KR102324334B1 - Fluorescence probe for detecting hydrogen sulfide and manufacturing method using the same - Google Patents
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Abstract
본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 황화수소 검출용 형광 프로브 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
[화학식 1]
상기 화학식 1에서 R은 C1-6 알킬 또는 -(CH2CH2O)n-H 이며, 이 때 n은 1 내지 10의 정수이다.
본 발명에 의한 황화수소를 검출할 수 있는 형광 센서는 신속하고 정확하게 황화수소만을 선택적으로 검출이 가능한 효과를 가진다.
또한, 생체 내 비침습적인 영상을 이용하여 세포 및 조직의 깊은 곳에서 진행되는 생물학적인 현상을 실시간으로 확인이 가능하다.The present invention relates to a fluorescent probe for detecting hydrogen sulfide represented by the following formula (1) and a method for preparing the same.
[Formula 1]
In Formula 1, R is C 1-6 alkyl or -(CH 2 CH 2 O) n -H, where n is an integer of 1 to 10.
The fluorescent sensor capable of detecting hydrogen sulfide according to the present invention has the effect of selectively detecting only hydrogen sulfide quickly and accurately.
In addition, it is possible to check in real time a biological phenomenon that proceeds deep in cells and tissues using non-invasive images in vivo.
Description
본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 황화수소 검출용 형광 프로브 및 이의 제조방법에 관한 것이다.The present invention relates to a fluorescent probe for detecting hydrogen sulfide represented by the following formula (1) and a method for preparing the same.
[화학식 1][Formula 1]
상기 화학식 1에서 R은 C1-6 알킬 또는 -(CH2CH2O)n-H 이며, 이 때 n은 1 내지 10의 정수이다.In
황화수소(H2S)는 시스타티오닌-γ-리아제(Cystathinone-γ-lyase, CSE) 및 시스타티오닌-β-신타아제(Cystathionin-β-synthase, CBS)와 같은 효소의 활동을 통해 시스테인(Cysteine) 및 호모시스테인(Homocysteine)으로부터 포유류의 조직에서 합성된다.Hydrogen sulfide (H 2 S) is converted to cysteine ( Cysteine) and homocysteine are synthesized in mammalian tissues.
이러한 황화수소(H2S)는 산화질소(Nitric oxide)와 일산화탄소(Carbon monoxide)와 더불어 3차 기체신호전달물질(3th gasotransmitter) 또는 기체(gasomediator)로써 다양한 생리현상에 참여하고, 세포 면역 시스템에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 특히, K-ATP의 개시자(opener) 역할을 하여 심혈관 시스템의 항상성에 기여하며 손상된 심혈관 근육의 치유 및 신경계의 산화 스트레스로부터 보호 역할 등에 직접 관여하는 것으로 알려져 있어, 여러 연구 분야에서 각광을 받고 있다. 이와 관련하여 종래 한국등록특허 제1,404,369호에서는 황화수소 농도를 실시간으로 검출하는 황화수소 센서를 구비하는 심장 허혈 및 재관류에 대한 실시간 생체신호 측정 장치가 개시된 바 있다.Hydrogen sulfide (H 2 S) participates in various physiological phenomena as a third gasotransmitter or gas (gasodiator) along with nitric oxide and carbon monoxide, and is important for the cellular immune system. known to play a role. In particular, it plays a role as an opener of K-ATP, contributing to the homeostasis of the cardiovascular system, and is known to be directly involved in the healing of damaged cardiovascular muscles and protection from oxidative stress in the nervous system. . In this regard, prior Korean Patent No. 1,404,369 discloses a real-time biosignal measuring device for cardiac ischemia and reperfusion having a hydrogen sulfide sensor that detects hydrogen sulfide concentration in real time.
또한, 인간의 혈액 내 혈장(plasma)의 황화수소 농도는 50 ~ 100㎛ 수준으로 알려져 있으므로, 황화수소의 농도 수준을 정량적으로 검출할 수 있다면 다운 증후군(Down syndrome), 알츠하이머 병(Alzheimer's disease), 당뇨병 및 간경변증 등의 질병 진단이 가능하다.In addition, since the concentration of hydrogen sulfide in human blood plasma is known to be 50 to 100 μm, if the concentration level of hydrogen sulfide can be quantitatively detected, Down syndrome, Alzheimer's disease, diabetes and Diagnosis of diseases such as liver cirrhosis is possible.
최근에, 살아있는 세포 또는 조직에서 황화수소(H2S)를 검출하는 방법으로는 가스 크로마토그래피, 전기화학 및 비색법 등이 있으나, 이러한 방법들은 조직 및 세포 용해물의 처리 및/또는 파괴를 필요로 한다. Recently, methods for detecting hydrogen sulfide (H 2 S) in living cells or tissues include gas chromatography, electrochemical and colorimetric methods, but these methods require processing and/or destruction of tissues and cell lysates. .
또한, 미토콘드리아 내부에는 전체 황화물의 30%가 저장되어 있고 황화수소 역량의 황화물이 존재하고 있는데, 이러한 황화수소(H2S)를 선택적이고 정량적으로 검출하는 방법이 요구되는 실정이다.In addition, 30% of the total sulfide is stored inside the mitochondria and there is a sulfide having hydrogen sulfide capacity. A method for selectively and quantitatively detecting such hydrogen sulfide (H 2 S) is required.
이에, 최근 들어 다양한 형광탐침법(Fluorescent probe)들이 개발되고 있다. 예를 들면, 종래 황화수소(H2S) 검출을 위한 형광 프로브로서 2,4-디니트로벤젠 설포닐 플루오로세인 화합물이 개시된 바 있으나, 상기 화합물의 경우 시간이 지남에 따라 술폰산 에스테르가 가수 분해하여 형광 강도가 변화한다는 문제점이 발생한다.(Analytica Chimica Acta, 631, 91, 2009)Accordingly, recently, various fluorescent probes have been developed. For example, a conventional 2,4-dinitrobenzene sulfonyl fluorescein compound has been disclosed as a fluorescent probe for detecting hydrogen sulfide (H 2 S), but in the case of the compound, the sulfonic acid ester is hydrolyzed over time There is a problem that the fluorescence intensity changes. (Analytica Chimica Acta, 631, 91, 2009)
본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로, 생체 내에서 비침습적인 영상을 이용하여 황화수소(H2S)를 검출할 수 있는 형광 프로브와 이의 제조방법을 제공하는데 그 목적이 있다.The present invention has been devised to solve the above problems, and an object of the present invention is to provide a fluorescent probe capable of detecting hydrogen sulfide (H 2 S) using a non-invasive image in vivo and a method for manufacturing the same.
또한, 본 발명은 세포 및 생체 내에 존재하는 황화수소(H2S)를 검출하는 방법을 제공하는데 그 목적이 있다.Another object of the present invention is to provide a method for detecting hydrogen sulfide (H 2 S) present in cells and in vivo.
본 발명의 적절한 실시 형태에 따르면, 황화수소 검출용 형광 프로브는 하기 화학식 1로 표시되는 것을 특징으로 한다.According to a suitable embodiment of the present invention, the fluorescent probe for detecting hydrogen sulfide is characterized in that it is represented by the following formula (1).
[화학식 1][Formula 1]
상기 화학식 1에서 R은 C1-6 알킬 또는 -(CH2CH2O)n-H 이며, 이 때 n은 1 내지 10의 정수이다. In
구체적으로 상기 프로브는 하기 화학식 2 또는 화학식 3으로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있다. Specifically, the probe may be characterized in that it is represented by the following Chemical Formula 2 or Chemical Formula 3.
[화학식 2][Formula 2]
[화학식 3][Formula 3]
또한, 상기 황화수소 검출용 형광 프로브는, 생체 내의 황화수소와 반응하여 450 내지 700nm에서 형광으로 가변하는 것을 특징으로 한다. In addition, the fluorescent probe for detecting hydrogen sulfide is characterized in that it reacts with hydrogen sulfide in a living body to change fluorescence at 450 to 700 nm.
본 발명의 다른 적절한 실시 형태에 따르면, 황화수소 검출용 형광 프로브의 제조방법은, 화학식 4로 표시되는 화합물을 화학식 5 또는 하기 화학식 6으로 표시되는 화합물과 반응시켜, 하기 화학식 7로 표시되는 화합물을 제조하는 단계; 및 상기 제조된 화학식 7로 표시되는 화합물을 아자이드염과 반응시켜, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물을 제조하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다. According to another suitable embodiment of the present invention, in the method for preparing a fluorescent probe for detecting hydrogen sulfide, a compound represented by Formula 4 is reacted with a compound represented by Formula 5 or Formula 6 to prepare a compound represented by Formula 7 to do; and reacting the prepared compound represented by Formula 7 with an azide salt to prepare a compound represented by
[화학식 4][Formula 4]
상기 화학식 4에서 X는 F, Cl, Br 또는 I 이다. In Formula 4, X is F, Cl, Br or I.
[화학식 5][Formula 5]
H2N-(CH2CH2O)n-H H 2 N-(CH 2 CH 2 O) n -H
상기 화학식 5에서 n은 1 내지 10의 정수이다. In
[화학식 6][Formula 6]
R-NH2 R-NH 2
상기 화학식 6에서 R은 C1-6 알킬이다. In Formula 6, R is C 1-6 alkyl.
[화학식 7][Formula 7]
상기 화학식 7에서 R은 C1-6 알킬 또는 -(CH2CH2O)n-H 이고, X는 F, Cl, Br 또는 I 이며, 이 때 n은 1 내지 10의 정수이다. In Formula 7, R is C 1-6 alkyl or -(CH 2 CH 2 O) n -H, and X is F, Cl, Br or I, where n is an integer of 1 to 10.
[화학식 1][Formula 1]
상기 화학식 1에서 R은 C1-6 알킬 또는 -(CH2CH2O)n-H 이며, 이 때 상기 n은 1 내지 10의 정수이다. In
본 발명의 또 다른 적절한 실시 형태에 따르면, 황화수소의 검출 방법은, 상기 황화수소 검출용 형광 프로브를 생체 내에 주입하는 단계; 상기 황화수소 검출용 형광 프로브가 생체 내 황화수소와 반응하여 형광을 나타내는 단계; 및 상기 형광을 확인하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다. According to another suitable embodiment of the present invention, a method for detecting hydrogen sulfide includes: injecting the fluorescent probe for detecting hydrogen sulfide into a living body; displaying fluorescence by reacting the fluorescent probe for hydrogen sulfide detection with hydrogen sulfide in vivo; and confirming the fluorescence.
본 발명에 의한 황화수소를 검출할 수 있는 형광 프로브는 신속하고 정확하게 황화수소만을 선택적으로 검출이 가능한 효과를 가진다.The fluorescent probe capable of detecting hydrogen sulfide according to the present invention has the effect of selectively detecting only hydrogen sulfide quickly and accurately.
또한, 생체 내 비침습적인 영상을 이용하여 세포 및 조직의 깊은 곳에서 진행되는 생물학적인 현상을 실시간으로 관찰이 가능하다.In addition, it is possible to observe in real time a biological phenomenon that proceeds deep in cells and tissues using non-invasive images in vivo.
도 1은 화학식 2로 표시되는 화합물(L1 형광 프로브)의 1H-NMR 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 2는 화학식 2로 표시되는 화합물(L1 형광 프로브)의 13C-NMR 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 3은 L1 형광 프로브의 황화수소 농도에 따는 흡광도 스펙트럼 및 형광 사진을 나타낸 것이다.
도 4는 L1 및 L2 형광 프로브를 대상으로 형광 반응 평가 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 L1 및 L2 형광 프로브를 대상으로 시간 및 농도에 따른 형광 세기를 나타낸 그래프이다.
도 6은 다른 검출 대상 성분과 L1 형광 프로브의 혼합물의 황화수소에 따른 형광 세기 변화를 확인한 그래프이다.
도 7은 L1 및 L2 형광 프로브를 대상으로 황화수소의 선택적인 검출 결과를 확인한 그래프이다.
도 8은 L1 및 L2 형광 프로브의 세포 독성 실험 결과를 나타낸 그래프이다.
도 9는 L1 및 L2 형광 프로브에 따른 세포 내 외인성 황화수소 검출 결과를 확인한 형광 현미경 사진이다.
도 10은 황화수소 농도에 따른 세포 내 외인성 황화수소 검출 결과를 확인한 사진 및 그래프이다.
도 11은 L1 및 L2 형광 프로브에 따른 제브라피쉬 배아 내 내인성 황화수소 검출 결과를 확인한 사진 및 그래프이다. 1 shows a 1 H-NMR spectrum of a compound represented by Formula 2 (L1 fluorescent probe).
2 shows a 13 C-NMR spectrum of a compound represented by Formula 2 (L1 fluorescent probe).
3 shows an absorbance spectrum and a fluorescence photograph according to the hydrogen sulfide concentration of the L1 fluorescent probe.
4 shows the results of evaluation of fluorescence reactions with respect to L1 and L2 fluorescent probes.
5 is a graph showing fluorescence intensity according to time and concentration for L1 and L2 fluorescent probes.
6 is a graph illustrating a change in fluorescence intensity according to hydrogen sulfide in a mixture of another detection target component and an L1 fluorescent probe.
7 is a graph confirming the results of selective detection of hydrogen sulfide for L1 and L2 fluorescent probes.
8 is a graph showing the cytotoxicity test results of L1 and L2 fluorescent probes.
9 is a fluorescence micrograph confirming the detection result of exogenous hydrogen sulfide in cells by L1 and L2 fluorescent probes.
10 is a photograph and graph confirming the detection result of exogenous hydrogen sulfide in cells according to the concentration of hydrogen sulfide.
11 is a photograph and graph confirming the detection result of endogenous hydrogen sulfide in zebrafish embryos according to L1 and L2 fluorescent probes.
이하, 본 발명에 대하여 상세히 설명하기로 한다. 이에 앞서, 본 명세서 및 청구범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정해서 해석되어서는 아니되며, 발명자는 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야만 한다. 따라서, 본 명세서에 기재된 실시예에 기재된 구성은 본 발명의 가장 바람직한 일 실시예에 불과할 뿐이고 본 발명의 기술적 사상을 모두 대변하는 것은 아니므로, 본 출원시점에 있어서 이들을 대체할 수 있는 다양한 균등물과 변형예들이 있을 수 있음을 이해하여야 한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail. Prior to this, the terms or words used in the present specification and claims should not be construed as being limited to conventional or dictionary meanings, and the inventor should properly understand the concept of the term in order to best describe his invention. Based on the principle that it can be defined, it should be interpreted as meaning and concept consistent with the technical idea of the present invention. Accordingly, the configuration described in the embodiment described in this specification is only the most preferred embodiment of the present invention and does not represent all of the technical idea of the present invention, so various equivalents and It should be understood that there may be variations.
본 발명에서, 용어 '프로브'는 '센서'라고도 하며 생체 내/외 표적을 검출하거나, 영상화할 수 있는 것으로 정의된다. 일반적으로 영상화제, 조영제, 방사성 의약품 등의 용어로 대체하여 사용되고 있다.In the present invention, the term 'probe' is also referred to as 'sensor' and is defined as capable of detecting or imaging an in vivo/external target. In general, it is used in place of terms such as imaging agent, contrast agent, and radiopharmaceutical.
본 발명의 황화수소 검출용 형광 프로브는 하기 화학식 1로 표시되는 화합물이다.The fluorescent probe for detecting hydrogen sulfide of the present invention is a compound represented by the following formula (1).
[화학식 1][Formula 1]
상기 화학식 1에서 R은 C1-6 알킬 또는 -(CH2CH2O)n-H 이며, 이 때 n은 1 내지 10의 정수이다.In
상기 화학식에서 나프탈이미드 구조의 N-이미드 위치에서 치환되는 R의 사슬은 형광강도, 수성 매질에서의 용해도, 다양한 분석체에 대한 선택성, 세포 투과도, 황화물에 대한 반응성 등에 영향을 미친다.In the above formula, the chain of R substituted at the N-imide position of the naphthalimide structure affects fluorescence intensity, solubility in aqueous media, selectivity for various analytes, cell permeability, reactivity to sulfides, and the like.
구체적으로 상기 프로브는 하기 화학식 2 또는 화학식 3으로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있다.Specifically, the probe may be characterized in that it is represented by the following
[화학식 2][Formula 2]
[화학식 3][Formula 3]
상기 황화수소 검출용 형광 프로브는 근적외선 형광물질(Near-Infrared Fluorescence, NIRF)로, 생체 내에 주입하게 되면 미토콘드리아 또는 세포질에 선택적으로 위치될 수 있다. 상기 황화수소 검출용 형광 프로브를 생체 내에 주입하게 되면, 황화수소와 반응하여 450 내지 700nm에서 형광으로 가변하게 되고, 이를 통하여 황화수소를 검출할 수 있다.The fluorescent probe for detecting hydrogen sulfide is a near-infrared fluorescence (NIRF), and may be selectively located in mitochondria or cytoplasm when injected into a living body. When the fluorescent probe for detecting hydrogen sulfide is injected into a living body, it reacts with hydrogen sulfide and changes to fluorescence at 450 to 700 nm, thereby detecting hydrogen sulfide.
상기 황화수소 검출용 형광 프로브를 적용하면 바람직하게는 세포 또는 조직과 같은 생체 내 100 내지 200㎛의 투과 깊이에서 황화수소의 탐지가 가능하고, 또한 실시간으로 영상화할 수 있다. 따라서, 황화수소와 관련된 생명과학 연구와 질병의 조기 진단, 진단 시약 및 치료제의 개발에 크게 기여할 수 있다.When the fluorescent probe for detecting hydrogen sulfide is applied, it is preferably possible to detect hydrogen sulfide at a penetration depth of 100 to 200 μm in a living body such as a cell or tissue, and also to image in real time. Therefore, it can greatly contribute to life science research related to hydrogen sulfide, early diagnosis of diseases, and development of diagnostic reagents and therapeutics.
한편 상기 황화수소 검출용 형광 프로브는 하기와 같은 방법을 통하여 제조될 수 있다.Meanwhile, the fluorescent probe for detecting hydrogen sulfide may be prepared by the following method.
먼저, 화학식 4로 표시되는 화합물을 화학식 5 또는 하기 화학식 6으로 표시되는 화합물과 반응시켜, 하기 화학식 7로 표시되는 화합물을 제조한다.First, a compound represented by Formula 4 is reacted with a compound represented by
[화학식 4][Formula 4]
상기 화학식 4에서 X는 F, Cl, Br 또는 I 이다. In Formula 4, X is F, Cl, Br or I.
[화학식 5][Formula 5]
H2N-(CH2CH2O)n-H H 2 N-(CH 2 CH 2 O) n -H
상기 화학식 5에서 n은 1 내지 10의 정수이다. In
[화학식 6][Formula 6]
R-NH2 R-NH 2
상기 화학식 6에서 R은 C1-6 알킬이다. In Formula 6, R is C 1-6 alkyl.
[화학식 7][Formula 7]
상기 화학식 7에서 R은 C1-6 알킬 또는 -(CH2CH2O)n-H 이고, X는 F, Cl, Br 또는 I 이며, 이 때 n은 1 내지 10의 정수이다.In Formula 7, R is C 1-6 alkyl or -(CH 2 CH 2 O) n -H, and X is F, Cl, Br or I, where n is an integer of 1 to 10.
상기 반응은 환류 에탄올 내 50 내지 100 ℃에서 교반한 후 반응 혼합물을 냉각시키고, 용매를 증발시킨 다음 컬럼크로마토그래피 등을 이용하여 정제하는 과정을 거쳐 이루어질 수 있다.The reaction may be performed by stirring the mixture at 50 to 100° C. in refluxing ethanol, cooling the reaction mixture, evaporating the solvent, and then purifying using column chromatography or the like.
다음 상기 화학식 7로 표시되는 화합물을 아자이드염과 반응시켜, 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 얻을 수 있다.Next, the compound represented by Formula 7 may be reacted with an azide salt to obtain a compound represented by
[화학식 1][Formula 1]
상기 화학식 1에서 R은 C1-6 알킬 또는 -(CH2CH2O)n-H 이며, 이 때 n은 1 내지 10의 정수이다. In
상기 아자이드염은 나트륨아자이드(NaN3) 등이 사용될 수 있으며, 아자이드염과의 반응 후 반응물을 유기 용매로 추출한 뒤 유기층을 분리 및 농축하여 화학식 1로 표시되는 화합물을 포함하는 잔류물을 얻을 수 있다.As the azide salt, sodium azide (NaN 3 ), etc. may be used, and after reaction with the azide salt, the reaction product is extracted with an organic solvent, and then the organic layer is separated and concentrated to obtain a residue containing the compound represented by
본 발명의 황화수소 검출 방법으로는, 상기에서 제조된 황화수소 검출용 형광 프로브를 생체 내에 주입하는 단계; 상기 황화수소 검출용 형광 프로브가 생체 내 황화수소와 반응하여 형광을 나타내는 단계; 및 형광을 확인하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.In the method for detecting hydrogen sulfide of the present invention, the method comprising: injecting the fluorescent probe for detecting hydrogen sulfide prepared above into a living body; displaying fluorescence by reacting the fluorescent probe for hydrogen sulfide detection with hydrogen sulfide in vivo; and confirming fluorescence.
예를 들어 상기 화학식 2 및 3으로 표시되는 황화수소 검출용 형광 프로브는 하기 반응식 1 및 2와 같이 황화수소와 반응하여 형광을 나타내는 것을 특징으로 한다.For example, the fluorescent probes for detecting hydrogen sulfide represented by
[반응식 1][Scheme 1]
[반응식 2][Scheme 2]
이상의 설명은 본 발명의 기술 사상을 예시적으로 설명한 것에 불과한 것으로서, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 다양한 수정 및 변형이 가능할 것이다. 따라서, 본 발명에 개시된 실시예들은 본 발명의 기술 사상을 한정하기 위한 것이 아니라 설명하기 위한 것이고, 이러한 실시예에 의하여 본 발명의 기술 사상의 범위가 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 보호범위는 아래의 청구범위에 의하여 해석되어야 하며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 기술 사상은 본 발명의 권리범위에 포함되는 것으로 해석되어야 할 것이다.The above description is merely illustrative of the technical spirit of the present invention, and various modifications and variations will be possible without departing from the essential characteristics of the present invention by those skilled in the art to which the present invention pertains. Accordingly, the embodiments disclosed in the present invention are not intended to limit the technical spirit of the present invention, but to explain, and the scope of the technical spirit of the present invention is not limited by these embodiments. The protection scope of the present invention should be construed by the following claims, and all technical ideas within the scope equivalent thereto should be construed as being included in the scope of the present invention.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시 예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail through examples. These examples are only for illustrating the present invention in more detail, and it will be apparent to those skilled in the art that the scope of the present invention is not limited by these examples according to the gist of the present invention. .
합성예Synthesis example
1 : 화학식 2로 표시되는 화합물의 합성 1: Synthesis of the compound represented by
4-브로모-1,8-나프탈렌 안하이드라이드(0.4643 g, 1.6757 mmol)을 에탄올 (9.3 mL)에 녹이고, 2-[2-(2-아미노에톡시)에톡시]에탄올 (0.250 g, 1.6757 mmol)을 첨가하고, 환류 에탄올 내에서 80 ℃에서 2 시간 동안 교반 하였다. 반응 혼합물을 냉각시키고, 용매를 증발시킨 후, 생성물을 에틸 아세테이트 / 헥산 (부피비 3 : 1)을 사용하여 실리카 겔상에서 칼럼크로마토그래피로 정제하였다. 이를 통하여 연한 황색 고체상의 하기 화학식 8로 표시되는 화합물(569.5 mg, 83%)을 제조하였다. Dissolve 4-bromo-1,8-naphthalene anhydride (0.4643 g, 1.6757 mmol) in ethanol (9.3 mL), 2-[2-(2-aminoethoxy)ethoxy]ethanol (0.250 g, 1.6757) mmol) and stirred in refluxing ethanol at 80 °C for 2 h. After cooling the reaction mixture and evaporating the solvent, the product was purified by column chromatography on silica gel using ethyl acetate/hexane (volume ratio 3 : 1). Through this, a compound represented by the following Chemical Formula 8 (569.5 mg, 83%) as a pale yellow solid was prepared.
[화학식 8][Formula 8]
1H-NMR (CDCl3, 600 MHz): δ 8.56 (d, 1H, J = 7.2 Hz), 8.43 (d, 1H, J = 9.0 Hz), 8.31 (d, 1H, J = 7.8 Hz), 7.95 (t, 1H, J = 7.8Hz), 7.78 (t, 1H, J = 16.2 Hz), 4.42 (t, 1H, J = 12Hz), 3.86 (t, 1H, J = 12.6 Hz). 1 H-NMR (CDCl 3 , 600 MHz): δ 8.56 (d, 1H, J = 7.2 Hz), 8.43 (d, 1H, J = 9.0 Hz), 8.31 (d, 1H, J = 7.8 Hz), 7.95 (t, 1H, J = 7.8 Hz), 7.78 (t, 1H, J = 16.2 Hz), 4.42 (t, 1H, J = 12 Hz), 3.86 (t, 1H, J = 12.6 Hz).
13C-NMR (CDCl3, 600 MHz): δ 163.52, 163.49, 133.14, 131.98, 131.15, 130.98, 130.29, 130.22, 128.70, 127.97, 122.71, 121.86, 72.48, 70.39, 70.04, 67.91, 61.64, 39.20. 13 C-NMR (CDCl 3 , 600 MHz): δ 163.52, 163.49, 133.14, 131.98, 131.15, 130.98, 130.29, 130.22, 128.70, 127.97, 122.71, 121.86, 72.48, 70.39, 70.04, 67.91, 61.64, 39.20.
HRMS (m/z); Calcd for [M + Na]+ 430.0261, found 430.0268.HRMS (m/z); Calcd for [M + Na] + 430.0261, found 430.0268.
상기 화학식 8로 표시되는 화합물 0.5695 g (1.3949 mmol)을 디메틸포름아마이드(DMF) 11.6 mL에 용해시키고, NaN3(0.9069 g, 13.949 mmol)을 첨가하였다. 80 ℃에서 6 시간 동안 교반한 후, H2O로 희석한 용액을 에틸 아세테이트로 추출하였다. 유기층을 분리하여, Na2SO4상에서 건조한 후, 생성물을 진공에서 농축시켜 황색 고체상의 하기 화학식 2로 표시되는 화합물(419 mg, 81%)을 얻었다.0.5695 g (1.3949 mmol) of the compound represented by
본 발명에서 화학식 2로 표시되는 화합물을 ‘L1'으로 명명하였다.In the present invention, the compound represented by
[화학식 2][Formula 2]
상기 화학식 2로 표시되는 화합물의 1H-NMR 및 13C-NMR을 각각 도 1 및 도 2에 나타내었다. 1 H-NMR and 13 C-NMR of the compound represented by
1H-NMR (CDCl3, 600 MHz): δ 8.51 (d, 1H, J = 7.2 Hz), 8.43 (d, 1H, J = 7.8 Hz), 8.29 (d, 1H, J = 7.8 Hz), 7.66 (t, 1H, J = 15.6Hz), 7.35 (d, 1H, J = 7.8 Hz), 4.40 (t, 1H, J = 12.6 Hz), 3.85 (t, 1H, J = 12.6 Hz). 1 H-NMR (CDCl 3 , 600 MHz): δ 8.51 (d, 1H, J = 7.2 Hz), 8.43 (d, 1H, J = 7.8 Hz), 8.29 (d, 1H, J = 7.8 Hz), 7.66 (t, 1H, J = 15.6 Hz), 7.35 (d, 1H, J = 7.8 Hz), 4.40 (t, 1H, J = 12.6 Hz), 3.85 (t, 1H, J = 12.6 Hz).
13C-NMR (CDCl3, 600 MHz): δ 163.81, 163.36, 143.25, 132.05, 131.57, 128.80, 126.68, 123.96, 122.18, 118.43, 114.51, 77.10, 72.45, 70.38, 70.00, 67.92, 61.61, 39.00. 13 C-NMR (CDCl 3 , 600 MHz): δ 163.81, 163.36, 143.25, 132.05, 131.57, 128.80, 126.68, 123.96, 122.18, 118.43, 114.51, 77.10, 72.45, 70.38, 70.00, 67.92, 61.61
HRMS (m/z); Calcd for [M + Na]+ 393.1169, found 393.1170.HRMS (m/z); Calcd for [M + Na] + 393.1169, found 393.1170.
합성예Synthesis example 2 : 화학식 3으로 표시되는 화합물의 합성 2: Synthesis of the compound represented by Formula 3
4-브로모-1,8-나프탈렌 안하이드라이드(4.0 g, 14.43 mmol)을 에탄올 (80 mL)에 녹이고, 부틸아민 (1.005 g, 14.43 mmol)을 첨가하고, 환류 에탄올 내에서 24 시간 동안 교반 하였다. 반응 혼합물을 냉각시키고, 감압 하에 건조하여 황색 고체상의 하기 화학식 9로 표시되는 화합물(4.60 mg, 96%)을 제조하였다.4-Bromo-1,8-naphthalene anhydride (4.0 g, 14.43 mmol) was dissolved in ethanol (80 mL), butylamine (1.005 g, 14.43 mmol) was added, and stirred in refluxing ethanol for 24 hours. did. The reaction mixture was cooled and dried under reduced pressure to prepare a compound represented by the following Chemical Formula 9 (4.60 mg, 96%) as a yellow solid.
[화학식 9][Formula 9]
1H-NMR (CDCl3, 400 MHz): δ 8.66 (dd, 1H, J = 6.8, 0.8 Hz), 8.57 (dd, 1H, J = 8.4, 0.8 Hz), 8.42(d, 1H, J = 7.6 Hz), 8.05 (d, 1H, J = 7.6Hz), 7.86 (t, 1H, J = 15.6, 7.2 Hz). 1 H-NMR (CDCl 3 , 400 MHz): δ 8.66 (dd, 1H, J = 6.8, 0.8 Hz), 8.57 (dd, 1H, J = 8.4, 0.8 Hz), 8.42 (d, 1H, J = 7.6) Hz), 8.05 (d, 1H, J = 7.6 Hz), 7.86 (t, 1H, J = 15.6, 7.2 Hz).
13C-NMR (CDCl3, 400 MHz): δ 163.60, 133.16, 131.96, 131.15, 131.06, 130.61, 130.13, 128.04, 123.16, 122.30, 76.98, 40.35, 30.14, 20.37, 13.79. 13 C-NMR (CDCl 3 , 400 MHz): δ 163.60, 133.16, 131.96, 131.15, 131.06, 130.61, 130.13, 128.04, 123.16, 122.30, 76.98, 40.35, 30.14, 20.37, 13.79.
HRMS (m/z); Calcd for [M + Na]+ 354.0, found 354.02.HRMS (m/z); Calcd for [M + Na] + 354.0, found 355.02.
상기 화학식 9로 표시되는 화합물 2.2 g (6.02 mmol)을 디메틸포름아마이드(DMF) 50 mL에 용해시키고, NaN3(3.91 g, 60.20 mmol)을 첨가하였다. 80 ℃에서 6 시간 동안 교반 한 후, H2O로 희석한 용액을 에틸 아세테이트로 추출하였다. 유기층을 분리하여, Na2SO4상에서 건조한 후, 생성물을 진공에서 농축시켜 황색 고체상의 잔류물을 얻었다. 이를 하룻밤 상온에서 둔 다음 에테르를 첨가한 후 여과 및 건조하여 하기 화학식 3(1.0717g, 60.49%)으로 표시되는 화합물을 얻었다.2.2 g (6.02 mmol) of the compound represented by
본 발명에서 화학식 3으로 표시되는 화합물을 ‘L2'로 명명하였다.In the present invention, the compound represented by Formula 3 was named 'L2'.
[화학식 3][Formula 3]
1H-NMR (CDCl3, 400 MHz): δ 8.63 (dd, 1H, J = 7.6, 1.2 Hz), 8.58 (d, 1H, J = 8.0 Hz), 8.43 (dd, 1H, J = 8.8 , 1.2 Hz), 7.75 (t, 1H, J = 15.6, 7.2Hz), 7.47 (d, 1H, J = 8 Hz). 1 H-NMR (CDCl 3 , 400 MHz): δ 8.63 (dd, 1H, J = 7.6, 1.2 Hz), 8.58 (d, 1H, J = 8.0 Hz), 8.43 (dd, 1H, J = 8.8 , 1.2) Hz), 7.75 (t, 1H, J = 15.6, 7.2 Hz), 7.47 (d, 1H, J = 8 Hz).
13C-NMR (CDCl3, 400 MHz): δ 163.95, 163.53, 143.32, 132.12, 131.61, 129.12, 126.81, 124.32, 122.67, 122.67, 118.97, 114.62, 76.98, 40.24, 30.19, 20.35, 13.80. 13 C-NMR (CDCl 3 , 400 MHz): δ 163.95, 163.53, 143.32, 132.12, 131.61, 129.12, 126.81, 124.32, 122.67, 122.67, 118.97, 114.62, 76.98, 40.24, 30.19, 20.35, 13.80.
HRMS (m/z); Calcd for [M + Na]+ 317.1, found 317.1.HRMS (m/z); Calcd for [M + Na] + 317.1, found 317.1.
실험예Experimental example 1. 농도에 따른 형광 스펙트럼 평가 1. Fluorescence spectrum evaluation according to concentration
30분 동안 37℃에서 PBS 완충액(10μM, pH 7.4) 내 NaHS를 0 내지 200μM의 농도로 조절하여, 황화수소의 농도에 따른 상기 화합물 L1의 흡광도 및 형광 세기를 살펴보았다. 흡광도 및 형광 강도 스펙트럼은 도 3에 나타내었다.NaHS in PBS buffer (10 μM, pH 7.4) was adjusted to a concentration of 0 to 200 μM at 37° C. for 30 minutes, and the absorbance and fluorescence intensity of the compound L1 according to the concentration of hydrogen sulfide were examined. Absorbance and fluorescence intensity spectra are shown in FIG. 3 .
도 3-a를 살펴보면, L1의 UV-vis 스펙트럼은 350 내지 400 nm, 400 내지 500 nm에서 현저한 흡수 밴드를 나타났다. 이 때 황화수소의 농도가 높아질수록 약 435nm에서의 새로운 피크가 높게 형성되는 것을 알 수 있었다. 또한, 예측한 바와 같이 λmax(457 nm)에서 여기될 때, 수성 매질에서 높은 양자 수율(Φ L1 = 0.62)을 나타내었다.Referring to FIG. 3-a, the UV-vis spectrum of L1 showed significant absorption bands at 350 to 400 nm and 400 to 500 nm. At this time, it was found that the higher the concentration of hydrogen sulfide, the higher the new peak at about 435 nm was formed. In addition, as expected, when excited at λ max ( 457 nm), a high quantum yield (Φ L1 = 0.62) was shown in the aqueous medium.
또한, 도 3-b를 살펴보면, 457 nm 파장의 레이저 조사(여기 파장 λmax 457 nm)에 의하여 흡광도가 증가하는 것과 함께 녹색 형광의 증가가 확인되었다. 또한, 황화수소와의 반응 시 프로브의 적정이 이루어졌으며, 435 nm 여기 시, 550 nm 에서의 발광이 확인되었다. 여기서, 발광 강도의 비율(I550nm/I435nm)은 0.028에서 1.0로 변화하여 약 70배의 형광 신호가 증가한 것으로 나타났고, 이러한 현상은 30분의 반응 동안 지속되었다.In addition, referring to FIG. 3-B , it was confirmed that the absorbance was increased and green fluorescence was increased by laser irradiation with a wavelength of 457 nm (excitation wavelength λ max 457 nm). In addition, the probe was titrated upon reaction with hydrogen sulfide, and light emission at 550 nm was confirmed upon excitation at 435 nm. Here, the ratio of luminescence intensity (I 550 nm /I 435 nm ) was changed from 0.028 to 1.0, indicating that the fluorescence signal was increased by about 70 times, and this phenomenon continued for 30 minutes of reaction.
한편, L1(10μM) 및 L2(10μM) 형광 프로브를 대상으로 pH 7.4 PBS 완충액에서 황화수소(200μM)의 존재 하에 UV-vis 흡광도 및 형광 강도를 평가하였다. 평가 결과는 도 4에 나타내었다.Meanwhile, UV-vis absorbance and fluorescence intensity were evaluated for L1 (10 μM) and L2 (10 μM) fluorescent probes in the presence of hydrogen sulfide (200 μM) in pH 7.4 PBS buffer. The evaluation results are shown in FIG. 4 .
도 4에서 보는 바와 같이, L1 형광 프로브가 L2 형광 프로브보다 형광 강도면에서 높게 나타나는 것을 확인할 수 있었다. 이는 L1 형광 프로브 내 ‘이미드 사이트’의 측쇄에 도입된 화학 구조가 형광 강도의 강화를 가져온 것으로 예상된다. 측쇄에 위치한 하이드록시기는 수용성을 높이고 응집 가능성을 감소시킨다. 또한, 측쇄에 위치한 산소 원자는 용해도 증가에 영향을 미친 것으로 판단된다. As shown in FIG. 4 , it was confirmed that the L1 fluorescent probe showed higher fluorescence intensity than the L2 fluorescent probe. It is expected that the chemical structure introduced into the side chain of the 'imide site' in the L1 fluorescent probe resulted in the enhancement of the fluorescence intensity. The hydroxyl group located in the side chain increases water solubility and reduces the possibility of aggregation. In addition, it is judged that the oxygen atom located in the side chain affected the solubility increase.
실험예Experimental example 2. 시간 및 농도에 따른 형광 세기 평가 2. Evaluation of fluorescence intensity according to time and concentration
37℃에서 PBS 완충액(10μM) 내에서 L1(10μM) 및 L2(10μM) 형광 프로브를 NaHS(100μM)와 함께 반응시키고, 시간에 따른 형광 강도(550 nm)를 측정하였으며, 그 결과를 도 5-a에 나타내었다.L1 (10 μM) and L2 (10 μM) fluorescent probes were reacted with NaHS (100 μM) in PBS buffer (10 μM) at 37° C., and the fluorescence intensity over time (550 nm) was measured, and the results are shown in FIG. 5- It is shown in a.
도 5-a를 살펴보면, L1 형광 프로브는 약 80분 후에 정상 상태(steady state)에 도달하였으나, L2 형광 프로브는 약 40분 후에 이에 도달하였다. L1 형광 프로브가 정상 상태에 도달하기 까지 L2 형광 프로브보다 2배의 시간이 소요된 이유는 L1 형광 프로브의 나프탈아미드 골격에 친수성 알킬 사슬의 치환에 의한 용해도에 따라 반응 시간이 길어졌기 때문인 것으로 추측된다.Referring to FIG. 5-A , the L1 fluorescent probe reached a steady state after about 80 minutes, but the L2 fluorescent probe reached this after about 40 minutes. The reason that the L1 fluorescent probe took twice as long as the L2 fluorescent probe to reach a steady state is thought to be because the reaction time is longer depending on the solubility due to the substitution of the hydrophilic alkyl chain in the naphthalamide backbone of the L1 fluorescent probe. do.
상기 실험을 통하여 확인한 시간 의존적 형광 반응은, 본 발명의 형광 프로브가 황화수소를 정성 및 정량적으로 검출할 수 있음을 확인하였다. The time-dependent fluorescence reaction confirmed through the above experiment confirmed that the fluorescent probe of the present invention can detect hydrogen sulfide qualitatively and quantitatively.
또한, 동일 조건에서 NaHS의 농도를 달리하며(0, 10, 30, 50, 100, 150, 200, 250, 300 및 400μM), 반응을 진행하였으며, 그 결과를 도 5-b에 나타내었다.In addition, different concentrations of NaHS (0, 10, 30, 50, 100, 150, 200, 250, 300 and 400 μM) were carried out under the same conditions, and the reaction was carried out, and the results are shown in FIG. 5-b.
도 5-b를 살펴보면, L1 및 L2 형광 프로브는 NaHS의 농도가 증가할수록 형광 강도가 선형적으로 증가하다가, NaHS 200μM 농도에서는 형광 반응 능력이 포화된 것으로 나타났다. 결과적으로, 포유 동물의 혈액 내 황화수소의 농도 범위가 20-100 μM 수준으로 알려진 바, 본 발명의 프로브는 생물학적 시료 중의 황화수소 농도를 측정하기에 충분한 것으로 확인되었다.Referring to FIG. 5-b , the fluorescence intensity of the L1 and L2 fluorescent probes increased linearly as the concentration of NaHS increased, but the fluorescence reaction capacity was saturated at the concentration of 200 μM NaHS. As a result, the concentration range of hydrogen sulfide in mammalian blood is known to be 20-100 μM, and it was confirmed that the probe of the present invention is sufficient to measure the concentration of hydrogen sulfide in a biological sample.
실험예Experimental example 3. 선택적 황화수소 검출 평가 3. Selective hydrogen sulfide detection evaluation
L1 형광 프로브를 대상으로 황화수소를 선택적으로 검출할 수 있는지 여부를 확인하기 위하여 다음과 같은 실험을 진행하였다. 검출 대상 성분으로는 황을 포함하는 무기 이온(S2O3, SO4 2, SO3 2, SCN, 1 mM), 무기염(NaH2PO4, 1 mM), 유기황화물(α-lipoic acid), 활성 산소종(H2O2, 1 mM), 반응성 질소종(NO, NO3, NO2, 1 mM), 티올(L-cys, homo-cys, glutathione, 1 mM), L-ascorbic acid (1 mM)를 사용하였다. L1 형광 프로브 10 μM 단독 조성 및 L1 형광 프로브 10 μM와 상기 검출 대상 성분과의 혼합물을 60분 동안 37℃에서 PBS 완충액(pH 7.4) 내에서 NaHS 100 μM과 반응시켰다. 그 반응 결과를 도 6에 나타내었다.In order to check whether hydrogen sulfide can be selectively detected by the L1 fluorescent probe, the following experiment was performed. Detectable components include sulfur-containing inorganic ions (S 2 O 3 , SO 4 2 , SO 3 2 , SCN, 1 mM), inorganic salts (NaH 2 PO 4 , 1 mM), organic sulfides (α-lipoic acid) ), reactive oxygen species (H 2 O 2 , 1 mM), reactive nitrogen species (NO, NO 3 , NO 2 , 1 mM), thiols (L-cys, homo-cys, glutathione, 1 mM), L-ascorbic acid (1 mM) was used. A composition of 10 μM of the L1 fluorescent probe alone and a mixture of 10 μM of the L1 fluorescent probe and the component to be detected were reacted with 100 μM of NaHS in PBS buffer (pH 7.4) at 37° C. for 60 minutes. The reaction results are shown in FIG. 6 .
도 6에서 보는 바와 같이, L1 형광 프로브와 검출 대상 성분이 혼합된 혼합물에서 모두 황화수소에 의한 형광을 확인할 수 있는 바, 이를 통하여 형광 프로브와 다른 성분과의 반응은 일어나지 않은 것으로 판단되었다.As shown in FIG. 6 , fluorescence by hydrogen sulfide was confirmed in both the mixture of the L1 fluorescent probe and the component to be detected, and thus, it was determined that the reaction between the fluorescent probe and other components did not occur.
한편, 상기 검출 대상 성분과 NaHS을 대상으로 L1 및 L2 형광 프로브와 반응을 진행한 결과를 도 7에 나타내었다.On the other hand, the results of the reaction with the L1 and L2 fluorescent probes for the detection target component and NaHS are shown in FIG. 7 .
도 7에서 보는 바와 같이, 다른 검출 대상 성분과의 반응을 통하여는 형광 세기에 있어서 유의미한 차이가 나타나지 않으나, 황화수소를 대상으로는 형광 강도가 높게 나타나는 것을 확인할 수 있었다.As shown in FIG. 7 , there was no significant difference in fluorescence intensity through the reaction with other components to be detected, but it was confirmed that the fluorescence intensity was high for hydrogen sulfide.
따라서 L1 및 L2 형광 프로브가 황화수소만을 선택적으로 검출할 수 있음을 확인할 수 있었다.Therefore, it was confirmed that the L1 and L2 fluorescent probes could selectively detect only hydrogen sulfide.
실험예Experimental example 4. 세포 독성 검사( 4. Cytotoxicity test ( CCKCCK -8 assays)-8 assays)
상기 L1 및 L2 형광 프로브를 대상으로 RAW264.7 세포에 대한 세포독성검사(CCK-8 assays)를 진행하였다. 형광 프로브의 농도를 0 내지 20 μM까지의 변화시키면서 세포 생존율을 확인하였으며, 그 결과를 도 8에 나타내었다.The L1 and L2 fluorescent probes were subjected to cytotoxicity test (CCK-8 assays) on RAW264.7 cells. Cell viability was confirmed while varying the concentration of the fluorescent probe from 0 to 20 μM, and the results are shown in FIG. 8 .
상기 도 8에서 보는 바와 같이, L1, L2 형광 프로브 처리 시, RAW264.7 세포는 24시간 경과 후 세포 생존율이 약 90% 수준으로 나타난 바, 상기 형광 프로브의 세포 독성이 최소화 된 것을 확인할 수 있었다.As shown in FIG. 8, when the L1 and L2 fluorescent probes were treated, the RAW264.7 cells showed a cell viability of about 90% after 24 hours, confirming that the cytotoxicity of the fluorescent probes was minimized.
실험예Experimental example 5. 세포 내 형광 반응 평가 5. Evaluation of Intracellular Fluorescence Response
L1 및 L2 형광 프로브를 대상으로 살아있는 세포 내 외인성 황화수소의 검출에 따른 형광 반응을 평가하였고, 이를 도 9에 나타내었다. 상기 도 9의 이미지는 505 ~ 605 nm 방출 채널에서 얻어졌다.The fluorescence response according to the detection of exogenous hydrogen sulfide in living cells was evaluated with respect to the L1 and L2 fluorescent probes, and the results are shown in FIG. 9 . The image of FIG. 9 was obtained at a 505-605 nm emission channel.
RAW 264.7 세포를 30분 동안 5μM의 형광 프로브와 함께 배양(도 9-a, b 참조)하였고, 이후 5분 동안 200μM의 NaHS와 반응(도 9-c, d)시켰다(488nm 여기 상태).RAW 264.7 cells were incubated with a fluorescent probe at 5 μM for 30 min (see FIGS. 9-a, b) and then reacted with 200 μM NaHS for 5 min ( FIGS. 9-c, d) (488 nm excited state).
도 9에서 보는 바와 같이, 본 발명의 형광 프로브를 통하여 세포 내 황화수소의 검출이 가능함을 확인할 수 있었다.As shown in FIG. 9 , it was confirmed that the detection of intracellular hydrogen sulfide was possible through the fluorescent probe of the present invention.
한편, 37℃에서 1시간 동안 L1 형광 프로브 5 μM와 함께 RAW 264.7 세포를 배양한 후, NaHS의 농도를 달리하여 첨가(50, 100, 150 및 200 μM)하고 1시간 동안 배양시켰다. 이어, 과량의 NaHS를 제거한 후, 세포들을 공초점 형광 현미경을 사용하여 모니터링 하였으며, 그 결과를 도 10에 나타내었다.On the other hand, after culturing RAW 264.7 cells with 5 μM of the L1 fluorescent probe at 37° C. for 1 hour, different concentrations of NaHS were added (50, 100, 150 and 200 μM) and incubated for 1 hour. Then, after removing the excess NaHS, the cells were monitored using a confocal fluorescence microscope, and the results are shown in FIG. 10 .
도 10을 살펴보면, L1 형광 프로브만을 처리한 RAW 264.7 세포는 505 내지 605 nm에서 형광을 나타내지 않았다(488 nm 여기). 그러나 NaHS의 존재 하에서 L1 형광 프로브를 처리한 경우 RAW 264.7 세포는 50μM NaHS에서도 강한 형광 반응을 나타냈으며, 형광 강도는 NaHS 농도가 증가함에 따라 함께 같이 증가하는 것을 확인할 수 있었다.Referring to FIG. 10 , RAW 264.7 cells treated only with the L1 fluorescent probe did not show fluorescence at 505 to 605 nm (488 nm excitation). However, when the L1 fluorescent probe was treated in the presence of NaHS, RAW 264.7 cells showed a strong fluorescence response even in 50 μM NaHS, and it was confirmed that the fluorescence intensity increased with the increase of NaHS concentration.
실험예Experimental example 6. 6. 제브라피쉬zebrafish 배아( embryo ( zebrafishzebrafish embryos) 내 형광 반응 평가 evaluation of fluorescence responses within embryos)
제브라 피쉬 배아를 이용하여 내인성 황화수소의 검출을 확인하고자 L1 형광 프로브를 24시간 수정 후의 제브라 피시 배아에 하기와 같이 처리하였다. 30분 동안 0.01%의 DMSO(도 11-a, b), 5 μM L1 형광 프로브(도 11-c, d), 25 μM L1 형광 프로브(도 11-e, f)를 처리하였다. 이 때, 도 11-a, c, e는 제브라피쉬 배아를 2시간 동안 탈이온수로 전처리한 후의 이미지이고, 도 11-b, d, f는 2시간 동안 100 μM AOAA(aminooxyacetic acid)를 처리한 후의 이미지이다. 상기 AOAA는 황화수소 합성의 주요 효소인 시스타티오닌-β-신타아제(cystathionine-β-synthase)의 억제제로 널리 사용된다. 한편, 도 11-g는 상기 a 내지 f 전체 배아체의 형광 강도를 측정하여 비교한 결과이다.In order to confirm the detection of endogenous hydrogen sulfide using zebrafish embryos, the L1 fluorescent probe was treated as follows in zebrafish embryos after 24 hours fertilization. For 30 min, 0.01% DMSO (Fig. 11-a, b), 5 μM L1 fluorescent probe (Fig. 11-c, d), and 25 μM L1 fluorescent probe (Fig. 11-e, f) were treated. At this time, FIGS. 11-a, c, and e are images after pretreatment of zebrafish embryos with deionized water for 2 hours, and FIGS. 11-b, d, and f are 100 μM AOAA (aminooxyacetic acid) for 2 hours. This is the later image. The AOAA is widely used as an inhibitor of cystathionine-β-synthase, which is a major enzyme for hydrogen sulfide synthesis. On the other hand, Figure 11-g is a comparison result of measuring the fluorescence intensity of all embryos a to f.
도 11-a, b와 같이 DMSO를 처리한 배아에서는 형광이 나타나지 않았으나, 5 μM의 L1 형광 프로브를 처리한 배아는 난황에서 형광 반응이 나타났고, 25μM의 L1 형광 프로브를 처리한 배아는 뇌 및 척수에서 강한 형광이 나타나는 것을 확인할 수 있었다. 또한, AOAA 처리 시 형광 강도가 50% 이하로 감소한 것으로 보아, 본 발명의 형광 프로브가 내인성 황화수소를 정량적으로 검출할 수 있음을 알 수 있었다.As shown in FIGS. 11-a and b, fluorescence was not observed in the DMSO-treated embryos, but the embryos treated with the 5 μM L1 fluorescent probe exhibited fluorescence in the egg yolk, and the embryos treated with the 25 μM L1 fluorescent probe exhibited fluorescence in the brain and It was confirmed that strong fluorescence appeared in the spinal cord. In addition, since the fluorescence intensity was reduced to 50% or less during AOAA treatment, it was found that the fluorescent probe of the present invention can quantitatively detect endogenous hydrogen sulfide.
Claims (6)
[화학식 2]
A fluorescent probe for detecting hydrogen sulfide represented by the following formula (2).
[Formula 2]
상기 황화수소 검출용 형광 프로브는, 생체 내의 황화수소와 반응하여 450 내지 700nm에서 형광으로 가변하는 것을 특징으로 하는 황화수소 검출용 형광 프로브.
The method of claim 1,
The fluorescent probe for detecting hydrogen sulfide is a fluorescent probe for detecting hydrogen sulfide, characterized in that it changes to fluorescence at 450 to 700 nm by reacting with hydrogen sulfide in a living body.
상기 제조된 화학식 7로 표시되는 화합물을 아자이드염과 반응시켜, 하기 화학식 2로 표시되는 화합물을 제조하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 황화수소 검출용 형광 프로브의 제조방법.
[화학식 4]
상기 화학식 4에서 X는 F, Cl, Br 또는 I 이다.
[화학식 5]
H2N-(CH2CH2O)n-H
상기 화학식 5에서 n은 3이다.
[화학식 7]
상기 화학식 7에서 R은 -(CH2CH2O)n-H 이고, X는 F, Cl, Br 또는 I 이며, 이 때 n은 3이다.
[화학식 2]
reacting a compound represented by Formula 4 with a compound represented by Formula 5 to prepare a compound represented by Formula 7; and
A method for producing a fluorescent probe for detecting hydrogen sulfide, comprising the step of reacting the prepared compound represented by Formula 7 with an azide salt to prepare a compound represented by Formula 2 below.
[Formula 4]
In Formula 4, X is F, Cl, Br or I.
[Formula 5]
H 2 N-(CH 2 CH 2 O) n -H
In Formula 5, n is 3.
[Formula 7]
In Formula 7, R is -(CH 2 CH 2 O) n -H, and X is F, Cl, Br or I, where n is 3.
[Formula 2]
상기 황화수소 검출용 형광 프로브가 생체 내 황화수소와 반응하여 형광을 나타내는 단계; 및
상기 형광을 확인하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 황화수소의 검출 방법.injecting the fluorescent probe for detecting hydrogen sulfide according to claim 1 into an animal body or cell other than a human;
displaying fluorescence by reacting the fluorescent probe for hydrogen sulfide detection with hydrogen sulfide in vivo; and
A method of detecting hydrogen sulfide comprising the step of confirming the fluorescence.
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| XU QIUYAN et al., ‘An ICT-based hydrogen sulfide sensor with good water solubility for fluorescence imaging in living cells’, J Fluoresc., Vol. 27, pp 5-11. 1부.* |
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