KR102348600B1 - 카드뮴 노출 또는 중독의 진단 방법, 카드뮴 노출 또는 중독 관련 질환의 진단 방법, 및 카드뮴 노출 또는 중독 관련 질환의 예방 또는 치료용 약물 스크리닝 방법 - Google Patents

카드뮴 노출 또는 중독의 진단 방법, 카드뮴 노출 또는 중독 관련 질환의 진단 방법, 및 카드뮴 노출 또는 중독 관련 질환의 예방 또는 치료용 약물 스크리닝 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 카드뮴 노출 또는 중독의 진단 방법, 카드뮴 노출 또는 중독 관련 질환의 진단 방법 및 카드뮴 노출 또는 중독 관련 질환의 예방 또는 치료용 약물 스크리닝 방법에 관한 것으로, 본 발명은 카드뮴 유래 산화 스트레스와 미토콘드리아 STAT3 의 관계를 이용하여, 효과적인 카드뮴 노출/중독 여부 진단 방법, 카드뮴 노출/중독 관련 질환 진단 방법, 및 카드뮴 노출/중독 관련 질환의 예방 또는 치료용 약물 스크리닝 방법을 제공하는 유용한 효과가 있다.

Description

카드뮴 노출 또는 중독의 진단 방법, 카드뮴 노출 또는 중독 관련 질환의 진단 방법, 및 카드뮴 노출 또는 중독 관련 질환의 예방 또는 치료용 약물 스크리닝 방법 {Methods for diagnosing cadmium exposure or addiction, methods for diagnosing cadmium exposure or addiction-related diseases, and methods for screening drug for preventing or treating cadmium exposure or addiction-related diseases}
본 발명은 카드뮴 노출 또는 중독의 진단 방법, 카드뮴 노출 또는 중독 관련 질환의 진단 방법 및 카드뮴 노출 또는 중독 관련 질환의 예방 또는 치료용 약물 스크리닝 방법에 관한 것이다.
산업화에 따라 카드뮴의 사용은 증가 하였으며, 이에 중금속에 대한 직업적인 고농도 폭로 외에도 환경 내에서의 만성적인 저농도 폭로가 건강에 미치는 영향도 중요한 문제로 대두하고 있다.
카드뮴(Cadmium, Cd)은 생체조직에서 다양한 독성작용을 유발하는 환경 및 산업오염물질의 하나이다. 카드뮴은 인체의 물질대사에 전혀 불필요한 유해금속물질(TNEM, toxic and non-essential heavy metal)로서 체내에서 축적되며, 카드뮴에 대한 인체의 노출은 주로 흡입 또는 섭취를 통해서이며, 담배 흡연은 흡입 노출의 주요 원인으로 밝혀져 있다(2006, Lancet Oncol., 7, 119-126). 카드뮴에 노출되면, 주로 간과 신장에 카드뮴이 농축되는 것으로 보고되고 있다(2007, Toxocol. Lett., 173, 181-190). 또한 저농도의 카드뮴에 지속적으로 노출되는 경우 카드뮴은 배출이 매우 느리고, 체내에서 카드뮴의 생물학적 반감기는 10~35년 정도이다.
카드뮴은 간과 신장 등 다양한 기관에 독성을 미치는데, 카드뮴의 급·만성 노출은 주로 간독성을 초래한다. 간 손상의 정도는 노출량과 노출지속기간에 의존한다. 특히 신장은 만성 경구노출에서 가장 영향을 많이 받는 기관으로 알려져 있으며 신장의 인과 칼슘처리 장애는 뼈로부터 무기물 재흡수를 일으켜 신장결석과 골연화증을 일으킬 수 있다(1995, Ren. Fail., 17, 483-487). 카드뮴의 잠재적 위협은 혈류로 흡수되는 종류와 양, 노출 기간 및 노출 경로에 따라 다르며, 간, 신장, 뼈뿐만 아니라 신경과 심장 혈관 시스템에 안좋은 영향을 줄 수 있다(2007, Toxicology, 234, 34-43). 또한, 카드뮴은 폐에 대하여 강한 자극작용을 가지고 있어 기도를 통하여 분진이나 증기를 섭취하면 호흡곤란을 수반하는 폐수종이나 화학성 폐렴을 일으킨다. 또한, 다량의 카드뮴이 경구로 섭취에 따른 유연, 구토, 설사, 복통 등의 소화관 장해가 발생되는 것으로 알려져 있으며, 카드뮴의 골 대사에 미치는 작용으로서는 이타이이타이병과 같은 공해병이 알려져 있고, 칼슘의 흡수저해나 비타민D의 활성화를 저해하는 것 등이 알려져 있다(1987, oxicology, 45, 1-11). 카드뮴은 그 외에도 철의 흡수를 저해하여 저혈색소성 빈혈, 정소의 출혈괴사, 마우스에서 최기형성 등을 일으킨다고 보고되어 있다. 또한 IARC(International Agency for Research on cancer)는 카드뮴을 발암 가능성이 있는 2A 그룹으로 분류하고 있고, 육종이나 전립선암의 발생과 관계가 있다.
이에, 카드뮴 노출/중독 여부를 신속하게 진단하여 카드뮴 노출/중독에 의한 피해를 최소화 하는 것이 중요하며, 또한 보다 근본적으로 카드뮴 노출/중독에 의한 발병 기전을 차단할 수 있는 치료제 개발이 필요한 상황이다.
다만, 현재까지 카드뮴 노출/중독에 대한 치료방법은 대증요법이 주를 이루며, 일부 킬레이트제가 사용되고 있으나, 체내에서 카드뮴을 완전히 제거하기는 매우 어렵고, 한편, 카드뮴 노출/중독 여부에 대한 검사법은 PCR(중합효소연쇄반응)을 기초로 하는 SSH(suppressive subtraction hybridization)는 mRNA 분석을 통해 세포의 카드뮴 노출 여부를 확인하는 방법이 제시된 바 있고(Diatchenko L., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, pp6025-6030, 1996; Kitajima H., et al., Arch. Toxicol., 73, pp410-412, 199) 그 외에도 SSH법과 마이크로어레이법을 사용한 카드뮴에 의해 발현되는 유전자를 검색하여 이를 통해 카드뮴 노출 여부를 확인하는 방법 등이 제시된 바 있으나(공개특허 10-2005-0092248), 보다 간편하고 효과적인 방법 제시가 여전히 필요한 상황이다.
한편, 카드뮴이 나타내는 독성은 ROS 증가에 의한 것으로 알려져 있으나, 카드뮴 독성 및 이로부터 유도되는 활성산소의 생성과 관련된 미토콘드리아 STAT3 단백질에 의해 매개되는 ROS 신호전달 경로(또는 기능)는 보고된 바 없었다.
이러한 상황에서 본 발명자들은 카드뮴 유래 산화 스트레스와 미토콘드리아 STAT3 발현을 연구하던 중, 카드뮴 유발 산화 스트레스가 카드뮴에 의한 미토콘드리아 STAT3 신호전달 경로를 조절하여 나타나는 것임을 규명하고, 미토콘드리아 STAT3 발현량 측정을 통해 카드뮴 노출/중독 여부를 진단할 수 있고, 카드뮴 노출/중독 관련 질환 진단에 사용할 수 있으며, 미토콘드리아 STAT3 (mitoSTAT3) 단백질 발현량 감소 억제를 통하여 활성산소 증가를 막는 작용을 할 수 있는 물질을 스크리닝 함으로써, 새로운 카드뮴 노출/중독 관련 질환의 예방 또는 치료용 약물을 찾아낼 수 있음을 확인하여, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 산업화에 따른 카드뮴 노출/중독 사례가 증가함에 따라, 이에 대응하기 위하여, 효과적으로 카드뮴 노출/중독 여부를 진단할 수 있고, 카드뮴 노출/중독 관련 질환 진단 정보를 제공하는 방법을 제공하고, 나아가 카드뮴 노출/중독 관련 질환의 예방 또는 치료용 약물 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여,
본 발명의 일 측면에서, 1) 피검체로부터 시료를 준비하는 단계; 2) 상기 단계 1)의 시료에서 미토콘드리아를 분리하는 단계; 3) 상기 단계 2)에서 분리된 미토콘드리아의 STAT3(signal transducer and activator of transcription3) 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 4) 상기 단계 3)에서 측정된 STAT3 단백질의 발현 수준을 카드뮴 노출/중독이 없는 정상 대조군과 비교하여 정상 대조군에 비해 감소된 미토콘드리아 STAT3 단백질 발현 수준으로 확인되는 경우, 카드뮴 노출/중독된 것으로 진단하는 단계를 포함하는 카드뮴 노출/중독 진단 정보의 제공 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 측면에서, 1) 피검체로부터 시료를 준비하는 단계; 2) 상기 단계 1)의 시료에서 미토콘드리아를 분리하는 단계; 3) 상기 단계 2)에서 분리된 미토콘드리아의 STAT3(signal transducer and activator of transcription3) 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 4) 상기 단계 3)에서 측정된 STAT3 단백질의 발현 수준을 카드뮴 노출/중독이 없는 정상 대조군과 비교하여 정상 대조군에 비해 감소된 미토콘드리아 STAT3 단백질 발현 수준으로 확인되는 경우, 카드뮴 노출/중독 관련 질환으로 진단하거나 또는 발병 위험이 있는 것으로 진단하는 단계를 포함하는 카드뮴 노출/중독 관련 질환 진단 정보의 제공 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면에서, 1) 피검체로부터 시간 차를 두고 두개 이상의 시료를 준비하는 단계; 2) 상기 단계 1)의 각각의 시료에서 미토콘드리아를 분리하는 단계; 3) 상기 단계 2)에서 분리된 미토콘드리아의 STAT3(signal transducer and activator of transcription3) 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 4) 상기 단계 3)에서 측정된 STAT3 단백질의 발현 수준을 비교하여 최초 얻은 시료에 비해 이후에 얻은 시료에서 감소된 미토콘드리아 STAT3 단백질 발현 수준이 확인되는 경우, 카드뮴 노출/중독 관련 질환의 예후가 좋지 않은 것으로 진단하는 단계를 포함하는 카드뮴 노출/중독 관련 질환 예후 예측 정보의 제공 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 측면에서, 1) 카드뮴에 노출/중독된 시료에 후보 약물을 처리하는 단계; 2) 상기 단계 1)의 시료에서 미토콘드리아를 분리하는 단계; 3) 분리된 미토콘드리아의 STAT3 단백질 발현 수준을 측정하는 단계; 및 4) 상기 단계 3)의 미토콘드리아 STAT3 단백질의 발현 수준을 후보 약물을 처리하지 않은 대조군에 비해 증가시키는 후보 약물을 선별하는 단계를 포함하는 카드뮴 노출/중독 관련 질환의 예방 또는 치료용 약물 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명은 카드뮴 유래 산화 스트레스와 미토콘드리아 STAT3 의 관계를 이용하여, 효과적인 카드뮴 노출/중독 여부 진단 방법, 카드뮴 노출/중독 관련 질환 진단 방법, 및 카드뮴 노출/중독 관련 질환의 예방 또는 치료용 약물 스크리닝 방법을 제공하는 유용한 효과가 있다.
도 1은 카드뮴 처리 세포 생존률 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 2는 카드뮴 유도 미토콘드리아 단백질 발현 변화 분석 결과를 나타낸 것이다. 구체적으로 도 2A는 인체의 전립선 세포주 (WPMY-1)에 있어서 미토콘드리아 STAT3 발현량 변화를 확인한 것이고, 도 2B는 마우스 유래 세포주 (MEFs)에서 미토콘드리아 STAT3 발현량을 확인한 것이고, 도 2C는 유방암 세포주 (MDA-MB231)에 있어서 미토콘드리아 STAT3 발현량 확인한 것이다.
도 3은 카드뮴 처리 유무에 따른 미토콘드리아 형태 변화를 확인한 사진이다.
도 4는 카드뮴 처리 유무에 따른 미토콘드리아 형태 변화를 정량적으로 나타낸 그래프이다.
도 5는 카드뮴 처리에 따른 미토콘드리아의 활성산소를 측정한 결과를 나타낸 것이다. 도 5A는 인체 유래 세포주 전립선 세포주에서 (WPMY-1) 미토콘드리아의 활성산소를 측정한 것이고, 도 5B는 마우스 유래 배아섬유 세포주 (MEFs)에서 미토콘드리아의 활성산소를 측정한 것이며, 도 5C는 유방암 세포주 (MDA-MB231)에서 미토콘드리아의 활성산소를 측정한 것이다.
도 6은 유방암 세포주에 STAT3 siRNA 처리 후 카드뮴에 대한 민감도를 분석한 결과이다. 구체적으로 도 6A는 세포생존률을 현미경으로 확인한 것이고, 도 6B는 도 6A에서 확인한 세포생존률을 정량적으로 나타낸 그래프이다.
도 7은 유방암 세포주에 STAT3 siRNA 처리에 따른 미토콘드리아의 카드뮴에 대한 민감도를 미토콘드리아 활성산소 측면에서 정량적으로 나타낸 그래프이다.
도 8은 전립선 유래 세포주(WPMY-1)에 STAT3 siRNA 처리 후 카드뮴에 대한 민감도를 세포생존률 측면에서 정량적으로 나타낸 그래프이다.
도 9는 전립선 유래 세포주(WPMY-1)에 STAT3 siRNA 처리 후 카드뮴에 대한 민감도를 미토콘드리아 활성산소 측면에서 정량적으로 나타낸 그래프이다.
도 10은 마우스 배아섬유아세포(MEF) STAT3 넉아웃 세포주에서 세포 생존률 (도 10A)과 카드뮴 유도 활성산소(도 10B)를 분석한 결과이다.
도 11 내지 도 14는 멜라토닌의 카드뮴 유래 미토콘드리아 활성 산소 저감능을 확인한 결과이다. 구체적으로 도 11A는 세포 생존률을 정량적으로 나타낸 그래프이고, 도 11B는 활성산소 수준을 나타낸 그래프이다. 도 12는 유방암 세포주에서 미토콘드리아 STAT3 발현수준을 나타낸 것(A)과 이를 정량적으로 나타낸 그래프(B)이다. 도 13은 미토콘드리아 형태 변화를 확인할 수 있는 사진이고, 도 14는 도 13에서 확인된 미토콘드리아 형태 변화를 확인할 수 있는 미토콘드리아 길이를 비교할 수 있는 그래프이다.
도 15는 전립선 세포주에서의 멜라토닌 효과를 분석한 결과이다. 도 15A는 미토콘드리아 STAT3 발현량을 나타낸 그림이고, 도 15B는 도 15A에서 확인한 결과를 정량적으로 나타낸 그래프이다. 도 15C는 카드뮴에 의해 감소되는 인산화 STAT3 (pY705-STAT3, pS727-STAT3) 보여주고, 멜라토닌에 의해 pS727-STAT3가 회복되어 미토콘드리아 STAT3 단백질이 유지되는 것을 보여준다.
도 16은 실험예 10에 따른 마우스 배아섬유아 세포주에서의 멜라토닌 효과를 분석한 결과이다. 도 16A는 미토콘드리아 STAT3 발현량을 나타낸 그림이고, 도 16B는 도 16A에서 확인한 결과를 정량적으로 나타낸 그래프이다.
도 17은 요약문으로 카드뮴에 의해 STAT3와 pS727-STAT3에 변화를 유도하여 미토콘드리아 막이 열리고 활성산소의 증가를 유도되는 현상을 확인한 결과이다. 멜라토닌은 pS727STAT3를 활성화 시켜 카드뮴으로 유도되는 미토콘드리아 STAT3 단백질 변화를 방어하고, 최종적으로 활성산소 증가를 막아준다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 일 측면에서, 1) 피검체로부터 시료를 준비하는 단계; 2) 상기 단계 1)의 시료에서 미토콘드리아를 분리하는 단계; 3) 상기 단계 2)에서 분리된 미토콘드리아의 STAT3(signal transducer and activator of transcription3) 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 4) 상기 단계 3)에서 측정된 STAT3 단백질의 발현 수준을 카드뮴 노출/중독이 없는 정상 대조군과 비교하여 정상 대조군에 비해 감소된 미토콘드리아 STAT3 단백질 발현 수준으로 확인되는 경우, 카드뮴 노출/중독된 것으로 진단하는 단계를 포함하는 카드뮴 노출/중독 진단 정보의 제공 방법을 제공한다.
본 발명은 카드뮴 유래 산화 스트레스와 미토콘드리아 STAT3 발현량 변화의 관계 규명을 통하여, 카드뮴 노출/중독 여부를 진단한다. 상기 카드뮴 노출/중독 진단은 카드뮴 유발 산화 스트레스가 미토콘드리아 STAT3 신호전달 경로를 통해 조절되는 것에 기인하고, 카드뮴 유발 산화 스트레스가 미토콘드리아 STAT3 발현량에 의하여 조절되는 것을 확인하였다.
본 발명의 상기 진단 정보의 제공은, 본 발명자들에 의해 규명 된 바와 같이, 세포가 카드뮴 노출/중독되는 경우, 세포 내 미토콘드리아의 STAT3 량의 감소 또는 미토콘드리아의 STAT3 발현량 저감을 확인하는 것으로부터 제공된다. 본 발명이 하술되는 이론에 제한되는 것은 아니나, 카드뮴에 노출/중독된 세포는 세포질에 존재하는 STAT3의 인산화와 STAT3의 미토콘드리아 내로의 유입을 막고, 미토콘드리아 내에 존재하는 STAT3 량이 감소되고, 미토콘드리아의 막이 열리고 활성산소의 증가가 초래된다. 상기한 예시적인 기전과 같이 카드뮴에 의해 노출/중독된 세포는 미토콘드리아의 기능 이상과 활성산소의 증가로부터 세포 괴사가 야기될 수 있고, 카드뮴으로 인하여 발병되는 것으로 알려져 있거나, 관계되 있는 것으로 규명된 바 있는 다양한 질환을 야기한다. 상술한 바와 같이, 본 발명에서 처음으로 규명한 사실로부터, 미토콘드리아의 STAT3 발현량 변화를 측정하는 것에 의해 카드뮴 노출/중독 여부의 진단 정보가 제공된다.
이하, 본 발명의 카드뮴 노출/중독 진단 정보의 제공 방법을 하술한 바와 같이, 단계별로 상세히 설명한다.
상기 진단 정보의 제공 방법에 있어서, 1) 피검체로부터 시료를 준비하는 단계는, 미토콘드리아 STAT3 단백질 발현량 확인이 가능한 시료를 준비하는 단계이다. 여기서, 상기 시료는 예를 들어, 카드뮴 노출/중독 여부를 진단하기 위한 피검체의 생물학적 시료로서, 피검체, 예를 들어 포유 또는 비포유 동물, 바람직하게 사람 또는 가축 등의 동물에서 분리된 조직 또는 세포이다. 상기 조직 또는 세포는 피검체의 전신에서 유래된 것일 수 있으나, 예를 들어 카드뮴에 노출되는 경로의 조직 또는 세포이거나 또는 카드뮴이 축적되는 기관의 조직 또는 세포이고, 예를 들어 구강, 기도, 폐, 식도, 위, 혈관, 혈액, 간, 신장 유래의 조직 또는 세포일 수 있다.
상기 진단 정보의 제공 방법에 있어서, 2) 상기 단계 1)의 시료에서 미토콘드리아를 분리하는 단계는, 당해 기술분야에서 알려진 통상적인 방법으로 이루어질 수 있고, 본 발명의 일 구체예에서, 상기 단계 1)의 세포들 각각에 수크로스 버퍼 (sucrose buffer)를 세포에 처리하여 용해 (lysis)한 후 homogenize를 사용하여 세포를 분해한 후 원심분리하여 상층액을 얻은 뒤 상기 상층액을 다시 원심분리하여 펠렛 (pellet)을 얻고 수크로스 버퍼로 현탁한 후 트립신 소화 (trypsin digestion) 방법으로 처리하였다. 이후 BSA로 중화 (neuralization)하고 원심분리 한 후 펠렛 (pellet)으로 분리된 미토콘드리아를 수득하는 방법을 통해 미토콘드리아를 분리하는 단계이다.
상기 진단 정보의 제공 방법에 있어서, 3) 상기 단계 2)에서 분리된 미토콘드리아의 STAT3(signal transducer and activator of transcription3) 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계는, 분리된 세포들의 미토콘드리아 STAT3 단백질 발현을 확인하는 단계로서, 상기 단계 3)의 STAT3 단백질 발현 수준의 측정은 웨스턴 블롯(western blot), 면역침강법(immunoprecipitation), 이중 루시퍼라제 측정법(dual luciferase reporter assay), 효소면역분석법(ELISA) 및 면역조직화학법(immunohistochemistry)으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 방법으로 측정할 수 있고, 본 발명의 일 구체예어서, 웨스턴 블롯 방법을 사용하여 단백질 변화를 측정하였다. 세포에서 분리된 미토콘드리아 단백질을 사용하여 웨스턴 블롯 방법으로 STAT3 항체와 미토콘드리아 complex 1 항체인 NDUFA9 (미토콘드리아 단백질에 대한 loading control)를 사용하여 단백질 변화를 측정하였다.
상기 진단 정보의 제공 방법에 있어서, 4) 상기 단계 3)에서 측정된 STAT3 단백질의 발현 수준을 카드뮴 노출/중독이 없는 정상 대조군과 비교하여 정상 대조군에 비해 감소된 미토콘드리아 STAT3 단백질 발현 수준으로 확인되는 경우, 카드뮴 노출/중독된 것으로 진단하는 단계는, STAT3 단백질 발현량을 비교하여 카드뮴 노출/중독 여부를 확인하는 단계이다. 본 발명의 일 구체예에서, 상기 카드뮴 노출/중독 여부의 진단은 본 발명의 실험예 2 내지 8의 결과에서 확인되는 결과에 기초한다. 구체적으로, 카드뮴 처리 된 세포는 카드뮴 농도 의존적으로 세포 생존률이 감소하고, 미토콘드리아 STAT3 단백질 발현량이 저감되며, 미토콘드리아 형태 또한 변화하고, 세포의 활성산소 수준이 상승되는 것을 확인하였다. 나아가, 미토콘드리아 STAT3 단백질의 관련성을 명확히 하기 위해 미토콘드리아 STAT3 siRNA 처리하였을 때 활성산소 수준이 증가하는 것과 미토콘드리아 STAT3 넉아웃시켰을 경우 활성산소 수준이 증가하는 것을 확인하여, 카드뮴에 의한 활성산소와 미토콘드리아 STAT3 단백질의 관계를 규명하였다. 본 발명이 규명해낸 바를 통해 카드뮴 노출/중독 되는 경우 피검체의 세포의 미토콘드리아 STAT3 단백질 발현 수준이 감소되고, 이러한 STAT3 단백질 발현 수준 감소를 확인하는 것을 통하여 카드뮴 노출/중독 여부가 확인되고, 카드뮴 노출/중독 여부에 대한 진단 정보가 제공된다.
한편, 상기 단계 4)의 카드뮴 노출/중독이 없는 정상 대조군은 피검체에서 얻은 시료와 동일한 유래의 시료이되, 카드뮴 노출/중독 이력이 없는 시료, 또는 카드뮴 노출/중독 위험에 노출되지 않았던 정상의 생물학적 시료로서, 예를 들어 포유 또는 비포유 동물, 바람직하게 사람 또는 가축 등의 동물에서 분리된 조직 또는 세포이다. 이처럼 정상 대조군의 시료에서 얻은 미토콘드리아 STAT3 발현량과 시험군인 피검체의 시료에서 얻은 미토콘드리아 STAT3 발현량을 비교하여, 정상 대조군에 비해 감소된 미토콘드리아 STAT3 단백질 발현 수준으로 확인되는 경우, 카드뮴 노출/중독된 것으로 진단한다.
또 다르게는 카드뮴 노출/중독 진단 정보의 제공은, 하나의 피검체로부터 얻은 시료 둘을 비교하여 제공될 수 있다. 예를 들어, 피검체가 카드뮴 노출/중독 위험이 있는 환경에 노출되어 있는 경우, 시간 경과를 두고 최초 얻은 시료에서 미토콘드리아 STAT3 발현량과 소정의 시간 경과 후 얻은 시료에서 미토콘드리아 STAT3 발현량을 서로 비교하여 대조군(최초 얻은 시료)에 비해 감소된 미토콘드리아 STAT3 단백질 발현 수준으로 확인되는 경우, 카드뮴 노출/중독된 것으로 진단한다.
나아가 또 다르게는 카드뮴 노출/중독 진단 정보의 제공은, 하나의 피검체로부터 얻은 시료 둘을 비교하여 제공될 수 있다. 예를 들어, 피검체로부터 두 시료를 얻되, 하나는 카드뮴 노출/중독 경로가 되는 기관이나 카드뮴이 축적되는 기관에서 얻은 조직 또는 세포를 사용하고, 다른 하나는 카드뮴 노출/중독 경로나 축적되는 기관이 아닌 조직과 세포를 사용하여, 두 시료의 미토콘드리아 STAT3 발현량을 비교하여 대조군(카드뮴 노출/중독 경로나 축적되는 기관이 아닌 조직과 세포)에 비해 감소된 미토콘드리아 STAT3 단백질 발현 수준으로 확인되는 경우, 카드뮴 노출/중독된 것으로 진단한다.
전술된 예시 외에도 카드뮴 노출/중독 여부의 확인은 본 발명에서 제공하는 미토콘드리아 STAT3 단백질 발현량 변화, 예를 들어 대조군 대비 감소된 발현량을 확인하는 방법에 의한 것인 바, 이를 통한 카드뮴 노출/중독 진단 정보의 제공 방법은 본 발명에 포함된다.
본 발명의 다른 측면에서, 1) 피검체로부터 시료를 준비하는 단계; 2) 상기 단계 1)의 시료에서 미토콘드리아를 분리하는 단계; 3) 상기 단계 2)에서 분리된 미토콘드리아의 STAT3(signal transducer and activator of transcription3) 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 4) 상기 단계 3)에서 측정된 STAT3 단백질의 발현 수준을 카드뮴 노출/중독이 없는 정상 대조군과 비교하여 정상 대조군에 비해 감소된 미토콘드리아 STAT3 단백질 발현 수준으로 확인되는 경우, 카드뮴 노출/중독 관련 질환으로 진단하거나 또는 발병 위험이 있는 것으로 진단하는 단계를 포함하는 카드뮴 노출/중독 관련 질환 진단 정보의 제공 방법을 제공한다.
본 발명은 카드뮴 유래 산화 스트레스와 미토콘드리아 STAT3 발현량 변화의 관계 규명을 통하여, 카드뮴 노출/중독 관련 질환 진단 정보를 제공한다. 상기 카드뮴 노출/중독 관련 질환의 진단은 카드뮴 유발 산화 스트레스가 미토콘드리아 STAT3 신호전달 경로를 통해 조절되는 것에 기인하고, 카드뮴 유발 산화 스트레스가 미토콘드리아 STAT3 발현량에 의하여 조절되는 것을 확인한 것으로부터 착안 된 것이다. 이에, 카드뮴 유래 활성산소, 이에 의한 산화 스트레스, 미토콘드리아 열림, 미토콘드리아 형태 변화, 미토콘드리아 기능 이상, 세포 사멸, 세포 괴사 등에 기인한 질환은 본 발명의 방법에 의하여 카드뮴 노출/중독 관련 질환 진단 정보가 제공된다.
이하, 본 발명의 카드뮴 노출/중독 관련 질환 진단 정보의 제공 방법을 하술한 바와 같이, 단계별로 상세히 설명한다.
상기 진단 정보의 제공 방법에 있어서, 1) 피검체로부터 시료를 준비하는 단계는, 미토콘드리아 STAT3 단백질 발현량 확인이 가능한 시료를 준비하는 단계이다. 여기서, 상기 시료는 예를 들어, 카드뮴 노출/중독 여부를 진단하기 위한 피검체의 생물학적 시료로서, 피검체, 예를 들어 포유 또는 비포유 동물, 바람직하게 사람 또는 가축 등의 동물에서 분리된 조직 또는 세포이다. 상기 조직 또는 세포는 피검체의 전신에서 유래된 것일 수 있으나, 예를 들어 카드뮴에 노출되는 경로의 조직 또는 세포이거나 또는 카드뮴이 축적되는 기관의 조직 또는 세포이고, 예를 들어 구강, 기도, 폐, 식도, 위, 혈관, 혈액, 간, 신장 유래의 조직 또는 세포일 수 있다. 또 다르게는, 상기 시료는 병변이 발생하거나 또는 발생하는 것으로 알려진 또는 발생 위험이 있는 기관 또는 부위에서 얻어진 조직 또는 세포이다.
상기 진단 정보의 제공 방법에 있어서, 2) 상기 단계 1)의 시료에서 미토콘드리아를 분리하는 단계는, 당해 기술분야에서 알려진 통상적인 방법으로 이루어질 수 있고, 본 발명의 일 구체예에서, 상기 단계 1)의 세포들 각각에 수크로스 버퍼 (sucrose buffer)를 세포에 처리하여 용해 (lysis)한 후 homogenize를 사용하여 세포를 분해한 후 원심분리하여 상층액을 얻은 뒤 상기 상층액을 다시 원심분리하여 펠렛 (pellet)을 얻고 수크로스 버퍼로 현탁한 후 트립신 소화 (trypsin digestion) 방법으로 처리하였다. 이후 BSA로 중화 (neuralization)하고 원심분리 한 후 펠렛 (pellet)으로 분리된 미토콘드리아를 수득하는 방법을 통해 미토콘드리아를 분리하는 단계이다.
상기 진단 정보의 제공 방법에 있어서, 3) 상기 단계 2)에서 분리된 미토콘드리아의 STAT3(signal transducer and activator of transcription3) 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계는, 분리된 세포들의 미토콘드리아 STAT3 단백질 발현을 확인하는 단계로서, 상기 단계 3)의 STAT3 단백질 발현 수준의 측정은 웨스턴 블롯(western blot), 면역침강법(immunoprecipitation), 이중 루시퍼라제 측정법(dual luciferase reporter assay), 효소면역분석법(ELISA) 및 면역조직화학법(immunohistochemistry)으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 방법으로 측정할 수 있고, 본 발명의 일 구체예어서, 웨스턴 블롯 방법을 사용하여 단백질 변화를 측정하였다. 세포에서 분리된 미토콘드리아 단백질을 사용하여 웨스턴 블롯 방법으로 STAT3 항체와 미토콘드리아 complex 1 항체인 NDUFA9 (미토콘드리아 단백질에 대한 loading control)를 사용하여 단백질 변화를 측정하였다.
상기 진단 정보의 제공 방법에 있어서, 4) 상기 단계 3)에서 측정된 STAT3 단백질의 발현 수준을 카드뮴 노출/중독이 없는 정상 대조군과 비교하여 정상 대조군에 비해 감소된 미토콘드리아 STAT3 단백질 발현 수준으로 확인되는 경우, 카드뮴 노출/중독 관련 질환이 발병되었거나, 발병 위험이 있는 것으로 진단한다. 본 발명의 일 구체예에서, 상기 카드뮴 노출/중독 여부의 진단은 본 발명의 실험예 2 내지 8의 결과에서 확인되는 결과에 기초한다. 구체적으로, 카드뮴 처리 된 세포는 카드뮴 농도 의존적으로 세포 생존률이 감소하고, 미토콘드리아 STAT3 단백질 발현량이 저감되며, 미토콘드리아 형태 또한 변화하고, 세포의 활성산소 수준이 상승되는 것을 확인하였다. 나아가, 미토콘드리아 STAT3 단백질의 관련성을 명확히 하기 위해 미토콘드리아 STAT3 siRNA 처리하였을 때 활성산소 수준이 증가하는 것과 미토콘드리아 STAT3 넉아웃시켰을 경우 활성산소 수준이 증가하는 것을 확인하여, 카드뮴에 의한 활성산소와 미토콘드리아 STAT3 단백질의 관계를 규명하였다. 본 발명이 규명해낸 바를 통해 카드뮴 노출/중독 관련 질환이 발병되었거나, 발병 위험이 있는 것으로 판단되는 경우는 피검체의 세포의 미토콘드리아 STAT3 단백질 발현 수준이 감소되고, 이러한 STAT3 단백질 발현 수준 감소를 확인하는 것을 통하여 확인된다.
한편, 상기 단계 4)의 카드뮴 노출/중독이 없는 정상 대조군은 피검체에서 얻은 시료와 동일한 유래의 시료이되, 카드뮴 노출/중독 이력이 없는 시료, 카드뮴 노출/중독 관련 질환의 이력이 없는 시료, 또는 카드뮴 노출/중독 위험에 노출되지 않았던 정상의 생물학적 시료로서, 예를 들어 포유 또는 비포유 동물, 바람직하게 사람 또는 가축 등의 동물에서 분리된 조직 또는 세포이다. 이처럼 정상 대조군의 시료에서 얻은 미토콘드리아 STAT3 발현량과 시험군인 피검체의 시료에서 얻은 미토콘드리아 STAT3 발현량을 비교하여, 정상 대조군에 비해 감소된 미토콘드리아 STAT3 단백질 발현 수준으로 확인되는 경우, 카드뮴 노출/중독된 것으로 진단한다.
또 다르게는 카드뮴 노출/중독 관련 질환의 진단 정보의 제공은, 하나의 피검체로부터 얻은 시료 둘을 비교하여 제공될 수 있다. 예를 들어, 피검체가 카드뮴 노출/중독 위험이 있는 환경에 노출되어 있는 경우 또는 피검체가 카드뮴 노출/중독 관련 질환의 이력이 있는 경우, 시간 경과를 두고 최초 얻은 시료에서 미토콘드리아 STAT3 발현량과 소정의 시간 경과 후 얻은 시료에서 미토콘드리아 STAT3 발현량을 서로 비교하여 대조군(최초 얻은 시료)에 비해 감소된 미토콘드리아 STAT3 단백질 발현 수준으로 확인되는 경우, 카드뮴 노출/중독 관련 질환이 발병되거나, 발병 위험이 있는 것으로 진단한다.
나아가 또 다르게는 카드뮴 노출/중독 관련 질환의 진단 정보의 제공은, 하나의 피검체로부터 얻은 시료 둘을 비교하여 제공될 수 있다. 예를 들어, 피검체로부터 두 시료를 얻되, 하나는 카드뮴 노출/중독 경로가 되는 기관이나 카드뮴이 축적되는 기관에서 얻은 조직 또는 세포를 사용하고, 다른 하나는 카드뮴 노출/중독 경로나 축적되는 기관이 아닌 조직과 세포를 사용하여, 두 시료의 미토콘드리아 STAT3 발현량을 비교하여 대조군(카드뮴 노출/중독 경로나 축적되는 기관이 아닌 조직과 세포)에 비해 감소된 미토콘드리아 STAT3 단백질 발현 수준으로 확인되는 경우, 카드뮴 노출/중독된 것으로 진단한다.
전술된 예시 외에도 카드뮴 노출/중독 관련 질환 진단 정보의 제공은 본 발명에서 제공하는 미토콘드리아 STAT3 단백질 발현량 변화, 예를 들어 대조군 대비 감소된 발현량을 확인하는 방법에 의한 것인 바, 이를 통한 카드뮴 노출/중독 관련 질환의 진단 정보의 제공 방법은 본 발명에 포함된다.
본 발명의 상기 진단 정보의 제공은, 본 발명자들에 의해 규명 된 바와 같이, 세포가 카드뮴 노출/중독되는 경우, 세포 내 미토콘드리아의 STAT3 량의 감소 또는 미토콘드리아의 STAT3 발현량 저감을 확인하는 것으로부터 제공된다. 본 발명이 하술되는 이론에 제한되는 것은 아니나, 카드뮴에 노출/중독된 세포는 세포질에 존재하는 STAT3의 인산화와 STAT3의 미토콘드리아 내로의 유입을 막고, 미토콘드리아 내에 존재하는 STAT3 량이 감소되고, 미토콘드리아의 막이 열리고 활성산소의 증가가 초래된다. 상기한 예시적인 기전과 같이 카드뮴에 의해 노출/중독된 세포는 미토콘드리아의 기능 이상과 활성산소의 증가로부터 세포 괴사가 야기될 수 있고, 카드뮴으로 인하여 발병되는 것으로 알려져 있거나, 관계되 있는 것으로 규명된 바 있는 다양한 질환을 야기한다. 상술한 바와 같이, 본 발명에서 처음으로 규명한 사실로부터, 미토콘드리아의 STAT3 발현량 변화를 측정하는 것에 의해 카드뮴 노출/중독 관련 질환의 진단 정보가 제공된다.
상기 진단 정보의 제공 방법에 있어서, 상기 카드뮴 노출/중독 관련 질환은 예를 들어, 카드뮴 노출/중독증, 카드뮴 유래 간독성, 카드뮴 유래 신장결석, 카드뮴 유래 골연화증, 카드뮴 유래 호흡곤란, 카드뮴 유래 폐수종, 카드뮴 유래 폐렴, 카드뮴 유래 소화관 장애, 이타이이타이병, 카드뮴 유래 암 또는 종양, 카드뮴 유래 당뇨 및 카드뮴 유래 고혈압 중 어느 하나 이상이다.
본 발명의 일 구체예에서, 카드뮴 세포 처리 시 카드뮴의 농도 의존적으로 세포 생존률이 감소하는 것을 확인하였고, 카드뮴 처리 농도 의존적으로 미토콘드리아 STAT3 단백질 발현 수준이 감소하는 것을 확인하였다. 또한, 카드뮴 처리 시 미토콘드리아의 모양이 짧고, 동그랗게 변화가 일어남을 알 수 있고. 이를 정량적으로 분석했을 때 미토콘드리아의 길이가 짧아지는 것을 확인할 수 있다 (실험예 4 및 도 3, 4). 또한, 카드뮴 처리에 따른 미토콘드리아의 활성산소를 측정하였을 때, 마우스 유래 세포주 (MEFs), 인체 유래 세포주 전립선 (WPMY-1) 및 유방암 세포주 (MDA-MB231)에 10μg의 카드뮴을 처리하고 24시간이 지났을 때 카드뮴을 처리하지 않은 무처리 대조군에 비하여 활성산소가 증가되는 것을 확인할 수 있다 (실험예 5 및 도 5). 또한, STAT3 siRNA 처리 후 카드뮴에 대한 민감도를 분석하였을 때, 카드뮴 독성으로 유도된 활성 산소에 미토콘드리아 STAT3 단백질이 관여하는지 알아보지 위해 미토콘드리아 STAT3 siRNA를 처리하였고, STAT3 siRNA를 처리한 뒤 카드뮴을 처리하였을 때 세포생존률과 활성산소 수준을 측정한 결과 siRNA를 처리하지 않은 군과 비교한 경우 STAT3 siRNA를 처리한 군의 경우 세포 생존률이 카드뮴 처리 후 24시간, 48시간에서 20% 이상 감소하였고 (도 6), 미토콘드리아 내부의 활성산소 수준도 1.5배 이상 증가한 것을 확인할 수 있다 (도 7). 이를 통해 카드뮴에 의해 유도된 활성 산소, 세포 생존률과 관련된 신호 조절에 미토콘드리아의 STAT3 단백질에 관련되어 있음을 알 수 있다 (실험예 6 및 도 6, 7). 미토콘드리아 STAT3 siRNA 처리 후 카드뮴에 대한 민감도를 분석하였을 때, 인체 유래 전립성 세포주 (WPMY-1)에 있어서 실험예 6과 같은 실험을 수행한 결과로서, siRNA를 처리하지 않은 군과 비교한 경우 STAT3 siRNA를 처리한 군의 경우 세포 생존률이 감소하였고 (도 8), 미토콘드리아 내부의 활성산소 수준도 2배 이상 증가한 것을 확인할 수 있다 (도 9 및 10). 이를 통해 카드뮴에 의해 유도된 활성 산소, 세포 생존률과 관련된 신호 조절에 미토콘드리아의 STAT3 단백질에 관련되어 있음을 알 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면에서, 1) 피검체로부터 시간 차를 두고 두개 이상의 시료를 준비하는 단계; 2) 상기 단계 1)의 각각의 시료에서 미토콘드리아를 분리하는 단계; 3) 상기 단계 2)에서 분리된 미토콘드리아의 STAT3(signal transducer and activator of transcription3) 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 4) 상기 단계 3)에서 측정된 STAT3 단백질의 발현 수준을 비교하여 최초 얻은 시료에 비해 이후에 얻은 시료에서 감소된 미토콘드리아 STAT3 단백질 발현 수준이 확인되는 경우, 카드뮴 노출/중독 관련 질환의 예후가 좋지 않은 것으로 진단하는 단계를 포함하는 카드뮴 노출/중독 관련 질환 예후 예측 정보의 제공 방법을 제공한다.
이하, 본 발명의 카드뮴 노출/중독 관련 질환 예후 예측 정보의 제공 방법을 하술한 바와 같이, 단계별로 상세히 설명한다.
상기 예후 예측 정보의 제공 방법에 있어서, 1) 피검체로부터 시간 차를 두고 두개 이상의 시료를 준비하는 단계는, 미토콘드리아 STAT3 단백질 발현량 확인이 가능한 둘 이상의 시료를 준비하는 단계이다. 상기 시간 차는 이에 제한되지는 않으나, 최초 얻은 시료와 이후 얻은 시료의 시간 간격이 질환 예후를 판단하기에 충분한 시간이고, 예를 들어, 12시간 이상 경과, 24시간 이상 경과, 48시간 이상 경과, 3일 경과, 5일 경과, 10일 경과, 1개월 경과, 3개월 경과, 6개월 경과, 12개월 경과의 시간 차이를 두고 얻은 두개 이상의 시료일 수 있다.
여기서, 상기 시료는 예를 들어, 카드뮴 노출/중독 여부를 진단하기 위한 피검체의 생물학적 시료로서, 피검체, 예를 들어 포유 또는 비포유 동물, 바람직하게 사람 또는 가축 등의 동물에서 분리된 조직 또는 세포이다. 상기 조직 또는 세포는 피검체의 전신에서 유래된 것일 수 있으나, 예를 들어 카드뮴에 노출되는 경로의 조직 또는 세포이거나 또는 카드뮴이 축적되는 기관의 조직 또는 세포이고, 예를 들어 구강, 기도, 폐, 식도, 위, 혈관, 혈액, 간, 신장 유래의 조직 또는 세포일 수 있다. 또 다르게는, 상기 시료는 병변이 발생하거나 또는 발생하는 것으로 알려진 또는 발생 위험이 있는 기관 또는 부위에서 얻어진 조직 또는 세포이다.
상기 예후 예측 정보의 제공 방법에 있어서, 2) 상기 단계 1)의 각각의 시료에서 미토콘드리아를 분리하는 단계는, 당해 기술분야에서 알려진 통상적인 방법으로 이루어질 수 있고, 본 발명의 일 구체예에서, 상기 단계 1)의 세포들 각각에 수크로스 버퍼 (sucrose buffer)를 세포에 처리하여 용해 (lysis)한 후 homogenize를 사용하여 세포를 분해한 후 원심분리하여 상층액을 얻은 뒤 상기 상층액을 다시 원심분리하여 펠렛 (pellet)을 얻고 수크로스 버퍼로 현탁한 후 트립신 소화 (trypsin digestion) 방법으로 처리하였다. 이후 BSA로 중화 (neuralization)하고 원심분리 한 후 펠렛 (pellet)으로 분리된 미토콘드리아를 수득하는 방법을 통해 미토콘드리아를 분리하는 단계이다.
상기 예후 예측 정보의 제공 방법에 있어서, 3) 상기 단계 2)에서 분리된 미토콘드리아의 STAT3 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계는, 분리된 세포들의 미토콘드리아 STAT3 단백질 발현을 확인하는 단계로서, 상기 단계 3)의 STAT3 단백질 발현 수준의 측정은 웨스턴 블롯(western blot), 면역침강법(immunoprecipitation), 이중 루시퍼라제 측정법(dual luciferase reporter assay), 효소면역분석법(ELISA) 및 면역조직화학법(immunohistochemistry)으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 방법으로 측정할 수 있고, 본 발명의 일 구체예어서, 웨스턴 블롯 방법을 사용하여 단백질 변화를 측정하였다. 세포에서 분리된 미토콘드리아 단백질을 사용하여 웨스턴 블롯 방법으로 STAT3 항체와 미토콘드리아 complex 1 항체인 NDUFA9 (미토콘드리아 단백질에 대한 loading control)를 사용하여 단백질 변화를 측정하였다.
상기 예후 예측 정보의 제공 방법에 있어서, 4) 상기 단계 3)에서 측정된 STAT3 단백질의 발현 수준을 비교하여 최초 얻은 시료에 비해 이후에 얻은 시료에서 감소된 미토콘드리아 STAT3 단백질 발현 수준이 확인되는 경우, 카드뮴 노출/중독 관련 질환의 예후가 좋지 않은 것으로 진단한다. 본 발명의 일 구체예에서, 상기 카드뮴 노출/중독 관련 질환 예후의 진단은 본 발명의 실험예 2 내지 8의 결과에서 확인되는 결과에 기초한다. 구체적으로, 카드뮴 처리 된 세포는 카드뮴 농도 의존적으로 세포 생존률이 감소하고, 미토콘드리아 STAT3 단백질 발현량이 저감되며, 미토콘드리아 형태 또한 변화하고, 세포의 활성산소 수준이 상승되는 것을 확인하였다. 나아가, 미토콘드리아 STAT3 단백질의 관련성을 명확히 하기 위해 미토콘드리아 STAT3 siRNA 처리하였을 때 활성산소 수준이 증가하는 것과 미토콘드리아 STAT3 넉아웃시켰을 경우 활성산소 수준이 증가하는 것을 확인하여, 카드뮴에 의한 활성산소와 미토콘드리아 STAT3 단백질의 관계를 규명하였다. 본 발명이 규명해낸 바를 통해 카드뮴 노출/중독 관련 질환의 예후가 좋지 않은 것으로 판단되는 경우는 피검체의 세포의 미토콘드리아 STAT3 단백질 발현 수준이 최초 얻은 시료 대비 이후 얻은 시료에서 감소되고, 이러한 STAT3 단백질 발현 수준 감소를 확인하는 것을 통하여 확인된다.
전술된 예시 외에도 카드뮴 노출/중독 관련 질환 예후 예측 정보의 제공은 본 발명에서 제공하는 미토콘드리아 STAT3 단백질 발현량 변화, 예를 들어 최초 얻은 시료 대비 이후 얻은 시료에서 감소된 발현량을 확인하는 방법에 의한 것인 바, 이를 통한 카드뮴 노출/중독 관련 질환 예후 예측 정보의 제공 방법은 본 발명에 포함된다.
본 발명의 다른 측면에서, 1) 카드뮴에 노출/중독된 시료에 후보 약물을 처리하는 단계; 2) 상기 단계 1)의 시료에서 미토콘드리아를 분리하는 단계; 3) 분리된 미토콘드리아의 STAT3 단백질 발현 수준을 측정하는 단계; 및 4) 상기 단계 3)의 미토콘드리아 STAT3 단백질의 발현 수준을 후보 약물을 처리하지 않은 대조군에 비해 증가시키는 후보 약물을 선별하는 단계를 포함하는 카드뮴 노출/중독 관련 질환의 예방 또는 치료용 약물 스크리닝 방법을 제공한다.
이하, 본 발명의 카드뮴 노출/중독 관련 질환의 예방 또는 치료용 약물 스크리닝 방법을 하술한 바와 같이, 단계별로 상세히 설명한다.
상기 카드뮴 노출/중독 관련 질환의 예방 또는 치료용 약물 스크리닝 방법에 있어서, 1) 카드뮴에 노출/중독된 시료에 후보 약물을 처리하는 단계는 후보 약물을 카드뮴 노출/중독 이전에, 동시에, 또는 이후에 처리하는 단계로 이해될 수 있고, 예를 들어 탐색하고자 하는 약물의 용도에 따라 처리 시점을 선택할 수 있다. 본 발명의 일 구체예에서, 카드뮴 노출/중독 관련 질환의 예방용 약물을 스크리닝하기 위한 방법으로는 시료에 카드뮴 노출/중독 이전에 또는 동시에 후보 약물을 처리하는 방법으로 확인할 수 있고, 또는 카드뮴 노출/중독 관련 질환의 치료용 약물을 스크리닝하기 위한 방법으로는 시료에 카드뮴 노출/중독과 동시에 또는 이후에 후보 약물을 처리하는 방법으로 확인할 수 있다.
한편, 상기 단계 1의 시료는 전술된 시료, 생물학적 시료, 조직 또는 세포를 포함하는 것으로서, 중복된 설명은 생략한다. 일 구체예로, 상기 단계 1)의 시료는 세포로서, 카드뮴 처리된 인체 유래 전립선 세포주 (WPMY-1)와 유방암 세포주 (MDA-MD231) 및 마우스 유래 세포주 (Mouse Embryonic fibroblast, MEFs) 중 어느 하나이다.
상기 단계 1)의 카드뮴을 처리하는 단계는 카드뮴을 직접적으로 처리함으로써 카드뮴 노출/중독 관련 질환을 나타내는 단계이다. 구체적으로 상기 카드뮴 처리는 1 내지 40 μM, 더욱 구체적으로 4 내지 30 μM 의 CdCl2가 처리되는 것일 수 있다. 상기 카드뮴 처리가 1 μM 미만일 경우 카드뮴 노출/중독 관련 질환을 나타내기 어렵고, 40 μM초과의 경우 세포가 생존하기 어렵다.
상기 카드뮴 노출/중독 관련 질환의 예방 또는 치료용 약물 스크리닝 방법에 있어서, 상기 2) 상기 단계 1)의 시료에서 미토콘드리아를 분리하는 단계는 미토콘드리아 STAT3 단백질 발현량을 확인하기 위해 미토콘드리아를 분리하는 단계이다. 상기 미토콘드리아 분리는 기술분야에서 알려진 방법으로 이루어질 수 있다. 구체적으로, 상기 단계 1)의 세포들 각각에 수크로스 버퍼 (sucrose buffer)를 세포에 처리하여 용해 (lysis)한 후 homogenize를 사용하여 세포를 분해한 후 원심분리하여 상층액을 얻은 뒤 상기 상층액을 다시 원심분리하여 펠렛 (pellet)을 얻고 수크로스 버퍼로 현탁한 후 트립신 소화 (trypsin digestion) 방법으로 처리하였다. 이후 BSA로 중화 (neuralization)하고 원심분리 한 후 펠렛 (pellet)으로 분리된 미토콘드리아를 수득하는 방법을 통해 미토콘드리아를 분리하였다.
상기 카드뮴 노출/중독 관련 질환의 예방 또는 치료용 약물 스크리닝 방법에 있어서, 3) 분리된 미토콘드리아의 STAT3 단백질 발현 수준을 측정하는 단계는 예를 들어 웨스턴 블롯(western blot), 면역침강법(immunoprecipitation), 이중 루시퍼라제 측정법(dual luciferase reporter assay), 효소면역분석법(ELISA) 및 면역조직화학법(immunohistochemistry)으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나이다.
상기 카드뮴 노출/중독 관련 질환의 예방 또는 치료용 약물 스크리닝 방법에 있어서, 4) 상기 단계 3)의 미토콘드리아 STAT3 단백질의 발현 수준을 후보 약물을 처리하지 않은 대조군에 비해 증가시키는 후보 약물을 선별하는 단계는, 미토콘드리아 STAT3 단백질 발현량을 후보 약물이 처리되지 않은 시료의 대조군과 후보 약물이 처리된 시료의 시험군을 비교하여 시험군의 미토콘드리아 STAT3 단백질 발현량 감소를 막거나, 또는 발현량을 증가시킨 후보 약물을 선별하는 단계이다.
본 발명의 일 구체예에서, 멜라토닌은 카드뮴에 의한 미토콘드리아 STAT3 (mitoSTAT3) 단백질 발현량 감소를 막으며, 활성산소 증가를 방지하는 것으로서, 카드뮴 노출/중독 관련 질환의 예방 또는 치료용 신규 약물로 사용될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 멜라토닌의 카드뮴 유래 미토콘드리아 활성 산소 저감능을 확인하고자 무처리 대조군, 카드뮴 처리군, 멜라토닌 처리군, 카드뮴+멜라토닌 처리군에 대하여 세포 생존률과 활성산소 수준을 측정하였을 때, 카드뮴 처리군에 비하여 카드뮴+멜라토닌 처리군에서 세포 생존률이 상승하고, 활성산소 수준이 감소하는 것이 확인된다(도 11). 또한 미토콘드리아 STAT3 단백질 발현 변화를 확인한 결과 카드뮴 처리군에서는 STAT3 단백질 발현이 줄어들지만, 카드뮴+멜라토닌 처리군에 있어서는 STAT3 단백질 발현이 무처리 대조군 수준으로 회복되는 것이 확인된다(도 12). 또한, 카드뮴 처리군에서는 미토콘드리아 모양이 짧고 동그랗게 변하는데 비하여 카드뮴+멜라토닌 처리군은 미토콘드리아의 모양은 무처리 대조군의 미토콘드리아와 유사한 형태가 관찰된다(도 13). 이를 정량적으로 분석했을 때 카드뮴 처리군에서는 미토콘드리아의 길이가 짧아지나, 카드뮴+멜라토닌 처리군에서는 미토콘드리의 길이는 무처리군의 수준으로 회복되는 것이 확인된다(도 14). 또한, 이러한 결과는 인체의 전립선 세포주 (WPMY-1)에 있어서도 동일한 결과를 나타내어, 이를 통해 멜라토닌의 처리가 카드뮴에 의해 감소된 세포 생존률, 증가된 활성산소 수준, 감소된 STAT3 발현 수준 및 변화된 미토콘드리아의 형태를 정상수준으로 회복시킴을 알 수 있다.
이하 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명한다. 하술된 실시예는 본 발명을 설명하기 위한 일 예시일 뿐, 본 발명의 범위가 실시예로 한정되는 것은 아니다.
<실험예 1> 실험 세포주 준비
<실험예 1-1> 세포주의 준비
인체 유래 전립선 세포주 (WPMY-1)와 유방암 세포주 (MDA-MD231) 및 마우스 유래 세포주 (Mouse Embryonic fibroblast, MEFs)를 준비하였다.
<실험예 1-2> 카드뮴 및 멜라토닌의 준비
실험 세포주 준비에 사용되는 카드뮴운 CdCl2 (Sigma)를 사용하였고, 멜라토닌은 sigma에 구매하여 사용하였고, 실험 세포주의 준비에 사용하기 위해 상기 멜라토닌을 에탄올을 사용하여 농도 1 mM으로 적정하여 사용하였다.
<실험예 1-3> 실험 세포주의 준비
상기 각 세포주에 대하여 무처리 대조군, 카드뮴 처리군 (4, 5, 10, 15, 20 및 30 μM CdCl2), 멜라토닌 처리군 (1 mM 멜라토닌 처리) 및 카드뮴+멜라토닌 처리군 (1 mM 멜라토닌 처리 후 카드뮴 5, 10, 20 μM 처리)을 준비하였다.
<실험예 1-4> STAT3 siRNA 준비 및 형질전환
AccuTarget™ Genome-wide Predesigned siRNA (BioRP, 10 nmole) STAT3 siRNA (Bioneer, Cat#6774-3, sense CCGAGCCAAUUGUGAUGCU(dTdT)와 antisense AGCAUCACAAUUGGCUCGG(dTdT))를 Bioneer, Korea에서 구입하였다. 음성 대조군과 STAT3 siRNA를 lipofectamin rnaimax(ThermoFisher, Cat#13778100)와 1:3 비율로 Opti-MEM medium에 각각 섞는다. 15분후 6 웰 플레이트에 각각의 RNAi mixture를 처리한 후 48시간정도 배양 후 실험에 활용하였다.
<실험예 2> 카드뮴 처리 세포 생존률 분석
상기 실험예 1-3에서 준비된 무처리 대조군 및 카드뮴 처리군 (5, 10 및 20 μM CdCl2 처리)의 세포 생존률을 확인하였다. MTT assay 방법을 이용하여 세포 생존률을 측정하였다. 대조군과 카드뮴 처리군에 MTT 시약을 처리한 후 15분후에 세포를 세척하고 DMSO를 처리하여 염색약을 수확하여 마이크로플레이트리더기를 사용하여 흡광도를 측정하여 세포 생존률을 측정하였다.
그 결과, 도 1에서 확인되는 바와 같이 무처리 대조군에 비하여 카드뮴 처리군에서 세포 생존률이 감소하였고, 구체적으로 카드뮴 처리 농도 의존적으로 세포 생존률이 감소한 것을 확인하였다.
<실험예 3> 카드뮴 유도 미토콘드리아 단백질 발현 변화 분석
카드뮴 독성과 미토콘드리아의 상관 관계를 확인하기 위해 카드뮴 처리군에서 미토콘드리아 및 단백질 발현 변화를 확인하였다. 구체적으로 상기 실험예 1-3에서 준비된 무처리 대조군 및 카드뮴 처리군 (5, 10, 20 및 30 μM CdCl2 처리)의 미토콘드리아 단백질, 특히 STAT3 의 발현 수준을 확인하였고, 미토콘드리아의 분리 및 단백질 발현 분석은 아래의 절차로 진행하였다.
<실험예 3-1> 미토콘드리아 분리
카드뮴 처리군에서 세포를 모은 후 수크로스 버퍼 (sucrose buffer)를 세포에 처리하여 용해 (lysis)한 후 균질기(homogenize)를 사용하여 세포를 분해한 후 원심분리하여 상층액을 얻었다. 상기 상층액을 다시 원심분리하여 펠렛 (pellet)을 얻고 수크로스 버퍼로 현탁한 후 트립신 소화 (trypsin digestion) 방법으로 처리하였다. 이후 BSA로 중화 (neuralization)하고 원심분리 한 후 펠렛 (pellet)으로 분리된 미토콘드리아를 얻었다.
<실험예 3-2> 단백질 발현 분석
미토콘드리아의 단백질 발현 분석을 위하여 STAT3 항체와 로딩 컨트롤로 미토콘드리아 complex I marker (NDUFA9)와 complex V marker (ATP5A)를 사용하였다.
상기한 방법으로 카드뮴 유도 미토콘드리아 단백질 발현 변화를 분석한 결과, 도 2에서 확인되는 바와 같이 미처리 대조군에 비하여, 카드뮴 처리군 (5, 10, 20, 30, 40 및 45 μM CdCl2 처리)은 STAT3 발현량이 줄어들고, 구체적으로 카드뮴 농도 의존적으로 발현량이 감소되는 것을 확인할 수 있다.
<실험예 4> 카드뮴 처리에 따른 미토콘드리아 형태 변화 분석
카드뮴 처리에 따른 미토콘드리아의 형태 변화를 확인하기 위해 카드뮴 처리군의 미토콘드리아의 형태를 확인하였다. 구체적으로, 상기 실험예 1-3에서 준비된 무처리 대조군과 카드뮴 처리군(10 μM CdCl2 처리)을 준비하였고, 상기 세포들에서 실험예 3-1의 방법으로 미토콘드리아를 분리하였다.
카드뮴 처리군의 경우 카드뮴 처리 24시간 후 카드뮴을 제거하고 PBS로 세척한 후 Mitotacker를 처리하였으며, 이후 형광 현미경을 사용하여 미토콘드리아의 형태를 확인하였다. 무처리 대조군의 경우 mitotracker 처리 후 형광 현미경을 사용하여 미토콘드리아의 형태를 확인하였다.
그 결과, 도 3 및 4에서 확인되는 바와 같이 카드뮴 처리에 따른 미토콘드리아의 길이 변화를 확인할 수 있다. 구체적으로 카드뮴 처리 시 미토콘드리아의 모양이 짧고, 동그랗게 변화가 일어남을 알 수 있다(도 3). 이를 정량적으로 분석했을 때 미토콘드리아의 길이가 짧아지는 것을 확인할 수 있다(도 4).
<실험예 5> 카드뮴 처리에 따른 미토콘드리아의 활성산소 측정
상기한 실험예 3에서 확인되는 바와 같이 미토콘드리아의 STAT3 단백질 발현 감소는 활성산소의 증가로 유도되는 것으로 추측되어, 카드뮴 처리와 미토콘드리아 STAT3 단백질 발현 감소의 연관성을 확인하기 위해 아래의 실험이 수행되었다.
구체적으로, 무처리 대조군 마우스 유래 세포주 (MEFs) 및 카드뮴 처리 (20, 30 및 40 μM CdCl2)마우스 유래 세포주 (MEFs), 무처리 대조군 인체 유래 전립선 세포주 (WPMY-1) 및 카드뮴 처리 (10, 20, 30 및 40 μM CdCl2) 인체 유래 전립선 세포주 (WPMY-1) 및 무처리 대조군 인체 유래 유방암 세포주 (MDA-MD231) 및 카드뮴 처리 (5, 10 및 20 μM CdCl2) 인체 유래 유방암 세포주 (MDA-MD231)를 준비하였고, 이들 세포주의 미토콘드리아 특이적인 활성산소를 측정하기 위하여 MitoSoX 염색약을 사용하여 MitoSoX(SOD) 분석을 수행하여 활성산소를 측정하였다.
그 결과, 도 5에서 확인되는 바와 같이 마우스 유래 세포주 (MEFs), 인체 유래 세포주 전립선 (WPMY-1) 및 유방암 세포주 (MDA-MB231)에 카드뮴을 처리하고 24시간이 지났을 때 카드뮴을 처리하지 않은 무처리 대조군에 비하여 활성산소가 증가되는 것을 확인하였다.
<실험예 6> STAT3 siRNA 처리 후 카드뮴에 대한 민감도 분석
카드뮴 독성으로 유도된 활성산소 증가가 STAT3 단백질이 관여하는 지 확인하기 위해 STAT3 siRNA를 처리하여 불활성화 하고 카드뮴 처리를 하여 세포 생존률, 활성산소 증감을 확인하였다.
구체적으로 siRNA를 처리한 그룹과 처리하지 않은 그룹으로 나누고 카드뮴 무처리 대조군과 카드뮴 처리군 (20μM CdCl2)에 대하여 세포 생존률 및 활성산소를 측정하였다.
그 결과, 도 6 및 7에서 확인되는 바와 같이 STAT3 siRNA를 처리한 뒤 카드뮴을 처리하였을 때 세포생존률과 활성산소 수준을 측정한 결과 siRNA를 처리하지 않은 군과 비교한 경우 STAT3 siRNA를 처리한 군의 경우 세포 생존률이 카드뮴 처리 후 24시간, 48시간에서 20% 이상 감소하였고 (도 6), 미토콘드리아 내부의 활성산소 수준도 1.5배 이상 증가한 것을 확인할 수 있다 (도 7). 이를 통해 카드뮴에 의해 유도된 활성 산소, 세포 생존률과 관련된 신호 조절에 미토콘드리아의 STAT3 단백질에 관련되어 있음을 알 수 있다.
<실험예 7> STAT3 siRNA 처리 후 카드뮴에 대한 민감도 분석
인체 유래 전립선 세포주 (WPMY-1)에서도 카드뮴 독성으로 유도된 활성산소 증가가 STAT3 단백질이 관여하는 지 확인하기 위해 STAT3 siRNA를 처리하여 불활성화 하고 카드뮴 처리를 하여 세포 생존률, 활성산소 증감을 확인하였다. 구체적 실험 방법은 인체 유래 전립선 세포주 (WPMY-1)를 사용하고, 카드뮴 처리양 (10 μM CdCl2)을 제외한 실험방법은 상기한 실험예 6과 동일한 방법으로 수행하였다.
그 결과, 도 8 및 9에서 확인되는 바와 같이 siRNA를 처리하지 않은 군과 비교한 경우 STAT3 siRNA를 처리한 군의 경우 세포 생존률이 감소하였고(도 8), 미토콘드리아 내부의 활성산소 수준도 2배 이상 증가한 것을 확인할 수 있다(도 9). 이를 통해 카드뮴에 의해 유도된 활성 산소, 세포 생존률과 관련된 신호 조절에 미토콘드리아의 STAT3 단백질에 관련되어 있음을 알 수 있다.
<실험예 8> STAT3 넉아웃 세포주에서의 카드뮴 유도 활성산소 분석
마우스 유래 세포주 (Mouse Embryonic fibroblast, MEFs)에 대하여 카드뮴 독성으로 유도된 활성산소 증가가 STAT3 단백질이 관여하는지 확인하기 위해 STAT3 염기서열을 넉아웃 시켜 불활성화 하고 카드뮴 처리를 하여 활성산소 증감을 확인하였다.
구체적으로, 미국 Virginia Commonwealth University, Dr. Andrew Larner lab에서 녹 아웃 세포주를 분양 받아 사용하였고, 야생형, STAT3 넉아웃 마우스 유래 세포주 (Mouse Embryonic fibroblast, MEFs) 각각을 무처리 대조군 및 카드뮴 처리군 (30 μM CdCl2)으로 분류하였다. 각각의 세포에 대해 활성산소양을 측정하였고, 활성산소 측정방법은 상기한 실험예 5와 같다.
그 결과, 도 10에서 확인되는 바와 같이 STAT3 넉아웃 세포주는 카드뮴 처리 시 야생형 세포주에 비해 3배 이상 미토콘드리아 내부의 활성산소 수준이 증가하였다. 이를 통해 카드뮴에 의해 유도된 활성 산소, 세포 생존률과 관련된 신호 조절에 미토콘드리아의 STAT3 단백질에 관련되어 있음을 알 수 있다.
<실험예 9> 멜라토닌의 카드뮴 유래 미토콘드리아 활성 산소 저감능 및 미토콘드리아 STAT3 발현량 회복능 확인
전술한 바와 같이 카드뮴 처리에 의한 활성산소 수준 증가 및 활성산소 수준 증가에 관련된 미토콘드리아 STAT3의 역할을 확인하였다. 카드뮴 처리에 의한 활성산소 수준 증가 및 미토콘드리아 STAT3 발현 저감을 해결하는 물질의 필요성으로 인해, 증가된 활성산소의 수준을 저감시키는 물질을 스크리닝 하였고, 활성산소 저감능이 알려진 멜라토닌이 증가된 카드뮴 유래 미토콘드리아 활성 산소 수준 또한 저감하는지, 미토콘드리아 STAT3 발현을 회복하는지를 확인하였다.
구체적으로, 무처리 대조군, 카드뮴 처리군 (5, 10, 및 20 μM CdCl2) 및 멜라토닌 처리군 (1 mM 멜라토닌 처리) 및 카드뮴+멜라토닌 처리군 (1 mM 멜라토닌 처리 후 카드뮴 5, 10, 20 μM 처리)을 준비하였다. 이들의 카드뮴 농도별 세포 생존률, 활성산소 수준을 확인하고, 무처리 대조군, 카드뮴 처리군 (10 μM CdCl2), 멜라토닌 처리군 (1 mM 멜라토닌 처리) 및 카드뮴+멜라토닌 처리군 (1 mM 멜라토닌 처리 후 카드뮴 10 μM 처리)의 STAT3 단백질 발현능과 미토콘드리아 형태 변화를 분석하였다. 각각의 실험방법은 실험예 2, 실험예 3 및 실험예 5와 같다.
그 결과, 도 11 내지 도 14에서 확인되는 바와 같이 카드뮴 처리군에 비하여 카드뮴+멜라토닌 처리군에서 세포 생존률이 상승하고, 활성산소 수준이 감소하는 것을 확인할 수 있다(도 11). 또한 미토콘드리아 STAT3 단백질 발현 변화를 확인한 결과 카드뮴 처리군에서는 STAT3 단백질 발현이 줄어들지만, 카드뮴+멜라토닌 처리군에 있어서는 STAT3 단백질 발현이 무처리 대조군 수준으로 회복되는 것을 확인 할 수 있다(도 12). 또한, 카드뮴 처리군에서는 미토콘드리아 모양이 짧고 동그랗게 변하는데 비하여 카드뮴+멜라토닌 처리군은 미토콘드리아의 모양은 무처리 대조군의 미토콘드리아와 유사한 형태가 관찰되었다(도 13). 이를 정량적으로 분석했을 때 카드뮴 처리군에서는 미토콘드리아의 분열이 이루어지면서 미토콘드리아의 길이가 짧아지나, 카드뮴+멜라토닌 처리군에서는 미토콘드리아의 길이는 무처리군의 수준으로 회복되는 것을 확인할 수 있다(도 14). 이를 통해 멜라토닌의 처리가 카드뮴에 의해 감소된 세포 생존률, 증가된 활성산소 수준, 감소된 STAT3 발현 수준 및 변화된 미토콘드리아의 형태가 정상수준으로 회복시킴을 알 수 있다.
<실험예 10> 전립선 세포주에서의 멜라토닌 효과 분석
상기한 실험예 9의 실험 결과가 인체 유래 전립선 세포주 (WPMY-1)에서도 확인되는지를 수행하였다. 실험 세포주를 인체 유래 전립선 세포주 (WPMY-1)로 사용하는 것 이외에는 실험예 9에 기재된 방법으로 중 STAT3 단백질 발현능을 확인하였다. 또한, 미토콘드리아 단백질 loading control로 NDUFA9을 활용하였고 cytosol 단백질 loading control로 Tubulin을 사용하였다.
그 결과, 도 15에서 확인되는 바와 같이 카드뮴 처리군에서는 STAT3의 발현이 무처리군의 절반 수준으로 감소하나, 카드뮴+멜라토닌 처리군에서는 STAT3의 발현이 무처리군 수준으로 회복되었으며, cytosol에서 pS727-STAT3가 유지되는 것을 알 수 있다. 이를 통해 멜라토닌의 처리가 카드뮴에 의해 감소된 STAT3 발현 수준이 정상수준으로 회복시킴을 알 수 있다.
<실험예 11> 마우스 유래 배아섬유 세포주에서의 멜라토닌 효과 분석
상기한 실험예 9의 실험 결과가 마우스 배아섬유 세포주 (MEFs)에서도 확인되는지를 수행하였다. 실험 세포주를 마우스 배아섬유 세포주 (MEFs)로 사용하는 것 이외에는 실험예 9, 10에 기재된 방법으로 중 STAT3 단백질 발현능을 확인하였다. 또한, loading control로 NDUFA9을 활용하였다.
그 결과, 도 16에서 확인되는 바와 같이 카드뮴 처리군에서는 STAT3의 발현이 무처리군의 절반 수준으로 감소하나, 카드뮴+멜라토닌 처리군에서는 STAT3의 발현이 무처리군 수준으로 회복되는 것을 알 수 있다. 이를 통해 멜라토닌의 처리가 카드뮴에 의해 감소된 STAT3 발현 수준이 정상수준으로 회복시킴을 알 수 있다.

Claims (12)

1) 피검체로부터 시료를 준비하는 단계; 2) 상기 단계 1)의 시료에서 미토콘드리아를 분리하는 단계; 3) 상기 단계 2)에서 분리된 미토콘드리아의 STAT3(signal transducer and activator of transcription3) 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 4) 상기 단계 3)에서 측정된 STAT3 단백질의 발현 수준을 카드뮴 노출/중독이 없는 정상 대조군과 비교하여 정상 대조군에 비해 감소된 미토콘드리아 STAT3 단백질 발현 수준으로 확인되는 경우, 카드뮴 노출/중독된 것으로 판단하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 카드뮴 노출/중독 여부의 판단을 위한 정보의 제공 방법.
제1항에 있어서,
상기 단계 3)의 STAT3 단백질 발현 수준의 측정은 웨스턴 블롯(western blot), 면역침강법(immunoprecipitation), 이중 루시퍼라제 측정법(dual luciferase reporter assay), 효소면역분석법(ELISA) 및 면역조직화학법(immunohistochemistry)으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 방법으로 측정하는 것을 특징으로 하는 카드뮴 노출/중독 여부의 판단을 위한 정보의 제공 방법.
제1항에 있어서
상기 단계 4)의 정상 대조군은 피검체 시료와 동일한 기관, 조직 또는 세포 유래의 시료인 것을 특징으로 하는 카드뮴 노출/중독 여부의 판단을 위한 정보의 제공 방법.
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제1항에 있어서,
상기 단계 1)의 시간 차를 두고 두개 이상의 시료 준비는, 피검체에서 최초 시료를 얻은 시점에서 12시간 이상 경과 후 또 다른 시료를 더 준비하는 단계인 것을 특징으로 하는, 카드뮴 노출/중독 여부의 판단을 위한 정보의 제공 방법.
1) 카드뮴에 노출/중독된 시료에 후보 약물을 처리하는 단계; 2) 상기 단계 1)의 시료에서 미토콘드리아를 분리하는 단계; 3) 분리된 미토콘드리아의 STAT3 단백질 발현 수준을 측정하는 단계; 및 4) 상기 단계 3)의 미토콘드리아 STAT3 단백질의 발현 수준을 후보 약물을 처리하지 않은 대조군에 비해 증가시키는 후보 약물을 선별하는 단계를 포함하는 카드뮴 노출/중독 관련 질환의 예방 또는 치료용 약물 스크리닝 방법.
제8항에 있어서,
상기 단계 1)의 시료는 카드뮴 처리된 인체 유래 전립선 세포주 (WPMY-1)와 유방암 세포주 (MDA-MD231) 및 마우스 유래 세포주 (Mouse Embryonic fibroblast, MEFs) 중 어느 하나인 것을 특징으로하는 카드뮴 노출/중독 관련 질환의 예방 또는 치료용 약물 스크리닝 방법.
제8항에 있어서,
상기 카드뮴 처리는 1 내지 40 μM의 CdCl2가 처리되는 것을 특징으로 하는 카드뮴 노출/중독 관련 질환의 예방 또는 치료용 약물 스크리닝 방법.
제8항에 있어서,
상기 카드뮴 중독 관련 질환은 카드뮴 중독증, 카드뮴 유래 간독성, 카드뮴 유래 신장결석, 카드뮴 유래 골연화증, 카드뮴 유래 호흡곤란, 카드뮴 유래 폐수종, 카드뮴 유래 폐렴, 카드뮴 유래 소화관 장애, 이타이이타이병, 카드뮴 유래 암, 카드뮴 유래 당뇨 및 카드뮴 유래 고혈압 중 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 카드뮴 노출/중독 관련 질환의 예방 또는 치료용 약물 스크리닝 방법.
제8항에 있어서,
상기 단계 3)의 STAT3 단백질 발현 수준의 측정은 웨스턴 블롯(western blot), 면역침강법(immunoprecipitation), 이중 루시퍼라제 측정법(dual luciferase reporter assay), 효소면역분석법(ELISA) 및 면역조직화학법(immunohistochemistry)으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 방법으로 측정하는 것을 특징으로 하는 카드뮴 노출/중독 관련 질환의 예방 또는 치료용 약물 스크리닝 방법.
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Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MEIER, JEREMY A. et al., ‘Stress-induced dynamic regulation of mitochondrial STAT3 and its association with cyclophilin D reduce mitochondrial ROS production’ Science signaling, 2017, Vol. 10, pp 1-15*
WANG, YUDONG et al., ‘Cadmium inhibits the electron transfer chain and induces reactive oxygen species’, Free Radical Biology and Medicine, 2004, Vol. 36, pp 1434-1443. 1부.*
YANG, M. S. et al., ‘Increase in intracellular free/bound NAD[P]H as a cause of Cd-induced oxidative stress in the HepG2 cells’, Toxicology, 2008, Vol. 247, pp 6-10. 1부.*

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