KR102331564B1 - Process for differentiation and cultivation of human nasal inferior turbinate derived mesenchymal stem cell with serum free media - Google Patents

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Abstract

본 발명은 이종 동물 혈청이 첨가되지 않은 배지를 이용하여 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포를 배양하는 방법, 및 상기 배양된 중간엽 줄기세포를 이종 동물 혈청이 첨가되지 않은 분화배지를 이용하여 연골세포, 골세포, 또는 지방세포로 분화시키는 방법에 관한 것이다.
본 발명자들은 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포를 이종 동물 혈청이 첨가되지 않은 배지를 이용하여 배양하였으며, 상기 배양된 중간엽 줄기세포는 원래 중간엽 줄기세포의 특성 및 세포 증식능이 유지되며, 각각 이종 동물 혈청이 첨가되지 않은 연골세포, 골세포, 또는 지방세포로 분화시켰을 때 높은 분화능을 나타내며, 특히 기존의 방법으로 배양하여 이종 항원이 포함된 각 분화배지를 이용해 분화시킨 경우와 비교하여 골세포 및 지방세포로의 분화능이 우수함을 확인하였는바, 이종 동물 혈청이 첨가되지 않은 배지를 이용하여 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포를 배양 및 분화시켜 실제 임상에 용이하게 적용하여 연골세포, 골세포, 또는 지방세포 결손 및 기능 부전에 의해 유발되는 다양한 질환의 치료 용도에 유용하게 이용될 수 있을 것으로 기대된다. The present invention relates to a method of culturing human inferior turbinate-derived mesenchymal stem cells using a medium not added with xenogeneic animal serum, and chondrocytes using a differentiation medium to which the cultured mesenchymal stem cells are not added with heterologous animal serum. , to a method for differentiating into osteocytes, or adipocytes.
The present inventors cultured human inferior turbinate-derived mesenchymal stem cells using a medium not added with xenogeneic animal serum, and the cultured mesenchymal stem cells maintain the original mesenchymal stem cell characteristics and cell proliferation ability, respectively. When differentiated into chondrocytes, osteocytes, or adipocytes to which no animal serum has been added, high differentiation capacity is exhibited. As it was confirmed that the ability to differentiate into adipocytes was excellent, human inferior turbinate-derived mesenchymal stem cells were cultured and differentiated using a medium not added with xenogeneic animal serum, which was then easily applied to actual clinical practice, such as chondrocytes, osteocytes, or fat. It is expected to be usefully used for the treatment of various diseases caused by cell defects and dysfunction.

Description

이종 동물 혈청이 첨가된 배지 없이 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포를 배양 및 분화시키는 방법 {Process for differentiation and cultivation of human nasal inferior turbinate derived mesenchymal stem cell with serum free media}Method for culturing and differentiating human inferior turbinate-derived mesenchymal stem cells without a medium to which heterogeneous animal serum is added {Process for differentiation and cultivation of human nasal inferior turbinate derived mesenchymal stem cell with serum free media}

본 발명은 이종 동물 혈청이 첨가되지 않은 배지를 이용하여 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포를 배양하는 방법, 및 상기 배양된 중간엽 줄기세포를 이종 동물 혈청이 첨가되지 않은 분화배지를 이용하여 연골세포, 골세포, 또는 지방세포로 분화시키는 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a method of culturing human inferior turbinate-derived mesenchymal stem cells using a medium not added with xenogeneic animal serum, and chondrocytes using a differentiation medium to which the cultured mesenchymal stem cells are not added with heterologous animal serum. , to a method for differentiating into osteocytes, or adipocytes.

줄기세포에 대한 연구는 1981년 Evans 등이 처음으로 쥐의 배아 줄기세포주를 확립하는데 성공한 이후, 줄기세포의 무한한 자가재생능과 모든 세포로 분화가 가능한 전능성에 대한 연구가 본격적으로 진행되었다. 이러한 줄기세포는 얻는 과정에 따라 발생초기의 배반포(blstocyst)에서 얻어지는 배아 줄기세포 및 발생과정이 끝난 성인 또는 태반에서 얻어지는 성체 줄기세포로 분류할 수 있다. 배아 줄기세포의 경우는 미분화 상태의 자가 재생능이 뛰어나 증식이 용이한 반면, 사용 및 연구에 있어서 윤리적인 문제를 항상 내포하고 있으며 생체 내에 세포치료를 위해 이식한 경우 미분화 상태의 세포가 증식하는 암(teratoma) 발생 가능성 등이 있어 임상적인 상용화에는 어려움이 있다. 성체 줄기세포인 중간엽 줄기세포(mesenchymal stromal cell)는 생체 외 배양 조건에서 분화가 용이한 반면에 증식이 어려운 단점이 있으나, 성체조직인 골수, 흡입된 지방조직 등 전신 대부분의 조직에서 얻을 수 있으며 생체 내에 이식된 후 장기의 특성에 맞게 분화하는 장기 특이적 분화(site-specific differentiation)와 본래의 세포 특성과 다른 종류의 기관 세포로 교차분화(trans-differentiation) 할 수 있는 다형성 능력(plasticity of stem cells)을 가지고 있는 것으로 밝혀지면서 조직공학과 재생의학의 영역에서 많은 연구가 이루어지고 있다. 최근 보고서에 의하면 줄기세포를 이용한 세포치료제가 개발될 경우 대상 환자의 수는 약 1억 2천만 명에 달할 것으로 추정되고 있으며, 이들의 시장 규모는 최소 연간 3,000억 달러를 넘어설 것으로 예상하고 있다.In the study of stem cells, after Evans et al. first succeeded in establishing a mouse embryonic stem cell line in 1981, research on the unlimited self-renewal ability of stem cells and their pluripotency capable of differentiating into all cells was conducted in earnest. These stem cells can be classified into embryonic stem cells obtained from blastocysts at an early stage of development, and adult stem cells obtained from adult or placenta after the development process is completed, depending on the process of obtaining them. Embryonic stem cells have excellent self-renewal ability in an undifferentiated state and are easy to proliferate, but they always have ethical issues in use and research. teratoma), making it difficult for clinical commercialization. Adult stem cells, mesenchymal stromal cells, are easy to differentiate under ex vivo culture conditions, but have the disadvantage of being difficult to proliferate. Site-specific differentiation, which differentiates according to the characteristics of the organ after transplantation, and the plasticity of stem cells, which can trans-differentiate into different types of organ cells ), a lot of research is being done in the areas of tissue engineering and regenerative medicine. According to a recent report, if a cell therapy using stem cells is developed, the number of target patients is estimated to reach about 120 million, and their market size is expected to exceed at least $300 billion per year.

이러한 줄기세포를 세포치료제로 활용하기 위해서는 충분한 양으로 증식시키기 위한 배양과정이 필요하며, 이때 상당히 많은 양의 배양액이 사용된다. 현재 소태아 혈청(fetal bovine serum; FBS)은 세포배양 배지에서 세포의 부착, 성장, 및 증식에 필요한 요소들이 대부분 칵테일 형태로 섞여 있어서 대부분의 인간유래 세포의 배양에 일반적으로 필수적인 첨가물로 상용되고 있다. 하지만 세포배양에 있어서 이종 동물의 혈청을 사용하는 것은 향후 세포치료제로의 사용 시에 여러 가지 문제점을 야기할 수 있다. 이론적 그리고 생물학적인 측면에서 혈청 조성은 알부민(albumin), 트랜스페린(transferrin) 등과 같이 주요 성분과 함께 잘 알려져 있지만, 밝혀지지 않은 미지의 성분이 미량 포함되어 있으며 이들이 세포 성장에 상당한 영향을 미칠 수 있으므로 재현성 있는 실험을 진행하기 위해서는 이러한 미지의 미량 성분을 배제할 필요가 있다. 또한, 혈청은 채취 시기와 채취 장소에 따라 성분의 변화가 있을 수 있고 같은 로트(lot)의 혈청을 대량으로 준비하더라도 보관 기관 중에 성분변화가 야기될 수 있다. 같은 로트의 혈청을 미리 준비하지 못한다면 다른 로트의 혈청을 실험에 사용하기 전에 광범위한 검사를 시행하여 이전의 혈청과 비교해야 한다. 이외에도 혈청은 동물에서 채취하므로 동물의 병원성 또는 기타요인에 오염이 될 수 있어서 실험결과에 영향을 미칠 수 있고, 경제적인 측면에서는 매우 고가이며 공급보다 수요가 많아지면 공급 또한 원활하지 못할 수 있다. 더욱이 혈청은 매우 복잡한 산물이므로 세포 배양 후 배양 산물을 이용하고자 할 때 혈청 성분을 제거하기 어려우며 다음 공정 과정이 제한되는 경우가 많다. In order to utilize these stem cells as a cell therapy, a culture process is required to proliferate in a sufficient amount, and at this time, a fairly large amount of culture medium is used. Currently, fetal bovine serum (FBS) is commonly used as an essential additive for culturing most human-derived cells because most of the elements necessary for cell adhesion, growth, and proliferation are mixed in a cocktail form in a cell culture medium. . However, the use of serum from a heterogeneous animal in cell culture may cause various problems when used as a cell therapy in the future. Theoretically and biologically, serum composition is well known along with major components such as albumin and transferrin, but it contains trace amounts of unknown and unknown components, which can have a significant effect on cell growth. In order to proceed with the experiment, it is necessary to exclude these unknown trace components. In addition, there may be changes in the composition of the serum depending on the collection time and collection location, and even if a large amount of serum of the same lot is prepared, the composition may change in the storage institution. If sera from the same lot cannot be prepared in advance, sera from different lots should be compared with the previous sera by performing extensive testing before use in the experiment. In addition, since serum is collected from animals, it may be contaminated with animal pathogenicity or other factors, which may affect the experimental results. Moreover, since serum is a very complex product, it is difficult to remove serum components when using the culture product after cell culture, and the subsequent process is often limited.

상기와 같은 문제점들 때문에 지난 삼십년 전부터 소태아 혈청을 대체하기 위해서 성분이 정확히 알려져 있는 대체 첨가물을 사용하는 이종 항원 및 단백질이 없는 배지 (serum and protein free media)를 이용한 사람 세포의 배양에 대한 연구들이 진행되어 왔고, 최근에는 상품화된 배지를 이용한 연구들이 발표되고 있다(한국 등록특허10-1156745). 이종 항원 및 단백질이 없는 배지를 사용하게 되면 상기와 같은 번거로운 과정을 피할 수 있고 배지 성분이 완전히 밝혀져 있기 때문에 재현성 있는 실험이 가능하며, 배양 후 공정과정에 이용할 때 용이하다. 따라서 이종 항원 및 단백질이 없는 배지를 배양에 사용하게 되면 위와 같은 이종 동물 혈청 사용에 따른 단점을 보완할 수 있다.Due to the above problems, studies on human cell culture using a heterogeneous antigen and protein free media using an alternative additive with an exact component have been conducted for the past 30 years to replace the fetal bovine serum. has been in progress, and recently, studies using commercialized media have been published (Korean Patent Registration No. 10-1156745). When a medium free of heterogeneous antigens and proteins is used, the cumbersome process as described above can be avoided, and reproducible experiments are possible because the medium components are completely revealed, and it is easy to use in the post-culturing process. Therefore, if a medium free of heterologous antigens and proteins is used for culture, the above disadvantages associated with the use of heterologous animal serum can be compensated.

상기와 같은 종래의 문제점을 극복하기 위하여, 본 발명자들은 많은 수술 과정 중에 제거되어 폐기되는 사람의 코 안에 존재하는 하비갑개 조직에서 분리한 중간엽 줄기세포를 향후 실제 임상적용의 용이성을 위해 이종 항원 및 단백질이 첨가되지 않은 배지를 이용하여 배양하였으며, 상기 배양된 중간엽 줄기세포는 원래 세포의 특성 및 각각 연골세포, 골세포, 또는 지방세포로의 분화능이 유지 및 향상되는 것을 확인하였는바, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다. In order to overcome the above problems of the prior art, the present inventors have prepared mesenchymal stem cells isolated from the inferior turbinate tissue present in the nose of a person, which are removed and discarded during many surgical procedures, for ease of practical clinical application in the future. It was cultured using a protein-free medium, and it was confirmed that the cultured mesenchymal stem cells maintained and improved the characteristics of the original cells and the ability to differentiate into chondrocytes, osteocytes, or adipocytes, respectively, based on this. The present invention was completed.

이에, 본 발명은 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포를 이종 동물 혈청이 첨가되지 않은 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포의 배양방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.Accordingly, an object of the present invention is to provide a method for culturing human inferior turbinate-derived mesenchymal stem cells, comprising the step of culturing the human inferior turbinate-derived mesenchymal stem cells in a medium not added with heterologous animal serum.

또한, 본 발명은 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포로부터 연골세포, 골세포, 또는 지방세포로의 분화방법을 제공하는 것을 다른 목적으로 한다. Another object of the present invention is to provide a method for differentiation from human inferior turbinate-derived mesenchymal stem cells into chondrocytes, osteocytes, or adipocytes.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.However, the technical problem to be achieved by the present invention is not limited to the above-mentioned problems, and other problems not mentioned will be clearly understood by those skilled in the art from the following description.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포를 이종 동물 혈청이 첨가되지 않은 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포의 배양방법을 제공한다. In order to achieve the object of the present invention as described above, the present invention is a culture of human inferior turbinate-derived mesenchymal stem cells, comprising the step of culturing the human inferior turbinate-derived mesenchymal stem cells in a medium not added with xenogeneic animal serum. provide a way

또한, 본 발명은 (a) 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포를 이종 동물 혈청이 첨가되지 않은 배지에서 배양하는 단계; 및In addition, the present invention comprises the steps of (a) culturing human inferior turbinate-derived mesenchymal stem cells in a medium not added with xenogeneic animal serum; and

(b) 상기 배양된 중간엽 줄기세포를 이종 동물 혈청이 첨가되지 않은 연골 분화배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포로부터 연골세포로의 분화방법을 제공한다. (B) provides a method of differentiation from human inferior turbinate-derived mesenchymal stem cells into chondrocytes, comprising the step of culturing the cultured mesenchymal stem cells in a cartilage differentiation medium not added with xenogeneic animal serum.

또한, 본 발명은 (a) 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포를 이종 동물 혈청이 첨가되지 않은 배지에서 배양하는 단계; 및In addition, the present invention comprises the steps of (a) culturing human inferior turbinate-derived mesenchymal stem cells in a medium not added with xenogeneic animal serum; and

(b) 상기 배양된 중간엽 줄기세포를 이종 동물 혈청이 첨가되지 않은 골 분화배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포로부터 골세포로의 분화방법을 제공한다. (b) provides a method for differentiation from human inferior turbinate-derived mesenchymal stem cells into osteocytes, comprising the step of culturing the cultured mesenchymal stem cells in a bone differentiation medium not added with xenogeneic animal serum.

또한, (a) 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포를 이종 동물 혈청이 첨가되지 않은 배지에서 배양하는 단계; 및In addition, (a) culturing the human inferior turbinate-derived mesenchymal stem cells in a medium not added with heterologous animal serum; and

(b) 상기 배양된 중간엽 줄기세포를 이종 동물 혈청이 첨가되지 않은 지방 분화배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포로부터 지방세포로의 분화방법을 제공한다. (b) provides a method for differentiation from human inferior turbinate-derived mesenchymal stem cells into adipocytes, comprising the step of culturing the cultured mesenchymal stem cells in an adipose differentiation medium not added with xenogeneic animal serum.

본 발명의 일구현예로, 상기 이종 동물 혈청이 첨가되지 않은 배지에서 배양하는 단계 이전에 인간 유래 성분으로 이루어진 기질로 코팅된 배양플레이트에 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포를 올리고 슬라이드 글라스로 덮어 부착시키는 단계를 더 포함할 수 있다. In one embodiment of the present invention, human inferior turbinate-derived mesenchymal stem cells are placed on a culture plate coated with a substrate made of human-derived components before the step of culturing in a medium to which the heterogeneous animal serum is not added and covered with a slide glass to attach It may further include a step of making.

본 발명의 다른 구현예로, 상기 이종 동물 혈청이 첨가되지 않은 배지는 재조합된 PDGF-BB(human platelet-derived growth factor-BB), bFGF(basic fibroblast growth factor), 및 TGF-β1(transforming growth factor-β1)을 포함하는 것일 수 있다. In another embodiment of the present invention, the medium to which the heterologous animal serum is not added is recombinant human platelet-derived growth factor-BB (PDGF-BB), basic fibroblast growth factor (bFGF), and transforming growth factor (TGF-β1). -β1) may be included.

본 발명의 다른 구현예로, 상기 인간 유래 성분으로 이루어진 기질은 CELLstart CTS Attachment substrate 또는 인간 혈장 피브로넥틴(human plasma fibronectin)일 수 있다. In another embodiment of the present invention, the substrate made of the human-derived component may be a CELLstart CTS Attachment substrate or human plasma fibronectin.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 단계 (a) 또는 (b)에서 배양은 1 내지 3주 동안 수행될 수 있다.In another embodiment of the present invention, the culturing in step (a) or (b) may be performed for 1 to 3 weeks.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 연골 분화배지는 DMEM 배지에 인슐린 성장인자(insulin growth factor-1; IGF-1), 덱사메타손(dexamethasone), 아스코르브산-2 인산(ascorbate-2 phosphate), 인슐린-트랜스페린 아셀렌산나트륨(Insulin-transferrin sodium selenite), 피루브산나트륨(sodium pyrubate), 프롤린(proline), L-글루타민(L-glutaime), 재조합된 PDGF-BB(human platelet-derived growth factor-BB), bFGF(basic fibroblast growth factor), 및 TGF-β1(transforming growth factor-β1)가 포함된 것일 수 있다.In another embodiment of the present invention, the cartilage differentiation medium is insulin growth factor-1 (IGF-1), dexamethasone, ascorbate-2 phosphate, insulin in DMEM medium. -Transferrin sodium selenite, sodium pyrubate, proline, L-glutaime, recombinant human platelet-derived growth factor-BB (PDGF-BB) , bFGF (basic fibroblast growth factor), and TGF-β1 (transforming growth factor-β1) may be included.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 골 분화배지는 DMEM 배지에 페니실린(penicillin), 스트렙토마이신(streptomycin), 덱사메타손(dexamethasone), 아스코르브산-2 인산(ascorbate-2 phosphate), 베타-글리세로포스페이트(β-glycerophosphate), 재조합된 PDGF-BB(human platelet-derived growth factor-BB), bFGF(basic fibroblast growth factor), 및 TGF-β1(transforming growth factor-β1)가 포함된 것일 수 있다.In another embodiment of the present invention, the bone differentiation medium is DMEM medium with penicillin, streptomycin, dexamethasone, ascorbate-2 phosphate, beta-glycerophosphate. (β-glycerophosphate), recombinant human platelet-derived growth factor-BB (PDGF-BB), basic fibroblast growth factor (bFGF), and transforming growth factor-β1 (TGF-β1) may be included.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 지방 분화배지는 DMEM 배지에 인슐린(insulin), 인도메타신(indomethacin), 덱사메타손(dexamethasone), 3-이소부틸-1-메틸잔틴(3-isobutyl-1-methylxanthine), 재조합된 PDGF-BB(human platelet-derived growth factor-BB), bFGF(basic fibroblast growth factor), 및 TGF-β1(transforming growth factor-β1)이 포함된 것일 수 있다.In another embodiment of the present invention, the adipose differentiation medium is insulin (insulin), indomethacin (indomethacin), dexamethasone, 3-isobutyl-1-methyl xanthine (3-isobutyl-1-) in DMEM medium methylxanthine), recombinant human platelet-derived growth factor-BB (PDGF-BB), basic fibroblast growth factor (bFGF), and transforming growth factor-β1 (TGF-β1) may be included.

본 발명자들은 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포를 이종 동물 혈청이 첨가되지 않은 배지를 이용하여 배양하였으며, 상기 배양된 중간엽 줄기세포는 원래 중간엽 줄기세포의 형태 및 세포증식능이 유지되고, 각각 이종 동물 혈청이 첨가되지 않은 분화배지를 이용하여 연골세포, 골세포, 또는 지방세포로 분화시켰을 때 높은 분화능을 나타내며, 특히 기존의 방법으로 배양하여 이종 항원이 포함된 각 분화배지를 이용해 분화시킨 경우와 비교하여 골세포 및 지방세포로의 분화능이 우수함을 확인하였는바, 이종 동물 혈청이 첨가되지 않은 배지를 이용하여 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포를 배양 및 분화시켜 실제 임상에 용이하게 적용하여 연골세포, 골세포, 또는 지방세포 결손 및 기능 부전에 의해 유발되는 다양한 질환의 치료 용도에 유용하게 이용될 수 있을 것으로 기대된다. The present inventors cultured human inferior turbinate-derived mesenchymal stem cells using a medium not added with xenogeneic animal serum, and the cultured mesenchymal stem cells maintain the original mesenchymal stem cell morphology and cell proliferation ability, It shows high differentiation ability when differentiated into chondrocytes, osteocytes, or adipocytes using a differentiation medium not added with animal serum. By comparison, it was confirmed that the ability to differentiate into osteocytes and adipocytes was excellent. By culturing and differentiating human inferior turbinate-derived mesenchymal stem cells using a medium not added with xenogeneic animal serum, chondrocytes, It is expected to be useful for the treatment of various diseases caused by osteocytes or adipocyte defects and dysfunction.

도 1은 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포를 이종 동물 혈청이 첨가되지 않은 배지(serum free cultivation) 또는 기존의 이종 동물 혈청이 포함된 배지(serum containing cultivation)를 이용하여 배양한 후 현미경으로 세포의 형태를 관찰한 결과이다.
도 2는 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포를 이종 동물 혈청이 첨가되지 않은 배지(serum free cultivation) 또는 기존의 이종 동물 혈청이 포함된 배지(serum containing cultivation)를 이용하여 배양한 후 유세포 분석을 통해 세포 표면 표지자(CD14, CD19, CD29, CD34, CD73, CD90 및 HLA-DR)들의 발현수준을 분석한 결과이다.
도 3은 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포를 이종 동물 혈청이 첨가되지 않은 배지(Serum free culture) 또는 기존의 이종 동물 혈청이 포함된 배지(Conventional culture)를 이용하여 7일 동안 배양하면서 세포증식능을 측정하여 비교한 결과이다.
도 4a 및 도 4b는 이종 동물 혈청이 첨가되지 않은 배지에서 배양한 후 역시 이종 동물 혈청이 없는 연골 분화배지에서 분화시킨 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포(serum free cultivation) 및 기존의 방법으로 배양한 후 이종 항원이 포함된 연골 분화배지에서 분화시킨 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포(serum containing cultivation)를 Toluidine blue-O 염색을 통한 연골 특이적 기질 생성(도 4a) 및 real-time PCR을 통한 연골 분화 관련 유전자(COLI 및 ACAN)의 mRNA 발현수준(도 4b)을 분석하여 연골세포로의 분화능을 비교분석한 결과이다.
도 5a 및 도 5b는 이종 동물 혈청이 첨가되지 않은 배지에서 배양한 후 역시 이종 동물 혈청이 없는 골 분화배지에서 분화시킨 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포(serum free cultivation) 및 기존의 방법으로 배양한 후 이종 항원이 포함된 골 분화배지에서 분화시킨 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포(serum containing cultivation)를 알칼리성 인산가수분해효소(Akaline phosphatase) 염색을 통한 골 특이적 기질 생성(도 5a) 및 real-time PCR을 통한 골 분화 관련 유전자(OC, Runx2, 및 COLI)의 mRNA 발현수준(도 5b)을 분석하여 골세포로의 분화능을 비교분석한 결과이다.
도 6a 및 도 6b는 이종 동물 혈청이 첨가되지 않은 배지에서 배양한 후 역시 이종 동물 혈청이 없는 지방 분화배지에서 분화시킨 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포(serum free cultivation) 및 기존의 방법으로 배양한 후 이종 항원이 포함된 지방 분화배지에서 분화시킨 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포(serum containing cultivation)를 Oil-red O 염색을 통한 지방 특이적 소체의 생성(도 6a) 및 real-time PCR을 통한 지방 분화 관련 유전자(PPARG 및 ACSS2)의 mRNA 발현수준(도 6b)을 분석하여 지방세포로의 분화능을 비교분석한 결과이다.1 is a microscopic view of human inferior turbinate-derived mesenchymal stem cells under a microscope after culturing using a medium free of heterologous animal serum or an existing medium containing serum of a heterologous animal; It is the result of observing the shape.
2 is a flow cytometry analysis of human inferior turbinate-derived mesenchymal stem cells through flow cytometry after culturing using a medium free of xenogeneic animal serum or an existing medium containing serum of a xenogeneic animal. These are the results of analyzing the expression levels of cell surface markers (CD14, CD19, CD29, CD34, CD73, CD90 and HLA-DR).
Figure 3 shows the cell proliferative ability while culturing human inferior turbinate-derived mesenchymal stem cells for 7 days using a medium not added with xenogeneic animal serum (Serum free culture) or a conventional culture medium containing xenogeneic animal serum (Conventional culture). It is the result of measurement and comparison.
4A and 4B show human inferior turbinate-derived mesenchymal stem cells (serum free cultivation), which were differentiated in a cartilage differentiation medium without the serum of a heterogeneous animal, after culturing in a medium without the addition of serum from a heterologous animal, and cultured by a conventional method; Afterwards, human inferior turbinate-derived mesenchymal stem cells (serum containing cultivation) differentiated in a cartilage differentiation medium containing a heterologous antigen were produced cartilage-specific matrix through Toluidine blue-O staining (Fig. 4a) and cartilage through real-time PCR It is the result of comparative analysis of the ability to differentiate into chondrocytes by analyzing the mRNA expression level (FIG. 4b) of differentiation-related genes (COLI and ACAN).
5A and 5B show human inferior turbinate-derived mesenchymal stem cells (serum free cultivation), which were differentiated in a bone differentiation medium without the serum of a heterogeneous animal, after culturing in a medium without the addition of serum from a heterogeneous animal, and cultured by a conventional method; Then, human inferior turbinate-derived mesenchymal stem cells (serum containing cultivation) differentiated in a bone differentiation medium containing a heterologous antigen were treated with alkaline phosphatase. Comparative analysis of the ability to differentiate into osteocytes by analyzing the mRNA expression level (Fig. 5b) of bone differentiation-related genes (OC, Runx2, and COLI) through staining (Fig. 5a) and real-time PCR is a result
6A and 6B show human inferior turbinate-derived mesenchymal stem cells (serum free cultivation) that were differentiated in an adipose differentiation medium without the serum of a heterogeneous animal after culturing in a medium not added with serum from a heterologous animal, and cultured using a conventional method; After that, human inferior turbinate-derived mesenchymal stem cells (serum containing cultivation) differentiated in an adipose differentiation medium containing a heterologous antigen were subjected to Oil-red O. This is the result of comparative analysis of the ability to differentiate into adipocytes by analyzing the generation of fat-specific bodies through staining (FIG. 6a) and the mRNA expression levels of adipogenic differentiation-related genes (PPARG and ACSS2) (FIG. 6b) through real-time PCR. .

본 발명자들은 사람 하비갑개 조직에서 분리한 중간엽 줄기세포를 향후 실제 임상적용의 용이성을 위해 이종 항원 및 단백질이 첨가되지 않은 배지를 이용하여 배양하였으며, 상기 배양된 중간엽 줄기세포는 원래 세포의 특성 및 각각 연골세포, 골세포, 또는 지방세포로의 분화능이 유지 및 향상되는 것을 확인하였는바, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다. The present inventors cultured the mesenchymal stem cells isolated from the human inferior turbinate tissue using a medium to which heterologous antigens and proteins are not added for ease of future clinical application, and the cultured mesenchymal stem cells have the characteristics of the original cells. And it was confirmed that the ability to differentiate into chondrocytes, osteocytes, or adipocytes, respectively, was maintained and improved. Based on this, the present invention was completed.

이에, 본 발명은 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포를 이종 동물 혈청이 첨가되지 않은 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포의 배양방법을 제공한다. Accordingly, the present invention provides a method for culturing human inferior turbinate-derived mesenchymal stem cells, comprising the step of culturing the human inferior turbinate-derived mesenchymal stem cells in a medium not added with heterologous animal serum.

본 발명에서 사용되는 용어 "줄기세포(stem cell)"란, 개체를 구성하는 세포나 조직의 근간이 되는 세포로서 그 특징은 반복 분열하여 자가 재생(self-renewal)할 수 있고, 환경에 따라 특정한 기능을 지닌 세포로 분화할 수 있는 다분화 능력을 갖는 세포를 의미한다. 태아의 발생과정 중 모든 조직에서 생겨나며, 성인이 되어서도 골수, 상피조직 등 세포가 활발히 교체되는 일부 조직에서 발견된다. 줄기세포는 분화 가능한 세포의 종류에 따라 수정란이 첫 분열을 시작할 때 형성되는 전능성 줄기세포(totipotent stem cells)와, 이 세포들이 계속 분열해 만들어진 포배 내막에 있는 만능성 줄기세포(pluripotent stem cells), 그리고 성숙한 조직과 기관 속에 존재하는 다능성 줄기세포(multipotent stem cells)로 분류된다. 이때, 다능성 줄기세포는, 이 세포가 포함되어 있는 조직 및 기관에 특이적인 세포로만 분화할 수 있는 세포로써 태아기, 신생아기 및 성체기의 각 조직 및 장기의 성장과 발달은 물론 성체조직의 항상성 유지와 조직 손상 시 재생을 유도하는 기능에 관여하고 있다. 이러한 조직 특이적 다능성 세포들을 총칭하여 성체 줄기세포라고도 한다.The term "stem cell" as used in the present invention is a cell that is the basis of cells or tissues constituting an individual, and its characteristics are capable of self-renewal by repeated division, and are specific according to the environment. It refers to a cell having a multidifferentiation ability capable of differentiating into a cell having a function. It occurs in all tissues during the development of the fetus and is found in some tissues where cells are actively replaced, such as bone marrow and epithelial tissue, even in adulthood. Stem cells are totipotent stem cells, which are formed when a fertilized egg starts dividing, and pluripotent stem cells in the blastocyst, which are formed by continuing division of these cells, depending on the type of differentiated cell. And they are classified as multipotent stem cells that exist in mature tissues and organs. At this time, pluripotent stem cells are cells that can be differentiated only into cells specific to the tissues and organs that contain these cells. It is involved in maintenance and inducing regeneration in the event of tissue damage. These tissue-specific pluripotent cells are collectively referred to as adult stem cells.

성체 줄기세포로 분류되는 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell)는 재생의학의 재료로 각광받고 있는 세포로, 골수, 제대혈, 지방조직, 탯줄 등의 조직에서 채취될 수 있으며, 혈액 줄기세포와 달리 지방세포, 골세포, 연골세포, 신경세포, 심근세포 등 다양한 인체 조직을 구성하는 세포로의 분화능을 가진다. 본 발명에서는 사람 하비갑개 조직으로부터 분리한 중간엽 줄기세포를 이용하였다.Mesenchymal stem cells, classified as adult stem cells, are cells that are attracting attention as materials for regenerative medicine. They can be collected from tissues such as bone marrow, umbilical cord blood, adipose tissue, and umbilical cord. It has the ability to differentiate into cells constituting various human tissues, such as cells, osteocytes, chondrocytes, nerve cells, and cardiomyocytes. In the present invention, mesenchymal stem cells isolated from human inferior turbinate tissue were used.

본 발명에 있어서, 이종 동물 혈청이란 세포의 배양 및 분화에 이용될 수 있는 인간을 제외한 동물에서 유래한 혈청을 의미하며, 보다 바람직하게는 널리 사용되는 소태아 혈청(fetal bovine serum; FBS) 또는 송아지 태아 혈청(fetal calf serum; FCS)을 포함하나, 보다 넓은 의미로 인간을 제외한 동물 유래 항원 또는 단백질이 포함된 물질을 의미한다.In the present invention, the heterologous animal serum means a serum derived from an animal other than a human that can be used for cell culture and differentiation, and more preferably, fetal bovine serum (FBS) or calf widely used. It includes fetal calf serum (FCS), but in a broader sense refers to a substance containing an antigen or protein derived from animals other than humans.

본 발명에 있어서, 상기 이종 동물 혈청이 첨가되지 않은 배지는 재조합된 PDGF-BB(human platelet-derived growth factor-BB), bFGF(basic fibroblast growth factor), 및 TGF-β1(transforming growth factor-β1)를 주요 구성성분으로 포함하며, StemPro SFM XenoFree을 이용할 수 있으나, 이것으로 제한되는 것은 아니다. In the present invention, the medium to which the heterologous animal serum is not added is recombinant human platelet-derived growth factor-BB (PDGF-BB), basic fibroblast growth factor (bFGF), and transforming growth factor-β1 (TGF-β1). As a major component, StemPro SFM XenoFree can be used, but is not limited thereto.

상기 배양은 1주 내지 3주 동안 수행될 수 있고, 보다 바람직하게는 2주 내지 3주 동안 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. The culture may be performed for 1 to 3 weeks, more preferably 2 to 3 weeks, but is not limited thereto.

상기 이종 동물 혈청이 첨가되지 않은 배지에서 배양하는 단계 이전에, 인간 유래 성분으로 이루어진 기질로 코팅된 배양플레이트에 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포를 올리고 슬라이드 글라스로 덮어 부착시키는 단계를 더 포함할 수 있으며, 상기 기질은 CELLstart CTS Attachment substrate 또는 인간 혈장 피브로넥틴(human plasma fibronectin)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.Prior to the step of culturing in a medium to which the heterogeneous animal serum is not added, the method may further include attaching human inferior turbinate-derived mesenchymal stem cells to a culture plate coated with a substrate made of a human-derived component and covering it with a slide glass. And, the substrate may be a CELLstart CTS Attachment substrate or human plasma fibronectin, but is not limited thereto.

본 발명의 실시예에서는 상기와 같은 본 발명의 배양방법에 따라 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포를 배양하고, 기존의 방법인 이종 동물 혈청을 첨가한 배지로 배양한 세포와 그 특성을 비교분석하였다. In an embodiment of the present invention, human inferior turbinate-derived mesenchymal stem cells were cultured according to the culturing method of the present invention as described above, and the characteristics were compared and analyzed with cells cultured in a medium supplemented with heterologous animal serum, which is a conventional method. .

본 발명의 일실시예에서는, 본 발명에 따른 배양방법에 따라 배양한 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포 및 기존의 방법으로 배양한 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포를 각각 현미경으로 관찰한 결과 세포가 동일하게 방추형의 섬유모세포의 형태를 갖는 것을 확인하였다(실시예 1 참조). In one embodiment of the present invention, as a result of observing the human inferior turbinate-derived mesenchymal stem cells cultured according to the culture method according to the present invention and the human inferior turbinate-derived mesenchymal stem cells cultured by the conventional method under a microscope, respectively, the cells Similarly, it was confirmed to have a spindle-shaped fibroblast morphology (see Example 1).

본 발명의 다른 실시예에서는, 상기 두 가지 방법에 따라 배양한 중간엽 줄기세포에 대하여 유세포 분석을 통해 세포 표면의 표지자(CD14, CD19, CD29, CD34, CD73, CD90 및 HLA-DR)의 발현수준을 분석한 결과, 동일하게 조혈모세포 표지자인 CD14, CD19, 및 CD34는 100% 음성을 나타내었고, 중간엽 줄기세포의 표지자인 CD29, CD73, 및 CD90은 거의 100% 양성임을 확인함으로써 본 발명에 따른 배양방법으로 배양한 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포는 원래 세포의 특성이 유지되는 것을 알 수 있었으며, 조직적합성 항원인 HLA에 대해 100% 음성임을 관찰함으로써 인체 적합성에 면역학적 문제점이 없음을 확인하였다(실시예 2 참조). In another embodiment of the present invention, the expression level of cell surface markers (CD14, CD19, CD29, CD34, CD73, CD90 and HLA-DR) through flow cytometry analysis of mesenchymal stem cells cultured according to the above two methods. As a result of the analysis, the same hematopoietic stem cell markers CD14, CD19, and CD34 were 100% negative, and the mesenchymal stem cell markers CD29, CD73, and CD90 were almost 100% positive. Human inferior turbinate-derived mesenchymal stem cells cultured by the culture method were found to maintain original cell characteristics, and by observing that they were 100% negative for HLA, a histocompatibility antigen, it was confirmed that there were no immunological problems with human compatibility. (See Example 2).

본 발명의 또 다른 실시예에서는, 상기 두 가지 방법에 따라 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포를 7일 동안 배양하면서 세포증식능을 측정한 결과 배양 초기에는 증식능이 다소 떨어지나 배양 후기에는 상기 두 가지 방법으로 배양한 세포의 증식능이 유사하게 나타나는 것을 확인하였다(실시예 3 참조).In another embodiment of the present invention, as a result of measuring cell proliferative capacity while culturing human inferior turbinate-derived mesenchymal stem cells for 7 days according to the above two methods, the proliferative capacity is somewhat decreased at the beginning of the culture, but the proliferative capacity is somewhat decreased at the end of the culture by the above two methods. It was confirmed that the proliferative ability of the cultured cells was similar (see Example 3).

상기 실시예 결과들을 통해 본 발명에 따른 이종 동물 혈청이 첨가되지 않은 배지로 배양한 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포는 원래 세포의 특성 및 세포증식능이 유지되는 것을 확인하였으며, 이를 통해 이종 동물 혈청이 첨가되지 않은 배지를 이용한 배양방법이 이용 가능함을 알 수 있었다.Through the results of the above examples, it was confirmed that the original cell characteristics and cell proliferation ability of human inferior turbinate-derived mesenchymal stem cells cultured in the medium without the addition of heterologous animal serum according to the present invention were maintained, and through this, it was confirmed that the heterogeneous animal serum It was found that a culture method using an unadded medium is available.

본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 (a) 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포를 이종 동물 혈청이 첨가되지 않은 배지에서 배양하는 단계; 및In another aspect of the present invention, the present invention comprises the steps of (a) culturing human inferior turbinate-derived mesenchymal stem cells in a medium not added with xenogeneic animal serum; and

(b) 상기 배양된 중간엽 줄기세포를 이종 동물 혈청이 첨가되지 않은 연골 분화배지에서 배양하는 단계를 포함하는 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포로부터 연골세포로의 분화방법을 제공한다.(B) provides a method for differentiation from human inferior turbinate-derived mesenchymal stem cells into chondrocytes, comprising the step of culturing the cultured mesenchymal stem cells in a cartilage differentiation medium not added with xenogeneic animal serum.

상기 연골 분화배지는 DMEM 배지에 인슐린 성장인자(insulin growth factor-1; IGF-1), 덱사메타손(dexamethasone), 아스코르브산-2 인산(ascorbate-2 phosphate), 인슐린-트랜스페린 아셀렌산나트륨(Insulin-transferrin sodium selenite), 피루브산나트륨(sodium pyrubate), 프롤린(proline), L-글루타민(L-glutaime), 재조합된 PDGF-BB(human platelet-derived growth factor-BB), bFGF(basic fibroblast growth factor), 및 TGF-β1(transforming growth factor-β1)가 포함된 것일 수 있고, 바람직하게는 StemPro® chondrogenesis Differentiation Kit일 수 있으나, 본 발명에 따른 배양방법으로 배양한 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포를 연골세포로 분화시킬 수 있는 이종 항원이 포함되지 않은 배지라면 그 종류가 제한되지 않는다. The cartilage differentiation medium is DMEM medium with insulin growth factor-1 (IGF-1), dexamethasone, ascorbate-2 phosphate, insulin-transferrin sodium selenite (Insulin- transferrin sodium selenite), sodium pyrubate, proline, L-glutamine (L-glutaime), recombinant human platelet-derived growth factor-BB (PDGF-BB), basic fibroblast growth factor (bFGF), And TGF-β1 (transforming growth factor-β1) may be included, preferably StemPro® chondrogenesis Differentiation Kit, but human inferior turbinate-derived mesenchymal stem cells cultured by the culture method according to the present invention are chondrocytes The type is not limited as long as the medium does not contain a heterologous antigen that can be differentiated into

상기 연골 분화배지는 DMEM 배지에 인슐린 성장인자(insulin growth factor-1; IGF-1), 덱사메타손(dexamethasone), 아스코르브산-2 인산(ascorbate-2 phosphate), 인슐린-트랜스페린 아셀렌산나트륨(Insulin-transferrin sodium selenite), 피루브산나트륨(sodium pyrubate), 프롤린(proline), L-글루타민(L-glutaime), 재조합된 PDGF-BB(human platelet-derived growth factor-BB), bFGF(basic fibroblast growth factor), 및 TGF-β1(transforming growth factor-β1)가 포함된 것일 수 있고, 바람직하게는 StemPro® chondrogenesis Differentiation Kit일 수 있으나, 본 발명에 따른 배양방법으로 배양한 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포를 연골세포로 분화시킬 수 있는 이종 항원이 포함되지 않은 배지라면 그 종류가 제한되지 않는다. The cartilage differentiation medium is DMEM medium with insulin growth factor-1 (IGF-1), dexamethasone, ascorbate-2 phosphate, insulin-transferrin sodium selenite (Insulin- transferrin sodium selenite), sodium pyrubate, proline, L-glutamine (L-glutaime), recombinant human platelet-derived growth factor-BB (PDGF-BB), basic fibroblast growth factor (bFGF), And TGF-β1 (transforming growth factor-β1) may be included, preferably StemPro® chondrogenesis Differentiation Kit, but human inferior turbinate-derived mesenchymal stem cells cultured by the culture method according to the present invention are chondrocytes The type is not limited as long as the medium does not contain a heterologous antigen that can be differentiated into

또한, 본 발명은 (a) 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포를 이종 동물 혈청이 첨가되지 않은 배지에서 배양하는 단계; 및In addition, the present invention comprises the steps of (a) culturing human inferior turbinate-derived mesenchymal stem cells in a medium not added with xenogeneic animal serum; and

(b) 상기 배양된 중간엽 줄기세포를 이종 동물 혈청이 첨가되지 않은 골 분화배지에서 배양하는 단계를 포함하는 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포로부터 골세포로의 분화방법을 제공한다.(b) provides a method for differentiation from human inferior turbinate-derived mesenchymal stem cells into osteocytes, comprising the step of culturing the cultured mesenchymal stem cells in a bone differentiation medium not added with xenogeneic animal serum.

상기 골 분화배지는 DMEM 배지에 페니실린(penicillin), 스트렙토마이신(streptomycin), 덱사메타손(dexamethasone), 아스코르브산-2 인산(ascorbate-2 phosphate), 베타-글리세로포스페이트(β-glycerophosphate), 재조합된 PDGF-BB(human platelet-derived growth factor-BB), bFGF(basic fibroblast growth factor), 및 TGF-β1(transforming growth factor-β1)가 포함된 것일 수 있고, 바람직하게는 StemPro® osteogenesis Differentiation Kit일 수 있 수 있으나, 본 발명에 따른 배양방법으로 배양한 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포를 골세포로 분화시킬 수 있는 이종 항원이 포함되지 않은 배지라면 그 종류가 제한되지 않는다. The bone differentiation medium is DMEM medium with penicillin, streptomycin, dexamethasone, ascorbate-2 phosphate, beta-glycerophosphate, recombinant PDGF -BB (human platelet-derived growth factor-BB), bFGF (basic fibroblast growth factor), and TGF-β1 (transforming growth factor-β1) may be included, preferably StemPro® osteogenesis Differentiation Kit. However, as long as the medium does not contain a heterologous antigen capable of differentiating human inferior turbinate-derived mesenchymal stem cells cultured by the culture method according to the present invention into osteocytes, the type is not limited.

또한, 본 발명은 (a) 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포를 이종 동물 혈청이 첨가되지 않은 배지에서 배양하는 단계; 및In addition, the present invention comprises the steps of (a) culturing human inferior turbinate-derived mesenchymal stem cells in a medium not added with xenogeneic animal serum; and

(b) 상기 배양된 중간엽 줄기세포를 이종 동물 혈청이 첨가되지 않은 지방 분화배지에서 배양하는 단계를 포함하는 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포로부터 지방세포로의 분화방법을 제공한다.(b) provides a method for differentiation from human inferior turbinate-derived mesenchymal stem cells into adipocytes, comprising the step of culturing the cultured mesenchymal stem cells in an adipose differentiation medium not added with xenogeneic animal serum.

상기 지방 분화배지는 DMEM 배지에 인슐린(insulin), 인도메타신(indomethacin), 덱사메타손(dexamethasone), 3-이소부틸-1-메틸잔틴(3-isobutyl-1-methylxanthine), 재조합된 PDGF-BB(human platelet-derived growth factor-BB), bFGF(basic fibroblast growth factor), 및 TGF-β1(transforming growth factor-β1)이 포함된 것일 수 있고, 바람직하게는 StemPro® adipogenesis Differentiation Kit일 수 있으나, 본 발명에 따른 배양방법으로 배양한 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포를 지방세포로 분화시킬 수 있는 이종 항원이 포함되지 않은 배지라면 그 종류가 제한되지 않는다.The fat differentiation medium is DMEM medium with insulin, indomethacin, dexamethasone, 3-isobutyl-1-methylxanthine, and recombinant PDGF-BB ( Human platelet-derived growth factor-BB), basic fibroblast growth factor (bFGF), and transforming growth factor-β1 (TGF-β1) may be included, and preferably StemPro® adipogenesis Differentiation Kit, but the present invention The type is not limited as long as the medium does not contain a heterologous antigen that can differentiate human inferior turbinate-derived mesenchymal stem cells into adipocytes cultured by the culture method according to

본 발명에 있어서, 상기 단계 (a) 이전에 인간 유래 성분으로 이루어진 기질로 코팅된 배양플레이트에 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포를 올리고 슬라이드 글라스로 덮어 부착시키는 단계를 더 포함할 수 있다.In the present invention, the method may further include attaching human inferior turbinate-derived mesenchymal stem cells to a culture plate coated with a substrate made of a human component before step (a) and attaching the mesenchymal stem cells to a slide glass.

상기 단계 (a) 또는 (b)에서 배양은 1 내지 3주 동안 수행될 수 있으며, 보다 바람직하게는 2 내지 3주 동안 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.The culturing in step (a) or (b) may be performed for 1 to 3 weeks, and more preferably, may be performed for 2 to 3 weeks, but is not limited thereto.

본 발명에서 사용되는 용어, "분화(differentiation)"란 초기 단계의 상기 줄기세포가 각 조직으로서의 특성을 갖게 되는 과정을 일컫는 것으로서, 본 발명의 목적상 연골세포, 골세포, 또는 지방세포로서의 특성을 지니게 되는 것을 의미한다. As used herein, the term "differentiation" refers to a process in which the stem cells in the initial stage have characteristics as individual tissues, and for the purpose of the present invention, characteristics as chondrocytes, osteocytes, or adipocytes are obtained. means to have

본 발명의 실시예에서는, 본 발명에 따른 이종 동물 혈청이 첨가되지 않은 배지 또는 기존의 이종 동물 혈청이 첨가된 배지로 배양한 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포를 대상으로 각각의 연골세포, 골세포, 또는 지방세포로의 분화능을 비교분석하였다.In an embodiment of the present invention, each of chondrocytes and osteocytes is targeted to human inferior turbinate-derived mesenchymal stem cells cultured in a medium to which a heterologous animal serum according to the present invention is not added or a medium to which an existing heterologous animal serum is added. , or the ability to differentiate into adipocytes was comparatively analyzed.

본 발명의 일실시예에서는, 본 발명에 따른 방법으로 배양한 상기 중간엽 줄기세포를 이종 동물 혈청이 첨가되지 않은 연골 분화배지를 이용하여 분화시키거나, 기존의 방법으로 배양한 상기 중간엽 줄기세포를 이종 항원이 포함된 연골 분화배지를 이용하여 분화시킨 후 Toluidine blue-O 염색을 통해 연골 특이적 기질 생성 정도 및 연골 분화관련 유전자인 type I collagen(COLI)과 aggrecan(ACAN)의 mRNA 발현수준을 비교분석하였다. 그 결과, 기질 생성 정도는 유사하였으며, 상기 유전자들의 발현수준은 본 발명에 따른 방법으로 분화시킨 경우 낮게 측정되었으나 시간 경과에 따른 발현량 증가는 유사하게 나타나 연골 분화가 진행되는 것을 확인하였다(실시예 4 참조). In one embodiment of the present invention, the mesenchymal stem cells cultured by the method according to the present invention are differentiated using a cartilage differentiation medium not added with xenogeneic animal serum, or the mesenchymal stem cells cultured by the conventional method were differentiated using a chondrogenic differentiation medium containing a heterologous antigen, and the level of cartilage-specific matrix production and the mRNA expression levels of type I collagen (COLI) and aggrecan (ACAN), which are genes related to cartilage differentiation, were measured through Toluidine blue-O staining. Comparative analysis was performed. As a result, the level of matrix production was similar, and the expression level of the genes was measured to be low when differentiated by the method according to the present invention, but the increase in expression level over time was similar, confirming that cartilage differentiation proceeded (Example) see 4).

본 발명의 다른 실시예에서는, 상기 연골 분화능 분석과 유사한 방법으로 실험을 진행하는 대신 골 분화를 위해 이종 동물 혈청이 첨가되지 않은 골 분화배지를 이용하여 분화시키거나, 이종 항원이 포함된 골 분화배지를 이용하여 분화시킨 후 알칼리성 인산가수분해효소 염색을 통해 골 특이적 기질 생성 정도 및 골 분화관련 유전자인 osteocalcin(OC), Runt-related transcription factor 2(Runx2), 및 type I collagen(COLI)의 mRNA 발현수준을 비교분석하였다. 그 결과, 골 특이적 기질 생성 정도는 유사한 반면에 본 발명에 따른 방법으로 분화시킨 중간엽 줄기세포의 경우 골 분화관련 유전자들의 발현수준이 유의하게 높게 측정되었으며, 시간 경과에 따른 발현량 증가를 통해 골 분화가 진행되는 것을 확인하였다(실시예 5 참조). In another embodiment of the present invention, instead of proceeding with the experiment in a method similar to the analysis of cartilage differentiation ability, differentiation is performed using a bone differentiation medium not added with a heterologous animal serum for bone differentiation, or a bone differentiation medium containing a heterologous antigen. mRNA of osteocalcin (OC), Runt-related transcription factor 2 (Runx2), and type I collagen (COLI), which are genes related to bone differentiation and the degree of bone-specific matrix production through alkaline phosphatase staining after differentiation using Expression levels were comparatively analyzed. As a result, while the degree of bone-specific matrix production was similar, in the case of mesenchymal stem cells differentiated by the method according to the present invention, the expression level of bone differentiation-related genes was measured to be significantly higher, It was confirmed that bone differentiation proceeds (see Example 5).

본 발명의 또 다른 실시예에서는, 상기 연골 분화능 분석과 유사한 방법으로 실험을 진행하는 대신 지방 분화를 위해 이종 동물 혈청이 첨가되지 않은 지방 분화배지를 이용하여 분화시키거나, 이종 항원이 포함된 지방 분화배지를 이용하여 분화시킨 후 Oil red O 염색을 통해 지방 특이적 소체 생성 정도 및 지방 분화관련 유전자인 peroxisome proliferator activated receptor r(PPARG) 와 AcylCoA synthetase(ACSS2) mRNA의 발현수준을 비교분석하였다. 그 결과, 지방 특이적 소체의 생성 정도는 유사하게 나타난 반면 본 발명에 따른 방법으로 분화시킨 중간엽 줄기세포의 경우 지방 분화관련 유전자들의 발현수준이 유의하게 높게 측정되었으며, 시간 경과에 따른 발현량 증가를 통해 지방 분화가 진행되는 것을 확인하였다(실시예 6 참조).In another embodiment of the present invention, instead of proceeding with the experiment in a method similar to the analysis of cartilage differentiation ability, differentiation is performed using an adipose differentiation medium not added with heterologous animal serum for adipogenesis or adipogenic differentiation containing a heterologous antigen. After differentiation using a medium, the level of adipose-specific body production and the expression levels of peroxisome proliferator activated receptor r (PPARG) and AcylCoA synthetase (ACSS2) mRNA, which are genes related to adipogenesis, were comparatively analyzed through Oil red O staining. As a result, while the level of adipose-specific body production was similar, in the case of mesenchymal stem cells differentiated by the method according to the present invention, the expression level of the adipogenic differentiation-related genes was significantly higher, and the expression level increased with time. It was confirmed that fat differentiation proceeds through (see Example 6).

상기 실시예 결과들을 통해, 이종 동물 혈청이 첨가되지 않은 배지에서 배양한 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포는 연골세포, 골세포, 또는 지방세포로의 분화능이 그대로 유지되며, 이종 동물 혈청이 없는 각각의 분화배지를 이용하여 분화시키는 경우 특히 골세포 또는 지방세포로의 분화능이 향상되는 것을 확인하였다.Through the results of the above examples, human inferior turbinate-derived mesenchymal stem cells cultured in a medium not added with xenogeneic animal serum maintain their differentiation ability into chondrocytes, osteocytes, or adipocytes, and each In the case of differentiation using a differentiation medium, it was confirmed that, in particular, the ability to differentiate into osteocytes or adipocytes was improved.

이에, 본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 본 발명에 따른 방법으로 분화된 연골세포 및 상기 연골세포를 유효성분으로 포함하는 연골 손상질환 치료용 조성물을 제공한다. Accordingly, as another aspect of the present invention, the present invention provides chondrocytes differentiated by the method according to the present invention and a composition for treating cartilage damage disease comprising the chondrocytes as an active ingredient.

상기 연골 손상질환은 퇴행성 관절염, 류마티스성 관절염, 또는 외상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. The cartilage damage disease may be degenerative arthritis, rheumatoid arthritis, or trauma, but is not limited thereto.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 방법으로 분화된 골세포 및 상기 골세포를 유효성분으로 포함하는 골 손상질환 또는 골대사성 질환 치료용 조성물을 제공한다.In addition, the present invention provides a composition for treating bone damage or a metabolic disease comprising osteocytes differentiated by the method according to the present invention and the osteocytes as an active ingredient.

상기 골 손상질환 또는 골대사성 질환은 골의 파괴 흡수가 과대하여 생리적 병리상태를 초래하는 질환을 의미하며, 바람직하게는 골다공증, 유방암 또는 전립선암 등 종양이 뼈로 전이된 뼈전이암 병소(bone metastatic lesion), 원발성으로 뼈에 생성된 종양, 치주질환, 염증성 치조골 흡수 질환, 염증성 뼈 흡수 질환, 또는 파게트 질병(Paget’s disease)를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. The bone damage disease or bone metabolic disease means a disease in which excessive bone destruction and resorption causes a physiological pathology, and preferably, a bone metastatic lesion in which a tumor such as osteoporosis, breast cancer or prostate cancer has metastasized to bone. ), a primary bone-generated tumor, periodontal disease, inflammatory alveolar bone resorption disease, inflammatory bone resorption disease, or Paget's disease, but is not limited thereto.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 방법으로 분화된 지방세포 및 상기 지방세포를 포함하는 피부조직 재생을 위한 지방세포 이식용 조성물을 제공한다. The present invention also provides a composition for transplantation of adipocytes differentiated by the method according to the present invention and a composition for transplantation of adipocytes for skin tissue regeneration comprising the adipocytes.

상기 지방세포 이식은 나이로 인하여 노화된 피부의 주름 개선을 비롯하여, 입술선, 턱선, 이마선의 교정, 코 성형 등에 사용되고 있으며, 화상이나 상처로 인하여 함목된 피부, 암 절제 수술로 상실된 부분 등에도 이식함으로써 결함 부위를 교정하는 수술로 이용되고 있다. The fat cell transplantation is used to improve wrinkles of aging skin due to age, correction of the lip line, jaw line, forehead line, nose surgery, etc. It is used as a surgical procedure to correct defects.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다. Hereinafter, preferred examples are presented to help the understanding of the present invention. However, the following examples are only provided for easier understanding of the present invention, and the contents of the present invention are not limited by the following examples.

[실시예][Example]

실시예 1. 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포의 분리 및 배양Example 1. Isolation and culture of human inferior turbinate-derived mesenchymal stem cells

본 연구에 이용한 하비갑개 조직은 하비갑개절제술 시행과정에서 얻어진 것으로써 수술 전 환자의 동의하에 이용하였다. 하비갑개 조직을 채취한 직후 젠타마이신(gentamicin)(국제약품공업, 성남, 대한민국)이 포함된 생리식염수로 3-5회 세척한 후 상기 조직으로부터 섬유모세포를 분리하였다. The inferior turbinate tissue used in this study was obtained during inferior turbinate resection and was used with the consent of the patient before surgery. Immediately after harvesting the inferior turbinate tissue, the fibroblasts were isolated from the tissue after washing 3-5 times with physiological saline containing gentamicin (Kukje Pharmaceutical Co., Ltd., Seongnam, Korea).

사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포의 분리를 위해 수술과정에서 제거된 하비갑개 조직을 4℃에서 냉장 보관하였고, 상기 조직을 실온에서 항생-항진균 용액(Gibco, Gaithersberg, MD)으로 3회 세척하였다. 이를 다시 중성의 인산완충용액(phosphate buffered saline; PBS)으로 2회 세척한 후 작은 수술용 가위를 이용하여 1 ㎜3 크기로 잘게 절단하였다. 이후 절단한 조직의 배양을 위해, 먼저 100 ㎜ 배양용 접시에 인간 유래 성분만 함유한 기질로써 중간엽 줄기세포의 부착을 도와주는 CELLstart CTS Attachment Substrate(Cat.no. A1014201, Invitrogen) 또는 5 ㎍/cm2의 인간 혈장 피브로넥틴(human plasma fibronectin)을 얇게 씌우고(coating), 상기 방법으로 잘게 절단한 하비갑개 조직을 배양용 접시 위에 놓고 소독된 슬라이드 글라스로 덮어 배양용 접시에 유착시킨 후 재조합된 PDGF-BB(human platelet-derived growth factor-BB), bFGF(basic fibroblast growth factor), 및 TGF-β1(transforming growth factor-β1)를 주요 구성성분으로 포함하는 StemPro SFM XenoFree 배양액(Cat.no. A10675, Invitrogen)에 200 mM L-글루타민(Cat.no. 25030, Invitrogen)을 첨가한 배지를 넣어 37℃, 5% CO2 조건의 배양기에서 배양하였다. 2-3주 동안 배양한 후, 슬라이드 글라스를 제거하고 배양액에 부유하는 세포를 세척하여 버린 다음 배양용 접시 바닥에 부착된 사람 하비갑개 유래 중간엽 기질세포를 얻었다. 계대배양 시에는 접시에 붙은 세포를 떼어 내기 위해 일반적으로 사용하는 돼지혈청 유래 트립신(trypsin) 대신 동물 유래 성분이 없는 TryplE Select 10X(Gibco, cat.no. A12177-01)을 사용하였고, 3대까지 계대배양하여 본 실험에 이용하였다.For the isolation of human inferior turbinate-derived mesenchymal stem cells, the inferior turbinate tissue removed during surgery was refrigerated at 4° C., and the tissue was washed three times with an antibiotic-antifungal solution (Gibco, Gaithersberg, MD) at room temperature. This was again washed twice with neutral phosphate buffered saline (PBS), and then cut into pieces of 1 mm 3 using small surgical scissors. Afterwards, for culturing the cut tissue, CELLstart CTS Attachment Substrate (Cat.no. A1014201, Invitrogen) or 5 μg/ cm 2 A thin layer of human plasma fibronectin is coated (coating), and the inferior turbinate tissue cut by the above method is placed on a culture dish, covered with a sterilized slide glass, and adhered to the culture dish. Then, the recombinant PDGF- StemPro SFM XenoFree culture medium (Cat.no. A10675, Invitrogen) containing human platelet-derived growth factor-BB (BB), basic fibroblast growth factor (bFGF), and transforming growth factor-β1 (TGF-β1) as main components ) was added with 200 mM L-glutamine (Cat.no. 25030, Invitrogen) and cultured in an incubator at 37°C and 5% CO 2 conditions. After culturing for 2-3 weeks, the slide glass was removed, the cells floating in the culture medium were washed and discarded, and human inferior turbinate-derived mesenchymal stromal cells attached to the bottom of the culture dish were obtained. During subculture, TryplE Select 10X (Gibco, cat.no. A12177-01) without animal-derived ingredients was used instead of trypsin derived from pig serum, which is generally used to remove cells attached to the plate, and up to 3 generations. Subculture was used in this experiment.

또한, 상기 이종 동물 혈청을 첨가하지 않은 무혈청 배양방법(serum free cultivation)과 더불어 기존의 중간엽 줄기세포의 배양방법인 혈청을 첨가하여 배양하는 방법(serum containing cultivation)도 동시에 진행을 하여 비교분석하였다. 보다 구체적으로, 사람 하비갑개 조직을 상기와 동일한 방법으로 잘게 절단한 후에 100 ㎜ 배양용 접시에 놓고 소독된 슬라이드 글라스로 덮어 배양용 접시에 유착시킨 후 10% 소태아 혈청(fetal bovine serum; FBS)이 포함된 DMEM 배지를 넣어 37℃, 5% CO2 조건의 배양기에서 배양하였다. 2-3주간의 배양 후 슬라이드 글라스를 제거하고 배양액에 부유하는 세포를 세척하여 버린 다음, 배양용 접시 바닥에 부착된 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포는 트립신을 사용해서 바닥으로부터 떼어내어 3대까지 계대배양한 세포를 사용하였다. 상기 두 가지 배양 방법을 통해서 얻어진 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포들을 현미경으로 관찰한 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이 모두 방추형의 섬유모세포 형태인 것을 확인하였다.In addition, in addition to the serum free cultivation method without adding the serum of the heterogeneous animal, the conventional method of culturing mesenchymal stem cells (serum containing cultivation) was performed simultaneously for comparative analysis. did. More specifically, the human inferior turbinate tissue is cut in the same way as above, placed on a 100 mm culture dish, covered with sterilized slide glass, and adhered to the culture dish, followed by 10% fetal bovine serum (FBS). The DMEM medium containing this was put in and cultured in an incubator at 37° C., 5% CO 2 condition. After 2-3 weeks of incubation, the slide glass is removed, the cells floating in the culture medium are washed and discarded, and the human inferior turbinate-derived mesenchymal stem cells attached to the bottom of the culture dish are removed from the bottom using trypsin and removed up to 3 generations. Cells subcultured were used. As a result of observing the human inferior turbinate-derived mesenchymal stem cells obtained through the above two culture methods under a microscope, it was confirmed that all of them were in the form of spindle-shaped fibroblasts, as shown in FIG. 1 .

실시예Example 2. 이종 동물 혈청이 첨가된 배지 없이 배양된 사람 2. Humans cultured without media supplemented with xenogeneic animal serum 하비갑개Harvey Turbines 유래 origin 중간엽mesenchymal 줄기 세포의of stem cells 특성 분석 Characterization

상기 실시예 1의 이종 동물 혈청이 포함된 배지를 이용하지 않고 분리 및 배양한 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포의 특성을 분석하기 위하여, 상기 방법으로 3대까지 계대배양한 중간엽 줄기세포를 계수하여 1ⅹ105 cells/㎖로 시험관에 분주하고, 중성의 PBS로 3회 세척하였다. 다음으로 FITC(Fluorescein Isothiocyanate)와 PE(Phycoerythrin)가 접합되어 있는 CD14, CD19, CD29, CD34, CD73, CD90 및 HLA-DR에 대한 1차 항체를 상기 세포에 처리하고 1시간 동안 반응시킨 후, PBS로 다시 3회 세척한 다음 유세포 분석(FACS Caliber, Becton Dickson, San Diego, CA)을 실시하였다. In order to analyze the characteristics of human inferior turbinate-derived mesenchymal stem cells isolated and cultured without using the medium containing the xenogeneic animal serum of Example 1, the mesenchymal stem cells subcultured up to three generations by the above method were counted. and 1×10 5 cells/ml were dispensed into test tubes, and washed 3 times with neutral PBS. Next, primary antibodies against CD14, CD19, CD29, CD34, CD73, CD90 and HLA-DR conjugated with FITC (Fluorescein Isothiocyanate) and PE (Phycoerythrin) were treated with the cells and reacted for 1 hour, followed by PBS After washing again 3 times with a flow cytometric analysis (FACS Caliber, Becton Dickson, San Diego, CA) was performed.

상기 방법으로 이종 동물 혈청이 첨가된 배지 없이 배양한 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포가 원래의 중간엽 줄기세포의 특성을 갖는지 확인한 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 조혈모세포의 표지자인 CD14, CD19, 및 CD34는 발현되지 않아 거의 100% 음성임을 확인하였고, 중간엽 줄기세포의 표면 표지자인 CD29, CD73, 및 CD90은 거의 100% 양성임을 관찰함으로써 상기 방법으로 배양한 중간엽 줄기세포가 원래의 특성을 갖는 것을 알 수 있었다. 또한, 조직적합성 항원인 HLA(Human leukocyte antigen) 표면 표지자에 대하여 100% 음성을 나타냄을 확인함으로써 인체 적합성에 면역학적 문제점이 없음을 중명할 수 있었다. As a result of confirming whether human inferior turbinate-derived mesenchymal stem cells cultured without a medium to which heterogeneous animal serum was added by the above method had the characteristics of the original mesenchymal stem cells, as shown in FIG. 2 , CD14, CD19, which are markers of hematopoietic stem cells , and CD34 were not expressed, so it was confirmed that they were almost 100% negative, and CD29, CD73, and CD90, which are surface markers of mesenchymal stem cells, were observed to be almost 100% positive. was found to have In addition, by confirming that it was 100% negative for the histocompatibility antigen, human leukocyte antigen (HLA) surface marker, it was possible to prove that there was no immunological problem in human compatibility.

또한, 상기와 같은 결과는 기존의 이종 동물 혈청이 첨가된 배지를 이용하여 배양한 중간엽 줄기세포에서의 표지자 발현 분석 결과와 동일한 것임을 확인하였다. In addition, it was confirmed that the above results are the same as the results of marker expression analysis in mesenchymal stem cells cultured using the existing medium to which heterogeneous animal serum was added.

실시예Example 3. 이종 동물 혈청이 첨가된 배지 없이 배양된 사람 3. Humans cultured without media supplemented with xenogeneic animal serum 하비갑개Harvey Turbines 유래 origin 중간엽mesenchymal 줄기세포의 세포 증식능 평가 Evaluation of cell proliferation ability of stem cells

세포를 활용하기 위해서는 배양을 통하여 충분한 양으로 증식되는 것이 중요하며 이와 관련해서 배지의 변화 시에 증식능의 증감을 분석하는 것은 중요하다. 따라서 상기 실시예 1의 방법으로 이종 동물 혈청이 첨가된 배지 없이 배양한 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포의 성장 곡선을 확인하고자 하였다. 이를 위해, 96-웰 플레이트에 상기 중간엽 줄기세포를 1500 cells/㎖씩 분주하고, 2-3일 간격으로 배양배지를 교환해 주었으며, 세포 증식능 분석을 위해 cell counting kit(CCK)-8(Dojindo Laboratories, Kumamoto, Japan)을 이용하였다. 세포의 배양배지를 제거하고 10 ㎕의 CCK-8 용액을 포함하는 100 ㎕의 배지를 각 웰에 첨가한 후 37℃에서 4시간 동안 배양하였으며, 세포의 생존율은 450 nm에서의 흡광도(optical density values)를 측정하였고, 7일 동안 측정하여 분석하였다.In order to utilize the cells, it is important to proliferate in a sufficient amount through culture, and in this regard, it is important to analyze the increase or decrease in proliferation ability when the medium is changed. Therefore, it was attempted to confirm the growth curve of human inferior turbinate-derived mesenchymal stem cells cultured without a medium to which heterologous animal serum was added by the method of Example 1. To this end, the mesenchymal stem cells were dispensed in a 96-well plate by 1500 cells/ml, the culture medium was exchanged every 2-3 days, and cell counting kit (CCK)-8 (Dojindo) for cell proliferation analysis. Laboratories, Kumamoto, Japan) were used. After removing the culture medium of the cells and adding 100 μl of a medium containing 10 μl of CCK-8 solution to each well, incubated at 37° C. for 4 hours, the viability of the cells was measured by absorbance at 450 nm (optical density values). ) was measured and analyzed for 7 days.

그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 초기 배양(4일 이내) 동안에는 이종 동물 혈청이 첨가된 배지 없이 배양한 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포의 증식능이 기존의 배양 방법하의 세포와 비교하여 유의하게 적었으나, 후기 배양(5일 이후)부터는 통계학적 차이가 없이 유사한 정도의 증식능을 보이는 것을 확인하였다.As a result, as shown in FIG. 3 , during the initial culture (within 4 days), the proliferative ability of human inferior turbinate-derived mesenchymal stem cells cultured without a medium to which heterologous animal serum was added was significantly higher than that of cells under the conventional culture method. However, it was confirmed that there was no statistical difference from the later culture (after 5 days) and showed a similar level of proliferative capacity.

실시예Example 4. 이종 동물 혈청이 첨가된 배지 없이 배양된 사람 4. Humans cultured without media supplemented with xenogeneic animal serum 하비갑개Harvey Turbines 유래 origin 중간엽mesenchymal 줄기세포의 연골 분화 유도능 분석 Analysis of Stem Cell Cartilage Differentiation Inducing Ability

상기 실시예 1의 이종 동물 혈청이 첨가된 배지 없이 배양된 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포의 연골세포로의 분화능을 분석하고자 하였다. 일반적으로 이용되는 연골세포로의 분화용 배지의 제조에는 이종 동물 혈청인 10% FBS가 포함되기 때문에 상기와 같은 혈청이 첨가된 배지를 사용하지 않고 배양한 중간엽 줄기세포의 연골 분화를 위해, 중간엽 줄기세포의 연골형성 경로에 기여하여 연골세포를 생성하도록 하는데 필요한 성분이 있으면서 이종 동물 혈청이 없는 StemPro® chondrogenesis Differentiation Kit(Gibco, cat.no. A1007101)를 사용하여 연골 분화배지를 제조하였다. 상기 연골 분화배지는 10-7 M 덱사메타손(dexamethasone), 50 ㎍/㎖ 아스코르브산(ascorbate), 50 ㎎/㎖ 인슐린-트랜스페린 아셀렌산나트륨(Insulin-transferrin sodium selenite), 100 ㎍/㎖ 피루브산나트륨(sodium pyrubate), 40 ㎍/㎖ 프롤린(proline), 2 mM L-글루타민(L-glutaime)이 포함된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Media, Gibco) 배지에 10% FBS 대신 재조합된 PDGF-BB(human platelet-derived growth factor-BB), bFGF(basic fibroblast growth factor), 및 TGF-β1(transforming growth factor-β1)가 포함된 것을 구성으로 한다. The differentiation ability of human inferior turbinate-derived mesenchymal stem cells cultured without the medium to which the heterologous animal serum of Example 1 was added into chondrocytes was analyzed. For the chondrogenic differentiation of mesenchymal stem cells cultured without using the serum-added medium as described above, intermediate A chondrogenesis medium was prepared using the StemPro® chondrogenesis Differentiation Kit (Gibco, cat.no. A1007101) that has the components necessary to generate chondrocytes by contributing to the chondrogenesis pathway of mesenchymal stem cells and free of xenogeneic animal serum. The cartilage differentiation medium is 10 -7 M dexamethasone, 50 μg/ml ascorbate, 50 mg/ml insulin-transferrin sodium selenite, 100 μg/ml sodium pyruvate ( Sodium pyrubate), 40 μg/ml proline, and 2 mM L-glutamine (Dulbecco's Modified Eagle Media, Gibco) in DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Media, Gibco) medium instead of 10% FBS. derived growth factor-BB), basic fibroblast growth factor (bFGF), and transforming growth factor-β1 (TGF-β1).

보다 구체적으로, 12-웰 플레이트에 상기 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포를 2×104 cells/웰씩 분주하고, 상기 연골 분화배지를 2-3일 간격으로 교체해주었으며, 연골 분화정도를 확인하기 위해 Toluidine blue-O 염색을 통한 조직학적 분석 및 real-time PCR을 실시하였다. More specifically, the human inferior turbinate-derived mesenchymal stem cells were dispensed in a 12-well plate at a rate of 2×10 4 cells/well, and the chondrogenic differentiation medium was replaced every 2-3 days, to determine the degree of cartilage differentiation. Histological analysis through Toluidine blue-O staining and real-time PCR were performed.

또한, 본 발명에 따른 중간엽 줄기세포의 연골세포로의 분화능과 비교분석하기 위하여, 기존의 방법으로 배양한 중간엽 줄기세포의 연골세포로의 분화능을 함께 분석하였다. 이를 위해, 10% FBS가 포함된 DMEM 배지에 10-7 M 덱사메타손(dexamethasone), 50 ㎍/㎖ 아스코르브산(ascorbate), 50 ㎎/㎖ 인슐린-트랜스페린 아셀렌산나트륨(Insulin-transferrin sodium selenite), 100 ㎍/㎖ 피루브산나트륨(sodium pyrubate), 40 ㎍/㎖ 프롤린(proline), 2 mM L-글루타민(L-glutaime)을 첨가하여 연골 분화배지를 제조하였고, 상기 방법과 동일하게 12-웰 플레이트에 기존의 방법으로 배양한 중간엽 줄기세포를 2×104 cells/웰 씩 분주한 후 상기 연골 분화배지를 2-3일 간격으로 교체하였으며, 이때 TGF-β1(10ng/㎖, Sigma) 및 IGF-I(10ng/㎖, Sigma)을 첨가해 주었다. 배양 2주 후 동일한 방법으로 연골 분화정도를 분석하였다.In addition, in order to compare and analyze the differentiation ability of the mesenchymal stem cells according to the present invention into chondrocytes, the differentiation ability of the mesenchymal stem cells cultured by the conventional method into chondrocytes was also analyzed. For this, 10 -7 M dexamethasone, 50 μg/ml ascorbate, 50 mg/ml insulin-transferrin sodium selenite in DMEM medium containing 10% FBS, 100 μg/ml sodium pyrubate, 40 μg/ml proline, and 2 mM L-glutamine (L-glutaime) were added to prepare a chondrogenic differentiation medium, and in the same manner as above, in a 12-well plate. After dispensing the mesenchymal stem cells cultured by the conventional method at 2×10 4 cells/well, the chondrogenic differentiation medium was replaced every 2-3 days, at which time TGF-β1 (10ng/ml, Sigma) and IGF- I (10ng/ml, Sigma) was added. After 2 weeks of culture, the degree of cartilage differentiation was analyzed in the same manner.

4-1. Toluidine blue-O 염색4-1. Toluidine blue-O staining

상기 두 가지 방법으로 각각 배양 및 분화시킨 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포를 배양 2주째에 통상적인 조직학적 방법에 따라 10% 포르말린(formalin)으로 고정한 후 파라핀에 포매하였고, 조직을 5㎛ 두께의 절편으로 제작한 다음 Toluidine blue-O 염색을 실시하여 조직샘플을 현미경으로 관찰하였으며, Spot software(Polaroid Digital Microscope Camera Ie v1.25, Polaroid, Waltham, MA)를 사용하여 디지털 영상을 촬영하였다.Human inferior turbinate-derived mesenchymal stem cells cultured and differentiated by the above two methods were fixed with 10% formalin according to a conventional histological method at the second week of culture and embedded in paraffin, Tissues were fabricated into sections with a thickness of 5 μm and then stained with Toluidine blue-O to observe the tissue samples under a microscope. was photographed.

그 결과, 도 4a에 나타낸 바와 같이, 푸르게 염색된 부분을 통해 연골세포로의 분화 배양을 통해 연골 특이적 기질이 생성된 것을 확인할 수 있는데, 본 발명에 따른 방법으로 배양한 후 역시 이종 동물 혈청이 없는 연골 분화배지에서 분화시킨 중간엽 줄기세포의 경우(serum free cultivation)와 기존의 방법으로 배양한 후 이종 항원이 포함된 연골 분화배지에서 분화시킨 중간엽 줄기세포의 경우(serum containing cultivation) 연골 특이적 기질이 유사한 정도로 생성된 것을 관찰하였다.As a result, as shown in Fig. 4a, it can be confirmed that a cartilage-specific matrix was generated through differentiation culture into chondrocytes through the blue-stained portion. In the case of mesenchymal stem cells differentiated in a cartilage differentiation medium without cartilage (serum free cultivation) and in the case of mesenchymal stem cells differentiated in a cartilage differentiation medium containing a heterologous antigen after culturing by the conventional method (serum containing cultivation), cartilage-specific It was observed that the red substrate was produced to a similar degree.

4-2. Real-time PCR 분석4-2. Real-time PCR analysis

상기 두 가지 방법으로 각각 배양 및 분화시킨 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포에 대하여 각각 배양 0일, 7일, 및 14일(2주)째에 RNeasy 미니 키트(QIAGEN, Valencia, CA, USA)를 사용해서 총 RNA를 추출하였고, deoxyribonuclease 1(QIAGEN)을 처리하여 게놈 DNA를 제거한 다음 1 ㎎의 정제 된 RNA는 게놈 DNA를 제거하는 단계(QIAGEN)를 포함하는 iScript reverse transcription kit(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)를 통해서 첫 번째 가닥과 상보적인 DNA로 역전사되도록 하였다. 상기 방법으로 추출한 RNA를 이용하여 cDNA를 합성한 후 연골 분화정도를 확인할 수 있는 type I collagen(COLI) 과 aggrecan(ACAN) 유전자의 mRNA 발현수준을 배양 0일, 7일, 및 14일째에 TaqMan 유전자 발현 분석법을 이용해 lightcycler 480 PCR system(Roche, Mannheim, Germany)으로 분석하였다. 모든 분석은 유사한 증폭 효율을 보였고 델타 사이클을 사용한 임계 실험 디자인을 상대적으로 정량을 위해서 사용하였다. 반응은 TaqMan probe Master Mix(Roche)를 사용하여 20 ㎖의 부피로 3회 반복수행 하였고, 10 ng의 보완 DNA를 각각의 반응에 이용하였다. GAPDH(Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase) 유전자의 발현수준을 함께 측정하여 내인성 대조군으로 사용하였으며, 결과는 lightcycler 480 instrument software 1.2(Roche)를 이용하여 분석 하였다. For human inferior turbinate-derived mesenchymal stem cells cultured and differentiated by the above two methods, respectively, RNeasy mini kit (QIAGEN, Valencia, CA, USA) was applied on days 0, 7, and 14 (2 weeks) of culture. Total RNA was extracted using the iScript reverse transcription kit (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) was reverse transcribed into DNA complementary to the first strand. After synthesizing cDNA using the RNA extracted by the above method, mRNA expression levels of type I collagen (COLI) and aggrecan (ACAN) genes, which can confirm the degree of cartilage differentiation, were measured on days 0, 7, and 14 of culture TaqMan gene. Expression analysis was performed using the lightcycler 480 PCR system (Roche, Mannheim, Germany). All assays showed similar amplification efficiencies and a critical experimental design using delta cycles was used for relative quantitation. The reaction was repeated three times in a volume of 20 ml using TaqMan probe Master Mix (Roche), and 10 ng of complementary DNA was used for each reaction. The expression level of GAPDH (Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase) gene was measured together and used as an endogenous control, and the results were analyzed using lightcycler 480 instrument software 1.2 (Roche).

그 결과, 도 4b에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 방법으로 배양한 후 역시 이종 동물 혈청이 없는 연골 분화배지에서 분화시킨 중간엽 줄기세포의 경우(serum free) 시간이 지남에 따라 연골 분화정도가 증가되는 양상을 보이는 것을 확인하였다. 비록 기존의 방법으로 배양한 후 이종 항원이 포함된 연골 분화배지에서 분화시킨 중간엽 줄기세포의 경우(Conventional)와 비교할 때 통계적으로 상기 유전자들의 mRNA 발현수준이 유의하게 적게 나타났으나, 시간 경과에 따라 증가되는 양상은 유사한 것을 알 수 있었다. As a result, as shown in FIG. 4B , the degree of cartilage differentiation decreased over time in the case of mesenchymal stem cells differentiated in a cartilage differentiation medium without serum of a heterogeneous animal after culturing by the method according to the present invention (serum free). It was confirmed that it showed an increasing pattern. Although the mRNA expression level of the above genes was statistically significantly lower than in the case of mesenchymal stem cells differentiated in a cartilage differentiation medium containing a heterologous antigen after culturing by the conventional method (Conventional), over time, It can be seen that the increasing pattern is similar.

실시예Example 5. 이종 동물 혈청이 첨가된 배지 없이 배양된 사람 5. Humans cultured without media supplemented with heterologous animal serum 하비갑개Harvey Turbines 유래 origin 중간엽mesenchymal 줄기세포의 골 분화 유도능 분석 Analysis of the osteogenic differentiation inducibility of stem cells

상기 실시예 1의 이종 동물 혈청이 첨가된 배지 없이 배양된 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포의 골세포로의 분화능을 분석하기 위해, 상기 실시예 4와 유사하게 중간엽 줄기세포의 골 형성 경로에 기여하여 골세포를 생성하도록 하는데 필요한 성분이 있으면서 이종 동물 혈청이 없는 StemPro® osteogenesis Differentiation Kit(Gibco, cat.no. A1007201)를 사용하여 골 분화배지를 제조하였다. 상기 골 분화배지는 보다 상세하게 DMEM 배지에 페니실린(penicillin), 스트렙토마이신(streptomycin), 덱사메타손(dexamethasone), 아스코르브산-2 인산(ascorbate-2 phosphate), 베타-글리세로포스페이트(β-glycerophosphate), 재조합된 PDGF-BB(human platelet-derived growth factor-BB), bFGF(basic fibroblast growth factor), 및 TGF-β1(transforming growth factor-β1)가 포함된 것을 구성으로 하고, 2주 동안의 배양기간 동안 2-3일 간격으로 교체해 주었으며, 배양 후 골 분화정도를 확인하기 위해 알칼리성 인산가수분해효소(Alkaline phosphatase) 염색 및 real-time PCR을 실시하였다.To analyze the differentiation ability of human inferior turbinate-derived mesenchymal stem cells cultured without the medium to which the heterologous animal serum of Example 1 was added into osteocytes, similarly to Example 4, the osteogenic pathway of mesenchymal stem cells was analyzed. A bone differentiation medium was prepared using the StemPro® osteogenesis Differentiation Kit (Gibco, cat.no. A1007201) that had the components necessary to contribute to the generation of osteocytes and was free from xenogeneic animal serum. In more detail, the bone differentiation medium is DMEM medium with penicillin, streptomycin, dexamethasone, ascorbate-2 phosphate, beta-glycerophosphate, It consists of a composition containing recombinant human platelet-derived growth factor-BB (PDGF-BB), basic fibroblast growth factor (bFGF), and transforming growth factor-β1 (TGF-β1), and during the culture period for 2 weeks They were replaced every 2-3 days, and after culture, alkaline phosphatase staining and real-time PCR were performed to check the degree of bone differentiation.

또한, 본 발명에 따른 중간엽 줄기세포의 골세포로의 분화능과 비교분석하기 위하여, 기존의 방법으로 배양한 중간엽 줄기세포의 골세포로의 분화능을 함께 분석하였다. 이를 위해, FBS가 포함되지 않은 DMEM 배지에 100 U/㎖ 페니실린(penicillin), 100 μg/㎖ 스트렙토마이신(streptomycin), 10-8 M 덱사메타손, 5 mM 베타-글리세포포스페이트(β-glycerophosphate), 및 50 ㎍/㎖ ascorbate-2-phosphate를 첨가하여 골 분화배지를 제조하였다. 이후 기존의 방법으로 배양한 중간엽 줄기세포를 이용해 상기와 동일한 방법으로 골 분화를 유도하고, 상기 골 분화배지를 2-3일 간격으로 교체하였으며 배양 2주 후 골 분화정도를 분석하였다.In addition, in order to compare and analyze the differentiation ability of the mesenchymal stem cells according to the present invention into osteocytes, the differentiation ability of the mesenchymal stem cells cultured by the conventional method into osteocytes was also analyzed. For this, 100 U/ml penicillin, 100 μg/ml streptomycin, 10 -8 M dexamethasone, 5 mM beta-glycerophosphate, and A bone differentiation medium was prepared by adding 50 μg/ml ascorbate-2-phosphate. Thereafter, bone differentiation was induced in the same manner as above using mesenchymal stem cells cultured by the conventional method, the bone differentiation medium was replaced every 2-3 days, and the degree of bone differentiation was analyzed after 2 weeks of culture.

5-1. 알칼리성 인산가수분해효소(Akaline phosphatase) 염색5-1. Akaline phosphatase staining

4웰 챔버 슬라이드에 각 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포를 1×104 ㎖씩 분주하고 2주 동안 각각의 골 분화배지를 이용해 분화를 유도하였다. 배양 2주째에 각 웰을 PBS로 1회 세척하고 멸균 3차 증류수로 3회 세척한 후 구연산-아세톤-포름알데하이드(citrate-acetone-formaldehyde) 고정액으로 15분 동안 세포를 고정시켰다. 이후 멸균 3차 증류수로 3회 세척하고, alkaline dye 혼합액(Nitrite, FRV-alkaline, Naphthol AS-BI alkaline siolution, Sigma)으로 빛을 차단한 상태에서 상온에서 15분간 염색하고, 멸균 3차 증류수로 다시 3회 세척한 후 도립현미경(inverted microscope)하에서 관찰하였다. 1×10 4 ml of each human inferior turbinate-derived mesenchymal stem cell was dispensed on a 4-well chamber slide, and differentiation was induced using each bone differentiation medium for 2 weeks. At the second week of culture, each well was washed once with PBS, washed three times with sterile tertiary distilled water, and then the cells were fixed with a citrate-acetone-formaldehyde fixative for 15 minutes. Afterwards, wash with sterile tertiary distilled water 3 times, dye with alkaline dye mixture (Nitrite, FRV-alkaline, Naphthol AS-BI alkaline siolution, Sigma) at room temperature for 15 minutes while blocking light, and then again with sterile tertiary distilled water After washing three times, it was observed under an inverted microscope.

그 결과, 도 5a에 나타낸 바와 같이, 상기 염색법을 통해 골 특이적 기질의 생성여부를 관찰할 수 있는데, 본 발명에 따른 방법으로 배양한 후 역시 이종 동물 혈청이 없는 골 분화배지에서 분화시킨 중간엽 줄기세포의 경우(serum free cultivation)와 기존의 방법으로 배양한 후 이종 항원이 포함된 골 분화배지에서 분화시킨 중간엽 줄기세포의 경우(serum containing cultivation) 골 특이적 기질이 유사한 정도로 생성된 것을 관찰하였다.As a result, as shown in FIG. 5A , the generation of a bone-specific matrix can be observed through the staining method. After culturing according to the method according to the present invention, the mesenchymal differentiated in a bone differentiation medium without serum of a heterogeneous animal. In the case of stem cells (serum free cultivation) and in the case of mesenchymal stem cells differentiated in a bone differentiation medium containing a heterologous antigen after culturing by the conventional method (serum containing cultivation), it was observed that a bone-specific matrix was generated to a similar degree. did.

5-2. Real-time PCR 분석5-2. Real-time PCR analysis

12-웰 플레이트에 각 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포를 2×104 ㎖씩 분주하고 2주 동안 각 골 분화배지를 이용해 분화를 유도하였다. 상기 두 가지 방법에 따라 배양한 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포의 골 분화 정도를 분석하기 위해, 배양된 세포들을 PBS로 수세하고 Ambion RNAqueous kit를 이용하여 Tri-ZolTMreagent 1 ㎖를 넣어 제조사의 방법에 따라 RNA를 추출하고, 상기 실시예 4-2와 동일한 방법으로 real-time PCR 분석을 실시하여 골 분화와 관련된 osteocalcin(OC), Runt-related transcription factor 2(Runx2), 및 type I collagen(COLI) mRNA의 발현수준을 각각 배양 0일, 7일, 및 14일째에 분석하였다. 2×10 4 ml of each human inferior turbinate-derived mesenchymal stem cell was dispensed in a 12-well plate, and differentiation was induced using each bone differentiation medium for 2 weeks. To analyze the degree of osteodifferentiation of human inferior turbinate-derived mesenchymal stem cells cultured according to the above two methods, the cultured cells were washed with PBS, and 1 ml of Tri-Zol TM reagent was added using the Ambion RNAqueous kit. RNA was extracted according to the method, and real-time PCR analysis was performed in the same manner as in Example 4-2 to perform osteocalcin (OC), Runt-related transcription factor 2 (Runx2), and type I collagen ( COLI) mRNA expression levels were analyzed on days 0, 7, and 14 of culture, respectively.

그 결과, 도 5b에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 방법으로 배양한 후 역시 이종 동물 혈청이 없는 연골 분화배지에서 분화시킨 중간엽 줄기세포의 경우(serum free) 시간이 지남에 따라 상기 3가지 유전자의 발현이 모두 증가하는 양상을 나타내는 것을 통해 상기 중간엽 줄기세포의 골 분화가 진행되는 것을 확인하였다. 또한, 기존의 방법으로 배양한 후 이종 항원이 포함된 골 분화배지에서 분화시킨 중간엽 줄기세포의 경우(Conventional)에 비하여 시간 경과에 따른 유전자 발현의 증가 양상이 매우 높게 나타났으며, 통계적으로도 유의하게 높게 발현되는 것을 확인하였다.As a result, as shown in FIG. 5B , in the case of mesenchymal stem cells differentiated in a cartilage differentiation medium without serum of a heterogeneous animal after culturing by the method according to the present invention (serum free), the three genes It was confirmed that bone differentiation of the mesenchymal stem cells proceeded through the expression of all increasing. In addition, compared to the case of mesenchymal stem cells differentiated in bone differentiation medium containing a heterologous antigen after culturing by the conventional method (Conventional), the increase in gene expression over time was found to be very high. It was confirmed that the expression was significantly high.

실시예Example 6. 이종 동물 혈청이 첨가된 배지 없이 배양된 사람 6. Humans cultured without media supplemented with xenogeneic animal serum 하비갑개Harvey Turbines 유래 origin 중간엽mesenchymal 줄기세포의 지방 분화 유도능 분석 Analysis of the ability of stem cells to induce adipogenesis

상기 실시예 1의 이종 동물 혈청이 첨가된 배지 없이 배양된 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포의 지방세포로의 분화능을 분석하기 위해, 상기 실시예 4와 유사하게 중간엽 줄기세포의 지방형성 경로에 기여하여 지방세포를 생성하도록 하는데 필요한 성분이 있으면서 이종 동물 혈청이 없는 StemPro® adipogenesis Differentiation Kit(Gibco, cat. no. A1007001)를 사용하여 지방 분화배지를 제조하였다. 상기 지방 분화배지는 보다 상세하게 DMEM 배지에 인슐린(insulin), 인도메타신(indomethacin), 덱사메타손(dexamethasone), 3-이소부틸-1-메틸잔틴(3-isobutyl-1-methylxanthine), 재조합된 PDGF-BB(human platelet-derived growth factor-BB), bFGF(basic fibroblast growth factor), 및 TGF-β1(transforming growth factor-β1)이 포함된 구성이며, 2주 동안의 배양기간 동안 2-3일 간격으로 교체해 주었으며, 지방 분화정도를 확인하기 위해 Oil red O 염색 및 real-time PCR을 실시하였다.In order to analyze the differentiation ability of human inferior turbinate-derived mesenchymal stem cells cultured without the medium to which the xenogeneic animal serum of Example 1 was added into adipocytes, similarly to Example 4 above, mesenchymal stem cells contributed to the adipogenesis pathway. The adipogenesis medium was prepared using the StemPro® adipogenesis Differentiation Kit (Gibco, cat. no. A1007001) that contained the necessary components to produce adipocytes and was free of xenogeneic animal serum. The adipose differentiation medium is in more detail DMEM medium insulin (insulin), indomethacin (indomethacin), dexamethasone (dexamethasone), 3-isobutyl-1-methyl xanthine (3-isobutyl-1-methylxanthine), recombinant PDGF -Consists of human platelet-derived growth factor-BB (BB), basic fibroblast growth factor (bFGF), and transforming growth factor-β1 (TGF-β1), with an interval of 2-3 days during a 2-week incubation period Oil red O staining and real-time PCR were performed to confirm the degree of fat differentiation.

또한, 본 발명에 따른 중간엽 줄기세포의 지방세포로의 분화능을 분석하기 위하여, 기존의 방법으로 배양한 중간엽 줄기세포의 골세포로의 분화능을 비교분석하였다. 이를 위해, FBS를 포함하는 α-MEM 배지에 10 ㎍/㎖ 인슐린, 200 μM 인도메타신(indomethacin), 0.1 μM 덱사메타손, 0.5 μM 3-이소부틸-1-메틸잔틴(3-isobutyl-1-methylxanthine)을 첨가하여 지방 분화배지를 제조하였다. 이후 상기와 동일한 방법으로 지방 분화를 유도하고, 상기 지방 분화배지를 2-3일 간격으로 교체하였으며 배양 2주 후 상기와 동일한 방법으로 지방 분화정도를 분석하였다.In addition, in order to analyze the differentiation ability of the mesenchymal stem cells according to the present invention into adipocytes, the differentiation ability of the mesenchymal stem cells cultured by the conventional method into osteocytes was comparatively analyzed. For this, 10 μg/ml insulin, 200 μM indomethacin, 0.1 μM dexamethasone, 0.5 μM 3-isobutyl-1-methylxanthine in α-MEM medium containing FBS ) was added to prepare a fat differentiation medium. Thereafter, adipogenic differentiation was induced in the same manner as above, the adipogenic differentiation medium was replaced every 2-3 days, and the degree of adipogenic differentiation was analyzed in the same manner as above after 2 weeks of culture.

6-1. Oil red O 염색6-1. Oil red O dyeing

4웰 챔버 슬라이드에 각 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포를 1×104 ㎖씩 분주하고 2주 동안 각 지방 분화배지를 이용해 분화를 유도하였다. 배양 2주째에 각 웰을 PBS로 1회 세척 후 4% 파라포름알데히드 고정액을 이용해 10분 동안 고정한 후 세척하고 0.16% Oil-red O 용액으로 20분간 염색하여 현미경하에서 관찰하였다. 1×10 4 ml of each human inferior turbinate-derived mesenchymal stem cells were dispensed on a 4-well chamber slide, and differentiation was induced using each adipose differentiation medium for 2 weeks. At the second week of culture, each well was washed once with PBS, fixed for 10 minutes using 4% paraformaldehyde fixative, washed, and stained with 0.16% Oil-red O solution for 20 minutes, and observed under a microscope.

그 결과, 도 6a에 나타낸 바와 같이, 상기 염색방법을 이용해 세포의 핵 내에서 지방 특이 소체의 생성을 확인할 수 있는데, 본 발명에 따른 방법으로 배양한 후 이종 동물 혈청이 없는 지방 분화배지에서 배양한 중간엽 줄기세포의 경우(serum free cultivation)와 기존의 방법으로 배양한 후 이종 항원이 포함된 지방 분화배지에서 배양한 중간엽 줄기세포의 경우(serum containing cultivation) 지방 특이적 소체가 유사한 정도로 생성된 것으로 관찰되었다.As a result, as shown in Fig. 6a, the generation of adipose-specific bodies in the nucleus of cells can be confirmed using the above staining method. In the case of mesenchymal stem cells (serum free cultivation) and in the case of mesenchymal stem cells cultured in an adipose differentiation medium containing a heterologous antigen after culturing by the conventional method (serum containing cultivation), fat-specific bodies were produced to a similar degree. was observed to be

6-2. Real-time PCR 분석6-2. Real-time PCR analysis

12-웰 플레이트에 각 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포를 2×104 ㎖씩 분주하고 2주 동안 각 지방 분화배지를 이용해 분화를 유도하였다. 이후 상기 두 가지 방법에 따라 배양한 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포의 지방 분화정도를 분석하기 위해, 배양된 세포들을 PBS로 수세하고 Ambion RNAqueous kit를 이용하여 Tri-ZolTMreagent 1 ㎖를 넣어 제조사의 방법에 따라 RNA를 추출하고, 상기 실시예 4-2와 동일한 방법으로 real-time PCR 분석을 실시하여 지방 분화와 관련된 peroxisome proliferator activated receptor r(PPARG) 와 AcylCoA synthetase(ACSS2) mRNA의 발현수준을 각각 배양 0일, 7일, 및 14일째에 분석하였다. 2×10 4 ml of each human inferior turbinate-derived mesenchymal stem cells were dispensed in a 12-well plate, and differentiation was induced using each adipose differentiation medium for 2 weeks. Then, in order to analyze the degree of adipogenic differentiation of human inferior turbinate-derived mesenchymal stem cells cultured according to the above two methods, the cultured cells were washed with PBS, and 1 ml of Tri-Zol TM reagent was added using the Ambion RNAqueous kit. RNA was extracted according to the method of , and real-time PCR analysis was performed in the same manner as in Example 4-2 to determine the expression levels of peroxisome proliferator activated receptor r (PPARG) and AcylCoA synthetase (ACSS2) mRNA related to adipogenesis. Analysis was performed on days 0, 7, and 14 of culture, respectively.

그 결과, 도 6b에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 방법으로 배양한 후 이종 동물 혈청이 없는 지방 분화배지에서 배양한 중간엽 줄기세포의 경우(serum free) 시간이 지남에 따라 상기 3가지 유전자의 발현 모두 증가하는 양상을 나타내는 것을 통해 상기 중간엽 줄기세포의 골 분화가 진행되는 것을 확인하였다. 또한, 기존의 방법에 따라 배양한 후 이종 항원이 포함된 분화배지에서 배양한 중간엽 줄기세포(Conventional)에 비하여 시간 경과에 따른 유전자 발현의 증가 양상이 매우 높게 나타났으며, 통계적으로도 유의하게 높게 발현되는 것을 확인하였다.As a result, as shown in FIG. 6b , in the case of mesenchymal stem cells cultured in an adipose differentiation medium without serum of a heterogeneous animal after culturing by the method according to the present invention (serum free), the three genes It was confirmed that bone differentiation of the mesenchymal stem cells proceeded through the expression of all increasing patterns. In addition, compared to mesenchymal stem cells (Conventional) cultured in a differentiation medium containing a heterologous antigen after culturing according to the existing method, the increase in gene expression over time was found to be very high, and statistically significant It was confirmed that the expression was high.

상기 진술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.The description of the present invention stated above is for illustration, and those of ordinary skill in the art to which the present invention pertains can understand that it can be easily modified into other specific forms without changing the technical spirit or essential features of the present invention. There will be. Therefore, it should be understood that the embodiments described above are illustrative in all respects and not restrictive.

Claims (23)

삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete (a) 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포를 이종 동물 혈청이 첨가되지 않은 배지에서 배양하는 단계; 및
(b) 상기 배양된 중간엽 줄기세포를 이종 동물 혈청이 첨가되지 않은 골 분화배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포로부터 골세포로의 분화방법으로서,
상기 이종 동물 혈청이 첨가되지 않은 배지는 재조합된 PDGF-BB(human platelet-derived growth factor-BB), bFGF(basic fibroblast growth factor), 및 TGF-β1(transforming growth factor-β1)을 포함하고,
상기 골 분화배지는 페니실린(penicillin) 및 스트렙토마이신(streptomycin)을 포함하는 것을 특징으로 하는, 분화방법.
(a) culturing human inferior turbinate-derived mesenchymal stem cells in a medium not added with xenogeneic animal serum; and
(b) a method of differentiation from human inferior turbinate-derived mesenchymal stem cells into osteocytes, comprising the step of culturing the cultured mesenchymal stem cells in a bone differentiation medium not added with xenogeneic animal serum,
The medium to which the heterologous animal serum is not added includes recombinant human platelet-derived growth factor-BB (PDGF-BB), basic fibroblast growth factor (bFGF), and transforming growth factor-β1 (TGF-β1),
The bone differentiation medium is a differentiation method, characterized in that it comprises penicillin (penicillin) and streptomycin (streptomycin).
 제12항에 있어서,
상기 단계 (a) 이전에 인간 유래 성분으로 이루어진 기질로 코팅된 배양플레이트에 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포를 올리고 슬라이드 글라스로 덮어 부착시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 분화방법.
13. The method of claim 12,
The differentiation method, characterized in that it further comprises the step of attaching human inferior turbinate-derived mesenchymal stem cells to a culture plate coated with a substrate made of a human-derived component prior to step (a), covered with a slide glass.
 삭제delete 제12항에 있어서,
상기 단계 (b)의 골 분화배지는 재조합된 PDGF-BB(human platelet-derived growth factor-BB), bFGF(basic fibroblast growth factor), 및 TGF-β1(transforming growth factor-β1)이 포함된 것을 특징으로 하는, 분화방법.
13. The method of claim 12,
The bone differentiation medium of step (b) is characterized in that it contains recombinant human platelet-derived growth factor-BB (PDGF-BB), basic fibroblast growth factor (bFGF), and transforming growth factor-β1 (TGF-β1). , the differentiation method.
 제13항에 있어서,
상기 인간 유래 성분으로 이루어진 기질은 CELLstart CTS Attachment substrate 또는 인간 혈장 피브로넥틴(human plasma fibronectin)인 것을 특징으로 하는, 분화방법.
14. The method of claim 13,
The substrate consisting of the human-derived component is a CELLstart CTS Attachment substrate or human plasma fibronectin, characterized in that the differentiation method.
 제12항에 있어서,
상기 단계 (a) 또는 (b)에서 배양은 1 내지 3주 동안 수행되는 것을 특징으로 하는, 분화방법.
13. The method of claim 12,
In the step (a) or (b), the culturing is performed for 1 to 3 weeks, the differentiation method.
 (a) 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포를 이종 동물 혈청이 첨가되지 않은 배지에서 배양하는 단계; 및
(b) 상기 배양된 중간엽 줄기세포를 이종 동물 혈청이 첨가되지 않은 지방 분화배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포로부터 지방세포로의 분화방법으로서,
상기 이종 동물 혈청이 첨가되지 않은 배지는 재조합된 PDGF-BB(human platelet-derived growth factor-BB), bFGF(basic fibroblast growth factor), 및 TGF-β1(transforming growth factor-β1)을 포함하고,
상기 지방 분화배지는 인슐린(insulin)을 포함하는 것을 특징으로 하는, 분화방법.
(a) culturing human inferior turbinate-derived mesenchymal stem cells in a medium not added with xenogeneic animal serum; and
(b) a method for differentiation from human inferior turbinate-derived mesenchymal stem cells into adipocytes, comprising the step of culturing the cultured mesenchymal stem cells in an adipose differentiation medium not added with heterologous animal serum,
The medium to which the heterologous animal serum is not added includes recombinant human platelet-derived growth factor-BB (PDGF-BB), basic fibroblast growth factor (bFGF), and transforming growth factor-β1 (TGF-β1),
The differentiation method, characterized in that the fat differentiation medium comprises insulin (insulin).
 제18항에 있어서,
상기 단계 (a) 이전에 인간 유래 성분으로 이루어진 기질로 코팅된 배양플레이트에 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포를 올리고 슬라이드 글라스로 덮어 부착시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 분화방법.
19. The method of claim 18,
The differentiation method, characterized in that it further comprises the step of attaching human inferior turbinate-derived mesenchymal stem cells to a culture plate coated with a substrate made of a human-derived component prior to step (a), covered with a slide glass.
 삭제delete 제18항에 있어서,
상기 단계 (b)의 지방 분화배지는 재조합된 PDGF-BB(human platelet-derived growth factor-BB), bFGF(basic fibroblast growth factor), 및 TGF-β1(transforming growth factor-β1)이 포함된 것을 특징으로 하는, 분화방법.
19. The method of claim 18,
The adipose differentiation medium of step (b) is characterized in that it contains recombinant human platelet-derived growth factor-BB (PDGF-BB), basic fibroblast growth factor (bFGF), and transforming growth factor-β1 (TGF-β1). , the differentiation method.
 제19항에 있어서,
상기 인간 유래 성분으로 이루어진 기질은 CELLstart CTS Attachment substrate 또는 인간 혈장 피브로넥틴(human plasma fibronectin)인 것을 특징으로 하는, 분화방법.
20. The method of claim 19,
The substrate consisting of the human-derived component is a CELLstart CTS Attachment substrate or human plasma fibronectin, characterized in that the differentiation method.
 제18항에 있어서,
상기 단계 (a) 또는 (b)에서 배양은 1 내지 3주 동안 수행되는 것을 특징으로 하는, 분화방법.19. The method of claim 18,
In the step (a) or (b), the culturing is performed for 1 to 3 weeks, the differentiation method.
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