KR102349267B1 - 미리스톨레익산을 유효성분으로 함유하는 항균 및 생물막 형성 억제용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 미리스톨레익산을 유효성분으로 함유하는 항균 및 생물막 형성 억제용 조성물에 관한 것으로, 상기 미리스톨레익산은 피부염증과 트러블을 유발시키는 여드름균 및 황색포도상구균의 항균 효과를 나타내며, 매우 낮은 농도로 여드름균과 황색포도상구균의 생물막을 효과적으로 억제하는 것을 확인함에 따라, 상기 미리스톨레익산을 유효성분으로 함유하는 조성물은 항균제, 항생물막 조성물로 제공될 수 있으며, 피부염증 질환 개선용 화장료 조성물로 제공될 수 있다.

Description

미리스톨레익산을 유효성분으로 함유하는 항균 및 생물막 형성 억제용 조성물{Composition for antimicrobial and biofilm inhibition comprising myristoleic acid}

본 발명은 미리스톨레익산을 유효성분으로 함유하는 항균 및 생물막 형성 억제용 조성물에 관한 것이다.

세균이 감염된 부분에는, 폴리머(polymer) 기질로 감싸인 세균의 집락인 점액질이 존재할 때가 있다. 이 세균에 의해 형성된 점액질의 세균 복합체를 바이오필름 (biofilm), 균막 또는 생물막이라고 부른다. 바이오필름은 고형 (solid)의 생물학적 표면 (biological surface)인 세균 집락을 비생물학적 표면 (non-biological surface)이며, 다당류와 폴리펩타이드로 이루어진 폴리머 기질인 외막이 둘러싼 복합체이며, 바이오필름 내부에서 세균은 서로 의사소통을 하고, 외부세계에 대하여 방어를 한다. 이를 통하여 바이오필름은 항생제를 포함한 여러 환경 스트레스 (environmental stress) 아래에서도 세균의 생존을 가능하게 만든다.

이런 바이오필름은 일반 자연환경 외에 세균감염성 질환과 관련하여서도 자주 발견된다. 사람의 장기에 형성되기도 하고 치아의 플라크 형태로 나타나기도 하며, 산업용 장비나 의료용 이식 기구에 생길 수도 있다. 이런 탓에 바이오필름은 치주 질환 (periodontal disease)이나 낭포성 섬유증 (cystic fibrosis)에 동반하는 폐렴, 중이 (middle ear)에 생기는 이통 (earache) 등을 연구하는 학자들의 관심 대상이 되어 왔다. 미국 국립보건연구소는 2002년 보고에서 박테리아 군의 최대 80%가 이 같은 바이오필름 형성을 통해 병원균을 퍼트리고 있는 것으로 추산했다.

별개로 부유하던 세균(planktonic bacteria)에 대해 약효를 나타내던 항생제도 세균이 바이오필름을 형성하면 효능을 상실하는 경향이 커진다. 세균이 바이오필름을 형성하면 바이오필름에 존재하는 외막을 항체 등이 투과할 수 없어 숙주의 면역체계(host immune system)를 무력화시키고, 항생제에 대한 세균의 저항성이 약 1,000배까지 높아질 수 있다. 이런 바이오필름 형성에 의한 항생제에 대한 저항성의 증가 원인은 아직 정확하게 밝혀져있지는 않으나 다음의 3가지 정도로 설명된다. 첫 번째는 “미생물의 생태적 변화”이다. 바이오필름이 형성된 상태에서는 세균 사이의 결착력이 강화되어 결과적으로 세균집락이 잘 퍼지지 않게 되며 따라서 세균 증식도 저하되게 된다. 이렇게 되면 주위 환경과의 교환 작용에 대한 의존성이 약화되고, 대사 작용이 느려지며, 결과적으로 항생물질에 대한 감수성이 낮아지게 된다.

두 번째는 “점액성 다당류로 구성된 외막”의 물리적 특성이다. 외막을 형성하는 점액성 다당류들은 전기적 성질을 가지고 있어 항생 물질과 결합하려는 경향을 갖고 있으며 이렇게 항생 물질과 결합함으로써 항생 물질이 퍼지는 것을 방해한다. 즉 항생 물질이 개개의 세균까지 잘 전달되지 않게 되어 그 효능을 발휘하기 어렵게 된다.

세 번째는 일반적 항생제 내성 획득 기작과 관련 있는 추정으로 “억제 인자의 생산”이다. 항생 물질의 효능을 억제하는 억제 인자로 가장 많이 알려진 물질로는 슈도모나스균(pseudomonas)에 의하여 생산되는 베타-락타메이스(β-lactamases)를 들 수 있다. 바이오필름이 형성되면 그 바이오필름 속에 존재하는 내성이 없던 세균들도 주위의 내성 세균으로부터 수평 유전자 전이(horizontal gene transfer)를 통하여 내성 인자 관련 유전자를 획득하여 내성 세균화되는 경향이 있다. 즉, 감염부위에 바이오필름이 형성되게 되면 이는 항생제 내성 상태가 되었다고 볼 수 있다.

이러한 이유들로 인하여 바이오필름이 형성되면 감염증 치료에 널리 사용되던 항생제의 작용이 어렵게 되어 결과적으로 항생제에 의한 치료 효과가 약화되며, 만성적인 세균 감염 상태에 돌입하게 된다. 이 경우 상기에 기술했듯이 세균들의 항생제에 대한 감수성이 낮아져 항생제를 사용해도 거의 효과가 없으며 이를 극복하기 위해 단순하게 항생제를 과다처방하면 세균의 항생제 내성만을 키우게 된다. 즉, 바이오필름이 형성된 세균 감염증은 단순히 항생제로만 치료하는 것은 더이상 효과적 치료가 되지 못함을 의미한다. 특히 바이오필름을 형성하고 있는 세균에 의한 감염은 여러 가지 항생제에 대해 내성을 갖는 다제내성(multi-drug resistance) 균에 의한 경우가 많아 더욱 문제가 심각해진다.

따라서 상기 문제를 해결하기 위하여, 바이오필름 또는 바이오필름에 존재하는 외막을 파괴할 수 있는 치료제의 개발이 필요한 실정이다.

대한민국 공개특허 제10-2012-0051974호 (2013.11.26. 공개)

본 발명은 피부염 질환 및 피부트러블의 원인이 되는 여드름균 및 황색포도상구균의 생물막을 억제하고, 균의 사멸 효과를 증가시키기 위해 미리스톨레익산을 항균 및 생물막 형성 억제용 조성물로 제공하고자 한다.

본 발명은 미리스톨레익산을 유효성분으로 함유하는 생물막 형성 억제용 조성물을 제공한다.

본 발명은 미리스톨레익산을 유효성분으로 함유하는 항균용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 미리스톨레익산을 유효성분으로 함유하는 피부염 질환 또는 피부 트러블 예방 또는 개선용 화장료조성물을 제공한다.

본 발명에 따르면, 미리스톨레익산은 피부염증과 트러블을 유발시키는 여드름균 및 황색포도상구균의 항균 효과를 나타내며, 매우 낮은 농도로 여드름균과 황색포도상구균의 생물막을 효과적으로 억제하는 것을 확인함에 따라, 상기 미리스톨레익산을 유효성분으로 함유하는 조성물은 항균제, 항생물막 조성물로 제공될 수 있으며, 피부염증 질환 개선용 화장료 조성물로 제공될 수 있다.

도 1은 C. 아크네스의 생물막 형성 및 세포 성장에 대한 다양한 지방산의 영향을 확인한 결과로, 도 1A는 96-웰 플레이트에서 두 종류의 C. 아크네스 균주를 96시간 동안 RCM 배지에서 배양한 후 상기 균주에 대한 지방산의 항생물막 활성을 확인한 결과로, 모든 지방산을 20 μg/ml 농도로 처리하였으며 (*, P<0.05 대 비처리 대조군), 도 1B는 C. 아크네스 ATCC 6919에 대한 각 지방산의 MIC를 나타낸 결과이다.
도 2는 C. 아크네스에 대한 미리스톨레익산의 항필름막 및 항미생물 활성을 확인한 결과로, 도 2A는 미리스톨레익산 존재하에서 96시간 배양 후 C. 아크네스 ATCC 6919의 생물막 형성을 정량한 결과이며, 도 2B는 라우르산 (lauric acid) 존재하에서 96시간 배양 후 C. 아크네스 ATCC 6919의 생물막 형성을 정량한 결과로, 오차막대는 표준편차를 나타내고 (*, P<0.05 대 비처리 대조군), 도 2C는 미리스톨레익산 처리된 C. 아크네스 ATCC 6919의 플랑크톤 세포 성장을 확인한 결과이며, 도 2D는 미리스톨레익산과 라우르산에 의한 C. 아크네스 ATCC 6919의 신속한 사멸효과를 확인한 결과로, MOA 및 LA는 각각 미리스톨레익산 및 라우르산을 나타낸다.
도 3은 세포외중합체 물질 (exopolymeric substances, EPS)에 대한 미리스톨레익산의 영향을 확인한 결과로, 도 3A는 0 및 10 μg/ml 지방산을 처리하여 96시간 배양 후 EPS가 생성된 C. 아크네스 ATCC 6919를 정량한 결과이며, 도 3B는 미리스톨레익산 (10 μg/ml) 처리 또는 비처리된 C. 아크네스의 생물막을 SEM으로 확인한 결과이다.
도 4는 C. 아크네스의 소수성에 대한 지방산의 영향을 확인한 결과로, 도 4A는 0, 10, 및 20 μg/ml 지방산과 96시간 동안 배양한 후 C. 아크네스 ATCC 6919의 세포 표면 소수성을 확인한 결과이며, 도 4B는 C. 아크네스의 소수성에 대한 미리스톨레익산의 용량의존적 영향을 확인한 결과이다.
도 5는 S. aureus 균주 및 S. epidermidis 균주에 대한 미리스톨레익산의 항생물막 억제 활성을 확인한 결과로, 도 5A는 S. aureus ATCC 6538의 생물막 형성을 확인한 결과이며, 도 5B는 S. aureus ATCC 25923의 생물막 형성을 확인한 결과이며, 도 5C는 MRSA MW2의 생물막 형성을 확인한 결과이며, 도 5D는 MRSA ATCC 33591의 생물막 형성을 확인한 결과로, 96-웰 플레이트에서 미리스톨레익산 또는 라우르산 존재하에서 배양된 결과이며, 도 5E는 S. epidermidis ATCC 14990의 생물막 형성을 확인한 결과로, LB 배지에서 24시간 배양 후 정량한 결과이다. (*, P<0.05 대 비처리 대조군).
도 6은 C. 아크네스가 감염된 C. 엘레간스 및 이의 독성에 대한 미리스톨레익산의 영향을 확인한 결과로, 도 6A는 미리스톨레익산 존재 또는 비존재 하에서 C. acnes ATCC 6919와 함께 접종 후 선충류의 생존을 확인한 결과이며, 도 6B는 비감염된 C. 엘레간스에 5일간 미리스톨레익산을 처리하여 미리스톨레익산의 독성을 확인한 결과로, None은 처리되지 않은 세포를 나타낸다 (*, P<0.05 대 비처리 대조군).

이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

본 발명자들은 다양한 지방산을 이용한 항균 및 항생물막 조성물을 연구하던 중 다른 지방산과 다르게 미리스톨레익산이 매우 낮은 농도로 여드름균인 큐티박테리움 아크네스균과 황색포도상구균의 생물막 형성을 효과적으로 억제하는 것을 확인함에 따라, 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 미리스톨레익산을 유효성분으로 함유하는 생물막 형성 억제용 조성물을 제공할 수 있다.

상기 미리스톨레익산은 여드름균 (Cutibacterium acnes) 및 황색포도상구균 (Staphylococcus strains)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 균주의 생물막 형성을 억제하는 것일 수 있다.

상기 여드름균은 큐티박테리움 아크네스 (Cutibacterium acnes, C. acnes) 균주 KCCM 41747 (ATCC 6919) 및 큐티박테리움 아크네스 균주 KCCM 42791로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.

상기 황색포도상구균은 메치실린 감수성 황색포도상구균 균주 ATCC 25923, 메치실린 감수성 황색포도상구균 균주 ATCC 6538, 메치실린 저항성 황색포도상구균 균주 MW2, 메치실린 저항성 황색포도상구균 균주 ATCC 33591 및 표피포도상구균 (S. epidermidis) 균주로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.

본 발명은 미리스톨레익산을 유효성분으로 함유하는 항균용 조성물을 제공할 수 있다.

상기 미리스톨레익산은 여드름균 (Cutibacterium acnes) 및 황색포도상구균 (Staphylococcus strains)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 균주를 사멸시키는 것일 수 있다.

본 발명은 미리스톨레익산을 유효성분으로 함유하는 피부염 질환 또는 피부 트러블 예방 또는 개선용 화장료조성물을 제공할 수 있다.

상기 피부염 질환 또는 피부 트러블은 여드름균 (Cutibacterium acnes), 황색포도상구균 (Staphylococcus strains) 또는 이들의 생물막에 의해 발병하는 것일 수 있다.

상기 피부염 질환은 면포성 여드름, 구진성 여드름, 농포성 여드름, 결정성 여드름, 낭포성 여드름, 심상성 여드름, 전격성 여드름, 응괴성 여드름, 켈로이드성 여드름, 건선증, 아토피성 피부염, 지루성 피부염, 접촉성 피부염, 화폐성 피부염 및 일반 피부염으로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.

상기 화장료조성물은 유효성분인 미리스톨레익산 외에 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함할 수 있다.

상기 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 썬 크림, 유연 화장수, 수렴 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.

상기 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜,실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

상기 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

상기 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해 화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

상기 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

<실험예>

하기의 실험예들은 본 발명에 따른 각각의 실시예에 공통적으로 적용되는 실험예를 제공하기 위한 것이다.

1. 균주, 화합물 및 배양 조건

큐티박테리움 아크네스 (Cutibacterium acnes) 균주 KCCM 41747 (ATCC 6919) (isolated from human facial acne) 및 C. 아크네스 (C. acnes) 균주 KCCM 42791 (isolated from dental plaque)를 이용하였다. 상기 균주는 KCCM (Korean Culture Center for Microorganisms, Seoul, Korea)에서 얻었으며, 콜로니를 준비하기 위해 Reinforced Clostridium Media (RCM) 아가 플레이트에서 배양하였으며, 37℃, 혐기성 조건에서 액체 RCM을 이용하여 모든 추가 실험을 수행하였으며, BD GasPak™ EZ Gas Generating Anaerobic Pouch Systems (Fisher Scientific, Pittsburgh, USA)을 이용하여 유지시켰다.

전체 24 지방산은 부탄산 (butanoic acid), 펜탄산 (pentanoic acid), 헥사노익산 (hexanoic acid), 헵탄산 (heptanoic acid), 옥탄산 (octanoic acid), 노난산 (nonanoic acid), 데칸산 (decanoic acid), 운데카논산 (undecanoic acid), 라우르산 (lauric acid), 미리스트산 (myristic acid), 미리스톨레익산 (myristoleic acid), 팔미트산 (palmitic acid), 시스-9 헥사데센산 (cis-9 hexadecenoic acid), 헵타데칸산 (heptadecanoic acid), 스테아릭산 (stearic acid), 올레익산(oleic acid), 페트로셀린산 (petroselinic acid), 리놀레산 (linoleic acid), 리놀렌산 (linolenic acid), 결합된 리놀레산 (conjugated linoleic acid), 아라키돈산 (arachidonic acid), 에루신산 (erucic acid), 트리코산산 (tricosanoic acid) 및 네르본산 (nervonic acid)을 Sigma Aldrich (St. Louis, USA) 또는 TCI Co. (Tokyo, Japan)에서 구입하였다.

부티르산 (butyric acid)을 제외한 모든 지방산을 용해하기 위한 용매로 디메틸 설폭사이드 (DMSO)를 사용하였으며, DMSO (0.1% v/v)를 음성대조군으로 사용하였다. 0.1% 이하의 DMSO는 박테리아 성장 또는 생물막 형성에 영향이 나타내지 않았다.

2. 플랑크톤 세포 성장 측정 및 MIC 확인

C. 아크네스의 플랑크톤 성장에 있어서 지방산의 영향을 확인하기 위해, 96 웰 플레이트에 96시간 배양된 배양물을 1:50으로 희석하여 재이식하고 다른 농도의 지방산을 처리하였다.

플레이트를 37℃, 혐기성 조건으로 배양하였으며, 혐기성 파우치(Fisher Scientific, Pittsburgh, USA)를 이용하여 유지시켰다. 96시간 배양 후 Optizen 2120UV spectrophotometer (Mecasys Co. Ltd., Daejeon, Korea)를 이용하여 600 nm에서 세포 혼탁도를 확인하였다.

3. 크리스탈 바이올렛 필름 분석

앞서 보고된 방법 (Lee et al., 2017b)으로 크리스탈 바이올렛 분석을 수행하여 생물막 형성을 정량하였다.

간략하게, 600 nm에서 초기 OD 2.3 (CFU ~10⁸) cells/ml 값을 나타내며, 96시간 배양된 C. 아크네스를 멸균된 RCM 배지로 1:50으로 희석하고, 지방산이 존재하거나 존재하지 않는 조건으로 96 웰 플레이트에 분산시킨 후 37℃,혐기성 조건하에서 96시간 동안 배양하였다.

생물막을 정량하기 위해, 플랑크톤 성장을 폐기하고 플레이트를 증류수로 세번 세척하고 웰에 부착된 생물막을 0.1% 크리스탈 바이올렛으로 20분간 염색하였다. 그 후, 플레이트를 멸균 증류수로 3회 세척하고 95% 에탄올을 이용하여 크리스탈 바이올렛을 추출하고 Multiskan EX microplate reader (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)를 이용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하였이며, 최소 12 반복 웰의 평균값으로 결과를 나타내었다.

억제율의 백분율은 상대적인 생물막 형성을 나타낸다 (100 x biofilm formation with chemical/biofilm formation of untreated control).

4. 지방산을 이용한 여드름균의 신속한 사멸(Rapid killing) 분석

지방산에 의한 사멸 시간을 확인하기 위해, 시간-살균(time-kill) 실험을 수행하였다. 간략하게, RCM broth (BD Difco™, Fisher Scientific, Pittsburgh, USA)에서 37℃, 혐기성 조건으로 96시간 동안 성장시킨 C. acnes ATCC 6919 배양물을 신선한 RCM 배지를 이용하여 1:50으로 희석하였다.

시료에 미리스톨레익산 (myristoleic acid, 50 및 100 μg/ml) 또는 라우르산 (lauric acid, 50 및 100 μg/ml)을 처리하고 37℃, 혐기성 조건하에서 교반시키면서 배양하였다.

시간포인트마다, 처리된 세포의 부분표본을 수집하고, 적절한 희석을 수행한 후 세포를 RCM 아가 플레이트 위에 도말하고 37℃에서 96시간 동안 인큐베이션한 후 CFUs를 열거하였으며, 각 실험은 중복수행되었다.

5. 주사 전자 현미경 관찰

앞서 보고된 방법(Lee et al., 2011)으로 전자현미경 (SEM)으로 세포외중합체 물질 (extracellular polymeric substance, EPS) 생성을 확인하였다,

간략하게, 96-웰 플레이트에서 지방산이 존재하거나 존재하지 않는 조건으로 C. acnes 세포를 접종하고, 각 웰에 나이론 필터(0.4 x 0.4 mm square)첨가하였다. 37℃, 혐기성 조건하에서 교반없이 96 시간동안 함께 배양하여 나일론 필터 위에 생물막을 성장시켰다.

그 후, 나이론 필터 조각 위 생물막 세포를 2.5% 글루타알데하이드 및 2% 포름알데하이드로 24시간동안 고정시키고, 사산화오스뮴으로 연속적으로 고정시키고, 에탄올 시리즈(50, 70, 80, 90, 95 및 100%) 및 아세트산 이소아밀(isoamyl acetate)을 이용하여 탈수시켰다.

임계점 건조 후, 필터상 세포를 팔라디움/금으로 스토퍼 코팅하고, S-4100 scanning electron microscope (Hitachi, Tokyo, Japan)하에서 15 kV의 가속전압을 이용하여 ×1000 내지 10,000 배율로 관찰하였다.

6. 세포외중합체 물질 (extracellular polymeric substance, EPS) 정량

EPS 정량을 위해, 대조군 및 미리스톨레익산이 처리된 C. 아크네스를 37℃에서 96시간 동안 배양하였다. 배양 후 배양물을 8,228 ×g로 10분간 원심분리하고 상층액을 분리하였다.

세포 펠렛을 멸균된 PBS로 세척하여 잔여 세포가 없는 배양 상층액을 제거하였다. 등장성 용액 (10 mM Tris/HCl, pH 8.0, 10 mM EDTA, 2.5% NaCl) 15 ml를 세포 펠렛에 첨가하고, 혼합한 웰을 4℃에서 하룻밤동안 배양하였다.

하룻밤 배양 후, 세포 현탁액을 5분간 흔들어 혼합한 후 8,228×g에서 10분간 원심분리하였다. 세포에 결합되어 있는 EPS가 포함된 상층액을 세포로부터 분리하였다. 차가운 에탄올을 1:3의 비율로 상기 상층액에 첨가하고 -20℃에서 하룻밤동안 정치시켰다.

4℃에서 18,514×g로 30분간 원심분리하여 침전된 EPS를 수집한 후, 펠렛을 70% 에탄올로 세척하고 건조시켰다. 건조된 EPS를 칭량하고 지방산에 의한 EPS 생성 억제를 하기 계산식 (Badireddy et al., 2008; Sivasankar et al., 2016)으로 계산하였다.

([Control wt - Treated wt/Control wt] × 100)

7. 소수성 (Hydrophobicity) 분석: Microbial adherence to hydrocarbon (MATH)

탄화수소 (톨루엔)에 대한 C. 아크네스의 부착성 및 C. 아크네스의 세포 표면 소수성에 대한 지방산의 영향을 확인하기 위해 MATH 분석 (Rosenberg et al., 1980)을 수행하였다.

37℃, 혐기성 조건하에서 96시간 동안 지방산 없이 C. 아크네스를 성장시켰다.

인큐베이션 후, 멸균된 PBS로 미리스톨레익산이 포함되지 않은 대조군 및 미리스톨레익산이 처리된 배양물(5, 10, 15 또는 20 μg/ml)의 세포 현탁액을 준비하였다. 모든 처리 및 비처리된 배양물의 OD 값을 OD 0.5 ± 0.05로 조정하고, 동일한 부피의 톨루엔을 세포 현탁액 3 ml에 첨가한 후 60초 동안 교반시켰다.

교반 후, 실온에서 하룻밤동안 수용액 인큐베이선을 수행하여 미량 용매 완벽하게 제거하였다. 수용액상의 OD₆₀₀을 확인하고 세포 표면 소수성 (CSH)을 하기 계산식을 이용하여 소수성 인덱스 (HI)로 평가하였다.

(HI = [1-(OD₆₀₀ after vortexing/OD₆₀₀ before vortexing)] × 100) (Mattos-Guaraldi et al., 1999; Pompilio et al., 2008; Sivasankar et al., 2016).

8. 선충모델에서 항-바이러스 효과 및 미리스톨레익산의 세포독성 확인

앞서 보고된 방법(Beceiro et al., 2014)을 약간 변형시켜 C. 아크네스 사멸 분석을 수행하였다. 간략하게, 96-웰 플레이트에서 분석을 수행하였다.

젊은 성인 선충 (20 - 30) [fer-15(b26);fem-1(hc17)]을 M9 용액에 포함된 각 웰에 옮겼다. 처리되지 않은 대조군 및 지방산이 처리된 C. acnes 세포를 각각 20 내지 30 선충을 함유하는 분리된 웰에 첨가하고 25℃에서 인큐베이션하였다.

1 × 10⁶ cells/ml의 CFU에서 대장균 OP50에 단독으로 노출된 선충을 대조군으로 사용하였다.

앞서 보고된 방법(Rajasekharan et al., 2018)으로 iRiSTM Digital Cell Imaging System (Logos BioSystems, South Korea)을 이용하여 10 내지 30초간 LED 또는 UV LED 광에 노출시켜 생존능력을 확인하였다. 세번 반복 실험을 수행하였다.

미리스톨레익산의 독성을 C. 아크네스에서 확인하였다.

미리스톨레익산을 다양한 용량으로 C. 아크네스에 처리하고 연속적으로 5일동안 매일 생존을 확인하였다.

<실시예 1> C. 아크네스에 대한 다양한 지방산의 항균성 및 항생물막 활성 확인

신규한 항생물막제를 확인하기 위해, 96-웰 플레이트에서 20 μg/ml의 농도로 24개의 지방산 (14개의 포화지방산 및 10개의 불포화지방산)의 최소 항균 효과를 스크리닝하였다.

지방산 존재하에서 C. 아크네스 생물막 형성을 확인한 결과, 도 1A와 같이 대부분의 지방산은 두 종류의 C. 아크네스 균주 (ATCC 6919 및 KCCM 42791)에 대한 생물막 형성에 있어서, 매우 다른 억제 효율을 나타내는 것이 확인되었다.

특히, 17개 지방산 (노난산, 데칸산, 운데카논산, 라우르산, 미리스트산, 미리스톨레익산, 팔미트산, 헵타데칸산, 스테아린산, 올레산, 페트로셀린산, 리놀레산, 리놀렌산, 결합된 리놀레산, 아라키돈산, 에루신산, 트리코산산)은 20 μg/ml 농도에서 C. 아크네스 생물막 형성을 60% 이상 억제한 반면, 3개의 지방산 (발레르산, 헵탄산 및 시스-9-헥사데센산)은 ATCC 691 균주에 대한 생물막 형성을 매우 적게 변화시켰다. 동일한 조건에서 C. 아크네스의 생물막 형성을 증가시킨 지방산은 확인되지 않았다.

대다수 지방산의 항생물막 효과는 치태에서 분리된 다른 C. 아크네스 균주 KCCM 42791에서도 유사하게 확인되었다.

특히, 20 μg/ml 농도의 라우르산 및 미리스톨레익산은 95% 이상의 C. 아크네스 생물막 형성 억제 효과를 나타내는 것을 확인할 수 있었다.

앞선 보고에 따르면 라우르산은 72시간 후 MIC 60 μg/ml으로 C. 아크네스에 대한 항균활성이 나타나는 것으로 확인되었다. (Nakatsuji et al., 2009).

이에 따라서, C. 아크네스 생물막 연구에 널리 사용되는 C. 아크네스 ATCC 6919 균주를 이용하여 미리스톨레익산 및 대조군으로서 라우르산의 영향을 확인하였다.

도 1B를 참고하여 지방산의 MIC를 결정하였다.

대부분의 FAs의 MIC는 500 μg/ml 이상인 반면, 4개의 중간사슬지방산 (medium-chain fatty acids, MCFA)인 데칸산, 운데카논산, 라우르산 및 미리스톨레익산은 96시간 배양 후 25 내지 200 μg/ml 범위를 나타내었다.

특히, 미리스톨레익산 및 라우르산은 98% 이상으로 매우 현저한 생물막 형성 억제 효과를 나타내었으며, 미리스톨레익산 및 라우르산의 MICs는 각각 25 μg/ml 및 100 μg/ml로 확인되었다.

라우르산 및 데칸산의 항균 활성은 이미 앞선 보고에서 확인되었으며, 도 1B의 결과와 매우 유사한 것을 확인할 수 있었다. 그러나 억제 수준 이하의 지방산들의 C. 아크네스의 생물막 억제 활성에 대해서는 전혀 언급되어 있지 않다.

<실시예 2> 미리스톨레익산 및 라우르산의 C. 아크네스 생물막 형성 억제 효과 확인

보다 상세한 생물막 실험 결과를 확인하기 위해, 96-웰 폴리스티렌 플레이트에서 C. 아크네스 생물막 형성 억제 효과를 미리스톨레익산 및 라우르산의 용량의존적으로 확인하였다.

그 결과, 도 2A 및 도 2B와 같이 미리스톨레익산 및 라우르산은 1 μg/ml에서 80% 이상의 생물막 형성 억제 효과를 나타내었으며, 미리스톨레익산의 MIC (25 μg/ml)가 잘 알려진 항여드름제 라우르산의 MIC (100 μg/ml) 보다 4배 낮은 것을 확인할 수 있었다. 또한, 도 2C를 참고하면, 미리스톨레익산은 10 μg/ml로 증가하여도 플랑크톤성 세포 성장을 감소시키지 않았다.

항여드름 치료에 적용할 경우, 고려해야할 특성 중 하나는 빠른 작용이다.

이에 따라, 미리스톨레익산 및 라우르산 존재하에서 C. 아크네스 세포 사멸에 요구되는 시간을 확인하였다.

그 결과, 도 2D와 같이 미리스톨레익산은 100 μg/ml 농도에서 1시간 만에 C. 아크네스 세포를 대부분 사멸(99.999% 이상)시킨 반면, 라우르산은 동일한 농도에서 C. 아크네스 세포를 효과적으로 사멸시키지 못한 것을 확인할 수 있었다.

상기 결과로부터 높은 농도에서 미리스톨레익산의 즉각적인 사멸을 유도할 수 있으며, 최소억제 농도(< 10 μg/ml)의 미리스톨레익산은 C. 아크네스 생물막 형성을 현저하게 억제시키는 것이 확인되었다.

<실시예 3> 미리스톨레익산 및 라우르산의 세포외중합체물질 (EPS) 생산 감소 효과 확인

세포외중합체물질(EPS) 생산은 생물막 형성의 주요특징으로, 플랑크톤 세포들을 결합시켜 외부의 가혹한 환경으로부터 자신들을 보호하도록 돕는다 (Costerton et al., 1987).

이에 따라, 몇 가지 지방산의 존재하에서 EPS 생산을 확인하였으며, 상기 지방산의 C. 아크네스 생물막 형성 억제 효과를 확인하였다.

그 결과, 도 3B와 같이 10 μg/ml 농도의 운데카논산, 라우르산 및 미리스톨레익산에서 현저한 EPS 생산 감소가 확인된 반면, 도 3A와 같이 다른 항생물막 지방산 (데칸산, 스테아르산 및 트리코산산) 및 효과가 적은 지방산 (헵탄산 및 시스-9-헥사데센산)에서는 유의한 변화가 확인되지 않았다. SEM 분석 역시 도 3B와 같이 10 μg/ml 농도의 미리스톨레익산이 처리된 실험군에서 EPS 생산 감소가 확인되었다.

상기 결과로부터 지방산의 C. 아크네스에 대한 항생물막 활성은 EPS 생산 저해를 통하여 야기되는 것이 확인되었다.

<실시예 4> C. 아크네스 세포의 소수성에 대한 지방산의 영향 확인

세포 표면 소수성은 표면에 초기 부착 또는 분리에 결정적인 역할을 한다.

일반적으로, 많은 소수성 세포들은 폴리스티렌(polystyrene), 폴리프로필렌(polypropylene), 실리콘(silicon) 및 테프론(teflon)과 같은 소수성 표면에 더 많이 부착되는 경향이 나타나고, 친수성 세포는 친수성 표면에 부착될 수 있다.

이에 따라, 생물막 억제에 활성 또는 적은 활성을 나타내는 12개의 지방산 존재하에서 세포 표면 소수성을 확인하였다.

지방산이 없는 조건에서 박테리아의 소수성 지수가 > 50% 일 경우, 박테리아는 소수성으로 간주되며, C. 아크네스는 적은 소수성(소수성 지수 60%)을 나타나는 것으로 확인되었다.

도 4A를 참고하면, 10개의 활성 항생물막 지방산은 C. 아크네스의 소수성을 감소시켰으며, 세포를 친수성으로 만들었다 (소수성 지수 < 50%). 이는 상기 지방산들이 도 1A와 같이 생물막 형성을 억제시킨 결과이다.

상기 결과로부터 지방산에 의한 소수성 감소율은 그들의 항생물막 효과와 관련성이 있음이 확인되었다.

활성 라우르산, 미리스톨레익산 및 리놀레산은 세포 소수성을 가장 많이 감소시킨 반면 적은 활성을 나타낸 헵타데칸산, 시스-9-헥사데센산, 스테아르산 및 트리코산산은 거의 소수성 변화가 나타나지 않았다.

보다 상세하게 도 4B를 참고하면, 미리스톨레익산은 10 μg/ml 농도에서 C. acnes 세포를 친수성으로 만들었으며 (> 20%), 용량의존적으로 소수성을 확실하게 감소시켰다.

상기 결과로부터 지방산에 의한 세포 표면 소수성 감소는 지방산의 항생물막 활성의 가능한 원인 중 하나일 것으로 제안될 수 있다.

<실시예 5> 황색포도상구균(Staphylococcus strains)에 대한 미리스톨레익산의 항균 및 항생물막 활성 확인

2개의 메치실린 감수성 S. aureus 균주 (MSSA; ATCC 25923 및 ATCC 6538), 2개의 메치실린 저항성 S. aureus 균주 (MRSA, MW2 및 ATCC 33591) 및 S. epidermidis 균주를 포함하여 5개의 황색포도상구균에 대한 미리스톨레익산의 항균 및 항생물막 활성을 확인하였다.

그 결과, 도 5와 같이 미리스톨레익산은 황색포도상구균 5 균주에 대한 강한 항생물막 활성을 나타내었다. 50 μg/ml 농도의 미리스톨레익산은 5 균주 모두에서 대하여 90% 이상의 생물막 형성 억제 효과를 나타낸 반면, 라우르산은 S. aureus ATCC 6538에 대하여 약한 항생물막 활성을 나타내었다. 또한, 미리스톨레익산의 MIC는 150 μg/ml로 확인되었다.

이에 따라 미리스톨레익산의 항생물막 활성은 부분적인 항균 활성에 의한 것임이 확인되었다. 또한, 박테리아는 종종 다른 박테리아와 함께 다종 생물막을 형성하기 때문에 미리스톨레익산을 C. 아크네스 및 S. aureus의 다종 생물막 억제에 사용할 수 있다.

<실시예 6> 선충모델에서 미리스톨레익산 및 라우르산의 C. 아크네스의 독성 제거 효과 확인

선충류 C. 엘레간스 (C. elegans)는 다양한 병원성 박테리아의 독성 능력을 확인하기 위한 대안적인 분석법으로 이용되어 왔으며, C. 아크네스는 선충류 C. 엘레간스에 대한 독성을 나타내는 것으로 보고됨에 따라 (Sivasankar et al., 2016), C. 엘레간스 사멸 분석을 수행하여 지방산이 선충에서 C. 아크네스 독성에 영향을 미칠 수 있는 지 확인하였다.

그 결과, 도 6A와 같이 10 μg/ml 농도의 미리스트올레익산 처리된 경우, C. 아크네스 감염의 존재하에서도 선충의 생존이 증가된 것을 확인할 수 있었다. 보다 상세하게 4일 동안 C. 아크네스를 감염시킨 C. 엘레간스는 20%만 생존한 반면, 미리스톨레익산의 존재하에서 C. 아크네스를 감염시킨 C. 엘레간스는 70%가 생존한 것으로 나타났다.

또한, 미리스톨레익산의 화학적 독성을 확인하기 위해, 감염되지 않은 선충에 미리스톨레익산을 상이한 농도로 노출시켰다. 그 결과, 도 6B와 같이 5일 동안 500 μg/ml까지 증가된 미리스톨레익산은 C. 엘레간스에게 독성을 나타내지 않았다.

상기 결과로부터 미리스톨레익산은 C. 아크네스의 독성을 효과적으로 감소시키고, 감염된 선충류에 독성 효과 없이 생존을 증가시키는 것을 확인할 수 있었다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (9)

1. 미리스톨레익산을 유효성분으로 함유하며, 상기 미리스톨레익산은 여드름균 (Cutibacterium acnes) 및 황색포도상구균 (Staphylococcus strains)의 생물막 형성을 억제하고, 상기 여드름균 (Cutibacterium acnes) 및 황색포도상구균 (Staphylococcus strains)의 생물막에 의해 유발되는 피부염 질환 예방 또는 치료용 약학조성물로서,
   상기 피부염 질환은 면포성 여드름, 구진성 여드름, 농포성 여드름, 결정성 여드름, 낭포성 여드름, 심상성 여드름, 전격성 여드름, 응괴성 여드름, 켈로이드성 여드름, 건선증, 아토피성 피부염, 지루성 피부염, 접촉성 피부염, 화폐성 피부염 및 일반 피부염으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 약학조성물.
2. 삭제
3. 청구항 1에 있어서, 상기 여드름균은 큐티박테리움 아크네스 (Cutibacterium acnes, C. acnes) 균주 KCCM 41747 (ATCC 6919) 및 큐티박테리움 아크네스 균주 KCCM 42791로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 약학조성물.
4. 청구항 1에 있어서, 상기 황색포도상구균은 메치실린 감수성 황색포도상구균 균주 ATCC 25923, 메치실린 감수성 황색포도상구균 균주 ATCC 6538, 메치실린 저항성 황색포도상구균 균주 MW2, 메치실린 저항성 황색포도상구균 균주 ATCC 33591 및 표피포도상구균 (S. epidermidis) 균주로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 약학조성물.
5. 삭제
6. 삭제
7. 미리스톨레익산을 유효성분으로 함유하며, 상기 미리스톨레익산은 여드름균 (Cutibacterium acnes) 및 황색포도상구균 (Staphylococcus strains)의 생물막 형성을 억제하고, 상기 여드름균 (Cutibacterium acnes) 및 황색포도상구균 (Staphylococcus strains)의 생물막에 의해 유발되는 피부염 질환 또는 피부 트러블 예방 또는 개선용 화장료조성물로서,
   상기 피부염 질환은 면포성 여드름, 구진성 여드름, 농포성 여드름, 결정성 여드름, 낭포성 여드름, 심상성 여드름, 전격성 여드름, 응괴성 여드름, 켈로이드성 여드름, 건선증, 아토피성 피부염, 지루성 피부염, 접촉성 피부염, 화폐성 피부염 및 일반 피부염으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 화장료조성물.
8. 삭제
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