KR102333797B1 - Novel biomarker microRNA for distinguishing and diagnosing mild cognitive impairment and early Alzheimer's disease - Google Patents
Novel biomarker microRNA for distinguishing and diagnosing mild cognitive impairment and early Alzheimer's disease Download PDFInfo
- Publication number
- KR102333797B1 KR102333797B1 KR1020210149785A KR20210149785A KR102333797B1 KR 102333797 B1 KR102333797 B1 KR 102333797B1 KR 1020210149785 A KR1020210149785 A KR 1020210149785A KR 20210149785 A KR20210149785 A KR 20210149785A KR 102333797 B1 KR102333797 B1 KR 102333797B1
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- alzheimer
- dementia
- cognitive impairment
- mild cognitive
- screening
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2537/00—Reactions characterised by the reaction format or use of a specific feature
- C12Q2537/10—Reactions characterised by the reaction format or use of a specific feature the purpose or use of
- C12Q2537/143—Multiplexing, i.e. use of multiple primers or probes in a single reaction, usually for simultaneously analyse of multiple analysis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/178—Oligonucleotides characterized by their use miRNA, siRNA or ncRNA
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Pathology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
본 발명은 경도인지장애 및 알츠하이머성 치매의 선별 진단을 위한 신규 마이크로 RNA 바이오마커에 관한 것이다. The present invention relates to a novel microRNA biomarker for the screening diagnosis of mild cognitive impairment and Alzheimer's dementia.
인지기능의 손상과 아밀로이드 가설을 기반으로 신경심리검사 및 영상진단을 통해 알츠하이머성 치매를 진단하고 있지만 많은 한계점으로 인해, 최근 상대적으로 비침습적인 시료인 혈액으로부터 알츠하이머성 치매의 진단지표를 개발하려는 노력이 활발하게 이루어지고 있다.Although Alzheimer's dementia is diagnosed through neuropsychological tests and imaging based on cognitive impairment and amyloid hypothesis, recent efforts to develop diagnostic indicators for Alzheimer's dementia from blood, a relatively non-invasive sample, are due to many limitations. This is being actively done.
miRNA는 약 20개 정도의 염기서열을 가진 단일 사슬의 작은 RNA로써 특정 타겟이 되는 mRNA의 3'-UTR(3'-untranslated regions)과 결합하여 mRNA의 번역 억제를 통해 단백질을 조절할 수 있는 짧은 서열의 RNA이다. 현재까지 밝혀진 miRNA는, 사람의 경우 1,000여개 정도의 miRNA가 밝혀졌으나 대부분의 miRNA는 기능이 밝혀지지 않은 상태이다. miRNA is a single-stranded small RNA with about 20 base sequences, a short sequence that can regulate protein through translation inhibition of mRNA by binding to 3'-UTR (3'-untranslated regions) of a specific target mRNA is the RNA of About 1,000 miRNAs have been identified so far in humans, but the functions of most miRNAs remain unknown.
현재, 혈액을 이용한 치매 분석은 주로 단백질에 의존하고 있으나, 구조적 안정성에 비해 환자별 편차가 심하고, 알츠하이머성 치매 병리를 혈액에 온전히 반영하지 못하는 단점이 있다. 더 예민한 진단 지표 도출을 위해서는, 더 작은 사이즈의 타겟이 필요하다. 특히 알츠하이머성 치매의 경우, 비정상적 단백질의 응집 등이 유전적인 요인으로만 일어나는 것이 아닌, 다양한 환경적 자극으로 유발되기 때문에, 단백질이라는 결과보다 단백질의 번역 이전인 유전자 발현 조절 변화 분석으로 근본적인 타겟을 찾는 것이 중요할 것으로 사료된다. miRNA를 진단 지표로 활용할 경우 혈액, 소변 및 타액을 포함한 모든 생체 유체에 존재하는 21-25 뉴클레오타이드의 단일 가닥 RNA로 mRNA의 번역을 억제하여 유전자 발현을 직접 제어하는 역할을 한다. 또한 RNase에 의한 분해에 강해 혈액에서 안정적으로 존재하며, miRNA의 대사 또는 기능의 결함은 치매의 발병과 밀접한 관련이 있고, 질병에 따라 높은 특이성 및 민감도를 가지는 것으로 알려져 가장 최적의 진단지표로 활용할 수 있다.Currently, the analysis of dementia using blood mainly relies on protein, but there is a significant difference between patients compared to structural stability, and there are disadvantages in that the pathology of Alzheimer's dementia cannot be fully reflected in the blood. In order to derive a more sensitive diagnostic index, a smaller size target is required. In particular, in the case of Alzheimer's dementia, since the aggregation of abnormal proteins is induced by various environmental stimuli, rather than by genetic factors, it is more difficult to find a fundamental target by analyzing changes in gene expression regulation prior to protein translation rather than protein results. is presumed to be important. When miRNA is used as a diagnostic index, it is a single-stranded RNA of 21-25 nucleotides present in all living fluids, including blood, urine and saliva, and plays a role in directly controlling gene expression by inhibiting the translation of mRNA. In addition, it is resistant to degradation by RNase, so it is stably present in the blood, and defects in miRNA metabolism or function are closely related to the onset of dementia. have.
알츠하이머병의 진단은 환자에 대해 가장 잘 알고 있는 보호자의 보고를 통한 정확한 병력 청취가 매우 중요하다. 의사는 이전에 비해 기억력을 포함한 인지 기능의 변화가 있는지, 있다면 언제부터 어떠한 양상으로 나타났는지 확인하고, 신체검사와 신경학적 검사, 정신상태 검사, 일상생활 기능수준 검사, 혈액 검사 등의 생화학적 검사, 뇌영상학 검사, 신경심리 검사 등을 통해 진단하고 있지만, 아직까지는 알츠하이머병을 진단하는데는 여러가지 한계점이 존재하여, 조기진단이 어려운 상황이다. 주로, 인지기능의 손상과 아밀로이드 가설을 기반으로 신경심리검사 및 영상진단을 통해 알츠하이머성 치매를 진단하고 있고, 최근들어 비침습적 시료인 혈액으로부터 알츠하이머성 치매를 진단하는 지표를 개발하려는 노력이 활발하게 이루어지고 있다.For the diagnosis of Alzheimer's disease, it is very important to take an accurate history through the report of a caregiver who knows the patient best. The doctor will check if there is any change in cognitive function, including memory, compared to before, and if so, when and how it appeared, and biochemical tests such as physical examination, neurological examination, mental state examination, daily living function level test, blood test, etc. , brain imaging tests, neuropsychological tests, etc. However, there are still various limitations in diagnosing Alzheimer's disease, making early diagnosis difficult. Mainly, Alzheimer's dementia is diagnosed through neuropsychological examination and imaging based on the cognitive impairment and amyloid hypothesis. is being done
한편, 인지기능장애의 진단 관련 기술로는 한국등록특허 제2033776호에 타우 단백질의 발현수준을 측정하는 제제를 포함하는 알츠하이머 중증도 진단용 조성물 및 이를 이용한 알츠하이머 중증도의 진단방법이 개시되어 있고, 한국등록특허 제1992539호에 miRNA 기반의 인지장애 질환 진단용 조성물 및 방법이 개시되어 있으나, 아직까지는 본 발명의 경도인지장애 및 알츠하이머성 치매의 선별 진단을 위한 신규 마이크로 RNA 바이오마커에 대해서는 개시된 바 없다.On the other hand, as a diagnosis-related technology for cognitive dysfunction, Korean Patent No. 2033776 discloses a composition for diagnosing Alzheimer's severity including a formulation for measuring the expression level of tau protein, and a method for diagnosing Alzheimer's severity using the same. Although miRNA-based compositions and methods for diagnosing cognitive impairment diseases are disclosed in No. 1992539, novel microRNA biomarkers for screening and diagnosis of mild cognitive impairment and Alzheimer's dementia of the present invention have not yet been disclosed.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명은 경도인지장애 및 알츠하이머성 치매의 선별 진단을 위한 신규 마이크로 RNA 바이오마커를 제공하고, 본 발명에 따른 서열번호 1 또는 서열번호 3의 신규 miRNA가 경도인지장애 환자군 및 알츠하이머성 치매 환자군의 혈장에서 발현량의 차이가 있으며, 알츠하이머성 치매 관련 단백질의 발현을 감소시킬 수 있다는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.The present invention has been derived from the above needs, and the present invention provides a novel micro RNA biomarker for screening and diagnosis of mild cognitive impairment and Alzheimer's dementia, and the novel microRNA biomarker of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3 according to the present invention The present invention was completed by confirming that there is a difference in the expression level of miRNA in the plasma of the mild cognitive impairment patient group and the Alzheimer's dementia patient group, and can reduce the expression of the Alzheimer's dementia-related protein.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 또는 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 신규 마이크로 RNA를 유효성분으로 포함하는 경도인지장애 및 알츠하이머성 치매의 선별 진단용 바이오 마커 조성물을 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention provides a biomarker composition for screening and diagnosis of mild cognitive impairment and Alzheimer's dementia comprising a novel microRNA comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3 as an active ingredient.
또한, 본 발명은 서열번호 1 또는 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 마이크로 RNA를 검출할 수 있는 제제를 유효성분으로 포함하는 경도인지장애 및 알츠하이머성 치매의 선별 진단용 바이오센서 조성물을 제공한다.In addition, the present invention provides a biosensor composition for screening and diagnosing mild cognitive impairment and Alzheimer's dementia, comprising as an active ingredient an agent capable of detecting microRNA consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3.
또한, 본 발명은 상기 경도인지장애 또는 알츠하이머성 치매 조기 진단용 바이오마커 조성물을 유효성분으로 포함하는 경도인지장애 및 알츠하이머성 치매의 선별 진단용 키트를 제공한다.In addition, the present invention provides a kit for screening and diagnosis of mild cognitive impairment and Alzheimer's dementia comprising the biomarker composition for early diagnosis of mild cognitive impairment or Alzheimer's dementia as an active ingredient.
본 발명은 경도인지장애 및 알츠하이머성 치매의 선별 진단을 위한 신규 마이크로 RNA 바이오마커에 관한 것으로, 본 발명에 따른 서열번호 1 또는 서열번호 3의 신규 miRNA가 경도인지장애 환자군의 혈장에서 발현되며, 알츠하이머성 치매 관련 단백질의 발현을 감소시키는 효과가 있는 것이다. 따라서, 본 발명은 상대적으로 침습성이 낮은 혈장에 존재하는 신규 miRNA를 진단지표로 활용함으로써, 경도인지장애 및 알츠하이머성 치매의 조기진단 뿐만 아니라 경도인지장애 및 알츠하이머성 치매간의 구분이 가능한 효과가 있다.The present invention relates to a novel microRNA biomarker for the selective diagnosis of mild cognitive impairment and Alzheimer's dementia, wherein the novel miRNA of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3 according to the present invention is expressed in the plasma of a group of patients with mild cognitive impairment, Alzheimer's It has the effect of reducing the expression of senile dementia-related proteins. Therefore, the present invention utilizes the novel miRNA present in plasma with relatively low invasiveness as a diagnostic index, thereby enabling early diagnosis of mild cognitive impairment and Alzheimer's dementia as well as distinguishing between mild cognitive impairment and Alzheimer's dementia.
도 1은 본 발명에서 확인한 신규 miRNA4의 스템 루프(stem loop) 구조 및 서열 정보를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명에서 확인한 신규 miRNA5의 스템 루프(stem loop) 구조 및 서열 정보를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 신규 miRNA 기능을 확인하기 위한 miRNA4(A) 및 miRNA5(B)의 mimic 및 저해자 합성 서열을 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 신규 miRNA4의 타겟 유전자가 코딩하는 MAP1A(microtubule associated protein 1A)의 발현량 변화를 확인한 웨스턴블랏 결과이다. **, ***은 아무것도 처리하지 않은 대조군과 본 발명의 miRNA mimic 또는 miRNA 저해자를 처리한 군에서의 타겟 유전자 발현량이 통계적으로 유의미한 차이가 있다는 것으로, **은 p<0.01이며, ***은 p<0.001이다.
도 5는 본 발명의 신규 miRNA5의 타겟 유전자가 코딩하는 SHANK1(SH3 and multiple ankyrin repeat domains protein 1)의 발현량 변화를 확인한 웨스턴블랏 결과이다. **, ***은 아무것도 처리하지 않은 대조군과 본 발명의 miRNA mimic 또는 miRNA 저해자를 처리한 군에서의 타겟 유전자 발현량이 통계적으로 유의미한 차이가 있다는 것으로, **은 p<0.01이고, ***은 p<0.001이다.
도 6은 본 발명의 신규 miRNA4 및 miRNA5의 타겟 유전자가 각각 코딩하는 MAP1A 및 SHANK1의 발현량 변화를 경도인지장애 군(MCI) 및 알츠하이머성 치매군(AD)의 혈장에서 확인한 결과이다. *, ***은 경도인지장애 군(MCI) 및 알츠하이머성 치매군(AD)의 타겟 단백질 발현량이 통계적으로 유의미하게 차이가 있다는 것으로, *은 p<0.05이고, ***은 p<0.001이다. 1 shows the stem loop structure and sequence information of the novel miRNA4 identified in the present invention.
Figure 2 shows the stem loop (stem loop) structure and sequence information of the novel miRNA5 identified in the present invention.
Figure 3 shows mimic and inhibitor synthesis sequences of miRNA4 (A) and miRNA5 (B) for confirming the novel miRNA function of the present invention.
4 is a Western blot result confirming the change in the expression level of MAP1A (microtubule associated protein 1A) encoded by the novel miRNA4 target gene of the present invention. **, *** indicates that there is a statistically significant difference in target gene expression level between the control group untreated and the group treated with miRNA mimic or miRNA inhibitor of the present invention, ** is p<0.01, *** is p<0.001.
5 is a Western blot result confirming the change in the expression level of SHANK1 (SH3 and multiple ankyrin repeat domains protein 1) encoded by the novel miRNA5 target gene of the present invention. **, *** indicates that there is a statistically significant difference in the target gene expression level between the control group untreated and the group treated with miRNA mimic or miRNA inhibitor of the present invention, ** is p<0.01, *** is p<0.001.
6 is a result of confirming the change in the expression levels of MAP1A and SHANK1, respectively encoded by the novel miRNA4 and miRNA5 target genes of the present invention, in the plasma of the mild cognitive impairment group (MCI) and Alzheimer's dementia group (AD). *, *** indicates that there is a statistically significant difference in the target protein expression level of the mild cognitive impairment group (MCI) and Alzheimer's dementia group (AD), * is p<0.05, *** is p<0.001 .
본 발명은 서열번호 1 또는 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 신규 마이크로 RNA를 유효성분으로 포함하는 경도인지장애 및 알츠하이머성 치매의 선별 진단용 바이오 마커 조성물에 관한 것이다.The present invention relates to a biomarker composition for screening and diagnosis of mild cognitive impairment and Alzheimer's dementia comprising a novel microRNA comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3 as an active ingredient.
본 발명에서 마이크로 RNA(miRNA)는 표적 RNA의 분해(degradation)를 촉진시키거나 또는 그들의 번역을 억제시킴으로써 유전자 발현을 전사 후에 조절하는 21~23개의 비코딩 RNA를 말한다. 특정 염기서열로 나타내는 miRNA 뿐만 아니라 상기 miRNA의 전구체(pre-miRNA, pri-miRNA), 이들과 생물학적 기능이 동등한 miRNA, 예를 들면 동족체(즉, 호몰로그 또는 오솔로그), 유전자다형 등의 변이체, 및 유도체도 포함한다. In the present invention, micro RNA (miRNA) refers to 21 to 23 non-coding RNAs that regulate gene expression after transcription by promoting degradation of target RNA or inhibiting translation thereof. MiRNAs represented by specific nucleotide sequences as well as precursors of the miRNAs (pre-miRNA, pri-miRNA), miRNAs having biological functions equivalent to them, such as homologues (i.e., homologs or orthologs), variants such as polymorphisms, and derivatives.
상기 신규 마이크로 RNA는 인간의 혈장 유래인 것이 바람직하지만 이에 한정하지 않는다.The novel microRNA is preferably derived from human plasma, but is not limited thereto.
상기 서열번호 1의 신규 마이크로 RNA는 MAP1A(microtubule associated protein 1A) 유전자의 발현량을 감소시키며, 서열번호 3의 신규 마이크로 RNA는 SHANK1(SH3 and multiple ankyrin repeat domains protein 1) 유전자의 발현량을 감소시키는 것을 특징이다.The novel micro RNA of SEQ ID NO: 1 reduces the expression level of the MAP1A (microtubule associated protein 1A) gene, and the novel micro RNA of SEQ ID NO: 3 reduces the expression level of the SHANK1 (SH3 and multiple ankyrin repeat domains protein 1) gene. is characterized by
본 발명의 '진단'은 특정 질병 또는 질환에 대한 한 객체 즉 검사 대상자의 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 한 객체가 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는지 여부를 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환에 걸린 한 객체의 예후(prognosis)를 판정하는 것 또는 테라메트릭스(therametrics)(예컨대, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 객체의 상태를 모니터링하는 것)을 포함하는 개념이다.'Diagnosis' of the present invention is to determine the susceptibility of an object, that is, a test subject to a specific disease or disorder, to determine whether an object currently has a specific disease or disorder, Concepts involving determining the prognosis of an affected subject or therametrics (eg, monitoring a subject's condition to provide information on treatment efficacy).
본 발명의 '선별진단'은 경도인지장애 및 알츠하이머성 치매의 조기진단 뿐만 아니라 경도인지장애 및 알츠하이머성 치매간의 구분이 가능한 것을 말한다.The 'selective diagnosis' of the present invention refers to early diagnosis of mild cognitive impairment and Alzheimer's dementia, as well as distinguishing between mild cognitive impairment and Alzheimer's dementia.
또한, 본 발명은 서열번호 1 또는 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 마이크로 RNA를 검출할 수 있는 제제를 유효성분으로 포함하는 경도인지장애 및 알츠하이머성 치매의 선별 진단용 바이오센서 조성물에 관한 것이다.In addition, the present invention relates to a biosensor composition for screening and diagnosis of mild cognitive impairment and Alzheimer's dementia, comprising as an active ingredient an agent capable of detecting a microRNA comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3.
상기 제제는 상기 마이크로 RNA에 상보적인 안티센스 올리고뉴클레오티드; 프라이머; 프로브; 및 형광체 또는 소광체가 연결된 루프형성 올리고뉴클레오티드; 중에서 선택된 어느 하나를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.The agent comprises an antisense oligonucleotide complementary to the microRNA; primer; probe; and a loop-forming oligonucleotide to which a phosphor or quencher is linked; It may include any one selected from, but is not limited thereto.
경도인지장애는 정상적인 노화현상으로 인한 인지능력의 감퇴와 치매의 중간 단계를 의미한다. 즉, 동일한 연령대에 비해 인지 능력이 저하되어 있는 상태를 말하며, 일상생활이 가능한 것이 치매와 다른 점이다. 이러한 경도인지장애는 정상과 치매의 중간단계이며, 치매의 고위험군으로 알려져 있다. Mild cognitive impairment refers to an intermediate stage between cognitive decline and dementia due to normal aging. In other words, it refers to a state in which cognitive ability is lowered compared to the same age group, and it is different from dementia in that daily life is possible. This mild cognitive impairment is an intermediate stage between normal and dementia, and is known as a high-risk group for dementia.
알츠하이머성 치매는 인지기능 저하뿐만 아니라 성격변화, 초조행동, 우울증, 망상, 환각, 공격성 증가, 수면 장애 등의 정신행동 증상이 흔히 동반되며 말기에 이르면 경직, 보행 이상 등의 신경학적 장애 또는 대소변 실금, 감염, 욕창 등 신체적인 합병증까지 나타나게 되는 질병으로, 초기에는 매우 서서히 진행되어 발병을 인지하기 어려울 수도 있다. Alzheimer's dementia is often accompanied by psycho-behavioral symptoms such as personality changes, agitation, depression, delusions, hallucinations, increased aggression, and sleep disturbance as well as cognitive decline. , infection, and even physical complications such as bedsores, it progresses very slowly in the beginning and it may be difficult to recognize the onset.
본 발명에서 사용된 바이오센서 조성물은 경도인지장애 및 알츠하이머성 치매의 선별을 센싱(감지)할 수 있다는 의미로 사용된 용어로서, '바이오마커 조성물'과 동등 또는 유사한 의미로 사용된 것이다.The biosensor composition used in the present invention is a term used in the sense of being able to sense (sensing) the selection of mild cognitive impairment and Alzheimer's dementia, and is used in an equivalent or similar meaning to a 'biomarker composition'.
또한, 본 발명은 서열번호 1 또는 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 신규 마이크로 RNA를 검출할 수 있는 제제를 유효성분으로 포함하는 경도인지장애 및 알츠하이머성 치매의 선별 진단용 바이오마커 조성물을 유효성분으로 포함하는 경도인지장애 및 알츠하이머성 치매의 선별 진단용 키트에 관한 것이다.In addition, the present invention includes, as an active ingredient, a biomarker composition for screening and diagnosis of mild cognitive impairment and Alzheimer's dementia comprising an agent capable of detecting a novel microRNA consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3 as an active ingredient It relates to a kit for screening and diagnosis of mild cognitive impairment and Alzheimer's dementia.
상기 키트는 RT-PCR, 실시간(real-time) PCR, 등온 PCR, 노던 블랏팅, RNA 보호분석법 또는 마이크로어레이 칩용인 것이 바람직하지만 이에 한정되는 것은 아니다.The kit is preferably for RT-PCR, real-time PCR, isothermal PCR, northern blotting, RNA protection assay or microarray chip, but is not limited thereto.
본 발명의 키트는 서열번호 1 또는 서열번호 3의 마이크로 RNA와 특이적으로 결합 가능한 핵산을 추가적으로 포함할 수 있고, 상기 핵산은 RNA, DNA, 또는 RNA/DNA(키메라) 모두 포함하는 것을 의미하고, 상기 DNA에는 cDNA, 게놈 DNA, 및 합성 DNA 모두가 포함될 수 있다. The kit of the present invention may additionally include a nucleic acid capable of specifically binding to the microRNA of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3, which means that the nucleic acid includes both RNA, DNA, or RNA/DNA (chimera), The DNA may include all of cDNA, genomic DNA, and synthetic DNA.
또한, 상기 RNA에는 total RNA, mRNA, rRNA, miRNA, siRNA, snoRNA, snRNA, 비코딩(non-coding)RNA 및 합성 RNA 모두가 포함될 수 있다. 본 발명의 키트는 상기 핵산에 추가하여 경도인지장애 및 알츠하이머성 치매의 선별 진단을 가능하게 하는 기지의 핵산 또는 장래 발견될 수 있는 핵산을 포함할 수 있으며, 공지의 경도인지장애 및 알츠하이머성 치매의 선별 진단용 마커를 측정하기 위한 항체도 포함시킬 수 있다. 상기 키트에 포함되는 상기 핵산은 개별적으로 또는 임의로 조합하여 다른 용기에 포장될 수 있다. In addition, the RNA may include total RNA, mRNA, rRNA, miRNA, siRNA, snoRNA, snRNA, non-coding RNA, and synthetic RNA. In addition to the nucleic acid, the kit of the present invention may contain a known nucleic acid or a nucleic acid that can be discovered in the future that enables the selective diagnosis of mild cognitive impairment and Alzheimer's dementia, and may contain known mild cognitive impairment and Alzheimer's dementia. Antibodies for measuring selectable diagnostic markers may also be included. The nucleic acids included in the kit may be packaged in different containers individually or in any combination.
본 발명의 키트에는 표지용 형광물질, 핵산 증폭용 효소 및 배지, 사용 설명서 등을 포함시킬 수 있다. 본 발명의 키트는 상기 핵산이 예를 들면 고상에 결합 또는 부착된 경도인지장애 및 알츠하이머성 치매의 선별 진단을 위한 장치이다. 고상의 재질의 예는 플라스틱, 종이, 유리, 실리콘 등이며, 가공의 용이함으로부터 바람직한 고상의 재질은 플라스틱일 수 있다. 고상의 형상은 임의이며, 예를 들면 사각형, 원형, 직사각형, 필름형 등일 수 있다.The kit of the present invention may include a fluorescent material for labeling, an enzyme and medium for nucleic acid amplification, instructions for use, and the like. The kit of the present invention is a device for screening and diagnosing mild cognitive impairment and Alzheimer's dementia in which the nucleic acid is bound or attached to a solid phase, for example. Examples of the solid material include plastic, paper, glass, silicone, and the like, and a preferred solid material from the viewpoint of ease of processing may be plastic. The shape of the solid phase is arbitrary, and may be, for example, a square, a circle, a rectangle, a film shape, and the like.
본 발명의 키트는 다량의 miRNA 시료를 동시에 처리하는 HTS(high-throughput-screening) 기반 다중 현장진단(multiplexed POCT)용 장치에 포함될 수 있다. The kit of the present invention may be included in a device for high-throughput-screening (HTS)-based multiplexed POCT that simultaneously processes a large amount of miRNA samples.
상기 다중 현장진단용 장치 내 카트릿지는 항온장치, 교반기, 일회용 팁, 검체 주입용기 등으로 구성될 수 있고, 초소형 전혈분리기, 형광검출기, 리퀴드핸들러 내장 올인원 장치로 사람의 혈액을 주입하면 자동으로 '치매 위험 지수'가 도출되는 알고리즘 및 전자동 검출 시스템이 포함될 수 있다.The cartridge in the multi-point diagnosis device can be composed of a thermostat, a stirrer, a disposable tip, a sample injection container, etc., and when human blood is injected with an all-in-one device with an ultra-small whole blood separator, a fluorescence detector, and a liquid handler, it automatically 'risk of dementia' An algorithm from which the index' is derived and a fully automatic detection system may be included.
또한, 본 발명은 (1) 개체로부터 혈액을 채취하는 단계;In addition, the present invention comprises the steps of (1) collecting blood from a subject;
(2) 상기 단계 (1)의 혈액으로부터 혈장을 분리하는 단계; 및(2) separating plasma from the blood of step (1); and
(3) 상기 단계 (2)에서 분리한 혈장 내 서열번호 1 또는 서열번호 3의 miRNA 발현여부를 확인하는 단계;를 포함하는 경도인지장애 및 알츠하이머성 치매의 선별 진단 방법에 관한 것이다.(3) confirming the expression of miRNA of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3 in the plasma isolated in step (2); relates to a method for screening and diagnosing mild cognitive impairment and Alzheimer's dementia, including the.
이하, 실시예를 이용하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들에 의해 제한되지 않는다는 것은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 자명한 것이다. Hereinafter, the present invention will be described in more detail using examples. These examples are only for illustrating the present invention in more detail, and it will be apparent to those of ordinary skill in the art that the scope of the present invention is not limited thereto.
1. 알츠하이머성 치매 환자의 시료 확보1. Obtaining samples from Alzheimer's dementia patients
MCI와 AD로 분류된 환자의 혈액을 EDTA 튜브에 채취한 후, 혈장(plasma)을 분리하여 경상국립대학교 신경생물학실험실에서 사용하기 전까지 -70℃에서 보관하였다. After the blood of patients classified as MCI and AD was collected in an EDTA tube, plasma was separated and stored at -70°C until used in the Neurobiology Laboratory of Gyeongsang National University.
2. Total miRNA 추출2. Total miRNA extraction
소량의 혈청 및 혈장에서 주로 miRNA 및 기타 small RNA를 정제할 수 있는 QIAGEN miRNeasy 혈청/혈장 분리 키트를 사용하여 상기 확보한 환자군 및 정상군의 각 혈장 내 있는 Total RNA를 추출하였다. Total RNA in each plasma of the obtained patient group and normal group was extracted using the QIAGEN miRNeasy Serum/Plasma Separation Kit, which can mainly purify miRNA and other small RNAs from a small amount of serum and plasma.
이후, Bioanalyzer RNA Small RNA chip을 이용하여 NGS 분석을 위한 라이브러리 제작에 충분한 RNA 양이 확보되었는지를 확인하였다.Thereafter, it was confirmed whether a sufficient amount of RNA was secured for library production for NGS analysis using the Bioanalyzer RNA Small RNA chip.
3. 차세대 염기 서열 분석(Next Generation Sequencing; NGS)3. Next Generation Sequencing (NGS)
소량의 RNA에서도 고품질 miRNA 라이브러리 제작이 가능한 SMARTer smRNA-Seq Kit를 사용하여 Illumina Platform에서 small RNA-seq 라이브러리를 생성하였다. SMARTer smRNA-Seq Kit 매뉴얼에 따라 NovaSeq 6000 시퀀싱 플랫폼으로 준비된 시료를 시퀀싱하였다.A small RNA-seq library was generated on the Illumina Platform using the SMARTer smRNA-Seq Kit, which can produce a high-quality miRNA library even with a small amount of RNA. Prepared samples were sequenced with the NovaSeq 6000 sequencing platform according to the SMARTer smRNA-Seq Kit manual.
4. 가공하지 않은 데이터 분석을 통한 miRNA 데이터 선별 4. Selection of miRNA data through raw data analysis
NGS 분석으로 획득한 가공하지 않은 데이터를 Adapter, Quality 및 Length의 trimming 순으로 혈장 속에 존재하는 오염되거나 양이 적은 데이터를 제거하였다. 이러한 trimming 과정을 거쳐 불필요한 정보가 제거된 clean 데이터로 miRNA Deep2* 시퀀싱을 실시하였다. In the order of trimming of adapter, quality, and length of the raw data obtained by NGS analysis, contaminant or small amount of data present in plasma was removed. Through this trimming process, miRNA Deep2* sequencing was performed with clean data from which unnecessary information was removed.
5. miRNA Deep2* 시퀀싱5. miRNA Deep2* Sequencing
miRNA Deep2*는 정제된 가공하지 않은 데이터에서 신규 miRNA를 식별할 수 있는 소프트웨어로, RNAfold 알고리즘에 따라, mature, star 및 loop 서열에 짧게 잘려진 miRBase(Pre-miRNA) 라이브러리를 나란히 배열하여 신규 miRNA를 예측할 수 있으며, RNAfold 알고리즘은 가장 비슷한 열역학 모델을 이용해 RNA 서열이 최소 자유에너지를 갖는 2차 구조를 예측하는 방식으로 도출할 수 있다. RNA fold 생성 그래픽에는 헤어핀(Hairpin)의 각 부분에 대한 읽기 수, 최소자유에너지에 대한 점수, randfold에 대한 점수 및 conserved seed sequence 점수가 포함되어 있다. miRNA Deep2* is a software that can identify new miRNAs from purified raw data. According to the RNAfold algorithm, miRBase (Pre-miRNA) libraries cut short in mature, star and loop sequences are arranged side by side to predict new miRNAs. The RNAfold algorithm can be derived in a way that predicts the secondary structure of the RNA sequence with the least free energy using the most similar thermodynamic model. The RNA fold generation graphic includes the number of reads for each part of the hairpin, the score for the minimum free energy, the score for the randfold, and the conserved seed sequence score.
miRDeep2* 시스템은 RNA 데이터베이스를 활용한 맵핑으로 기존에 알려진 miRNA를 탐지하고 신규 miRNA을 탐지할 수 있다. The miRDeep2* system can detect previously known miRNAs and detect new miRNAs by mapping using an RNA database.
6. 혈액에 반영되는 알츠하이머성 치매 관련 신규 miRNA의 검증6. Verification of novel miRNA related to Alzheimer's disease reflected in blood
신규 miRNA가 알츠하이머성 치매와 어떤 연관이 있는지에 대한 기능 검증을 위해 miRNA의 서열기반으로 타겟 유전자(miRNA)를 스코어링하는 miRDB 소프트웨어를 사용하여 스크리닝하였다. 높은 유전자 스코어를 가진 타겟 유전자 중 알츠하이머성 치매와 관련된 유전자에 대한 발현량 분석을 통해 검증하였다. For functional verification of how novel miRNAs are related to Alzheimer's dementia, they were screened using miRDB software that scores target genes (miRNAs) based on the sequence of miRNAs. It was verified through expression level analysis of genes related to Alzheimer's dementia among target genes with high gene scores.
신경기능 및 분화 모델로 사용되는 SH-SY5Y 세포를 사용하였으며, 선별된 신규 miRNA의 과발현 효과를 나타내는 miRNA mimic, 신규 miRNA의 발현을 억제하는 miRNA 억제제(inhibitor) 및 음성대조군 miRNA를 SH-SY5Y에 형질주입 후, 타겟 유전자의 단백질 발현을 웨스턴블랏으로 확인하였다.SH-SY5Y cells used as models for neural function and differentiation were used, and a miRNA mimic showing the overexpression effect of selected new miRNAs, a miRNA inhibitor that suppresses the expression of new miRNAs, and a negative control miRNA were transfected into SH-SY5Y. After injection, the protein expression of the target gene was confirmed by Western blot.
실시예 1. 시료 확보 및 Total RNA 추출Example 1. Sample acquisition and total RNA extraction
소량의 혈장에서 miRNA 및 기타 small RNA를 정제할 수 있는 QIAGEN miRNeasy Serum/Plasma Kit를 사용하여 환자군 및 정상군에서 채취한 각 혈장 내에 있는 Total RNA를 추출하였다. 이후 NGS를 위한 라이브러리 제작에 충분한 RNA 양이 확보되었는지 Bioanalyzer RNA Small RNA chip를 이용하여 RNA를 정량하여 NGS 분석에 충분한 양이 확보되었다는 것을 확인하였다.Total RNA in each plasma collected from the patient group and the normal group was extracted using the QIAGEN miRNeasy Serum/Plasma Kit, which can purify miRNA and other small RNAs from a small amount of plasma. Afterwards, it was confirmed that a sufficient amount of RNA was secured for NGS analysis by quantifying RNA using a Bioanalyzer RNA Small RNA chip to see if sufficient amount of RNA was secured for library production for NGS.
실시예 2. Next Generation Sequencing(NGS)Example 2. Next Generation Sequencing (NGS)
(1) 라이브러리 구축 및 가공하지 않은 데이터 도출(1) Library construction and raw data derivation
NGS를 위한 Illumina Platform에서 시퀀싱을 위한 작은 RNA-seq 라이브러리를 생성하는데 있어, 소량의 RNA에서도 고품질 miRNA 라이브러리 제작이 가능한 SMARTer smRNA-Seq Kit를 사용하였다. 혈장에서 획득한 환자군 및 정상군의 총 RNA 시퀀싱을 위한 라이브러리를 제작하였고, 제작된 라이브러리 및 NovaSeq 6000 시퀀싱 플랫폼을 이용하여 시퀀싱하여 가공하지 않은 데이터를 도출하였다. In generating a small RNA-seq library for sequencing on the Illumina Platform for NGS, the SMARTer smRNA-Seq Kit, which can produce high-quality miRNA libraries even with a small amount of RNA, was used. A library was prepared for sequencing the total RNA of the patient group and the normal group obtained from plasma, and sequencing was performed using the prepared library and the NovaSeq 6000 sequencing platform to derive raw data.
(2) 가공하지 않은 데이터(Raw data)로부터 miRNA의 데이터 선별(2) Selection of miRNA data from raw data
NGS 분석에서 획득한 가공하지 않은 데이터를 Adapter, Quality, Length 순서로 trimming 하여 오염되거나 적은 양의 데이터를 제거하였다. The raw data obtained from NGS analysis was trimmed in the order of Adapter, Quality, and Length to remove contaminated or small amount of data.
시퀀싱하여 획득한 가공하지 않은 데이터인 Total Read Count에서 Adapter 유무(nonAdapter Read Count), 적당한 길이(Short Read Count), 낮은 품질(Low Quality Read Count)의 정도를 확인하였으며, 이러한 trimming 선별과정을 통해 불필요한 정보가 제거된 1차 가공 데이터를 이용하여 miRNA Deep2* 시퀀싱을 수행하였다.In Total Read Count, which is the raw data obtained by sequencing, the presence of adapter (nonAdapter Read Count), appropriate length (Short Read Count), and low quality (Low Quality Read Count) were checked. miRNA Deep2* sequencing was performed using the primary processing data from which information has been removed.
(3) miRNA Deep2* sequencing(3) miRNA Deep2* sequencing
miRNA Deep2*는 상기 1차 가공된 데이터로부터 새롭게 알려진 miRNA를 식별할 수 있는 소프트웨어의 RNAfold 알고리즘에 따라, mature, star, loop 서열에 짧게 잘려진 miRBase(Pre-miRNA) 라이브러리를 나란히 배열하여 신규 miRNA를 예측하였으며, RNAfold 알고리즘은 가장 비슷한 열역학 모델을 이용해 RNA 서열이 최소 자유에너지를 갖는 2차 구조를 예측하는 방식으로 도출하였다. miRNA Deep2* predicts new miRNAs by arranging miRBase (Pre-miRNA) libraries cut short in mature, star, and loop sequences according to the software's RNAfold algorithm that can identify newly known miRNAs from the primary processed data. The RNAfold algorithm was derived by predicting the secondary structure of the RNA sequence with the minimum free energy using the most similar thermodynamic model.
RNA fold 생성 그래픽에는 Hairpin의 각 부분에 대한 읽기 수, 최소 자유 에너지에 대한 점수, randfold에 대한 점수 및 conserved seed sequence 점수가 포함되어 있다. miRDeep2* 시스템은 RNA 데이터베이스를 활용한 맵핑으로 기존 알려진 miRNA 및 신규 miRNA을 탐지하였다.The RNA fold generation graphic includes the number of reads for each part of the hairpin, the score for the minimum free energy, the score for the randfold, and the conserved seed sequence score. The miRDeep2* system detected known miRNAs and new miRNAs by mapping using an RNA database.
상기 각각의 시료에 대해 최종 처리된 리드는 miRBase v22.1과 non-coding RNA database(RNAcentral release 14.0)을 통해 piRNA, tRNA, snRNA, snoRNA, 이미 알려진 miRNA 및 신규 miRNA를 분류하였다. The final processed reads for each sample were classified into piRNA, tRNA, snRNA, snoRNA, known miRNA and novel miRNA through miRBase v22.1 and non-coding RNA database (RNAcentral release 14.0).
Genome 맵핑은 RSEM을 사용하여 Bowtie와 STAR에 의해 처리되었다. Bowtie는 이후 Genome 서열을 사용하여 miRDeep2 분석에 이용하였다. miRDeep2에 의해 예측된 알려진/신규 miRNA 및 RNAcentral과 일치하는 다른 small RNA는 Bowtie(표적 small RNA, <50nt) 및 Bowtie2(표적 smRNA, ≥50nt)를 사용하여 정렬하였다.Genome mapping was processed by Bowtie and STAR using RSEM. Bowtie then used the genome sequence for miRDeep2 analysis. Known/new miRNAs predicted by miRDeep2 and other small RNAs consistent with RNAcentral were aligned using Bowtie (target small RNA, <50 nt) and Bowtie2 (target smRNA, ≥ 50 nt).
- RSEM(RNA-Seq by Expectation-Maximization): RNA-Seq 전사체를 정량화하는 도구- RSEM (RNA-Seq by Expectation-Maximization): A tool to quantify RNA-Seq transcripts
- Bowtie: 서열 정렬 및 서열 분석에 일반적으로 사용되는 소프트웨어- Bowtie: software commonly used for sequence alignment and sequencing
- STAR(Spliced Transcripts Alignment to a Reference): 빠른 RNA-seq read mapper- STAR (Spliced Transcripts Alignment to a Reference): fast RNA-seq read mapper
신규 miRNA를 예측하기 위해 고유 클러스터링된 read는 reference genome 및 전구체 miRNA에 대해 별도로 정렬되었다. miRNA는 miRNA Deep2*를 사용하는 RNAfold 알고리즘에 따라 성숙한 star 및 loop 서열을 예측할 수 있다. RNAfold 함수는 가장 근접한 이웃 열역학 모델을 사용하여 RNA 서열의 최소 자유 에너지 2차 구조를 예측하였다. RNAfold에서 생성된 그래픽에는 실제 in silico-folded 헤어핀이 포함되어 있으며, 헤어핀의 각 부분에 대한 판독 횟수, 최소 자유 에너지 점수, randfold 점수 보존된 seed 서열의 점수도 포함되어 있다. To predict novel miRNAs, unique clustered reads were separately aligned against the reference genome and precursor miRNAs. miRNAs can predict mature star and loop sequences according to the RNAfold algorithm using miRNA Deep2*. The RNAfold function predicted the least free energy secondary structure of the RNA sequence using the nearest neighbor thermodynamic model. Graphics generated from RNAfold contain actual in silico-folded hairpins, as well as the number of reads for each part of the hairpin, minimum free energy score, randfold score and score of the conserved seed sequence.
miRDeep2*는 -10~10의 점수를 통해 신규 miRNA를 도출하였다. 상기 도출된 신규 miRNA는 경도인지장애 군 및 알츠하이머병 군에서 모두 발현하는 것으로, 그 중 miRDeep2* 점수는 1이상, RNA fold는 "yes"이고, mature read의 수가 10 이상인 miRNA4종을 선별하였다. miRDeep2* derived a novel miRNA through a score of -10 to 10. The derived novel miRNAs were expressed in both the mild cognitive impairment group and the Alzheimer's disease group, among which miRNA4 types with a miRDeep2* score of 1 or more, an RNA fold of "yes", and the number of mature reads of 10 or more were selected.
선별된 신규 miRNA4 및 miRNA5의 stem loop 구조를 도 1 및 도 2에 개시하였으며, 서열 정보는 도 3에 개시하였다. The stem loop structures of the selected novel miRNA4 and miRNA5 are disclosed in FIGS. 1 and 2 , and sequence information is disclosed in FIG. 3 .
실시예 3. 신규 miRNA의 알츠하이머성 치매 관련 유전자 발현량 조절 확인Example 3. Confirmation of the regulation of gene expression level related to Alzheimer's dementia by novel miRNA
신규 miRNA가 알츠하이머성 치매와 어떤 연관이 있는지를 검증하기 위해 miRNA의 서열 기반으로 타겟이 되는 유전자를 스코어별로 스크리닝하는 miRDB 소프트웨어를 사용하였다. 높은 유전자 스코어를 가진 타겟 유전자 중 알츠하이머성 치매와 관련된 유전자를 선별하였다. In order to verify how the novel miRNA is related to Alzheimer's dementia, miRDB software was used that screens target genes by score based on the sequence of the miRNA. Among the target genes with high gene scores, genes related to Alzheimer's dementia were selected.
신경 기능 및 분화에 모델로 사용되는 SH-SY5Y 세포를 사용하였으며, 선별된 신규 miRNA의 과발현 효과를 나타내는 miRNA mimic, 신규 miRNA의 발현을 억제하는 miRNA inhibitor, 음성대조군 miRNA를 SH-SY5Y에 형질주입 후, 타겟 유전자의 단백질 발현을 웨스턴블랏으로 확인하였다. SH-SY5Y cells used as a model for neural function and differentiation were used. After transfection of a miRNA mimic that shows the overexpression effect of selected new miRNAs, a miRNA inhibitor that suppresses the expression of new miRNAs, and a negative control miRNA into SH-SY5Y , The protein expression of the target gene was confirmed by Western blot.
miRNA mimic은 실제로 생체 내에 있는 신규 miRNA처럼 기능할 수 있는 miRNA로 이중결합으로 제작되었다. miRNA inhibitor는 도출된 해당 miRNA의 상보적인 서열로, 단일 결합으로 제작되어 해당 miRNA를 억제할 수 있는 miRNA이다. 한편, 음성대조군 miRNA는 유전자를 조절하지 않는 miRNA로 이루어진 miRNA로 검증의 기준이 된다. 제작한 신규 miRNA4, 및 miRNA5의 mimic; 및 miRNA inhibitor는 도 3에 개시하였다.miRNA mimic is actually a miRNA that can function like a novel miRNA in a living body, and was made with a double bond. A miRNA inhibitor is a complementary sequence of the derived miRNA, and is a miRNA that is made into a single bond and can inhibit the corresponding miRNA. On the other hand, the negative control miRNA is a miRNA composed of miRNAs that do not regulate genes, and serves as a verification standard. mimic of the novel miRNA4 and miRNA5 produced; and miRNA inhibitors were disclosed in FIG. 3 .
[miRDB 소프트웨어를 이용한 유전자 스크리닝][Genetic screening using miRDB software]
신규 miRNA가 제어하는 유전자 중, 알츠하이머성 치매와 관련성이 높은 타겟을 선별하기 위해, 신규 miRNA 중 miRNA4 mimic은 서열 5'-GGGGGUGUGGGGUAAAAAAU-3'(서열번호 1)를 기반으로, miRNA5 mimic은 서열 5'-GGGGGAGAGAAGGGAAAAG-3'(서열번호 3)를 기반으로, 타겟 예측 miRDB 소프트웨어를 이용해 유전자를 스코어별로 스크리닝하였다. 서열번호 1의 miRNA mimic에 대한 miRNA inhibitor는 5'-AUUUUUUACCCCACACCCCC-3'(서열번호 2)이고, 서열번호 3의 miRNA mimic에 대한 miRNA inhibitor는 5'-CUUUUCCCUUCUUCUCUCCCCC-3'(서열번호 4)이다. Among the genes controlled by the new miRNA, in order to select a target highly related to Alzheimer's dementia, the miRNA4 mimic among the novel miRNAs is based on the
해당 miRNA의 유전자 스코어의 컷-오프 값을 80으로 설정한 후, 신경 및 알츠하이머성 치매 관련 타겟 유전자를 선별하였다. After setting the cut-off value of the gene score of the corresponding miRNA to 80, target genes related to neurological and Alzheimer's disease were selected.
miRNA4의 타겟 유전자로, MAP1A(microtubule associated protein 1A) 유전자를 선별하였다. 상기 MAP1A 단백질은 뇌에서 미세소관(Microtubule) 관련 단백질 패밀리에 속하는 타우에 결합이 가능한 단백질로서 신경 발생의 필수 단계인 미세소관 조립에 관여하며, 신경세포의 항상성과 시냅스 가소성 조절에 중요한 역할을 하는 것이다. As a target gene for miRNA4, a MAP1A (microtubule associated protein 1A) gene was selected. The MAP1A protein is As a protein capable of binding to tau belonging to the microtubule-related protein family in the brain, it is involved in microtubule assembly, an essential step in neurogenesis, and plays an important role in regulating neuronal homeostasis and synaptic plasticity.
신규 miRNA4의 과발현을 위한 miRNA4 mimic, 기능 억제를 위한 miRNA4 inhibitor를 인간 신경모세포종 SH-SY5Y에 각각의 miRNA를 농도 별로 24시간 동안 형질주입하였다. 이후 단백질을 분리하여 웨스턴 블랏을 실시하였다. Each miRNA was transfected into human neuroblastoma SH-SY5Y with miRNA4 mimic for overexpression of novel miRNA4 and miRNA4 inhibitor for function inhibition for 24 hours at each concentration. Thereafter, the protein was isolated and Western blot was performed.
miRNA4의 과발현으로 3'-UTR에 결합하는 miRNA4의 증가에 따른 후보 타겟 유전자 단백질인 MAP1A의 발현이 유의적으로 감소하는 것을 확인하였다. 또한 inhibitor miRNA로 3'-UTR에 결합하는 miRNA4의 제거를 통해 타겟 단백질 MAP1A의 발현이 증가하는 것을 확인하였다(도 4).It was confirmed that the expression of MAP1A, a candidate target gene protein, was significantly decreased according to the increase of miRNA4 binding to 3'-UTR due to overexpression of miRNA4. In addition, it was confirmed that the expression of the target protein MAP1 A was increased through the removal of miRNA4 binding to 3'-UTR with inhibitor miRNA (FIG. 4).
또한, miRNA5의 타겟 유전자로, SHANK1(SH3 and multiple ankyrin repeat domains protein 1)을 선별하였다. SHANK1 단백질은 GKAP/PSD-95 및 Homer와 복합체를 이루며 NMDA형 및 대사성 글루타메이트 수용체를 포함하는 시냅스 후 막의 수용체와 액틴 기반 세포골격을 연결하는 흥분성 시냅스의 PSD(adapter protein in the postsynaptic density)로 수지상 척추와 시냅스 접합부의 구조적 및 기능적 역할을 수행하는 것이다. In addition, as a target gene for miRNA5, SHANK1 (SH3 and multiple ankyrin repeat domains protein 1) was selected. The SHANK1 protein forms a complex with GKAP/PSD-95 and Homer, and is an excitatory synaptic adapter protein in the postsynaptic density (PSD) that connects the actin-based cytoskeleton with the receptors of the post-synaptic membrane including NMDA-type and metabolic glutamate receptors. and synaptic junctions to perform structural and functional roles.
신규 miRNA5의 과발현을 위한 mimic miRNA5, 기능 억제를 위한 inhibitor miRNA5를 인간신경모세포종 SH-SY5Y에 농도 의존적으로(1nM, 10nM, 100 nM)를 48시간 동안 형질 주입하였고, 단백질을 분리하여 웨스턴 블랏을 실시하였다. 신규 miRNA5의 과발현으로 3'-UTR에 결합하는 miRNA5가 증가함에 따라 후보 타겟 유전자 단백질인 SHANK1의 발현이 유의적으로 감소하는 것을 확인하였고, inhibitor miRNA5로 3'-UTR에 결합하는 miRNA5를 제거함으로써, 후보 타겟 유전자 단백질 SHANK1의 발현이 증가하는 것을 확인하였다(도 5).Human neuroblastoma SH-SY5Y was transfected with mimic miRNA5 for overexpression of novel miRNA5 and inhibitor miRNA5 for function inhibition in a concentration-dependent manner (1 nM, 10 nM, 100 nM) for 48 hours, and the protein was isolated and Western blot was performed. did. It was confirmed that the expression of the candidate target gene protein, SHANK1, was significantly reduced as miRNA5 binding to 3'-UTR increased due to overexpression of new miRNA5. By removing miRNA5 binding to 3'-UTR with inhibitor miRNA5, It was confirmed that the expression of the candidate target gene protein SHANK1 was increased (FIG. 5).
한편, 신규 miRNA가 실제 환자의 혈액 내에서 그룹별 발현량 차이가 나는지 확인하기 위해 MCI와 AD로 분류된 환자의 혈장 내 신규 miRNA4와 miRNA5의 발현량 분석을 위한 타겟 시퀀싱을 실시하였다. 경도인지장애(MCI) 그룹과 알츠하이머성 치매(AD) 그룹에서의 miRNA4와 miRNA5의 유의미한 발현량의 차이를 확인하였다. Meanwhile, target sequencing was performed to analyze the expression levels of new miRNA4 and miRNA5 in plasma of patients classified as MCI and AD to check whether the expression level of the new miRNA differs by group in the actual patient's blood. A significant difference in the expression levels of miRNA4 and miRNA5 was confirmed in the mild cognitive impairment (MCI) group and the Alzheimer's dementia (AD) group.
<110> Alz-Dementia Korea Co.
<120> Novel biomarker microRNA for distinguishing and diagnosing mild
cognitive impairment and early Alzheimer's disease
<130> PN21374
<160> 4
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 20
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
gggggugugg gguaaaaaau 20
<210> 2
<211> 20
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 2
auuuuuuacc ccacaccccc 20
<210> 3
<211> 19
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 3
gggggagaga agggaaaag 19
<210> 4
<211> 22
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 4
cuuuucccuu cuucucuccc cc 22
<110> Alz-Dementia Korea Co.
<120> Novel biomarker microRNA for distinguishing and diagnosing mild
cognitive impairment and early Alzheimer's disease
<130> PN21374
<160> 4
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 20
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
gggggugugg gguaaaaaau 20
<210> 2
<211> 20
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 2
auuuuuuacc ccacaccccc 20
<210> 3
<211> 19
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 3
Claims (11)
Priority Applications (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
KR1020210149785A KR102333797B1 (en) | 2021-11-03 | 2021-11-03 | Novel biomarker microRNA for distinguishing and diagnosing mild cognitive impairment and early Alzheimer's disease |
PCT/KR2022/000603 WO2023080340A1 (en) | 2021-11-03 | 2022-01-13 | Novel microrna biomarker for selective diagnosis of mild cognitive impairment and alzheimer dementia |
CN202280054587.7A CN117916391A (en) | 2021-08-13 | 2022-08-11 | Novel microribonucleic acid biomarkers for early diagnosis of mild cognitive impairment or dementia with alzheimer's disease |
PCT/KR2022/012056 WO2023018266A1 (en) | 2021-08-13 | 2022-08-11 | Novel microrna biomarker for early diagnosis of mild cognitive impairment or alzheimer's disease |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
KR1020210149785A KR102333797B1 (en) | 2021-11-03 | 2021-11-03 | Novel biomarker microRNA for distinguishing and diagnosing mild cognitive impairment and early Alzheimer's disease |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
KR102333797B1 true KR102333797B1 (en) | 2021-12-01 |
Family
ID=78900044
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
KR1020210149785A KR102333797B1 (en) | 2021-08-13 | 2021-11-03 | Novel biomarker microRNA for distinguishing and diagnosing mild cognitive impairment and early Alzheimer's disease |
Country Status (3)
Country | Link |
---|---|
KR (1) | KR102333797B1 (en) |
CN (1) | CN117916391A (en) |
WO (1) | WO2023080340A1 (en) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2023018266A1 (en) * | 2021-08-13 | 2023-02-16 | 주식회사 알츠코리아 | Novel microrna biomarker for early diagnosis of mild cognitive impairment or alzheimer's disease |
WO2023080340A1 (en) * | 2021-11-03 | 2023-05-11 | 주식회사 알츠코리아 | Novel microrna biomarker for selective diagnosis of mild cognitive impairment and alzheimer dementia |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR20160006432A (en) * | 2014-07-09 | 2016-01-19 | 대한민국(관리부서 질병관리본부장) | Biomarker for diagnosing Mild Cognitive Impairment |
KR20180031612A (en) * | 2016-09-20 | 2018-03-28 | 피씨엘 (주) | A Method of Rapid Diagnosis With High Sensitivity By Using Single Diagnosis Chip Comprising Reaction and Analysis Process |
KR20180051243A (en) * | 2016-11-08 | 2018-05-16 | 대한민국(관리부서 질병관리본부장) | Method for diagnosing dementia using blood-derived cellular gene expression pattern |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR102333797B1 (en) * | 2021-11-03 | 2021-12-01 | 주식회사 알츠코리아 | Novel biomarker microRNA for distinguishing and diagnosing mild cognitive impairment and early Alzheimer's disease |
-
2021
- 2021-11-03 KR KR1020210149785A patent/KR102333797B1/en active IP Right Grant
-
2022
- 2022-01-13 WO PCT/KR2022/000603 patent/WO2023080340A1/en unknown
- 2022-08-11 CN CN202280054587.7A patent/CN117916391A/en active Pending
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR20160006432A (en) * | 2014-07-09 | 2016-01-19 | 대한민국(관리부서 질병관리본부장) | Biomarker for diagnosing Mild Cognitive Impairment |
KR20180031612A (en) * | 2016-09-20 | 2018-03-28 | 피씨엘 (주) | A Method of Rapid Diagnosis With High Sensitivity By Using Single Diagnosis Chip Comprising Reaction and Analysis Process |
KR20180051243A (en) * | 2016-11-08 | 2018-05-16 | 대한민국(관리부서 질병관리본부장) | Method for diagnosing dementia using blood-derived cellular gene expression pattern |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2023018266A1 (en) * | 2021-08-13 | 2023-02-16 | 주식회사 알츠코리아 | Novel microrna biomarker for early diagnosis of mild cognitive impairment or alzheimer's disease |
WO2023080340A1 (en) * | 2021-11-03 | 2023-05-11 | 주식회사 알츠코리아 | Novel microrna biomarker for selective diagnosis of mild cognitive impairment and alzheimer dementia |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN117916391A (en) | 2024-04-19 |
WO2023080340A1 (en) | 2023-05-11 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CA2780222C (en) | Methods of using small rna from bodily fluids for diagnosis and monitoring of neurodegenerative diseases | |
EP2733219B1 (en) | Diagnostic miRNA markers for Alzheimer | |
KR102333797B1 (en) | Novel biomarker microRNA for distinguishing and diagnosing mild cognitive impairment and early Alzheimer's disease | |
TWI580788B (en) | Methods and kits for detecting kawasaki disease | |
Pietrzak et al. | Gene expression profiling of brain samples from patients with Lewy body dementia | |
CN110791560B (en) | miRNA marker for diagnosing and/or treating Alzheimer disease | |
KR102341233B1 (en) | Novel biomarker microRNA for diagnosing mild cognitive impairment or early Alzheimer's disease | |
CN108676872B (en) | One kind biomarker relevant to asthma and its application | |
Toffolo et al. | Circulating microRNAs as biomarkers in traumatic brain injury | |
CN104968802B (en) | New miRNA as diagnosis marker | |
WO2021000893A1 (en) | Mirna receptivity analysis of the endometrium | |
US20170032100A1 (en) | Use of micro-ribonucleic acid (mirna) to diagnose transplant rejection and tolerance of immunosuppression therapy | |
CN111518884A (en) | Application of miRNA30 cluster as Alzheimer disease diagnostic marker | |
KR102321753B1 (en) | Novel biomarker microRNA for diagnosing early Alzheimer's disease | |
CN112980941B (en) | Kit for diagnosing whether subject suffers from Alzheimer disease and application of kit | |
KR101998457B1 (en) | A biomarker for diagnizing alzheimers disease | |
CN111944809B (en) | Diagnostic marker for Parkinson's disease and application thereof | |
CN108034707B (en) | SPAG7 gene is preparing the application in diagnosis of dementia preparation | |
JP6541049B2 (en) | Biomarkers for amyotrophic lateral sclerosis | |
WO2012034189A1 (en) | Methods of using mirnas transcribed from the 14q32 region of human chromosome 14 as biomarkers for schizophrenia or symptoms thereof | |
CN113801879A (en) | Target lncRNA for learning and memory dysfunction caused by microwave radiation: MSTRG.27033.1 | |
WO2023018266A1 (en) | Novel microrna biomarker for early diagnosis of mild cognitive impairment or alzheimer's disease | |
TW202019483A (en) | Diagnosis and treatment of psoriatic arthritis and kit thereof | |
CN108277271A (en) | A kind of miRNA of auxiliary detection alzheimer disease | |
US11655507B2 (en) | Method for diagnosing Parkinson's disease using nasal mucus, composition therefore, and kit comprising the same |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A302 | Request for accelerated examination | ||
E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
GRNT | Written decision to grant |