KR102332082B1 - Surface-enhanced Raman scattering (SERS) with magnetic microparticle-based assay for bio materials detection - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 타겟 캡쳐 프로브로 개질된 자성 마이크로입자와 표면증강라만신호를 이용한 검출방법 등에 관한 것이다. The present invention relates to a detection method using magnetic microparticles modified with a target capture probe and a surface-enhanced Raman signal, and the like.
자성 마이크로입자(magnetic microparticles, MMP)는 세포 분리(cell separation), 단백질 정제(protein purification), 및 단백질 또는 핵산 바이오마커의 검출을 위한 분석 프로토콜의 주요 인자로서, 다양한 목적으로 이용되어왔다. MMP는 내부에 초상자성(superparamagnetic) 나노입자를 포함하는 단분산 마이크로 크기의 폴리스티렌 입자로서, 액상에서 자유롭게 분산된 상태이며, 외부 자기장을 걸어줌으로써 액상으로부터 빠르게 분리될 수 있다. 또한, 카복실이나 아민과 같은 MMP 표면에 다양한 표면 화학(surface chemistry)을 가지므로, MMP를 항체 또는 핵산을 포함하도록 변형함으로써 간단한 세포 분석, 면역분석(immunoassay), 및 핵산 검출의 분야에서 활용할 수 있다.Magnetic microparticles (MMP) have been used for a variety of purposes as a key factor in cell separation, protein purification, and assay protocols for the detection of protein or nucleic acid biomarkers. MMPs are monodisperse micro-sized polystyrene particles containing superparamagnetic nanoparticles therein. They are freely dispersed in a liquid phase, and can be quickly separated from the liquid phase by applying an external magnetic field. In addition, since the MMP surface has various surface chemistry such as carboxyl or amine, it can be utilized in the fields of simple cell analysis, immunoassay, and nucleic acid detection by modifying the MMP to include an antibody or nucleic acid. .
분석 과정에 있어서, 타겟을 단백질이나 핵산에 결합한 후, 신호 전달(signal transduction)은 필수적이며, MMP 또는 MMP에서 방출된 신호 분자를 이용하여 광학, 분광법을 포함한 다양한 신호를 직접적으로 측정할 수 있다. MMP는 다가성(multivalency)이며 MMP에서 신호 분자가 풍요로운 상태(enriched state)에 있는바, 높은 민감도로 상기 타겟을 검출할 수 있다. 종래에 MMP에서 직접적으로 보낸 형광 신호를 포함한 현장 진단(point-of-care diagnostics, POCD)에서 병원균 유래 DNA 검출하기 위한 MMP의 잠재적인 활용에 대해 연구되었으며, 스캐노메트릭법(scanometric method)으로 MMP에서 방출된 바코드(bar-code) DNA를 검출함으로써 500 zeptomolar 민감도 수준으로 타겟 DNA를 검출할 수 있는 MMP 기반 검출 시스템에 대해 보고된 바 있다. 또한 MMP에서 방출된 DNA 바코드를 검출하기 위해 질량 분석법(mass spectrometry)을 이용함으로써 aM 민감도를 갖는 바코드 DNA 매개 바이오분자 검출에 대해 보고된 바 있다. 상기 연구들은 추가적인 신호 증폭 방법을 포함 또는 제외한 것으로서, MMP의 특이적인 특성에 강하게 의존한 분석법으로 볼 수 있다. In the analysis process, after binding a target to a protein or nucleic acid, signal transduction is essential, and various signals including optical and spectroscopy can be directly measured using MMPs or signal molecules released from MMPs. MMP is multivalency, and since the signal molecule is in an enriched state in MMP, the target can be detected with high sensitivity. Previously, the potential utilization of MMP for the detection of pathogen-derived DNA in point-of-care diagnostics (POCD) including a fluorescence signal sent directly from the MMP was studied, and MMP was used as a scanometric method. It has been reported on an MMP-based detection system that can detect target DNA with a sensitivity level of 500 zeptomolar by detecting barcode DNA released from It has also been reported on the detection of barcoded DNA-mediated biomolecules with aM sensitivity by using mass spectrometry to detect DNA barcodes released from MMPs. The above studies include or exclude additional signal amplification methods, and can be viewed as assays that strongly depend on the specific properties of MMPs.
MMP를 사용한 다양한 분석에도 불구하고, 신호 판독으로서 라만 산란(Raman scattering)은 아직 널리 이용되지 않았다. 이는 형광 신호와 비교하여 라만 산란이 낮은 신호 강도를 가지기 때문이다. 그러나, 라만 신호는 표면 증강 라만 분산을 이용함으로써 크게 증가할 수 있으며, 라만 분산은 신호 전달에 있어 전도유망한 방법일 뿐만 아니라, MMP 기반 분석에 있어 신호 증폭에 좋은 전략이 될 수 있다. 그러나, 라만 분산과 형광신호 간의 분석 능력에 대한 시스템적인 비교는 아직 상세히 조사되지 않았다.Despite various analyzes using MMP, Raman scattering as a signal readout has not yet been widely used. This is because the Raman scattering has a low signal intensity compared to the fluorescence signal. However, the Raman signal can be greatly increased by using surface-enhanced Raman dispersion, which is not only a promising method for signal transduction, but also a good strategy for signal amplification in MMP-based assays. However, a systematic comparison of the analytical capability between Raman dispersion and fluorescence signal has not yet been investigated in detail.
따라서, 본 발명은 패혈증(sepsis)을 유발하는 것으로 알려진 주요 병원균인 Escherichia coli(E. coli), Enterococcus faecalis(E. faecalis), 및 Staphylococcus aureus(S. aureus)와 같은 세균의 핵산 타겟을 선별하였다. 패혈증의 경우, 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)과 같은 종래의 효소적 증폭 방법(enzymatic amplification method) 또는 배양-기반 방법(culture-based method)에 의존하지 않는 간단하고, 빠르고, 탄탄한 분석법에 대한 강한 수요가 존재한다. 세균 배양은 시간이 많이 소요되고 PCR은 효소적 증폭 방법으로서 허위 양성(false-positive)이 발생하는 경향이 있기 때문이다. 이러한 점에서, 라만 산란을 포함하는 MMP 기반 분석은 신뢰성 있는 비효소적 증폭 방법이자 분석 전략으로서 전도유망하다.Therefore, in the present invention, nucleic acid targets of bacteria such as Escherichia coli (E. coli) , Enterococcus faecalis (E. faecalis) , and Staphylococcus aureus (S. aureus ), which are major pathogens known to cause sepsis, were selected. . In the case of sepsis, a simple, fast, and robust assay that does not rely on culture-based methods or conventional enzymatic amplification methods such as polymerase chain reaction (PCR). There is a strong demand for This is because bacterial culture is time-consuming and PCR is an enzymatic amplification method, which tends to produce false-positives. In this respect, MMP-based assays involving Raman scattering are promising as reliable non-enzymatic amplification methods and assay strategies.
본 발명은 타겟 캡쳐 프로브(capture probe) DNA 서열 및 형광 염료로 개질된 신호프로브(signal probe) DNA 서열을 고안했으며, 양 서열은 타겟 DNA 서열에 대해 반상보적(half-complementary) 서열이다(도 2). 형광 신호는 i) MMP를 포함하는 용액으로부터 직접 측정되거나, ii) 상기 MMP 용액으로부터 방출된 신호 프로브에 의해 측정될 수 있다. 상기 방출된 신호 프로브는 표면 증강 라만 산란(Surface-enhanced Raman scattering, SERS)을 이용하여 정량화될 수 있다. 상기 전략에 기초하여, 형광 및 라만 산란 간의 민감도 및 다중진단능력과 같은 분석 능력에 대한 엄격한 비교를 통해 본 발명자는 SERS를 포함한 MMP-기반 방법이 민감도 및 다중진단능력의 관점에서 세균 타겟 DNA를 검출하는데 전도유망한 신규 전략임을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.The present invention devised a target capture probe DNA sequence and a signal probe DNA sequence modified with a fluorescent dye, both sequences being half-complementary to the target DNA sequence (Fig. 2). The fluorescence signal can be i) measured directly from a solution containing MMP, or ii) by a signal probe emitted from the MMP solution. The emitted signal probe may be quantified using surface-enhanced Raman scattering (SERS). Based on the above strategy, through rigorous comparison of analytical capabilities such as sensitivity and multidiagnostic capability between fluorescence and Raman scattering, the present inventors found that MMP-based methods including SERS detect bacterial target DNA in terms of sensitivity and multidiagnostic capability. It was confirmed that it is a promising new strategy to do this, and the present invention was completed.
본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 타겟 캡쳐 프로브로 개질된 자성 마이크로입자를 포함하는 바이오물질 다중 검출방법을 제공하는 것이다.An object of the present invention is to provide a method for detecting multiple biomaterials including magnetic microparticles modified with a target capture probe.
또한, 본 발명의 다른 목적은 타겟 캡쳐 프로브로 개질된 자성 마이크로입자를 포함하는 세균 감염성 질환을 진단하기 위한 정보제공방법을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide an information providing method for diagnosing bacterial infectious diseases including magnetic microparticles modified with a target capture probe.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당해 기술분야의 통상의 기술자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.However, the technical problem to be achieved by the present invention is not limited to the above-mentioned problems, and other problems not mentioned will be clearly understood by those skilled in the art from the following description.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 바이오물질 다중 검출방법을 제공한다.In order to solve the above problems, the present invention provides a method for detecting multiple biomaterials comprising the following steps.
(a) 타겟 캡쳐 프로브로 개질된 자성 마이크로입자(magnetic microparticles, MMP)를 제조하는 단계;(a) preparing magnetic microparticles (MMP) modified with a target capture probe;
(b) 상기 타겟 캡쳐 프로브로 개질된 MMP를 검출하고자 하는 바이오물질 특이적 타겟서열 및 신호 프로브와 혼성화하는 단계;(b) hybridizing with a biomaterial-specific target sequence and signal probe to detect the modified MMP with the target capture probe;
(c) 상기 혼성화된 MMP를 포함하는 용액 및 상기 MMP 용액으로부터 방출된 신호 프로브로부터 형광 신호를 각각 검출하는 단계; 및(c) detecting a fluorescence signal from a solution containing the hybridized MMP and a signal probe emitted from the MMP solution, respectively; and
(d) 상기 방출된 신호 프로브에 금속 나노입자를 첨가하여 라만(SERS) 신호를 검출하는 단계.(d) detecting a Raman (SERS) signal by adding metal nanoparticles to the emitted signal probe.
본 발명의 일 구현 예로서, 상기 타겟 캡쳐 프로브와 신호 프로브는 각각 상기 타겟 서열과 반상보적(half-complementary)인 것일 수 있다.In one embodiment of the present invention, the target capture probe and the signal probe may be half-complementary to the target sequence, respectively.
본 발명의 다른 구현 예로서, 상기 (a) 단계의 MMP는 종류가 다른 2개 이상의 타겟 캡쳐 프로브로 개질된 것으로서, 2종 이상의 타겟 서열에 특이적으로 결합할 수 있다.In another embodiment of the present invention, the MMP of step (a) is modified with two or more different target capture probes, and can specifically bind to two or more target sequences.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 (b) 단계에서 혼성화 시간은 3 시간 내지 12 시간이고, 0.15 M 내지 0.3 M 농도의 염을 처리하는 것일 수 있으며, 바람직하게는 혼성화시간은 3 시간이고, 염의 농도는 0.3 M일 수 있다.As another embodiment of the present invention, the hybridization time in step (b) is 3 hours to 12 hours, and may be to treat the salt at a concentration of 0.15 M to 0.3 M, preferably the hybridization time is 3 hours, and the The concentration may be 0.3 M.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 (c) 단계의 방출된 신호 프로브는 상기 혼성화된 MMP 용액에 자기장을 걸어 분산되고, 상기 타겟 서열의 Tm(melting temperature)보다 높은 온도로 가열됨으로써 방출되는 것일 수 있다.As another embodiment of the present invention, the signal probe emitted in step (c) is dispersed by applying a magnetic field to the hybridized MMP solution, and is emitted by heating to a temperature higher than the T m (melting temperature) of the target sequence. can
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 검출방법은 최소 검출한계가 30 fM, 즉 3 Х 10-14 M일 수 있다.In another embodiment of the present invention, the detection method may have a minimum detection limit of 30 fM, that is, 3 Х 10 -14 M.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 금속 나노입자의 표면을 시스테아민(cysteamine), APTES(3-Aminopropyl)triethoxysilane), APTMS(3-Aminopropyl)trimethoxysilane, AEAPTMS(N-[3-(Trimethoxysilyl)propyl]ethylenediamine, MPTMS(3- Mercaptopropyl)trimethoxysilane, MPTES((3-Mercaptopropyl)triethoxysilane), MPA(mercaptopropionic acid), MHA(6-mercaptohexanoic acid), BDT(1,4- benzenedithiol), MBA(4-mercaptobenzoic acid), 및 MBIA(2 -mercaptobenzoimidazole- 5-carboxylic acid)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상으로 개질한 것일 수 있다.As another embodiment of the present invention, the surface of the metal nanoparticles is cysteamine, APTES (3-Aminopropyl) triethoxysilane), APTMS (3-Aminopropyl) trimethoxysilane, AEAPTMS (N- [3- (Trimethoxysilyl) propyl) ]ethylenediamine, MPTMS(3- Mercaptopropyl)trimethoxysilane, MPTES((3-Mercaptopropyl)triethoxysilane), MPA(mercaptopropionic acid), MHA(6-mercaptohexanoic acid), BDT(1,4-benzenedithiol), MBA(4-mercaptobenzoic acid) ), and MBIA (2-mercaptobenzoimidazole-5-carboxylic acid) may be modified with any one or more selected from the group consisting of.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 신호 프로브는 형광물질, 발색물질, 또는 화학발광물질로 표지된 것일 수 있다.In another embodiment of the present invention, the signal probe may be labeled with a fluorescent material, a color developing material, or a chemiluminescent material.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 형광물질은 ATTO 계열 염료, 시아닌(Cyanine) 계열 염료, FAM(6-carboxyfluorescein), 텍사스 레드(texas red), 플루 오레신(fluorescein), HEX(2',4',5',7'-tetrachloro-6-carboxy-4,7- dichlorofluorescein), 플루오레신 클로로트리아지닐(fluorescein chlorotriazinyl), 로다민 그린(rhodamine green), 로다민 레드(rhodamine red), 테트라메틸 로다민(tetramethyl rhodamine), FITC(fluorescein isothiocyanate), 오레곤 그린(oregon green), 알렉사 플루오로(alexa fluor), JOE(6-Carboxy-4',5'-Dichloro-2',7'-Dimethoxyfluorescein), ROX(6-Carboxyl-XRhodamine), TET(Tetrachloro-Fluorescein), TRITC(tertramethylrodamine isothiocyanate), TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), NED(N-(1-Naphthyl) ethylenediamine), 및 씨아디카르보시아닌(thiadicarbocyanine)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.As another embodiment of the present invention, the fluorescent material is an ATTO-based dye, a cyanine-based dye, FAM (6-carboxyfluorescein), Texas red (texas red), fluorescein, HEX (2',4',5',7'-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), fluorescein fluorescein chlorotriazinyl, rhodamine green, rhodamine red, tetramethyl rhodamine, fluorescein isothiocyanate (FITC), oregon green, Alexa Fluoro (alexa fluor), JOE (6-Carboxy-4',5'-Dichloro-2',7'-Dimethoxyfluorescein), ROX (6-Carboxyl-XRhodamine), TET (Tetrachloro-Fluorescein), TRITC (tertramethylrodamine isothiocyanate), It may be any one or more selected from the group consisting of TAMRA (6-carboxytetramethyl-rhodamine), NED (N-(1-Naphthyl) ethylenediamine), and thiadicarbocyanine.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 검출방법은 웰, 채널, 튜브, 또는 이들의 조합에서 수행되는 것일 수 있다.In another embodiment of the present invention, the detection method may be performed in a well, a channel, a tube, or a combination thereof.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 바이오물질은 단백질, 세포, 바이러스, 핵산, 유기분자, 및 무기분자로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.In another embodiment of the present invention, the biomaterial may be any one or more selected from the group consisting of proteins, cells, viruses, nucleic acids, organic molecules, and inorganic molecules.
또한, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 세균 감염성 질환을 진단하기 위한 정보제공방법을 제공한다.In addition, the present invention provides an information providing method for diagnosing a bacterial infectious disease comprising the following steps.
(a) 타겟 캡쳐 프로브로 개질된 자성 마이크로입자(magnetic microparticles, MMP)를 제조하는 단계;(a) preparing magnetic microparticles (MMP) modified with a target capture probe;
(b) 상기 타겟 캡쳐 프로브로 개질된 MMP를 검출하고자 하는 바이오물질 특이적 타겟 서열 및 신호 프로브와 혼성화하는 단계;(b) hybridizing with a biomaterial-specific target sequence and signal probe to detect the modified MMP with the target capture probe;
(c) 상기 혼성화된 MMP를 포함하는 용액 및 상기 MMP 용액으로부터 방출된 신호 프로브로부터 형광 신호를 각각 검출하는 단계; 및(c) detecting a fluorescence signal from a solution containing the hybridized MMP and a signal probe emitted from the MMP solution, respectively; and
(d) 상기 방출된 신호 프로브에 금속 나노입자를 첨가하여 방출되는 라만(SERS) 신호를 검출하는 단계.(d) detecting the emitted Raman (SERS) signal by adding metal nanoparticles to the emitted signal probe.
본 발명의 일 구현 예로서, 상기 타겟 캡쳐 프로브와 신호 프로브는 각각 상기 타겟 서열과 반상보적(half-complementary)인 것일 수 있다.In one embodiment of the present invention, the target capture probe and the signal probe may be half-complementary to the target sequence, respectively.
본 발명의 다른 구현 예로서, 상기 (a) 단계 이전에, 세균 감염성 질환이 의심되는 환자샘플에서 유전체 DNA를 추출하는 단계를 포함할 수 있다.As another embodiment of the present invention, before step (a), it may include extracting genomic DNA from a patient sample suspected of having a bacterial infectious disease.
본 발명의 또 다른 구현 예로서, 상기 환자샘플은 혈액, 혈청, 및 혈장으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.In another embodiment of the present invention, the patient sample may be any one or more selected from the group consisting of blood, serum, and plasma.
본 발명의 다른 구현 예로서, 상기 (a) 단계의 MMP는 종류가 다른 2개 이상의 타겟 캡쳐 프로브로 개질된 것으로서, 2종 이상의 타겟 서열에 특이적으로 결합하여, 상기 타겟 서열을 포함하는 미생물을 각각 원인균으로 하는 2종 이상의 세균 감염성 질환을 진단하는 것일 수 있다.In another embodiment of the present invention, the MMP of step (a) is modified with two or more target capture probes of different types, and specifically binds to two or more target sequences, thereby producing a microorganism comprising the target sequence. It may be diagnosing two or more types of bacterial infectious diseases, each of which is a causative organism.
본 발명의 다른 구현 예로서, 상기 (d) 단계 이후에, 상기 바이오물질에 의한 형광 신호 또는 라만 신호의 정보를 이용하여 세균 감염성 질환 원인균의 존재 여부 또는 상기 원인균의 종류를 판정하는 단계를 포함할 수 있다.In another embodiment of the present invention, after step (d), determining the presence or absence of a bacterial infectious disease causative organism or the type of the causative organism using information of a fluorescence signal or a Raman signal by the biomaterial. can
본 발명의 다른 구현 예로서, 상기 세균 감염성 질환은 패혈증, 부비동염, 폐렴, 식중독, 이질, 결핵, 녹농균 감염, 농가진, 화농성 질환, 급성 피부염, 균혈증, 심내막염, 장염, 골관절염, 골수염, 요로감염, 뇌염, 뇌막염, 및 신장염으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.In another embodiment of the present invention, the bacterial infectious disease is sepsis, sinusitis, pneumonia, food poisoning, dysentery, tuberculosis, P. aeruginosa infection, impetigo, purulent disease, acute dermatitis, bacteremia, endocarditis, enteritis, osteoarthritis, osteomyelitis, urinary tract infection, encephalitis , may be any one or more selected from the group consisting of meningitis, and nephritis.
본 발명의 다른 구현 예로서, 세균은 그람 양성균, 그람 음성균 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.In another embodiment of the present invention, the bacteria may be any one or more selected from the group consisting of gram-positive bacteria, gram-negative bacteria, and mixtures thereof.
본 발명은 타겟 캡쳐 프로브로 개질된 자성 마이크로입자(magnetic microparticles, MMP)를 포함하는 라만 신호를 이용한 바이오물질 다중 검출방법 등에 관한 것으로서, 보다 구체적으로 상기 개질된 MMP를 검출하고자 하는 바이오물질 특이적 타겟 서열 및 신호 프로브와 혼성화하고, 상기 혼성화된 MMP를 포함하는 용액 및 상기 MMP 용액으로부터 방출된 신호 프로브로부터 형광 신호를 각각 검출하고, 이후 상기 방출된 신호 프로브에 금속 나노입자를 첨가하여 라만 신호를 검출하는 단계를 포함함으로써, 높은 민감도로 2종 이상의 바이오물질을 특이적으로 검출할 수 있다. 본 발명은 형광 신호 및 라만 신호를 고감도로 수득할 수 있고, MMP를 분리 후 세척하는 단계가 간단하여 다양한 프로브를 사용해 다중 검출이 가능하며, 혼성화 단계와 신호 검출 단계를 분리함으로써 비특이적인 결합을 감소시키고, 바이오물질 탐지 효율을 높일 수 있다.The present invention relates to a method for multiple detection of a biomaterial using a Raman signal including magnetic microparticles (MMP) modified as a target capture probe, and more specifically, a biomaterial-specific target for detecting the modified MMP. After hybridization with a sequence and a signal probe, a fluorescence signal is detected from a solution containing the hybridized MMP and a signal probe emitted from the MMP solution, respectively, and then metal nanoparticles are added to the emitted signal probe to detect a Raman signal By including the step of, it is possible to specifically detect two or more types of biomaterials with high sensitivity. The present invention can obtain a fluorescence signal and a Raman signal with high sensitivity, and since the step of separating and washing MMP is simple, multiple detection using various probes is possible, and non-specific binding is reduced by separating the hybridization step and the signal detection step and increase the biomaterial detection efficiency.
도 1은 세균 타겟 DNA 검출을 위한 MMP 기반 분석을 나타낸 것이다. 타겟 캡쳐 프로브로 개질된 MMP가 바이오물질 타겟서열 및 신호 프로브와 혼성화하고, 상기 신호 프로브와 혼성화된 MMP가 자기장에서 분리된다. 형광 및 SERS 기반 검출 방법을 통해 상기 MMP의 형광 강도 및 방출된 신호를 측정할 수 있다.
도 2는 혼성화 조건에 따른 형광 신호의 영향을 나타낸 것이다. (A)는 타겟 결합 과정을 나타낸 것이고, (B)는 혼성화 시간(0, 1, 3, 6, 12 시간)에 따른 타겟 DNA의 혼성화 후 MMP의 형광 강도 및 이미지를 나타낸 것이며, (C)는 염도(타겟이 없는 경우, 0.15 M NaCl, 0.3 M NaCl)에 따른 타겟 DNA의 혼성화 후 MMP의 형광 강도 및 이미지를 나타낸 것이다. 이 때, scale bar는 5 μm이다.
도 3(A)는 타겟 캡쳐 프로브와 상보적인 Cy5로 개질된 DNA (5'-Cy5 dye-GTGCCAATGATCTTCGCTCG-3')를 이용하여 MMP에서 타겟 캡쳐 프로브의 양을 정량화하는 실험 기법을 나타낸 것이고, (B)는 Cy5-DNA 서열의 보정 곡선을 나타낸 것이며, (C) COOH-기능화된 MMP, Cy5-DNA 혼성화된 MMP, 및 Cy5-DNA를 방출한 후의 MMP의 B/F 및 형광 이미지를 나타낸 것이다.
도 4(A)는 Cys-AuNP의 TEM 이미지를 나타낸 것이고, (B)는 Cys-AuNP의 UV-Vis 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 5(A)는 세균 유전체 DNA의 추출 방법 및 타겟 DNA의 디자인을 도식화한 것이고, (B)는 600 nm에서 측정한 37 oC에서 tryptic soy broth medium에 배양된 E. coli의 생장 곡선을 나타낸 것이며, (C)는 상기 추출된 E. coli 유전체 DNA의 UV-Vis 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 6(A)는 신호 프로브 용액(5'-ATTO488 dye-GGATTTTCGACAGGATATTA-3' (E.coli), 5'-ATTO590 dye-TGGTTAAACTTTTTGCCTTA-3' (E. faecalis), 및 5'-ATTO647 dye-TCACAAACAGATAATGGCGT-3' (S. aureus)) (10-7 M)의 형광 이미지를 나타낸 것이고, (B)는 MMP 단독, 타겟을 제외한 MMP, 각 세균의 타겟 DNA와 혼성화한 MMP의 B/F 및 형광 이미지를 나타낸 것이다.
도 7(A)는 신호 프로브 용액(5'-ATTO488 dye-GGATTTTCGACAGGATATTA-3', 5'-cy5 dye-GGAT TTTCGACAGGATATTA-3', 5'-ATTO590 dye-TGGTTAAACTTTTTGCCTTA-3', 및 5'-ATTO647 dye-TCACAAACAGATAATGGCGT-3') (10-6 M)의 SERS 스펙트럼을 나타낸 것이고, (B)는 혼합된 신호 프로브 용액(5'-ATTO488 dye-GGATTTTCGACAGGATATTA-3', 5'-ATTO590 dye-TGGTTAAACTTTTTGCCTTA-3', 5'-ATTO647 dye-TCACAAACAGATAATGGCGT-3', and 5'-cy5 dye-GGAT TTTCGACAGGATATTA-3', 5'-ATTO590 dye-TGGTTAAACTTTTTGCCTTA-3', 5'-ATTO647 dye-TCACAAACAGATAATGGCGT-3')의 SERS 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 8은 형광 기반 검출 및 SERS 기반 검출의 민감도를 비교한 것이다. (A)는 형광 및 SERS의 분석 기법을 나타낸 것이고, (B)는 신호 프로브와 혼성화한 MMP의 형광 강도 및 이미지와, 방출된 신호 프로브의 형광 강도를 나타낸 것이며, (C)는 타겟 DNA 농도에 따른 방출된 신호 프로브의 SERS 스펙트럼을 나타낸 것이고, (D)는 (C) 스펙트럼으로부터 선별된 라만 이동(Raman shift)의 SERS 강도를 나타낸 것이다. 이 때, scale bar는 5 μm이다.
도 9는 단일 타겟 DNA에 대한 형광 기반 및 SERS 기반 검출의 다중진단 분석을 나타낸 것이다. (A)는 단일 타겟(E.coli, E.faecalis, 및 S.aureus)의 형광 기반 및 SERS 기반 검출을 포함하는 다중진단 분석 전반을 나타낸 것이고, (B)는 단일 신호 프로브(ATTO 488;E.coli, ATTO 590;E.feacalis, and ATTO 647;S.aureus)를 혼성화한 bead의 형광 강도 및 이미지를 나타낸 것이며, (C)는 방출된 신호 프로브의 형광 강도를 나타낸 것이고, (D)는 세균 타겟 DNA(10-9 M)의 SERS 스펙트럼을 나타낸 것이다. 각 신호 프로브의 참고 스펙트럼(Reference spectrum)은 점선으로 나타냈다. 상기 참고 스펙트럼은 10 μL로 측정하고, 100 μL의 신호 프로브(10-7 M) 및 100 μL의 Cys-AuNP (O.D. 1.0)와 혼합함으로써 응집하였으며, 1800 rpm으로 15 분동안 원심분리하였다. 이 때, scale bar는 5 μm이다.
도 10은 다양한 타겟 농도(10-9 M, 10-10 M, 10-11 M, 10-12 M, 10-13 M, 10-14 M, 타겟이 없는 경우)에서 E. faecalis 타겟 DNA에 대한 세 번의 독립적인 분석으로부터 얻은 라만 스펙트럼을 반복 측정한 결과이다. (A)는 1st 시도, (B)는 2nd 시도, (C)는 3rd 시도를 나타낸다. (D)는 상기 세 번의 독립적인 분석으로부터 선별된 라만 이동(Raman shift (1333.29, 1520.53, and 1640.75 cm-1))의 강도를 나타낸 것이다.
도 11은 다수의 타겟 DNA에 대한 다중진단 분석을 나타낸 것이다. (A)는 다수의 타겟 DNA의 다중진단 분석 전반을 나타낸 것이고, (B)는 다수의 신호 프로브를 혼성화한 bead의 형광 강도 및 이미지를 나타낸 것이며, (C)는 다수의 방출된 신호 프로브의 형광 강도를 나타낸 것이고, (D)는 다수의 타겟 DNA의 SERS 스펙트럼을 나타낸 것이다. 이 때, scale bar는 5 μm이다.
도 12는 E. coli 유전체 DNA의 검출에 관한 것이다. (A)는 형광 및 SERS 기반 방법으로 E. coli 유전체 DNA를 검출하기 위한 실험 과정을 나타낸 것이고, (B)는 신호 프로브 및 방출된 신호 프로브와 혼성화된 bead의 형광 강도를 나타낸 것이며, (C)는 E. coli 유전체 DNA(30 pM ~ 30 fM)의 농도에 따른 SERS 스펙트럼을 나타낸 것이다.1 shows an MMP-based assay for bacterial target DNA detection. The MMP modified with the target capture probe is hybridized with the biomaterial target sequence and the signal probe, and the MMP hybridized with the signal probe is separated in a magnetic field. Fluorescence intensity and emitted signal of the MMP can be measured through a fluorescence and SERS-based detection method.
Figure 2 shows the effect of the fluorescence signal according to the hybridization conditions. (A) shows the target binding process, (B) shows the fluorescence intensity and image of the MMP after hybridization of the target DNA according to the hybridization time (0, 1, 3, 6, 12 hours), (C) is The fluorescence intensity and image of MMP after hybridization of target DNA according to salinity (in case of no target, 0.15 M NaCl, 0.3 M NaCl) are shown. At this time, the scale bar is 5 μm.
3(A) shows an experimental technique for quantifying the amount of target capture probe in MMP using Cy5-modified DNA (5'-Cy5 dye-GTGCCAATGATCTTCGCTCG-3') complementary to the target capture probe, (B ) shows the calibration curve of the Cy5-DNA sequence, and (C) shows B/F and fluorescence images of COOH-functionalized MMP, Cy5-DNA hybridized MMP, and MMP after releasing Cy5-DNA.
4(A) shows a TEM image of Cys-AuNP, and (B) shows a UV-Vis spectrum of Cys-AuNP.
Figure 5 (A) is a schematic diagram of the extraction method of bacterial genomic DNA and the design of the target DNA, (B) is a growth curve of E. coli cultured in tryptic soy broth medium at 37 o C measured at 600 nm. and (C) shows the UV-Vis spectrum of the extracted E. coli genomic DNA.
Figure 6(A) is a signal probe solution (5'-ATTO488 dye-GGATTTTCGACAGGATATTA-3' ( E.coli ), 5'-ATTO590 dye-TGGTTAAACTTTTTGCCTTA-3' ( E. faecalis ), and 5'-ATTO647 dye-TCACAAACAGATAATGGCGT -3' ( S. aureus )) (10 -7 M) shows a fluorescence image, (B) is a B/F and fluorescence image of MMP alone, MMP excluding the target, and MMP hybridized with the target DNA of each bacteria is shown.
7(A) shows a signal probe solution (5'-ATTO488 dye-GGATTTTCGACAGGATATTA-3', 5'-cy5 dye-GGAT TTTCGACAGGATATTA-3', 5'-ATTO590 dye-TGGTTAAACTTTTTGCCTTA-3', and 5'-ATTO647 dye -TCACAAACAGATAATGGCGT-3') (10 -6 M) shows the SERS spectrum, (B) is a mixed signal probe solution (5'-ATTO488 dye-GGATTTTCGACAGGATATTA-3', 5'-ATTO590 dye-TGGTTAAACTTTTTGCCTTA-3' SERS spectrum of 5'-ATTO647 dye-TCACAAACAGATAATGGCGT-3', and 5'-cy5 dye-GGAT TTTCGACAGGATATTA-3', 5'-ATTO590 dye-TGGTTAAACTTTTTGCCTTA-3', 5'-ATTO647 dye-TCACAAACAGATAATGGCGT-3') is shown.
8 is a comparison of the sensitivities of fluorescence-based detection and SERS-based detection. (A) shows the analysis technique of fluorescence and SERS, (B) shows the fluorescence intensity and image of the MMP hybridized with the signal probe, and the fluorescence intensity of the emitted signal probe, (C) shows the target DNA concentration It shows the SERS spectrum of the emitted signal probe, (D) shows the SERS intensity of the Raman shift (Raman shift) selected from the spectrum (C). At this time, the scale bar is 5 μm.
9 shows a multiplex diagnostic analysis of fluorescence-based and SERS-based detection for a single target DNA. (A) shows overall multiplex diagnostic assays including fluorescence-based and SERS-based detection of single targets (E.coli, E.faecalis, and S.aureus ), (B) single signal probes (
Figure 10 shows E. faecalis target DNA at various target concentrations (10 -9 M, 10 -10 M, 10 -11 M, 10 -12 M, 10 -13 M, 10 -14 M, no target). It is the result of repeated measurement of the Raman spectrum obtained from three independent analyzes. (A) is 1 st attempt, (B) is 2 nd attempt, (C) shows a 3 rd attempt. (D) shows the intensity of the Raman shift (Raman shift (1333.29, 1520.53, and 1640.75 cm -1 )) selected from the three independent analyzes.
11 shows a multiplex diagnostic analysis for a plurality of target DNAs. (A) shows the overall multiplex diagnostic analysis of multiple target DNAs, (B) shows the fluorescence intensity and images of beads hybridized with multiple signal probes, (C) shows the fluorescence of multiple emitted signal probes Intensity is shown, and (D) shows SERS spectra of multiple target DNAs. At this time, the scale bar is 5 μm.
12 relates to the detection of E. coli genomic DNA. (A) shows the experimental procedure for detecting E. coli genomic DNA by fluorescence and SERS-based methods, (B) shows the fluorescence intensity of the signal probe and the bead hybridized with the emitted signal probe, (C) shows the SERS spectrum according to the concentration of E. coli genomic DNA (30 pM ~ 30 fM).
본 발명자들은 바이오물질 다중 검출방법에 대해 예의 연구한 결과, 캡처 프로브로 개질된 자성 마이크로입자와 금속 나노입자를 포함하는 검출방법의 높은 민감도 및 다중진단능력을 확인하여 본 발명을 완성하였다.The present inventors have completed the present invention by confirming the high sensitivity and multi-diagnostic capability of a detection method including magnetic microparticles and metal nanoparticles modified with a capture probe as a result of intensive research on a method for detecting multiple biomaterials.
본 발명에서 용어, “바이오물질(bio materials)”이란, 특정 기질을 나타내는 생체 분자로서, 타겟 분자(target molecules), 또는 애널라이트(analytes)와 동일한 의미로 해석될 수 있다. 상기 생체 분자는 단백질, 세포, 바이러스, 핵산, 유기 분자 또는 무기 분자일 수 있다. 상기 단백질의 경우, 항원, 항체, 기질 단백질, 효소, 조효소 등 어떠한 바이오 물질이라도 가능하며, 상기 핵산의 경우, DNA(gDNA 및 cDNA), RNA, PNA, LNA 또는 이들의 조합일 수 있으며, 핵산 분자에서 기본 구성 단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체(analogue)도 포함한다. 상기 바이오물질은 바람직하게는 박테리아, 바이러스, 곰팡이균, 진균, 또는 이들의 조합을 포함하는 것일 수 있다.As used herein, the term “biomaterials” refers to biomolecules representing a specific substrate, and may be interpreted as having the same meaning as target molecules or analytes. The biomolecule may be a protein, a cell, a virus, a nucleic acid, an organic molecule, or an inorganic molecule. In the case of the protein, any biomaterial such as an antigen, antibody, substrate protein, enzyme, coenzyme, etc. is possible. In the case of the nucleic acid, it may be DNA (gDNA and cDNA), RNA, PNA, LNA, or a combination thereof, and a nucleic acid molecule The nucleotide, which is the basic structural unit in , includes not only natural nucleotides, but also analogs in which sugar or base regions are modified. The biomaterial may preferably include bacteria, viruses, fungi, fungi, or a combination thereof.
본 발명에서 용어, “타겟 서열(target sequence)”은 검출하고자 하는 상기 바이오물질에 특이적인 특정 핵산 서열로 나타낸 것이다.As used herein, the term “target sequence” refers to a specific nucleic acid sequence specific to the biomaterial to be detected.
본 발명에서 용어, "프로브(probe)"는 상기 타겟 서열에 특이적으로 결합할 수 있는 수개 내지 수백개의 염기로 이루어진 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며 라벨링되어 있어 상기 타겟 서열의 존재유무를 확인할 수 있다. 프로브는 올리고뉴클레오타이드 프로브, 단쇄 DNA 프로브, 이중쇄 DNA 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다.As used herein, the term "probe" refers to a nucleic acid fragment such as RNA or DNA consisting of several to hundreds of bases capable of specifically binding to the target sequence, and is labeled to determine the presence or absence of the target sequence. can be checked The probe may be manufactured in the form of an oligonucleotide probe, a single-stranded DNA probe, a double-stranded DNA probe, an RNA probe, or the like.
본 발명에서 용어, “타겟 캡쳐 프로브(capture probe)”는 상기 바이오물질의 특정 영역을 인식하고 그에 특이적으로 결합할 수 있는 분자적 성질의 화학적 또는 생물학적 제제를 의미한다.As used herein, the term “target capture probe” refers to a chemical or biological agent having molecular properties capable of recognizing a specific region of the biomaterial and specifically binding thereto.
본 발명에서 용어, "신호 프로브(signal probe)"는 상기 타겟 서열에 반상보적(half-complementary)인 서열을 포함하는 프로브로서, 상기 신호 프로브가 그의 타겟 서열에 결합된 경우, 검출가능한 신호를 생성할 수 있으며, 상기 신호 프로브가 그의 타겟 서열에 결합되지 않은 경우, 신호를 전혀 또는 거의 생성하지 않거나 상이한 신호를 생성할 수 있다. 일례로, 신호 프로브는 형광물질 및 퀀처 부분을 포함하는 형광 발생 또는 형광 프로브이며, 타겟 서열과 혼성화하는 경우 형광 변화가 일어난다.As used herein, the term "signal probe" refers to a probe comprising a sequence that is half-complementary to the target sequence. When the signal probe is bound to its target sequence, a detectable signal is detected. and, when the signal probe is not bound to its target sequence, it may generate no or little or a different signal. For example, the signal probe is a fluorescence-generating or fluorescent probe including a fluorescent substance and a quencher moiety, and when hybridized with a target sequence, a fluorescence change occurs.
상기 형광물질은 ATTO 계열 염료, 시아닌(Cyanine) 계열 염료, FAM(6-carboxyfluorescein), 텍사스 레드(texas red), 플루 오레신(fluorescein), HEX(2',4',5',7'-tetrachloro-6-carboxy-4,7- dichlorofluorescein), 플루오레신 클로로트리아지닐(fluorescein chlorotriazinyl), 로다민 그린(rhodamine green), 로다민 레드(rhodamine red), 테트라메틸 로다민(tetramethyl rhodamine), FITC(fluorescein isothiocyanate), 오레곤 그린(oregon green), 알렉사 플루오로(alexa fluor), JOE(6-Carboxy-4',5'-Dichloro-2',7'-Dimethoxyfluorescein), ROX(6-Carboxyl-XRhodamine), TET(Tetrachloro-Fluorescein), TRITC(tertramethylrodamine isothiocyanate), TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), NED(N-(1-Naphthyl) ethylenediamine), 및 씨아디카르보시아닌(thiadicarbocyanine)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.The fluorescent material is an ATTO-based dye, a cyanine-based dye, FAM (6-carboxyfluorescein), Texas red (texas red), fluorescein, HEX (2',4',5',7'-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), fluorescein fluorescein chlorotriazinyl, rhodamine green, rhodamine red, tetramethyl rhodamine, fluorescein isothiocyanate (FITC), oregon green, Alexa Fluoro (alexa fluor), JOE (6-Carboxy-4',5'-Dichloro-2',7'-Dimethoxyfluorescein), ROX (6-Carboxyl-XRhodamine), TET (Tetrachloro-Fluorescein), TRITC (tertramethylrodamine isothiocyanate), It may be any one or more selected from the group consisting of TAMRA (6-carboxytetramethyl-rhodamine), NED (N-(1-Naphthyl) ethylenediamine), and thiadicarbocyanine, but is not limited thereto.
본 발명에서 용어, "혼성화(hybridization)"는 상보적인 단일가닥 핵산들이 이중 가닥 핵산을 형성하는 것을 의미한다. 혼성화는 2개의 핵산 가닥 간의 상보성이 완전할 경우(perfect match; 정합) 일어나거나 또는 일부 부정합(mismatch) 염기가 존재하여도 일어날 수 있다. 혼성화에 필요한 상보성 정도는 혼성화 조건에 따라 달라질 수 있다.As used herein, the term “hybridization” means that complementary single-stranded nucleic acids form double-stranded nucleic acids. Hybridization may occur when the complementarity between two nucleic acid strands is perfect (perfect match) or may occur even in the presence of some mismatched bases. The degree of complementarity required for hybridization may vary depending on hybridization conditions.
본 발명에서 용어, “금속 나노 입자”는 금속으로 이루어진 나노 크기의 입자를 의미한다. 상기 금속은 금, 은, 구리 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 반드시 이로 제한되는 것은 아니며, 이 기술분야에서 널리 사용되고 있는 금속은 어느 것이나 제한없이 사용될 수 있다. 상기 금속 나노 입자의 직경은 0.1 nm 이상 1000 nm 이하의 크기일 수 있으며, 바람직하게는 금 나노 입자(gold nano particle, AuNP)일 수 있다. 상기 금 나노 입자는 제조가 가능하고 입자의 크기 조절이 용이하며 생체안정성이 높고 세포독성도가 낮은 장점을 갖는다.As used herein, the term “metal nanoparticles” refers to nano-sized particles made of metal. The metal may be selected from the group consisting of gold, silver, copper, and mixtures thereof, but is not necessarily limited thereto, and any metal widely used in the art may be used without limitation. The diameter of the metal nanoparticles may be 0.1 nm or more and 1000 nm or less, and preferably gold nanoparticles (AuNP). The gold nanoparticles can be manufactured, and the size of the particles can be easily controlled, and have advantages of high biostability and low cytotoxicity.
본 발명에서 용어, "라만 산란(Raman scattering)"은 빛이 어떤 매질을 통과할 때 빛의 파장을 변화시켜 빛의 일부가 진행 방향에서 이탈해 다른 방향으로 진행하는 현상을 의미한다. 본 발명에서 용어, "라만 분광법"은 시료에 단파장의 레이저를 조사하여 산란된 빛을 검출하여 분자 수준의 정보를 얻어내는 유용한 분광법으로, 기존의 적외선(Infrared) 분광법에서 얻을 수 있는 정보와 서로 상보적인 화학구조 정보를 얻을 수 있는 방법으로 생화학/화학/소재 분야에 광범위하게 사용되고 있으며, 적외선 분광법에 비해 시료 측정이 매우 간단하다. 라만 분광법은 분자들의 진동 상태(vibrational state)에 대한 정보를 제공한다. 대부분의 경우, 흡수된 광선(radiation)이 동일한 파장에서 재-방사(re-radiated)되는데, 이를 레일레이 산란(Rayleigh scattering) 또는 탄성 산란(elastic scattering)의 과정이라고 한다. 이때, 재-방사된 광선간의 에너지 차이는 이들 간의 파장에서의 이동(shift)으로 나타나고 이러한 차이의 정도는 파수(파장의 역수)의 단위로서 측정되어 라만 이동(Raman shift)으로 표현된다. 만일 투사 광선이 단파장이고 레이저를 그 소스로 이용하는 경우, 주파수 상에 차이를 가지는 산란된 광선(빛)은 레일레이 산란된 광선(빛)과 좀 더 용이하게 구별될 수 있다. 즉, 라만 쉬프트는 분자의 진동 주파수에 해당한다. 따라서, 라만 분광법은 적외선 분광법과 같이 분자의 진동 형태, 회전상태에 대한 정보를 얻기 위해 사용되지만 적외선 분광법에서와는 다른 메커니즘과 선택 규칙에 근거하며 측정방법도 다르다.As used herein, the term "Raman scattering" refers to a phenomenon in which a part of light deviates from a traveling direction and proceeds in another direction by changing the wavelength of light when light passes through a certain medium. As used herein, the term "Raman spectroscopy" is a useful spectroscopy method that obtains molecular level information by irradiating a short-wavelength laser to a sample to detect scattered light. It is widely used in the field of biochemistry/chemistry/materials as a method to obtain chemical structure information, and sample measurement is very simple compared to infrared spectroscopy. Raman spectroscopy provides information about the vibrational state of molecules. In most cases, absorbed radiation is re-radiated at the same wavelength, a process called Rayleigh scattering or elastic scattering. At this time, the energy difference between the re-radiated light rays appears as a shift in the wavelength between them, and the degree of this difference is measured as a unit of the wavenumber (the reciprocal of the wavelength) and expressed as a Raman shift. If the projected light has a short wavelength and uses a laser as its source, the scattered light (light) having a difference in frequency can be more easily distinguished from the Rayleigh scattered light (light). That is, the Raman shift corresponds to the vibration frequency of the molecule. Therefore, Raman spectroscopy is used to obtain information on the vibrational form and rotational state of molecules like infrared spectroscopy, but it is based on a different mechanism and selection rule than in infrared spectroscopy, and the measurement method is also different.
본 발명의 일 구체예로서, 표면-증강 라만 산란(surface-enhanced Raman scattering, SERS) 신호를 측정하는 단계를 포함하는 세균 감염성 질환을 진단하기 위한 정보제공방법을 제공한다. 상기 단계에서는, 프로브의 말단에 결합된 형광물질 또는 라만 활성 물질만을 분리하여 라만 신호를 측정할 수 있다. 이 때, 조사되는 빛의 파장은 400 ㎝-1 내지 800 ㎝-1 영역일 수 있다. 예를 들어, 상기 빛의 파장은 400 ㎝-1 내지 800 ㎝-1, 420 ㎝-1 내지 800 ㎝-1, 450 ㎝-1 내지 800 ㎝-1, 480 ㎝-1 내지 790 ㎝-1, 또는 488 ㎝-1 내지 785 ㎝-1 일 수 있다. 또한, 상기 빛의 파장은 514 ㎚ 파장을 갖는 Ar+ 레이저, 633 ㎚ 파장을 갖는 He-Ne 레이저 또는 785 ㎚ 파장을 갖는 다이오드 레이저일 수 있다. 즉, 라만 신호로부터 특정 피크가 관찰되면 개체가 세균 감염성 질환을 가지고 있는 것으로 판단할 수 있으며, 상기 세균 감염성 질환은 패혈증, 부비동염, 폐렴, 식중독, 이질, 결핵, 녹농균 감염, 농가진, 화농성 질환, 급성 피부염, 균혈증, 심내막염, 장염, 골관절염, 골수염, 요로감염, 뇌염, 뇌막염, 또는 신장염일 수 있다. 상기와 같은 방법을 통하여 타겟 서열을 검출할 수 있으며, 정량적인 검출도 가능하다.As an embodiment of the present invention, there is provided an information providing method for diagnosing bacterial infectious diseases, including measuring a surface-enhanced Raman scattering (SERS) signal. In the above step, the Raman signal may be measured by separating only the fluorescent material or the Raman active material bound to the end of the probe. In this case, the wavelength of the irradiated light may be in the range of 400 cm -1 to 800 cm -1. For example, the wavelength of the light is 400 cm -1 to 800 cm -1 , 420 cm -1 to 800 cm -1 , 450 cm -1 to 800 cm -1 , 480 cm -1 to 790 cm -1 , or It may be 488 cm -1 to 785 cm -1 . In addition, the wavelength of the light may be an Ar + laser having a wavelength of 514 nm, a He-Ne laser having a wavelength of 633 nm, or a diode laser having a wavelength of 785 nm. That is, when a specific peak is observed from the Raman signal, it can be determined that the individual has a bacterial infectious disease, and the bacterial infectious disease is sepsis, sinusitis, pneumonia, food poisoning, dysentery, tuberculosis, Pseudomonas aeruginosa infection, impetigo, purulent disease, acute dermatitis, bacteremia, endocarditis, enteritis, osteoarthritis, osteomyelitis, urinary tract infection, encephalitis, meningitis, or nephritis. The target sequence can be detected through the above method, and quantitative detection is also possible.
본 발명에서 "진단"이란 특정 질병 또는 질환에 대한 한 개체의 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 한 개체가 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는지 여부를 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환에 걸린 한 개체의 예후(prognosis)를 판정하는 것, 또는 테라메트릭스(therametrics)(예컨대, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 개체의 상태를 모니터링하는 것)을 포함한다.In the present invention, "diagnosis" means determining the susceptibility of an individual to a specific disease or disorder, determining whether an individual currently has a specific disease or disorder, or an individual suffering from a specific disease or disorder determining the prognosis of, or therametrics (eg, monitoring a subject's condition to provide information about treatment efficacy).
본 발명에서 용어, “다중(multiplexing) 검출 또는 진단”이란, 1개 또는 그 이상 종류의 바이오물질을 동시에 검출하는 것을 의미한다.As used herein, the term “multiplexing detection or diagnosis” refers to the simultaneous detection of one or more types of biomaterials.
본 발명은 다양한 변환을 가할 수 있고 여러 가지 실시예를 가질 수 있는 바, 이하 특정 실시예들을 도면에 예시하고 상세한 설명에 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변환, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.The present invention can apply various transformations and can have various embodiments. Hereinafter, specific embodiments are illustrated in the drawings and described in detail in the detailed description. However, this is not intended to limit the present invention to specific embodiments, and it should be understood to include all modifications, equivalents, and substitutes included in the spirit and scope of the present invention. In describing the present invention, if it is determined that a detailed description of a related known technology may obscure the gist of the present invention, the detailed description thereof will be omitted.
실시예 1. 재료, 기기 및 DNA 정보Example 1. Materials, Devices and DNA Information
모든 올리고뉴클레오타이드는 Integrated DNA Technologies (IDT Inc., Coralville, IA, USA)에서 구매했다. Dynabeads (M-270 carboxylic acid)는 BBI Solutions invitrogen (Madison, Waltham, Massachusetts WI, USA)에서 수득했다. N-(3-dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide hydrochloride (EDC), 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES) hydrate, Ethanolamine, sodium dodecyl sulfate (SDS), Gold(Ⅲ) chloride trihydrate (HAuCl4 ·3H2O), cysteamine, 및 sodium borohydride (NaBH4)는 Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA)에서 수득했다. Sodium phosphate monobasic dihydrate (NaH2PO4), sodium phosphate dibasic anhydrate (Na2HPO4) 및 sodium chloride (NaCl)은 DAEJUNG (Siheung, South Korea)에서 수득했다. Escherichia coli (KCCM 11234)는 Korean Culture Centre of Microorganisms (KCCM, Daejeon, South Korea)에서 수득했다. 상기 E. coli는 tryptic soy broth (Difco, Detroit, MI)에서 증식했다. 상기 E. coli 유전체 DNA는 DNA purification kit 및 automated instrument (MX-8L Apintech, Seoul)로부터 추출하였다.All oligonucleotides were purchased from Integrated DNA Technologies (IDT Inc., Coralville, IA, USA). Dynabeads (M-270 carboxylic acid) were obtained from BBI Solutions invitrogen (Madison, Waltham, Massachusetts WI, USA). N- (3-dimethylaminopropyl) -N'- ethylcarbodiimide hydrochloride (EDC), 2- (N-morpholino) ethanesulfonic acid (MES) hydrate, Ethanolamine, sodium dodecyl sulfate (SDS), Gold (Ⅲ) chloride trihydrate (
소멸 스펙트럼(Extinction spectra)은 Ultraviolet-visible (UV-Vis) spectrometer (SCINCO, South Korea)로 수득하였다. 투과형 전자 현미경(transmission electron microscope, TEM) (H-7100, Hitachi, Tokyo, Japan)은 나노분자를 특성화하는데 사용하였다. 명시야(bright field) 및 형광 이미지(fluorescence images)는 Х 20 air objective 및 Х 100 oil immersion lens objective (N.A. 1.3)를 갖춘 현미경(Olympus, DP80, Tokyo, Japan) 및 EzScan (NOST, South Korea) software를 이용하여 기록하였다. Cytation 3 Cell Imaging Multi-Mode Reader (BioTek Inc, Winooski, USA)은 형광 강도를 측정하기 위해 사용하였다. MX-8L nucleic acid extractor (Apintech, Seoul)를 사용하여 DNA 추출(DNA extraction)을 수행하였다.Extinction spectra were obtained with an Ultraviolet-visible (UV-Vis) spectrometer (SCINCO, South Korea). A transmission electron microscope (TEM) (H-7100, Hitachi, Tokyo, Japan) was used to characterize the nanoparticles. Bright field and fluorescence images were obtained under a microscope (Olympus, DP80, Tokyo, Japan) with a Х 20 air objective and
세균 특이적 프로브 서열을 고안하기 위해, 본 발명자들은 E. coli, E. faecalis, 및 S. aureus의 타겟 서열(40 bp)을 선별하였다. 세균 서열은 NCBI database (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)에서 수득하였고, 서열 정렬(gene alignment)는 Mega 5 program을 사용하여 수동으로 수행하였다. 프라이머 특이성에 대한 실리코 테스트(silico tests)는 NCBI BLAST tool (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)을 이용하여 수행하였다. 상기 타겟 서열은 하기 표 1과 같다.To design a bacterial-specific probe sequence, the present inventors selected target sequences (40 bp) of E. coli , E. faecalis , and S. aureus. Bacterial sequences were obtained from the NCBI database (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/), and gene alignment was performed manually using
타겟 서열 E. coli
target sequence
타겟 서열 E. faecalis
target sequence
타겟 서열 S. aureus
target sequence
상기 타겟 서열과 반상보적인 타겟 캡쳐 프로브(capture probe) 서열은 서열의 3' 말단에 아민기, A10 스페이서, 및 짧은 폴리에틸렌 기로 개질되었다. 상기 타겟 캡쳐 프로브는 하기 표 2와 같다.The target capture probe sequence semi-complementary to the target sequence was modified with an amine group, an A10 spacer, and a short polyethylene group at the 3' end of the sequence. The target capture probes are shown in Table 2 below.
캡쳐 프로브 E. coli
capture probe
캡쳐 프로브 E. faecalis
capture probe
캡쳐 프로브 S. aureus
capture probe
형광 기반 검출을 위해, 하기 표 3에 기재한 신호 프로브 서열을 사용하였다. 또한, Cy5 개질된 E. coli 신호 프로브(5'-Cy5 dye-GGATTTTCGACAGGATATTA-3', 서열번호 10)를 추출된 유전체 DNA의 형광 기반 검출에 사용하였고, Cy5로 개질된 E. faecalis 신호 프로브 (5'-Cy5 dye-GTGCCAATGATCTTCGCTCG-3', 서열번호 11)를 MMP에 개질할 캡쳐 프로브의 수를 정량화하기 위해 사용하였다. For fluorescence-based detection, the signal probe sequences shown in Table 3 below were used. In addition, a Cy5-modified E. coli signal probe (5'-Cy5 dye-GGATTTTCGACAGGATATTA-3', SEQ ID NO: 10) was used for fluorescence-based detection of the extracted genomic DNA, and a Cy5-modified E. faecalis signal probe (5 '-Cy5 dye-GTGCCAATGATCTTCGCTCG-3', SEQ ID NO: 11) was used to quantify the number of capture probes to be modified in MMP.
신호 프로브 E. coli
signal probe
신호 프로브 E. faecalis
signal probe
신호 프로브 S. aureus
signal probe
SERS 기반 검출을 위해, ATTO488로 개질된 E. coli 신호 프로브를 Cy5로 대체하였다. 이는 ATTO488가 ATTO590 및 ATTO647에 비해 낮은 SERS 강도를 가져 SERS 기반 검출에 부적합한 것으로 고려되기 때문이다. 따라서, E. coli 신호 프로브는 5'-cy5 dye-GGATTTTCGACAGGATATTA-3'(서열번호 10)이고, E. faecalis 및 S. aureus의 신호 프로브는 형광 기반 분석의 신호 프로브와 동일하게 사용하였다. For SERS-based detection, the ATTO488-modified E. coli signal probe was replaced with Cy5. This is because ATTO488 has a lower SERS intensity compared to ATTO590 and ATTO647, which is considered unsuitable for SERS-based detection. Therefore, the E. coli signal probe was 5'-cy5 dye-GGATTTTCGACAGGATATTA-3' (SEQ ID NO: 10), and the E. faecalis and S. aureus signal probes were used in the same way as the signal probes of the fluorescence-based assay.
실시예 2. 타겟 캡쳐 프로브(capture probes)로 개질된 MMPs의 제작Example 2. Construction of MMPs modified with target capture probes
타겟 캡쳐 프로브로 개질된 MMP를 EDC 커플링 방법을 이용하여 제작하였다. 먼저 100 μL의 carboxylic acid-modified dynabeads (MMPs) (30 mg/mL)를 100 μL의 25 mM MES buffer를 10 분 동안 첨가하여 세척하였다. 자기장을 2 분간 걸어주어 상기 MMP를 분산시키고 상층액을 제거하였다. 상기 단계를 2 - 3 번 반복하였다. 아민으로 개질한 DNA 올리고뉴클레오타이드 (E. faecalis 캡쳐 프로브, 10-4 M, 60 μL)를 MMP 용액 (30 mg/ml, 100 μL)에 첨가하였다. 상온에서 30 분동안 느린 기울기 회전으로 배양한 후, EDC (100 mM in MES buffer, 30 μL) 용액을 MMP 용액에 첨가하고, 느린 기울기 회전으로 밤새 배양하였다. 이후, PBS, pH 8.0에서 60 분간 느린 기울기 회전으로 상온에서 50 mM ethanolamine 로 세척하였다. 상기 세척 단계는 PBS로 4 번 반복하였다. 이후, 타겟 캡쳐 프로브로 개질된 MMPs를 증류수(10 mL)에 재분산하고, MMP에 있는 타겟 캡쳐 프로브의 양을 형광계로 측정하였다(도 3).MMPs modified with target capture probes were fabricated using the EDC coupling method. First, 100 μL of carboxylic acid-modified dynabeads (MMPs) (30 mg/mL) was washed by adding 100 μL of 25 mM MES buffer for 10 minutes. The MMP was dispersed by applying a magnetic field for 2 minutes, and the supernatant was removed. This step was repeated 2-3 times. An amine-modified DNA oligonucleotide ( E. faecalis capture probe, 10 -4 M, 60 μL) was added to the MMP solution (30 mg/ml, 100 μL). After incubation at room temperature for 30 minutes with a slow gradient rotation, an EDC (100 mM in MES buffer, 30 μL) solution was added to the MMP solution, and incubated overnight with a slow gradient rotation. Then, it was washed with 50 mM ethanolamine at room temperature with slow gradient rotation in PBS, pH 8.0 for 60 minutes. The washing step was repeated 4 times with PBS. Then, the MMPs modified with the target capture probe were redispersed in distilled water (10 mL), and the amount of the target capture probe in the MMP was measured with a fluorometer (FIG. 3).
실시예 3. 금 나노입자(AuNP)로 개질된 시스테아민(cysteamine) 합성Example 3. Synthesis of cysteamine modified with gold nanoparticles (AuNP)
AuNP로 개질된 시스테아민(Cys-AuNPs)을 제조하기 위해, 200 mL의 HAuCl4·3H2O 용액(111.5 mg/200 mL의 증류수, 1.42 mM)를 2 mL의 시스테아민 용액 (164 mg/10 mL의 증류수, 213 mM)에 첨가하였다. 이 때, 용액의 색은 노랑에서 오렌지색으로 변화하였다. 충분히 혼합한 후, 상기 용액을 50 μL NaBH4 용액(37.8 mg/10 mL의 증류수, 10 mM)에 첨가하고, 밤새 혼합하였다. 이 때, 용액의 색은 오렌지색에서 붉은 와인색으로 변화하였다. 이후, 상기 용액을 1,800 rpm에서 15 분간 원심분리하였다. UV-Vis 소멸 스펙트럼은 530 nm에서 기록하였다. TEM을 이용하여 Cys-AuNPs의 직경을 측정한 결과, 30.6 nm ± 4.1 nm이었다(도 4).To prepare AuNP-modified cysteamine (Cys-AuNPs), 200 mL of HAuCl 4 3H 2 O solution (111.5 mg/200 mL of distilled water, 1.42 mM) was mixed with 2 mL of cysteamine solution (164 mg /10 mL of distilled water, 213 mM). At this time, the color of the solution changed from yellow to orange. After sufficient mixing, the solution was added to 50 μL NaBH 4 solution (37.8 mg/10 mL of distilled water, 10 mM) and mixed overnight. At this time, the color of the solution changed from orange to red wine. Then, the solution was centrifuged at 1800 rpm for 15 minutes. UV-Vis extinction spectra were recorded at 530 nm. As a result of measuring the diameter of Cys-AuNPs using TEM, it was 30.6 nm ± 4.1 nm (FIG. 4).
실시예 4. Example 4. E. coliE. coli 유전체 DNA 추출 Genomic DNA Extraction
E. coli를 tryptic soy broth (Difco, Detroit, MI)에 증식시키고, 37 °C에서 배양하였다. E. coli가 생장 곡선의 정지기(stationary phase)에 도달한 때, 6000 rpm에서 10 분간 원심분리하였다. 침전물을 sterile saline에서 재분산하고, 농축하였다. 상기 농축된 E. coli 유전체 DNA를 bead beating을 사용하는 MX-8L cell-free DNA purification kit를 이용하여 추출하였다. 상기 DNA는 고농도의 guanidinium thiocyanate 존재 하에서 silica bead에 강하게 결합하였고, 잔여물은 컬럼에 남았으며, 다른 바이오물질(단백질, RNA 등)은 결합하지 못하므로, 유전체 DNA만 분리되었다. 상기 추출된 유전체 DNA에서 beads를 제거하기 위해 12,000 rpm에서 3 분간 원심분리하였다. E. coli 유전체 DNA의 몰농도는 260 nm 흡광도에서 측정하였으며, Beer-Lambert의 법칙을 적용하여 계산하였다. E. coli 유전체 DNA의 몰 추출 계수 (molar extinction coefficient) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/?term=E.coli) 는 8.36 Х 1010/mol-1cm-1였다. 예를 들어, E. coli 유전체 DNA 용액이 100 번 희석되어, 흡광도가 0.84인 경우, 유전체 DNA의 몰농도는 1 nM이다. Beer-Lambert 법칙이 아닌 empirical rule을 사용하여 계산한 E. coli 유전체 DNA의 몰농도는 1.32 nM이었다. 상기 두 계산법을 적용하여 계산한 몰 농도에는 거의 차이가 없었다. 따라서, Beer-Lambert 법칙을 적용하여 E. coli 유전체 DNA의 몰농도를 계산하였다(도 5). E. coli was grown in tryptic soy broth (Difco, Detroit, MI) and incubated at 37 °C. When E. coli reached the stationary phase of the growth curve, it was centrifuged at 6000 rpm for 10 minutes. The precipitate was redispersed in sterile saline and concentrated. The concentrated E. coli genomic DNA was extracted using the MX-8L cell-free DNA purification kit using bead beating. The DNA was strongly bound to the silica bead in the presence of a high concentration of guanidinium thiocyanate, and the residue remained on the column. Since other biomaterials (protein, RNA, etc.) were not bound, only genomic DNA was isolated. To remove beads from the extracted genomic DNA, centrifugation was performed at 12,000 rpm for 3 minutes. The molar concentration of E. coli genomic DNA was measured at absorbance at 260 nm and calculated by applying Beer-Lambert's law. The molar extinction coefficient (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/?term=E.coli) of E. coli genomic DNA is 8.36 Х 10 10 /mol -1 cm -1 it was For example, when an E. coli genomic DNA solution is diluted 100 times and the absorbance is 0.84, the molar concentration of the genomic DNA is 1 nM. The molar concentration of E. coli genomic DNA calculated using the empirical rule, not the Beer-Lambert rule, was 1.32 nM. There was little difference in the molar concentrations calculated by applying the above two calculation methods. Therefore, the molar concentration of E. coli genomic DNA was calculated by applying the Beer-Lambert law (FIG. 5).
실시예 5. 형광 측정 조건Example 5. Fluorescence measurement conditions
신호 프로브와 혼성화한 MMP의 형광 이미지를 GFP, TRITC, 및 Cy5 filters를 포함한 현미경을 이용하여 각각 수득하였다. MMP의 ATTO 488, ATTO 590, 및 ATTO 647 신호는 0.5 초, 0.25 초, 및 2 초동안 노출된 GFP filter (518-559 nm), TRITC filter (572-638 nm), 및 Cy5 filter (665-715 nm)로 검출하였다. 신호 프로브 용액으로부터 형광 강도를 측정하기 위해, 상기 용액을 특정 파장(500 nm (ATTO 488), 610 nm (ATTO 590), and 650 nm (ATTO 647))으로 들뜨게 하고, 각각 530 nm, 640 nm, 및 680 nm의 파장에서 강도를 기록하였다(도 6). Fluorescence images of MMP hybridized with a signal probe were obtained using a microscope including GFP, TRITC, and Cy5 filters, respectively. The
실시예 6. SERS 측정 조건Example 6. SERS measurement conditions
SERS 스펙트럼은 × 60 objective (N.A. 0.7) (Olympus, Tokyo, Japan)의 도립 라만 현미경(inverted Raman microscope (NOST, South Korea))을 이용하여 수집하였고, 633 nm 레이저 (6.7 mW, 1 초의 노출 시간)를 조사한 용액으로부터 수득하였다. 분산된 라만 신호는 분광계(FEX-MD, NOST, South Korea) (1200 g nm-1 grating)로 향하여, 최종적으로 spectroscopy charge-coupled device (CCD) camera (Andor (DV401A-DVF), Belfast, North Ireland)에 도달하는 confocal motorized pinhole (100 um)로 검출하였다. RAON Scan (NOST, South Korea) software가 라만 스펙트럼을 수득하는데 사용되었다.SERS spectra were collected using an inverted Raman microscope (NOST, South Korea) with a × 60 objective (NA 0.7) (Olympus, Tokyo, Japan) and a 633 nm laser (6.7 mW, exposure time of 1 sec.) was obtained from the irradiated solution. The dispersed Raman signal is directed to a spectrometer (FEX-MD, NOST, South Korea) (1200 g nm -1 grating), and finally a spectroscopy charge-coupled device (CCD) camera (Andor (DV401A-DVF), Belfast, North Ireland) ) was detected with a confocal motorized pinhole (100 um) reaching the RAON Scan (NOST, South Korea) software was used to acquire Raman spectra.
각 SERS 스펙트럼을 위해, MMP(100 μL)로부터 방출된 신호 프로브 용액을 100 μL의 AuNP(OD 1.0)로 개질된 시스테아민과 5 분간 부드럽게 흔들며 혼합하고, 상기 용액을 1,800 rpm에서 15 분간 원심분리하였다. 침전물을 포함하는 상기 원심분리한 용액을 라만 분석을 위해 커버 글라스(cover glass)의 well silicone isolator (2 mm diameter)에 옮겼다. For each SERS spectrum, the signal probe solution emitted from the MMP (100 μL) was mixed with 100 μL of cysteamine modified with AuNPs (OD 1.0) for 5 min with gentle shaking, and the solution was centrifuged at 1,800 rpm for 15 min. did. The centrifuged solution containing the precipitate was transferred to a well silicone isolator (2 mm diameter) of a cover glass for Raman analysis.
Cy5, ATTO 488, ATTO 590, 및 ATTO 647의 주요 SERS 피크는 순수 또는 혼합된 상태(ATTO 488, ATTO 590, ATTO 647 또는 Cy5, ATTO 590, ATTO 647)에서 수득하였다. 라만 스펙트럼은 민감도 또는 다중진단능력 관점에서 비교하였다. Cy5의 주요 라만 산란 피크는 1187.08, 1359.22, 1465.1, 및 1594.19 cm-1에서 선별되었다. ATTO 590의 주요 라만 산란 피크는 1333.29, 1520.53, 및 1640.75 cm-1에서 선별되었다. ATTO 647의 주요 라만 산란 피크는 1423.6, 및 1626.82 cm-1에서 선별되었다(도 7).The main SERS peaks of Cy5,
실험결과 1. 세균 타겟 DNA 검출을 위한 MMP 기반 분석 디자인
핵산 검출을 위한 자성 마이크로입자(Magnetic microbead, MMP) 기반 분석은 다양한 방면에서 유용하고 간단한 방법이다. MMP는 초상자성으로 혼합 용액에서 자유롭게 분산될 수 있어 효율적으로 타겟 DNA와 혼성화할 수 있고, 외부 자기장을 걸어줌으로써 빠르게 분산될 수 있다. 본 발명에서는 상술한 MMP의 장점을 활용하여, 도 1에 도시한 바와 같이 MMP 기반 핵산 타겟 검출 방법을 고안하였다.Magnetic microbead (MMP)-based assays for nucleic acid detection are useful and simple methods in various fields. MMPs can be freely dispersed in a mixed solution due to their superparamagnetism, so they can be efficiently hybridized with target DNA, and can be rapidly dispersed by applying an external magnetic field. In the present invention, by utilizing the advantages of the above-described MMP, as shown in FIG. 1 , an MMP-based nucleic acid target detection method was devised.
먼저, MMP를 타겟 DNA 서열과 반상보적인 타겟 캡쳐 프로브로 개질하였다. MMP는 타겟 서열 및, 타겟 서열과 반상보적인 (형광이 태그된) 신호 프로브 서열과 혼성화할 수 있다. MMP의 형광 강도는 쉽게 측정될 수 있으며, 형광 강도는 분석물의 타겟 DNA 양과 연관되어 있다. 형광 신호 강도는 MMP 용액의 농도를 95 oC (> Tm)로 높임으로써 방출된 신호 프로브로 측정할 수 있다. 또한, 형광 프로브를 AuNP로 개질된 시스테아민(Cys-AuNPs)과 혼합함으로써 방출된 신호 프로브에서 형광 분자의 SERS 신호를 측정함으로써 SERS-기반 검출도 가능하다. 상기 방법으로, 본 발명은 bead에서 형광, 용액에서 형광, 및 SERS 강도와 같은 형태에 따른 분석 능력을 엄밀히 비교하였다. 또한, 최적화된 분석 플랫폼은 간단한 핵산 검출 전략을 위해 활용될 것이다.First, the MMP was modified with a target capture probe semi-complementary to the target DNA sequence. MMPs can hybridize to a target sequence and a signal probe sequence that is semi-complementary to the target sequence (fluorescence-tagged). The fluorescence intensity of MMPs can be easily measured, and the fluorescence intensity is correlated with the amount of target DNA of the analyte. The fluorescence signal intensity can be measured with the emitted signal probe by raising the concentration of the MMP solution to 95 ° C (>T m ). In addition, SERS-based detection is also possible by measuring the SERS signal of fluorescent molecules in the emitted signal probe by mixing the fluorescent probe with AuNP-modified cysteamine (Cys-AuNPs). With the above method, the present invention strictly compared the analytical capabilities according to types such as fluorescence in beads, fluorescence in solution, and SERS intensity. In addition, the optimized assay platform will be utilized for a simple nucleic acid detection strategy.
실험결과 2. MMP에서 타겟 캡쳐 프로브 DNA(capture DNA) 양의 정량화
먼저, EDC 커플링(coupling)을 사용하여 카복실기(COOH)-코팅된 자성 마이크로입자(MMP)의 커플링 반응을 통해 MMP를 아민이 개질된 타겟 캡쳐 프로브로 개질하였다(도 3). 상세한 제조과정은 실시예 2에서 상술하였다. First, MMP was modified into an amine-modified target capture probe through a coupling reaction of a carboxyl group (COOH)-coated magnetic microparticle (MMP) using EDC coupling ( FIG. 3 ). The detailed manufacturing process was described above in Example 2.
성공적으로 결합되었는지 여부와 MMP에서 타겟 캡쳐 프로브의 양을 확인하기 위해, Cy5 염료를 포함한 상보적인 DNA 서열을 MMP에서 타겟 캡쳐 프로브와 3 시간동안 0.3M PBS에서 혼성화하였고, 과량의 결합되지 않은 Cy5 염료를 포함한 DNA 서열을 0.15M PBS를 이용하여 5 번 세척하였다. 이후, 용액을 95 oC까지 가열함으로써 MMP로부터 혼성화된 Cy5 서열을 방출하였다. 방출된 Cy5 DNA 서열의 형광 강도를 측정하고, Cy5 DNA 서열의 양을 계산하였다(도 3A).To confirm the successful binding and the amount of target capture probe in MMP, a complementary DNA sequence including Cy5 dye was hybridized with the target capture probe in MMP in 0.3 M PBS for 3 hours, and excess unbound Cy5 dye DNA sequences including The hybridized Cy5 sequence was then released from the MMP by heating the solution to 95 °C. The fluorescence intensity of the released Cy5 DNA sequence was measured, and the amount of the Cy5 DNA sequence was calculated (FIG. 3A).
Cy5 DNA 서열(1000, 500, 100, 50, 및 10 pM)과 수득한 보정 곡선(calibration curve)을 사용함으로써, Cy5 DNA 서열의 농도를 결정하였고, MMP 당 타겟 캡쳐 프로브의 양과 수를 계산하였다. 따라서, MMP 당 타겟 캡쳐 프로브 DNA의 수는 1.2Х104로 계산되었고, 이는 MMP의 결합 능력에 적합한 수치이다. By using the Cy5 DNA sequence (1000, 500, 100, 50, and 10 pM) and the obtained calibration curve, the concentration of the Cy5 DNA sequence was determined, and the amount and number of target capture probes per MMP were calculated. Therefore, the number of target capture probe DNAs per MMP was calculated to be 1.2Х10 4 , which is a suitable value for the binding ability of MMPs.
실험결과 3. 분석 조건의 최적화
타겟 핵산을 효율적으로 검출하기 위해서는 혼성화 시간, 염도와 같은 분석 조건이 매우 중요하다. 본 발명은 양 광학 신호를 포함하는 MMP 기반 분석 능력을 비교하기 전에 분석 조건을 최적화하였다. 도 2A에 나타낸 바와 같이, MMP(100 μL, 0.03 mg/ml)의 희석액, 신호 프로브(50 μL, 10-6 M, 5'-ATTO590 dye-TGGTTAAACTTTTTGCCTTA-3', 서열번호 8), 및 타겟 DNA (15 μL의 10-8 M ~ 10-9 M 최종 농도, 5'-GTGCCAATGATCTTCGCTCGTAAGGCAAAAAGTTTAACCA-3'; E. faecalis 타겟 DNA, 서열번호 2)를 모두 혼합한 후, phosphate buffer (100 mM, pH 7.4) 및 2 M NaCl을 첨가하여 최종 농도로 10 mM PB 및 0.3 M NaCl을 제조하였다. 이후, 상기 용액을 95 oC에서 2 분간 가열하고, 혼성화 시간(0, 1, 3, 6, 및 12 시간)을 다르게 하여 상온에서 혼합하였다. 최종적으로, 상층액을 제거하여 MMP를 분리하고, 0.15 M PBS buffer에서 5 번 세척하고, 10 μL의 0.15 M PBS buffer를 첨가하였다. MMP로부터 ATTO590 염료의 형광 강도가 수득되었다(λex = 610 nm, λem = 640 nm). In order to efficiently detect a target nucleic acid, analysis conditions such as hybridization time and salinity are very important. The present invention optimizes the assay conditions before comparing the MMP-based assay capabilities involving both optical signals. As shown in Figure 2A, a dilution of MMP (100 μL, 0.03 mg/ml), a signal probe (50 μL, 10 -6 M, 5'-ATTO590 dye-TGGTTAAACTTTTTGCCTTA-3', SEQ ID NO: 8), and target DNA After mixing all (15 μL of 10 -8 M ~ 10 -9 M final concentration, 5'-GTGCCAATGATCTTCGCTCGTAAGGCAAAAAGTTTAACCA-3'; E. faecalis target DNA, SEQ ID NO: 2), phosphate buffer (100 mM, pH 7.4) and 2 M NaCl was added to prepare 10 mM PB and 0.3 M NaCl to final concentrations. Then, the solution was heated at 95 o C for 2 minutes, and mixed at room temperature with different hybridization times (0, 1, 3, 6, and 12 hours). Finally, MMP was separated by removing the supernatant, washed 5 times in 0.15 M PBS buffer, and 10 μL of 0.15 M PBS buffer was added. The fluorescence intensity of ATTO590 dye was obtained from MMP (λ ex = 610 nm, λ em = 640 nm).
형광 강도는 혼성화 시간이 증가할수록 선형적으로 증가하였다. 형광 강도는 3시간 혼성화 시간부터 시작하여 12시간 배양시간일 때 포화상태에 이르렀다(도 2B). 3 시간 및 12 시간간 강도 차이가 약 20%이기 때문에, 3시간의 혼성화 시간은 전체적인 분석 시간을 고려했을 때 상대적으로 합리적이었다.Fluorescence intensity increased linearly with increasing hybridization time. The fluorescence intensity reached saturation at the 12-hour incubation time starting from the 3-hour hybridization time (FIG. 2B). Since the intensity difference between 3 h and 12 h was about 20%, the hybridization time of 3 h was relatively reasonable considering the overall analysis time.
염 (NaCl) 농도 또한 타겟 DNA를 효율적으로 혼성화함에 있어 필수적인 조건이다. 상술한 모든 조건을 동일하게 하고, 10 mM PB에서 0 M, 0.15 M, 0.3 M NaCl 로 염의 농도만 달리하였다. 도 2C에 나타낸 바와 같이, 0.15 M NaCl에서 혼성화된 형광 강도가 0.3 M NaCl에서 수득한 결과보다 22.4 % 낮았다. 예상한 바와 같이, 높은 염 조건이 혼성화 수득률이 더 높았다. 상술한 결과들을 기초로, 본 발명에서는 MMP 기반 분석으로 혼성화 시간 3 시간, NaCl 농도 0.3 M을 채택하였다.The salt (NaCl) concentration is also an essential condition for efficiently hybridizing the target DNA. All the conditions described above were the same, and only the concentration of the salt was changed from 10 mM PB to 0 M, 0.15 M, and 0.3 M NaCl. As shown in Fig. 2C, the hybridized fluorescence intensity in 0.15 M NaCl was 22.4% lower than that obtained in 0.3 M NaCl. As expected, higher salt conditions resulted in higher hybridization yields. Based on the above results, in the present invention, a hybridization time of 3 hours and a NaCl concentration of 0.3 M was adopted as an MMP-based assay.
실험결과 4. 형광 및 SERS간 분석 능력 비교
본 발명은 두 개의 다른 광학 신호를 포함하는 MMP 기반 분석의 능력을 비교하였다. 먼저, 신호 프로브의 농도(10-6 M)를 고정한 상태에서, 타겟 농도의 범위(10-9, 10-12, 10-15, 10-18 M)를 변화하며 MMP 기반 분석의 민감도(sensitivity)을 조사하였다(최적화된 분석 조건은 실험결과 3에서 상술하였다.). The present invention compared the ability of MMP-based assays to include two different optical signals. First, while the concentration of the signal probe (10 -6 M) is fixed, the range of the target concentration (10 -9 , 10 -12 , 10 -15 , 10 -18 M) is changed and the sensitivity of the MMP-based assay is (Optimized analysis conditions were detailed in Experimental Result 3).
타겟 서열 E. faecalis
target sequence
캡쳐 프로브 E. faecalis
capture probe
신호 프로브 E. faecalis
signal probe
형광 측정을 위해, 타겟 및 신호 프로브와 혼성화한 MMP 용액의 형광 강도를 측정하고, 이어서 MMP로부터 방출된 신호 프로브의 형광 강도를 측정하였다(도 8A). 도 8B에서 나타낸 바와 같이, MMP 용액의 형광 강도는 타겟 DNA의 농도가 감소함에 따라 상당히 감소하였다. 10-11 M의 타겟 농도의 경우, 형광 강도는 대조군(타겟이 없음)과 차이가 없었으며, 이는 형광 기반 방법의 검출 한계(0.1 nM)를 나타낸다. MMP의 형광 이미지는 MMP 용액에서 수득한 결과에 부합하였다. 방출된 신호 프로브 용액의 형광 강도 역시 동일한 경향을 보였으나, MMP의 강도보다는 낮았다. For fluorescence measurement, the fluorescence intensity of the MMP solution hybridized with the target and the signal probe was measured, and then the fluorescence intensity of the signal probe emitted from the MMP was measured (FIG. 8A). As shown in FIG. 8B , the fluorescence intensity of the MMP solution decreased significantly as the concentration of target DNA decreased. For target concentrations of 10 −11 M, the fluorescence intensity did not differ from the control (no target), indicating the detection limit (0.1 nM) of the fluorescence-based method. The fluorescence images of MMP were consistent with the results obtained in the MMP solution. The fluorescence intensity of the emitted signal probe solution also showed the same trend, but was lower than that of MMP.
SERS 기반 측정을 위해, 방출된 신호 프로브를 Cys-AuNP와 혼합하여 응집체(aggregate)를 형성하였다. 라만 스펙트럼은 633 nm 레이저를 조사함으로써 응집체 용액으로부터 측정하였다. 도 8C에 나타낸 바와 같이, 신호 프로브(ATTO 590)의 SERS 스펙트럼은 10-14 M의 타겟 DNA 농도에서도 명확하게 확인되었다. 세 개의 주요 라만 피크(1333.29, 1520.53 and 1640.75 cm-1)의 신호 강도는 다양한 타겟 농도(10-9 M ~ 10-14 M)로부터 수득되었으며, 이는 SERS 기반 검출의 넓은 동적 범위를 보여준다(도 8D). 상기 결과는 SERS 기반 검출의 우수한 민감도를 나타내며, 이는 바이오분석 분야에서 모든 분석에 있어 중요한 능력이다. 또한, 재현성(reproducibility) 또한 모든 분석에 있어 매우 중요한 문제이다. 본 발명자들은, SERS의 용액 기반 측정이 신호 재현성을 매우 향상시킨다는 점을 발견하였다. 신호 재현성을 측정하기 위해, 동일한 타겟 및 다양한 농도에 대한 세 번의 독립적인 측정이 수행되었고, 그 결과 방출된 신호 프로브 및 Cys-AuNP 혼합물로부터 동일한 SERS 스펙트럼을 보여주었다(도 6).For SERS-based measurements, the emitted signal probes were mixed with Cys-AuNPs to form aggregates. Raman spectra were measured from the aggregate solution by irradiating a 633 nm laser. As shown in Fig. 8C, the SERS spectrum of the signal probe (ATTO 590) was clearly confirmed even at a target DNA concentration of 10 -14 M. The signal intensities of the three main Raman peaks (1333.29, 1520.53 and 1640.75 cm −1 ) were obtained from various target concentrations (10 −9 M to 10 −14 M), demonstrating the wide dynamic range of SERS-based detection (Fig. 8D). ). These results indicate the excellent sensitivity of SERS-based detection, which is an important capability for all assays in the field of bioanalysis. In addition, reproducibility is also a very important issue in any analysis. We have found that solution-based measurement of SERS greatly improves signal reproducibility. To measure the signal reproducibility, three independent measurements for the same target and various concentrations were performed, and as a result, the same SERS spectra were obtained from the emitted signal probe and the Cys-AuNP mixture (Fig. 6).
실험결과 5. 단일 타겟 DNA에 대한 다중진단능력(multiplexing capability)
민감도와 함께, 다중진단능력은 바이오분석 분야의 발전에 있어 매우 중요한 능력이다. 이러한 점에서, MMP 당 고농도의 타겟 캡쳐 프로브 DNA 서열을 가지는바, MMP의 사용은 매우 바람직하다. 이 때, 1.2 Х 104 프로브 DNA 서열이 단일 MMP에 개질될 수 있다는 점을 특히 주의해야 한다. 세균 타겟 DNA를 위한 MMP의 다중진단능력을 증명하기 위해, MMP에 세 개의 다른 타겟 캡쳐 프로브가 개질되어야 하며, 이들은 각각 그들의 고안된 타겟 서열(E. coli, E. faecalis, 및 S. aureus)과 결합할 수 있어야 한다(도 9A). 동시에 다양한 타겟 서열을 검출하기 전에, 본 발명은 세 개의 다른 타겟 캡쳐 프로브로 개질된 MMP를 사용하여 단일 타겟 서열을 검출하는 방법에 대해 먼저 조사하였다. E. coli, E. faecalis, 및 S. aureus 검출을 위해, ATTO 488, ATTO 590, 및 ATTO 647 염료를 포함한 단일 프로브를 사용하였고, 현미경에서 GFP, TRITC, CY5 filter를 이용하여 형광 이미지를 수득하였다(도 7). 선별된 filter 세트는 단일 프로브 내에서 고안된 형광 염료에 적합하였다.Along with sensitivity, multidiagnostic capability is a very important capability for the development of bioanalytical fields. In this regard, since the target capture probe DNA sequence has a high concentration per MMP, the use of MMP is highly desirable. At this time, it should be noted that the 1.2 Х 10 4 probe DNA sequence can be modified in a single MMP. To demonstrate the multidiagnostic ability of MMPs for bacterial target DNA, three different target capture probes must be modified in MMPs, each of which binds to their designed target sequences (E. coli , E. faecalis , and S. aureus). should be able to (Fig. 9A). Before simultaneously detecting various target sequences, the present invention first investigated a method for detecting a single target sequence using an MMP modified with three different target capture probes. For detection of E. coli , E. faecalis , and S. aureus ,
세 개의 타겟 캡쳐 프로브로 개질된 MMP를 단일 타겟(10-9 M)과 0.3 M PBS에서 3 시간동안 혼성화하였다. 일반적인 세척 단계를 수행한 후, MMP 용액의 형광 강도를 측정하였다. 도 9B에서 나타낸 바와 같이, 정확한 타겟 서열이 존재하는 경우에만(E. coli (1), E. faecalis (2), 및 S. aureus (3)) 강한 형광 강도가 수득되었다. 타겟이 없는 경우(4), 형광 신호는 관찰되지 않았다. MMP의 형광 이미지 역시 용액 기반 측정 결과, 즉 방출된 단일 프로브의 강도와 부합했다. 방출된 신호 프로브에서 수득한 결과는 MMP 기반 형광 측정 결과와 일치하였다(도 9C). 최종적으로, Cys-AuNP 및 단일 프로브의 혼합물로부터 수득한 SERS 스펙트럼은 ATTO 488, ATTO 590, 및 ATTO 647 염료의 전형적인 라만 스펙트럼과 부합하였다. 도 9D의 스펙트럼의 점선은 참조로서 각 염료의 라만 스펙트럼을 나타낸다. 모든 상기 결과는 다중진단 분석에서 중요한 시작점인 고안된 타겟에 대한 MMP의 특이적 결합 능력을 나타낸다. 라만 활성 분자의 선택 또한 분석의 민감도에 있어 중요하다. SERS를 위해, ATTO 488, ATTO 590, 및 ATTO 647 염료 및 금 나노입자를 633 nm로 여기(excitation)하였다. ATTO 488 염료 (400 - 534 nm)의 흡수 스펙트럼은 633 nm 여기상태에서 공명(resonance)을 일으키지 않았다. 도 10에서 나타낸 바와 같이, ATTO 488의 SERS 스펙트럼의 강도는 ATTO 590, 및 ATTO 647 염료의 강도에 비해 매우 약했다. 이는 다중진단 분석을 위한 바람직한 조건이 아니다. 상기 한계를 극복하기 위해, 633 nm 레이저 여기에서 cy5 염료가 높은 라만 단면(cross-section)을 가지고 1187.08, 1359.22, 및 1465.7 cm-1에서 뚜렷한 라만 피크를 보이는바, ATTO 488를 cy5 염료 (λabs = 650 nm)로 대체하였다(도 10). MMPs modified with three target capture probes were hybridized with a single target (10 −9 M) in 0.3 M PBS for 3 hours. After performing the usual washing steps, the fluorescence intensity of the MMP solution was measured. As shown in Fig. 9B, strong fluorescence intensities were obtained only when the correct target sequence was present ( E. coli (1), E. faecalis (2), and S. aureus (3)). In the absence of a target (4), no fluorescence signal was observed. The fluorescence image of the MMP also matched the solution-based measurement result, ie the intensity of the single emitted probe. The result obtained from the emitted signal probe was consistent with the MMP-based fluorescence measurement result (FIG. 9C). Finally, the SERS spectrum obtained from the mixture of Cys-AuNPs and single probes was
실험결과 6. 다수의 타겟 DNA에 대한 다중진단능력
다음으로, 다수의 타겟 DNA에 대한 MMP 기반 분석을 수행하였다. 형광 신호에대한 다중진단능력을 입증하기 위해, 다수의 타겟 캡쳐 프로브로 개질된 MMP를 제조하고, 두 개의 타겟 서열의 혼합물과 혼성화하였다(E. Coli (1) 및 E. faecalis (2), 또는 E. Coli (1) 및 S. aureus (3), 또는 E. faecalis (2) 및 S. aureus (3))(도 11A). 분석(1.0 nM 타겟 농도, 0.3 M PBS, 3 시간 배양)을 수행한 후, 분석 결과는 도 11B와 같다. MMP 프로브는 E. faecalis (2) 또는 S. aureus (3)의 혼합물임에도 선택적으로 E. Coli (1) 타겟과 결합하였다. MMP 프로브는 또한 E. Coli (1) 또는 S. aureus (3)의 혼합물임에도 선택적으로 E. faecalis (2) 타겟과 결합하였다. 그러나, 이 경우에 분석 동안 비특이적 결합이 존재하기 때문에 증가된 형광 강도가 관찰될 수 있다. S. aureus (3) 타겟에 대해서, MMP 프로브는 E. Coli (1) 또는 E. faecalis (2)의 혼합물임에도 선택적으로 S. aureus (3) 타겟과 결합하였다. 방출된 프로브 용액의 형광 강도는 동일한 결과를 나타냈으나, E. faecalis (2) 타겟 검출에서 관찰된 현저한 비특이적 결합 신호는 상당히 감소하였다. 형광 신호를 포함한 MMP 기반 분석은 높은 정확도의 결과를 보일뿐 아니라, 세 개의 다른 타겟에 대해서 우수한 다중진단능력을 갖는다.Next, MMP-based analysis of multiple target DNAs was performed. To demonstrate multiplex diagnostic capability for fluorescent signals, MMPs modified with multiple target capture probes were prepared and hybridized with a mixture of two target sequences ( E. Coli (1) and E. faecalis (2), or E. Coli (1) and S. aureus (3), or E. faecalis (2) and S. aureus (3)) ( FIG. 11A ). After performing the analysis (1.0 nM target concentration, 0.3 M PBS, 3 hours incubation), the analysis result is shown in FIG. 11B. Although the MMP probe was a mixture of E. faecalis (2) or S. aureus (3), it selectively bound to the E. Coli (1) target. The MMP probe also selectively bound to the E. faecalis (2) target, albeit a mixture of E. Coli (1) or S. aureus (3). However, in this case an increased fluorescence intensity can be observed due to the presence of non-specific binding during the assay. For the S. aureus (3) target, the MMP probe selectively bound to the S. aureus (3) target even though it was a mixture of E. coli (1) or E. faecalis (2). The fluorescence intensity of the emitted probe solution showed the same result, but the significant non-specific binding signal observed in E. faecalis (2) target detection was significantly reduced. MMP-based analysis including fluorescence signals not only shows high-accuracy results, but also has excellent multiplex diagnostic capability for three different targets.
SERS 기반 신호를 사용한 다중진단능력 역시 두 개의 타겟 서열의 혼합물을 이용하여 조사하였다(E. Coli (1) 및 E. faecalis (2), 또는 E. Coli (1) 및 S. aureus (3), 또는 E. faecalis (2) 및 S. aureus (3)). MMP로부터 신호 프로브가 방출된 후, 단일 프로브 및 Cys-AuNP의 혼합물로부터 SERS 스펙트럼을 수득하였다. 상술한 바와 같이, SERS 리포터로서, E. Coli (1) 타겟에는 cy5 염료를, E. faecalis (2) 타겟에는 ATTO 590 염료를, S. aureus (3) 타겟에는 ATTO 647 염료를 사용하였다. 도 11D에 도시한 바와 같이, E. Coli (1) 및 E. faecalis (2), E. Coli (1) 및 S. aureus (3), 또는 E. faecalis (2) 및 S. aureus (3)로부터 수득한 SERS 스펙트럼은 매우 복잡하였다. cy5, ATTO 590, 및 ATTO 647 염료의 특이한 라만 스펙트럼 패턴은 스펙트럼 중복(spectral overlap)에 의해 쉽게 구별되지 않았다. 상기 결과는 다중진단 분석을 위한 SERS 리포터의 선택에 있어서, 서로 중복되지 않도록 하는 것이 가장 중요하다는 점을 나타낸다. 상업적인 형광 염료는 구조적으로 유사하고 복잡한 화학적 구조를 가지므로 스펙트럼 중복을 피할 수 없다. 따라서, 4,4'-dipyridyl, 4-azobis(pyridine) 또는 alkyne dye와 같이 높은 라만 단면(Raman cross-section)을 가지는 간단한 화학적 구조들이 라만 리포터로서, 특히 다중진단 라만 기반 분석에 있어서 바람직할 것이다.Multidiagnostic ability using SERS-based signals was also investigated using a mixture of two target sequences ( E. Coli (1) and E. faecalis (2), or E. Coli (1) and S. aureus (3), or E. faecalis (2) and S. aureus (3)). After the signal probe was released from the MMP, a SERS spectrum was obtained from a mixture of a single probe and Cys-AuNP. As described above, as the SERS reporter, cy5 dye was used for the E. Coli (1) target, the
실험결과 7. Experiment Result 7. E. coli. E. coli. 유전체dielectric DNA의 검출detection of DNA
MMP 기반 분석 능력을 실제 세균 타겟에 적용하기 위해, 추출된 E. coli의 유전체 DNA를 위한 양 광학 신호를 포함한 분석의 민감도를 조사하였다. 도 12A는 유전체 DNA를 추출하는 과정이 도시되어 있다. 상세한 추출 방법 및 추출된 E. coli의 농도를 결정하는 방법은 실시예 4에 상술하였다. E. coli의 농도를 30 pM, 3.0 pM, 300 fM, 및 30 fM으로 조정하고, 이후 동일한 분석 프로토콜에 따라 민감도를 비교하였다. 이 경우, 양 광학 신호를 정확하게 비교하기 위해 cy5 염료와 결합된 신호 프로브를 사용하였다. In order to apply the MMP-based assay capability to actual bacterial targets, the sensitivity of the assay including both optical signals for the extracted E. coli genomic DNA was investigated. 12A shows the process of extracting genomic DNA. A detailed extraction method and a method for determining the concentration of the extracted E. coli were detailed in Example 4. The concentrations of E. coli were adjusted to 30 pM, 3.0 pM, 300 fM, and 30 fM, and then the sensitivities were compared according to the same assay protocol. In this case, a signal probe coupled with a cy5 dye was used to accurately compare both optical signals.
도 6B에 나타낸 바와 같이, 형광 신호는 MMP에서 명확하게 관찰되었으며, 300 fM의 타겟 농도에서 신호 프로브가 방출되었다. 상기 결과의 표준 편차는 세 개의 독립적인 분석 결과의 강도 편차이다. 형광 신호의 민감도(300 fM)는 상술한 결과(ATTO 590 염료 및 E. faecalis 타겟으로부터 수득한 결과)와 비교하여 3 Х 103 배 더 높았다. 이 때, Cy5의 몰 추출 계수가 ATTO 590의 계수보다 2 배 더 높다는 점을 특히 주의해야 한다. 도 12C에 도시한 바와 같이, SERS 기반 분석은 30 fM의 타겟 농도에서 cy5의 명확한 라만 스펙트럼을 수득할 수 있으며, 타겟 샘플이 없는 경우, 신호도 관찰되지 않았다. 모든 상기 결과는 양 광학 신호를 포함한 MMP 기반 분석이 실제 세균 샘플에서도 핵산 타겟을 검출하는데 우수한 능력을 가진다는 점을 나타낸다. 상기 전체 분석 과정을 수행하는데 4 시간이 소요되었으며, 이는 패혈증의 발병을 방지하기 위해 세균을 규명하는 매우 중요한 과정이다. 단일 타겟 검출에 있어, SERS-기반 신호는 형광 기반 신호보다 우수했으나, SERS를 이용한 다중진단 분석은 라만 리포터의 고안이 중요하므로, 이는 더 실용적인 진단을 위한 MMP 기반 분석의 향후 개발 방향이 될 것이다. As shown in Fig. 6B, the fluorescence signal was clearly observed in the MMP, and the signal probe was emitted at a target concentration of 300 fM. The standard deviation of the results is the intensity deviation of the results of three independent assays. The sensitivity of the fluorescence signal (300 fM) was 3
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.As described above in detail a specific part of the content of the present invention, for those of ordinary skill in the art, it is clear that this specific description is only a preferred embodiment, and the scope of the present invention is not limited thereby. something to do. Accordingly, the substantial scope of the present invention will be defined by the appended claims and their equivalents.
<110> Korea University Research and Buisness Foundation <120> Surface-enhanced Raman scattering (SERS) with magnetic microparticle-based assay for bio materials detection <130> DP-2020-0581, DHP20-K104 <160> 11 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 40 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 1 ttttggcaac agggctaggt taatatcctg tcgaaaatcc 40 <210> 2 <211> 40 <212> DNA <213> Enterococcus faecalis <400> 2 gtgccaatga tcttcgctcg taaggcaaaa agtttaacca 40 <210> 3 <211> 40 <212> DNA <213> Staphylococcus aureus <400> 3 cttcagaacc acttctattt acgccattat ctgtttgtga 40 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 4 acctagccct gttgccaaaa 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Enterococcus faecalis <400> 5 cgagcgaaga tcattggcac 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Staphylococcus aureus <400> 6 aaatagaagt ggttctgaag 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 7 ggattttcga caggatatta 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Enterococcus faecalis <400> 8 tggttaaact ttttgcctta 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Staphylococcus aureus <400> 9 tcacaaacag ataatggcgt 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 10 ggattttcga caggatatta 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Enterococcus faecalis <400> 11 gtgccaatga tcttcgctcg 20 <110> Korea University Research and Business Foundation <120> Surface-enhanced Raman scattering (SERS) with magnetic microparticle-based assay for bio materials detection <130> DP-2020-0581, DHP20-K104 <160> 11 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 40 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 1 ttttggcaac agggctaggt taatatcctg tcgaaaatcc 40 <210> 2 <211> 40 <212> DNA <213> Enterococcus faecalis <400> 2 gtgccaatga tcttcgctcg taaggcaaaa agtttaacca 40 <210> 3 <211> 40 <212> DNA <213> Staphylococcus aureus <400> 3 cttcagaacc acttctattt acgccattat ctgtttgtga 40 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 4 acctagccct gttgccaaaa 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Enterococcus faecalis <400> 5 cgagcgaaga tcattggcac 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Staphylococcus aureus <400> 6 aaatagaagt ggttctgaag 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 7 ggattttcga caggatatta 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Enterococcus faecalis <400> 8 tggttaaact ttttgcctta 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Staphylococcus aureus <400> 9 tcacaaacag ataatggcgt 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 10 ggattttcga caggatatta 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Enterococcus faecalis <400> 11 gtgccaatga tcttcgctcg 20
Claims (18)
(b) 상기 타겟 캡쳐 프로브로 개질된 MMP를 검출하고자 하는 바이오물질 특이적 타겟서열 및 신호 프로브와 혼성화하는 단계;
(c) 상기 혼성화된 MMP를 포함하는 용액 및 상기 MMP 용액으로부터 방출된 신호 프로브로부터 형광 신호를 각각 검출하는 단계; 및
(d) 상기 방출된 신호 프로브에 금속 나노입자를 첨가하여 라만(SERS) 신호를 검출하는 단계;
를 포함하는 바이오물질 다중 검출방법에 관한 것으로서,
상기 타겟 캡쳐 프로브와 신호 프로브는 각각 상기 타겟 서열과 반상보적(half-complementary)인 것을 특징으로 하는, 바이오물질 다중 검출방법.
(a) preparing magnetic microparticles (MMP) modified with a target capture probe;
(b) hybridizing with a biomaterial-specific target sequence and signal probe to detect the modified MMP with the target capture probe;
(c) detecting a fluorescence signal from a solution containing the hybridized MMP and a signal probe emitted from the MMP solution, respectively; and
(d) detecting a Raman (SERS) signal by adding metal nanoparticles to the emitted signal probe;
It relates to a biomaterial multiple detection method comprising:
The target capture probe and the signal probe are each half-complementary to the target sequence, characterized in that the biomaterial multiple detection method.
상기 (a) 단계의 MMP는 종류가 다른 2개 이상의 타겟 캡쳐 프로브로 개질된 것으로서, 2종 이상의 타겟 서열에 특이적으로 결합하는, 바이오물질 다중 검출방법.
According to claim 1,
The MMP of step (a) is modified with two or more different target capture probes, and specifically binds to two or more target sequences, a method for multiple detection of biomaterials.
상기 (b) 단계에서 혼성화 시간은 3 시간 내지 12 시간이고, 0.15 M 내지 0.3 M 농도의 염을 처리하는 것을 특징으로 하는, 바이오물질 다중 검출방법.
According to claim 1,
The hybridization time in step (b) is 3 hours to 12 hours, and a method for multiple detection of biomaterials, characterized in that a salt having a concentration of 0.15 M to 0.3 M is treated.
상기 (c) 단계의 방출된 신호 프로브는 상기 혼성화된 MMP 용액에 자기장을 걸어 분산되고, 상기 타겟 서열의 Tm(melting temperature)보다 높은 온도로 가열됨으로써 방출되는 것을 특징으로 하는, 바이오물질 다중 검출방법.
According to claim 1,
The signal probe emitted in step (c) is dispersed by applying a magnetic field to the hybridized MMP solution, characterized in that it is released by heating to a temperature higher than the T m (melting temperature) of the target sequence, biomaterial multiple detection Way.
상기 검출방법은 최소 검출한계가 30 fM인 것을 특징으로 하는, 바이오물질 다중 검출방법.
According to claim 1,
The detection method is characterized in that the minimum detection limit is 30 fM, biomaterial multiple detection method.
상기 금속 나노입자의 표면을 시스테아민(cysteamine), APTES(3-Aminopropyl)triethoxysilane), APTMS(3-Aminopropyl)trimethoxysilane, AEAPTMS(N-[3-(Trimethoxysilyl)propyl]ethylenediamine, MPTMS(3- Mercaptopropyl)trimethoxysilane, MPTES((3-Mercaptopropyl)triethoxysilane), MPA(mercaptopropionic acid), MHA(6-mercaptohexanoic acid), BDT(1,4- benzenedithiol), MBA(4-mercaptobenzoic acid), 및 MBIA(2 -mercaptobenzoimidazole- 5-carboxylic acid)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상으로 개질한 것을 특징으로 하는, 바이오물질 다중 검출방법.
According to claim 1,
The surface of the metal nanoparticles is cysteamine, APTES (3-Aminopropyl) triethoxysilane), APTMS (3-Aminopropyl) trimethoxysilane, AEAPTMS (N- [3- (Trimethoxysilyl) propyl] ethylenediamine, MPTMS (3- Mercaptopropyl) )trimethoxysilane, MPTES((3-Mercaptopropyl)triethoxysilane), MPA(mercaptopropionic acid), MHA(6-mercaptohexanoic acid), BDT(1,4-benzenedithiol), MBA(4-mercaptobenzoic acid), and MBIA(2-mercaptobenzoimidazole) - 5-carboxylic acid), characterized in that modified with any one or more selected from the group consisting of, biomaterial multiple detection method.
상기 신호 프로브는 형광물질, 발색물질, 또는 화학발광물질로 표지되어 있는, 바이오물질 다중 검출방법.
According to claim 1,
The signal probe is labeled with a fluorescent material, a chromogenic material, or a chemiluminescent material, a method for detecting multiple biomaterials.
상기 형광물질은 ATTO 계열 염료, 시아닌(Cyanine) 계열 염료, FAM(6-carboxyfluorescein), 텍사스 레드(texas red), 플루 오레신(fluorescein), HEX(2',4',5',7'-tetrachloro-6-carboxy-4,7- dichlorofluorescein), 플루오레신 클로로트리아지닐(fluorescein chlorotriazinyl), 로다민 그린(rhodamine green), 로다민 레드(rhodamine red), 테트라메틸 로다민(tetramethyl rhodamine), FITC(fluorescein isothiocyanate), 오레곤 그린(oregon green), 알렉사 플루오로(alexa fluor), JOE(6-Carboxy-4',5'-Dichloro-2',7'-Dimethoxyfluorescein), ROX(6-Carboxyl-XRhodamine), TET(Tetrachloro-Fluorescein), TRITC(tertramethylrodamine isothiocyanate), TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), NED(N-(1-Naphthyl) ethylenediamine), 및 씨아디카르보시아닌(thiadicarbocyanine)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인, 바이오물질 다중 검출방법.
8. The method of claim 7,
The fluorescent material is an ATTO-based dye, a cyanine-based dye, FAM (6-carboxyfluorescein), Texas red (texas red), fluorescein, HEX (2',4',5',7'-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), fluorescein fluorescein chlorotriazinyl, rhodamine green, rhodamine red, tetramethyl rhodamine, fluorescein isothiocyanate (FITC), oregon green, Alexa Fluoro (alexa fluor), JOE (6-Carboxy-4',5'-Dichloro-2',7'-Dimethoxyfluorescein), ROX (6-Carboxyl-XRhodamine), TET (Tetrachloro-Fluorescein), TRITC (tertramethylrodamine isothiocyanate), TAMRA (6-carboxytetramethyl-rhodamine), NED (N- (1-Naphthyl) ethylenediamine), and thiadicarbocyanine (thiadicarbocyanine) at least any one selected from the group consisting of, biomaterial multiple detection method.
상기 검출방법은 웰, 채널, 튜브, 또는 이들의 조합에서 수행되는 것인, 바이오물질 다중 검출방법.
According to claim 1,
Wherein the detection method is performed in a well, a channel, a tube, or a combination thereof, a multiple detection method of a biomaterial.
상기 바이오물질은 단백질, 세포, 바이러스, 핵산, 유기분자, 및 무기분자로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인, 바이오물질 다중 검출방법.
According to claim 1,
The biomaterial is any one or more selected from the group consisting of proteins, cells, viruses, nucleic acids, organic molecules, and inorganic molecules, biomaterial multiple detection method.
(b) 상기 타겟 캡쳐 프로브로 개질된 MMP를 검출하고자 하는 바이오물질 특이적 타겟 서열 및 신호 프로브와 혼성화하는 단계;
(c) 상기 혼성화된 MMP를 포함하는 용액 및 상기 MMP 용액으로부터 방출된 신호 프로브로부터 형광 신호를 각각 검출하는 단계; 및
(d) 상기 방출된 신호 프로브에 금속 나노입자를 첨가하여 방출되는 라만(SERS) 신호를 검출하는 단계;
를 포함하는 세균 감염성 질환을 진단하기 위한 정보제공방법에 관한 것으로서,
상기 타겟 캡쳐 프로브와 신호 프로브는 각각 상기 타겟 서열과 반상보적(half-complementary)인 것을 특징으로 하는, 정보제공방법.
(a) preparing magnetic microparticles (MMP) modified with a target capture probe;
(b) hybridizing with a biomaterial-specific target sequence and signal probe to detect the modified MMP with the target capture probe;
(c) detecting a fluorescence signal from a solution containing the hybridized MMP and a signal probe emitted from the MMP solution, respectively; and
(d) detecting an emitted Raman (SERS) signal by adding metal nanoparticles to the emitted signal probe;
It relates to a method for providing information for diagnosing bacterial infectious diseases, comprising:
The method for providing information, characterized in that the target capture probe and the signal probe are each half-complementary to the target sequence.
상기 (a) 단계 이전에, 세균 감염성 질환이 의심되는 환자샘플에서 유전체 DNA를 추출하는 단계를 포함하는, 정보제공방법.
12. The method of claim 11,
Prior to the step (a), the information providing method comprising the step of extracting genomic DNA from a patient sample suspected of a bacterial infectious disease.
상기 환자샘플은 혈액, 혈청, 및 혈장으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인, 정보제공방법.
13. The method of claim 12,
The patient sample is any one or more selected from the group consisting of blood, serum, and plasma, information providing method.
상기 (a) 단계의 MMP는 종류가 다른 2개 이상의 타겟 캡쳐 프로브로 개질된 것으로서, 2종 이상의 타겟 서열에 특이적으로 결합하여, 상기 타겟 서열을 포함하는 미생물을 각각 원인균으로 하는 2종 이상의 세균 감염성 질환을 진단하기 위한 정보제공방법.
12. The method of claim 11,
The MMP of step (a) is modified with two or more different target capture probes, and binds specifically to two or more target sequences, and two or more kinds of bacteria each having a microorganism containing the target sequence as the causative organism. A method of providing information for diagnosing infectious diseases.
상기 (d) 단계 이후에, 상기 바이오물질에 의한 형광 신호 또는 라만 신호의 정보를 이용하여 세균 감염성 질환 원인균의 존재 여부 또는 상기 원인균의 종류를 판정하는 단계를 포함하는, 정보제공방법.
12. The method of claim 11,
After the step (d), the information providing method comprising the step of determining the presence of a bacterial infectious disease causative organism or the type of the causative organism using information of a fluorescence signal or a Raman signal by the biomaterial.
상기 금속 나노입자의 표면을 시스테아민(cysteamine), APTES(3-Aminopropyl)triethoxysilane), APTMS(3-Aminopropyl)trimethoxysilane, AEAPTMS(N-[3-(Trimethoxysilyl)propyl]ethylenediamine, MPTMS(3- Mercaptopropyl)trimethoxysilane, MPTES((3-Mercaptopropyl)triethoxysilane), MPA(mercaptopropionic acid), MHA(6-mercaptohexanoic acid), BDT(1,4- benzenedithiol), MBA(4-mercaptobenzoic acid), 및 MBIA(2 -mercaptobenzoimidazole- 5-carboxylic acid)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상으로 개질한 것을 특징으로 하는, 정보제공방법.
12. The method of claim 11,
The surface of the metal nanoparticles is cysteamine, APTES (3-Aminopropyl) triethoxysilane), APTMS (3-Aminopropyl) trimethoxysilane, AEAPTMS (N- [3- (Trimethoxysilyl) propyl] ethylenediamine, MPTMS (3- Mercaptopropyl) )trimethoxysilane, MPTES((3-Mercaptopropyl)triethoxysilane), MPA(mercaptopropionic acid), MHA(6-mercaptohexanoic acid), BDT(1,4-benzenedithiol), MBA(4-mercaptobenzoic acid), and MBIA(2-mercaptobenzoimidazole) - 5-carboxylic acid) characterized in that modified with any one or more selected from the group consisting of, information providing method.
상기 세균 감염성 질환은 패혈증, 부비동염, 폐렴, 식중독, 이질, 결핵, 녹농균 감염, 농가진, 화농성 질환, 급성 피부염, 균혈증, 심내막염, 장염, 골관절염, 골수염, 요로감염, 뇌염, 뇌막염, 및 신장염으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인, 정보제공방법.
12. The method of claim 11,
The bacterial infectious disease is sepsis, sinusitis, pneumonia, food poisoning, dysentery, tuberculosis, Pseudomonas aeruginosa infection, impetigo, suppurative disease, acute dermatitis, bacteremia, endocarditis, enteritis, osteoarthritis, osteomyelitis, urinary tract infection, encephalitis, meningitis, and the group consisting of nephritis Any one or more selected from, information providing method.
세균은 그람 양성균, 그람 음성균 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인, 정보제공방법.
12. The method of claim 11,
Bacteria are any one or more selected from the group consisting of gram-positive bacteria, gram-negative bacteria, and mixtures thereof, the information providing method.
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