KR102321000B1 - 신규한 스트렙토마이세스 sp. SJ1-7 및 이의 이용 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 신규한 스트렙토마이세스 sp. SJ1-7 및 이의 이용에 관한 것으로, 구체적으로 수탁번호 KACC 92306P로 기탁된 스트렙토마이세스(Streptomyces) sp. SJ1-7 균주, 이를 이용한 항균용 조성물 및 항균물질 생산 방법에 관한 것이다.
본 발명의 균주는 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 리스테리아 모노사이토제니스(Listeria monocytogenes), 비브리오 파라헤모라이티커스(Vibrio parahaemolyticus), 스트렙토코커스 이니에(Streptococcus iniae), 포토박테리움 담셀레(Photobacterium damselae), 에드워드지엘라 타르다(Edwardsiella tarda), 스크렐로티니아 스크렐로티오럼(Sclerotinia sclerotiorum), 라이족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani), 푸사리움 옥시스포럼(Fusarium oxysporum), 피티움 아페니더마텀(Pythium aphenidermatum) 또는 클라비박터 미치가넨시스(Clavibacter michiganensis)와 같은 사람이나 가축, 식물에 유해성을 나타낼 수 있는 다양한 미생물에 대해 우수한 항균활성을 나타낼 수 있으며, 항암제이자 항생제인 크로모마이신 A3를 생산할 수 있다. 이에 이러한 균주를 이용하는 본 발명의 항균용 조성물은 상기와 같은 다양한 미생물을 관리하는데 크게 기여할 수 있으며, 이 균주를 이용하는 본 발명의 생산 방법은 크로모마이신 A3 생산 방법의 다양화를 제공할 수 있다.
본 발명의 균주는 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 리스테리아 모노사이토제니스(Listeria monocytogenes), 비브리오 파라헤모라이티커스(Vibrio parahaemolyticus), 스트렙토코커스 이니에(Streptococcus iniae), 포토박테리움 담셀레(Photobacterium damselae), 에드워드지엘라 타르다(Edwardsiella tarda), 스크렐로티니아 스크렐로티오럼(Sclerotinia sclerotiorum), 라이족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani), 푸사리움 옥시스포럼(Fusarium oxysporum), 피티움 아페니더마텀(Pythium aphenidermatum) 또는 클라비박터 미치가넨시스(Clavibacter michiganensis)와 같은 사람이나 가축, 식물에 유해성을 나타낼 수 있는 다양한 미생물에 대해 우수한 항균활성을 나타낼 수 있으며, 항암제이자 항생제인 크로모마이신 A3를 생산할 수 있다. 이에 이러한 균주를 이용하는 본 발명의 항균용 조성물은 상기와 같은 다양한 미생물을 관리하는데 크게 기여할 수 있으며, 이 균주를 이용하는 본 발명의 생산 방법은 크로모마이신 A3 생산 방법의 다양화를 제공할 수 있다.
Description
본 발명은 신규한 스트렙토마이세스 sp. SJ1-7 및 이의 이용에 관한 것으로, 구체적으로 수탁번호 KACC 92306P로 기탁된 스트렙토마이세스(Streptomyces) sp. SJ1-7 균주, 이를 이용한 항균용 조성물 및 항균물질 생산 방법에 관한 것이다.
병원성 미생물은 사람에게 많은 피해를 일으킨다. 사람에게 질병을 일으키는 직접적인 피해 뿐만 아니라 경제, 사회적인 관점에서의 피해 등 간접적인 피해를 야기시키므로 이러한 병원성 미생물을 관리하는 것은 매우 중요하다.
병원성 미생물 중 대표적으로 식중독균으로도 알려진 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus, 황색포도상구균)가 있다. 이 균은 그람양성의 통성혐기성 세균으로 사람이나 가축의 피부에 존재하여 염증을 유발하며, 이 균에 의해 식품이 오염될 경우 독소를 생산하여 식중독을 일으키는 것으로 잘 알려져 있다. 장염비브리오로 알려진 비브리오 파라헤모라이티커스(Vibrio parahaemolyticus) 또한 식중독을 일으키며 동물(토끼)의 적혈구를 용혈하는 용혈활성이 있고, 세포독성, 심장독성 등을 나타내는 것으로 알려져 있다. 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) 또한 그람양성의 통성형기성 세균으로 일반적으로는 비병원성이지만 설사형 또는 구토형 식중독을 일으킨다. 이 밖에 리스테리아증을 일으키는 리스테리아 모노사이토제니스(Listeria monocytogenes) 등을 포함하여 다양한 병원성 미생물이 알려져 있다.
이와 같이 사람에게 직접적으로 혹은 간접적으로 많은 피해를 주고 있는 병원성 미생물에 따른 피해를 막기 위해 이들에 대한 항균성을 나타내는 물질을 개발하고 이를 활용하는 기술들이 개발되고 있다.
한편, 토양에는 매우 다양한 미생물이 존재하며 이들 중에는 방선균도 포함된다. 방선균, 특히 스트렙토마이세스 속의 균은 다양한 항균물질을 생산할 수 있어 항생제를 개발하는데 매우 중요하다.
본 발명자는 상기와 같은 병원성 미생물을 비롯하여 다양한 미생물에 항균활성을 나타내는 균주를 토양으로부터 새롭게 발굴하여 동정하고, 이를 이용하여 병원성 미생물을 관리함으로써 이들로 인한 피해를 줄일 수 있는 기술을 제공하고자 하였다.
본 발명의 주된 목적은 병원성 미생물을 포함한 다양한 미생물에 대한 우수한 항균활성을 갖는 토양 유래의 새로운 균주를 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 균주를 이용한 항균용 조성물 및 항균물질의 생산 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 수탁번호 KACC 92306P로 기탁된 스트렙토마이세스(Streptomyces) sp. SJ1-7 균주를 제공한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 균주의 균체, 포자 및 배양액으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 유효성분으로 함유하는 항균용 조성물을 제공한다.
본 발명의 조성물에 있어서, 상기 조성물은 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 리스테리아 모노사이토제니스(Listeria monocytogenes), 비브리오 파라헤모라이티커스(Vibrio parahaemolyticus), 스트렙토코커스 이니에(Streptococcus iniae), 포토박테리움 담셀레(Photobacterium damselae), 에드워드지엘라 타르다(Edwardsiella tarda), 스크렐로티니아 스크렐로티오럼(Sclerotinia sclerotiorum), 라이족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani), 푸사리움 옥시스포럼(Fusarium oxysporum), 피티움 아페니더마텀(Pythium aphenidermatum) 또는 클라비박터 미치가넨시스(Clavibacter michiganensis)에 대한 항균의 용도인 것이 바람직하다.
본 발명의 조성물에 있어서, 상기 조성물은 식품 조성물, 식품 첨가제 조성물, 사료 조성물, 사료 첨가제 조성물, 비료 조성물 또는 비료 첨가제 조성물인 것이 바람직하다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 균주를 배양하는 것을 특징으로 하는 항균물질 생산 방법을 제공한다.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 항균물질은 크로모마이신 A3인 것이 바람직하다.
본 발명의 균주는 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 리스테리아 모노사이토제니스(Listeria monocytogenes), 비브리오 파라헤모라이티커스(Vibrio parahaemolyticus), 스트렙토코커스 이니에(Streptococcus iniae), 포토박테리움 담셀레(Photobacterium damselae), 에드워드지엘라 타르다(Edwardsiella tarda), 스크렐로티니아 스크렐로티오럼(Sclerotinia sclerotiorum), 라이족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani), 푸사리움 옥시스포럼(Fusarium oxysporum), 피티움 아페니더마텀(Pythium aphenidermatum) 또는 클라비박터 미치가넨시스(Clavibacter michiganensis)와 같은 사람이나 가축, 식물에 유해성을 나타낼 수 있는 다양한 미생물에 대해 우수한 항균활성을 나타낼 수 있으며, 항암제이자 항생제인 크로모마이신 A3를 생산할 수 있다. 이에 이러한 균주를 이용하는 본 발명의 항균용 조성물은 상기와 같은 다양한 미생물을 관리하는데 크게 기여할 수 있으며, 이 균주를 이용하는 본 발명의 생산 방법은 크로모마이신 A3 생산 방법의 다양화를 제공할 수 있다.
도 1은 본 발명의 신규 균주 스트렙토마이세스(Streptomyces) sp. SJ1-7의 주사전자현미경(SEM: scanning electron microscope) 사진이다.
도 2는 배지의 종류에 따른 본 발명 SJ1-7 균주의 형태분화를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명 SJ1-7 균주의 16S rRNA 유전자 염기서열을 바탕으로 작성된 계통수(phylogenetic tree)이다.
도 4는 배지의 종류에 따른 본 발명 SJ1-7 균주의 항균활성을 나타낸 것이다.
도 5의 좌측은 SJ1-7 배양액을 HP-20 수지를 이용하여 분획한 분획물의 스타필로코커스 아우레우스 209 균주에 대한 항균활성 실험결과이고, 우측은 이 분획물 중 100% 메탄올 용출 분획을 농축하여 Sephadex LH-20 칼럼 크로마토그래피로 분획한 분획물의 항균활성 실험결과이다. Acetone, 아세톤; Pass, HP-20에 흡착되지 않은 통과분획; 30M, 30% 메탄올 수용액 용출 분획; 70M, 70% 메탄올 수용액 용출 분획; MeOH, 100% 메탄올 용출 분획; 15 ~ 43, Sephadex LH-20 칼럼 크로마토그래피로 분획하여 수득한 15 ~ 43번 분획.
도 6은 상기 Sephadex LH-20 칼럼 크로마토그래피로 분획한 17 ~ 38번 분획을 모아 농축하여 ODS MPLC를 수행한 결과이다.
도 7은 상기 ODS MPLC에서 분획한 M1 ~ M5 분획의 HPLC 분석 결과이다.
도 8은 상기 ODS MPLC에서 분획한 M1 ~ M5 분획의 항균활성 실험결과이다.
도 9는 상기 M1 ~ M5 분획 중 M4 분획으로 다시 ODS MPLC를 수행한 결과이다.
도 10은 상기 M4 분획의 ODS MPLC에서 분획한 33 ~ 47번 분획(SJ-2)의 HPLC 분석 결과이다.
도 11은 상기 SJ-2의 분취 HPLC 크로마토그램이다.
도 12는 상기 SJ-2 및 분취 HPLC로 분리한 SJ2-1의 HPLC 크로마토그램이다.
도 13은 상기 SJ2-1의 UV 스펙트럼이다.
도 14는 상기 SJ2-1의 분리 및 정제 과정을 나타낸 것이다.
도 15는 상기 SJ2-1의 ESI-mass 스펙트럼이다.
도 16은 상기 SJ2-1의 1H NMR 스펙트럼이다.
도 17은 상기 SJ2-1의 13C NMR 스펙트럼이다.
도 18은 상기 SJ2-1의 1H-1H COSY 스펙트럼이다.
도 19는 상기 1H-1H COSY 스펙트럼의 해석에 따른 SJ2-1의 부분구조를 나타낸 것이다.
도 20은 상기 SJ2-1의 HMQC 스펙트럼이다.
도 21은 상기 SJ2-1의 HMBC 스펙트럼이다.
도 22는 상기 SJ2-1의 1H-1H COSY 및 HMBC 상관관계를 나타낸 것이다.
도 23은 상기 SJ2-1의 1H NMR 및 13C NMR 피크의 귀속을 나타낸 것이다.
도 24는 토마토궤양병균인 클라비박터 미치가넨시스(Clavibacter michiganensis) LMG 7333에 대한 본 발명 SJ1-7 균주의 항균활성 실험결과를 나타낸 것이다.
도 25는 감귤나무균핵병균인 스크렐로티니아 스크렐로티오럼(Sclerotinia sclerotiorum) KACC 40172에 대한 본 발명 SJ1-7 균주의 항균활성 실험결과를 나타낸 것이다.
도 26은 당근관부썩음병균인 라이족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani) AG2-2 KACC 40131에 대한 본 발명 SJ1-7 균주의 항균활성 실험결과를 나타낸 것이다.
도 27은 멜론덩굴쪼김병균인 푸사리움 옥시스포럼(Fusarium oxysporum) f. sp. 멜로니스(melonis) KACC 47669에 대한 본 발명 SJ1-7 균주의 항균활성 실험결과를 나타낸 것이다.
도 28은 양배추덩굴쪼김병균인 푸사리움 옥시스포럼(Fusarium oxysporum) f. sp. 콘글루티난스(conglutinans) KACC 47615에 대한 본 발명 SJ1-7 균주의 항균활성 실험결과를 나타낸 것이다.
도 29는 돌나물유묘마름병균인 피티움 아페니더마텀(Pythium aphenidermatum) NYJ-1에 대한 본 발명 SJ1-7 균주의 항균활성 실험결과를 나타낸 것이다.
도 2는 배지의 종류에 따른 본 발명 SJ1-7 균주의 형태분화를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명 SJ1-7 균주의 16S rRNA 유전자 염기서열을 바탕으로 작성된 계통수(phylogenetic tree)이다.
도 4는 배지의 종류에 따른 본 발명 SJ1-7 균주의 항균활성을 나타낸 것이다.
도 5의 좌측은 SJ1-7 배양액을 HP-20 수지를 이용하여 분획한 분획물의 스타필로코커스 아우레우스 209 균주에 대한 항균활성 실험결과이고, 우측은 이 분획물 중 100% 메탄올 용출 분획을 농축하여 Sephadex LH-20 칼럼 크로마토그래피로 분획한 분획물의 항균활성 실험결과이다. Acetone, 아세톤; Pass, HP-20에 흡착되지 않은 통과분획; 30M, 30% 메탄올 수용액 용출 분획; 70M, 70% 메탄올 수용액 용출 분획; MeOH, 100% 메탄올 용출 분획; 15 ~ 43, Sephadex LH-20 칼럼 크로마토그래피로 분획하여 수득한 15 ~ 43번 분획.
도 6은 상기 Sephadex LH-20 칼럼 크로마토그래피로 분획한 17 ~ 38번 분획을 모아 농축하여 ODS MPLC를 수행한 결과이다.
도 7은 상기 ODS MPLC에서 분획한 M1 ~ M5 분획의 HPLC 분석 결과이다.
도 8은 상기 ODS MPLC에서 분획한 M1 ~ M5 분획의 항균활성 실험결과이다.
도 9는 상기 M1 ~ M5 분획 중 M4 분획으로 다시 ODS MPLC를 수행한 결과이다.
도 10은 상기 M4 분획의 ODS MPLC에서 분획한 33 ~ 47번 분획(SJ-2)의 HPLC 분석 결과이다.
도 11은 상기 SJ-2의 분취 HPLC 크로마토그램이다.
도 12는 상기 SJ-2 및 분취 HPLC로 분리한 SJ2-1의 HPLC 크로마토그램이다.
도 13은 상기 SJ2-1의 UV 스펙트럼이다.
도 14는 상기 SJ2-1의 분리 및 정제 과정을 나타낸 것이다.
도 15는 상기 SJ2-1의 ESI-mass 스펙트럼이다.
도 16은 상기 SJ2-1의 1H NMR 스펙트럼이다.
도 17은 상기 SJ2-1의 13C NMR 스펙트럼이다.
도 18은 상기 SJ2-1의 1H-1H COSY 스펙트럼이다.
도 19는 상기 1H-1H COSY 스펙트럼의 해석에 따른 SJ2-1의 부분구조를 나타낸 것이다.
도 20은 상기 SJ2-1의 HMQC 스펙트럼이다.
도 21은 상기 SJ2-1의 HMBC 스펙트럼이다.
도 22는 상기 SJ2-1의 1H-1H COSY 및 HMBC 상관관계를 나타낸 것이다.
도 23은 상기 SJ2-1의 1H NMR 및 13C NMR 피크의 귀속을 나타낸 것이다.
도 24는 토마토궤양병균인 클라비박터 미치가넨시스(Clavibacter michiganensis) LMG 7333에 대한 본 발명 SJ1-7 균주의 항균활성 실험결과를 나타낸 것이다.
도 25는 감귤나무균핵병균인 스크렐로티니아 스크렐로티오럼(Sclerotinia sclerotiorum) KACC 40172에 대한 본 발명 SJ1-7 균주의 항균활성 실험결과를 나타낸 것이다.
도 26은 당근관부썩음병균인 라이족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani) AG2-2 KACC 40131에 대한 본 발명 SJ1-7 균주의 항균활성 실험결과를 나타낸 것이다.
도 27은 멜론덩굴쪼김병균인 푸사리움 옥시스포럼(Fusarium oxysporum) f. sp. 멜로니스(melonis) KACC 47669에 대한 본 발명 SJ1-7 균주의 항균활성 실험결과를 나타낸 것이다.
도 28은 양배추덩굴쪼김병균인 푸사리움 옥시스포럼(Fusarium oxysporum) f. sp. 콘글루티난스(conglutinans) KACC 47615에 대한 본 발명 SJ1-7 균주의 항균활성 실험결과를 나타낸 것이다.
도 29는 돌나물유묘마름병균인 피티움 아페니더마텀(Pythium aphenidermatum) NYJ-1에 대한 본 발명 SJ1-7 균주의 항균활성 실험결과를 나타낸 것이다.
본 발명의 신규 균주 스트렙토마이세스(Streptomyces) sp. SJ1-7(이하, 'SJ1-7'이라 한다)은 토양으로부터 분리되어 국립농업과학원 미생물은행(Korean Agricultural Culture Collection, KACC)에 수탁번호 KACC 92306P로 기탁되어 있다.
본 발명의 SJ1-7의 16S rRNA 유전자 염기서열을 분석한 결과 서열번호 1의 서열로 나타났으며, 이 서열을 바탕으로 기존에 서열이 알려진 다른 미생물들과의 상동성 비교결과를 바탕으로 스트렙토마이세스 속의 균주로 분류되었다.
본 발명의 SJ1-7은 스트렙토마이세스 속의 미생물을 배양하는 통상의 배양조건에 따라 배양할 수 있다. 예를 들어 감자 덱스트로오스(Potato Dextrose) 배지에서 약 37℃의 온도조건으로 배양할 수 있다. 이때 배지는 상기 배지 뿐만 아니라 사부로드 덱스트로오스(Sabouraud Dextrose) 배지, 글루코오스 가용성 전분(Glucose Soluble Starch) 배지, 글루코오스 효모추출물(Glucose Yeast Extract) 배지, ISP-2(International Streptomyces Project-2) 배지 및 ISP-4(International Streptomyces Project-4) 배지로 이루어진 군으로부터 선택되는 배지 또한 사용할 수 있으며, 이들 배지에 아가(agar)가 포함된 경우 아가를 제외하여 액체배양을 하거나, 배지에 아가가 포함되지 않은 경우 아가를 포함시켜 고체배양을 할 수 있다.
본 발명의 SJ1-7은 기저균사로부터 기균사를 형성하고 회색의 포자를 형성할 수 있다. 상기 SJ1-7의 포자는 예를 들어 체펙-효모추출물 배지(Czapek-Yeast Extract medium: Czapek Dox broth, 35g/L; Yeast extract, 3g/L; Agar, 15g/L)에서 약 25℃로 약 3주간 암상태에서 배양하는 방법으로 수득할 수 있다.
본 발명의 균주는 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 리스테리아 모노사이토제니스(Listeria monocytogenes), 비브리오 파라헤모라이티커스(Vibrio parahaemolyticus), 스트렙토코커스 이니에(Streptococcus iniae), 포토박테리움 담셀레(Photobacterium damselae), 에드워드지엘라 타르다(Edwardsiella tarda), 스크렐로티니아 스크렐로티오럼(Sclerotinia sclerotiorum), 라이족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani), 푸사리움 옥시스포럼(Fusarium oxysporum), 피티움 아페니더마텀(Pythium aphenidermatum) 또는 클라비박터 미치가넨시스(Clavibacter michiganensis)에 대한 항균활성을 나타낼 수 있다. 이들 병원성 미생물은 사람, 사람을 제외한 동물 또는 식물에 감염되거나 유해한 독소를 생산할 수 있다.
상기와 같은 본 발명 SJ1-7의 항균활성을 바탕으로 본 발명은 SJ1-7 균주의 균체, 포자 및 배양액으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 유효성분으로 함유하는 항균용 조성물을 제공한다.
본 발명의 항균용 조성물은 본 발명의 균주의 균체, 포자 및 배양액으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 유효성분으로 함유함으로서 상기 제시된 병원성 미생물들에 대한 항균활성을 나타낼 수 있으며, 이에 따라 상기 제시된 병원성 미생물들에 대한 항균의 용도로 사용될 수 있다.
상기와 같은 항균활성을 바탕으로 본 발명의 항균용 조성물은 바람직하게는 식품 조성물, 식품 첨가제 조성물, 사료 조성물, 사료 첨가제 조성물, 비료 조성물 또는 비료 첨가제 조성물이며, 이에 따라 상기 병원성 미생물들의 감염 또는 독소로 인한 사람, 사람을 제외한 동물 또는 식물의 피해를 효과적으로 예방할 수 있다.
본 발명의 항균용 조성물의 유효성분 중 하나인 본 발명의 균주의 배양액은 바람직하게는 감자 덱스트로오스(Potato Dextrose) 배지, 사부로드 덱스트로오스(Sabouraud Dextrose) 배지, 글루코오스 가용성 전분(Glucose Soluble Starch) 배지, 글루코오스 효모추출물(Glucose Yeast Extract) 배지, ISP-2(International Streptomyces Project-2) 배지 및 ISP-4(International Streptomyces Project-4) 배지로 이루어진 군으로부터 선택되는 배지에서 배양하여 수득된 것이다. 또한 바람직하게는 20 내지 40℃에서, 보다 바람직하게는 30 내지 40℃에서, 보다 바람직하게는 35 내지 39℃에서 배양하여 수득된 것이다. 또한 바람직하게는 1 내지 10일간, 보다 바람직하게는 2 내지 5일간 배양하여 수득된 것이다.
상기 본 발명의 항균용 조성물에서 유효성분, 즉 본 발명 SJ1-7 균주의 균체, 포자 및 배양액으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 함량은 조성물의 용도, 대상 등에 따라 적절히 변경될 수 있으나, 바람직하게는 조성물의 총 중량을 기준으로 0.00001 내지 100중량%일 수 있다.
상기 본 발명의 조성물에는 유효성분인 본 발명 SJ1-7 균주 또는 이의 배양물 이외에도 항균활성을 갖는 다른 성분, 예를 들어 다른 균주의 균체, 포자 또는 배양액이 더 포함될 수 있다. 이 밖에도 상기 항균활성을 조절, 예를 들어 항균활성의 강도 또는 지속시간 등을 조절하는 보조제 등이 더 포함될 수 있다.
본 발명에 따르면 본 발명의 SJ1-7은 크로모마이신 A3를 비롯하여 이의 유도체 등의 항균물질을 생산하는 것으로 확인되었다. 따라서 본 발명은 또한 본 발명의 균주를 배양하는 것을 특징으로 하는 항균물질, 특히 크로모마이신 A3의 생산 방법을 제공한다. 이때 배양에 관한 사항은 위에서 설명한 것과 동일하게 적용할 수 있으나, 바람직하게는 감자 덱스트로오스 액체배지(PDB)에서 35 내지 39℃로 4 내지 6일간 배양한다. 배양 이후에는 추가적인 정제 과정을 거쳐 항균물질의 순도를 높일 수 있다. 예를 들어, 아래 실시예에서 설명하는 바와 같은 정제 과정을 적용할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
[실시예]
1. 미생물 분리 및 특성 분석
1-1. 재료 및 방법
1-1-1. 미생물의 분리
경상북도 상주시에서 채취한 토양 시료 100g을 1000㎖의 멸균수로 1차 희석한 후 멸균수에 10-1 ~ 10-5로 연속희석법(serial dilution)으로 희석하였다. 1차 희석액은 최종농도 20% 글리세롤 상태로 만들어 -80℃ 초저온냉동고에 보관하였다. 연속희석된 희석액을 각각 100㎕ 씩 PDA(Potato Dextrose Agar) 고체배지에 도말한 후 37℃에서 48시간 배양하였다. 생성된 콜로니를 3차례 이상 계대배양하여 순수한 콜로니를 회수하였다. 순수 배양된 콜로니는 형태적 특성에 따라 분류하였으며 균체는 최종농도 20% 글리세롤 상태로 만들어 -80℃ 초저온냉동고에 보관하였다. 형태적으로 방선균으로 분류되는 콜로니는 고체배양 후 한천배양배지조각을 사용하여 지시균 Staphylococcus aureus에 대한 항균활성을 스크리닝하여, 최종적으로 SJ1-7 균주를 선발하였고, 이를 다음 실험에 사용하였다. S. aureus는 TSA(Tryptic Soy Agar) 배지에 계대하여 유지하였다.
1-1-2. 16S rRNA 유전자 염기서열 해독
선발된 균주 SJ1-7의 콜로니를 PDB 액체배지에 접종하여 2일 이상 진탕배양한 후 배양액을 10,000rpm에서 10분간 원심분리하여 상등액을 제거하고 균체를 회수하였다. 게놈 DNA 추출 키트(genomic DNA Extraction kit, DyneBio, 한국)를 사용하여 균체로부터 게놈 DNA를 추출하였다. 준비된 게놈 DNA의 16S rRNA 유전자 염기서열을 분석(마크로젠)하였으며, 4종류의 박테리아 유니버셜 프라이머(bacterial universal primer 518F, 785F, 800R, 907R)를 사용하였다. 16S rRNA 유전자 염기서열의 상동성 검사는 BLAST 프로그램을 사용하여 수행하였고, 표준 균주(type strain)들과의 유사성(similarity) 조사 및 관련된 분류군의 16S rRNA 유전자 염기서열의 확보는 Ezbiocloud 서버(http://www.ezbiocloud.net/eztaxon)에서 수행하였다.
1-1-3. 균주의 생리적 특성 분석
API ZYM 키트(Biomerieux, 프랑스)를 사용하여 제시된 방법에 따라 균주가 생산하는 세포외 효소를 관찰하였다. 또한 API 20NE 키트(Biomerieux, 프랑스)를 사용하여 기질이용 및 효소 생산 등에 관한 생리적 특성을 관찰하였다.
1-1-4. 균주의 형태적 특성 및 항균활성 분석
선발된 균주 SJ1-7을 SDA(Sabouraud Dextrose Agar, Difco), GSS(1.0% soluble starch, 2.0% glucose, 0.1% beef extract, 0.4% yeast extract, 0.2% NaCl, 0.025% K2HPO4, 0.2% CaCO3, pH 7.2), GYA(2.0% glucose, 1.0% yeast extract, 2.0% agar), LB(Luria-Bertani), NB(Nutrient Broth), TSB(Tryptic Soy Broth, Difco), PDA(Potato Dextrose Agar, Difco), ISP-2(International Streptomyces Project Yeast Malt Extract Agar, Difco), ISP-4(International Streptomyces Project Inorganic Salts Starch Agar, Difco) 등 9종의 고체배지에 7일간 배양하며 형태분화를 관찰하였다.
균주 SJ1-7의 고체배지에서 배양된 균체의 아가 플러그(agar plug)(직경 5㎜)를 이용하여, Listeria monocytogenes, Vibrio vulificus, Vibrio haemolyticus, Salmonella enterica subsp. Enterica, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Escherichia coli, Escherichia hermannii, Photobacterium damselae, Edwardsiella tarda, Candida albicans, Saccharomyces cerevisiae, Candida glabrata, Cryptococcus neoformans, Streptococcus iniae 등의 병원성균에 대한 항균활성을 살펴보았다. 상기 각 지시균 배양은 TSA 고체배지를 사용하였다. 지시균을 TSA 고체배지에 도말한 후 방선균 배지별 아가 플러그를 올려 30℃에서 밤새 배양한 후 저지환을 관찰하였다.
1-2. 결과
토양시료로부터 S. aureus에 대한 항균활성을 보이는 방선균 콜로니 중에서 활성이 우수한 SJ1-7을 선발하였다. 선발된 SJ1-7은 TSA, GYA, ISP-2, ISP-4, PDA 등의 고체배지에서 기저균사로부터 기균사를 형성하고 회색의 포자를 형성하는 일반적인 방선균의 형태분화가 관찰되었다(표 1 및 도 2). SJ1-7의 16S rRNA 유전자 염기서열의 상동성 검색 결과, 스트렙토마이세스(Streptomyces) 속의 균주들과 99% 이상의 높은 상동성을 보였다. 이러한 결과들을 토대로 SJ1-7을 스트렙토마이세스 속의 균주로 분류하여 Streptomyces sp. SJ1-7로 명명하였다.
| 균주 | 배지 | ||||||||
| SDA | TSA | GSS | GYA | ISP-2 | ISP-4 | PDA | NA | LB | |
| SJ1-7 | AM | SP | AM | SP | SP | SP | SP | AM | AM |
AM: aerial mycelium, 기균사SP: spore, 포자
Streptomyces sp. SJ1-7의 16S rRNA 유전자 염기서열을 토대로 하는 계통수(phylogenetic tree)는 도 3에 나타냈으며, 20NE 키트를 사용한 생리적 특성은 아래 표 2에 나타냈다.
| 성분 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | 13 | 14 | 15 | 16 | 17 |
| 반응 | NO2 | - | - | - | - | + | + | + | + | + | + | + | - | +- | + | + | - |
1, potassium nitrate; 2, L-tryptophane; 3, D-glucose(fermentation); 4, L-arginine; 5, urea; 6, esculin ferric citrate; 7, gelatine; 8, 4-nitrophenyl-βD-galactopyranoside; 9, D-glucose; 10, L-arabinose; 11, D-mannose; 12, potassium gluconate; 13, capric acid; 14, adipic acid.; 15, malic acid; 16, trisodium citrate. 17, phenylacetic acid. 부호 : +, 양성 반응; -, 음성 반응; +-, 약한 양성 반응; -+, 매우 약한 양성 반응.S. aureus에 항균활성을 갖는 균주로 분리된 Streptomyces sp. SJ1-7은 스크리닝 배지인 PDA에서 배양하였을 때, S. aureus를 포함하여 6종의 균주(B. cereus, B. subtilis, L. moncytogenes, V. parahaemolyticus, S. iniae)에 항균활성을 보였다. GYA 배지에서 배양하면 6종 이외에도 2종의 균주(P. damselae, E. tarda)에 항균활성을 보이는 것으로 관찰되었다(도 4). 배지에 따른 항균활성 결과는 표 3에 나타냈다. 강한 활성을 보이는 S. iniae와 약한 활성을 보인 P. damselae, E. tarda은 어병과 관련된 병원성 세균으로 알려져 있어, SJ1-7은 어병 관리에도 사용될 수 있을 것으로 기대된다.
| 병원균 | SDA | TSA | GSS | GYA | ISP-2 | ISP-4 | PDA | NA | LB |
| Vibrio harveyi FP8370 | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| Photobacterium damselae FP4101 | - | - | - | 2.5 | - | - | - | - | - |
| Edwardsiellatarda FP5050 | - | - | - | 2.5 | - | - | - | - | - |
| Pseudomonas aeruginosa KCTC2513 | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| Bacillus cereus KCTC3624 | 6 | - | 9 | 8 | 8 | 8 | 7 | - | - |
| Escherichia hermannii KCTC22526 | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| Escherichia coli KCTC2791 | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| Listeria monocytogenes KCTC3569 | 4 | - | 6 | 6 | 6 | 6 | 5 | - | - |
| Salmonella enterica subsp. Enterica ATCC39183 | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| Vibrio parahaemolyticus KCTC2471 | 5 | - | 7 | 8 | 6 | 7 | 5 | - | - |
| Candida albicans | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| Bacillus subtilis KCTC1027 | 6 | - | 9 | 9 | 8 | 8 | 7 | - | - |
| Staphylococcus aureus KCTC1621 | 5 | - | 8 | 7 | 7 | 8 | 6 | - | - |
| Streptococcus iniae FP52228 | 2 | - | 8 | 10 | 10 | 10 | 9 | - | - |
단위: ㎜-: 활성없음
Streptomyces sp. SJ1-7가 생산하는 항균활성물질은 그람양성 및 그람음성균 모두에서 활성을 보이지만, Vibrio 속 두 종에 대한 항균활성이 다르게 나타난 결과로부터 항균활성은 균주에 의존적으로 활성을 보이는 것으로 판단된다. 또한 TSA 배지의 경우에는 포자형성까지의 형태분화가 잘 이뤄지는데, 항균활성은 본 연구에서 사용된 지시균에서는 확인되지 않았다. 배지별로 항균활성의 차이가 확연히 차이를 보이므로 배양배지의 선택이 중요한 것으로 판단된다.
2. 항균 활성성분 분석
2-1. 항균 활성성분의 분리 및 정제
선발균주 SJ1-7 균주를 PDB(Potato dextrose broth)에 5일간 배양하여 15,000rpm에서 20분간 원심분리한 후 균체를 제거하고 상등액만을 취했다. 배양액 약 10ℓ에 1ℓ Diaion HP-20 수지(Sigma-aldrich, 미국)를 넣어 3시간 동안 교반하여 흡착하였다. 흡착시킨 수지를 칼럼(column)에 충진한 후, 흡착되지 않은 통과분획, 30% 메탄올 수용액, 50% 메탄올 수용액, 70% 메탄올 수용액, 100% 메탄올로 각각 용출시켜 분획을 확보하였다. 이들 분획에 대한 항균활성은 S. aureus 209 균주에 대한 저지환으로 평가하였다(도 5). 가장 활성이 강한 70% 메탄올 수용액 분획과 100% 메탄올 분획을 농축하여 Sephadex LH-20 칼럼 크로마토그래피(용출용매: 메탄올)를 수행하였고, 항균활성을 나타내는 17 내지 38번 분획을 모아 농축하여 ODS MPLC(용출용매: 10 내지 50% 아세토니트릴 수용액)를 수행하였다(도 6).
<ODS MPLC>
기기명 : Combiflash RF+ (Teledyne ISCO)
칼럼 C18 (86g, Teledyne ISCO)
이동상 : 증류수 - 아세토니트릴
M1 내지 M5 분획의 항균활성을 검정하였고, 각 분획을 HPLC로 분석하였다(도 7 및 8).
<HPLC>
시스템
HITACHI Chromaster, HITACHI, 일본
Pump 5110, Autosampler 5210
Column Oven 5310, PDA Detector 5430
분석조건
디텍터: UV detector DAD
칼럼: TSK-gel 100V (4.6㎜×250㎜, 5㎛), TOSOH, 일본
칼럼 오븐: 25℃
주입 부피: 10㎕
이동상: A-메탄올, B-5% 메탄올 수용액(0.04% TFA)
| 분 | B | A | 흐름률(㎖/분) |
| 0 | 90 | 10 | 1 |
| 2 | 90 | 10 | 1 |
| 20 | 0 | 100 | 1 |
| 22 | 0 | 100 | 1 |
| 23 | 90 | 10 | 1 |
| 26 | 90 | 10 | 1 |
활성이 강한 M4 분획을 다시 ODS-MPLC(용출용매: 20 내지 40% 아세토니트릴 수용액)를 수행하였다(도 9).
MPLC 분획물 33 내지 47(SJ-2)을 모아 농축하여 HPLC 분석을 수행한 결과 2개의 피크가 검출되어 최종적으로 분취 HPLC를 수행하여 SJ2-1을 분리하였다(도 10 내지 12).
<분취 HPLC>
디텍터: UV detector DAD
칼럼: Cosmosil, 5C18-MS-II, 10×150㎜, Nacalai tesque
이동상: A-메탄올, B-3차 증류수
| 분 | B | A | 흐름률(㎖/분) |
| 0 | 30 | 70 | 3 |
| 12 | 30 | 70 | 3 |
분리된 SJ2-1은 229, 278, 410nm에서 UV 최대흡수파장을 나타내었다(도 13).분리, 정제 과정은 도 14와 같다.
2-2. 항균 활성성분의 화학구조 분석
화합물 SJ2-1의 화학구조 분석은 분자량을 확인하기 위한 ESI-mass 측정과 1H NMR, 13C NMR, 1H-1H COSY, HMQC 및 HMBC 등의 NMR 스펙트럼의 측정과 해석을 통하여 수행하였다.
2-2-1. ESI-mass 스펙트럼의 측정 및 해석
화합물 SJ2-1의 분자량을 알아보고자 ESI-mass 분석을 수행하였다. 양성 모드(positive mode)에서 ESI-mass를 측정한 결과 분자량으로 추정되는 피크가 검출되지 않았다. 그러나 음성 모드(negative mode)에서 측정한 결과 m/z 1180.6에서 [M-H]- 피크가 관찰되어 분자량이 1,182로 추정되었다(도 15).
2-2-2. NMR 스펙트럼의 측정 및 해석
정제한 화합물 SJ2-1의 화학구조를 규명하기 위하여 CDCl3에 녹여 1H NMR, 13C NMR, 1H-1H COSY, HMQC 및 HMBC 스펙트럼을 측정하여 해석하였다.
1 H NMR 스펙트럼의 측정 및 해석: 정제한 화합물 SJ2-1을 CDCl3에 녹여 1H NMR 스펙트럼을 측정한 결과 15.69, 9.81ppm에서 수산기 프로톤, 6.75, 6.63ppm에서 두 개의 아로마틱 메틴 프로톤, 3.1 내지 5.3ppm 사이에서 5개의 아노머 프로톤 및 18개의 산소화 메틴 프로톤, 3.60, 3.51ppm에서 두 개의 메톡시 프로톤, 1.6 내지 3.1ppm 사이에서 6개의 메틸렌 프로톤, 2.18, 2.17, 2.14ppm에서 3개의 일중항 메틸 프로톤, 1.38, 1.37, 1.36, 1.35, 1.29, 1.28, 1.24ppm에서 7개의 메틸 피크가 관찰되었다(도 16). 이들 결과로부터 SJ2-1은 방향족환과 당으로 구성된 화합물로 유추되었다.
13 C NMR 스펙트럼의 측정 및 해석: 화합물 SJ2-1의 13C NMR 스펙트럼을 측정한 결과, 총 57개의 피크가 관찰되었다. 즉 211.1, 202.1ppm에서 케톤 카보닐 탄소, 171.5, 170.9ppm에서 에스터 카보닐 탄소, 165.3, 159.6, 156.1ppm에서 세 개의 산소와 결합한 sp2 4차 탄소, 138.4, 134.6, 111.6, 108.1, 108.0ppm에서 sp2 4차 탄소, 117.0, 100.8ppm에서 두 개의 sp2 메틴 탄소, 100.3, 99.7, 97.3, 97.1, 95.2ppm에서 5개의 아노머 탄소, 65.8 내지 82.3ppm 사이에서 18개의 산소와 결합한 메틴 탄소, 70.6ppm에서 산소와 결합한 4차 탄소, 62.4, 59.6ppm에서 메톡시 탄소, 43.8, 37.4, 37.1, 33.5, 32.9, 26.9ppm에서 6개의 메틸렌, 23.0, 20.9, 20.8, 20.6, 18.0, 17.8, 17.8, 17.2, 16.8, 8.2ppm에서 10개의 메틸 탄소가 관찰되었다(도 17). 화합물 SJ2-1의 화학구조를 규명하기 위하여 1H-1H COSY, HMQC, HMBC 등의 2차원 NMR 스펙트럼을 측정하여 해석하였다.
1 H- 1 H COSY 스펙트럼의 측정 및 해석: 화합물 SJ2-1의 1H-1H COSY 스펙트럼을 측정한 결과, 도 19에 나타낸 12개의 부분구조(굵은 선으로 표시)를 밝혔다(도 18).
HMQC 스펙트럼의 측정 및 해석: HMQC 스펙트럼을 측정하여 해석한 결과, 관찰된 모든 프로톤-베어링 탄소(1 J C-H)을 규명할 수 있었다(도 20).
HMBC 스펙트럼 측정 및 해석: HMBC 스펙트럼을 측정하여 해석한 결과 도 22에 도시한 장기적 상관관계가 관찰되었으며 이로부터 화합물의 화학구조를 결정하였다. 즉 15.69ppm의 수산기 프로톤으로부터 165.3, 108.1, 108.0ppm의 탄소에, 9.81ppm의 수산기 프로톤으로부터 156.1, 111.6, 108.0ppm의 탄소에, 2.18ppm의 메틸 프로톤으로부터 159.6, 156.1, 111.6ppm의 탄소에, 6.75ppm의 메틴 프로톤으로부터 108.1, 108.0, 100.8, 26.9ppm의 탄소에, 6.63ppm의 메틴 프로톤으로부터 117.0, 111.6, 108.0ppm의 탄소에 장기적 상관관계가 관찰되어 방향족 환의 구조가 결정되었다. 또한 각 당을 구성하는 메틸 프로톤으로부터 각 당의 4번 및 5번 탄소에 장기적 상관관계가 관찰되었고, 1.36ppm의 메틸 프로톤으로부터 79.6, 70.6, 43.8ppm의 탄소에 장기적 상관관계가 관찰되어 각 당의 유닛이 결정되었다. 각 구성당의 연결성은 5.12ppm의 아노머 프로톤으로부터 69.9ppm의 탄소에, 5.22ppm의 아노머 프로톤으로부터 159.6ppm의 탄소에, 5.08ppm의 아노머 프로톤으로부터 75.9ppm의 탄소에, 4.59ppm의 아노머 프로톤으로부터 82.3ppm의 탄소에 관찰된 장기적 상관관계에 의하여 결정되었다. 두 개의 아세틸 그룹의 치환위치는 5.17ppm의 메틴 프로톤으로부터 170.9ppm의 카보닐 탄소에, 4.62ppm의 메틴 프로톤으로부터 171.5ppm의 카보닐 탄소에 관찰된 장기적 상관관계에 의하여 결정되었다. 또한 두 개의 메톡시 그룹의 치환위치는 3.60ppm의 메틸 프로톤으로부터 81.5ppm의 탄소에, 3.51ppm의 메틸 프로톤으로부터 81.8ppm의 탄소에 관찰된 장기적 상관관계에 의하여 결정되었다. 그 외에 4.71, 4.22ppm의 메틴 프로톤으로부터 211.1ppm의 케톤 카보닐 탄소에, 1.37ppm의 메틸 프로톤으로부터 78.1, 67.9ppm의 탄소에, 4.72ppm의 메틴 프로톤으로부터 202.1ppm의 카보닐 탄소에 장기적 상관관계가 관찰되었다. 그러나 5.01ppm의 아노머 프로톤으로부터는 장기적 상관관계가 관찰되지 않았다. 따라서 시료의 양 및 구조적 복잡성에 의하여 모든 HMBC 상관관계가 관찰되지는 않았으나 상기의 구조적 정보를 이용하여 SciFinder 데이터베이스를 검색한 결과 본 화합물이 항생물질 크로모마이신(chromomycin) A3(동명: Olivomycin D, Aburamycin B, Antibiotic B 599, CMA3, NSC 58514, Toyomycin)과 잘 일치함을 알 수 있었다. 이상의 NMR 스펙트럼의 측정과 질량분석으로부터 본 화합물을 분자량 1,182, 분자식 C57H82O26의 크로모마이신 A3로 동정하였다. 크로모마이신 A3은 다양한 유도체가 동시에 생성되는 것으로 알려져 있으며 본 균주 배양액에도 미량의 유도체가 존재하는 것을 알 수 있었다. 도 23에 프로톤 및 탄소 피크의 귀속(assignment)을 나타내었다.
3. 식물병원성 곰팡이 및 세균에 대한 항균능 분석
이중 배양 분석법을 적용하여 SJ1-7의 식물병원성 곰팡이 및 세균에 대한 항균능 실험을 수행하였다.
실험에 사용한 식물병원성 곰팡이 및 세균은 표 6과 같다.
| 식물병원성 곰팡이 | ||
| 1 | 감귤나무균핵병균 | Sclerotiniasclerotiorum KACC40172 |
| 2 | 당근관부썩음병균 | Rhizoctonia solani AG-2-2(IV) KACC40131 |
| 3 | 양배추덩굴쪼김병균 | Fusarium oxysporum f. sp. conglutinans KACC47615 |
| 4 | 멜론덩굴쪼김병균 | Fusarium oxysporum f. sp. melonis KACC47669 |
| 5 | 돌나물유묘마름병균 | Pythium aphenidermatum |
| 식물병원성 세균 | ||
| 6 | 토마토궤양병균 | Clavibactermichiganensis LMG7333 |
식물병원성 곰팡이는 MEA(Malt Extract Agar) 배지(Malt extract, 30g/L; Agar, 15g/L)에서 25℃로 7일간 암상태에서 배양하고, 식물병원성 세균은 LB 배지에서 25℃로 2일간 암상태에서 배양한 뒤 실험에 사용하였다.Streptomyces sp. SJ1-7은 Czapek-Yeast Extract 배지(Czapek Dox broth, 35g/L; Yeast extract, 3g/L; Agar, 15g/L)에서 25℃로 3주간 암상태에서 배양한 뒤 사용하였다.
3-1. 식물병원성 곰팡이에 대한 항균능 분석
3주 동안 배양된 SJ1-7에 멸균증류수 2㎖를 부은 뒤, 멸균된 면봉을 이용하여 배지의 표면을 부드럽게 문지르면서 포자를 수거하였다. 수거된 포자로부터 SJ1-7의 균사를 제거하기 위해 멸균된 미라클로스(miracloth; Calbiochem)를 이용하여 걸러준 뒤, 실험에 사용하였다.
MEA 배지에서 25℃로 7일간 암상태에서 배양된 식물병원성 곰팡이 균사를 직경 5㎜ 코르크 보러(cork borer)를 이용하여 배지와 함께 펀치하여 디스크를 만들고, 이를 MEA 배지가 담긴 9㎝ 페트리 접시(직경 90㎜)의 중앙에 치상하는 방법으로 병원체를 접종하였다.
병원체가 접종된 9㎝ 페트리 접시에서 병원체가 접종된 곳으로부터 3.5㎜ 거리에 지름 6㎜의 멸균된 페이퍼 디스크를 치상하였다. 치상된 페이퍼 디스크에 준비한 SJ1-7 포자 현탁액 10㎕(포자 농도 108 cfu/㎖)를 떨어뜨려주었다.
이후 25℃로 1주일간 암상태에서 항온처리한 뒤 결과를 측정하였다.
각각의 병원체에 대해 3반복으로 실험을 수행하였으며, 페이퍼 디스크에 물 10㎕를 떨어뜨려 치상한 경우를 대조군으로 사용하였다. 또한, SJ1-7이 생산하는 주요 항균 물질로 확인된 크로모마이신 A3를 적용(50㎍)한 페이퍼 디스크도 비교를 위해 사용하였다.
3-2. 식물병원성 세균에 대한 항균능 분석
10㎖의 LB 액체 배지에서 25℃로 2일간 180rpm으로 배양한 병원체, 즉 Clavibacter michiganensis(그람양성세균, 토마토 궤양병균)과 Ralstonia solanacearum(그람음성세균, 토마토 풋마름병균)의 배양액 50㎕를 LB Agar 배지에 도말하였다.
병원체가 도말된 LB Agar 배지에 지름 6㎜의 멸균된 페이퍼 디스크를 치상하고, 치상된 페이퍼 디스크에 준비된 SJ1-7 포자 현탁액 10㎕(포자 농도 108 cfu/㎖)를 떨어뜨려주었다.
이후 25℃로 3일간 암상태에서 항온처리한 뒤 결과를 측정하였다.
페이퍼 디스크에 물 10㎕를 떨어뜨려 치상한 경우를 대조군으로 사용하였으며, SJ1-7이 생산하는 주요 항균 물질로 확인된 크로모마이신 A3를 적용(50㎍)한 페이퍼 디스크도 비교를 위해 사용하였다.
3-3. 결과
실험결과, 도 24 내지 29와 같이 SJ1-7은 다양한 식물병원성 곰팡이 및 세균에 대한 항균력을 갖는 것으로 나타났다. 특히 SJ1-7은 크로모마이신 A3가 항균력을 발휘하지 못하는 식물병원체에 대해서도 항균력을 갖는 것으로 나타났는데, 이는 SJ1-7이 크로모마이신 A3 이외의 다른 항균성 화합물을 생산할 가능성을 시사한다.
[서열번호 1]
Type : DNA
생물명 : Streptomyces sp. SJ1-7
agagtttgat cctggctcag gacgaacgct ggcggcgtgc ttaacacatg caagtcgaac 60
gatgaagcct ttcggggtgg attagtggcg aacgggtgag taacacgtgg gcaatctgcc 120
cttcactctg ggacaagccc tggaaacggg gtctaatacc ggataacact ctgtcctgca 180
tgggacgggg ttaaaagctc cggcggtgaa ggatgagccc gcggcctatc agcttgttgg 240
tggggtaatg gcctaccaag gcgacgacgg gtagccggcc tgagagggcg accggccaca 300
ctgggactga gacacggccc agactcctac gggaggcagc agtggggaat attgcacaat 360
gggcgaaagc ctgatgcagc gacgccgcgt gagggatgac ggccttcggg ttgtaaacct 420
ctttcagcag ggaagaagcg aaagtgacgg tacctgcaga agaagcgccg gctaactacg 480
tgccagcagc cgcggtaata cgtagggcgc aagcgttgtc cggaattatt gggcgtaaag 540
agctcgtagg cggcttgtca cgtcggatgt gaaagcccgg ggcttaaccc cgggtctgca 600
ttcgatacgg gctagctaga gtgtggtagg ggagatcgga attcctggtg tagcggtgaa 660
atgcgcagat atcaggagga acaccggtgg cgaaggcgga tctctgggcc attactgacg 720
ctgaggagcg aaagcgtggg gagcgaacag gattagatac cctggtagtc cacgccgtaa 780
acgttgggaa ctaggtgttg gcgacattcc acgtcgtcgg tgccgcagct aacgcattaa 840
gttccccgcc tggggagtac ggccgcaagg ctaaaactca aaggaattga cgggggcccg 900
cacaagcagc ggagcatgtg gcttaattcg acgcaacgcg aagaacctta ccaaggcttg 960
acatataccg gaaagcatca gagatggtgc cccccttgtg gtcggtatac aggtggtgca 1020
tggctgtcgt cagctcgtgt cgtgagatgt tgggttaagt cccgcaacga gcgcaaccct 1080
tgttctgtgt tgccagcatg cccttcgggg tgatggggac tcacaggaga ctgccggggt 1140
caactcggag gaaggtgggg acgacgtcaa gtcatcatgc cccttatgtc ttgggctgca 1200
cacgtgctac aatggccggt acaatgagct gcgatgccgc gaggcggagc gaatctcaaa 1260
aagccggtct cagttcggat tggggtctgc aactcgaccc catgaagtcg gagttgctag 1320
taatcgcaga tcagcattgc tgcggtgaat acgttcccgg gccttgtaca caccgcccgt 1380
cacgtcacga aagtcggtaa cacccgaagc cggtggccca accccttgtg ggagggagct 1440
gtcgaaggtg ggactggcga ttgggacgaa gtcgtaacaa ggtagccgta ccggaaggtg 1500
cggctggatc acct
<110> National Institute of Biological Resources
<120> Novel Streptomyces sp. SJ1-7 and use thereof
<130> ALP20015
<160> 1
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 1514
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> Streptomyces sp. SJ1-7
<400> 1
agagtttgat cctggctcag gacgaacgct ggcggcgtgc ttaacacatg caagtcgaac 60
gatgaagcct ttcggggtgg attagtggcg aacgggtgag taacacgtgg gcaatctgcc 120
cttcactctg ggacaagccc tggaaacggg gtctaatacc ggataacact ctgtcctgca 180
tgggacgggg ttaaaagctc cggcggtgaa ggatgagccc gcggcctatc agcttgttgg 240
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ctgggactga gacacggccc agactcctac gggaggcagc agtggggaat attgcacaat 360
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ctttcagcag ggaagaagcg aaagtgacgg tacctgcaga agaagcgccg gctaactacg 480
tgccagcagc cgcggtaata cgtagggcgc aagcgttgtc cggaattatt gggcgtaaag 540
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cggctggatc acct 1514
Claims (6)
- 수탁번호 KACC 92306P로 기탁된 스트렙토마이세스(Streptomyces) sp. SJ1-7 균주.
- 제1항의 균주의 균체, 포자 및 배양액으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 유효성분으로 함유하는 항균용 조성물.
- 제2항에 있어서,
상기 조성물은 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 리스테리아 모노사이토제니스(Listeria monocytogenes), 비브리오 파라헤모라이티커스(Vibrio parahaemolyticus), 스트렙토코커스 이니에(Streptococcus iniae), 포토박테리움 담셀레(Photobacterium damselae), 에드워드지엘라 타르다(Edwardsiella tarda), 스크렐로티니아 스크렐로티오럼(Sclerotinia sclerotiorum), 라이족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani), 푸사리움 옥시스포럼(Fusarium oxysporum), 피티움 아페니더마텀(Pythium aphenidermatum) 또는 클라비박터 미치가넨시스(Clavibacter michiganensis)에 대한 항균의 용도인 것을 특징으로 하는 조성물. - 제2항에 있어서,
상기 조성물은 식품 조성물, 식품 첨가제 조성물, 사료 조성물, 사료 첨가제 조성물, 비료 조성물 또는 비료 첨가제 조성물인 것을 특징으로 하는 조성물. - 제1항의 균주를 배양하는 것을 특징으로 하는 항균물질 생산 방법.
- 제5항에 있어서,
상기 항균물질은 크로모마이신 A3인 것을 특징으로 하는 생산 방법.
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|---|---|---|---|
| KR1020200060000A KR102321000B1 (ko) | 2020-05-19 | 2020-05-19 | 신규한 스트렙토마이세스 sp. SJ1-7 및 이의 이용 |
Applications Claiming Priority (1)
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|---|---|---|---|
| KR1020200060000A KR102321000B1 (ko) | 2020-05-19 | 2020-05-19 | 신규한 스트렙토마이세스 sp. SJ1-7 및 이의 이용 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR102321000B1 true KR102321000B1 (ko) | 2021-11-03 |
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ID=78505048
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| KR1020200060000A KR102321000B1 (ko) | 2020-05-19 | 2020-05-19 | 신규한 스트렙토마이세스 sp. SJ1-7 및 이의 이용 |
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|---|---|
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Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100895908B1 (ko) | 2007-03-16 | 2009-05-04 | 일동제약주식회사 | 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 케이제이에스-2 균주가 생산하는항균물질 마크로락틴 에이 |
| KR101818859B1 (ko) | 2016-07-04 | 2018-01-16 | 고려대학교 산학협력단 | 슈도모나스 아조토포만스 균주 kacc 92125p 및 이를 포함하는 조성물 |
-
2020
- 2020-05-19 KR KR1020200060000A patent/KR102321000B1/ko active IP Right Grant
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100895908B1 (ko) | 2007-03-16 | 2009-05-04 | 일동제약주식회사 | 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 케이제이에스-2 균주가 생산하는항균물질 마크로락틴 에이 |
| KR101818859B1 (ko) | 2016-07-04 | 2018-01-16 | 고려대학교 산학협력단 | 슈도모나스 아조토포만스 균주 kacc 92125p 및 이를 포함하는 조성물 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Yi, E. et al., Tetrahedron (2019) 75:1186-1193* * |
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|---|---|---|---|
| E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
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