수 있었다.As a result, as shown in [Fig. 6], the 1 H HR-MAS test result of the insoluble metabolite of the acorn leaf was similar to the 1 H Solution-State NMR result of the insoluble metabolite, but it was found that the resolution was not good.
고체핵자기공명분광법(Solid state NMR)Solid state NMR
상기 실시예 <1-2>의 동결건조한 식물 잎 시료를 일회용 Solid-State NMR rotor에 넣은 후 실험 진행하였다. The freeze-dried plant leaf sample of Example <1-2> was put into a disposable solid-state NMR rotor, and then the experiment was performed.
그 결과, [도 7] 에서 나타나는 바와 같이 5% HCl을 처리한 경우 control 시료에서 확인되는 도토리 나뭇잎의 대사체 중 벤젠 고리 영역 등 상당히 많은 화학적 구조 변형으로 인해 스펙트럼의 패턴이 변화한 것을 확인할 수 있다. 검은색 스펙트럼은 화학적 처리를 하지 않은 도토리나무 잎의 1H 측정 결과이다. 그리고 붉은색 스펙트럼은 5% HCl을 처리한 도토리나무 잎의 1H 측정 결과이다. As a result, as shown in [Fig. 7], when 5% HCl is treated, it can be confirmed that the pattern of the spectrum is changed due to a considerable number of chemical structural modifications such as the benzene ring region among metabolites of acorn leaves found in the control sample. . The black spectrum is the result of 1 H measurement of an acorn leaf without chemical treatment. And the red spectrum is the result of 1 H measurement of an acorn leaf treated with 5% HCl.
또한, [도 8]에서 나타나는 바와 같이 5% HCl을 처리한 경우, control시료에서 확인되는 도토리나무 잎의 대사체중 quaternary carbon등 상당히 많은 화학적 구조 변형으로 인해 정상적인 대사체들의 구조와 양이 변형될 것을 확인할 수 있다. 검은색 스펙트럼은 화학적 처리를 하지 않은 도토리나무 잎의 13C 측정 결과이다. 그리고 붉은색 스펙트럼은 5% HCl을 처리한 도토리나무 잎의 13C의 측정 결과이다.In addition, as shown in [Fig. 8], when 5% HCl was treated, the structure and amount of normal metabolites would be modified due to significant chemical structural modifications such as quaternary carbon, the metabolite of acorn leaf found in the control sample. can be checked The black spectrum is the 13 C measurement result of an acorn leaf without chemical treatment. And the red spectrum is the measurement result of 13 C of an acorn leaf treated with 5% HCl.
Claims (10)
ⅱ) 상기 단계 i)의 시료를 동결분쇄기로 미세하게 분쇄하는 단계; 및
ⅲ) 상기 단계 ⅱ)의 분쇄된 시료를 동결건조하는 단계;
를 포함하되, 상기 식물 시료는 식물의 꽃, 잎, 가지, 기둥 및 뿌리로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 핵자기공명분광법 시료용 전처리 방법.
i) drying the plant sample washed in distilled water for 10 to 15 hours in a dryer at 30 to 45° C. and storing it in a freezer at -10 to -30° C.;
ii) finely pulverizing the sample of step i) with a freeze crusher; and
iii) freeze-drying the pulverized sample of step ii);
Including, wherein the plant sample is a nuclear magnetic resonance spectroscopy sample pretreatment method, characterized in that any one or more selected from the group consisting of flowers, leaves, branches, columns and roots of plants.
ⅳ) 상기 단계 ⅲ)의 동결건조된 시료 및 CDCl3 을 혼합하는 단계;
를 추가적으로 포함하는 핵자기공명분광법 시료용 전처리 방법.
According to claim 1, wherein the pretreatment method
iv) mixing the freeze-dried sample of step iii) and CDCl 3 ;
A pretreatment method for nuclear magnetic resonance spectroscopy samples additionally comprising a.
According to claim 1 or 2, wherein the nuclear magnetic resonance spectroscopy is high-resolution-MAS nuclear magnetic resonance spectroscopy (HR-MAS NMR), liquid nuclear magnetic resonance spectroscopy (Solution state NMR) and solid state nuclear magnetic resonance spectroscopy (Solid state NMR) ) nuclear magnetic resonance spectroscopy sample pretreatment method, characterized in that any one or more selected from the group consisting of.
ⅱ) 상기 단계 i)의 원심분리된 수용액 층 또는 유기용매 층에서 각각 분취하는 단계;
ⅲ) 상기 단계 ⅱ)에서 분취 후 남은 수용액 층 및 유기용매 층에 메탄올 수용액 및 클로로포름을 혼합하여 원심분리하는 단계; 및
ⅳ) 상기 단계 ⅲ)에서 원심분리된 수용액 층 또는 유기용매 층에서 각각 수용성 대사체 또는 불용성 대사체를 수득하는 단계;
를 포함하되, 상기 식물 시료는 식물의 꽃, 잎, 가지, 기둥 및 뿌리로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 핵자기공명분광법 시료용 전처리 방법.
i) centrifuging a mixture of plant sample, aqueous methanol solution and chloroform;
ii) separating each from the centrifuged aqueous solution layer or the organic solvent layer of step i);
iii) centrifuging by mixing an aqueous solution of methanol and chloroform in the aqueous solution layer and the organic solvent layer remaining after fractionation in step ii); and
iv) obtaining a water-soluble metabolite or an insoluble metabolite from the aqueous solution layer or the organic solvent layer centrifuged in step iii);
Including, wherein the plant sample is a nuclear magnetic resonance spectroscopy sample pretreatment method, characterized in that any one or more selected from the group consisting of flowers, leaves, branches, columns and roots of plants.
i) 증류수에 세척한 식물 시료를 30 내지 45℃의 건조기에서 10 내지 15시간 동안 건조 후 -10 내지 -30℃ 냉동고에 보관하는 단계;
ⅱ) 상기 단계 i)의 시료를 동결분쇄기로 미세하게 분쇄하는 단계; 및
ⅲ) 상기 단계 ⅱ)의 분쇄된 시료를 동결건조하는 단계;
로 제조되는 것을 특징으로 하는 핵자기공명분광법 시료용 전처리 방법.
The method of claim 5, wherein the plant sample of step i) is
i) drying the plant sample washed in distilled water for 10 to 15 hours in a dryer at 30 to 45° C. and storing it in a freezer at -10 to -30° C.;
ii) finely pulverizing the sample of step i) with a freeze crusher; and
iii) freeze-drying the pulverized sample of step ii);
Nuclear magnetic resonance spectroscopy sample pretreatment method, characterized in that prepared as.
v) 상기 단계 ⅳ)에서 수득한 수용성 대사체를 동결건조하여 가루형태의 시료로 제조하는 단계;
vi) 상기 단계 v)의 가루형태의 시료 및 H2O 를 혼합하여 vortexing 후 원심분리하여 상층액을 분취 및 동결건조하는 단계;
ⅶ) 상기 단계 ⅵ)의 동결건조된 상층액을 D2O와 혼합하여 원심분리한 후 상층액을 분취하는 단계;
를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 핵자기공명분광법 시료용 전처리 방법.
The method of claim 5, wherein the pretreatment method
v) preparing a sample in powder form by lyophilizing the water-soluble metabolite obtained in step iv);
vi) mixing the powdered sample of step v) and H 2 O, vortexing, and centrifuging to fractionate and freeze-dry the supernatant;
vii) mixing the lyophilized supernatant of step vi) with D 2 O and centrifuging the mixture, followed by aliquoting the supernatant;
Nuclear magnetic resonance spectroscopy sample pretreatment method comprising additionally.
v) 상기 단계 ⅳ)에서 수득한 불용성 대사체를 회전증발농축기를 이용하여 용매를 제거하는 단계; 및
vi) 상기 단계 v)의 용매가 제거된 불용성 대사체 및 CDCl3을 혼합하여 원심분리하여 상층액을 분취하는 단계;
를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 핵자기공명분광법 시료용 전처리 방법.
The method of claim 5, wherein the pretreatment method
v) removing the solvent from the insoluble metabolite obtained in step iv) using a rotary evaporator; and
vi) mixing the insoluble metabolite from which the solvent of step v) has been removed and CDCl 3 and centrifuging the mixture to collect the supernatant;
Nuclear magnetic resonance spectroscopy sample pretreatment method comprising additionally.
10. The method of claim 8 or 9, wherein the nuclear magnetic resonance spectroscopy is high-resolution-MAS nuclear magnetic resonance spectroscopy (HR-MAS NMR), liquid nuclear magnetic resonance spectroscopy (Solution state NMR) and solid state nuclear magnetic resonance spectroscopy (Solid state NMR) ) nuclear magnetic resonance spectroscopy sample pretreatment method, characterized in that any one or more selected from the group consisting of.
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Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101532870B1 (en) | 2014-04-07 | 2015-06-30 | 한양대학교 에리카산학협력단 | Method of determining the origin of marine species using stable isotope |
| WO2017043087A1 (en) | 2015-09-11 | 2017-03-16 | 学校法人慶應義塾 | Method for extracting substance from feces sample |
| KR101850208B1 (en) | 2016-08-11 | 2018-05-31 | 한국화학연구원 | Analytical standard reference consisting of multi-residue pesticides for cabbage with high stability and homogeneity and preparation method thereof |
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Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101077178B1 (en) * | 2009-04-24 | 2011-10-27 | 주식회사 비아이지 | Composition for controlling sycamore lace bug comprising Sophora flavescens extract and used thereof |
| KR20130087928A (en) * | 2012-01-30 | 2013-08-07 | 부경대학교 산학협력단 | COMPOSITION COMPRISING AND HEALTHY FOOD LUTEOLIN 5-O-β-D-GLUCOPYRANOSIDE OR THE EXTRACT OF CIRSIUM MAACKII FOR PREVENTING OR TREATING INFLAMMATORY DISEASE |
| KR101661554B1 (en) * | 2014-12-24 | 2016-10-04 | 참바다영어조합법인 | Analysis Method Of Functional Material Included In Stachys And Method Of Manufacturing Food Using Stachys |
-
2020
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Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101532870B1 (en) | 2014-04-07 | 2015-06-30 | 한양대학교 에리카산학협력단 | Method of determining the origin of marine species using stable isotope |
| WO2017043087A1 (en) | 2015-09-11 | 2017-03-16 | 学校法人慶應義塾 | Method for extracting substance from feces sample |
| KR101850208B1 (en) | 2016-08-11 | 2018-05-31 | 한국화학연구원 | Analytical standard reference consisting of multi-residue pesticides for cabbage with high stability and homogeneity and preparation method thereof |
| KR102046488B1 (en) | 2019-07-02 | 2019-11-19 | 건국대학교 글로컬산학협력단 | Method for analyzing ingredients of human milk in human milk bank |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| M. Maia 등. Metabolite extraction for high-throughput FTICR-MS-based metabolomics of grapevine leaves, EuPA Open Proteomics, Vol. 12, 2016.09., pp 4-9* |
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