KR102344395B1 - Method for Isolating and Preparing Nucleic Acid Using Magnetic Parcticle - Google Patents
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Abstract
본 발명은 자성 입자를 이용한 핵산 분리 정제 방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 (a) 핵산을 포함하는 생체 시료에 평균 입경 크기가 50nm ~ 1μm인 자성 입자를 첨가하여, 비용해성 응집물 또는 핵산분자와 상기 자성 입자를 결합시키는 단계; 및 (b) 비용해성 응집물 또는 핵산분자와 결합한 상기 자성 입자를 자기장을 이용하여 분리하여, 핵산을 수득하는 단계를 포함하는 자성 입자를 이용하여 생체 시료로부터 핵산 분리하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 자성 입자를 이용한 핵산 분리방법은 종래 방법보다 핵산 분리 시간을 획기적으로 단축시킬 수 있으며, 핵산 또는 단백질 분리 이후 과정에서도 실리카 자성 입자를 이용하여 빠른 시간 내에 정제를 완료함으로써 원심분리법이나 중력분리법 등에 비해 월등하게 빠른 시간 내에 전체 과정을 완료할 수 있으며, 수득율 또한 향상 시킬수 있는 장점이 있다.The present invention relates to a method for separating and purifying nucleic acids using magnetic particles, and more particularly, (a) adding magnetic particles having an average particle size of 50 nm to 1 μm to a biological sample containing nucleic acids to obtain insoluble aggregates or nucleic acid molecules and the binding magnetic particles; and (b) separating the magnetic particles bound to insoluble aggregates or nucleic acid molecules using a magnetic field to obtain nucleic acids.
The nucleic acid separation method using the magnetic particles of the present invention can significantly shorten the nucleic acid separation time compared to the conventional method, and even after the nucleic acid or protein separation process, the purification is completed within a short time using the silica magnetic particles, so that the centrifugation method or gravity separation method It has the advantage of being able to complete the entire process in a much shorter time compared to others, and improving the yield.
Description
본 발명은 자성 입자, 바람직하게는 소수성 자성 입자 또는 실리카 자성 입자를 이용한 핵산 분리 정제 방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 (a) 핵산을 포함하는 생체 시료에 평균 입경 크기가 50nm ~ 1μm인 자성 입자를 첨가하여, 비용해성 응집물 또는 핵산분자와 상기 자성 입자를 결합시키는 단계; 및 (b) 비용해성 응집물 또는 핵산분자와 결합한 상기 자성 입자를 자기장을 이용하여 분리하여, 핵산을 수득하는 단계;를 포함하는 자성 입자를 이용하여 생체 시료로부터 핵산 분리하는 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a nucleic acid separation and purification method using magnetic particles, preferably hydrophobic magnetic particles or silica magnetic particles, and more particularly, (a) magnetic particles having an average particle size of 50 nm to 1 μm in a biological sample containing nucleic acids by adding, binding the insoluble aggregates or nucleic acid molecules to the magnetic particles; and (b) separating the magnetic particles bound to insoluble aggregates or nucleic acid molecules using a magnetic field to obtain nucleic acids.
생물학적 물질에서 신속하고 빠르게 고순도의 핵산 또는 단백질을 분리, 정제하는 방법은 생화학 연구 및 진단 프로세스에 있어서 무엇보다 중요하다. 이를 위해 세포 용해 용액 내에 포함된 여러 종류의 물질들로부터 핵산 또는 단백질만을 선택적으로 효과적이고 재현성 있는 분리 방법에 대한 다양한 연구가 이루어져 왔다. A method for rapidly and rapidly isolating and purifying a high-purity nucleic acid or protein from a biological material is of utmost importance in biochemical research and diagnostic processes. To this end, various studies have been made on a method for selectively effective and reproducible separation of only nucleic acids or proteins from various types of substances included in the cell lysis solution.
최근에는 자성 입자를 이용하여 세포 혼합물에서 핵산 또는 단백질을 분리하는 연구가 활발히 진행 중이다. 자성 입자를 이용한 방법은 세포 혼합물에 자성 입자를 첨가해줌으로써, 핵산 또는 단백질과 자성 입자 사이에 결합을 유도하여 결합체를 형성시킨 후 외부 자기장을 이용하여 자성 입자와 결합된 핵산 또는 단백질만을 선택적으로 분리시키는 방법이다. 일반적으로 핵산 또는 단백질만을 선택적으로 분리 정제하는데 사용되는 자성 입자의 입자크기는 500 내지 2000nm 정도가 적당하다고 알려져 있다.Recently, research on separating nucleic acids or proteins from cell mixtures using magnetic particles is being actively conducted. In the method using magnetic particles, by adding magnetic particles to a cell mixture, binding between the nucleic acid or protein and the magnetic particle is induced to form a binder, and then only the nucleic acid or protein bound to the magnetic particle is selectively separated using an external magnetic field. way to do it In general, it is known that the particle size of magnetic particles used for selectively separating and purifying only nucleic acids or proteins is about 500 to 2000 nm.
미국 특허 5665554호에서는 게놈 DNA 물질에서 플라스미드 DNA를 분리시키는 방법으로 자성 비드와 자석을 이용하는 방법을 제시하고 있다. 상세하게는 플라스미드 DNA와 결합하는 자성 비드를 첨가하여 자성 비드와 플라스미드 DNA를 결합시켜 침전시키고 자석을 이용해 자성 비드와 플라스미드 DNA결합을 제외한 상층액을 제거하여 플라스미드 DNA만을 분리하는 방법이다.US Patent No. 5665554 discloses a method using magnetic beads and a magnet as a method of separating plasmid DNA from genomic DNA material. Specifically, it is a method of isolating only plasmid DNA by adding magnetic beads that bind to plasmid DNA, binding magnetic beads and plasmid DNA to precipitate, and removing the supernatant except for binding magnetic beads and plasmid DNA using a magnet.
미국 특허 6027945호에서는 실리카 자성 입자를 이용하여 생물학적 타겟 물질과 실리카 자성 입자의 결합체를 형성시킨 후 자기장을 제공해 줌으로써 타겟 물질을 분리하는 방법에 대해 제시하고 있으며, 실리카 자성 입자 1mg에 적어도 2ug의 타겟 물질이 결합되며 60%이상의 수득율을 제시하고 있다.U.S. Patent No. 6027945 discloses a method for separating a target material by providing a magnetic field after forming a combination of a biological target material and magnetic silica particles using silica magnetic particles, and at least 2ug of a target material per 1 mg of magnetic silica particles are combined, and a yield of more than 60% is presented.
미국 특허 7078224호에서는 1 ~ 15μm 사이즈의 자성 입자를 이용하는데, 상기 자성 입자는 pH 의존성 이온 교환 입자, 실리카 산화물로 코팅된 실리카 자성 입자를 이용하여 분리하는 방법을 제시하고 있다. 그러나, 이러한 실리카 코팅 자성 입자는 제조 과정이 복합하고, 입자 크기 분포를 균일하게 제어하기 어려운 문제점이 있다.In US Patent No. 7078224, magnetic particles having a size of 1 to 15 μm are used, and the magnetic particles are separated using pH-dependent ion exchange particles and silica magnetic particles coated with silica oxide. However, these silica-coated magnetic particles have problems in that the manufacturing process is complex and it is difficult to uniformly control the particle size distribution.
본 발명자들은 보다 쉽게 실리카 자성 입자를 제조하고, 입자크기를 균일하게 제어할 수 있는 새로운 제조방법을 개발하였으며(한국 등록특허 10-1053023호), 상기 방법에 의해 제조되는 실리카 자성 입자는 표면에 기능기를 갖으며 구형의 형태로 입자 크기 분포가 균일한 장점이 있으며. 그 입자 크기 또한 1 내지 20 μm로 제조된다. The present inventors have developed a new manufacturing method that can more easily manufacture silica magnetic particles and uniformly control the particle size (Korean Patent No. 10-1053023), and the magnetic silica particles produced by the method have a function on the surface It has a spherical shape and has the advantage of uniform particle size distribution. Its particle size is also prepared from 1 to 20 μm.
생물학적 시료에서 자성 입자와 결합된 핵산 또는 단백질만을 신속하게 분리하기 위해 외부에서 자기장을 보다 손쉽게 제공해주기 위한 다양한 제품도 다양하게 출시되고 있다. 일 예로 Maglisto(바이오니아사)는 생물학적 시료를 주입할 수 있는 튜브와 튜브가 고정되는 튜브고정부가 있으며, 튜브와 상응하는 외부 위치에서 자기장을 제공할 수 있는 자석고정부를 제공하고 있다. 이 때 제공되는 자석고정부도 튜브고정부와 용이하게 자석으로 탈부착이 가능하게 설계되어 있어, 사용자가 손쉽게 생물학적 물질에서 핵산 또는 단백질을 분리할 수 있는 장점이 있다. In order to quickly separate only nucleic acids or proteins bound to magnetic particles from a biological sample, various products are being released to provide a magnetic field from the outside more easily. As an example, Maglisto (Bioneer) has a tube into which a biological sample can be injected and a tube fixing part to which the tube is fixed, and a magnet fixing part capable of providing a magnetic field at an external position corresponding to the tube. The magnet fixing unit provided at this time is also designed to be easily detachable with a magnet from the tube fixing unit, so that the user can easily separate nucleic acids or proteins from biological materials.
그러나, 상기 방법들에서 사용되는 자성 입자는 비용해성 응집물 또는 타겟핵산과의 결합력이 충분하지 않아, 결합물질에 대한 결합력을 향상시킨 자성 입자의 개발이 요구되고 있다. However, the magnetic particles used in the above methods do not have sufficient binding force with the insoluble aggregate or the target nucleic acid, so the development of magnetic particles with improved binding force for the binding material is required.
이에, 본 발명자들은 자성 입자, 바람직하게는 소수성 자성 입자 또는 실리카 자성 입자를 이용하여 핵산을 분리하는 경우, 단백질 변성 응집물을 포함한 비용해성 응집물 또는 핵산분자를 보다 신속하고 효율적으로 분리할 수 있다는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.Accordingly, the present inventors confirmed that, when nucleic acids are separated using magnetic particles, preferably hydrophobic magnetic particles or silica magnetic particles, insoluble aggregates including protein-denatured aggregates or nucleic acid molecules can be separated more quickly and efficiently. and completed the present invention.
본 발명의 목적은 생체 시료로부터 비용해성 응집물 또는 타겟핵산을 보다 신속하고 효율적으로 분리할 수 있는 자성 입자를 이용하여 생체 시료로부터 핵산 분리하는 방법을 제공하는데 있다. An object of the present invention is to provide a method for separating nucleic acids from a biological sample using magnetic particles capable of more rapidly and efficiently separating insoluble aggregates or target nucleic acids from biological samples.
본 발명의 다른 목적은 상기 자성 입자를 이용한 생체 시료로부터 핵산을 전자동으로 분리하는 전자동 핵산 분리 장치를 제공하는데 있다. Another object of the present invention is to provide a fully automatic nucleic acid separation apparatus for fully automatically separating nucleic acids from a biological sample using the magnetic particles.
본 발명의 또다른 목적은 상기 자성 입자를 이용한 생체 시료로부터 핵산을 전자동으로 분리하는 전자동 핵산 분리 장치를 이용한 전자동 핵산 분리 방법을 제공하는데 있다. Another object of the present invention is to provide a fully automatic nucleic acid separation method using a fully automatic nucleic acid separation device for fully automatically separating nucleic acids from a biological sample using the magnetic particles.
본 발명의 또 다른 목적은 평균 입경 크기가 50 nm ~ 1μm인 자성 입자를 포함하는 생체시료로 부터 핵산 분리 정제용 키트를 제공하는데 있다. Another object of the present invention is to provide a kit for separation and purification of nucleic acids from a biological sample including magnetic particles having an average particle size of 50 nm to 1 μm.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 핵산을 포함하는 생체 시료에 평균 입경 크기가 50nm ~ 1μm인 자성 입자를 첨가하여, 비용해성 응집물 또는 핵산분자와 상기 자성 입자를 결합시키는 단계; 및 (b) 비용해성 응집물 또는 핵산분자와 결합한 상기 자성 입자를 자기장을 이용하여 분리하여, 핵산을 수득하는 단계;를 포함하는 자성 입자를 이용하여 생체 시료로부터 핵산 분리하는 방법을 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention comprises the steps of (a) adding magnetic particles having an average particle size of 50 nm to 1 μm to a biological sample containing a nucleic acid, thereby binding the magnetic particles to an insoluble aggregate or nucleic acid molecule; and (b) separating the magnetic particles bound to insoluble aggregates or nucleic acid molecules using a magnetic field to obtain nucleic acids.
본 발명은 또한, 수평방향 및 수직방향으로 이동 가능하게 설치되며, 다수의 피펫을 분리 가능하도록 장착하기 위한 피펫블록; 및 멀티웰 플레이트의 특정 단위 웰에 자기장을 인가 및 해제하기 위한 자기장 인가부;를 포함하고, 상기 멀티웰 플레이트에 생체시료와 평균 입경 크기가 50nm ~ 1μm인 자성 입자가 첨가되는 것을 특징으로 하는 생체 시료로부터 핵산을 전자동으로 분리하는 전자동 핵산 분리 장치를 제공한다.The present invention also includes a pipette block installed to be movable in a horizontal direction and a vertical direction, and for mounting a plurality of pipettes to be detachable; and a magnetic field applying unit for applying and releasing a magnetic field to a specific unit well of a multi-well plate, wherein the biological sample and magnetic particles having an average particle size of 50 nm to 1 μm are added to the multi-well plate. Provided is a fully automatic nucleic acid separation apparatus that fully automatically separates nucleic acids from a sample.
본 발명은 또한, 상기 전자동 핵산 분리 장치를 이용하여 생물학적 시료로부터 타겟핵산을 분리하는 방법으로서,The present invention also provides a method for isolating a target nucleic acid from a biological sample using the fully automatic nucleic acid separation device,
1) 자성 입자를 멀티 웰 플레이트의 특정 단위 웰에 첨가하여 타겟핵산을 제외한 비용해성 응집물 또는 핵산분자와 자성 입자를 결합시키는 단계;1) adding magnetic particles to a specific unit well of a multi-well plate to bind insoluble aggregates or nucleic acid molecules excluding the target nucleic acid to magnetic particles;
2) 비용해성 응집물 또는 핵산분자와 결합된 자성 입자를 제외한 타겟핵산을 함유한 혼합물을 수득하는 단계;2) obtaining a mixture containing a target nucleic acid excluding insoluble aggregates or magnetic particles bound to nucleic acid molecules;
3) 상기 수득된 혼합물에 친수성 자성 입자를 첨가하여 타겟핵산과 결합시키는 단계; 3) adding hydrophilic magnetic particles to the obtained mixture and binding to the target nucleic acid;
4) 타겟핵산이 결합된 친수성 자성 입자를 제외한 혼합물을 제거하는 단계; 및4) removing the mixture except for the hydrophilic magnetic particles to which the target nucleic acid is bound; and
5) 타겟핵산과 결합된 친수성 자성 입자에서 타겟핵산을 분리시키는 단계;5) separating the target nucleic acid from the hydrophilic magnetic particles bound to the target nucleic acid;
를 포함하는 것을 특징으로 하는 전자동 핵산 분리 방법을 제공한다.It provides a fully automatic nucleic acid separation method comprising a.
본 발명은 또한, 평균 입경 크기가 50nm ~ 1μm인 자성 입자를 포함하는 생체시료로부터 핵산 분리정제용 키트 및 장치를 제공한다.The present invention also provides a kit and apparatus for separation and purification of nucleic acids from a biological sample containing magnetic particles having an average particle size of 50 nm to 1 μm.
본 발명의 자성 입자, 바람직하게는 소수성 자성 입자 또는 실리카 자성 입자를 이용한 핵산 분리방법은 종래 방법보다 핵산 분리 시간을 획기적으로 단축시킬 수 있으며, 핵산 또는 단백질 분리 이후 과정에서도 실리카 나노 자성 입자를 이용하여 빠른 시간 내에 정제를 완료함으로써 원심분리법이나 중력분리법 등에 비해 월등하게 빠른 시간 내에 전체 과정을 완료할 수 있으며, 수득율 또한 향상시킬 수 있는 장점이 있다.The nucleic acid separation method using the magnetic particles of the present invention, preferably hydrophobic magnetic particles or silica magnetic particles, can significantly shorten the nucleic acid separation time compared to the conventional method, and use silica nanoparticles magnetic particles in the process after nucleic acid or protein separation. By completing the purification within a short time, the entire process can be completed in a much faster time than the centrifugal separation method or the gravity separation method, and there is an advantage in that the yield can also be improved.
도 1은 본 발명의 자성 입자를 사용하여 대장균 세포로부터 분리한 플라스미드 DNA를 제한효소 처리 후 아가로스 젤에 전기 영동한 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명의 방법을 이용하여 혈액에서 핵산 DNA을 추출하여 아가로스젤에 전기 영동한 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명의 방법을 이용하여 박테리아 배양액에서 핵산 DNA을 추출하여 아가로스젤에 전기 영동한 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 본 발명의 방법을 이용하여 배양된 세포에서 핵산 DNA을 추출하여 아가로스젤에 전기 영동한 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 본 발명의 방법을 이용하여 동물조직세포에서 핵산DNA을 추출하여 아가로스젤에 전기 영동한 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 본 발명의 방법을 이용하여 식물조직세포에서 핵산DNA을 추출하여 아가로스젤에 전기 영동한 결과를 나타낸 도이다.
도 7은 본 발명의 방법을 이용하여 배양된 다양한 세포에서 핵산 RNA을 추출하여 아가로스젤에 전기 영동한 결과를 나타낸 도이다.
도 8은 자동정제장치의 개략도이다.
도 9는 베이스 플레이트 사용 상태도이다.
도 10은 베이스 플레이트에 튜브랙이 장착된 상태도이다.
도 11은 베이스 플레이트 사용 상태도이다.
도 12는 본 발명의 실시예 6의 방법이 적용된 자성 입자를 분리하기 위한 자석부재장치이다.
도 13은 베이스 플레이트에 자석부재가 배치된 사용 상태도이다.
도 14는 자석부재가 배치된 베이스 플레이트에 멀티 웰 플레이트가 삽입배치된 단면도이다.
도 15는 자기장 인가부가 구비된 자석장착부에 대한 사시도이다.
도 16은 자성 입자를 이용한 타겟핵산 분리 방법에 대한 흐름도이다.
도 17은 같은 시료를 여러 개를 실시예 2와 같은 방법이 적용된 전자동 핵산추출장비로 추출을 진행하여 추출된 플라스미드를 아가로스 겔에 전기영동한 결과이다.
도 18은 플라스미드 핵산을 추출하고 삽입된 목적 유전자 주위의 특정 염기서열을 분리할 수 있는 제한효소로 처리하였을 때 목적 유전자의 크기만큼 적절히 절단되어 전기영동 상에서 확인한 결과이다.1 is a diagram showing the result of electrophoresis on an agarose gel after restriction enzyme treatment of plasmid DNA isolated from E. coli cells using the magnetic particles of the present invention.
2 is a diagram showing the results of electrophoresis on an agarose gel by extracting nucleic acid DNA from blood using the method of the present invention.
3 is a diagram showing the results of electrophoresis on an agarose gel by extracting nucleic acid DNA from a bacterial culture using the method of the present invention.
4 is a diagram showing the results of electrophoresis on an agarose gel by extracting nucleic acid DNA from cells cultured using the method of the present invention.
5 is a diagram showing the results of electrophoresis on an agarose gel after extracting nucleic acid DNA from animal tissue cells using the method of the present invention.
6 is a diagram showing the results of electrophoresis on an agarose gel after extracting nucleic acid DNA from plant tissue cells using the method of the present invention.
7 is a diagram showing the results of electrophoresis on an agarose gel by extracting nucleic acid RNA from various cells cultured using the method of the present invention.
8 is a schematic diagram of an automatic refining apparatus.
9 is a state diagram of a base plate in use.
10 is a state diagram in which the tube rack is mounted on the base plate.
11 is a diagram illustrating a state of using a base plate.
12 is a magnet member device for separating magnetic particles to which the method of Example 6 of the present invention is applied.
13 is a view showing a state of use in which a magnet member is disposed on a base plate.
14 is a cross-sectional view in which a multi-well plate is inserted into a base plate on which a magnet member is disposed.
15 is a perspective view of a magnet mounting unit provided with a magnetic field applying unit.
16 is a flowchart of a method for separating a target nucleic acid using magnetic particles.
17 is a result of electrophoresis of the extracted plasmid on an agarose gel by performing extraction of several of the same sample with a fully automatic nucleic acid extraction equipment to which the same method as in Example 2 is applied.
FIG. 18 shows the results confirmed on electrophoresis after the plasmid nucleic acid was extracted and treated with a restriction enzyme capable of separating a specific nucleotide sequence around the inserted target gene, appropriately cut to the size of the target gene.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다. Unless defined otherwise, all technical and scientific terms used herein have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art to which this invention belongs. In general, the nomenclature used herein is those well known and commonly used in the art.
본 발명은 일 관점에서, (a) 핵산을 포함하는 생체 시료에 평균 입경 크기가 50nm ~ 1μm인 자성 입자를 첨가하여, 비용해성 응집물 또는 핵산분자와 상기 자성 입자를 결합시키는 단계; 및 (b) 비용해성 응집물 또는 핵산분자와 결합한 상기 자성 입자를 자기장을 이용하여 분리하여, 핵산을 수득하는 단계;를 포함하는 자성 입자를 이용하여 생체 시료로부터 핵산 분리하는 방법에 관한 것이다. In one aspect, the present invention provides the steps of: (a) adding magnetic particles having an average particle size of 50 nm to 1 μm to a biological sample containing a nucleic acid, and binding the magnetic particles to an insoluble aggregate or nucleic acid molecule; and (b) separating the magnetic particles bound to insoluble aggregates or nucleic acid molecules using a magnetic field to obtain nucleic acids.
또한, 상기 단계 이후에 Also, after the above step
(c) (b) 단계에서 수득된 혼합물에 평균 입경 크기가 50nm ~ 1μm인 친수성 자성 입자를 첨가하여 타겟핵산과 친수성 자성 입자를 결합시키는 단계; 및(c) binding the target nucleic acid to the hydrophilic magnetic particles by adding the hydrophilic magnetic particles having an average particle size of 50 nm to 1 μm to the mixture obtained in step (b); and
(d) 타겟핵산과 결합한 친수성 자성 입자를 자기장을 이용하여 분리하여 타겟핵산을 수득하는 단계를 추가적으로 포함하여 생체시료로부터 핵산을 분리하는 방법에 관한 것이다.It relates to a method for isolating a nucleic acid from a biological sample, further comprising the step of (d) separating the hydrophilic magnetic particles bound to the target nucleic acid using a magnetic field to obtain the target nucleic acid.
상기 핵산은 DNA(deoxyribonucleic acid) 또는 RNA(ribonucleic acid)가 바람직하며, 게놈 DNA, 플라스미드 DNA, 파지 DNA, 유전자 재조합 DNA, mRNA, rRNA, tRNA, 유전자 재조합 RNA, micro RNA 등이 예시될 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명에서 수득되는 최종 타겟핵산은 바람직하게는 플라스미드 DNA, 박테리아의 게놈 DNA, 혈액 및 동식물 조직 DNA, 동물 세포주의 DNA 및 RNA로 구성된 군에서 선택되는 것일 수 있다.The nucleic acid is preferably DNA (deoxyribonucleic acid) or RNA (ribonucleic acid), genomic DNA, plasmid DNA, phage DNA, recombinant DNA, mRNA, rRNA, tRNA, recombinant RNA, micro RNA, etc. may be exemplified, The present invention is not limited thereto. The final target nucleic acid obtained in the present invention may be preferably selected from the group consisting of plasmid DNA, bacterial genomic DNA, blood and animal and plant tissue DNA, and animal cell line DNA and RNA.
본 발명에서 핵산 분리 방법은 원심 분리법, 진공 분리법(vacuum manifold type), 필터 분리법, 중력 분리법 또는 크로마토그래피법, 자기장을 이용한 분리법이 다양하게 적용될 수 있다. 이는 본 발명의 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 자명한 사항으로 상세한 설명은 생략하기로 한다. In the present invention, the nucleic acid separation method may be variously applied to a centrifugal separation method, a vacuum manifold type, a filter separation method, a gravity separation method or a chromatography method, and a separation method using a magnetic field. This is obvious to those of ordinary skill in the art, and a detailed description thereof will be omitted.
본 발명에 있어서, 상기 자성 입자는 소수성 자성 나노입자 또는 실리카 자성 나노입자 인 것을 특징으로 할 수 있다. In the present invention, the magnetic particles may be hydrophobic magnetic nanoparticles or silica magnetic nanoparticles.
상기 자성 입자는 철, 코발트, 니켈 및 그 산화물 또는 합금 등으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 물질로 제조될 수 있으며, 평균 크기는 50 nm ~ 1μm, 바람직하게는 50 ~ 700 nm, 가장 바람직하게는 200 ~ 500 nm로 제조되어 사용될 수 있다. The magnetic particles may be made of one or more materials selected from the group consisting of iron, cobalt, nickel and oxides or alloys thereof, and have an average size of 50 nm to 1 μm, preferably 50 to 700 nm, most preferably 200 It can be prepared and used at ~ 500 nm.
자성 입자의 직경이 1μm 이상이 되면 자성 입자의 침강속도가 빨라져 사용상 불편함을 초래하기 때문에 바람직하지 못하다. 또한, 직경이 50nm이하일 경우, 자성이 약해서 목적하는 물질과의 분리에 문제가 생길 수 있다. 입자의 형태는 원형, 사각형, 침형 등 다양한 형태의 입자 모두 사용 가능하다. When the diameter of the magnetic particles is 1 μm or more, it is not preferable because the sedimentation rate of the magnetic particles is increased, which causes inconvenience in use. In addition, when the diameter is 50 nm or less, the magnetic properties are weak, and there may be a problem in separation from the target material. As for the shape of the particle, all of various types of particles such as round, square, needle-shaped, etc. can be used.
본 발명에 있어서, 사용되는 친수성 자성 입자는 상기 자성 입자를 실리카 코팅하여 사용할 수 있다. 또한, 바이오니아에서 제조되는 AccuNanoBeadTM을 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 평균 크기는 50 nm ~ 1μm, 바람직하게는 50 ~ 700 nm, 가장 바람직하게는 200 ~ 500 nm로 사용될 수 있으며, 통상의 기술자들이 핵산을 분리, 정제하기 위해 사용하는 자성 입자를 광범위하게 사용할 수 있다. In the present invention, the hydrophilic magnetic particles used may be used by coating the magnetic particles with silica. In addition, AccuNanoBead TM manufactured by Bioneer can be used, but is not limited thereto, and the average size is 50 nm to 1 μm, preferably 50 to 700 nm, most preferably 200 to 500 nm. A wide range of magnetic particles used by technicians to isolate and purify nucleic acids are available.
상기 자성 입자는 그 자체로 사용하거나, 수용액에 분산되어 사용할 수 있으나, 수용액에 분산되어 사용하는 것이 자성 입자의 응집을 줄일 수 있을 뿐 아니라 실험 편의성 측면에서 보다 바람직하다. 이 때 수분산액은 자성 입자 자체의 응집 및 침강을 방지하기 위하여, 분산제를 더 함유하여 보관 및 사용될 수 있으며, 상기 분산제로는 글리세롤, 알콕실레이트, 알칸올아미드, 에스테르, 아민 옥사이드, 알킬 폴리길리코사이드, 폴리아크릴레이트, 폴리메타크릴레이트, 폴리비닐피롤리돈, 폴리에틸렌아민, 폴리비닐아민, 베타인, 글리시네이트 및 이미다졸린 및 글리세롤로 이루어진 군에서 선택된 1종이상의 분산제를 사용할 수 있다. The magnetic particles may be used by themselves or dispersed in an aqueous solution, but dispersion in an aqueous solution is more preferable in terms of not only reducing aggregation of magnetic particles but also experimental convenience. In this case, the aqueous dispersion may further contain a dispersing agent to prevent agglomeration and sedimentation of the magnetic particles themselves, and may be stored and used. Lycoside, polyacrylate, polymethacrylate, polyvinylpyrrolidone, polyethyleneamine, polyvinylamine, betaine, glycinate, and at least one dispersant selected from the group consisting of imidazoline and glycerol may be used. .
상기 자성 입자를 제공하는 단계는 The step of providing the magnetic particles is
ⅰ) 생체 시료에 직접 제공하는 단계i) providing directly to the biological sample
ⅱ) 생체 시료를 보전 처리하는 보전용액에 함께 섞어 제공하는 단계ii) providing a biological sample by mixing it with a preservation solution for preservation treatment
ⅲ) 생체 시료를 보전 처리하는 보전용액을 처리한 후 제공하는 단계iii) providing a preservation solution for preserving the biological sample after treatment
ⅳ) 생체 시료 용해를 위해 완충용액에 함께 섞어 제공하는 단계iv) providing the biological sample by mixing it with a buffer solution for dissolution
ⅴ) 생체 시료 용해를 위해 완충용액을 처리한 후 제공하는 단계ⅴ) providing a buffer solution after treatment for dissolution of the biological sample
ⅵ) 용해된 생체 시료에 단백질 변성 응집물을 형성시키기 위한 완충용액에 함께 섞어 제공하는 단계ⅵ) mixing and providing a buffer solution for forming protein-denatured aggregates in the dissolved biological sample
ⅶ) 단백질 변성 응집물이 형성된 용액에 제공하는 단계ⅶ) providing a solution in which protein-denatured aggregates are formed
에서 선택되는 어느 하나 이상의 단계에서 선택적으로 첨가되어 사용될 수 있으며, ⅱ) 생체 시료를 보전 처리하는 보전용액에 함께 섞어 제공하는 것이 자성 입자가 비용해성 응집물에 고르게 분포하여 핵산과의 분리 효과적인 측면에서 가장 바람직하다. It can be selectively added and used in any one or more steps selected from ii) The most effective way to separate from nucleic acids because magnetic particles are evenly distributed in insoluble aggregates to mix and provide a biological sample with a preservation solution. desirable.
또한, 상기 자성 입자를 첨가하는 단계를 응용함에 있어서, 본 발명에 따를 자성 입자를 포함하여 이루어지는 핵산 또는 단백질 추출용 키트에 적용하여 사용될 수 있다. In addition, in applying the step of adding the magnetic particles, it can be used by applying to a nucleic acid or protein extraction kit comprising the magnetic particles according to the present invention.
또한, 본 발명은 자성 입자와 결합된 비용해성 단백질 변성 응집물 및 세포 잔해 입자들과 핵산을 분리 분리시키는 방법에 있어서 자기장을 갖는 물질을 이용하는 방법을 제공하는 것이다. 이는 자성 입자가 갖는 자성의 성질을 이용하는 방법으로 비용해성 단백질 변성 응집물 및 세포 잔해 입자들과 결합된 자성 입자의 외부에 자기장을 제공해 줌으로써, 용이하게 응집물을 분리시킬 수 있는 장점을 갖는다. Another object of the present invention is to provide a method using a material having a magnetic field in a method for separating and separating nucleic acids from insoluble protein-denatured aggregates and cell debris particles bound to magnetic particles. This is a method that utilizes the magnetic properties of magnetic particles, and has the advantage of easily separating the aggregates by providing a magnetic field to the outside of the magnetic particles combined with insoluble protein-denatured aggregates and cell debris particles.
다른 관점에서, 본 발명은 수평방향 및 수직방향으로 이동 가능하게 설치되며, 다수의 피펫을 분리 가능하도록 장착하기 위한 피펫블록; 및 멀티웰 플레이트의 특정 단위 웰에 자기장을 인가 및 해제하기 위한 자기장 인가부;를 포함하고, 상기 멀티웰 플레이트에 생체시료와 평균 입경 크기가 50nm ~ 1μm인 자성 입자가 첨가되는 것을 특징으로 하는 생체 시료로부터 핵산을 전자동으로 분리하는 전자동 핵산 분리 장치에 관한 것이다. In another aspect, the present invention is a pipette block that is installed to be movable in the horizontal and vertical directions, and for mounting a plurality of pipettes to be detachable; and a magnetic field applying unit for applying and releasing a magnetic field to a specific unit well of a multi-well plate, wherein the biological sample and magnetic particles having an average particle size of 50 nm to 1 μm are added to the multi-well plate. It relates to a fully automatic nucleic acid separation device for fully automatically separating nucleic acids from a sample.
본 발명은 생물학적 시료로부터 핵산 또는 단백질을 분리, 정제하는데 있어 전자동 시스템인 자동정제장치를 이용하여 자동적으로 분리, 정제 할 수 있다. 상기 자동정제장치는 한국등록특허 제10-25135호, 한국공개특허 제2011-0121588호, 한국등록특허 제14-00675호에 기재된 장치 또는 바이오니아사에서 제조되는 Exiprep / Exiprogen을 사용할 수 있지만(도 8 내지 도 15 참조), 이에 한정되는 것은 아니며, 통상적으로 핵산 또는 단백질 등을 분리 정제할 수 있는 자동화 또는 반자동화 시스템에 제한없이 적용가능하다. The present invention can automatically separate and purify nucleic acids or proteins from biological samples by using an automatic purification apparatus that is a fully automatic system. The automatic purification device may use the device described in Korean Patent No. 10-25135, Korean Patent Publication No. 2011-0121588, and Korean Patent No. 14-00675 or Exiprep / Exiprogen manufactured by Bioneer (FIG. 8) 15), but is not limited thereto, and is generally applicable without limitation to an automated or semi-automated system capable of separating and purifying nucleic acids or proteins.
상기 자동정제장치는 수평방향 및 수직방향으로 이동 가능하게 설치되며, 유동성 물질이 흡입 및 토출되는 다수의 피펫을 분리 가능하도록 장착하기 위한 피펫블록; 베이스플레이트에 탑재되어 상기 피펫블록의 하방에 위치하는 멀티웰플레이트의 특정 단위 웰에 자기장을 인가 및 해제하기 위한 자기장 인가부를 포함하는 것을 특징으로 하는 자기장 인가부를 구비한 생물학적 시료 자동정제장치에 관한 것이다. The automatic purification device includes: a pipette block installed to be movable in a horizontal direction and a vertical direction, and for detachably mounting a plurality of pipettes through which a fluid material is sucked and discharged; It relates to an automatic biological sample purification apparatus equipped with a magnetic field applying unit, which is mounted on a base plate and includes a magnetic field applying unit for applying and releasing a magnetic field to a specific unit well of a multi-well plate located below the pipette block. .
본 발명은 상기 멀티웰플레이트의 상기 특정 단위 웰을 가열하기 위한 히팅부를 추가로 포함할 수 있고, 상기 자기장 인가부는, 자석이 장착되며 상기 멀티웰플레이트의 특정 단위 웰 하방에 위치하는 자석장착부; 상기 멀티웰플레이트의 특정 단위 웰에 자기장을 인가 및 해제하기 위하여 상기 자석장착부를 상승 및 하강시키는 승강부; 를 포함하고, 상기 히팅부는 상기 자석장착부에 설치될 수 있고, 상기 히팅부는 상기 자석장착부에 접촉 설치된 발열 필름일 수 있다.The present invention may further include a heating unit for heating the specific unit well of the multi-well plate, wherein the magnetic field applying unit includes a magnet mounting unit mounted with a magnet and positioned below a specific unit well of the multi-well plate; a lifting unit for raising and lowering the magnet mounting unit to apply and release a magnetic field to a specific unit well of the multi-well plate; Including, the heating unit may be installed in the magnet mounting unit, the heating unit may be a heating film installed in contact with the magnet mounting unit.
본 발명은 상기 피펫블록을 지지하는 고정몸체; 상기 고정몸체에 설치된 용액 받이대 이동수단에 의하여 수평방향으로 이동 가능하도록 설치되어 상기 피펫블록의 수평방향 이동시 상기 피펫블록에 장착된 상기 다수의 피펫 하방에 위치하는 용액 받이대; 를 포함할 수 있고, 상기 다수의 피펫 중 상기 타겟핵산을 포함한 용액에 적셔진 부분들이 외부와 차단되도록, 상기 다수의 피펫 하방에 위치한 상기 용액 받이대와 밀착되어 상기 다수의 피펫 중 상기 타겟핵산을 포함한 용액에 적셔진 부분들을 감싸도록 형성된 에어로졸방지대를 포함할 수 있다.The present invention provides a fixed body for supporting the pipette block; a solution receiver installed to be movable in a horizontal direction by a solution receiver moving means installed on the fixed body and positioned below the plurality of pipettes mounted on the pipette block when the pipette block is moved in the horizontal direction; may include, and is in close contact with the solution holder located under the plurality of pipettes so that parts of the plurality of pipettes soaked in the solution containing the target nucleic acid are blocked from the outside, and the target nucleic acid of the plurality of pipettes It may include an aerosol barrier formed to surround the parts wetted with the containing solution.
본 발명에 있어서, 상기 베이스플레이트에는 상기 피펫블록에 장착되기 위한 다수의 피펫이 삽착 수용되는 피펫랙, 분리된 상기 타겟핵산을 수용하기 위한 다수의 타겟핵산 보관용 튜브가 삽착 수용되는 제1 튜브랙 및 상기 피펫블록에 장착된 다수의 피펫으로부터 버려지는 폐액을 수용하기 위한 폐액통이 탑재될 수 있고, 상기 베이스플레이트에는 상기 제1 튜브랙을 냉각하기 위한 냉각블록이 탑재될 수 있다.In the present invention, the base plate has a pipette rack in which a plurality of pipettes for mounting on the pipette block are inserted and accommodated, and a plurality of target nucleic acid storage tubes for accommodating the separated target nucleic acids are inserted and received in the first tube rack. And a waste liquid container for accommodating waste liquid discarded from a plurality of pipettes mounted on the pipette block may be mounted, and a cooling block for cooling the first tube rack may be mounted on the base plate.
상기 자기장인가부는 자석봉이 장착된 자석부재가 추가적으로 포함될 수 있다. 상기 자석부재는 멀티웰 플레이트의 특정 단위 웰 하부에 장착할 수 있음으로써, 멀티웰 플레이트의 특정 단위 웰에서 형성된 자성 입자와 결합된 혼합물을 응집시켜 분리할 수 있게 한다.The magnetic field applying unit may additionally include a magnet member to which a magnetic rod is mounted. The magnet member can be mounted under a specific unit well of the multi-well plate, so that the mixture bound to the magnetic particles formed in the specific unit well of the multi-well plate can be agglomerated and separated.
상기 자동정제장치는 목적에 맞게 제조된 멀티 웰 플레이트를 사용하는 것을 특징으로 한다. 상기 멀티 웰 플레이트는 핵산 분리 정제를 위한 용액, 즉, DEPC 증류수, 세포 용해용액, 발현용액, 자성 입자 현탁액, 세척용액, 단백질 분해효소 등에서 선택되는 하나 이상의 용액을 포함하여 제조된다. 상기 핵산 분리 정제를 위한 용액들은 이에 한정된 것은 아니고 통상의 기술자들이 핵산 분리 정제를 위해 사용하는 광범위하게 모두 포함될 수 있다.The automatic purification apparatus is characterized in that it uses a multi-well plate manufactured for the purpose. The multi-well plate is prepared by containing one or more solutions selected from a solution for separation and purification of nucleic acids, that is, DEPC distilled water, cell lysis solution, expression solution, magnetic particle suspension, washing solution, protease, and the like. The solutions for isolation and purification of nucleic acids are not limited thereto, and may include a wide range of solutions used by those skilled in the art for isolation and purification of nucleic acids.
또 다른 관점에서, 본 발명은 전자동 핵산 분리 장치를 이용하여 생물학적 시료로부터 타겟핵산을 분리하는 방법으로서,In another aspect, the present invention provides a method for separating a target nucleic acid from a biological sample using a fully automatic nucleic acid separation device,
1) 자성 입자를 멀티 웰 플레이트의 특정 단위 웰에 첨가하여 타겟핵산을 제외한 비용해성 응집물 또는 핵산분자와 소수성 자성 입자를 결합시키는 단계;1) adding magnetic particles to a specific unit well of a multi-well plate to bind insoluble aggregates or nucleic acid molecules excluding the target nucleic acid to the hydrophobic magnetic particles;
2) 비용해성 응집물 또는 핵산분자와 결합된 자성 입자를 제외한 타겟핵산을 함유한 혼합물을 수득하는 단계;2) obtaining a mixture containing a target nucleic acid excluding insoluble aggregates or magnetic particles bound to nucleic acid molecules;
3) 상기 수득된 혼합물에 친수성 자성 입자를 첨가하여 타겟핵산과 결합시키는 단계; 3) adding hydrophilic magnetic particles to the obtained mixture and binding to the target nucleic acid;
4) 타겟핵산이 결합된 친수성 자성 입자를 제외한 혼합물을 제거하는 단계; 및4) removing the mixture except for the hydrophilic magnetic particles to which the target nucleic acid is bound; and
5) 타겟핵산과 결합된 친수성 자성 입자에서 타겟핵산을 분리시키는 단계; 5) separating the target nucleic acid from the hydrophilic magnetic particles bound to the target nucleic acid;
를 포함하는 것을 특징으로 하는 전자동 핵산 분리 방법에 관한 것이다. It relates to a fully automatic nucleic acid separation method comprising a.
상기 2)단계 또는 4)단계에서 비용해성 응집물 또는 핵산분자와 결합된 자성 입자 또는 타겟핵산과 결합된 친수성 자성 입자는 자동정제장치에 포함된 자기장 인가부에 의해 멀티 웰 플레이트 하부에 응집되어 분리될 수 있다.In step 2) or 4), the insoluble aggregate or magnetic particles bound to nucleic acid molecules or hydrophilic magnetic particles bound to target nucleic acid are aggregated at the bottom of the multi-well plate by the magnetic field applying unit included in the automatic purification device to be separated. can
또 다른 관점에서, 본 발명은 평균 입경 크기가 50nm ~ 1μm인 자성 입자, 바람직하게는 소수성 자성 입자 또는 실리카 자성 입자를 포함하는 생체시료로부터 핵산 분리정제용 키트에 관한 것이다. In another aspect, the present invention relates to a kit for separation and purification of nucleic acids from a biological sample comprising magnetic particles having an average particle size of 50 nm to 1 μm, preferably hydrophobic magnetic particles or silica magnetic particles.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail through examples. These examples are only for illustrating the present invention, and it will be apparent to those of ordinary skill in the art that the scope of the present invention is not to be construed as being limited by these examples.
실시예 1: 소수성 자성 입자 및 친수성 자성 입자의 제조Example 1: Preparation of hydrophobic magnetic particles and hydrophilic magnetic particles
본발명에서 사용한 소수성 자성 입자는 평균 400nm 정도의 제품(코스모신소재, SMT-01S)을 구입하여 사용하였다. 상기 자성 입자의 특성은 표면적 7.87 m2/g, 기공체적 0.01608 cm3/g, 기공크기 8.17nm을 갖는다. The hydrophobic magnetic particles used in the present invention were purchased and used with an average of about 400 nm (Cosmo Advanced Materials, SMT-01S). The magnetic particles have a surface area of 7.87 m 2 /g, a pore volume of 0.01608 cm 3 /g, and a pore size of 8.17 nm.
본발명에서 사용한 친수성 자성 입자는 평균 400nm 정도의 실리카 코팅 자성 입자 제품(바이오니아, AccuNanoBeadTM TA-1010)을 구입하여 사용하였다. 상기 친수성 자성 입자의 특성은 표면적 15.50 m2/g, 기공체적 0.02277 cm3/g, 기공크기 5.87nm을 갖는다. The hydrophilic magnetic particles used in the present invention were used after purchasing a silica-coated magnetic particle product (Bioneer, AccuNanoBead TM TA-1010) having an average of about 400 nm. The hydrophilic magnetic particles have a surface area of 15.50 m 2 /g, a pore volume of 0.02277 cm 3 /g, and a pore size of 5.87 nm.
실시예 2: 소수성 자성 입자를 이용한 핵산 추출Example 2: Nucleic acid extraction using hydrophobic magnetic particles
생체 시료로부터 핵산을 분리하기 위해 실시예 1의 소수성 자성 입자와 함께 단백질 변성 응집물과 세포 잔해 입자 및 크로모조멀 DNA(chromosomal DNA) 를 응집시킨 후 자석을 이용하여 핵산을 분리하고 이후 실리카 자성 입자와 자석을 이용하여 플라스미드 DNA를 정제한 후 흡광도 측정을 통해 수율과 순도를 확인하였다.To separate nucleic acids from biological samples, protein-denatured aggregates, cell debris particles, and chromosomal DNA were aggregated together with the hydrophobic magnetic particles of Example 1, and then the nucleic acids were separated using a magnet, and then the silica magnetic particles and After purifying the plasmid DNA using a magnet, the yield and purity were confirmed by measuring the absorbance.
생체 시료로는 암피실린 저항성 유전자가 삽입된 3.0kb의 pGEM-B1 vector (Bioneer, 한국)가 도입된 DH5α 대장균주를 사용하였다. 100㎍/ml의 암피실린이 포함된 LB 액체배지에 접종한 후 37℃에서 16시간 정도 진탕 배양하여 O.D600 값이 2.0이 되도록 배양하였다. 배양된 대장균 배양액 2ml을 원심분리하여 배양액과 대장균 세포를 분리하고 상등액을 제거하여 대장균 세포만 획득하였다.As a biological sample, a 3.0 kb pGEM-B1 vector (Bioneer, Korea) into which the ampicillin resistance gene was inserted was used in the DH5α E. coli strain. After inoculation in LB broth containing 100 μg/ml of ampicillin, incubated with shaking at 37° C. for 16 hours to obtain an O.D600 value of 2.0. 2ml of the cultured E. coli culture medium was centrifuged to separate the culture medium and E. coli cells, and only E. coli cells were obtained by removing the supernatant.
획득된 각각의 대장균 세포에 소수성 자성 입자와 RNase A가 포함된 보전 처리용 완충용액을 넣고 세포를 잘 풀어준 후 세포 용해용 완충용액을 넣고 잘 섞어 주었다. 마지막으로 중화용 완충용액을 넣고 잘 섞어 준 후 자석을 이용하여 용액과 비용해성 응집물을 분리하였다.To each of the obtained E. coli cells, a buffer solution for preservation treatment containing hydrophobic magnetic particles and RNase A was added, the cells were well released, and then a buffer solution for cell lysis was added and mixed well. Finally, a neutralization buffer solution was added, mixed well, and the solution and insoluble aggregates were separated using a magnet.
분리된 용액에 구아니딘 염산과 실리카 자성 입자를 첨가하여 섞어준 후 자석을 이용하여 상등액만 제거 한 후 에탄올을 이용해 다시 한번 씻어 주었다. 열풍기, 건열 건조기나 자연건조를 통해 남아있는 에탄올을 모두 제거한 후 물이나 TE 버퍼에 녹여 핵산을 회수하였다.After adding and mixing guanidine hydrochloric acid and magnetic silica particles to the separated solution, only the supernatant was removed using a magnet and washed again with ethanol. After removing all remaining ethanol through a hot air blower, dry heat dryer, or natural drying, the nucleic acid was recovered by dissolving it in water or TE buffer.
회수된 핵산은 분광광도계를 이용하여 DNA 수율과 순도를 확인하고 그 결과를 표 1에 나타내었다.The recovered nucleic acid was checked for DNA yield and purity using a spectrophotometer, and the results are shown in Table 1.
일반적으로 정제가 잘 된 깨끗한 상태의 핵산은 OD260nm/280nm가 1.8 이상이고 OD260nm/230nm가 2.0 이상일 때를 말한다. In general, nucleic acids in a well-purified and clean state refer to when OD260nm/280nm is 1.8 or more and OD260nm/230nm is 2.0 or more.
도 1과 표 1에 나타난 바와 같이, 소수성 자성 입자와 실리카 자성 입자를 이용하는 방법으로 실험하였을 때 모든 시료에서 OD260nm/280nm값은 1.8 이상이고 OD260nm/230nm 값은 2.0 이상을 유지하여 핵산이 깨끗하게 정제되었음을 확인하였다.As shown in Figure 1 and Table 1, when the method using magnetic hydrophobic particles and silica magnetic particles was tested, OD260nm/280nm values were 1.8 or more in all samples, and OD260nm/230nm values were 2.0 or more. Confirmed.
실시예 3: 소수성 자성 입자를 이용한 핵산분리와 필터를 이용한 핵산분리방법의 비교Example 3: Comparison of nucleic acid separation using hydrophobic magnetic particles and nucleic acid separation method using a filter
소수성 자성 입자를 처리하여 핵산을 분리하는 방법과 소수성 자성 입자를 사용하지 않은 핵산분리방법의 전체 실험 소요 시간을 비교하였다. The total experimental time was compared between the method of separating nucleic acids by treating hydrophobic magnetic particles and the method of separating nucleic acids without using the hydrophobic magnetic particles.
실시예 2에 따라 2ml의 대장균 세포를 준비하고, 동일하게 실험한 후 전체 소요시간을 계산하여 일반적으로 많이 사용하는 필터방식과 비교하였다.According to Example 2, 2 ml of E. coli cells were prepared, and after the same experiment, the total required time was calculated and compared with the commonly used filter method.
소요시간Biological sample dissolution and aggregation, nucleic acid and separation process
time taken
또한 생물시료를 용해 및 응집시켜 핵산과 분리하는 과정은 원심분리로 이루어지며 10분가량 원심분리를 해야 분리되기 때문에 이 과정에서 많은 시간이 소요된다.In addition, the process of dissolving and aggregating biological samples to separate them from nucleic acids is performed by centrifugation, and since centrifugation is required for about 10 minutes to separate, this process takes a lot of time.
반면 소수성 자성 입자를 사용하는 방법에서는 생물시료를 용해 및 응집시켜 핵산과 분리하는 과정이 자석을 이용해 짧은 시간 (1분 이내)에 완료 되고 정제 과정에서도 기계 사용 없이 자석을 이용하여 빠르게 과정을 완료할 수 있다.On the other hand, in the method using hydrophobic magnetic particles, the process of dissolving and aggregating the biological sample and separating it from the nucleic acid is completed in a short time (within 1 minute) using a magnet, and the purification process can be completed quickly using a magnet without using a machine. can
표 2에 나타난 바와 같이, 본 발명에 의한 핵산 분리과정은 필터 분리법에 비해 소요시간이 약 1/3로 줄어드는 효과를 나타내었다. As shown in Table 2, the nucleic acid separation process according to the present invention exhibited the effect of reducing the time required by about 1/3 compared to the filter separation method.
실시예Example 4: 소수성 자성 입자가 처리된 실험 방법을 이용하여 생물시료로부터 분리된 핵산의 효소활성 저해여부 확인 4: Confirmation of inhibition of enzymatic activity of nucleic acids isolated from biological samples using an experimental method treated with hydrophobic magnetic particles
실시예 2에서 분리된 플라스미드 1㎍을 바이오니아로부터 구입한 EcoRI 으로 37℃에서 1시간 동안 절단하고 1.0% 아가로스 젤에서 전기영동을 통해 제한효소에 의해 절단된 플라스미드 DNA의 크기가 3.0kb가 맞는지 확인하고, 실시예 1에서 제조된 소수성 자성 입자가 포함된 핵산 분리 방법에 의한 결과물이 효소 활성 저해요인을 포함하고 있는지 확인하여 그 결과를 도 1에 나타내었다.1 μg of the plasmid isolated in Example 2 was cut with Eco RI purchased from Bioneer at 37° C. for 1 hour, and the size of the plasmid DNA cut by restriction enzymes was 3.0 kb through electrophoresis on a 1.0% agarose gel. It was confirmed, and the result of the nucleic acid separation method containing the hydrophobic magnetic particles prepared in Example 1 was confirmed to contain enzyme activity inhibitory factors, and the results are shown in FIG. 1 .
도 1의 M레인은 사이즈 마커(size marker, 바이오니아사, 1kb ladder)이고, 레인 1~ 3은 본 발명에 의한 방법으로 분리한 플라스미드 DNA를 제한효소 (EcoRI) 처리한 실험구이다.M lane of FIG. 1 is a size marker (size marker, Bioneer Inc., 1 kb ladder), and
도 1의 전기영동 사진에서 볼 수 있듯이 본 발명에 의한 방법으로 분리된 플라스미드 DNA는 효소 활성에 아무런 저해 요소를 갖고 있지 않음을 알 수 있었다.As can be seen from the electrophoresis picture of FIG. 1 , it was found that the plasmid DNA isolated by the method according to the present invention did not have any inhibitory elements on enzyme activity.
실시예 5: 실리카 자성 나노 입자를 이용한 혈액 샘플의 핵산 추출 방법Example 5: Nucleic Acid Extraction Method of Blood Sample Using Silica Magnetic Nanoparticles
상기 실시예 2 방법을 동물의 혈액 샘플에서 다음과 같이 간편한 방법으로 응용하였다.The method of Example 2 was applied to animal blood samples in a simple manner as follows.
획득된 혈액 샘플에 구아니딘 염산과 계면활성제, 완충용액 혼합액을 넣고 잘 섞어준다. 다음에 프로티나아제 K를 넣고 60℃에서 10분간 단백질 분해 반응을 거친다. 다음에 용액에 에탄올을 첨가하여 섞고 실리카 자성 나노 입자까지 첨가하여 섞어준 후 자석을 이용하여 상등액만 제거 한 후 구아니딘 염산과 에탄올 혼합액, 염화나트륨과 에탄올 혼합액, 에탄올을 순차적으로 사용하여 실리카 자성입자를 씻어 준다. 열풍기, 건열 건조기나 자연건조를 통해 남아있는 에탄올을 모두 제거한 후 물이나 Tris 완충용액에 녹여 핵산을 회수하였다.Add guanidine hydrochloride, surfactant, and buffer solution to the obtained blood sample and mix well. Next, proteinase K is added and subjected to proteolysis at 60° C. for 10 minutes. Next, add ethanol to the solution and mix, add and mix silica magnetic nanoparticles, and then use a magnet to remove only the supernatant. give. After removing all remaining ethanol through a hot air blower, dry heat dryer or natural drying, the nucleic acid was recovered by dissolving it in water or Tris buffer solution.
도 2의 M은 바이오니아로부터 구입한 1kb ladder 제품으로 사이즈 마커(size marker)이고, 레인 1~ 4은 본 발명에 의한 방법으로 분리한 핵산 DNA를 전기영동하여 핵산의 농도 및 순도가 일정함을 확인하였다.M in FIG. 2 is a 1kb ladder product purchased from Bioneer, which is a size marker, and
실시예 6: 실리카 자성 나노 입자를 이용한 배양된 박테리아 샘플의 핵산 추출 방법Example 6: Nucleic Acid Extraction Method of Cultured Bacterial Sample Using Silica Magnetic Nanoparticles
상기 실시예 2 방법을 배양시킨 박테리아 샘플에서 다음과 같이 응용하였다.The method of Example 2 was applied to cultured bacterial samples as follows.
배양시킨 박테리아가 있는 배양액 샘플을 고속으로 원심분리하여 박테리아 침전물을 얻는다. 이는 실시예2 방법 중 생체시료에서 대장균 세포를 얻는 과정과 유사하다. 얻어진 침전물은 박테리아 종류 중 그람양성의 경우 라이소자임 효소와 그람양성 전용 완충액과 을 섞어 37℃에서 30분간 반응시키고 프로티나아제 K 와 구아니딘 염산과 계면활성제, 완충용액 혼합액을 첨가하여 60℃에서 30분간 반응시킨다. 박테리아중 그람음성은 침전물에서 세포분해용 완충액 을 넣고 잘 섞는다. 다음에 프로티나아제 K를 넣고 60℃에서 10분간 단백질 분해 반응을 거친다. 다음에 용액에 구아니딘 염산과 계면활성제, 완충용액 혼합액을 넣어 섞는다. 이후 박테리아 그람 양성, 음성 모두 같은 방법으로, 에탄올을 첨가하여 섞은 다음 실리카 자성 나노 입자까지 첨가하여 섞어준 후 자석을 이용하여 상등액만 제거 한 후 구아니딘 염산과 에탄올 혼합액, 염화나트륨과 에탄올 혼합액, 에탄올을 순차적으로 사용하여 실리카 자성입자를 씻어 준다. 열풍기, 건열 건조기나 자연건조를 통해 남아있는 에탄올을 모두 제거한 후 물이나 Tris 완충용액에 녹여 핵산을 회수하였다.A culture sample containing the cultured bacteria is centrifuged at high speed to obtain a bacterial precipitate. This is similar to the process of obtaining E. coli cells from a biological sample in the method of Example 2. In the case of gram-positive among bacterial types, the resulting precipitate is mixed with a lysozyme enzyme and a gram-positive buffer solution and reacted at 37°C for 30 minutes. make it Among the gram-negative bacteria, add a cell lysis buffer from the precipitate and mix well. Next, proteinase K is added and subjected to proteolysis at 60° C. for 10 minutes. Next, add guanidine hydrochloride, a surfactant, and a buffer solution to the solution and mix. After that, in the same way for both gram-positive and negative bacteria, ethanol was added and mixed, and then silica magnetic nanoparticles were added and mixed, and then only the supernatant was removed using a magnet. Then, guanidine hydrochloric acid and ethanol mixture, sodium chloride and ethanol mixture, and ethanol were sequentially added. to wash the silica magnetic particles. After removing all remaining ethanol through a hot air blower, dry heat dryer or natural drying, the nucleic acid was recovered by dissolving it in water or Tris buffer solution.
도 3의 M은 바이오니아로부터 구입한 1kb ladder 제품으로 사이즈 마커(size marker)이고, 레인 1~ 2은 본 발명에 의한 방법으로 분리한 핵산 DNA를 전기영동하여 핵산의 농도 및 순도가 일정함을 확인하였다.M in FIG. 3 is a 1kb ladder product purchased from Bioneer and is a size marker, and
실시예 7: 실리카 자성 나노 입자를 이용한 배양 세포의 핵산 추출 방법Example 7: Nucleic acid extraction method of cultured cells using silica magnetic nanoparticles
상기 실시예 2 방법을 배양된 세포 샘플에서 다음과 같은 방법으로 응용하였다.The method of Example 2 was applied to the cultured cell sample in the following way.
배양된 세포와 배양액이 섞인 샘플을 10분간 중력가속도의 3000배 정도의 속도로 원심분리하여 상층액을 모두 제거하고 인산완충액(PBS)를 넣어 재부유시킨다. 프로티나아제 K 와 구아니딘 염산과 계면활성제, 완충용액 혼합액을 첨가하여 60℃에서 10분간 단백질 분해 반응을 거친다. 다음에 용액에 에탄올을 첨가하여 섞고 실리카 자성 나노 입자까지 첨가하여 섞어준 후 자석을 이용하여 상등액만 제거 한 후 구아니딘 염산과 에탄올 혼합액, 염화나트륨과 에탄올 혼합액, 에탄올을 순차적으로 사용하여 실리카 자성입자를 씻어 준다. 열풍기, 건열 건조기나 자연건조를 통해 남아있는 에탄올을 모두 제거한 후 물이나 Tris 완충용액에 녹여 핵산을 회수하였다.A sample mixed with cultured cells and culture medium is centrifuged at a speed of 3000 times the acceleration of gravity for 10 minutes to remove all of the supernatant and resuspended by adding phosphate buffer (PBS). Proteinase K, guanidine hydrochloric acid, surfactant, and buffer solution are added, and proteolytic reaction is performed at 60° C. for 10 minutes. Next, add ethanol to the solution and mix, add and mix silica magnetic nanoparticles, and then use a magnet to remove only the supernatant. give. After removing all remaining ethanol through a hot air blower, dry heat dryer or natural drying, the nucleic acid was recovered by dissolving it in water or Tris buffer solution.
도 4의 M은 바이오니아로부터 구입한 1kb ladder 제품으로 사이즈 마커(size marker)이고, 레인 1~ 4은 본 발명에 의한 방법으로 분리한 핵산 DNA를 전기영동하여 핵산의 농도 및 순도가 일정함을 확인하였다.M in FIG. 4 is a 1kb ladder product purchased from Bioneer, which is a size marker, and
실시예 8: 실리카 자성 나노 입자를 이용한 동물조직의 핵산 추출 방법Example 8: Nucleic acid extraction method from animal tissue using magnetic silica nanoparticles
상기 실시예 2 방법을 채취된 동물조직 샘플에서 다음과 같은 방법으로 응용하였다.The method of Example 2 was applied to the collected animal tissue samples in the following way.
채취된 동물조직 샘플을 액체질소로 급속냉동시켜 조직파쇄기, 믹서를 사용하여 최대한 가루가 되도록 파쇄시킨다. 가루가 된 조직 샘플 20mg을 프로티나아제 K 와 조직용해액을 첨가하여 60℃에서 10분간 단백질 분해 반응을 거친다. 다음에 용액에 구아니딘 염산과 계면활성제, 완충용액 혼합액을 첨가하여 최대한 골고루 섞고 에탄올을 첨가하여 섞은 다음 실리카 자성 나노 입자까지 첨가하여 섞어준 후 자석을 이용하여 상등액만 제거 한 후 구아니딘 염산과 에탄올 혼합액, 염화나트륨과 에탄올 혼합액, 에탄올을 순차적으로 사용하여 실리카 자성입자를 씻어 준다. 열풍기, 건열 건조기나 자연건조를 통해 남아있는 에탄올을 모두 제거한 후 물이나 Tris 완충용액에 녹여 핵산을 회수하였다.The collected animal tissue samples are rapidly frozen in liquid nitrogen, and then crushed to as powder as possible using a tissue shredder or mixer. Proteinase K and tissue lysate are added to 20 mg of the powdered tissue sample and subjected to proteolysis at 60° C. for 10 minutes. Next, add a mixture of guanidine hydrochloric acid, surfactant, and buffer solution to the solution, mix as much as possible, add ethanol to mix, and then add magnetic silica nanoparticles to mix, remove only the supernatant using a magnet, Wash the silica magnetic particles sequentially using a mixture of sodium chloride, ethanol, and ethanol. After removing all remaining ethanol through a hot air blower, dry heat dryer or natural drying, the nucleic acid was recovered by dissolving it in water or Tris buffer solution.
도 5의 M은 바이오니아로부터 구입한 1kb ladder 제품으로 사이즈 마커(size marker)이고, 레인 1~ 4은 본 발명에 의한 방법으로 분리한 핵산 DNA를 전기영동하여 핵산의 농도 및 순도가 일정함을 확인하였다.M in FIG. 5 is a 1kb ladder product purchased from Bioneer, which is a size marker, and
실시예 9: 실리카 자성 나노 입자를 이용한 식물조직의 핵산 추출 방법Example 9: Nucleic Acid Extraction Method of Plant Tissue Using Magnetic Silica Nanoparticles
상기 실시예 2 방법을 채취된 식물조직 샘플에서 다음과 같은 방법으로 응용하였다.The method of Example 2 was applied to the collected plant tissue samples in the following way.
채취된 식물조직 샘플을 액체질소로 급속냉동시켜 조직파쇄기, 믹서를 사용하여 최대한 가루가 되도록 파쇄시킨다. 가루가 된 조직 샘플 100mg을 프로티나아제 K 와 계면활성제가 첨가된 조직용해액을 첨가하여 60℃에서 10분간 단백질 분해 반응을 거친다. 다음에 용액에 초산과 완충용액 혼합액을 첨가하여 최대한 골고루 섞고 10분간 얼음에 둔 후, 고속으로 원심분리하여 상층액을 새로운 튜브에 옮긴다. 상층액에 구아니딘 염산과 에탄올 혼합액을 첨가하여 섞은 다음 실리카 자성 나노 입자까지 첨가하여 섞어준 후 자석을 이용하여 상등액만 제거 한 후 구아니딘 염산과 에탄올 혼합액, 염화나트륨과 에탄올 혼합액, 에탄올을 순차적으로 사용하여 실리카 자성입자를 씻어 준다. 열풍기, 건열 건조기나 자연건조를 통해 남아있는 에탄올을 모두 제거한 후 물이나 Tris 완충용액에 녹여 핵산을 회수하였다.The collected plant tissue samples are rapidly frozen with liquid nitrogen, and then crushed to as powder as possible using a tissue shredder or mixer. A tissue lysate containing proteinase K and surfactant is added to 100 mg of the powdered tissue sample and subjected to proteolysis at 60° C. for 10 minutes. Next, add acetic acid and buffer solution to the solution, mix as much as possible, and place on ice for 10 minutes, centrifuge at high speed and transfer the supernatant to a new tube. Add and mix guanidine hydrochloric acid and ethanol mixture to the supernatant, then add magnetic silica nanoparticles to mix, remove only the supernatant using a magnet, and sequentially use guanidine hydrochloric acid and ethanol mixture, sodium chloride and ethanol mixture, and ethanol to silica Wash the magnetic particles. After removing all remaining ethanol through a hot air blower, dry heat dryer or natural drying, the nucleic acid was recovered by dissolving it in water or Tris buffer solution.
도 6의 M은 바이오니아로부터 구입한 1kb ladder 제품으로 사이즈 마커(size marker)이고, 레인 1~ 4은 본 발명에 의한 방법으로 분리한 핵산 DNA를 전기영동하여 핵산의 농도 및 순도가 일정함을 확인하였다.M in FIG. 6 is a 1kb ladder product purchased from Bioneer and is a size marker, and
실시예 10: 실리카 자성 나노 입자를 이용한 배양 세포의 핵산 RNA 추출 방법Example 10: Nucleic acid RNA extraction method of cultured cells using silica magnetic nanoparticles
상기 실시예 2 방법을 배양된 세포 샘플에서 다음과 같은 방법으로 응용하였다.The method of Example 2 was applied to the cultured cell sample in the following way.
배양된 세포와 배양액이 섞인 샘플을 모두 수집하여 5분간 중력가속도의 300배 정도의 속도로 원심분리하여 상층액을 모두 제거하고 구아니딘 염산과 계면활성제, 완충용액 혼합액을 첨가하고 1분 이상 골고루 섞어 세포파쇄과정을 거친다. 다음에 용액에 에탄올을 첨가하여 섞고 실리카 자성 나노 입자까지 첨가하여 섞어준 후 자석을 이용하여 상등액만 제거 한 후 구아니딘 염산과 에탄올 혼합액, 염화나트륨과 에탄올 혼합액, 에탄올을 순차적으로 사용하여 실리카 자성입자를 씻어 준다. 열풍기, 건열 건조기나 자연건조를 통해 남아있는 에탄올을 모두 제거한 후 물이나 Tris 완충용액에 녹여 핵산을 회수하였다.Collect all samples of the cultured cells and culture solution, centrifuge at a speed of 300 times the acceleration of gravity for 5 minutes to remove all of the supernatant, add guanidine hydrochloride, surfactant, and buffer solution, and mix evenly for 1 minute or more. through the crushing process. Next, add ethanol to the solution and mix, add and mix silica magnetic nanoparticles, and then use a magnet to remove only the supernatant. give. After removing all remaining ethanol through a hot air blower, dry heat dryer or natural drying, the nucleic acid was recovered by dissolving it in water or Tris buffer solution.
도 7의 레인 1~ 4은 본 발명에 의한 방법으로 분리한 배양된 다양한 세포의 핵산 RNA를 전기영동하여 핵산의 농도 및 순도가 일정함을 확인하였다.In
실시예 11: 실리카 자성 나노 입자 처리를 이용한 다양한 샘플의 핵산 추출 방법Example 11: Nucleic Acid Extraction Method of Various Samples Using Silica Magnetic Nanoparticle Treatment
상기 실시예 2 방법을 다양한 샘플의 핵산 추출 방법에 보다 간편한 방법으로 응용하였다.The method of Example 2 was applied as a simpler method to the method for extracting nucleic acids from various samples.
획득한 혈액 샘플, 액체 배지에서 배양된 동물 세포주, 동물조직 및 식물조직 등 에 전처리용 세포 용해용 완충용액을 넣고 잘 섞어준다. 이 때, 동식물의 조직세포들은 완충용액 외에도 프로티나아제 등의 단백질 분해 단계를 진행할 수 있다. 그 다음, 용액에 구아니딘 염산과 실리카 자성 나노 입자, 에탄올을 첨가하여 섞어준 후 자석을 이용하여 상등액만 제거 한 후 구아니딘 염산과 에탄올 혼합액, 염화나트륨과 에탄올 혼합액, 에탄올을 순차적으로 사용하여 실리카 자성입자를 씻어 주었다. 열풍기, 건열 건조기나 자연건조를 통해 남아있는 에탄올을 모두 제거한 후 물이나 Tris 완충용액에 녹여 핵산을 회수하였다.Add the pretreatment cell lysis buffer to the obtained blood sample, animal cell lines cultured in liquid medium, animal tissue, and plant tissue, and mix well. At this time, the tissue cells of animals and plants may proceed with a protein degradation step such as proteinase in addition to the buffer solution. Then, add guanidine hydrochloric acid, magnetic silica nanoparticles, and ethanol to the solution, mix them, and then use a magnet to remove only the supernatant, and then sequentially use the guanidine hydrochloric acid and ethanol mixture, sodium chloride and ethanol mixture, and ethanol washed away After removing all remaining ethanol through a hot air blower, dry heat dryer or natural drying, the nucleic acid was recovered by dissolving it in water or Tris buffer solution.
핵산 분리 방법에 의한 결과물이 불순물 없이 잘 추출되었는지에 대해 아가로즈 젤 전기영동을 통해 확인한 결과, 도 2 내지 7에 개시된 바와 같이 불순물 없이 잘 추출된 것을 확인할 수 있었다. 도 2 내지 7의 M레인은 사이즈 마커(size marker, 바이오니아사, 1kb ladder)이고, 레인 번호는 본 발명에 의한 방법으로 추출한 샘플 DNA이다.As a result of confirming through agarose gel electrophoresis whether the result of the nucleic acid separation method was well extracted without impurities, it could be confirmed that the result was well extracted without impurities as shown in FIGS. 2 to 7 . M lanes of FIGS. 2 to 7 are size markers (size marker, Bioneer Inc., 1 kb ladder), and lane numbers are sample DNA extracted by the method according to the present invention.
실시예Example 12: 소수성 자성 입자 및 실리카 자성 입자 처리를 이용한 추출 방법을 핵산추출 장비에 적용한 전자동화 12: Fully automated extraction method using hydrophobic magnetic particles and silica magnetic particle treatment applied to nucleic acid extraction equipment
실시예 2의 핵산추출 방법을 핵산추출장비를 사용하여 전자동화시켰다. The nucleic acid extraction method of Example 2 was fully automated using a nucleic acid extraction equipment.
단백질 합성 정제 및 핵산추출용 장비 ExiProgen (바이오니아사, 한국공개특허 제2011-0041126호 및 제2011-0085824호 등에 사용되는 전용 키트의 샘플 주입칸에 넣고 가동시키면 상기 실시예 2의 핵산추출 방법의 모든 절차가 전자동으로 장비 내에서 실행된다. Equipment for protein synthesis purification and nucleic acid extraction ExiProgen ( Bioneer Inc., Korea Patent Publication Nos. 2011-0041126 and 2011-0085824) All of the nucleic acid extraction methods of Example 2 are put into the sample injection compartment of the dedicated kit used, etc. The procedure is fully automated within the machine.
핵산추출용 장비 ExiProgen은 도 8~15에 그 개략도 및 상태도를 나타내었다. The equipment for nucleic acid extraction ExiProgen is shown schematically and state diagrams in FIGS. 8-15.
첫 번째 세포 용해용 완충용액을 제외한 모든 용액이 따로 전용키트에 각각 들어있으며 1개 샘플에서부터 최대 16개 샘플까지 동시에 용액을 이동 및 혼합을 하여 실험을 진행할 수 있다.Except for the first cell lysis buffer, all solutions are included in a separate kit, and experiments can be carried out by moving and mixing solutions from one sample to a maximum of 16 samples at the same time.
상기 실시예1 방법으로 획득된 각각의 대장균 세포를 RNase A가 포함된 보전 처리용 완충용액을 넣고 세포를 잘 풀어준 후 세포 용해용 완충용액을 넣고 잘 섞어 전용키트에 샘플을 주입하고 장비를 가동한다. 장비내부에서 중화용 완충용액과 소수성 자성 입자까지 섞인 용액을 장비내 설치된 자석장치를 이용하여 비용해성 응집물을 키트 일부 웰에 붙이고 용액을 분리하였다. 설치된 자석장치는 도 12와 같은 구조로 ExiProgen 장비 내에 장착되어 있다.To each E. coli cell obtained by the method of Example 1, add a buffer solution for preservation treatment containing RNase A, loosen the cells, add a buffer solution for cell lysis, mix well, inject a sample into a dedicated kit, and operate the equipment do. A solution in which the neutralization buffer solution and hydrophobic magnetic particles were mixed inside the equipment was attached to some wells of the kit using a magnetic device installed in the equipment, and the solution was separated. The installed magnet device is mounted in the ExiProgen device with the structure shown in FIG. 12 .
분리된 용액에 구아니딘 염산과 실리카 자성 입자를 첨가하여 섞어준 후 장비내 구동하는 자기장 인가부를 이용하여 상등액만 제거한 후 에탄올을 이용해 다시 한번 씻어 주었다. 에탄올을 자기장 인가부의 히팅 장치로 모두 제거한 후 물이나 TE 버퍼에 녹여 핵산을 회수하였다.After adding and mixing guanidine hydrochloric acid and magnetic silica particles to the separated solution, only the supernatant was removed using a magnetic field applying unit driven in the equipment, and then washed again with ethanol. After all ethanol was removed by the heating device of the magnetic field applying unit, the nucleic acid was recovered by dissolving it in water or TE buffer.
회수된 핵산은 분광광도계를 이용하여 DNA 수율과 순도를 확인하고 그 결과를 표 3에 나타내었다.The recovered nucleic acid was checked for DNA yield and purity using a spectrophotometer, and the results are shown in Table 3.
일반적으로 정제가 잘 된 깨끗한 상태의 핵산은 OD260nm/280nm가 1.8 이상이고 OD 260nm/230nm가 2.0 이상 일 때를 말한다. In general, nucleic acids in a well-purified, clean state refer to when OD260nm/280nm is 1.8 or more and OD 260nm/230nm is 2.0 or more.
자성 입자, 상세하게는 소수성 자성 입자 또는 실리카 자성 나노입자와 실리카 자성 입자를 이용하는 방법을 단백질 합성 정제 및 핵산추출용 장비 ExiProgen (바이오니아사, 한국공개특허 제2011-0041126호 및 제2011-0085824호)를 이용하여 자동화시켜 장비 내에서 모든 작업이 이루어지면 최대 16개까지 같이 동시에 작동할 수 있고 표 3과 도 17에 나타난 바와 같이 거의 일정한 농도와 모든 시료에서 OD 260nm/280nm값은 1.8 이상이고 OD 260nm/230nm값은 2.0 이상을 유지하여 핵산이 깨끗하게 정제 되었음을 확인하였다. Equipment for protein synthesis purification and nucleic acid extraction ExiProgen ( Bioneer, Korean Patent Laid-Open Nos. 2011-0041126 and 2011-0085824) If all tasks are performed within the equipment by using the automation system, up to 16 units can be operated simultaneously. The /230nm value was maintained at 2.0 or higher, confirming that the nucleic acid was cleanly purified.
표 3의 분리된 핵산을 1.0% 아가로스 젤에서 전기영동 한 결과 전자동화장치 내에서 정제된 핵산 중 플라스미드 DNA가 깨끗하게 정제되었음을 확인할 수 있었다. 도 17의 M레인은 사이즈 마커(size marker, 바이오니아사, 1kb ladder)이고, 1 내지 8 레인은 표 3에서 회수한 핵산 시료이다. As a result of electrophoresis of the isolated nucleic acids in Table 3 on a 1.0% agarose gel, it was confirmed that plasmid DNA was clearly purified among the nucleic acids purified in the fully automated device. Lane M of FIG. 17 is a size marker (size marker, Bioneer Inc., 1 kb ladder), and
실시예 13: 전자동화 장치를 이용하여 생물시료로부터 분리된 핵산의 효소활성 저해여부 확인Example 13: Confirmation of inhibition of enzymatic activity of nucleic acids isolated from biological samples using a fully automated device
실시예 12에서 분리된 플라스미드 1㎍을 바이오니아로부터 구입한 EcoRI 으로 37℃에서 1시간 동안 절단하고 1.0% 아가로스 젤에서 전기영동을 통해 제한효소에 의해 절단된 플라스미드 DNA의 크기가 3.0kb가 맞는지 확인하고, 전자동화 장치에 의해 분리된 결과물을 도 18에 나타내었다.1 μg of the plasmid isolated in Example 12 was cut with Eco RI purchased from Bioneer at 37° C. for 1 hour, and the size of the plasmid DNA cut by restriction enzymes was 3.0 kb through electrophoresis on a 1.0% agarose gel. Confirmed, and the result separated by the fully automated device is shown in FIG. 18 .
도 18의 M레인은 사이즈 마커(size marker, 바이오니아사, 1kb ladder)이고, U레인은 제한효소에 의해 절단하지 않은 플라스미드 DNA이고, C 레인은 플라스미드 DNA를 제한효소 (EcoRI) 처리한 실험구이다. 전기영동 결과에서 볼 수 있듯이, 플라스미드 핵산에 삽입된 목적 유전자 주위의 특정 염기서열을 분리할 수 있는 제한효소로 처리하였을 때 목적 유전자의 크기만큼 적절히 절단되어 전기영동상에서 뚜렷하게 나타나는 것을 확인하였다18, M lane is a size marker (size marker, Bioneer Inc., 1 kb ladder), U lane is plasmid DNA not cut by restriction enzyme, and C lane is an experimental group in which plasmid DNA is treated with restriction enzyme (EcoRI) . As can be seen from the electrophoresis results, when treated with a restriction enzyme capable of separating a specific nucleotide sequence around the target gene inserted into the plasmid nucleic acid, it was appropriately cut to the size of the target gene, and it was confirmed that it appeared clearly on the electrophoresis.
이상으로 본 발명의 내용을 상세히 기술하였는바, 당 업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다. As the content of the present invention has been described in detail above, for those of ordinary skill in the art, it will be clear that these specific descriptions are only preferred embodiments, and the scope of the present invention is not limited thereby. . Accordingly, the substantial scope of the present invention will be defined by the appended claims and their equivalents.
120 : 피스톤 130 : 피스톤 안내부
140 : 피펫부 141 : 제1열 피펫 142 : 제2열 피펫
150 : 피스톤 안내부 지지판
200 : 고정몸체
231 : 상하 이동모터 232 : 상하 이동벨트
233 : 상하 이동스크류 241 : 전후 이동 슬라이더
300 : 케이싱
310 : 전후 이동 지지봉 311 : 전후 안내가이더
320 : 전후 이동모터 330: 전후 이동벨트
340 : 멸균을 위한 자외선 램프
400 : 베이스플레이트 401 : 손잡이
420 : 멀티웰플레이트 420' : 멀티웰플레이트
430 : 피펫랙 440 : 시료보관용 튜브랙
440-1 : 타겟핵산 보관용 튜브삽착공 440-3 : 타겟핵산 진단용 튜브삽착공
442-1 : 타겟핵산 보관용 튜브 442-3 : 타겟핵산 진단용 튜브
450 : 폐액통 460 : 고온반응블럭
472 : 생물학적 시료용 튜브
700 : 자기장 인가부
710 : 자석장착부 711 : 자석
713 : 단위 웰 인입홈
720 : 자석장착부 지지대 730 : 가이드봉
740 : 가이드 블럭 750 : 인장 스프링
760 : 승강부 761 : 승강모터
762 : 제1 승강축 763 : 승강캠
764 : 제2 승강축
770 : 센싱부 장착판
780 : 높이 감지 센서
781 : 센싱부 782 : 센싱 타겟부
810 : 히팅부 812 : 히팅부 고정판120: piston 130: piston guide part
140: pipette part 141: first row pipette 142: second row pipette
150: piston guide support plate
200: fixed body
231: vertical movement motor 232: vertical movement belt
233: vertical movement screw 241: forward and backward movement slider
300: casing
310: forward and backward movement support rod 311: forward and backward guide guide
320: forward and backward movement motor 330: forward and backward movement belt
340: UV lamp for sterilization
400: base plate 401: handle
420: multi-well plate 420': multi-well plate
430: pipette rack 440: tube rack for sample storage
440-1: tube insertion hole for target nucleic acid storage 440-3: tube insertion hole for target nucleic acid diagnosis
442-1: tube for storing target nucleic acid 442-3: tube for diagnosis of target nucleic acid
450: waste liquid container 460: high temperature reaction block
472: tube for biological sample
700: magnetic field applying unit
710: magnet mounting part 711: magnet
713: unit well inlet groove
720: magnet mounting part support 730: guide rod
740: guide block 750: tension spring
760: elevating unit 761: elevating motor
762: first lifting shaft 763: lifting cam
764: second lifting shaft
770: sensing unit mounting plate
780: height detection sensor
781: sensing unit 782: sensing target unit
810: heating unit 812: heating unit fixing plate
Claims (18)
(a) 핵산을 포함하는 생체 시료에 평균 입경 크기가 50nm ~ 1μm인 소수성 자성 입자를 첨가하여, 타겟 핵산을 제외한 비용해성 응집물 또는 핵산분자와 상기 입자를 결합시키는 단계;
(b) 타겟 핵산을 제외한 비용해성 응집물 또는 핵산분자와 결합한 상기 소수성 자성 입자를 자기장을 이용하여 분리하여, 타겟핵산을 함유한 혼합물을 수득하는 단계;
(c) (b) 단계에서 수득된 혼합물에 평균 입경 크기가 50nm ~ 1μm인 실리카 자성 입자를 첨가하여 타겟핵산과 실리카 자성 입자를 결합시키는 단계; 및
(d) 타겟핵산과 결합한 실리카 자성 입자를 자기장을 이용하여 분리하여 타겟핵산을 수득하는 단계
를 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산 분리 방법.
A method of separating nucleic acids from a biological sample using magnetic particles comprising the following steps
(a) adding hydrophobic magnetic particles having an average particle size of 50 nm to 1 μm to a biological sample containing a nucleic acid, and binding the particles to an insoluble aggregate or nucleic acid molecule other than a target nucleic acid;
(b) separating the hydrophobic magnetic particles bound to insoluble aggregates or nucleic acid molecules other than the target nucleic acid using a magnetic field to obtain a mixture containing the target nucleic acid;
(c) binding the target nucleic acid to the magnetic silica particles by adding magnetic silica particles having an average particle size of 50 nm to 1 μm to the mixture obtained in step (b); and
(d) separating the magnetic silica particles bound to the target nucleic acid using a magnetic field to obtain the target nucleic acid
A nucleic acid isolation method comprising a.
상기 소수성 자성 입자의 평균 입경이 50nm ~ 700nm인 것을 특징으로 하는 핵산의 분리 방법.
According to claim 1,
The method for separating nucleic acids, characterized in that the average particle diameter of the hydrophobic magnetic particles is 50nm ~ 700nm.
상기 실리카 자성 입자의 평균 입경이 50nm ~ 700nm인 것을 특징으로 하는 핵산의 분리 방법.
According to claim 1,
The method for separating nucleic acids, characterized in that the silica magnetic particles have an average particle diameter of 50 nm to 700 nm.
The method of claim 1, wherein the magnetic particles are at least one selected from iron, cobalt, nickel, and oxides or alloys thereof.
상기 자성 입자를 첨가하는 단계는
ⅰ) 생체 시료에 직접 제공하는 단계;
ⅱ) 생체 시료를 보전 처리하는 보전용액에 함께 섞어 제공하는 단계;
ⅲ) 생체 시료를 보전 처리하는 보전용액을 처리한 후 제공하는 단계;
ⅳ) 생체 시료 용해를 위해 완충용액에 함께 섞어 제공하는 단계;
ⅴ) 생체 시료 용해를 위해 완충용액을 처리한 후 제공하는 단계;
ⅵ) 용해된 생체 시료에 단백질 변성 응집물을 형성시키기 위한 완충용액에 함께 섞어 제공하는 단계; 및
ⅶ) 단백질 변성 응집물이 형성된 용액에 제공하는 단계;
에서 선택되는 단계에 첨가되는 것을 특징으로 하는 핵산의 분리 방법.
According to claim 1,
The step of adding the magnetic particles is
i) providing directly to the biological sample;
ii) providing a biological sample mixed with a preservation solution for preservation treatment;
iii) providing a preservation solution for preserving the biological sample after treatment;
iv) providing a mixture with a buffer solution for dissolution of the biological sample;
v) providing a buffer solution after treatment for dissolution of the biological sample;
ⅵ) mixing and providing a buffer solution for forming protein-denatured aggregates in the dissolved biological sample; and
iv) providing a solution in which the protein denatured aggregate is formed;
Separation method of nucleic acid, characterized in that added to the step selected from.
The method according to claim 1, wherein the target nucleic acid to be isolated is selected from the group consisting of plasmid DNA, bacterial genomic DNA, blood and animal and plant tissue DNA, and animal cell line DNA and RNA.
멀티 웰 플레이트의 특정 단위 웰에 자기장을 인가 및 해제하기 위한 자기장 인가부;
상기 멀티 웰 플레이트의 특정 단위 웰 하방에 위치하는 자석장착부;
상기 자석장착부를 상승 및 하강시키기 위한 승강부;
자성 입자를 분리하기 위한 자석부재; 및
상기 멀티 웰 플레이트의 특정 단위 웰을 가열하기 위한 히팅부;
를 포함하고,
상기 멀티 웰 플레이트에 생체시료와 평균 입경 크기가 50nm ~ 1μm인 자성 입자가 첨가되는 것을 특징으로 하는 생체 시료로부터 핵산을 전자동으로 분리하는 전자동 핵산 분리 장치를 이용하여 생물학적 시료로부터 타겟핵산을 분리하는 방법으로서,
1) 소수성 자성 입자를 멀티 웰 플레이트의 특정 단위 웰에 첨가하여 타겟핵산을 제외한 비용해성 응집물 또는 핵산분자와 자성 입자를 결합시키는 단계;
2) 타겟 핵산을 제외한 비용해성 응집물 또는 핵산분자와 결합한 상기 소수성 자성 입자를 자기장을 이용하여 분리하여, 타겟핵산을 함유한 혼합물을 수득하는 단계;;
3) 2) 단계에서 수득된 혼합물에 평균 입경 크기가 50nm ~ 1μm인 실리카 자성 입자를 첨가하여 타겟핵산과 결합시키는 단계;
4) 타겟핵산과 결합된 실리카 자성 입자를 제외한 혼합물을 제거하는 단계; 및
5) 타겟핵산과 결합된 실리카 자성 입자에서 타겟핵산을 분리하는 단계;
를 포함하는 것을 특징으로 하는 전자동 핵산 분리 방법.
a pipette block installed to be movable in the horizontal and vertical directions, and for mounting a plurality of pipettes to be detachably;
a magnetic field applying unit for applying and releasing a magnetic field to a specific unit well of the multi-well plate;
a magnet mounting part positioned below a specific unit well of the multi-well plate;
a lifting unit for raising and lowering the magnet mounting unit;
a magnet member for separating magnetic particles; and
a heating unit for heating a specific unit well of the multi-well plate;
including,
Method of separating a target nucleic acid from a biological sample using a fully automatic nucleic acid separation device for automatically separating nucleic acids from a biological sample, characterized in that a biological sample and magnetic particles having an average particle size of 50 nm to 1 μm are added to the multi-well plate As,
1) adding hydrophobic magnetic particles to a specific unit well of a multi-well plate to bind magnetic particles to insoluble aggregates or nucleic acid molecules except for the target nucleic acid;
2) separating the hydrophobic magnetic particles bound to insoluble aggregates or nucleic acid molecules other than the target nucleic acid using a magnetic field to obtain a mixture containing the target nucleic acid;
3) adding magnetic silica particles having an average particle size of 50 nm to 1 μm to the mixture obtained in step 2) and binding to the target nucleic acid;
4) removing the mixture except for the magnetic silica particles bound to the target nucleic acid; and
5) separating the target nucleic acid from the magnetic silica particles bound to the target nucleic acid;
Fully automatic nucleic acid separation method comprising a.
2) 단계 또는 4) 단계의 자성 입자와 결합된 물질을 분리함에 있어서, 자기장 인가부를 이용하여 상기 멀티 웰 플레이트의 특정 단위 웰 하부의 내벽에 부착시켜 분리하는 것을 특징으로 하는 전자동 핵산 분리 방법
11. The method of claim 10,
In separating the material bound to the magnetic particles in step 2) or step 4), a fully automatic nucleic acid separation method, characterized in that the separation is performed by attaching it to the inner wall of the lower part of a specific unit well of the multi-well plate using a magnetic field applying unit
분리되는 타겟 핵산은 플라스미드 DNA, 박테리아의 게놈 DNA, 혈액 및 동식물 조직 DNA, 동물 세포주의 DNA 및 RNA로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 핵산의 분리 방법.
11. The method of claim 10,
The target nucleic acid to be isolated is selected from the group consisting of plasmid DNA, bacterial genomic DNA, blood and animal and plant tissue DNA, and animal cell line DNA and RNA.
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Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20060024712A1 (en) * | 2004-06-25 | 2006-02-02 | Invitrogen Corporation | Separation of nucleic acid |
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|---|---|---|---|---|
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| US6027945A (en) * | 1997-01-21 | 2000-02-22 | Promega Corporation | Methods of isolating biological target materials using silica magnetic particles |
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Patent Citations (1)
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|---|---|---|---|---|
| US20060024712A1 (en) * | 2004-06-25 | 2006-02-02 | Invitrogen Corporation | Separation of nucleic acid |
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