KR102335708B1 - Uv-a induced aging modle of stem/progenitor cell line and screening system for potential anti-aging component using them - Google Patents

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Abstract

본 명세서는 진피 유래 성체 줄기세포로부터 유도된 노화 모델 줄기세포주에 관한 것이다. 이러한 노화 모델 줄기세포주는 UV-A를 조사하여 유도된 것이며, 본 명세서에 개시된 발명은 쉽고 간단한 방법으로 노화 모델 줄기세포주를 유도할 수 있다. 유도된 노화모델 줄기세포주는 피부 노화 또는 줄기세포성 촉진 여부에 관한 실험에서 널리 사용될 수 있으며, 구체적으로 줄기세포성을 촉진하는 물질 또는 피부 노화를 개선하는 신규 물질을 탐색하는데 있어서 사용될 수 있다. The present specification relates to a senescence model stem cell line derived from dermal-derived adult stem cells. These senescence model stem cell lines are induced by irradiation with UV-A, and the invention disclosed herein can induce senescence model stem cell lines in an easy and simple way. The induced aging model stem cell line can be widely used in experiments on whether to promote skin aging or stem cell properties, and specifically can be used to search for substances that promote stem cell properties or novel materials to improve skin aging.

Description

자외선으로 유도된 노화 모델 줄기세포주 및 이를 이용한 피부 노화개선 후보물질 스크리닝 시스템 {UV-A INDUCED AGING MODLE OF STEM/PROGENITOR CELL LINE AND SCREENING SYSTEM FOR POTENTIAL ANTI-AGING COMPONENT USING THEM}UV-induced aging model stem cell line and skin aging improvement candidate screening system using the same {UV-A INDUCED AGING MODLE OF STEM/PROGENITOR CELL LINE AND SCREENING SYSTEM FOR POTENTIAL ANTI-AGING COMPONENT USING THEM}

본 명세서는 노화 모델 줄기세포주 및 그 이용에 관한 것이다. The present specification relates to a senescence model stem cell line and its use.

다분화 기능(pluripotent)을 소유하는 성체 줄기세포를 조직으로부터 분리하려는 노력은 최근 몇 년 전부터 계속적으로 진행되어 왔다. 이러한 성체 줄기세포는 배아줄기세포의 전분화기능(totipotent)에 비해 조직 내의 모든 세포로 분화하지는 못하는 단점이 있지만, 배아줄기세포에서 문제시될 수 있는 윤리적인 문제에서는 자유로울 수 있다는 점에서 연구 및 활용의 의미가 있다. 그러나, 성체 줄기세포는 배아줄기세포와 달리 성체 조직에서 발굴/동정 할 수 있는 성체 줄기세포의 수(해당 조직의 약 1~5% 미만으로 추정)가 매우 적어서, 연구에 어려움이 있다. Efforts to isolate adult stem cells possessing pluripotent functions from tissues have been ongoing in recent years. These adult stem cells have the disadvantage of not being able to differentiate into all cells in the tissue compared to the totipotent function of embryonic stem cells. It makes sense. However, unlike embryonic stem cells, adult stem cells have a very small number of adult stem cells that can be excavated/identified in adult tissues (estimated to be less than about 1 to 5% of the tissue), making it difficult to research.

줄기세포 연구의 궁극적인 목표는 주로 재생의학적 관점에서의 치료로, 특정 장기 조직에서의 질환 또는 질병을 앓고 있는 환자들에게 줄기세포 기반의 신규 세포를 공급하는 세포 이식(cell transplantation) 또는 교체(replacement) 방법으로 활발히 연구되고 있다. 인간의 피부 성체 줄기세포 역시 화상과 같은 피부 손상, 창상, 궤양, 아토피 등 피부 질환을 치료하는 데 응용될 수 있다고 판단되고 연구가 진행되고 있다. 각질층(epidermis), 진피(dermis), 피하지방층(subcutaneous adipose), 그리고, 부속기(appendage)로 구성된 이들 피부층에서 즉, 각질층으로부터 각질 줄기세포(epidermal stem cells), 부속기인 모발로부터 모낭 줄기세포 (hair follicle stem cells) 같은 다분화 기능을 갖는 세포군이 동정이 되었다. 또한, 진피 성체 줄기세포들의 경우에는 설치류 및 인간으로부터 현탁 배양(suspension culture)이라는 특정 배양 시스템을 사용해서 동정이 되었는데, 이런 진피 성체 줄기세포들(Skin Derived Precursors, SKPs)은 지방 세포, 골세포, 근육 세포 등 중간엽(mesoderm) 형태의 세포로 분화될 수 있다는 정도만 관찰되었다 (Toma et al., 2001). The ultimate goal of stem cell research is mainly from a regenerative medicine perspective, and cell transplantation or replacement, which supplies new stem cell-based cells to patients suffering from diseases or disorders in specific organ tissues. ) method is being actively studied. Human skin adult stem cells are also being studied and judged to be applicable to skin diseases such as burns, wounds, ulcers, and atopic dermatitis. In these skin layers consisting of the epidermis, dermis, subcutaneous adipose, and appendages, i.e., epidermal stem cells from the stratum corneum, and hair follicle stem cells from the appendages. Cell groups with multi-differentiation functions such as follicle stem cells) were identified. In addition, in the case of dermal adult stem cells, they were identified using a specific culture system called suspension culture from rodents and humans. These dermal adult stem cells (Skin Derived Precursors, SKPs) are Only the degree of differentiation into mesenchymal cells such as muscle cells was observed (Toma et al., 2001).

무엇보다, 이들 피부 성체 줄기세포는 전체 피부 조직에서 차지하는 수가 현저히 낮은데, 각질 줄기세포의 경우에는 각질형성세포 수의 1-5% 미만으로 예상되며, 진피 줄기세포의 경우에도 2-3% 정도로 파악되어 이를 분리하는 데 어려움이 있었다. 이에 따라, 진피 유래 성체 줄기세포를 분리 및 확보하는 방법에 대한 연구 및 이렇게 분리한 진피 유래 성체 줄기세포의 기능에 대한 연구 역시 논의된 바가 전혀 없었다. Above all, the number of these adult skin stem cells is significantly low in the total skin tissue, and in the case of keratinocytes, it is expected to account for less than 1-5% of the number of keratinocytes, and in the case of dermal stem cells, it is identified as about 2-3%. It was difficult to separate them. Accordingly, a study on a method for isolating and securing dermal-derived adult stem cells and a study on the function of the isolated dermal-derived adult stem cells were also not discussed at all.

피부의 탄력과 주름을 개선하고 진피층의 섬유아세포를 활성화 시키는 것으로서, 식품의약품안전처 고시 원료로는 레티놀(retinol), 아데노신(adenosine) 등의 성분 들이 알려져 있다. 이들 성분을 함유한 제품들은 주름개선의 효과를 보이는 것으로 알려져 있다. 이러한 성분은 기질금속단백분해효소의 활성을 억제시키거나 콜라겐의 생성을 촉진하여 피부노화를 개선한다고 알려져 있다. 그러나 새로운 노화개선 유효성 평가의 개발이 절실한 시점에서 현재 국내외의 연구동향을 살펴보면 성체줄기세포를 활용한 유효성 평가법의 개발이 전무한 상태이고 기존의 평가법을 활용한 신규 소재 개발이나 기존 원료의 안정화나 피부 흡수율 개선에만 한정하여 연구되고 있는 실정이다.It improves skin elasticity and wrinkles and activates fibroblasts in the dermal layer. Ingredients such as retinol and adenosine are known as raw materials notified by the Ministry of Food and Drug Safety. Products containing these ingredients are known to show wrinkle-improving effects. These ingredients are known to improve skin aging by inhibiting the activity of matrix metalloproteinases or promoting collagen production. However, at a time when the development of a new anti-aging efficacy evaluation is urgently needed, looking at current research trends at home and abroad, there is no development of an efficacy evaluation method using adult stem cells. Research is limited to improvement only.

Toma et al., 2001 (Nat Cell Biol. 778-84)Toma et al., 2001 (Nat Cell Biol. 778-84)

상기와 같은 문제를 해결하기 위하여 본 명세서는 성체 줄기세포를 활용하여 노화모델 줄기세포주를 확립하고, 이를 이용하여 새로운 노화 개선 유효성을 평가하는 시스템에 관한 것이다. In order to solve the above problems, the present specification relates to a system for establishing a senescence model stem cell line using adult stem cells and evaluating the effectiveness of new aging improvement using the stem cell line.

상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 일측면에 있어서, 진피 유래 성체 줄기세포에 UV-A를 조사하여 유도된 노화 모델 줄기세포주 및 이를 이용한 노화 개선의 유효성 평가 시스템을 제공한다.In order to achieve the above object, in one aspect, the present invention provides a senescence model stem cell line induced by irradiating UV-A to dermis-derived adult stem cells and a system for evaluating the effectiveness of aging improvement using the same.

본 발명의 일 측면에 따른 노화 모델 줄기세포주는 인간 피부의 진피로부터 유래된 성체 줄기세포에 UV-A를 조사하여 유도된 것이며, 이러한 노화 모델 줄기세포주는 쉽고 간단하며 높은 수율로 확보할 수 있으며 간단한 방법으로 줄기세포성이 감소된 것이다. 따라서, 이렇게 경제적이고 간단하게 생성된 노화 모델 줄기세포주는 피부의 노화를 개선하는 후보물질을 검색하는 시스템에서 활용될 수 있으며, 이를 이용하여 신규한 노화 개선 물질을 스크리닝 하는데 이용될 수 있다. The aging model stem cell line according to an aspect of the present invention is induced by irradiating UV-A to adult stem cells derived from the dermis of human skin, and this aging model stem cell line is easy, simple, and can be obtained in high yield and simple In this way, stem cellularity is reduced. Therefore, the economically and simply generated aging model stem cell line can be utilized in a system for searching for a candidate substance that improves skin aging, and can be used to screen for a novel aging improvement substance using this.

도 1은 UV-A 조사에 따른 줄기세포의 세포 생존력에 대한 그래프(A) 및 부유배양 시 구(sphere) 형성 여부에 관한 그림(B)이다.
도 2는 급성 노화모델과 만성 노화모델에 대한 UV-A 조사 방법을 나타낸 그림이다.
도 3은 급성 노화모델과 만성 노화모델에 대한 줄기세포 바이오마커 유전자인 SOX2, S100B, 및 NANOG의 발현 정도를 각각 나타낸 그래프이다.
도 4는 만성 노화 모델에 대한 지방세포 바이오마커 유전자의 발현 정도에 대한 그래프 및 지방구를 오일 레드 오(Oil Red O)로 염색한 사진이다.
도 5는 만성 노화 모델에 대한 연골세포 바이오마커 유전자의 발현 정도에 대한 그래프이다. 1 is a graph for cell viability of stem cells according to UV-A irradiation (A) and a figure for whether spheres are formed during suspension culture (B).
2 is a diagram showing a UV-A irradiation method for an acute aging model and a chronic aging model.
3 is a graph showing the expression levels of stem cell biomarker genes SOX2, S100B, and NANOG for an acute aging model and a chronic aging model, respectively.
4 is a graph of the expression level of the adipocyte biomarker gene for a chronic aging model and a photograph of staining the adipocytes with Oil Red O. FIG.
5 is a graph of the expression level of chondrocyte biomarker genes for a chronic aging model.

본 발명은 일 측면에 있어서, 진피 유래 성체 줄기세포로부터 유도된 노화 모델 줄기세포주에 관한 것일 수 있다. In one aspect, the present invention may relate to a senescence model stem cell line derived from dermal-derived adult stem cells.

본 발명의 일 측면에 있어서, 상기 노화 모델 줄기세포주는 하기 특성 중 하나 이상을 가지는 것일 수 있다:In one aspect of the present invention, the senescence model stem cell line may have one or more of the following characteristics:

1) 노화되지 않은 대조군 진피 유래 성체 줄기세포를 기준으로, 줄기세포 바이오마커 유전자의 발현 또는 이러한 유전자로부터 코딩된 단백질의 발현이 60% 이상 감소한 것이고, 상기 줄기세포 바이오마커 유전자는 SOX2(SRY(sex determining region Y)-box 2)(NM_003106), S100B(S100 calcium binding protein B) (NM_006272), 및NANOG(NM_001297698)으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상인 특성;1) Based on the non-senescent control dermis-derived adult stem cells, the expression of the stem cell biomarker gene or the expression of the protein encoded by the gene is reduced by 60% or more, and the stem cell biomarker gene is SOX2 (SRY(sex) at least one characteristic selected from the group consisting of determining region Y)-box 2) (NM_003106), S100B (S100 calcium binding protein B) (NM_006272), and NANOG (NM_001297698);

2) 노화되지 않은 대조군 진피 유래 성체 줄기세포를 기준으로, 지방세포 바이오마커 유전자의 발현 또는 이러한 유전자로부터 코딩된 단백질의 발현이 60% 이상 감소한 것이고, 상기 지방세포 바이오마커는 퍼옥시좀 증식자 활성화 수용체 감마(Peroxisome proliferator-activated receptor gamma, PPARγ)(NM_005037), 렙틴(Leptin, LEP)(NM_000230), 아디포넥틴(adiponectin, ADIPOQ)(NM_001177800), 및 아디포사이트 단백질 2(adipocyte protein 2, FABP4)(NM_001442)으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상인 특성;2) Based on the non-senescent control dermal-derived adult stem cells, the expression of the adipocyte biomarker gene or the expression of the protein encoded by the gene was reduced by 60% or more, and the adipocyte biomarker activates the peroxisome proliferator Peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPARγ) (NM_005037), leptin (LEP) (NM_000230), adiponectin (ADIPOQ) (NM_001177800), and adipocyte protein 2 (FABP4) ( NM_001442) at least one characteristic selected from the group consisting of;

3) 노화되지 않은 대조군 진피 유래 성체 줄기세포를 기준으로, 연골세포 바이오마커 유전자의 발현 또는 이러한 유전자로부터 코딩된 단백질의 발현이 60% 이상 감소한 것이고, 상기 연골세포 바이오마커는 콜라겐 타입II 알파 1(collagen typeII alpha1, COL2A1)(NM_001844), 및 어그리칸(aggrecan, ACAN)(NM_001135)중 하나 이상인 특성; 및 3) Based on the non-aging control dermis-derived adult stem cells, the expression of the chondrocyte biomarker gene or the expression of a protein encoded from this gene was reduced by 60% or more, and the chondrocyte biomarker is collagen type II alpha 1 ( collagen typeII alpha1, COL2A1) (NM_001844), and aggrecan (ACAN) (NM_001135) at least one characteristic; and

4) 노화되지 않은 대조군 진피 유래 성체 줄기세포를 기준으로, 골아세포 바이오마커 유전자의 발현 또는 이러한 유전자로부터 코딩된 단백질의 발현이 60% 이상 감소한 것이고, 상기 골아세포 바이오마커는 오스테오글리신(Osteoglycin gene, OGN)(NM_014057), 및 오스테오칼신(osteocalcin, bone gamma-carboxyglutamic acid-containing protein, BGLAP)(NM_199173)중 하나 이상인 특성.4) Based on the non-senescent control dermis-derived adult stem cells, the expression of the osteoblast biomarker gene or the expression of the protein encoded by the gene is reduced by 60% or more, and the osteoblast biomarker is osteoglycin (Osteoglycin gene) , OGN) (NM_014057), and osteocalcin (bone gamma-carboxyglutamic acid-containing protein, BGLAP) (NM_199173).

본 발명의 일 측면에 있어서, 상기 노화 모델 줄기세포주의 특성으로서 줄기세포, 지방세포, 연골세포 또는 골아세포 바이오마커 유전자의 발현 또는 이러한 유전자로부터 코딩된 단백질의 발현 정도는 노화되지 않은 대조군 진피 유래 성체 줄기세포를 기준으로 99%이상, 90%이상, 85%이상, 80%이상, 75%이상, 70%이상, 65% 이상, 63% 이상, 60%이상, 59%이상, 58%이상, 55%이상, 50%이상, 45%이상, 40%이상, 35%이상, 30%이상, 25%이상, 20%이상, 15%이상, 10% 이상, 5%이상, 또는 1% 이상 감소된 것일 수 있다. In one aspect of the present invention, as a characteristic of the aging model stem cell line, the expression of a stem cell, adipocyte, chondrocyte or osteoblast biomarker gene or the expression level of a protein encoded by such a gene is a non-senescent control dermal-derived adult Based on stem cells 99% or more, 90% or more, 85% or more, 80% or more, 75% or more, 70% or more, 65% or more, 63% or more, 60% or more, 59% or more, 58% or more, 55 % or more, 50% or more, 45% or more, 40% or more, 35% or more, 30% or more, 25% or more, 20% or more, 15% or more, 10% or more, 5% or more, or 1% or more can

본 발명의 일 측면에 있어서, 상기 진피 유래 성체 줄기세포는 인간의 진피 유래 성체 줄기세포(human dermal stem/progenitor cells, hDSPCs)일 수 있다. In one aspect of the present invention, the dermal-derived adult stem cells may be human dermal stem/progenitor cells (hDSPCs).

본 발명의 일 측면에 있어서, 상기 진피 유래 성체 줄기세포는 기탁번호 KCTC11995BP의 줄기세포일 수 있다. In one aspect of the present invention, the dermis-derived adult stem cells may be stem cells of accession number KCTC11995BP.

본 발명의 일 측면에 있어서, 상기 노화 모델은 만성(chronic) 노화모델 일 수 있다. In one aspect of the present invention, the aging model may be a chronic (chronic) aging model.

본 발명은 일 측면에 있어서, 본 발명의 일 측면에 따른 노화 모델 줄기세포주를 유효성분으로 포함하는 조성물에 관한 것일 수 있다. In one aspect, the present invention may relate to a composition comprising the aging model stem cell line according to an aspect of the present invention as an active ingredient.

본 발명의 일 측면에 있어서, 상기 조성물은 줄기세포성 촉진 물질 또는 피부 노화 개선 물질의 스크리닝용 또는 탐지용 조성물일 수 있다. In one aspect of the present invention, the composition may be a composition for screening or detecting a stem cell promoting material or a skin aging improving material.

본 발명은 일 측면에 있어서, 진피 유래 성체 줄기세포에 UV-A를 조사하는 것을 포함하는 본 발명의 일 측면에 따른 노화 모델 줄기세포주의 제조 방법에 관한 것일 수 있다.In one aspect, the present invention may relate to a method for producing a senescence model stem cell line according to an aspect of the present invention, comprising irradiating UV-A to dermal-derived adult stem cells.

본 발명의 일 측면에 있어서, 급성 노화모델은 진피 유래 성체 줄기세포에 UV-A를 일시에 3.0~6.0 J/cm2으로 조사하여 제조 또는 유도되는 것이며, 만성 노화모델은 진피 유래 성체 줄기세포에 UV-A를 20-28시간 간격으로 한번에 1.3~1.7 J/cm2으로 2회 이상 조사하여 제조 또는 유도되는 것일 수 있다. In one aspect of the present invention, the acute aging model is manufactured or induced by irradiating UV-A to dermal-derived adult stem cells at a time of 3.0 to 6.0 J/cm 2 , and the chronic aging model is based on dermal-derived adult stem cells. It may be manufactured or induced by irradiating UV-A twice or more at a time of 1.3 to 1.7 J/cm 2 at intervals of 20-28 hours.

본 발명의 일 측면에 있어서, UV-A의 조사는 22-26시간 간격으로 한번에 1.4-1.6 J/cm2으로 3회 이상 조사하는 것일 수 있다. In one aspect of the present invention, the irradiation of UV-A may be irradiated three or more times at a time of 1.4-1.6 J/cm 2 at intervals of 22-26 hours.

본 발명의 일 측면에 있어서, UV-A의 조사는 16시간 이상, 20시간 이상, 22시간 이상, 23시간 이상, 24시간 이상, 25시간 이상, 28시간 이상, 32시간 이상, 또는 36시간 이상이거나 36시간 이하, 32시간 이하, 28시간 이하, 25시간 이하, 24시간 이하, 23시간 이하, 22시간 이하, 20시간 이하, 16시간 이하의 간격으로 수행될 수 있다. 구체적으로 UV-A의 조사는 22-26시간, 더 구체적으로 23-25시간, 더 구체적으로 23.5-24.5 시간, 더 구체적으로 23.8-24.2시간 간격으로 수행될 수 있다. In one aspect of the present invention, UV-A irradiation is 16 hours or more, 20 hours or more, 22 hours or more, 23 hours or more, 24 hours or more, 25 hours or more, 28 hours or more, 32 hours or more, or 36 hours or more. or 36 hours or less, 32 hours or less, 28 hours or less, 25 hours or less, 24 hours or less, 23 hours or less, 22 hours or less, 20 hours or less, 16 hours or less. Specifically, UV-A irradiation may be performed at intervals of 22-26 hours, more specifically 23-25 hours, more specifically 23.5-24.5 hours, more specifically 23.8-24.2 hours.

본 발명의 일 측면에 있어서, UV-A의 조사는 한번 조사시에 0.1 J/cm2 이상, 0.5 J/cm2 이상, 1.0 J/cm2 이상, 1.1 J/cm2 이상, 1.2 J/cm2 이상, 1.3 J/cm2 이상, 1.4 J/cm2 이상, 1.5 J/cm2 이상, 1.6 J/cm2 이상, 1.7 J/cm2 이상, 1.8 J/cm2 이상, 1.9 J/cm2 이상, 2.0 J/cm2 이상, 2.5 J/cm2 이상, 또는 3.0 J/cm2 이상이거나 3.0 J/cm2 이하, 2.5 J/cm2 이하, 2.0 J/cm2 이하, 1.9 J/cm2 이하, 1.8 J/cm2 이하, 1.7 J/cm2 이하, 1.6 J/cm2 이하, 1.5 J/cm2 이하, 1.4 J/cm2 이하, 1.3 J/cm2 이하, 1.2 J/cm2 이하, 1.1 J/cm2 이하, 1.0 J/cm2 이하, 또는 0.5 J/cm2 이하의 조사량으로 수행될 수 있다. 구체적으로 UV-A의 조사는 1.3~1.7 J/cm2, 더 구체적으로 1.4~1.6 J/cm2, 더 구체적으로 1.45~1.55 J/cm2 의 조사량으로 수행 될 수 있다. In one aspect of the present invention, the irradiation of UV-A is 0.1 J/cm 2 or more, 0.5 J/cm 2 or more, 1.0 J/cm 2 or more, 1.1 J/cm 2 or more, 1.2 J/cm when irradiated once. 2 or more, 1.3 J/cm 2 or more, 1.4 J/cm 2 or more, 1.5 J/cm 2 or more, 1.6 J/cm 2 or more, 1.7 J/cm 2 or more, 1.8 J/cm 2 or more, 1.9 J/cm 2 or more or more, 2.0 J / cm 2 or more, 2.5 J / cm 2 or more, or 3.0 J / cm 2 or more, or 3.0 J / cm 2 or less, 2.5 J / cm 2 or less, 2.0 J / cm 2 or less, 1.9 J / cm 2 or less, 1.8 J/cm 2 or less, 1.7 J/cm 2 or less, 1.6 J/cm 2 or less, 1.5 J/cm 2 or less, 1.4 J/cm 2 or less, 1.3 J/cm 2 or less, 1.2 J/cm 2 or less , 1.1 J/cm 2 or less, 1.0 J/cm 2 or less, or 0.5 J/cm 2 or less, may be performed at an irradiation dose. Specifically, the irradiation of UV-A 1.3 ~ 1.7 J/cm 2 , more specifically 1.4 ~ 1.6 J/cm 2 , more specifically 1.45 ~ 1.55 J/cm 2 It may be performed at an irradiation amount.

본 발명의 일 측면에 있어서, UV-A의 조사는 2회 이상, 3회 이상, 4회 이상, 또는 5회 이상 반복하여 수행될 수 있다. In one aspect of the present invention, the irradiation of UV-A may be performed repeatedly two or more times, three or more times, four or more times, or five or more times.

본 발명의 일 측면에 있어서, UV-A의 조사는 총 조사량이 4.0 내지 5.0 J/cm2이 되도록 n회 이상 반복하여 수행될 수 있으며, 상기 n은 2이상 10 이하의 정수이고, 한 회당 조사되는 조사량은

Figure 112014119592534-pat00001
에 해당한다. In one aspect of the present invention, UV-A irradiation may be repeated n times or more so that the total irradiation amount is 4.0 to 5.0 J/cm 2 , wherein n is an integer of 2 or more and 10 or less, and irradiation per one time The amount of irradiation
Figure 112014119592534-pat00001
corresponds to

본 발명의 일 측면에 있어서, 상기 방법은 UV-A를 조사하기 이전에, 진피 유래 섬유아세포를 젤라틴 또는 제4형 콜라겐이 코팅된 배양접시에서 3~10분 간 배양하여 진피 성체 줄기세포를 유도하는 단계를 더 포함할 수 있다. 구체적으로 배양 접시에서의 배양은 1분 이상, 2분 이상, 3분 이상, 4분 이상, 5분 이상, 6분 이상, 7분 이상, 또는 10분 이상이거나 10분 이하, 7분 이하, 6분 이하, 5분 이하, 4분 이하, 3분 이하, 2분 이하, 1분 이하 동안 수행하는 것일 수 있다. In one aspect of the present invention, the method induces dermal adult stem cells by culturing dermal-derived fibroblasts in a culture dish coated with gelatin or type 4 collagen for 3 to 10 minutes prior to UV-A irradiation. It may further include the step of Specifically, the culture in a culture dish is 1 minute or more, 2 minutes or more, 3 minutes or more, 4 minutes or more, 5 minutes or more, 6 minutes or more, 7 minutes or more, or 10 minutes or more, or 10 minutes or less, 7 minutes or less, 6 Minutes or less, 5 minutes or less, 4 minutes or less, 3 minutes or less, 2 minutes or less, 1 minute or less may be performed.

본 발명의 일 측면에 있어서, 진피 유래 성체 줄기세포를 유도하는 단계는 배양 후 배양 접시에 붙은 세포들을 분리하는 단계를 더 포함할 수 있다. In one aspect of the present invention, the step of inducing the dermal-derived adult stem cells may further include isolating the cells attached to the culture dish after culture.

본 발명은 일 측면에 있어서, 본 발명의 일 측면에 따른 노화 모델 줄기세포주; 및 노화 모델 줄기세포주의 세포생존율 또는 줄기세포성을 확인할 수 있는 장치를 포함하는 줄기세포성 촉진 물질 또는 피부 노화 개선 물질의 스크리닝 키트에 관한 것일 수 있다. In one aspect, the present invention, a senescence model stem cell line according to an aspect of the present invention; And it may relate to a screening kit for a stem cell-promoting material or skin aging improvement material, including a device that can check the cell viability or stem cell characteristics of the aging model stem cell line.

본 발명은 일 측면에 있어서, 본 발명의 일 측면에 따른 노화 모델 줄기세포주에 후보물질을 처리하는 단계; 및 처리된 줄기세포주의 세포생존율 또는 줄기세포성을 측정하는 단계를 포함하는 줄기세포성 촉진 물질 또는 피부 노화 개선 물질의 스크리닝 방법에 관한 것일 수 있다. In one aspect, the present invention, the step of treating a candidate material to the aging model stem cell line according to an aspect of the present invention; And it may relate to a screening method of a stem cell-promoting material or skin aging improving material comprising the step of measuring the cell viability or stem cell characteristics of the treated stem cell line.

본 발명의 일 측면에 있어서, 상기 줄기세포성의 측정은 노화 모델 줄기세포주의 지방세포로의 분화 정도, 노화 모델 줄기세포주의 유전자 발현 또는 이러한 유전자로부터 코딩된 단백질의 발현을 측정하는 것이며, 상기 유전자는 SOX2(SRY(sex determining region Y)-box 2)(NM_003106), S100B(S100 calcium binding protein B) (NM_006272), NANOG(NM_001297698), 퍼옥시좀 증식자 활성화 수용체 감마(Peroxisome proliferator-activated receptor gamma, PPARγ)(NM_005037), 렙틴(Leptin, LEP)(NM_000230), 아디포넥틴(adiponectin, ADIPOQ)(NM_001177800), 아디포사이트 단백질 2(adipocyte protein 2, FABP4)(NM_001442), 콜라겐 타입II 알파 1(collagen typeII alpha1, COL2A1)(NM_001844), 어그리칸(aggrecan, ACAN)(NM_001135), 오스테오글리신(Osteoglycin gene, OGN)(NM_014057), 및 오스테오칼신(osteocalcin, bone gamma-carboxyglutamic acid-containing protein, BGLAP)(NM_199173)으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자일 수 있다. In one aspect of the present invention, the measurement of stem cellularity is to measure the degree of differentiation into adipocytes of the aging model stem cell line, the gene expression of the aging model stem cell line, or the expression of a protein encoded by such a gene, wherein the gene is SOX2 (SRY (sex determining region Y)-box 2) (NM_003106), S100B (S100 calcium binding protein B) (NM_006272), NANOG (NM_001297698), Peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPARγ) ) (NM_005037), leptin (Leptin, LEP) (NM_000230), adiponectin (ADIPOQ) (NM_001177800), adipocyte protein 2 (FABP4) (NM_001442), collagen type II alpha1 , COL2A1) (NM_001844), aggrecan (ACAN) (NM_001135), osteoglycin gene (OGN) (NM_014057), and osteocalcin (bone gamma-carboxyglutamic acid-containing protein, BGLAP) (NM_199173) ) may be one or more genes selected from the group consisting of.

본 발명의 일 측면에 있어서, 상기 방법은 후보물질을 처리하지 않은 대조군에 비하여 노화 모델 줄기세포주의 세포생존율 또는 줄기세포성을 증가시키는 물질을 피부 노화 개선물질로 판단하는 단계를 더 포함할 수 있다. In one aspect of the present invention, the method may further include determining a substance that increases the cell viability or stem cell property of the aging model stem cell line as a skin aging improving substance compared to a control that is not treated with the candidate substance. .

본 발명의 일 측면에 있어서, 상기 방법은 후보물질을 처리하는 단계 이전에, 진피 유래 성체 줄기세포에 UV-A를 조사하여 노화 모델 줄기세포주를 유도하는 단계를 더 포함할 수 있다. In one aspect of the present invention, the method may further include the step of inducing a senescence model stem cell line by irradiating UV-A to the dermal-derived adult stem cells before the step of treating the candidate material.

본 발명의 일 측면에 있어서, 상기 방법은 진피 유래 성체 줄기세포의 노화를 유도하는 단계 이전에, 진피 유래 섬유아세포를 젤라틴 또는 제4형 콜라겐이 코팅된 배양접시에서 3~10분 간 배양하여 진피 성체 줄기세포를 유도하는 단계를 더 포함할 수 있다. In one aspect of the present invention, in the method, before the step of inducing aging of dermis-derived adult stem cells, dermal-derived fibroblasts are cultured in a gelatin or type 4 collagen-coated culture dish for 3 to 10 minutes to incubate the dermis It may further include the step of inducing adult stem cells.

본 발명의 일 측면에 있어서, 상기 방법은 진피 유래 성체 줄기세포를 유도하는 단계는 배양 후 배양 접시에 붙은 세포들을 분리하는 단계를 더 포함할 수 있다.In one aspect of the present invention, in the method, the step of inducing dermal-derived adult stem cells may further include isolating the cells attached to the culture dish after culturing.

본 명세서에서, 상기 “진피 유래 섬유아세포” 는 제4형 콜라겐이 코팅된 배양접시에서 5분간 배양하였을 때, 초기 5분 내에 배양접시에 붙지는 않지만 4시간 이내에 붙는 세포(SA; Slowly Adhering)를 의미할 수 있다. 본 명세서에서 진피 유래 섬유아세포는 인간의 진피에서 유래한 섬유아세포(Normal human dermal fibroblasts, NHDF) 일 수 있다. In the present specification, the "dermis-derived fibroblasts" are cells (SA; Slowly Adhering) that do not adhere to the culture dish within the initial 5 minutes but adhere within 4 hours when cultured for 5 minutes in a culture dish coated with type 4 collagen. can mean In the present specification, dermal-derived fibroblasts may be fibroblasts derived from human dermis (Normal human dermal fibroblasts, NHDF).

아울러, 본 명세서에서 상기 “진피 유래 성체 줄기세포”는 진피의 섬유아세포로부터 유도된 줄기세포로서, 제4형 콜라겐이 코팅된 배양접시에서 진피 유래 섬유아세포를 5분간 배양하였을 때, 초기 5분 내에 배양접시에 붙은 세포(RA; Rapidly Adhering)를 의미할 수 있다. In addition, in the present specification, the “dermis-derived adult stem cells” are stem cells derived from dermal fibroblasts, and when cultured for 5 minutes in a culture dish coated with type 4 collagen, within the initial 5 minutes It may refer to cells attached to a culture dish (RA; Rapidly Adhering).

본 발명의 일 측면에 있어서, 상기 진피 유래 성체 줄기세포는 진피 유래 섬유아세포를 계대배양하여 얻어지는 세포로서, 제4형 콜라겐이 처리된 배양 접시에서 진피 유래 섬유아세포를 1 내지 10분 동안 배양하였을 때, 콜라겐에 부착되는 세포를 의미할 수 있다. In one aspect of the present invention, the dermal-derived adult stem cells are cells obtained by sub-culturing dermal-derived fibroblasts, and when cultured for 1 to 10 minutes in a culture dish treated with type 4 collagen. , may refer to cells attached to collagen.

구체적으로, 상기 줄기세포는 상기 진피 유래 섬유아세포를 1~10분, 구체적으로 3~10분, 구체적으로 4~6분, 구체적으로 4.5~5.5분 동안 젤라틴 또는 제4형 콜라겐과 반응시켜 얻어진 것일 수 있고, 상기 젤라틴은 증류수에 0.1~1 중량%의 농도로 용해된 것일 수 있으며, 상기 제4형 콜라겐은 증류수에 10~30 μg/ml의 함량으로 용해된 것일 수 있다. 아울러, 상기 젤라틴 또는 제4형 콜라겐은 0~10℃의 온도에서 16~24시간 동안 기질에 코팅시켜 사용할 수 있다. Specifically, the stem cells are those obtained by reacting the dermis-derived fibroblasts with gelatin or type 4 collagen for 1 to 10 minutes, specifically 3 to 10 minutes, specifically 4 to 6 minutes, specifically 4.5 to 5.5 minutes. In addition, the gelatin may be dissolved in distilled water at a concentration of 0.1 to 1% by weight, and the type 4 collagen may be dissolved in distilled water at a content of 10 to 30 μg/ml. In addition, the gelatin or type 4 collagen may be used by coating the substrate at a temperature of 0 to 10° C. for 16 to 24 hours.

본 발명의 일 측면에 있어서, 상기 방법은 줄기세포의 바이오마커인 SOX2, NANOG, S100B의 발현을 감소시킬 수 있다. In one aspect of the present invention, the method can reduce the expression of biomarkers SOX2, NANOG, S100B of stem cells.

본 발명의 일 측면에 있어서, 상기 방법은 줄기세포의 지방세포로의 분화를 현저히 감소시키는 효과가 있어 지방세포의 바이오마커인 PPARγ, ADIPOQ, LEP, FABP4, Oil Red O의 발현을 감소시킬 수 있다. In one aspect of the present invention, the method has an effect of remarkably reducing the differentiation of stem cells into adipocytes, thereby reducing the expression of biomarkers PPARγ, ADIPOQ, LEP, FABP4, and Oil Red O of adipocytes.

본 발명의 일 측면에 있어서, 상기 방법은 줄기세포의 연골세포로의 분화를 현저히 감소시키는 효과가 있어 연골세포의 바이오마커인 COL2A, ACAN의 발현을 감소시킬 수 있다. In one aspect of the present invention, the method has the effect of significantly reducing the differentiation of stem cells into chondrocytes, thereby reducing the expression of COL2A and ACAN, which are biomarkers of chondrocytes.

본 발명의 일 측면에 있어서, 상기 방법은 줄기세포의 골아세포로의 분화를 현저히 감소시키는 효과가 있어 골아세포의 바이오마커인 OGN, OCN의 발현을 감소시킬 수 있다. In one aspect of the present invention, the method has the effect of remarkably reducing the differentiation of stem cells into osteoblasts, thereby reducing the expression of OGN and OCN, which are biomarkers of osteoblasts.

본 발명의 일 측면에 따른 노화 모델 줄기세포 및 이를 제조하는 방법은 피부 노화개선 후보물질 검색 시스템 구축에 활용할 수 있고 본 발명에 의해 발굴된 신규 피부 노화개선 후보물질은 화장료 조성물로 사용될 수 있다. The aging model stem cell and the method for manufacturing the same according to an aspect of the present invention can be utilized to build a skin aging improvement candidate material search system, and the novel skin aging improvement candidate material discovered by the present invention can be used as a cosmetic composition.

본 발명은 일 측면에 있어서, 본 발명의 일 측면에 따른 피부 노화 개선 물질의 스크리닝 방법에 따라 스크리닝된 피부 노화 개선 물질에 관한 것일 수 있다. In one aspect, the present invention may relate to a skin aging improving material screened according to the screening method for a skin aging improving material according to an aspect of the present invention.

본 발명은 일 측면에 있어서, 본 발명의 일 측면에 따른 피부 노화 개선 물질을 포함하는 조성물에 관한 것일 수 있다. In one aspect, the present invention may relate to a composition comprising the skin aging improving material according to an aspect of the present invention.

본 발명의 일 측면에 있어서, 상기 조성물은 피부외용제 조성물 일 수 있다. In one aspect of the present invention, the composition may be a composition for external application to the skin.

본 발명의 일 측면에 있어서, 상기 조성물은 피부 노화 개선용, 예방용, 또는 치료용 조성물일 수 있다. In one aspect of the present invention, the composition may be a composition for improving, preventing, or treating skin aging.

본 발명의 일 측면에 있어서, 상기 조성물은 항노화 또는 항주름용 조성물일 수 있다. In one aspect of the present invention, the composition may be an anti-aging or anti-wrinkle composition.

본 발명은 일측면에 있어서, 진피층에 존재하는 진피줄기세포를 분리 동정하여 자외선 조사를 통한 적절한 노화조건을 확립하여 새로운 노화개선 유효성 평가기술을 개발하는데 도움을 주고자 한다. 구체적으로 진피 섬유아세포에서 분리해낸 진피줄기세포에 UV-A를 조사하여 진피줄기세포의 바이오마커인 SOX2, NANOG, S100B의 발현이 감소하는 노화조건을 확립하였고, 이렇게 노화된 진피줄기세포는 정상 진피줄기세포에 비해 지방세포, 골아세포, 연골세포로 분화할 수 있는 다분화능이 현저하게 감소함을 확인하였다. 이를 바탕으로 UV-A에 인한 진피줄기세포의 줄기세포성 감소를 회복할 수 있는 신규 항노화 소재 개발의 기본이 되는 유효성 평가법을 제공할 수 있다.
In one aspect, the present invention aims to help develop a new anti-aging efficacy evaluation technology by isolating and identifying dermal stem cells present in the dermal layer and establishing appropriate aging conditions through ultraviolet irradiation. Specifically, dermal stem cells isolated from dermal fibroblasts were irradiated with UV-A to establish aging conditions in which the expression of biomarkers of dermal stem cells, SOX2, NANOG, and S100B, decreased. It was confirmed that the pluripotency to differentiate into adipocytes, osteoblasts, and chondrocytes was significantly reduced compared to stem cells. Based on this, it is possible to provide an efficacy evaluation method, which is the basis for the development of new anti-aging materials that can restore the stem cell decline of dermal stem cells caused by UV-A.

이하, 하기의 시험예를 통하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다. 그러나 하기의 시험예는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위해 예시의 목적으로만 제공된 것일 뿐, 본 발명의 범주 및 범위가 이에 한정되지 않는다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail through the following test examples. However, the following test examples are provided only for the purpose of illustration in order to help the understanding of the present invention, and the scope and scope of the present invention are not limited thereto.

[시험예 1] 제4형 콜라겐을 이용한 진피 유래 섬유아세포에서 RA/SA 세포의 분리[Test Example 1] Isolation of RA/SA cells from dermal-derived fibroblasts using type 4 collagen

인간 피부 진피 유래 섬유아세포 (Normal human dermal fibroblasts, NHDF)를 론자(Lonza, Inc. Walkersville, MD, USA, NHDF-Ad-Der Fibroblasts, CC-2511)에서 구입하였다. 상기 섬유아세포를 75 cm2 T-플라스크에서 계대배양 하여, CO2 배양기 (CO2 Incubator)에서 37℃, 5% CO2 조건하에서 배양하였다. 세포를 배양하여 75 cm2 T-플라스크에 섬유아세포가 가득차면, 트립신/EDTA로 처리한 뒤, 세포를 떼어내어 플라스크내에 존재했던 총 세포의 1:4로 계대배양하는 것을 3회 반복하였고, 이렇게 해당 세포의 양을 충분히 늘려서 RA/SA세포로의 분리를 시도하였다. 우선, 20 μg/ml의 제4형 콜라겐(Sigma Aldrich Co.)을 100 mm 배양접시에 5ml씩 넣어주어 4℃에서 24시간 동안 코팅하였다. 0.25중량%의 트립신 (Trypsin-EDTA)을 사용하여 T-플라스크로부터 섬유아세포를 분리한 뒤, 15 ml 팔콘 튜브(falcon tube)에 옮겨 1200rpm에서 원심 분리시켜 5분간 세포를 가라앉힌 다음, 상층액을 제거한 뒤에 5ml의 DMEM배지 (Lonza Co.) 를 넣어주어 세포를 현탁하고, 제4형 콜라겐이 코팅된 배양접시에서 5분간 배양하였다. 배양 후, 배양접시에 붙은 세포(RA; Rapidly Adhering)와 초기 5분 내에 배양접시에 붙지는 않지만 4시간 이내에 붙는 세포(SA; Slowly Adhering)로 각각 분리하였고, 상기 RA 세포를 기탁하였다 (KCTC11995BP). 이렇게 수득된 RA 세포가 진피 유래 성체 줄기세포에 해당한다.
Normal human dermal fibroblasts (NHDF) were purchased from Lonza (Lonza, Inc. Walkersville, MD, USA, NHDF-Ad-Der Fibroblasts, CC-2511). By sub-culturing the fibroblast cells in 75 cm 2 T- flask, and cultured in the CO 2 incubator (CO 2 Incubator) at 37 ℃, 5% CO 2 condition. When the cells were cultured and the 75 cm 2 T-flask was full of fibroblasts, treated with trypsin/EDTA, the cells were removed and subcultured at 1:4 of the total cells present in the flask was repeated 3 times. Separation into RA/SA cells was attempted by sufficiently increasing the amount of the cells. First, 20 μg/ml of type 4 collagen (Sigma Aldrich Co.) was put into a 100 mm culture dish by 5 ml and coated at 4° C. for 24 hours. After separating the fibroblasts from the T-flask using 0.25% by weight of trypsin (Trypsin-EDTA), transferred to a 15 ml falcon tube, centrifuged at 1200 rpm to sink the cells for 5 minutes, and then the supernatant After removal, 5 ml of DMEM medium (Lonza Co.) was added to suspend the cells, and incubated for 5 minutes in a culture dish coated with type 4 collagen. After incubation, cells that adhere to the culture dish (RA; Rapidly Adhering) and cells that do not adhere to the culture dish within the first 5 minutes but adhere within 4 hours (SA; Slowly Adhering) were respectively separated, and the RA cells were deposited (KCTC11995BP). . The RA cells thus obtained correspond to dermal-derived adult stem cells.

[시험예 2] UV-A의 조사를 통한 노화 모델 줄기세포주의 제조[Test Example 2] Preparation of aging model stem cell line through UV-A irradiation

(1) UV-A 의 조사 조건 및 방법(1) UV-A irradiation conditions and methods

UV-A 조사로 진피 유래 성체 줄기세포를 노화 모델 줄기세포주로 유도하기 위하여 하기와 같은 조건으로 UV-A의 조사를 수행하였다. 분리된 진피 유래 성체 줄기세포를 2 X 105 개/ 2 ml가 되도록 페놀 레드(phenol red)가 첨가되지 않은 DMEM을 사용하여 35π 하이드로셀(HydroCell) 배양접시에 접종한 후 자외선 조사장치(BioSun, Vilber Lourmat, France)를 사용하여 UV-A를 조사하였다.
UV-A irradiation was performed under the following conditions to induce dermal-derived adult stem cells into senescence model stem cell lines by UV-A irradiation. After inoculating the separated dermis-derived adult stem cells in a 35π HydroCell culture dish using DMEM without phenol red to become 2 X 10 5 / 2 ml, an ultraviolet irradiation device (BioSun, UV-A was irradiated using Vilber Lourmat, France).

(2) UV-A 조사에 따른 세포 생존력 및 구(sphere) 형성 여부 측정
(2) Measurement of cell viability and sphere formation according to UV-A irradiation

세포 생존력을 유지하면서도 줄기세포로서의 특성을 상실한 노화 모델 줄기세포주를 확립하기 위하여 하기와 같은 실험을 진행하였다. In order to establish a senescence model stem cell line that has lost its characteristics as a stem cell while maintaining cell viability, the following experiment was performed.

먼저, UV-A가 진피 유래 성체 줄기세포에 미치는 독성을 알아보기 위해, 시험예 1에 따라서 수득된 진피 유래 성체 줄기세포에 각각 1.5, 3, 4.5, 6, 7.5 J/cm2로 UV-A를 조사하였다. 이후 2일간 부유배양을 한 후, CCK8 검정(assay)으로 진피 유래 성체 줄기세포의 세포 생존율을 분석하였다. CCK8 검정을 수행하기 위해서, 부유배양 후에 CCK8 시약을 첨가하여 2 시간 동안 5% CO2, 37 ℃ 배양기에서 배양하였다. ELISA 판독기(Molecular Devices, USA)를 사용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 세포를 첨가하지 않은 배지만 넣은 대조군의 흡광도를 기준으로 세포생존율을 산출하였다. 이러한 분석 결과를 도 1의 A에 그래프로 나타내었다. First, in order to investigate the toxicity of UV-A on dermal-derived adult stem cells, 1.5, 3, 4.5, 6, 7.5 J/cm 2 of UV-A was applied to the dermal-derived adult stem cells obtained according to Test Example 1, respectively. was investigated. After suspension culture for 2 days, cell viability of dermal-derived adult stem cells was analyzed by CCK8 assay. In order to perform the CCK8 assay, CCK8 reagent was added after suspension culture and incubated in an incubator at 5% CO 2 , 37° C. for 2 hours. Absorbance was measured at 450 nm using an ELISA reader (Molecular Devices, USA), and cell viability was calculated based on the absorbance of a control group containing only a medium to which no cells were added. The results of this analysis are graphically shown in FIG. 1A .

도1의 A에 따르면 6 J/cm2 이상의 UV-A가 조사된 진피 유래 성체 줄기세포에서 세포 생존력이 50% 이상 감소하였음을 확인하였다. According to FIG. 1A, it was confirmed that cell viability was reduced by 50% or more in dermis-derived adult stem cells irradiated with UV-A of 6 J/cm 2 or more.

진피 유래 성체 줄기세포를 부유배양하면 3차원의 구(sphere)를 형성하게 된다. 4.5 J/cm2 및 되는데 6 J/cm2 의 조사량으로 조사한 진피 유래 성체 줄기세포의 부유배양 결과를 광학현미경을 이용하여 확인하였으며, 이러한 그림은 도 1의 B에 나타내었다. When dermal-derived adult stem cells are suspended in culture, a three-dimensional sphere is formed. The results of suspension culture of dermis-derived adult stem cells irradiated with an irradiation dose of 4.5 J/cm 2 and 6 J/cm 2 of dermis were confirmed using an optical microscope, and these figures are shown in FIG. 1B .

도 1의 B에 따르면 6 J/cm2의 UV-A가 조사된 진피 유래 성체 줄기세포는 부유배양을 하더라도 구를 형성하지 못하고 줄기세포로서의 특징을 잃게 되는 것을 확인할 수 있었다. According to FIG. 1B, it was confirmed that the dermis-derived adult stem cells irradiated with UV-A of 6 J/cm 2 did not form spheres and lost their characteristics as stem cells even after suspension culture.

따라서, 이러한 결과를 바탕으로 세포생존력을 유지하면서 줄기세포성을 상실하는 진피 유래 성체 줄기세포의 노화모델을 확립하기 위해 4.5 J/cm2의 조사량을 선정하였다.
Therefore, based on these results, an irradiation dose of 4.5 J/cm 2 was selected to establish a senescence model of dermal-derived adult stem cells that loses stem cell properties while maintaining cell viability.

(3) 급성 및 만성 노화모델의 줄기세포성 감소여부 비교
(3) Comparison of reduced stem cell characteristics in acute and chronic aging models

시험예 1에서 수득한 진피 유래 성체 줄기세포에 대하여 UV-A의 조사 방법을 달리하여 급성과 만성 노화모델로 나눈 뒤, 어느 것이 더 적합한 노화모델에 해당하는지 여부를 실험하였다. 이는 총 조사량은 동일하게 하면서 조사 횟수를 한번에 하거나 또는 수회로 나누어서 하는 것에 차이점을 두어 구상하였다.
The dermal-derived adult stem cells obtained in Test Example 1 were divided into acute and chronic aging models by changing the UV-A irradiation method, and then whether which corresponds to the more suitable aging model was tested. This was conceived with the difference in doing the number of irradiations at once or divided into several times while the total amount of irradiation was the same.

1) 급성 및 만성 노화모델1) Acute and chronic aging models

급성 노화모델의 경우 진피 유래 성체 줄기세포에 총 4.5 J/cm2 의 조사량으로 한번 조사를 수행하였으며, 만성 노화모델의 경우 총 4.5 J/cm2의 조사량을 3회로 나누어 조사 간에 하루의 간격을 두어 조사를 수행하였다. 이러한 급성 및 만성 노화모델에 대한 조사 방법은 도 2에도 나타나 있다.
In the case of acute aging model, dermal-derived adult stem cells were irradiated once with a total dose of 4.5 J/cm 2 , and in the case of chronic aging model, a total dose of 4.5 J/cm 2 was divided into three doses, with an interval of one day between irradiations. An investigation was carried out. The investigation method for these acute and chronic aging models is also shown in FIG.

2) 급성 및 만성 노화모델에 대한 줄기세포성 확인2) Confirmation of stem cell properties for acute and chronic aging models

위와 같은 급성 및 만성 노화모델 줄기세포주 각각을 2 ml의 PBS로 세척한 다음, 트리졸 시약(Trizol reagent, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 사용하여 세포 내의 RNA를 분리하였다. 분리된 RNA를 키아젠사의 RNA 키트(QIAGEN RNeasy kit, QIAGEN, Valencia, CA)로 한번 더 정제한 후, 애질런트사의 바이오어낼라이저 2100 모델 기기(Agilent 2100 BioAnalyzer, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)를 사용하여 RNA의 질(quality)을 확인하였다. 인비트로젠사의 역전사키트(Superscript Reverse Transcriptase (RT) kit, Invitrogen, Carlsbad, CA)를 이용하여 상기 RNA로부터 cDNA를 합성하였고, 이를 실시간 역전사 중합 효소 연쇄반응(real time-reverse transcription polymerase chain reaction, Q-RT-PCR)을 통해 정량적으로 분석하였다. Each of the above acute and chronic aging model stem cell lines was washed with 2 ml of PBS, and then intracellular RNA was isolated using Trizol reagent (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). The isolated RNA was purified once again with QIAGEN's RNA kit (QIAGEN RNeasy kit, QIAGEN, Valencia, CA), and then the Agilent's Bioanalyzer 2100 model instrument (Agilent 2100 BioAnalyzer, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) was used to confirm the quality of RNA. cDNA was synthesized from the RNA using Invitrogen's Superscript Reverse Transcriptase (RT) kit, Invitrogen, Carlsbad, CA) -RT-PCR) was quantitatively analyzed.

진피의 세포외 기질 유전자의 발현 패턴 변화를 어플라이드 바이오시스템사의 택맨 유전자 발현 시스템(TaqMan gene expression assay kit,Applied Biosystems, Foster City, CA)을 이용하여 줄기세포 바이오마커 유전자인 SOX2(Hs01053049_s1), S100B(Hs00389217_m1), 및 NANOG(Hs04260366_g1)의 발현 정도를 정량적으로 분석하였으며, 그 결과를 도 3에 나타내었다. 통계는 양측 스튜던트 t 테스트로 검증하였으며, p 값이 0.05 이하일 때 유의적인 차이가 있다고 표시하였다.Stem cell biomarker genes SOX2 (Hs01053049_s1), S100B ( The expression levels of Hs00389217_m1) and NANOG (Hs04260366_g1) were quantitatively analyzed, and the results are shown in FIG. 3 . Statistics were verified by the two-tailed Student's t test, and significant differences were indicated when the p value was 0.05 or less.

도 3에 따르면, 한 차례 조사한 급성 노화모델의 경우 UV-A를 조사하지 않은 대조군에 비하여 줄기세포 바이오마커 유전자의 발현 정도가 거의 차이 나지 않았다. 그러나, 3회 조사한 만성 노화모델의 경우 대조군에 비하여 유전자의 발현정도가 SOX2는 58%, NANOG는 63%, 그리고 S100B는 59% 감소된 결과를 나타내었다. According to FIG. 3 , in the case of the acute aging model irradiated once, the expression level of the stem cell biomarker gene was hardly different compared to the control group not irradiated with UV-A. However, in the case of the chronic aging model investigated three times, compared to the control group, SOX2 showed a 58% decrease, NANOG 63%, and S100B 59% decrease.

이러한 결과에 따르면, 줄기세포의 세포 생존력을 그대로 유지하면서 줄기세포성이 상실된 노화 모델 줄기세포주를 확립하는데 있어서는 급성 노화모델보다 만성 노화모델과 같이 일정한 간격을 두고 수회에 나누어 UV-A를 조사하는 것이 더 바람직 하다는 것을 확인할 수 있었다.
According to these results, in establishing an aging model stem cell line in which stem cell properties are lost while maintaining cell viability of stem cells, it is better to irradiate UV-A several times at regular intervals like a chronic aging model rather than an acute aging model. It was confirmed that it was more preferable.

[시험예 3] 만성 노화모델 줄기세포주에 대한 줄기세포성 인자의 발현정도 확인[Test Example 3] Confirmation of the expression level of stem cell factors for chronic aging model stem cell lines

상기와 같이 만성 노화모델이 더 적합하다는 것을 확인하였으므로, 하기 실험에서는 시험예 2에 의해서 유도된 만성 노화모델 줄기세포주에 대하여 지방세포, 골아세포, 또는 연골세포의 바이오마커 유전자의 발현 정도를 확인하였다. As it was confirmed that the chronic aging model is more suitable as described above, in the following experiment, the expression level of the biomarker gene of adipocytes, osteoblasts, or chondrocytes was confirmed with respect to the chronic aging model stem cell line induced by Test Example 2. .

시험예 2에 따른 만성 노화모델 줄기세포를 지방세포, 골아세포, 연골세포로 각각 분화를 유도하는 분화배지에서 배양하였다. The chronic aging model stem cells according to Test Example 2 were cultured in a differentiation medium for inducing differentiation into adipocytes, osteoblasts, and chondrocytes, respectively.

지방세포의 분화는 10중량% 우태아혈청과 0.1% 인슐린(Insulin), 1μM의 덱사메타손(Dexamethasone), 0.5mM의 아이비엠엑스(IBMX), 1μM의 트로글리타존 (Troglitazone)이 첨가된 DMEM배지를 이용하여 유도되었다. 만성 노화모델 줄기세포는 각각 6 웰 배양접시에 각각 20 X 104 개씩 배양한 후 지방세포 분화배지로 7일간 분화를 유도하였다.Adipocyte differentiation was induced using DMEM medium supplemented with 10 wt% fetal bovine serum, 0.1% insulin, 1 μM dexamethasone, 0.5 mM IBMX, and 1 μM troglitazone. became After culturing each of the chronic aging model stem cells in a 6-well culture dish at 20 X 10 4 each, differentiation was induced with adipocyte differentiation medium for 7 days.

골아세포의 분화는 론자 (Lonza, Inc. Walkersville, MD, USA)의 골아세포 분화배지(hMSC Mesenchymal Stem Cell Osteogenic Differentiation Medium, PT-3002)를 이용하여 유도되었다. 만성 노화모델 줄기세포는 각각 6 웰 배양접시에 각각 20 X 104 개씩 배양한 후 골아세포 분화배지로 14일간 분화를 유도하였다.Osteoblast differentiation was induced using Lonza (Lonza, Inc. Walkersville, MD, USA) osteoblast differentiation medium (hMSC Mesenchymal Stem Cell Osteogenic Differentiation Medium, PT-3002). After culturing each of the chronic aging model stem cells in a 6-well culture dish, 20 X 10 4 each, differentiation was induced for 14 days with an osteoblast differentiation medium.

연골세포의 분화는 (Lonza, Inc. Walkersville, MD, USA)의 연골세포 분화배지(hMSC Mesenchymal Stem Cell Condrogenic Differentiation Medium, PT-3003)를 이용하여 유도되었다. 만성 노화모델 줄기세포는 각각 6 웰 배양접시에 각각 20 X 104 개씩 배양한 후 연골세포 분화배지로 21일간 분화를 유도하였다.Chondrocyte differentiation was induced using (Lonza, Inc. Walkersville, MD, USA) chondrocyte differentiation medium (hMSC Mesenchymal Stem Cell Condrogenic Differentiation Medium, PT-3003). After culturing each of the chronic aging model stem cells in a 6-well culture dish, 20 X 10 4 each, differentiation was induced for 21 days with a chondrocyte differentiation medium.

이렇게 배양된 세포들에 대하여 시험예 2에 기재된 방법과 동일하게 유전자의 발현 정도를 확인하였고, 지방세포 바이오마커 유전자로서 퍼옥시좀 증식자 활성화 수용체 감마(PPARγ, Hs01115513_m1), 렙틴(LEP, Hs00174877_m1), 아디포넥틴(ADIPOQ, Hs00605917_m1), 및 아디포사이트 단백질 2(FABP4, Hs00609791_m1); 연골세포 바이오마커 유전자로서 콜라겐 타입II 알파 1(COL2A1, Hs00264051_m1) 및 어그리칸(ACAN. Hs00153936_m1); 그리고 골아세포 바이오마커 유전자로서 오스테오글리신(OGN, Hs00247901_m1) 및 오스테오칼신(OCN, Hs01587814_g1)의 발현 정도를 정량적으로 분석하였다. 통계는 양측 스튜던트 t 테스트로 검증하였으며, p 값이 0.05 이하일 때 유의적인 차이가 있다고 표시하였다.For the cells cultured in this way, the expression level of the gene was confirmed in the same manner as in Test Example 2, and as adipocyte biomarker genes, peroxisome proliferator activation receptor gamma (PPARγ, Hs01115513_m1), leptin (LEP, Hs00174877_m1) , adiponectin (ADIPOQ, Hs00605917_m1), and adipocytic protein 2 (FABP4, Hs00609791_m1); Collagen type II alpha 1 (COL2A1, Hs00264051_m1) and aggrecan (ACAN. Hs00153936_m1) as chondrocyte biomarker genes; And, as osteoblast biomarker genes, the expression levels of osteoglycine (OGN, Hs00247901_m1) and osteocalcin (OCN, Hs01587814_g1) were quantitatively analyzed. Statistics were verified by two-tailed Student's t test, and significant differences were indicated when the p value was 0.05 or less.

지방세포 바이오마커 유전자에 대한 분석 결과는 도 4에 나타내었으며, 연골세포 및 골아세포 바이오마커 유전자에 대한 분석 결과는 도 5에 나타내었다. The analysis results for the adipocyte biomarker genes are shown in FIG. 4 , and the analysis results for the chondrocyte and osteoblast biomarker genes are shown in FIG. 5 .

도 4 내지 도 5에 따르면, 모든 바이오마커 유전자의 발현량은 만성 노화 모델 줄기세포주에서 대조군에 비해 현저하게 감소한 것을 확인할 수 있었다. 즉, 대조군 대비 각 유전자의 발현 감소량은 다음과 같다. 지방세포 바이오마커 유전자로서 퍼옥시좀 증식자 활성화 수용체 감마(PPARγ, 약 90% 감소), 렙틴(LEP, 약90% 감소), 아디포넥틴(ADIPOQ, 약 70% 감소), 및 아디포사이트 단백질 2(FABP4, 약 45% 감소); 연골세포 바이오마커 유전자로서 콜라겐 타입II 알파 1(COL2A1, 약 65% 감소) 및 어그리칸(ACAN. 약 85% 감소); 그리고 골아세포 바이오마커 유전자로서 오스테오글리신(OGN, 약 70% 감소) 및 오스테오칼신(OCN, 약 64% 감소).4 to 5 , it was confirmed that the expression levels of all biomarker genes were significantly reduced in the chronic aging model stem cell line compared to the control group. That is, the amount of decrease in expression of each gene compared to the control group is as follows. Peroxisome proliferator activated receptor gamma (PPARγ, approximately 90% decrease), leptin (LEP, approximately 90% decrease), adiponectin (ADIPOQ, approximately 70% decrease), and adipocyte protein 2 as adipocyte biomarker genes ( FABP4, reduced by about 45%); Collagen type II alpha 1 (COL2A1, about 65% reduction) and aggrecan (ACAN. About 85% reduction) as chondrocyte biomarker genes; and osteoglycine (OGN, approximately 70% reduction) and osteocalcin (OCN, approximately 64% reduction) as osteoblast biomarker genes.

상기 시험예 1 내지 3의 결과에 따르면 본 발명의 일 측면에 따른 만성 노화 모델 줄기세포주는 세포의 생존력을 유지하면서 그 줄기세포성을 상실하는 특징을 나타내는 것에 해당하며, 이를 이용하여 줄기세포성을 촉진시키거나 피부 노화를 개선할 수 있는 물질을 확인할 수 있을 것이다. According to the results of Test Examples 1 to 3, the chronic aging model stem cell line according to an aspect of the present invention corresponds to exhibiting the characteristic of losing stem cell property while maintaining cell viability, and using this You will be able to identify substances that can promote or improve skin aging.

구체적으로, 미지의 물질을 본 발명의 노화 모델 줄기세포주에 처리하고, 줄기세포성을 나타내는 유전자들 또는 이들로부터 코딩된 단백질의 발현량을 비교하여, 유전자 또는 단백질의 발현량을 증가시키는 물질은 줄기세포성을 향상 또는 촉진시키거나 그로 인하여 피부 노화를 개선할 수 있는 물질이라고 판단하는 것이 가능할 것이다.
Specifically, by treating an unknown substance in the aging model stem cell line of the present invention, and comparing the expression level of the genes or proteins encoded therefrom, the material that increases the expression level of the gene or protein is the stem cell line. It will be possible to determine that it is a substance capable of improving or promoting cellularity or thereby improving skin aging.

[시험예 4] Oil Red O의 발현 관찰 [Test Example 4] Expression observation of Oil Red O

시험예 3 중에서 지방세포로 분화된 진피 유래 성체 줄기세포를 확인하기 위해 시험예 3에 따라 지방세포로의 분화를 유도하는 배양배지에서 배양된 노화 모델 줄기세포주의 지방구를 오일 레드 오(Oil Red O)로 염색하였다. 세포를 4중량% 파라포름알데히드(paraformaldehyde)로 10분간 상온에서 고정 시킨 후, 60중량% 이소프로판올(isopropanol)로 세척하였다. 그리고 세포를 오일 레드 오(Oil Red O) 염색약(Sigma, USA)으로 10분간 상온에서 염색하였다. 염색 후 과도한 염색은 70% 에탄올로 제거하고, PBS로 세척하였다. To identify dermal-derived adult stem cells differentiated into adipocytes in Test Example 3, adipocytes of the aging model stem cell line cultured in a culture medium induced to differentiate into adipocytes according to Test Example 3 were subjected to Oil Red O (Oil Red O). ) was stained. The cells were fixed with 4 wt% paraformaldehyde at room temperature for 10 minutes, and then washed with 60 wt% isopropanol. And the cells were stained with Oil Red O dye (Sigma, USA) at room temperature for 10 minutes. After staining, excess staining was removed with 70% ethanol and washed with PBS.

이렇게 염색된 지방구를 확인하기 위하여 광학현미경을 이용하여 세포의 염색 상태를 확인하였고, 이를 도 4의 E에 나타내었다. In order to confirm the stained adipocytes, the staining state of the cells was checked using an optical microscope, and this is shown in FIG. 4E .

도 4의 E에 따르면 본 발명에 따른 노화모델의 경우 대조군에 비하여 지방구의 수가 현저하게 감소한 것을 확인할 수 있으며, 이로 인해 줄기세포가 지방세포로 잘 분화하지 않았다는 것을 확인할 수 있었다.
According to FIG. 4E , in the case of the aging model according to the present invention, it was confirmed that the number of fat cells was significantly reduced compared to the control group, and thus it was confirmed that the stem cells did not differentiate well into adipocytes.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.As described above in detail a specific part of the present invention, for those of ordinary skill in the art, this specific description is only a preferred embodiment, and it is clear that the scope of the present invention is not limited thereto. Accordingly, the substantial scope of the present invention will be defined by the appended claims and their equivalents.

한국생명공학연구원Korea Institute of Biotechnology and Biotechnology KCTC11995BPKCTC11995BP 2011080820110808

Claims (23)

노화 모델 세포로서,
상기 노화 모델 세포는 진피 유래 성체 줄기세포에 UV-A를 20 - 28시간 간격으로 한번에 1.3 - 1.7 J/cm2으로 2회 이상 조사하여 제조된 것으로 노화되지 않은 대조군 진피 유래 성체 줄기세포를 기준으로 줄기세포 바이오마커의 유전자의 발현 또는 이러한 유전자로부터 코딩된 단백질의 발현이 감소된 것이고,
상기 줄기세포 바이오마커 유전자는 SOX2(SRY(sex determining region Y)-box 2)(NM_003106), S100B(S100 calcium binding protein B) (NM_006272), 및 NANOG(NM_001297698)으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상인 것인, 노화 모델 세포.As a senescence model cell,
The aging model cells dermis-derived adult stem cells UV-A 20 to the - relative to the 1.7 J / cm 2 as a control dermis-derived non-aging to be investigated were prepared twice or more adult stem cells at a time 28 interval 1.3 The expression of a gene of a stem cell biomarker or the expression of a protein encoded by such a gene is reduced,
The stem cell biomarker gene is at least one selected from the group consisting of SOX2 (sex determining region Y)-box 2 (NM_003106), S100 calcium binding protein B (S100B) (NM_006272), and NANOG (NM_001297698). , senescence model cells. 제1항에 있어서,
상기 노화 모델 세포는 하기 특성 중 하나 이상을 가지는 것인 노화 모델 세포:
1) 노화되지 않은 대조군 진피 유래 성체 줄기세포를 기준으로, 줄기세포 바이오마커 유전자의 발현 또는 이러한 유전자로부터 코딩된 단백질의 발현이 60% 이상 감소한 것인 특성;
2) 노화되지 않은 대조군 진피 유래 성체 줄기세포를 기준으로, 지방세포 바이오마커 유전자의 발현 또는 이러한 유전자로부터 코딩된 단백질의 발현이 60% 이상 감소한 것이고, 상기 지방세포 바이오마커는 퍼옥시좀 증식자 활성화 수용체 감마(Peroxisome proliferator-activated receptor gamma, PPARγ)(NM_005037), 렙틴(Leptin, LEP)(NM_000230), 아디포넥틴(adiponectin, ADIPOQ)(NM_001177800), 및 아디포사이트 단백질 2(adipocyte protein 2, FABP4)(NM_001442)으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상인 특성;
3) 노화되지 않은 대조군 진피 유래 성체 줄기세포를 기준으로, 연골세포 바이오마커 유전자의 발현 또는 이러한 유전자로부터 코딩된 단백질의 발현이 60% 이상 감소한 것이고, 상기 연골세포 바이오마커는 콜라겐 타입II 알파 1(collagen typeII alpha1, COL2A1)(NM_001844), 및 어그리칸(aggrecan, ACAN)(NM_001135)중 하나 이상인 특성; 및
4) 노화되지 않은 대조군 진피 유래 성체 줄기세포를 기준으로, 골아세포 바이오마커 유전자의 발현 또는 이러한 유전자로부터 코딩된 단백질의 발현이 60% 이상 감소한 것이고, 상기 골아세포 바이오마커는 오스테오글리신(Osteoglycin gene, OGN)(NM_014057), 및 오스테오칼신(osteocalcin, bone gamma-carboxyglutamic acid-containing protein, BGLAP)(NM_199173)중 하나 이상인 특성.According to claim 1,
The senescence model cell has one or more of the following characteristics:
1) Based on the non-senescent control dermal-derived adult stem cells, the expression of the stem cell biomarker gene or the expression of the protein encoded by the gene is reduced by 60% or more;
2) Based on the non-senescent control dermal-derived adult stem cells, the expression of the adipocyte biomarker gene or the expression of the protein encoded by the gene was reduced by 60% or more, and the adipocyte biomarker activates the peroxisome proliferator Peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPARγ) (NM_005037), leptin (LEP) (NM_000230), adiponectin (ADIPOQ) (NM_001177800), and adipocyte protein 2 (FABP4) ( NM_001442) at least one characteristic selected from the group consisting of;
3) Based on the non-aging control dermis-derived adult stem cells, the expression of the chondrocyte biomarker gene or the expression of a protein encoded from this gene was reduced by 60% or more, and the chondrocyte biomarker is collagen type II alpha 1 ( collagen typeII alpha1, COL2A1) (NM_001844), and aggrecan (ACAN) (NM_001135) at least one characteristic; and
4) Based on the non-senescent control dermis-derived adult stem cells, the expression of the osteoblast biomarker gene or the expression of a protein encoded from this gene is reduced by 60% or more, and the osteoblast biomarker is osteoglycin (Osteoglycin gene) , OGN) (NM_014057), and osteocalcin (bone gamma-carboxyglutamic acid-containing protein, BGLAP) (NM_199173). 제1항에 있어서,
상기 진피 유래 성체 줄기세포는 인간의 진피 유래 성체 줄기세포(human dermal stem/progenitor cells, hDSPCs)인 노화 모델 세포.According to claim 1,
The dermal-derived adult stem cells are human dermal stem/progenitor cells (hDSPCs), which are senescence model cells. 제3항에 있어서,
상기 진피 유래 성체 줄기세포는 기탁번호 KCTC11995BP의 줄기세포인 노화 모델 세포.4. The method of claim 3,
The dermis-derived adult stem cells are senescence model cells that are stem cells of accession number KCTC11995BP. 삭제delete 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 노화 모델 세포를 유효성분으로 포함하는 조성물.A composition comprising the senescence model cell according to any one of claims 1 to 4 as an active ingredient. 제6항에 있어서,
상기 조성물은 피부 노화 개선물질 또는 줄기세포성 촉진 물질의 스크리닝용, 또는 탐지용 조성물.7. The method of claim 6,
The composition is a composition for screening, or detection of a skin aging improving material or a stem cell promoting material. 진피 유래 성체 줄기세포에 UV-A를 조사하는 것을 포함하는 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 노화 모델 세포의 제조 방법.A method for producing a senescence model cell according to any one of claims 1 to 4, comprising irradiating UV-A to dermal-derived adult stem cells. 제8항에 있어서,
노화모델은 진피 유래 성체 줄기세포에 UV-A를 20-28시간 간격으로 한번에 1.3~1.7 J/cm2으로 2회 이상 조사하여 제조되는 것인 방법. 9. The method of claim 8,
The method of aging models at a time is a UV-A into the dermis-derived adult stem cells in the time interval 20-28 1.3 ~ 1.7 J / cm 2 to be produced by irradiating two or more times. 제9항에 있어서,
UV-A의 조사는 22-26시간 간격으로 한번에 1.4-1.6 J/cm2으로 3회 이상 조사하는 것인 방법.10. The method of claim 9,
The method of irradiating UV-A at 1.4-1.6 J/cm 2 at an interval of 22-26 hours at least three times. 제8항에 있어서,
UV-A의 조사는 20-28시간 간격으로 총 조사량이 4.0~5.0 J/cm2이 되도록 n회 이상 반복하여 수행되고,
상기 n은 2 이상 10이하의 정수이며,
한 회당 조사되는 조사량은
Figure 112014119592534-pat00002
인 방법.9. The method of claim 8,
UV-A irradiation is repeated n times or more so that the total irradiation amount is 4.0-5.0 J/cm 2 at intervals of 20-28 hours,
Wherein n is an integer of 2 or more and 10 or less,
The amount of irradiation per session is
Figure 112014119592534-pat00002
how to be. 제8항에 있어서,
상기 방법은 UV-A를 조사하기 이전에, 진피 유래 섬유아세포를 젤라틴 또는 제4형 콜라겐이 코팅된 배양접시에서 3~10분 간 배양하여 진피 성체 줄기세포를 유도하는 단계를 더 포함하는 방법.9. The method of claim 8,
The method further comprises inducing dermal adult stem cells by culturing dermal-derived fibroblasts in a culture dish coated with gelatin or type 4 collagen for 3 to 10 minutes prior to UV-A irradiation. 제12항에 있어서,
진피 유래 성체 줄기세포를 유도하는 단계는 배양 후 배양 접시에 붙은 세포들을 분리하는 단계를 더 포함하는 방법.13. The method of claim 12,
The step of inducing dermal-derived adult stem cells further comprises isolating the cells attached to the culture dish after culturing. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 노화 모델 세포; 및
노화 모델 세포의 세포생존율 또는 줄기세포성을 확인할 수 있는 장치를 포함하는 줄기세포성 촉진 물질 또는 피부 노화 개선 물질의 스크리닝 키트.A senescence model cell according to any one of claims 1 to 4; and
A screening kit for a stem cell-promoting material or skin aging improvement material, including a device that can check the cell viability or stem cell property of aging model cells. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 노화 모델 세포에 후보물질을 처리하는 단계; 및
처리된 세포의 세포생존율 또는 줄기세포성을 측정하는 단계를 포함하는 줄기세포성 촉진 물질 또는 피부 노화 개선 물질의 스크리닝 방법.Claims 1 to 4, comprising the steps of treating the candidate material to the senescence model cell according to any one of claims; and
A screening method for a stem cell-promoting material or skin aging improvement material comprising the step of measuring the cell viability or stem cell property of the treated cells. 제15항에 있어서,
상기 줄기세포성의 측정은 노화 모델 세포의 지방세포로의 분화 정도, 노화 모델 세포의 유전자 발현 또는 이러한 유전자로부터 코딩된 단백질의 발현을 측정하는 것이며,
상기 유전자는 SOX2(SRY(sex determining region Y)-box 2)(NM_003106), S100B(S100 calcium binding protein B) (NM_006272), NANOG(NM_001297698), 퍼옥시좀 증식자 활성화 수용체 감마(Peroxisome proliferator-activated receptor gamma, PPARγ)(NM_005037), 렙틴(Leptin, LEP)(NM_000230), 아디포넥틴(adiponectin, ADIPOQ)(NM_001177800), 아디포사이트 단백질 2(adipocyte protein 2, FABP4)(NM_001442), 콜라겐 타입II 알파 1(collagen typeII alpha1, COL2A1)(NM_001844), 어그리칸(aggrecan, ACAN)(NM_001135), 오스테오글리신(Osteoglycin gene, OGN)(NM_014057), 및 오스테오칼신(osteocalcin, bone gamma-carboxyglutamic acid-containing protein, BGLAP)(NM_199173)으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자인 방법.16. The method of claim 15,
The measurement of stem cellularity is to measure the degree of differentiation of senescence model cells into adipocytes, the gene expression of senescence model cells or the expression of a protein encoded by such a gene,
The gene is SOX2 (sex determining region Y)-box 2) (NM_003106), S100B (S100 calcium binding protein B) (NM_006272), NANOG (NM_001297698), peroxisome proliferator-activated receptor gamma receptor gamma, PPARγ) (NM_005037), leptin (LEP) (NM_000230), adiponectin (ADIPOQ) (NM_001177800), adipocyte protein 2 (FABP4) (NM_001442), collagen type II alpha 1 (collagen typeII alpha1, COL2A1) (NM_001844), aggrecan (ACAN) (NM_001135), osteoglycin gene (OGN) (NM_014057), and osteocalcin (bone gamma-carboxyglutamic acid-containing protein, BGLAP) (NM_199173). 제15항에 있어서,
상기 방법은 후보물질을 처리하지 않은 대조군에 비하여 노화 모델 세포의 세포생존율 또는 줄기세포성을 증가시키는 물질을 피부 노화 개선물질로 판단하는 단계를 더 포함하는 방법.16. The method of claim 15,
The method further comprises the step of determining as a skin aging improving material a substance that increases the cell viability or stem cell properties of aging model cells compared to a control that is not treated with the candidate substance. 제15항에 있어서,
상기 방법은 후보물질을 처리하는 단계 이전에, 진피 유래 성체 줄기세포에 UV-A를 조사하여 노화 모델 세포를 유도하는 단계를 더 포함하는 방법.16. The method of claim 15,
The method further comprises the step of inducing a senescence model cell by irradiating UV-A to the dermis-derived adult stem cells prior to treating the candidate material. 제18항에 있어서,
노화모델은 진피 유래 성체 줄기세포에 UV-A를 20-28시간 간격으로 한번에 1.3~1.7 J/cm2으로 2회 이상 조사하여 유도되는 것인 방법. 19. The method of claim 18,
The aging model is a method that is induced by irradiating dermal-derived adult stem cells with UV-A twice at a time of 1.3-1.7 J/cm 2 at intervals of 20-28 hours. 제19항에 있어서,
UV-A의 조사는 22-26시간 간격으로 한번에 1.4-1.6 J/cm2으로 3회 이상 조사하는 것인 방법.20. The method of claim 19,
The method of irradiating UV-A at 1.4-1.6 J/cm 2 at an interval of 22-26 hours at least three times. 제18항에 있어서,
UV-A의 조사는 20-28시간 간격으로 총 조사량이 4.0~5.0 J/cm2이 되도록 n회 이상 반복하여 수행되고,
상기 n은 2 이상 10이하의 정수이며,
한 회당 조사되는 조사량은
Figure 112014119592534-pat00003
인 방법.19. The method of claim 18,
UV-A irradiation is repeated n times or more so that the total irradiation amount is 4.0-5.0 J/cm 2 at intervals of 20-28 hours,
Wherein n is an integer of 2 or more and 10 or less,
The amount of irradiation per session is
Figure 112014119592534-pat00003
how to be. 제15항에 있어서,
상기 방법은 진피 유래 성체 줄기세포의 노화를 유도하는 단계 이전에,
진피 유래 섬유아세포를 젤라틴 또는 제4형 콜라겐이 코팅된 배양접시에서 3~10분 간 배양하여 진피 성체 줄기세포를 유도하는 단계를 더 포함하는 방법.16. The method of claim 15,
The method is before the step of inducing senescence of dermal-derived adult stem cells,
The method further comprising inducing dermal adult stem cells by culturing dermal-derived fibroblasts in a gelatin or type 4 collagen-coated culture dish for 3 to 10 minutes. 제22항에 있어서,
상기 방법은 진피 유래 성체 줄기세포를 유도하는 단계는 배양 후 배양 접시에 붙은 세포들을 분리하는 단계를 더 포함하는 방법.23. The method of claim 22,
In the method, the step of inducing dermal-derived adult stem cells further comprises isolating the cells attached to the culture dish after culturing.
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